JP2002509116A - 核酸およびサイトカインの単一溶媒での同時輸送による遺伝子免疫 - Google Patents
核酸およびサイトカインの単一溶媒での同時輸送による遺伝子免疫Info
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Abstract
Description
れた方法に関する。
Aは、本来の形での抗原の合成を指示して、免疫系にそれを有効に提示すること ができる。例えば、齧歯類およびヒト以外の霊長類では、HIV-1 DNAワクチン接 種によって強力な液性および細胞性免疫応答が誘導されている[1,2]。プラスミ ドは典型的に、筋肉内に単回注射または遺伝子銃を用いて投与される。
という知見が得られたことにより、HIVワクチンを開発するこの戦略を最適にす ることに強い関心が集まっている[3〜5]。アジュバントと共に製剤化した組換え
型抗原または死滅ウイルス抗原に依存する初代HIVワクチンは、有効なCTL反応を
生じることができなかった。DNA免疫は、抗原を本来の形で発現するという長所 を有し、それによって液性および細胞性免疫応答の双方を誘発するために、最適
なプロセシングおよび抗原提示細胞への提示がなされる可能性がある。
あるが、これらのベクターの安全性に対する懸念は依然として存在する。より安
全なウイルスベクターを操作するために十分かつ優れた研究が現在行われている
が、非ウイルスベクターをその代用として利用することがますます提唱されつつ
ある。HIVワクチン接種に関するそれらの中で主なものは、プラスミドDNAの筋肉
または皮膚組織への直接注射、およびDNAコーティングした金粒子の高圧遺伝子 銃による衝突である。残念なことに、トランスフェクション効率は典型的に低い
。このように、当技術分野では、改善された免疫応答を提供するDNAの輸送方法 が必要である。
特に癌免疫療法の分野において強い注目を集めた。一つのアプローチは腫瘍細胞
にサイトカイン遺伝子を直接導入することである[6〜23]。サイトカインはT細胞
に対する抗原提示を増強するか、またはT細胞活性化に関するさらなる共刺激シ グナルを提供するかのいずれかである。多くの場合、局所的に分泌されたサイト
カインは炎症反応を誘発して、注射した腫瘍細胞を拒絶する。場合によっては、
これらの遺伝子改変腫瘍細胞は、腫瘍細胞のその後の非経口的な投与に対して、
および時に確立した微小転移に対してさえも全身免疫を生じることがありうる。
の減少が起こったが、GM-CSFは反対の作用を示す[24]。いずれのサイトカインも
抗原特異的T細胞反応を刺激し、IL-12と同時輸送するとCTL反応は劇的に増加し た。当技術分野では、免疫応答を刺激するためにサイトカインを哺乳動物に輸送
することができるさらなる方法が必要である。
である。
製する方法を提供することである。
ことである。
み、ポリマー陽イオンがゼラチンおよびキトサンからなる群より選択され、なら
びにサイトカインがコアセルベートに封入されている、ポリマー陽イオンおよび
多価陰イオンのコアセルベートを含む、哺乳動物を遺伝子免疫するための5μm 未満の固体ナノスフェアを提供することによって達成される。
乳動物を免疫する方法が提供される。方法は以下の段階を含む: 多価陰イオンが抗原をコードする核酸を含み、ポリマー陽イオンがゼラチンお
よびキトサンからなる群より選択され、ならびにサイトカインがコアセルベート
に封入されている、ポリマー陽イオンおよび多価陰イオンのコアセルベートを含
む5μm未満の固体ナノスフェアを哺乳動物に投与する段階。
アを形成する方法が提供される。方法は以下の段階を含む: 抗原をコードする核酸を含む多価陰イオンとポリマー陽イオンとのコアセルベ
ーションによって固体ナノスフェアを形成する段階であって、該ポリマー陽イオ
ンがキトサンおよびゼラチンからなる群より選択され、該コアセルベーションが
サイトカインの存在下で行われ、それによってサイトカインが固体ナノスフェア
に封入される段階。
明細書に特に組み入れられる。
ラチンまたはキトサンのいずれかとの塩誘発複合体コアセルベーションによって
合成された非ウイルス遺伝子輸送システム(ナノスフェア)を開発した。遺伝子
ワクチン接種の有効性を増強するため、そして所望の免疫応答を得るためにサイ
