JP2005505746A - レアイベント検出システム - Google Patents
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Abstract
標的物体の異なる部分の示差的な蛍光標識によって、多数の候補物体を有する検体フィールド内の標的物体を検出する方法を開示する。蛍光団の使用者によって提供される柔軟性により、任意の稀な標的物体の高い効率および精度での迅速な検出が可能になる。
Description
【背景技術】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2001年2月2日に提出された「レアイベント検出システム（Rare Event Detection Sysem）」と題する米国特許出願第60／265,909号の利点を請求するものであり、この出願はその全体が参照として本明細書に組み入れられる。
【０００２】
連邦政府の資金援助を受けた研究としての申告
本発明は、米国立衛生研究所（National Institutes of Health）からの助成金（第CA13849号）により、連邦政府からの資金を受けてなされたものである。政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
発明の背景
ヒトの癌のほとんどは正常および／または異常な遺伝子の異常発現を特徴としており、癌細胞に自然淘汰が作用することによって増殖制御の喪失、血管新生、浸潤および転移が引き起こされる。このため、患者の試料中の特定の表現型の癌細胞を検出することができれば、医療提供者に対して有意義な情報がもたらされる。例えば、転移性癌細胞が体内に検出されれば、医療専門家はその患者に対してより積極的な治療法を検討すると考えられる。
【０００４】
癌マーカーの発現に依拠した癌細胞の検出方法は一般に、長く手間がかかり、時には費用もかかる免疫組織化学または核酸ハイブリダイゼーションの手順を必要とし、研究所には広く普及しているが、診療施設ではそれほど利用しやすくない。さらに、多くの場合、スクリーニングされる個々のマーカーは、癌の進行の後期になって初めて、または検出可能なレベルとして産生されるため、早期発見の恩恵が得られる機会を逃してしまう。現在の技術では、1百万分率（すなわち、100万個の他の細胞の中に癌細胞が1個の割合）程度の微小転移を検出することも可能であるが、癌によっては、この検出レベルでも真の「早期発見」には不十分である。検出感度のレベルがさらに上がれば、癌細胞の増殖に対する適切でより効果的な介入を可能にし、それによってより効果的かつ適時な癌治療および疾患修飾療法が可能になるような癌細胞の検出能が効果的に得られると考えられる。したがって、診療施設での使用により適した、迅速で、効率的で、信頼性が高く、感度の高い検出方法に対しての需要がある。
【０００５】
戦場での生物兵器（BW）の検出にも同様の問題があり、すなわち、多数の粒子の中の稀な粒子（例えば、毒素またはウイルス）を検出するために適した方法も装置もない。生物兵器は、意図的に用いられると他のものに危害を及ぼす、細菌およびウイルスまたは関連毒素などの感染因子として定義され、長きにわたって人類とともに存在してきた。矢尻が、毒素を含む植物もしくは動物の抽出物；またはガス壊疸菌クロストリジウム-パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）の源であってしばしば破傷風菌C.テタニ（C. tetani）の源でもある糞便もしくは腐りかけの肉に浸されていることからみて、これらはおそらく元々は先史時代に用いられていたと思われる。BWが記録に初めて現れたのは紀元前6世紀と古く、この時期にアッシリア人が敵の井戸を麦角で汚染させている；同じくアテネのソロンはクリッサ（Krissa）包囲攻撃時に下剤性薬草ヘレボルス（ザゼンソウ）を用いて給水路を汚染させた；ローマ人および他の多くの者も同様の戦略を用いている；14世紀には蒙古人が包囲中のカッファの城壁の向こう側に疫病感染者の死体を射出機で投げ込んでおり、この出来事は欧州全域に波及した黒死病流行のきっかけになった可能性もある。BWの未成熟な用い方やより精巧な使用の例は他にも数多く、20世紀後半までに至っている。
【０００６】
現在では基礎微生物学および応用微生物学の進歩に伴い、熟練した科学者が、極めて病毒性の強い病原体および毒素を兵器として利用することが可能になっている。いくつかの国（米国を含む）は20世紀中の何らかの時点でBW計画を策定しているが、おそらく最も知られているのは日本および旧ソ連での取り組みであろう。日本陸軍は1932年から第二次世界大戦終了時まで、中国に駐屯した「731部隊」を通じて生物兵器の研究に携わった。ヒト被験者（中国およびロシアの民間人、ならびに米国、英国、中国、韓国およびロシアの捕虜）を対象にさまざまな病原体を用いた研究が行われ、これには炭疽、鼻疽、ペスト、腸チフス、パラチフスAおよびB、チフス、痘瘡、野兎病、伝染性黄疸、ガス壊疽、破傷風、コレラ、赤痢、猩紅熱、波状熱、ダニ脳炎、百日咳、ジフテリア、肺炎、性病、結核およびサルモネラが含まれていた。ソ連の計画は1928年に始まり、統治機関であった革命軍事評議会がチフス菌の形質転換株を戦場兵器として投入する非公開決議に署名している。1930年代には、北極のソロベツキー島にある施設の研究員がチフス、Q熱、鼻疽および類鼻疽の研究に携わっている。ソ連は1973年から少なくとも1990年代初期に至るまで、既存の生物兵器を近代化し、大陸間戦争に用いる強力な兵器として利用できると考えられる抗生物質およびワクチンに耐性のある遺伝子改変病原体を開発することを目標とする計画を実施していた。研究対象の病原体には、炭疽、野兎病、ペスト、鼻疽、痘瘡、エボラ出血熱、マールブルグ病、マチュポウイルス、フニンウイルスおよびベネズエラウマ脳炎が含まれる。
【０００７】
我々の社会のような開かれた社会は、まさにその本質により、国際的集団および国内集団の双方からのテロリストの攻撃を受けやすい。このような現状からみて、生物兵器による攻撃を予期して回避するため、または標的集団（軍隊または民間人）の防御を通じてそれらを無効にするために、有効な対抗手段を開発することはまさに急務である。
【０００８】
生物兵器にはそれを特に手強いものにしている独特な特徴が二、三ある。その一つは、能力のある微生物学者および機械技師を含む少人数のチームがさまざまな病原体（細菌、ウイルスまたは毒素）を増殖させて抽出し、有効な分散系を構築することに障壁がほとんどない点である：15フィート×15フィートの空間があり、10,000ドル分の装置があれば立派な生物兵器工場を建設できると推定されている。このため、BWは、敵対側に大量の犠牲者を出すことをもくろんでテロを狙う集団が選ぶ手段となっている。また、場合によっては攻撃の成果が伝染のために最初の攻撃の範囲を地理的にも時間的にもはるかに上回ることもある。さらに、BW病原体の被害者に対する作用は数時間、通常は数日間遅れることが一般的であるため、この期間中は攻撃を顕在化させずに続けられるほか（加えて、攻撃者が逃亡する機会も生じ、これは秘密裡に活動するテロリストにとってもう1つの利点となる）、種々のBW病原体への感染の初期症状は流感様であるため、BW攻撃をそれとして直ちに認識することが極めて困難になる。
【０００９】
このため、免疫のない集団に対する生物兵器攻撃に我々が効果的に対応できるかどうかは、環境内のBW病原体を、空気伝染性（室内および室外）および水系伝染性の別なく、疾患の大発生の前に迅速に検出するための新たな手法を開発することに大きくかかっている。また、臨床症状の出現前にヒトの体液中、例えば血液中の病原体を早期発見することが重要な、時間域（time window）も存在する。
【００１０】
理論的には、あらゆる病原体を生物兵器として用いることが可能である。しかし、いくつかの特徴のために、生物体または細菌毒素などの生物由来の生物活性物質（BDBS）は大量破壊用の兵器として特に適している。これらの病原体は以下のものでありうる：1）感染性、伝染性および毒性が高い（すなわち、低レベルの曝露であっても疾患を引き起こす）；2）大気中などに効率的に分散する；3）容易に増殖し、大量に生産される；4）保存下で安定である；5）環境条件、例えば長期的な影響に対する耐性がある；および6）抗生物質、抗体、他の薬剤などの投与に対する耐性がある。
【００１１】
多数の天然の病原体のほかに、遺伝的に改変されたBW病原体も加えるべきであろう。この種の病原体は、新たな疾患さえも生み出すほど（例えば、「脳痘（brainpox）」ウイルスをもたらすなど）より強力なものとして、または既存の対抗手段に対する耐性のある病原体を産生するように作製されているため特に恐ろしい。これらは予測できないため、特に障害となる。
【００１２】
上記の理由から、BW病原体を用いた秘密裡の攻撃を発見して評価することは（諜報活動がなければ）極めて困難と考えられる。現時点では公式の環境監視システムが存在しないため、攻撃が行われたとの最初の知見は、多くの場合、犠牲者が救急治療室に続々と運ばれだし、疾患の大発生が認識されてはじめて得られると考えられる。言うまでもなく、これでは遅すぎる。病原体の古典的な監視方法は、増殖培地環境試料の採取（大気、給水）または体液試料の採取（血液、尿、喀痰など）を行って試料を培養し、その後に原因を同定するために一連の微生物学検査を行うことを含む。培養が容易な作業ではない（例えば、ウイルス用の場合）という事実に加えて、この種の手順は適時に警告を得るには時間がかかりすぎる。考えられる他の分析方法には、生化学アッセイ、イムノアッセイ、「ジーンチップ（GeneChip）」スクリーニングおよびポリメラーゼ連鎖反応（PCR）が含まれるが、これらは最初の試料には存在しない可能性のある量の不純物質を必要とし（現実の脅威に見合った感度を満たすため）、このために培養がやはり必要と思われる；PCRでさえも単一の細菌またはビリオンからは現実的ではない。