トカインをナノスフェアに同時封入する。ワクチンによって誘発された最終的な
免疫応答は、特異的および非特異的免疫作用機序の間の相互作用によって影響を
受ける。ワクチン接種部位に誘引された免疫細胞のタイプによって、例えば腫瘍
関連抗原によって誘導される最終的な抗腫瘍免疫が決定されうる。これらの細胞
の範囲もまた、サイトカインの時間的および空間的分布に支配される。サイトカ
イン遺伝子をナノスフェアに同時封入することによって、サイトカインの時間的
および空間的分布をさらに変化させることができる。これは免疫応答をTh1また はTh2経路のような特異的免疫アームに向けることができる。この戦略は例えば 、液性または細胞性アームを強調することによってHIV感染症に対する免疫応答 を調節することができる。
と共通の要素を有するが、核酸が固体マトリクスに物理的に捕獲されていること
およびコアセルベートが細胞外で安定であるという重要な局面が異なっている。
この遺伝子輸送システムは幾つかの魅力的な特徴を有する:1) 受容体媒介エン ドサイトーシスを刺激するため、そしておそらく細胞/組織を標的とするために
、リガンドをナノスフェアに結合させることができる;2)無傷DNAの細胞質への
漏出を促進するために、ライソゾーム溶解物質を組み入れることができる;3)R
NA、オリゴヌクレオチド、蛋白質または多数のプラスミドのようなその他の生物
活性物質を同時封入することができる。ワクチン応用に関連するのは、クラスII
提示を通じて、そして最近の知見によって示唆されるように、ナノスフェアが抗
原提示細胞によってインターアナライズされる場合には、クラスI提示によって 、免疫応答をおそらく増強するために、蛋白質抗原も同様にナノスフェアに同時
封入してもよいという点である;4)核酸がマトリクスによって血清ヌクレアー ゼ分解から保護されること、そしてナノスフェアがエンドライソゾーム経路に入
るまで核酸の放出はほとんどないことから、核酸の生物学的利用率を改善するこ
とができる。同様に、核酸を細胞内に持続的に放出する可能性もあり、これによ
って遺伝子産物のより持続的な発現が提供される可能性がある;5)ナノスフェ アは血漿電解質において安定であり、生物活性を失うことなく凍結乾燥すること
ができる。ナノスフェアは製造、溶解、および保存に関して従来の薬学的製剤と
同様に取り扱うことができる。
は生物分解性遊離調節能ナノスフェアによって満たすことができることを証明し
た。このアプローチは、個々に遺伝子を移入する必要性がなくなることからより
労力が少なくて済む。遺伝子移入の場合より一定のサイトカインレベルを容易に
得ることができること、そしてナノスフェアの特性を変化させることによってサ
イトカイン輸送の速度および期間を変化させることができることから、このアプ
ローチはより調節可能である。また多数のサイトカインを容易に用いることがで
きるため、そしてサイトカインに対する腫瘍抗原の比を容易に変化させることが
できるため、より可変性である。これらの利点はまた、HIVワクチン接種のよう な他のタイプのワクチン接種にも当てはまる。
混合した場合に発生する自然発生的な相分離のプロセスである。2つの巨大分子
種の間に静電気的相互作用が起こった結果、コアセルベート(ポリマーに富む相
)と上清(ポリマーが少ない相)の分離が起こる。この現象はナノスフェアを形
成するため、および多様な化合物を封入するために用いることができる。封入プ
ロセスは完全に水溶液中および低温で行うことができ、したがって、封入される
物質の生物活性が保持される可能性が高い。
マー陽イオンを用いて、核酸と複合体を形成してナノスフェアを形成する。この
中にはゼラチンおよびキトサンが含まれるがこれらに限定しない。ゼラチン源は
重要ではないと思われる;これはウシ、ブタ、ヒト、または他の動物起源となり
うる。典型的に、ポリマー陽イオンは分子量19,000〜30,000を有する。ポリ-L- リジンまたはキトサンは、本発明のポリマー陽イオンとして特に有用となる可能
性がある。ポリリジン、ポリリジン-ポリアルギニン、ポリアルギニン、プロタ ミン、スペルミン、スペルミジン等の、合成または天然に存在するポリアミノ酸
を用いることができる。多糖類を用いてもよい。望ましくは、硫酸ナトリウムを