【発明の開示】
【００１３】
発明の概要
本発明は、レアイベント（rare event）またはマーカーの存在の検出をもたらす技術に基づく。本発明は、ごく少量のレアイベントまたはマーカーの存在の同定、特徴分析（定量的、定性的またはその両方）、分析または判定を行うための装置および方法に関する。このようなレアイベントまたはマーカーの有無の判定、ならびにこのようなレアイベントまたはマーカーの定量化は、有毒な、または有害な可能性のある実体または状態の早期発見に有用であり、それらが後期ではなく早期に同定されれば、適切な対応、治療または他の介入計画もしくはプロトコールの適用が可能になる。レアイベントには、正常なイベント（例えば、正常な生理的状態下に存在する標的の物体（body）または細胞の有無）および異常なイベント（疾患、疾患症状または遺伝異常に伴うものといった、異常な生理的状態下に存在する標的の物体または細胞の有無）の両方が含まれる。現在の診断方法、特に癌に関するものに伴う1つの問題は、微小残存病変に関する。これはすなわち、疾患細胞または他の疾患マーカー（例えば、核酸、タンパク質、細胞表面受容体）のレベルが現在の検出方法にとっては低すぎるが、診断または治療を行わずに放置すればその後に増殖、アップレギュレーションまたは疾患の再発が起こる可能性は十分にある場合のことである。このため、多くの場合には、疾患リスク（すなわち、癌、関節硬化、中枢神経系疾患など）をより時機を逃さずに同定できれば、より早期の治療が可能になり、それがより効果的な治療につながると考えられる；または、集団に対するリスク（すなわち、生物兵器の病原体）をより早期に同定することが、曝露ならびにより多くの集団に対するそのリスクの歯止めのない波及および分散を最小限に留めることが可能になる点から望ましい。
【００１４】
本発明は、大規模な細胞集団における稀な癌細胞を検出する高感度かつ効率的な方法の発見に基づく。さらに、本明細書に組み込まれる癌細胞検出システムは、候補物体の大集団内のほぼあらゆる稀な標的物体を、同定しようとする個別の標的物体に合わせて調整したこのシステムによって検出しうるとの認識をもたらした。本発明の方法およびシステムは、検出しようとする標的物体を各サブセットが含む、大規模集団のサブセットと特異的に結合する蛍光標識に依拠している。標的物体とは、同定しようとする（例えば、標的物体に対する直接的なもの、または標識を標的物体と結合もしくは相互作用する分子と結合させるといった間接的なものを含む、標識による）、検体フィールド（specimen field）内の任意の物体（例えば、細胞、病原体、ウイルス、毒素、プリオン）のことである。候補物体とは、分析しようとする、検体フィールド内の任意の物体（例えば、細胞、病原体、ウイルス、毒素、プリオン）のことである。
【００１５】
したがって、本発明は、検体（specimen）中の標的物体（target body）（例えば、癌細胞）を検出するための方法であって、第1の蛍光団が光子を第1の波長で放出し、第2の蛍光団が光子を第2の波長で放出する、少なくとも第1の蛍光団および第2の蛍光団に対して曝露された、またはそれらによって標識された検体フィールド（例えば、ガラス表面上に塗布した末梢血液単核細胞（PBMC）または骨髄細胞）を入手すること；検体フィールドに、第1および第2の蛍光団を励起するのに十分な光を照射すること；検体フィールドを第1の光子源に関して第1の波長で、また第2の光子源に関して第2の波長で走査すること；第2の波長の光子を実質的に遮断するが第1の波長の光子は許容する光学または電子フィルターを介して生成された第1の画像である、検体フィールドの各位置での第1の画像を収集および記録すること；検体フィールド内部の対応する位置の索引付けを行うこと；第1の波長の光子を実質的に遮断するが第2の波長の光子は許容する光学または電子フィルターを介して生成された第2の画像である、検体フィールドの各位置での第2の画像を収集および記録すること；検体フィールド内部の対応する位置の索引付けを行うこと；ならびに、検体フィールド内部の単一の位置での第1の画像および第2の画像を検索（retrieve）および検査（inspect）すること、を含む方法を特徴とする。第1および第2の画像の単一の位置に候補物体が存在することにより、検体中に標的物体が存在することが示される。異なる蛍光シグナルの画像を、イベントが陽性であることの確認のため、または表現型の評価のために重ね合わせることができる。2回の走査は独立に行うことができる。
【００１６】
第1の蛍光団は、DNAと特異的に結合するDAPIなどの化合物、またはRNAと特異的に結合するアクリジンオレンジなどの化合物でありうる。第2の蛍光団は、サイトケラチンなどの癌細胞マーカーまたは別のマーカーと特異的に結合する分子（例えば、抗体または核酸）と結合させることができる。
【００１７】
いくつかの態様においては、レアイベントの検出の特異性を高めるため、または標的物体の複数のサブセット、例えば癌細胞およびウイルスを検出するために検体フィールドを第3の蛍光団で標識することができ、本方法はさらに、第3の波長で光を放出する第3の蛍光団を励起するのに十分な光を検体フィールドに照射すること；検体フィールドを第3の光子源に関して第3の波長で走査すること；検体フィールド内部の各々の第3の源の位置を登録すること；第1および第2の波長の光子を実質的に遮断するが第3の波長の光子は許容する光学または電子フィルターを介して生成された第3の画像である、検体フィールドの各位置での第3の画像を収集および記録すること；各々の第3の画像を検体フィールド内部の対応する位置に対して索引付けすること；ならびに検体フィールド内部の単一の位置での第3の画像の検索および検査を行うことを含みうる。単一の位置での第1、第2および第3の画像に候補物体が存在することにより、標的物体の存在が示される。第3の蛍光団は、上皮細胞接着分子（例えば、Ep-CAM）またはジシアロ-ガングリオシド抗原（例えば、GD2）などの第2の癌細胞マーカーと特異的に結合する分子（例えば、抗体）と結合させることができる。
【００１８】
本方法はさらに、第1の画像を生じた検体フィールド内の位置の総数を算定すること、第1の画像および第2の画像をいずれも生じた検体フィールド内の位置の総数を算定すること、または第1、第2および第3の画像を生じた検体フィールド内の位置の総数を算定することを含みうる。これに加えて、本方法は、第1の画像および第2の画像を検体フィールド内部の別の単一の位置で検査することを含むことができ、この別の方の単一の位置で第1の画像および第2の画像に候補物体が存在することにより、異なる標的物体の存在が示される。
【００１９】
本発明はさらに、以下のものを含む検出システムを特徴とする：検体フィールドを収容するための架台（stage）；検体フィールド内部の位置の画像を収集するために配置および構成された検出器（例えば、顕微鏡）；第1の蛍光団を第1の励起波長で励起するのに十分であって第2の蛍光団を第2の励起波長で励起するのに十分な光を検体フィールドに照射するために配置および構成された光源；検出器（例えば、顕微鏡）に取り付けられたカメラであって、（1）第2の蛍光団の第2の発光波長の光子を実質的に遮断するが第1の蛍光団の第1の発光波長の光子は許容する光学または電子フィルターを介して、検体フィールド内のある位置の第1の画像を取り込むため、および（2）第1の発光波長の光子を実質的に遮断するが第2の発光波長の光子は許容する光学または電子フィルターを介して、検体フィールド内のその位置の第2の画像を取り込むために配置および構成されたカメラ；ならびに、第1の画像および第2の画像を記録して、第1の画像および第2の画像を検体フィールド内部の対応する位置に対して索引付けするコンピュータであって、使用者による要求に応じて、対応する位置に関する第1の画像および第2の画像を表示するコンピュータ。
【００２０】
架台は3つの直交軸に関して動かすことができ、3つの軸の少なくとも2つでアドレス指定が可能である。または、カメラ、またはカメラおよび／もしくは画像取り込み装置を含む筐体は、3つの直交軸に関して動かすことができ、3つの軸の少なくとも2つでアドレス指定が可能である。カメラは、第1および第2の画像を取り込むための電荷結合素子、または第1および第2の画像の取り込みに用いるための多数の光学フィルターを含みうる。光学フィルターの代わりに、またはそれとともに、カメラまたはコンピュータは電子フィルターを含みうる。このようなフィルターは、一定範囲の波長（例えば、可視波長）で入手したデジタル化カラー画像を分解し、特定の波長またはより狭い範囲の波長で生成される画像にすることができる。
【００２１】
もう1つの面において、本発明は、少なくとも第1の蛍光団によって標識された検体フィールドであって、第1の蛍光団が光子を第1の波長で放出するような検体フィールドを入手すること；第1の蛍光団を励起するのに十分な光を検体フィールドに照射すること；検体フィールドを第1の光子源に関して第1の波長で低倍率で走査すること；検体フィールドの各位置での第1の画像を収集および記録すること；各々の第1の画像を検体フィールド内部の対応する位置に対して索引付けすること；ならびに検体フィールド内部の単一の位置での第1の画像の検査を行うこと、によって検体中の標的物体を検出する方法であって、その単一の位置で第1の画像に候補物体が存在することによって検体中に標的物体が存在することが示されるような方法を特徴とする。
【００２２】
本発明の方法およびシステムは、100万個の健常細胞の中にある1個の稀な癌細胞というような（これは本発明によって達成しうる感度のレベルである）、候補物体の大集団内にある稀な標的物体を迅速、高感度かつ効率的に検出することが可能である。本明細書の方法およびシステムは、約0.1百万分率程度、または相応する形でより有利には、約0.05、約0.03もしくは約0.01百万分率程度の検出レベルを可能にする。