用いてポリマー陽イオンおよび核酸のコアセルベーションを誘導する。エタノー
ルはコアセルベーションを誘導するために約40〜60%の濃度で用いることができ
る。コンドロイチン硫酸もまた、ナノスフェアに組み入れることができ、これは
薬剤およびライソゾーム溶解物質のような他の物質をナノスフェアに組み入れた
い場合には特に有用である。典型的に、コンドロイチン硫酸の濃度は約0.005% 〜0.1%である。
フェアは3ミクロン未満のナノスフェアであり、2、1、0.5、および0.1ミクロン
未満のナノスフェアがさらにより好ましい。大きさはコアセルベーション条件、
成分である多価陰イオン、および多価陽イオンの大きさによって影響を受けうる
が、サイズに基づいてナノスフェアを分離する技術を用いて、所望の大きさのナ
ノスフェアをサイズ選択することができる。
ことができ、または「ブリッジ」または「スペーサー」を用いて間接的に結合す
ることができる。ゼラチンのリジン基によって提供されるアミノ基のために、ナ
ノスフェアの表面はターゲティング部分と直接カップリングさせるために容易に
誘導体化することができる。例えば、カルボジイミドを誘導体化剤として用いる
ことができる。または、アビジン-ビオチンのようなスペーサー(ターゲティン グリガンド上の結合分子および誘導体化部分)を用いて、ターゲティングリガン
ドをナノスフェアに間接的にカップリングさせることができる。アビジンに対す
るビオチンの親和性が高いために(Ka〜1015 M-1)、ビオチン化抗体および/ま
たは他のビオチン化リガンドを、アビジンコーティングナノスフェア表面に効率
よくカップリングすることができる(ハズダ(Hazuda)ら、1990「前駆体インタ
ーロイキン1βのプロセシングと炎症疾患(Processing of precursor interleuk
in 1 beta and inflammatory disease)」、J. Biol. Chem. 265:6318〜22;ウ
ィルチェク(Wilchek)ら、1990、「アビジン・ビオチン技術概論(Introductio
n to avidin-biotin technology)」、Methods in Enzymology, 184:5〜13)。
IgGの方向選択的結合は、Fc部分上で認められるオリゴ多糖類基での抗体のビオ チン化によって得ることができる(オシャネシー(O'Shannessy)ら、1984、「 オリゴ多糖類部分との結合によって免疫グロブリンを標識する新規方法(A nove
l procedure for labeling immunoglobulins by conjugation to oligosacchari
des moieties)」、Immunol. Lett. 8:273〜277)。このデザインは、利用でき
る結合部位の総数を保存する際に有用であり、これによって結合した抗体はマク
ロファージのようなFc-受容体保有細胞に対して免疫原性が低くなる。当技術分 野で既知のように、アビジン-ビオチンブリッジ以外のスペーサーを用いること ができる。例えば、免疫グロブリン分子のFc部分をナノスフェアに結合させるた
めに、ブドウ球菌蛋白質Aをナノスフェアにコーティングすることができる。
ナノスフェアの安定性を促進すると共に、結合分子またはターゲティングリガン
ドをナノスフェアに共有結合させる場合にも用いられる。クロスリンクの程度は
ナノスフェアから放出される核酸の速度に直接影響を及ぼす。クロスリンクはグ
ルタルアルデヒド、EDC(1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミ
ドのようなカルボジイミド、DCC(N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド)、カ
ルボキシル(ペプチド結合)結合、ビス(スルホサクシニミジル)スベレート、
ジメチルスベリミデート等を用いて行うことができる。
に結合する如何なる分子でもある。これらは、それに対する細胞受容体が存在す
る如何なるタイプの分子であってもよい。好ましくは、細胞受容体は特定の細胞
タイプ上に限って発現される。用いてもよいターゲティングリガンドの例は、ホ
ルモン、抗体、細胞接着分子、糖、薬剤および神経伝達物質である。
酸の負荷量が20%または30%以上であるが、40%または50%未満であるナノスフ
ェアを得ることができる。典型的に核酸のナノスフェアへの負荷効率は95%以上
を得ることができる。
このプロセスは陽性荷電ポリマー陽イオンと、陰性荷電核酸との相互作用に依存
するため、これは複合体コアセルベーションプロセスとして見なすことができる
。しかし、硫酸ナトリウム(またはエタノール)は相転移を誘導することによっ
てコアセルベーション反応を誘発し、したがって、これは単純なコアセルベーシ
ョン反応と見なすことができる。核酸は、1 ng/ml〜500 μg/mlの濃度でコアセ
ルベーション混合液中に存在する。望ましくは、核酸は長さが少なくとも約2〜
3 kbである。硫酸ナトリウムは7〜43 mMで存在する。ゼラチンまたは他のポリ
マー陽イオンはコアセルベーション反応において約2〜7%で存在する。
荷量、遊離調節能、保存安定性および成分の免疫原性のような要因の繊細なバラ
ンスが必要である。本明細書に記述の遺伝子輸送システムは、リポソームシステ
ムを含む他の微粒子輸送システムと比較して利点を有する可能性がある。不安定
性、低い負荷量、および遊離調節能に関する問題は、ポリマーナノスフェアシス
テムによってよりよく解決される。ゼラチンは、その組織適合性およびインビボ
での酵素的分解性から、手術用組織絆創膏(バインシェルバウム(Weinschelbau
m)ら、1992、「本来の大動脈弁を保存した急性A型解離性動脈瘤の外科的処置と
生物接着剤の利用、6年追跡調査(Surgical treatment of acute type A disse
cting aneurysm with preservation of the native aortic valve and use of
biologic glue. Follow-up to 6 years)」、J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 13
0:369〜74)から定量的免疫組織化学アッセイ(イズミ(Izumi)ら、1990、「 戦場におけるらい病の血清診断に関する新規ゼラチン粒子凝集試験(Novel gela
tin particle agglutination test for serodiagnosis of leprosy in the fiel
d)」、J. Clinical Microbiol. 28:525〜9)に至るまで、そして薬物輸送媒体
(タバタ(Tabata)ら、1991、「インビボマウス腫瘍細胞増殖に及ぼす組換え型
αインターフェロン-ゼラチン結合物の影響(Effects of recombinant alpha-in
terferon-gelatin conjugate on in vivo murine tumor growth)」、Cancer Re
s. 51:5532〜8)として、ますます生物学的に使用されている。広く研究されて
いるポリ乳酸/ポリグリコール酸コポリマーのような他の合成ポリマー系と比較
すると、ナノスフェア製剤のマイルドな条件は関心を引く。合成ポリマーナノス
フェアを製剤化するために用いられる溶媒留去およびホットメルト技術とは異な
り、複合体コアセルベーションは、有機溶媒との接触または熱のいずれも必要と
しない。また、受動的溶媒捕獲のみならず、直接の電荷-電荷相互作用によって 、核酸のような生体高分子を封入するためにも特に適している。
b以上の核酸分子を用いることができ、10 kbより大きい核酸分子さえも用いても
よい。典型的に、核酸は300塩基以上であり、典型的に0.5、1、2、5、または10
kb以上である。典型的に、核酸分子は200、100、または50 kbより小さくてもよ いと思われる。
下、腹腔内、髄腔内注射等に依存する。全身注射の場合、この輸送システムの特
異性は、血液に取り囲まれたナノスフェアへの標的の近づき易さによって影響を
受け、これはまた粒子の大きさの範囲によって影響を受ける。粒子の大きさは、
コアセルベーション混合液の温度、成分の濃度、およびpHによって影響を受ける
。粒子はまた、例えば、蔗糖密度勾配超遠心によってサイズを分画することがで
きる。150 ナノメートル未満の大きさの粒子は、ほとんどの血管壁に沿って並ぶ