【００２３】
1つの面において、本発明は、検体中の標的物体の有無を検出する方法であって、
少なくとも第1の蛍光団および第2の蛍光団に対して曝露された、またはそれらによって標識された検体フィールドを入手すること、この際、第1の蛍光団は光子を第1の波長で放出し、第2の蛍光団は光子を第2の波長で放出する；
検体フィールドに第1および第2の蛍光団を励起するのに十分な光を照射すること；
検体フィールドを第1の光子源に関して第1の波長で、また第2の光子源に関して第2の波長で低倍率で走査すること；
検体フィールド内部の各々の第1の源および各々の第2の源の位置を登録すること；
第2の波長の光子を実質的に遮断するが第1の波長の光子は許容する光学または電子フィルターを介して生成された第1の画像である、検体フィールドの各位置での第1の画像を収集および記録すること；
第1の波長の光子を実質的に遮断するが第2の波長の光子は許容する光学または電子フィルターを介して生成された第2の画像である、検体フィールドの各位置で高倍率の第2の画像を収集および記録すること；
各々の第1の画像および各々の第2の画像を検体フィールド内部の対応する位置に対して索引付けすること；ならびに
検体フィールド内部の単一の位置での第1の画像および第2の画像を検査すること、を含み、
単一の位置での第1および第2の画像に候補物体が存在することにより、検体中に標的物体が存在することが示されるような方法である。
【００２４】
もう1つの面において、本発明は、検体フィールドの調製が、
a．細胞試料を可溶化して試料混合物を得ること；
b．試料混合物を遠心すること；
c．試料混合物から上清を分離すること；
d．この結果得られた細胞のペレットを生理的緩衝液中に再懸濁すること；
e．細胞を接着性スライドに対してプレーティングすること；
f．細胞培養液をスライドに対して添加すること、
を含む、本明細書中の任意の方法であって、
検体フィールドの調製がさらに、
段階dの後に、細胞混合物の希釈物を作製すること、希釈物を死細胞に対する感受性のある色素で処理すること、用いるスライドの試料細胞密度を決定するために細胞数算定を行うことを含む方法である。
【００２５】
他の面において、本方法は、以下であるような本明細書中の任意のものである：標的物体が、癌細胞、上皮細胞、平滑筋細胞、樹状細胞、記憶T細胞、記憶B細胞、体細胞、正常細胞、異常細胞または幹細胞である；システムが、少なくとも1,000,000個の細胞がある検体フィールド内の少なくとも1つの標的細胞を検出しうる；システムが、少なくとも25,000,000個の細胞がある検体フィールド内の少なくとも1つの標的細胞を検出しうる；システムが、少なくとも50,000,000個の細胞がある検体フィールド内の少なくとも1つの標的細胞を検出しうる；システムが、少なくとも100,000,000個の細胞がある検体フィールド内の少なくとも1つの標的細胞を検出しうる；記録が少なくとも1024×1024ピクセルアレイの画像を含む；または、記録が少なくとも1600×1600ピクセルアレイの画像を含む。
【００２６】
他の面において、本方法は、以下であるような本明細書中の任意のものである：フィールドの検体が大多数の細胞種として白血球を含む；フィールドの検体が不均一な細胞種を含む；フィールドの検体がマクロファージを含む；検体フィールドが環境試料である；光が紫外光、赤外光または可視光である；標的物体が癌細胞であり、検体フィールドがガラス表面上に塗布された白血球または骨髄細胞である；第1の蛍光団が、DNAと特異的に結合する化合物である；第2の蛍光団が、癌細胞マーカーと特異的に結合する分子と結合している；癌細胞マーカーがサイトケラチンである；癌細胞マーカーが細胞質中に存在する；癌細胞表面マーカーが上皮細胞接着分子である；癌細胞表面マーカーがジシアロ-ガングリオシド抗原である；第1の画像を生じた検体フィールド内の位置の総数を算定することをさらに含む；第1の画像および第2の画像をともに生じた検体フィールド内の位置の総数を算定することをさらに含む；第1、第2および第3の画像を生じた検体フィールド内の位置の総数を算定することをさらに含む；第1の画像および第2の画像を検体フィールド内部の別の単一の位置で検査することをさらに含み、この別の方の単一の位置で第1の画像および第2の画像に候補物体が存在することによって別の標的物体の存在が示される。
【００２７】
もう1つの面において、本発明は、
検体フィールドを収容するための架台；
ある所定レベルおよび所定レベルの1つまたは複数の追加的な倍率で、検体フィールド内部の位置の画像を収集するために配置および構成された検出器；
第1の蛍光団を第1の励起波長で励起するのに十分であって第2の蛍光団を第2の励起波長で励起するのに十分な光を検体フィールドに照射するために配置および構成された光源；
検出器に取り付けられたカメラであって、（1）第2の蛍光団の第2の発光波長の光子を実質的に遮断するが第1の蛍光団の第1の発光波長の光子は許容する光学または電子フィルターを介して、検体フィールド内のある位置の第1の画像を取り込むため、および（2）第1の発光波長の光子を実質的に遮断するが第2の発光波長の光子は許容する光学または電子フィルターを介して、検体フィールド内のその位置の第2の画像を取り込むために配置および構成されたカメラ；ならびに
第1の画像および第2の画像を記録して、第1の画像および第2の画像を検体フィールド内部の対応する位置に対して索引付けするコンピュータであって、使用者による要求に応じて、対応する位置に関する第1の画像および第2の画像を表示するコンピュータ、
を含む検出システムである。
【００２８】
他の面において、本システムは、以下であるような本明細書中の任意のものである：架台が3つの直交軸に関して動かすことができ、3つの軸の少なくとも2つでアドレス指定が可能である；カメラが、第1および第2の画像を取り込むための電荷結合素子を含む；カメラが多数の光学フィルターを含む；検出器が1024×1024ピクセルアレイの画像を含む；検出器が1600×1600ピクセルアレイの画像を含む；または、検出器がA×Bピクセルアレイの画像を含む、ここでAおよびBはそれぞれ独立に1000から1,000,000までの整数である。
【００２９】
本発明はまた、細胞の検体フィールド内の生物兵器（biological agent）細胞に関する分析のための方法であって、
i）検体フィールドを、生物兵器細胞を特定する第1の蛍光団によって処理すること；
ii）検体フィールドを、生物兵器細胞を特定する第2の蛍光団によって処理すること；
iii）検体フィールドに、第1の蛍光団に光子を放出させるのに適した光を照射すること；
iv）検体フィールドに、第2の蛍光団に光子を放出させるのに適した光を照射すること、
v）生物兵器細胞である、光子を放出する検体フィールド内の細胞を同定すること、
を含む方法にも関する。
【００３０】
もう1つの面において、本発明は、検体フィールド内の細胞の調製が、
a．試料混合物を遠心すること；
b．試料混合物を再懸濁すること；
c．細胞を接着性スライド上にプレーティングすること；
d．スライドを固定剤（パラホルムアルデヒド）で処理すること；
e．スライドを透過化剤（トリトン（Triton））で処理すること；
f．スライドをプレハイブリダイゼーション溶液で処理すること；
g．スライドを、蛍光団を有するハイブリダイゼーション溶液で処理すること；
h．スライドを蛍光色素で処理すること、を含み、
検体フィールドを、生物兵器細胞を特定する1つまたは複数の追加的な蛍光団によって処理すること、および検体フィールドに、1つまたは複数の追加的な蛍光団に光子を放出させるのに適した光を照射すること、
をさらに含む、本明細書中の任意の方法である。
【００３１】
他の面において、本発明は、以下のような本明細書中の任意の方法に関する：少なくとも1つの蛍光団が生物兵器細胞のDNAを特定する；少なくとも1つの蛍光団が、生物兵器細胞の表面と結合する分子を特定する；少なくとも1つの蛍光団が生物兵器細胞のDNAを特定し、少なくとも1つの蛍光団が生物兵器細胞の表面と結合する分子を特定する；または、生物兵器が細菌、リケッチア、ウイルス、真菌もしくはプリオンである。
【００３２】
もう1つの面において、本発明は、以下のような本明細書中の任意の方法である：検体フィールドの調製が、
a．血液試料を塩化アンモニウム溶液で可溶化すること；
b．試料混合物を遠心すること；
c．上清の塩化アンモニウム溶液および赤血球を分離すること；
d．この結果得られた白血球のペレットをPBS中に再懸濁すること；
e．試料混合物を遠心すること；
f．この結果得られた白血球のペレットをPBS中に再懸濁すること；
g．段階fの細胞混合物、トリパンブルーおよびPBSの希釈物を作製すること；
h．細胞を接着性スライド上にプレーティングすること；
i．細胞培養液をスライドに対して添加すること、を含み、
さらに、1つの蛍光団が標的細胞でない細胞を特定する。他の面において、本方法は、本方法が1つの検体フィールドに対して60分未満で完了する；または本方法が1つの検体フィールドに対して10分未満で完了するようなものである。
【００３３】
他の面において、本発明は、移植臓器提供者を標的物体の有無に関してスクリーニングするための方法であって、検体フィールドが臓器提供者から採取された試料（例えば、血液試料、組織試料）である、本明細書中の任意の方法を含む方法である。これは、提供者における標的物体を移植の前に同定し、それによって被提供者への物体の波及を防ぐのに有用である。本発明はまた、薬剤候補を投与された対象における疾患または疾患症状に対する薬剤候補の有効性を、その有無が疾患または疾患症状の指標となる標的物体の有無に関するスクリーニングによって評価するための方法であって、検体フィールドが対象から採取された試料である、本明細書中の任意の方法を含む方法にも関する。本発明はまた、標的物体の有無に関して血液試料をスクリーニングするための方法であって、検体フィールドが血液試料である、本明細書中の任意の方法を含む方法にも関する。これは、例えば血液銀行において、汚染された血液試料を、汚染された試料が流通する前に同定するのに有用である。また、これを用いて、提供者となる可能性のある者を提供行為の前にスクリーニングすることも可能と考えられる。本発明はまた、標的物体の有無に関して液体試料をスクリーニングするための方法であって、検体フィールドが液体試料である本明細書中の任意の方法を含む方法；および、標的物体が癌細胞である本明細書中の任意の方法を含む方法でもある。
【００３４】
もう1つの面において、本発明は、細菌の存在に関するスクリーニングの方法であって、以下のような本明細書中の任意の方法を含む方法である：少なくとも1つの蛍光団が細菌に対するDNAプローブを含む；検体フィールドが外科患者から手術後に採取される；検体フィールドが食品試料から採取される；
または、以下をさらに含む本明細書中の任意の方法である：
j．スライドを、アルデヒド系固定剤に曝露させること；
k．スライドを、リン酸緩衝食塩水（PBS）中ですすぎ洗いすること；
l．ヒトAB血清をスライドに対して添加すること；
m．一次抗体をスライドに対して添加して、スライドをインキュベートすること；
n．スライドをPBS中ですすぎ洗いすること；
o．二次抗体をスライドに対して添加して、スライドをインキュベートすること；
p．スライドを有機溶媒中で曝露させること；
q．スライドをPBS中ですすぎ洗いすること；
r．ヒトAB血清をスライドに添加すること；
s．一次抗体をスライドに添加して、スライドをインキュベートすること；
t．スライドをPBS中ですすぎ洗いすること；
u．二次抗体をスライドに添加して、スライドをインキュベートすること；
v．スライドをPBS中ですすぎ洗いすること；
w．細胞染色剤をスライドに添加して、スライドをインキュベートすること；
x．スライドをPBSですすぎ洗いすること；
y．スライドを水に曝露させること；
z．スライドをマウントすること；もしくは
段階sの一次抗体がケラチンであって、段階uの二次抗体が抗ウサギローダミンである；
または、以下をさらに含む本明細書中の任意の方法である：
j．スライドを有機溶媒中で曝露させること；
k．スライドをPBS中ですすぎ洗いすること；
l．一次抗体をスライドに添加して、スライドをインキュベートすること；
m．スライドをPBS中ですすぎ洗いすること；
n．二次抗体をスライドに添加して、スライドをインキュベートすること；
o．スライドをPBS中ですすぎ洗いすること；
p．細胞染色剤をスライドに添加して、スライドをインキュベートすること；
q．スライドをPBSですすぎ洗いすること；
r．スライドを水に曝露させること；
s．スライドをマウントすること；
または以下のようなものである：有機溶媒がアルコールもしくはアセトンである；一次抗体がケラチンである；二次抗体が抗ウサギローダミンである；蛍光団が細菌を検出する；蛍光団が核酸プローブである；もしくは核酸プローブがオリゴヌクレオチドである。
【００３５】
本発明のその他の特徴および利点は、以下の詳細な説明のほか、特許請求の範囲からも明らかになると考えられる。
【００３６】
詳細な説明
本発明は、多数の候補物体の中の稀な標的物体を検出するための、蛍光を用いる方法およびシステムに関する。非常にさまざまな蛍光団が市販されており、それらの最大発光波長が異なることから、本方法およびシステムを、候補物体の単一の大集団の中の多くの異なる標的物体を検出するように適合させることができる。例えば、蛍光団A、B、C、D、EおよびFを、それぞれ標的物体1、2、3、4、5および6と特異的に結合する分子と結合させることができる。必要なのは単に、候補物体の発光波長の取り込みおよび評価を行うこと（もしあれば）、ならびに候補物体が標的物体1、2、3、4、5または6のいずれであるかを決定するために、発光波長を蛍光団A〜Fから予想されるものと比較することのみである。事実、極めて多数の標的をこのようにして同時に検出することが可能である。 本発明における使用に適した種々の試薬および手順に関するそのほかの詳細については以下に考察する。
【００３７】
検出用の検体の調製
一般的な臨床的用途において、検体は通常、特定の表現型（例えば、抗体を用いる）または遺伝子型（例えば、オリゴヌクレオチドプローブを用いる）を有する稀な細胞の存在に関するスクリーニングを行える、体液、骨髄または組織試料中の細胞試料、例えば血液細胞試料である。
【００３８】
本明細書の細胞検体の調製方法は、分析するのに望ましい細胞種の濃縮をもたらす。これは例えば、勾配分離、または可溶化および遠心分離を含む、細胞の分離または単離に適した任意の方法によって行える。
【００３９】
末梢血液または骨髄におけるレアイベントの自動検出のためには、試料の処理時の細胞の損失ができるだけ少ない調製方法を利用することが重要である。稀な細胞を確実に最大限に回収するためには、赤血球の単純な溶解（例えば、塩化アンモニウム溶液を用いる）の方が、フィコール（Ficoll）を用いる単離方法よりも好ましい。血液試料を含む同じチューブ内で溶解処理を行った後に、同じチューブ内で分離（例えば、遠心分離、遠心沈殿）を行うこと（すなわち、溶解および分離の際に試料の移行を行わない）によっても、細胞の損失が最小限に抑えられ、試料中の細胞の構成のばらつきが最小限に抑えられる（すなわち、処理の前よび後のいずれの試料においても、稀な細胞の他の細胞に比した相対的な割合が一定に保たれる）。以下の実施例の項に記載した細胞調製／接着手順により、均一な細胞調製物が得られる。
【００４０】
これに対して、通常のサイトスピン調製では細胞の最大2／3が失われてしまう恐れがある。レアイベントの顕微鏡による検出を用いるほとんどの検査では、スライド上の実際に分析される細胞の総数をこれらの検査によって記録することはできないため、細胞数に関する情報を得ることはできない。それどころか、これらの実験は単に、回収が完全であると仮定した上で、陽性イベントの数を、処理した細胞の総数と関連づけるだけである。これは偏りを生じさせる：細胞が調製時に実際には不可避的に失われることが明らかになっただけでなく、特定の種類の試料の間（表1の「範囲」の欄を参照のこと）ならびに分析する試料の種類によって回収の程度も大きく異なる恐れがある。Marienfeld Laboratory Glassware（Paul Marienfeld GmbH & Co；www.superior.de）による接着性ガラス製顕微鏡用スライドは、これらのスライドによって均一な細胞単層（最適な細胞密度で、重複が極めて少ないもの）を取り込めたことから、以降に蛍光顕微鏡検査を行う目的で細胞検体フィールドを作製するのに優れた基質であった。ひとたび培地をスライドに投入した上で、任意のアルデヒド系固定剤（例えば、パラホルムアルデヒド、ホルマリン、グルタルアルデヒド、架橋剤）によって細胞を固定する。抗原が細胞表面にないある種の細胞種の場合には、透過化剤（例えば、メタノール、トリトン）を用いて細胞を透過化することができる。抗原が表面抗原であれば、透過化の必要はない。スライドの有機溶媒（例えば、アルコール、ケトン、メタノール、エタノール、アセトン）に対する曝露を用いて細胞を可溶化することもでき、ある種の溶媒（例えば、メタノール）では固定および透過化の両方が可能である。細胞培養液は、結合していない結合部位をカバーしうる、または、例えばRPMIもしくはDMEMを含むタンパク質を有しうる、任意の培養液であってよい。生理的緩衝液とは細胞との適合性があるものであり、これには例えば任意の等張液またはPBSが含まれる。細胞染色剤とは細胞を染色するのに適した任意の色素のことであり、これには例えば、DNA染色剤、細胞質染色剤、ミトコンドリア染色剤、DAPI、カルセインなどが含まれる。適切な検体調製を行うことにより、生物組織中または液体中の予期しないあらゆる細胞種を、本発明を用いて検出することができる。例えば、血中に平滑筋細胞が存在すれば、アテローム動脈硬化を意味すると考えられる。もう1つの例として、血液銀行の貯蔵血液を、ヒト免疫不全ウイルス、B型肝炎ウイルスまたはサイトメガロウイルスといった輸血によって伝染する主要な病原体の存在に関してスクリーニングすることもできる。
【００４１】
分析用の検体フィールドの調製にどのような方法を用いるにしても、その方法は検出しようとする標的物体を破壊したり大きく変化させたりしないことが重要である。例えば、標的物体がプリオン、細菌、ウイルス、原生動物または多細胞寄生生物であれば、単離の手順は異なると考えられる。固形組織（例えば、固形腫瘍）の分析には細胞の脱凝集が必要と思われるが、プロテアーゼは標的細胞の同定に用いられる細胞表面分子を変化させる恐れがあるため、これは例えば、トリプシン処理による代わりに物理的破壊によって行われる。ウイルス検体フィールドの調製は、検体フィールド内に細胞より小さい粒子のみが存在するように、一定のサイズの大きな粒子（例えば、細胞）を濾過によって除去することを必要とする。または、ウイルスに感染した細胞の検出が望ましい場合には、細胞を検体フィールドに含めることもできる。病理学および顕微鏡法の技術分野の当業者は、個々の生物試料に対するよく知られたさまざまな調製手順を利用することができ、これらの手順は検出しようとするいかなる標的物体に対しても適合化しうる。このような手順には、Shandon Cytocentrifugeを用いたサイトスピン法、Sakura（Torrance, CA）社によるCytotek Monoprep、およびCysyc（Boxborough, MA）社によるThinPrepが含まれる。
【００４２】