有窓部を通過することによって間質空間にアクセスすることができる。そのよう
な条件下では、標的とすることができる細胞の範囲は広い。標的とすることがで
きる細胞の省略語の一覧には、肝類洞の実質細胞、結合組織の繊維芽細胞、膵臓
ランゲルハンス島の細胞、心筋細胞、腸の主細胞および壁側細胞、骨における骨
細胞および軟骨細胞、ケラチノサイト、末梢神経系の神経細胞、腎および肺の上
皮細胞、精巣のセルトリ細胞等が含まれる。0.2ミクロン以上の大きさの粒子の 標的は、主に血管分画に限定される。この場合、標的可能な細胞タイプには赤血
球、白血球(すなわち単球、マクロファージ、BおよびTリンパ球、好中球、ナチ
ュラルキラー細胞、前駆細胞、肥満細胞、好酸球)、血小板、および内皮細胞が
含まれる。
書において説明目的のために提供され、本発明の範囲を制限すると解釈されない
以下の特定の実施例を参考にすることによって得ることができる。
方向末端反復(AAV-ITR)の存在によって異なる2つのlacZ発現ベクターによっ て誘導される抗β-gal免疫応答を評価した。AAV-ITR(pCI-neo)を欠損する発現
ベクターに、p43-clacZのCMV-イントロンA-lacZ(CMV/lacZ)カセットを挿入し たところ、「裸の」DNAの筋肉内注射によって免疫したマウスでは、抗β-gal抗 体および反応したCTLの著しい減少を示した。高用量のDNA(100 mg)では、p43-
clacZベクターはなおpCI-clacZベクターより性能が優れていたが、反応の差は低
用量(1 mg)で認められる場合と比較すると有意に小さかった。pCI-clacZ上の
ネオマイシン抵抗性遺伝子(neo)を例外として、pCI-clacZとp43-clacZとの唯 一の差はCMV/lacZカセットに隣接するAAV-ITRである。neo遺伝子はlacZ遺伝子発
現に関与しないため、そしてそれを用いた研究において既知の免疫学的結果を有
しないため、これらの結果から、抗β-gal免疫学的反応に認められた差はAAV-IT
Rの存在が原因となる可能性があることを示唆している。293細胞について実施し
たリポフェクタミン試薬を用いたインビトロトランスフェクション実験から、こ
れら2つのベクターの遺伝子発現レベルに差はないことが示されており(データ
は示していない)、このことは、免疫応答の差が遺伝子発現レベルに関連しない
ことを示唆している。
方向末端反復(AAV-ITR)の存在によって異なる2つのlacZ発現ベクターによっ て誘導される抗β-gal免疫応答を評価した。AAV-ITR(pCI-neo)を欠損する発現
ベクターにp43-clacZのCMV-イントロンA-lacZ(CMV/lacZ)カセットを挿入した ところ、「裸の」DNAの筋肉内注射によって免疫したマウスでは、抗β-gal抗体 および反応したCTLの著しい減少を示した。高用量のDNA(100 mg)では、p43-cl
acZベクターはなおpCI-clacZベクターより性能が優れていたが、反応の差は低用
量(1 mg)で認められる場合と比較すると有意に小さかった。pCI-clacZ上のネ
オマイシン抵抗性遺伝子(neo)を例外として、pCI-clacZとp43-clacZとの唯一 の差はCMV/lacZカセットに隣接するAAV-ITRである。neo遺伝子はlacZ遺伝子発現
に関与しないため、そしてそれを用いた研究において既知の免疫学的結果を有し
ないため、これらの結果から、抗β-gal免疫学的反応に認められた差はAAV-ITR の存在が原因となる可能性があることを示唆している。293細胞について実施し たリポフェクタミン試薬を用いたインビトロトランスフェクション実験は、これ
ら2つのベクターの遺伝子発現レベルに差がないことを示し(データは示してい
ない)、このことは、免疫応答の差が遺伝子発現レベルに関連しないことを示唆
している。
。0、1.5、15 U IL-4/mg DNAのいずれかと共に合成したナノスフェアを、1群4
匹のマウスに2週間毎に筋肉内注射して全体で3回免疫した。4週目に実施した
マウス血清のELISAアッセイ法により、IL-4含有量を漸増させたナノスフェアを 投与した群では、漸増的に大きな抗β-gal抗体反応を示した(図2)。8週目で
は、これらのマウスからのリンパ球を用いて実施したCTLアッセイ法では、抗β-