分析しようとする試料が血液などの生体液でない場合には、異なる装置を用いて大気などから試料を収集することができる。一般に大気捕集装置は、大気もしくは気体がその中もしくは傍らを通過する液体を含む、または大気もしくは気体がフィルターを通過する際に微粒子（例えば、標的物体）を捕捉する多孔性フィルターを含む、収集チャンバーを有する。液体を含む収集チャンバーの場合には、収集用液体に遠心または他の処理を行って液体から粒子を分離することができる。続いて、分離した粒子を標識または分析のために基質に沈着させる。フィルター（例えば、ニトロセルロース）を含む収集チャンバーの場合には、フィルターが、後に標識または分析を行うための基質としての役割を果たすことができる。または、粒子をフィルターから洗い流すこと、またはフィルターを溶解もしくは他の様式で粒子から除去することもできる。フィルター式収集チャンバーを、フィルターを通って流れる液体（例えば、給水試料または脳脊髄液）から粒子を収集するように適合させることもできる。さらに、上に考察したように、液体中に存在する粒子状物質を除去するために液体試料を遠心することもできる。被験物質が液体試料中に溶液として保たれ、望ましくない粒子状物質が除去される（例えば、濾過により）場合には、元の液体を分析用の試料とすることができる（溶液として、または試料溶液の真空乾燥を行う）。さまざまな試料採取器が知られており、本発明に用いることができる。SKC BioSampler（登録商標）および他の試料採取装置を販売しているSKC, Inc.（www.skc.com）を参照のこと。
【００４３】
本発明は生物兵器病原体、またはヒト、動物もしくは植物に有害な任意の病原体の検出を含むものと考えている。この点に鑑みて、本発明の方法およびシステムは、ヒト、商業的に価値のある動物または商業的に価値のある植物に有害な病原体を検出するために用いることができる。ヒトの細菌性およびリケッチア性病原体には、以下のものが非制限的に含まれる：Q熱リケッチア（Coxiella burnetii）、バルトネラ・クインタナ（Bartonella Quintana）（Rochalimea quintana、Rickettsia quintana）、リケッチア・プロワセッキ（Rickettsia prowasecki）、紅斑熱リケッチア（Rickettsia rickettsii）、炭疽菌（Bacillus anthraci）、ウシ流産菌（Brucella abortus）、ヤギ流産菌（Brucella melitensis）、ブタ流産菌（Brucella suis）、オウム病クラミジア（Chlamydia psittaci）、ボツリヌス菌（Clostridium botulinum）、野兎病菌（Francisella tularensis）、鼻疽菌（Burkholderia mallei）（Pseudomonas mallei）、類鼻疽菌（Burkholderia pseudomallei）（Pseudomonas pseudomallei）、チフス菌（Salmonella typhi）、赤痢菌（Shigella dysenteriae）、コレラ菌（Vibrio cholerae）、ペスト菌（Yersinia pestis）、ウェルシュ菌（Clostridium perfringens）、破傷風菌（Clostridium tetani）、腸管出血性大腸菌（血清型O157および他のベロ毒素産生血清型）、レジオネラ菌（Legionella pneumophila）および偽性結核菌（Yersinia pseudotuberculosis）。ヒトのウイルス性病原体には、以下のものが非制限的に含まれる：チクングンヤウイルス、コンゴ・クリミア出血熱ウイルス、デング熱ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、エボラウイルス、ハンターンウイルス、フニンウイルス、ラッサ熱ウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、マチュポウイルス、マールブルグウイルス、サル痘ウイルス、リフトバレー熱ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、痘瘡ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、白痘、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、キャサヌル森林熱ウイルス、跳躍病ウイルス、マリーバレー脳炎ウイルス、オムスク出血熱ウイルス、オロプーシェウイルス、ポワサンウイルス、ロシオウイルスおよびセントルイス脳炎ウイルス。
【００４４】
動物の細菌性およびリケッチア性病原体には、マイコプラズマ・ミコイデス（Mycoplasma mycoides）および炭疽菌が非制限的に含まれる。動物のウイルス性病原体には、以下のものが非制限的に含まれる：アフリカブタ熱ウイルス、鳥類インフルエンザウイルス2型、ブルータングウイルス、口蹄疫ウイルス、ヤギ痘ウイルス、ヘルペスウイルス（アウジェスキー病）、豚コレラウイルス（ブタ熱ウイルス）、狂犬病ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、小反芻動物病ウイルス、ブタ腸内ウイルス9型（ブタ水疱病ウイルス）、牛痘ウイルス、羊痘ウイルス、テッシェン病ウイルスおよび水疱性口内炎ウイルス。
【００４５】
植物の細菌性およびリケッチア性病原体には、 ザントモナス・アルビリネアンス（Xanthomonas albilineans）、柑橘潰瘍病菌（Xanthomonas campestris pv. Citri）、イネ白葉枯病菌（Xanthomonas campestris pv. Oryzae）および柑橘班入病菌（Xylella fastidiosa）が非制限的に含まれる。植物のウイルス性病原体には、バナナ萎縮病ウイルスが非制限的に含まれる。
【００４６】
プリオンは、ウシ海綿状脳症、スクレイピーおよびクロイツフェルト・ヤコブ病を非制限的に含む疾患と相互に関係している。
【００４７】
ある具体的な例としては、試料を以下のように調製することができる。微生物の免疫細胞化学的検出のための最適化された調製手順を、環境性（大気および水）およびヒト（血液および他の体液）試料に適用することができる。大気試料の収集には、SKC社（SKC, Inc.）のBioSampler（登録商標）を用いる。BioSampler（登録商標）はすべてガラスでできた真空駆動式のインピンジャー装置であり、液体に通気して泡立たせるのではなく、収集用液体の表面に対して接線方向にノズルを介して大気を通過させる。この設計のため、粒子の跳ね返りが最小限に抑えられ、再噴霧化が減る。水または粘度の類似した液体を収集用液体として用いて流速12.5L／分で動作させることにより、BioSamplerの収集効率は直径1μm程度の粒子に関しては100％近くになり、0.5μmでも依然として約90％、0.3μmで約80％である。このため、ほとんどの細菌は直径1〜10μmであり、多くのウイルスの大きさはこの範囲の下端である（例えば、エボラウイルスは1000×80nm）ことから、BioSampler（登録商標）は大気中の細菌、真菌、花粉およびウイルスを収集するための優れた装置である。
【００４８】
その他の大気捕集装置を用いることもできる。例えば、代替的な装置の一つにAir-O-Cell捕集カセット（SKC, Inc.）がある。この装置では、大気中の粒子を加速させて粘着性スライドに衝突させるが、これはさまざまな染色手順および顕微鏡検査を行うのにまさに適している。しかし、この収集方法は、2μmまたは3μmよりも小さい粒子には有効でない。
【００４９】
環境試料の採取において調整する必要のある主なパラメーターは、試料採取時間および収集用液体の組成である。さまざまな液体を、スライドへの接着を補助する能力に関して、既知の量の生物体を用いて試験し、直接接種試験で比較することができる。
【００５０】
ヒト体液の分析については、以下の実施例1の記載のように血液試料の分析によって例示する。
【００５１】
蛍光染色
本発明の1つの利点は、本発明を、よく知られた公的に入手可能な蛍光分子の大規模ライブラリーを用いて実施しうることである。その供給元には例えば、Molecular Probes社（Eugene, OR）、Jackson Immuno Research社（West Grove, PA）、Sigma社（St. Louis, MO）が含まれる。これらの分子は単独で標的物体（例えば、蛍光性DNA染色剤）の一部と特異的に結合しうるか、または標的物体の部分と特異的に結合する抗体もしくは核酸と結合させることができる。例えば、Fluorescent and Luminescent Probes for Biological Activity、WT Mason編、Academic Press, London, 1993、およびRP HauglandによるHandbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals、MTZ Spence編、Molecular Probes, 1996を参照のこと。一般に、抗体を免疫蛍光法に用いる場合には、蛍光色素を、標的物体上の抗原に対して特異的な一次抗体と結合する二次抗体に化学的に結合させる、または一次抗体に直接結合させる。一次抗体は多岐にわたる抗原に対して入手可能である。例えば、標的物体がプリオンであれば、クロイツフェルト・ヤコブ病の診断を目的として患者の脳脊髄液中のプリオンを検出するために、プリオン特異的抗体を用いることができる。用いるのに適した一次抗体には、抗GD2抗体および抗GD-3抗体（Matreya Inc., Pleasant Gap, PA）、抗HER-2neu抗体（Dako, Carpinteria, CA）、抗KSA／EpCAM抗体（Dako）および抗サイトケラチン抗体（Sigma, St. Louis, MO）が含まれる。用いるのに適した二次抗体には、Molecular Probes社（Eugene, OR）およびJackson Immuno Research社（West Grove, PA）から入手しうるものが含まれる。スライド調製の際の抗体導入段階の間にはPBSによる洗浄を行うべきである。しかし、抗体導入が血清遮断試薬である場合、すなわち、抗体を試料中の非特異的な結合部位を遮断するために導入する場合には、PBSによる洗浄は不要である、または有害ですらありうる。