gal CTL反応のIL-4用量に関連した減少を示した。IL-4の用量15 Uでは、抗β-ga
l CTL反応の完全な阻害が顕著に認められた。免疫学的作用が認められるIL-4の 用量、すなわち1〜15 U/ワクチン接種は、IL-4の免疫学的作用を得るために他 の研究において用いられてきた用量より2〜3次数低い用量を表すことに注意す
ること。この結果は、DNA-ゼラチンナノスフェアに封入した場合では、IL-4はよ
り低い用量で有効となりうることを示唆している。
用量のIL-4を含むナノスフェアをワクチン接種したマウスの免疫学的反応をさら
に特徴付けするために、リンパ球を回収して、β-gal蛋白質によって刺激し、次
にIL-4およびγ-INF産生に関して分析した。3日間培養血清について実施した標
準的なELISAアッセイ法によって、IL-4含有量を漸増させたナノスフェアで免疫 したマウスは、抗原による再刺激の際にこれに比例してより多くのIL-4を産生す
ることが判明した。これらの血清では、γ-INF産生の用量に関連した減少を認め
た。IL-4の産生は能動的に増殖するTh2ヘルパー細胞に関連するが、γ-INF産生 はTh1ヘルパー細胞に関連することから、ナノスフェアIL-4でワクチン接種した マウスではTh1ヘルパー細胞反応が抑制されているあいだにTh2ヘルパー細胞応答
が増強されたという結論が得られる。この結果は、抗β-gal抗体の用量に関連し
た増強およびCTL反応の同時阻害と併せて考慮すると、Th1強調反応からTh2強調 反応へのIL-4媒介免疫学的スイッチと一致する。
けるIL-4の有効性を、微小封入型または遊離型のいずれかとしてIL-4を含むナノ
スフェアをワクチン接種したマウスにおいて調べた。8週目(2回免疫後)のマ
ウス血清に関して実施したELISAアッセイ法から、遊離のIL-4と混合したナノス フェアを注射したマウスは抗β-gal抗体反応の増強を誘発することができなかっ
たことが示された(図3)。対照的に、ナノスフェアに封入したIL-4をワクチン
接種したマウスは抗体反応の著しい増強を示した。その上、同じIL-4用量の存在
下で「裸の」DNAを注射したマウスも、DNAのみをワクチン接種したマウスと比較
して免疫増強を生じることができない。データは、上記の実験において用いたIL
-4用量が、ナノスフェア封入型としての場合に限って抗体反応の増強に有効であ
ったことを示唆している。
否かを、ナノスフェア封入IL-2およびγ-INFのCTL反応に及ぼす作用を調べるこ とによってさらに証明した。p43-clacZ DNAのみ(総DNA2 mg)を含むナノスフ ェアをIL-2、またはIL-2およびγ-INFと共に単回注射によって免疫したマウスを
、4週目での抗β-gal CTL反応の生成に関して調べた。ナノスフェア単独または
裸のDNAによってワクチン接種したマウスのCTL反応は不良であった(図4)。こ
れは、強いCTL反応を得るためには少なくとも2または3回の免疫が必要である ことを示したわれわれのこれまでの研究と一致する。しかし、IL-2をナノスフェ
アに封入すると、CTL反応の増強を認めた。γ-INFをナノスフェアにおいてIL-2 と共に輸送すると、CTL反応は相乗的に増強された。IL-2およびγ-INFの双方を ナノスフェアに含めると、抗β-gal CTL反応は25%溶解(E:T比64:1で)から 、単回免疫での少なくとも65%まで改善した。
対する保護。陰性のセンスRNAウイルスであるエボラウイルスは、重度の出血性 発熱を引き起こし、感染したヒトにおける死亡率は高い。われわれは、エボラウ
イルスのリボヌクレオカプシドNP蛋白質(Ebo NP)および外膜GP糖蛋白質(Ebo
GP)抗原をコードするDNAによるナノスフェアワクチン接種の有効性を調べた。 これまでのDNA免疫試験から、Ebo NP抗原の保護的有効性がCTL反応と相関するこ
とが示唆されているが、Ebo GP抗原に関連した保護は強い抗体反応およびCTL反 応の双方に関連している。エボラNPまたはエボラGPをコードするナノスフェアDN
A 0.5μgまたは3μgをワクチン接種したマウスに、マウスに適合させた生存エボ
ラザイール株のLD50の30倍量を投与した。生存率はそれぞれの抗原に関してベク