【００５２】
異なる蛍光団が非常に多く存在し、その多くが異なる最大励起波長または最大発光波長を有することから、検体フィールド内の多数（例えば、24種またはそれ以上）の標的物体の多重的な検出が可能となる。この態様において、各抗体は1種類の標的物体のみに対して特異的でありうる。さらに、多重化によって標的物体の入れ子式（nested）グループの検出が可能になり、検出精度が高まる（例えば、偽陽性を最小限に抑えられる）。以下の実施例では、試料における総細胞数を示すことができ、蛍光マーカーが断片または細胞片ではなく実際に細胞と会合していることを確認するのに有用なDNA染色剤であるDAPIを用いて、有核細胞である標的物体を同定している。続いて、抗サイトケラチン抗体を用いて、DAPI陽性細胞の標的グループ内の癌細胞標的の候補を同定した。そして最後に、癌細胞表面マーカーに対する抗体を用いて、DAPI、サイトケラチンおよび細胞表面抗原に関して陽性である真の癌細胞のサブグループを同定して算定した。この入れ子式の蛍光染色により、偽陽性の結果は事実上なくなった。他の考察については以下に述べる。
【００５３】
免疫細胞化学アッセイにまず必要なことは抗体の作製である。市販のものまたは他のものが入手可能である場合には、表面または細胞内の標的に対する既存の抗体を得ることができる。その他の場合には、抗体を新規に作製する必要がある。照射処理を行った（死滅させた）関心対象の生物の試料を入手し（例えば、CDC、USAMRIIDなどからの病原体）、これを例えばA&G Pharmaceutical, Inc.（Baltimore, MD）に提供し、露出されたエピトープに対するモノクローナル抗体（mAb）を作製してもらうことができる。この企業は、ハイブリドーマの迅速な開発（60日未満）が妥当なコストで得られるmAb作製のための方法を開発している。これらの生物がいずれも交差反応の原因となりうる共通の表面エピトープを有していない場合、または確実に「死滅した」生物を入手できない場合には、その種に特異的な1つまたは複数の抗原を入手することができる。場合によっては、検出しようとする標的物体はあるクラスの標的であってそのクラス内の個々の種ではない。このため、種特異的ではなくクラス特異的な抗体が望ましいことも考えられる。抗原を精製し、それらのクローニングされた遺伝子から発現させること、または化学合成したペプチドによって模倣させることが可能である。抗体は蛍光分子を直接結合させること、または二次蛍光標識抗体と併用することが可能である。直接標識抗体はFACS分析により、他の系統学的な類縁種に対する特異性に関して検討することができる。
【００５４】
血液または骨髄調製物における癌細胞の検出の特異性は一般に、マーカーおよび抗体を手順に用いた場合にのみ優れている。最も広く用いられているマーカーは、上皮細胞および癌由来細胞の細胞骨格成分であるサイトケラチンである。サイトケラチンが乳癌、前立腺癌、胃癌および結腸直腸癌に関する有用なマーカーであることは数多くの臨床試験で立証されているが、これは真の腫瘍細胞特異的マーカーではなく、サイトケラチン細片または染色剤粒子を含む表皮細胞、貪食細胞も染色しうる。このような場合には、免疫染色された細胞が悪性細胞であることを顕微鏡で厳密に確認することが重要である。偽陽性イベントのもう1つの原因は、上皮細胞または癌細胞マーカーによる血液細胞または骨髄細胞の交差反応性染色であり、例えばムチン上皮膜マーカーは造血細胞と交差反応を生じうる。実際に、サイトケラチン抗体が健康な血液提供者からのPBMCを標識しうることが明らかになった（実施例1における表4）。正常血液提供者の末梢血試料のうち約17％は、低レベルではあるものの（平均は1.18CK+／10６個であった）、サイトケラチン陽性を示した。「正常」試料中のこれらのCK+細胞が、良性上皮細胞、交差反応性の造血細胞、または診断されていない原発癌から播種した癌細胞のいずれであるかは不明である。
【００５５】
癌細胞検出の特異性を向上させるために、サイトケラチンならびに上皮表面マーカーEpCAMおよびGD2の同時検出のための二重標識プロトコールを開発した。この手順によって偽陽性は劇的に減少し、検討した77個の試料のうち二重標識された細胞は1つのみであり（CK／Ep-CAMおよびCK／GD2；実施例の項の表5）、このことから正常試料中に検出された少数のCK+細胞は癌由来ではないことが示唆された。血液または骨髄試料中の癌細胞を単に検出することに加えて、稀な腫瘍細胞の表現型を、例えばその悪性度、細胞周期の時期または増殖挙動に関してさらに特徴付けるための取り組みも行われている（Allgayerら、J. Histochem. Cytochem. 45: 203-212, 1997；Allgayerら、Cancer Res. 57: 1394-1399, 1997；Pantelら、J. Natl. Cancer Inst. 85: 1419-1424, 1993；およびRiesenbergら、Histochem. 99: 61-66, 1993）。乳癌試料の分析を目的としてサイトケラチン標識を増殖因子受容体または増殖関連抗原と併用する（Pantelら、前記）、または前立腺癌の分析を目的としてサイトケラチン標識を前立腺特異抗原と併用する（Riesenbergら、前記）、多重マーカー分析のためのプロトコールも開発されている。また、胃癌患者において、サイトケラチンおよびウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター受容体に関して二重陽性であった細胞は高い転移能と相関していた（Allgayerら、Cancer Res. 57: 1394-1399, 1997）。有望なそのほかのさまざまな（癌特異的）マーカーも記載されており、これには例えば、糖タンパク質（Franklinら、Breast Cancer Res. Treat 41: 1-13, 1996）、ガングリオシド（Mossら、N. Engl. J. Med. 324: 219-226, 1991）、細胞接着分子（Rossら、Exp. Hematol. 23: 1478-1483, 1995；およびRossら、Bone Marrow Transplant. 15: 929-933, 1995）および他の分子（Vrendenburghら、J. Hematother. 5: 57-62, 1996）がある。新たなマーカーが利用可能になれば、癌細胞の検出方法の感度、質および特異性が向上する可能性がある。
【００５６】
一次抗体はさまざまな抗原に関して入手可能である。例えば、標的物体がプリオンであれば、クロイツフェルト・ヤコブ病の診断を目的として患者の脳脊髄液中のプリオンを検出するために、プリオン特異的抗体を用いることができる。
【００５７】
抗体の代わりに、蛍光標識した核酸を標的物体特異的プローブとして用いることができる。実際に、インサイチューハイブリダイゼーション（ISH）における核酸プローブを用いた検出が望ましい理由はいくつかある：（1）核酸（NA）プローブの方が抗体（Ab）よりも容易、迅速かつ安価に作製できる；（2）NAプローブは自在かつ安価に増やせる（モノクローナルAbも同じであるが、ポリクローナル抗体はそうでない）；（3）NAプローブはAbよりも均一である（特にポリクローナル；多重標識（多重）実験のために、Tmの一致したプローブを選択することすら可能である）；（4）NAプローブのコグネイトRNAまたはDNA標的とのハイブリダイゼーションは、抗体のエピトープとの相互作用よりもうまく制御できる（例えば、ハイブリダイゼーション温度、イオン強度などによる）；（5）NAプローブの方が多重標識実験を実施しやすい（異なる標識と結合させたヌクレオチドを単に組み入れる、またはビオチンに続いてさまざまなストレプトアビジン標識複合体を組み入れる；免疫蛍光法（IF）では、一次Abの標識がその結合を妨げることがあり、第2のAbを検出用に用いる場合、IFでは異なる種において産生させた一次Abを用いる必要がある）；および（6）NAプローブを用いて得られたシグナルは、特に直接標識の場合、Abによるものよりも定量的であると考えられ、さらに必要に応じて増幅することも可能である（ビオチンなど）。
【００５８】
標的物体（例えば、生物兵器用の生物）に関して入手可能な配列情報のすべてを用いることにより、それらのそれぞれに対して特異的なオリゴヌクレオチドプローブを設計することができる。他の生物と配列がたまたま一致してしまうリスクは交差反応性エピトープの場合よりもはるかに低いが、これは設計されるプローブのそれぞれを細菌／ウイルス核酸データベースの全内容と直接比較して、特定の標的に対して一意的となるように設計しうるためである。非常に短いプローブ（例えば20量体）を用いることにより、細胞壁／キャプシド浸透性および細胞内核酸標的に対する到達性を最大限に高めることができる。標的物体に対して一意的な標的配列としては、感度を最大限に高めるために、大量に発現されるRNA上にあるもの、例えば、リボソームRNA中の配列などを選択することができる。ウイルスの場合には、最も大量に発現される遺伝子に対して選択的なプローブを設計することができる。
【００５９】
単一標識実験には、ジゴキシゲニン検出システム（Zardaら、J. Gen. Microbiol. 137: 2823-2830, 1991）を用いることができる。このシステムはBoehringer Mannheim社からキットとして市販されている。しかし、ほとんどの場合には多重標識が必要と思われ、これはこのシステムでは不可能である。その代わりに、蛍光色素（例えば、Genset Corp.のもの）と結合させたヌクレオチドの存在下でオリゴヌクレオチドを合成することができる。シグナル増強が必要であるか求められる場合には、オリゴヌクレオチドを合成時にタグ（例えば、ビオチン）で標識しうる。この場合、タグ標識された各プローブは、標識が例えば24種の蛍光団のいずれか1つであるような、複数の異なるストレプトアビジン標識複合体の1つと別個に反応すると考えられる。これらの事前に反応させたオリゴプローブ複合体は細菌膜を通って自由に拡散する程度に小さい必要がある。しかし、そうでない場合には、細胞をリゾチーム／EDTAによって透過化することができる。
【００６０】
上記の通り、さまざまな蛍光分子が知られており、利用可能である。50,000種を上回る染色剤が、Eastman Kodak社、Polaroid社、Fuji Film社およびMolecular Probes社（www.probes.com）から販売されている。有核細胞標的に適した分子の例には、DAPI、ヨウ化プロピジウム、アクリジンオレンジおよびYOPROが含まれる。
【００６１】
検出システムの構成要素
検出システムに必要な種々の構成要素は市販されている。検出器は、光、蛍光、または励起、放出などを含む他のエネルギー伝達の測定、記録、画像化または検出を行うための任意の手段であってよい（例えば、装置、適した鏡および／もしくはレンズの組み合わせ、光電子増倍管または他の検出手段）。一般に、本システムは、電動式架台（例えば、いずれもNikon, Japan製のNikon Microphot-FXAもしくはNikon Eclipse 1000；Ludl Electronic Products Ltd., Hawthorne, NY製の架台またはZeiss, Germany製のAxioplan 2IE MOT）、蛍光フィルター（組み込まれたもの、またはOmega Optical, Brattleboro, VTに発注）、カメラ（例えば、DAGE-MIT, Inc., Michigan City, IN製のCCD 72カメラ；Zeiss, Germany製のAxioCam；またはPixelvision（www.pixelvision.com）製のSpectraVideoカメラ）、ならびにプリンタ、モニタ、記憶媒体、ディスプレイおよび本発明を実施するのに必要なソフトウエアを有するコンピュータを備えた蛍光顕微鏡を含む。上に挙げた構成要素の多くは、Nikon、Zeiss、Georgia Instruments（Roswell, GA）、Vaytek（Fairfield, IA）、Applied Imaging, Inc.（www.micrometastasis.org/metfs1.htm）およびChromavision Medical Systems, Inc.（www.chromavision.com）などの製造元から入手可能である。
【００６２】
どの構成要素を用いるにせよ、本システムは、以下の段階またはその変形物および同等物を行えるべきであると考えられる：
1）検体フィールド（例えば、顕微鏡用スライドガラス）当たりの標的物体（例えば、癌細胞）の数を、第2もしくは第3の蛍光団またはその両方を含む物体のカテゴリーに細分して算定すること；
2）各標的物体の画像を保存すること（例えば、記録、画像化、データ記憶媒体への保管）；
3）各標的物体のx、y座標を記録すること；
4）スライド上の物体の総数を算定すること。分析は検体フィールドを走査することによって行われる。走査は顕微鏡のハードウエアによって規定されるすべての倍率で行うことができる。使用者は何らかのフィルターセット（単一、二重または三重）を用いて検体フィールドを走査することを選択できる。走査は独立に行うことができる。
【００６３】
標的物体の検出および同定のためのアルゴリズムは、生物学的画像解析のための市販のソフトウエアに基づく（例えば、Media Cybernetics, www.mediacy.com製のImage Pro Plus；またはKontron, Germany製のKS 400）。標的物体の検出に関する選択基準は、例えば、以下のものでありうる：
a） 第2および第3の蛍光チャンネルにおける蛍光強度の閾値；
b）真の標的物体（例えば、完全な細胞）を偽標的物体（例えば、夾雑物、残渣）と識別するための、第2および第3の蛍光チャンネルにおける面積および形状；ならびに
c）第2および／または第3の蛍光チャンネルのシグナルが、常に第1の蛍光チャンネルからのシグナル（例えば、DAPIシグナル）と共存すべきであること。
【００６４】
各走査の前に、使用者が標的物体に対する選択基準を定義する。走査の後に、選択基準（上記参照）を満たすすべての標的物体の数を表示し、第2、第3またはその両方の蛍光標識を示す標的物体に細分する必要がある。選択基準を満たすすべての標的物体を画像化し、三色RGB画像として保存する（上記の段階2）。走査の終了時に、すべての画像を画像の一覧として表示し、オプションとして各画像の拡大を用意する。選択基準（上記参照）を満たすすべての標的物体についてx,y座標を記録し、使用者が各位置を呼び出して架台がその位置に自動的に移動するようにすることができる（上記の段階3）。このオプションにより、使用者は検出されたすべての標的物体を顕微鏡の高倍率下で調べ直すことができる。また、指定された位置で入手した対応する画像を呼び出すことも可能である。各走査時には、細胞の総数（第1の蛍光団、例えば、DAPIシグナルを計数し、走査終了時に表示する必要がある（上記の段階4）。
【００６５】
検出システムのユーザーインターフェース
1．走査の設定。走査の開始時に、使用者は以下の情報を入力し、走査のパラメーターを選択するように促される：
1．スライドの識別情報；
2．走査するスライドの数；
3．走査の倍率（対物レンズを選択）；および
4．走査のフィルター設定（走査中の単一、二重／三重フィルター、またはフィルターの交互使用を選択）。
【００６６】
入力した情報に基づいて初期画像が表示され、カメラが設定される（輝度およびコントラストを調整する）。使用者は陽性細胞に関する選択基準を定義し、以下を選択しなければならない：
1．強度の閾値；
2．面積の下限および上限；ならびに
3．形状の基準。
【００６７】
2．走査。初期設定の後に、走査が自動的に始まり、仕様に従ってスライドを分析する。
3．データの出力および記憶。各スライドに関して、以下の情報を表示して保存する：
1．標的物体の数；
2．各標的物体の画像および架台上での対応する座標；ならびに
3．スライド上の標的物体の総数。
【００６８】
上の情報1〜3は、使用者が命名して定義したフォルダ（スライドの識別情報）に保存される。
【００６９】
4．陽性細胞の手作業による確認。使用者は保存された画像を手作業で選択し、画像を入手した位置を呼び出すことができる。架台が自動的にその位置に移動し、接眼レンズを通してフィールドを観察することができる。
【００７０】
速度は、レアイベントの自動分析システムを評価するための基本的なパラメーターである。以下の実施例1に記載したシステムは、100万個の細胞を陽性イベント（例えば、CK陽性）に関して走査し、総細胞数を算定するのに約1時間を要する。より高感度の電荷結合素子（CCD）カメラおよびより高速なコンピュータを用いて、はるかに高速なシステムを利用することもできる。このようなシステムは、細胞100万個当たりの処理時間を数分程度に短縮させうると考えられる。このフロースルー速度はフローサイトメトリーと同程度であり、さらに必要に応じて形態学的確認のために、各々の陽性イベントをより高倍率で、または異なる光学素子を用いて観察しうる能力も保っている。
【００７１】
これ以上の詳述は行わないが、当業者は上記の開示および下記の説明に基づいて本発明を十二分に利用しうると考えられる。以下の説明は、当業者がいかにして本発明を実施しうるかを単に例示するためのものとみなされるべきであり、いかなる意味においても開示の残る部分を制限するものではない。本明細書中に引用した参考文献は、印刷物、電子形態、コンピュータが読める記憶媒体またはその他の形態のいずれかにかかわらず、要約書、論文、専門誌、刊行物、教科書、論説、インターネットのウェブサイト、データベース、特許および特許公報を非制限的に含む、その全体が明示的に参照として本明細書に組み入れられる。
【００７２】
実施例 1 ：癌細胞に関するレアイベント画像化システム
材料と方法
血液検体および骨髄検体の収集。5〜10mlの血液または骨髄を、対照被験者または乳癌もしくは小細胞肺癌と診断された患者から採取し、EDTAを抗凝固薬として含むヴァキュテーナー採血管（Becton Dickinson, Franklin Lakes, NY）に入れた。試料はすべて被験者または患者からインフォームドコンセントを得た上で採取し、収集して24時間以内に顕微鏡分析用に処理した。
【００７３】
細胞株。乳癌細胞株MCF-7および小細胞肺癌細胞株SW2をAmerican Type Culture Collection（ATCC）, Manassas, VAから購入し、以下の染色プロトコールの評価およびレアイベント画像化システムの感度の決定のために用いた。細胞株は、10％ウシ胎仔血清、100U／mlペニシリンおよび0.1mg／mlストレプトマイシンを含むダルベッコ変法イーグル培地（MCF-7）またはRPMI 1640（SW2）。
【００７４】
顕微鏡分析のための試料の調製。血液試料または骨髄試料を2倍容積の0.17M塩化アンモニウムと混合し、室温（RT）で40分間インキュベートした上で、800×gで室温にて10分間遠心した。続いて、細胞ペレットを洗浄し、リン酸緩衝食塩水（PBS）中に再懸濁した。生存している末梢血単核細胞（PBMC）または有核骨髄細胞の総数を、トリパンブルー色素排除法を用いて算定した。続いて細胞を接着性スライド（Paul Marienfeld GmbH & Co., KG, Bad Mergentheim, Germany）に37℃で40分間かけて接着させ、その後にスライドを細胞培養液により37℃で20分間かけてブロックした。スライド1枚当たりに適用された細胞の総数は約1.5×10６個であった。3つの別々のサークルに分割された総接着面積は約530mm２であった。