ター対照より大きく、より高用量では有意に大きかった(p<0.01)(図5)。 エボラNPワクチン接種では、エボラGPより大きい程度の保護が得られた(90%対
40%)。免疫したマウスの抗GPまたは抗NP抗体力価の幾何平均は低く、1±0.1 ×102であった。DNAナノスフェアによるワクチン接種は、遺伝子銃ワクチン接種
法と少なくとも同程度有効であった。NP抗原をパワージェクト-Xr(登録商標) 遺伝子銃DNA(用量3μg、ワクチン接種全3回)として用いた平行投与実験は、
80%の保護レベルを示した。
スフェアに基づく遺伝子ワクチン輸送の有効性を証明した。生存エボラウイルス
LD50の30倍量の投与に対して認められた保護は、核蛋白質抗原による免疫後では
外膜糖蛋白質抗原の場合より大きかった。この知見は、予想されるように、核蛋
白質ペプチドが、外膜蛋白質の場合よりも細胞障害性エピトープとしてより大き
く提示されることを反映する可能性がある。類似のレベルの保護は、同量のエボ
ラDNAによる遺伝子銃免疫によって得られており、これらの技術のいずれかによ って、製剤、投与し易さ、安全性、免疫調節物質の同時輸送、およびDNAの保護 を含む、ワクチンシステムの重要な特徴に関して、有効なワクチンを開発するこ
とができるか否かをなお決定する必要がある。しかし、本研究の結果は、ナノス
フェアが、特定の免疫応答表現型を必要とする疾患状態において特に価値がある
DNAワクチン輸送システムの重要な新しいタイプとなる可能性があることを示唆 している。
NA-ゼラチンナノスフェアを、異なる含有量のマウスIL-4と共に合成し(コアセ ルベート反応に加えた0、100、および1000 Uとして示す)、その後精製して、CT
-4S細胞と共にインキュベートした。ナノスフェアを加えて30時間後、細胞を3H-
チミジンによって標識し、次に細胞に関連した放射活性を18時間後に測定した。
ナノスフェアの用量は総DNAとして示す。データポイントは1試料あたり3個の 平均値±S.D.である。
L-4/μg p43-clacZ DNAのいずれかと共に合成したDNA-ゼラチンナノスフェアを 、1群4匹のマウスに2週間間隔で筋肉内注射して全体で3回免疫した。抗β-g
al IgG抗体反応に関するELISAアッセイを、4週目でのプールしたマウス血清に ついて実施した(2回免疫後)。8週目、それぞれの群の脾臓およびリンパ節か
らリンパ球を回収してプールし、CTLアッセイを行って、抗β-gal反応を調べた 。a) 抗β-gal抗体反応、b) 抗β-gal CTL反応。結果は1試料あたり3個の平均
値±S.D.である。
る抗β-gal抗体反応。1群4匹のマウスに、遊離IL-4 20 Uと混合したナノスフ ェア、20 U IL-4/1 mg p43-clacZ DNAを封入したナノスフェア、DNA、または遊
離IL-4 20 Uと混合したDNAを筋肉内注射した。それぞれの群を総DNA 1 mgによ って4週間間隔で2回ワクチンを接種した。8週目に、個々の群からの血清をプ
ールして、その後IgG抗β-gal抗体の全量に関してアッセイした。データは試料 あたり3個の平均値±S. D.である。
たナノスフェア、IL-2およびγINF(100 U/1 mg p43-clacZ-DNA)を封入したナ
ノスフェア、または「裸の」DNAのいずれかとして全体でp43-clacZ DNA2 mgを 1回筋肉内注射した。標準的なCTLアッセイを4週目に実施した。データは平均 値±S.Dである。
NAによるワクチン接種の後にエボラウイルスを感染させたマウスの生存。8週齢
のBALB/cマウス(1群10匹)に、エボラNP pDNA 0.5 μg(白い四角)もしくは 3μg(黒い四角);エボラGP pDNA 0.5 μg(白丸)もしくは3μg(黒丸); または対照WRG7077 pDNA3μg(白い三角)(Ebo NPもしくはGP遺伝子インサー トを含まないベクター)を含むナノスフェアを1ヶ月に1回3回、前脛骨筋に注
射して免疫した。マウス適合エボラウイルス投与システムおよびエボラpDNAベク
ター構築物は、バンデルザンデン(Vanderzanden)、1998、Virology 246:134 〜144に詳細に記述されている。生存率は、12週目にマウス適合生存エボラザイ ールウイルスのLD50の30倍量を投与した後に作表した。10日以降では死亡は認め
られなかった。
Claims (27)
- 【請求項1】 ポリマー陽イオンおよび多価陰イオンのコアセルベートを含
む、哺乳動物を遺伝子免疫するための5μm未満の固体ナノスフェアであって、 多価陰イオンが核酸を含み、核酸の少なくとも一部が抗原をコードし、およびサ
イトカインがコアセルベートに封入されているナノスフェア。 - 【請求項2】 ポリマー陽イオンがゼラチンである、請求項1記載のナノス
フェア。 - 【請求項3】 ポリマー陽イオンがキトサンである、請求項1記載のナノス
フェア。 - 【請求項4】 細胞ターゲティングリガンドがナノスフェアに結合している
、請求項1記載のナノスフェア。 - 【請求項5】 ターゲティングリガンドがグルタルアルデヒドクロスリンク
によってナノスフェアに共有結合している、請求項2記載のナノスフェア。 - 【請求項6】 核酸の少なくとも一部がサイトカインをコードする、請求項
1記載のナノスフェア。 - 【請求項7】 ポリマー陽イオンがキトサンである、請求項1記載のナノス
フェア。 - 【請求項8】 サイトカインが、GM-CSF、TNF-α、IL-12、IL-4、γ-IFNお よびその組合せからなる群より選択される、請求項1記載のナノスフェア。
- 【請求項9】 抗原がウイルス抗原である、請求項1記載のナノスフェア。
- 【請求項10】 抗原が細菌抗原である、請求項1記載のナノスフェア。
- 【請求項11】 抗原が腫瘍関連抗原である、請求項1記載のナノスフェア
。 - 【請求項12】 抗原もコアセルベートに封入されている、請求項1記載の
ナノスフェア。 - 【請求項13】 抗原に対する免疫応答を誘導するように哺乳動物を免疫す
る方法であって、以下の段階を含む方法: ポリマー陽イオンおよび多価陰イオンのコアセルベートを含む5μm未満の固 体ナノスフェアを哺乳動物に投与する段階であって、該多価陰イオンが抗原をコ
ードする核酸を含み、サイトカインがコアセルベートに封入されている段階。 - 【請求項14】 ポリマー陽イオンがゼラチンおよびキトサンからなる群よ
り選択される、請求項13記載の方法。 - 【請求項15】 投与が筋肉内注射によって行われる、請求項13記載の方法
。 - 【請求項16】 投与が皮下注射によって行われる、請求項13記載の方法。
- 【請求項17】 投与が高圧遺伝子銃からのナノスフェアの衝突によって行
われる、請求項13記載の方法。 - 【請求項18】 哺乳動物を免疫するための固体ナノスフェアを形成する方
法であって、以下の段階を含む方法: 抗原をコードする核酸を含む多価陰イオンおよびポリマー陽イオンのコアセル
ベーションによって固体ナノスフェアを形成する段階であって、該ポリマー陽イ
オンがキトサンおよびゼラチンからなる群より選択され、該コアセルベーション
がサイトカインの存在下で行われ、それによってサイトカインが該固体ナノスフ
ェアに封入される段階。 - 【請求項19】 以下の段階をさらに含む、請求項18記載の方法: 細胞ターゲティングリガンドをナノスフェアにクロスリンクさせる段階。
- 【請求項20】 コアセルベーションが硫酸ナトリウムの存在下で行われる
、請求項18記載の方法。 - 【請求項21】 ポリマー陽イオンがゼラチンである、請求項18記載の方法
。 - 【請求項22】 ポリマー陽イオンがキトサンである、請求項18記載の方法
。 - 【請求項23】 ターゲティングリガンドが抗体、ホルモン、細胞接着分子
、糖、薬剤および神経伝達物質からなる群より選択され、ナノスフェアの表面に
結合している請求項18記載の方法。 - 【請求項24】 コアセルベーション段階においてゼラチンが約2〜7%の
濃度で存在する、請求項18記載の方法。 - 【請求項25】 コアセルベーション段階において核酸が1 ng/ml〜500 μ
g/mlの濃度で存在する、請求項18記載の方法。 - 【請求項26】 コアセルベーション段階において硫酸ナトリウムの濃度が
約7〜43 mMである、請求項18記載の方法。 - 【請求項27】 核酸が2〜10 kbの遺伝子をコードする、請求項1記載の ナノスフェア。
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