【００７５】
サイトケラチンの単一標識のために、細胞を氷冷メタノール中で5分間固定し、PBSですすぎ洗いした上で、クラスIおよびIIサイトケラチンを標的とするウサギ抗サイトケラチン抗血清（Biomedical Technologies, Stoughton, MA）とともに37℃で1時間インキュベートした。その後、スライドをPBSで洗浄し、ローダミン結合抗ウサギ抗体（Jackson Immuno Research, West Grove, PA）とともに37℃で30分間インキュベートした上で、0.5μg／ml 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI；Molecular Probes, Eugene, OR）（PBS中）による対比染色を室温で10分間行い、グリセロール-ゼラチン（Sigma, St. Louis, MO）中にマウントした。処理したスライドは室温で保存し、1カ月以内に顕微鏡分析を行った。
【００７６】
サイトケラチンと細胞表面抗原Ep-CAMまたはGD2との二重標識のためには、細胞を1％パラホルムアルデヒド（PBS中、pH 7.4）中で室温にて5分間固定し、PBSで洗浄した上で、20％ヒトAB血清（Nabi Diagnostics, Boca Raton, FL）（PBS中）により37℃で20分間かけてブロックした。その後に、Ep-CAM（モノクローナルマウスKS1／4抗体）またはGD2（モノクローナルマウス1418抗体）を標的とする一次抗体を37℃で1時間適用した（抗体はいずれもKim-Ming Lo博士、Lexigen Pharmaceuticals, Lexington, MA.により寄贈された）。Ep-CAMを標的とする抗体は複数の製造元から入手可能であり、例えば、モノクローナルマウス抗ヒト上皮特異抗原はBiomeda社、Foster City, CAから販売されている；モノクローナル抗ヒト上皮抗原（Ber-EP4）はAccurate Chemical & Scientific Corp., Westbury, NYから販売されており、モノクローナルHEA-FITC抗体はMiltenyi Biotec社、Bergisch Gladbach, Germanyから販売されている。GD2に対する抗体はMatreya, Inc., Pleasant Gap, PAから販売されている。続いて、細胞を洗浄し、氷冷メタノール中で5分間固定した上で20％ヒトAB血清によりブロックし、抗サイトケラチン抗血清とともに37℃で1時間インキュベートした。二次抗体（FITC結合抗マウス抗体およびローダミン結合抗ウサギ抗体；Jackson Immuno Research）を混合し、37℃で30分間適用した。核を0.5μg／ml DAPI（PBS中）により対比染色した。二重標識細胞をGel/Mount（Biomeda, Foster City, CA）中にマウントした。スライドは40℃で保存し、1週間以内に顕微鏡分析を行った。
【００７７】
感度の決定のための腫瘍細胞の希釈。サイトケラチン陽性（CK+）細胞の検出の感度を決定するために、MCF-7乳癌細胞を健康血液提供者のPBMCにより連続希釈した。検討した希釈度は1：10３、1：10４、1：10５、1：2×10５、1：5×10５および1：10６である。溶液を接着性スライドに接触させ、上記の通りにサイトケラチン標識のための処理を行った。希釈度毎に最大8枚の接着性スライドを調製して走査した。試料をスライド1枚当たりの腫瘍細胞の数に関して分析し、総細胞数との関係をみた。
【００７８】
腫瘍細胞および総細胞数の顕微鏡による自動検出。画像化システム、例えば、Georgia Instruments, Inc.（Roswell, GA）により開発されたレアイベント画像化システム（Rare Event Imaging System）などを用いて、スライドを自動的に走査した。このシステムは、同社が権利を持つ、稀な蛍光イベントを検出して、分析した細胞の総数を決定する画像処理アルゴリズムを利用している。これは、自動焦点式でX、YおよびZ軸の電動制御、電動式フィルター選択および電子シャッターを備えた先進型コンピュータ制御式顕微鏡（Nikon Microphot-FXA, Nikon, Japan）から構成される。画像は積算式冷却型CCD検出器によって取り込まれ、60MHzペンティアム画像化ワークステーションによって処理される。
【００７９】
第1の段階では、陽性イベント（例えば、CK+細胞）の検出に関して、ローダミンフィルターセットを用いて、スライドを自動的に走査した。陽性イベントは蛍光強度および面積に基づく。各陽性イベントの（x,y）座標をコンピュータのメモリに格納し、画像を保管した。第2の段階では、スライド1枚当たりのDAPI標識された核の総数（これは総細胞数を表す）に関してスライドを走査した。スライド1枚当たりの総走査面積は、周辺効果を避けるために448mm２とした（接着面積の84％）。2回の走査が終了すると、陽性イベントの数および総細胞数が得られ、すべての陽性イベントを含む画像の一覧が表示される。使用者はこれらの画像を観察し、各画像に添付された記憶済みの座標を用いて、任意のイベントを以降の検討のために呼び出す。続いて、関心対象のフィールドを、より高倍率および追加のフィルターセット（例えば、フルオレセイン用またはUV用のフィルター）を用いて画像化することが可能と考えられる。イベントが陽性であることの確認および表現型の評価のために、異なる蛍光色の画像を電子的に重ね合わせることも可能と考えられる（多重標識）。1枚のスライドに対する総走査時間（2回の走査）は約1時間であった。2回の走査は独立に行えるため、陽性イベントのみをスクリーニングするという選択肢が得られ、これによってスライド1枚当たりの走査時間を30分間に短縮することもできる。
【００８０】
結果
細胞付着手順の評価。試料調製時に最も重要な段階の一つは、スライドに対する細胞の付着である。ポリ-L-リジン／PBSでコーティングされたスライド（0.1％；Sigma, St. Louis）、SectionLockスライド（Polysciences, Inc., Warrington, PA）および接着性スライド（Paul Marienfeld GmbH & Co., KG）に接着させた細胞調製物の顕微鏡下での定性的比較により、最も均一な細胞単層（最適な細胞密度で、重複が極めて少ないもの）が得られるのはPaul Marienfeld社製のスライドであることが明らかになった。このスライドは生細胞が接着するように荷電表面を含む。異なる種類の試料で本発明者らの付着技法を検証するために、レアイベント画像化システムによって決定された細胞の総数を、スライドに最初に付着した細胞の数と比較した。最適化を行うと、いずれの接着性表面（例えば、ポリ-L-リジンなどの正荷電物質でコーティングされたもの）も用いることができる。表1は、健康血液提供者の末梢血では細胞回収率が高いが（89％）。癌患者の試料では細胞の損失が幾分多いことを示している（PB、BMおよびSC試料のそれぞれの回収率は64、58および73％；PBおよびBMは正常PBとの比較でp＜0.05、t検定による）。
【００８１】
（表1）
【００８２】
健康被験者（正常）または癌患者からの末梢血（PB）、骨髄（BM）または末梢血幹細胞（SC）試料を「材料と方法」の項に記載した通りに調製し、1.5×10６個の細胞を接着性顕微鏡スライドのそれぞれに適用した。各群に指定された数（n）のスライドに関して細胞を計数し（DAPI標識に基づく）、その結果を平均±SEMとして表す。回収率の算出に関しては、各スライドの走査面積が総接着面積の84％であることに注意されたい（「材料と方法」の項を参照）。星印は、t検定による正常PBとの比較でp＜0.05であることを意味する。
【００８３】
検出方法の感度。レアイベント画像化システムの感度を調べる目的で、乳癌細胞（MCF-7）を加えたPBMC試料を調製し、サイトケラチン標識のための処理を行った。高輝度に染色された上皮MCF-7細胞は間葉由来の白血球と容易に区別することができる。CK+細胞の検出感度を、「材料と方法」の項に記載したように、種々の希釈度の腫瘍細胞（MCF-7／PBMC）を用いて検討した。10６個のPBMC当たりのMCF-7細胞が1個という、検討した中で最も希釈度の高い試料でも、予想された量の癌細胞を検出することができた（表2；予想曲線と観測曲線との間に有意差がない、χ２検定）。
【００８４】
（表2）
【００８５】
腫瘍細胞の二重標識。レアイベントの検出の特異性を高め、同定された癌細胞の特徴をさらに分析するために、細胞内サイトケラチンおよび癌細胞表面マーカーの同時検出を可能にする染色プロトコールを開発した。この二重標識手順は、第1に細胞表面を固定してEp-CAMまたはGD2に対する標識を行い、第2に細胞を透過化して細胞内サイトケラチンに対する染色を行うという2つの逐次的な段階からなる。この二重標識プロトコールを癌細胞株MCF-7（乳癌）およびSW2（小細胞肺癌）に対して最適化した。蛍光顕微鏡検査により、SW2細胞が抗GD2抗体および抗サイトケラチン抗血清によって効率的に標識されることが示された。この逐次的固定では、共焦点レーザー走査顕微鏡によって入手した光学切片で示されたように、どちらのタンパク質の抗原部位も細胞内局在の点で維持されていた。染色された細胞には明らかに、細胞質中のサイトケラチン（赤色）および細胞表面のGD2（緑色）が認められた。いずれのタンパク質も細胞集団内での発現レベルは非常に不均一であった。MCF7細胞を抗Ep-CAM抗体および抗サイトケラチン抗血清で二重標識した場合にも同様の結果が得られた。一次抗体の一方を用いずに両方の二次抗体を用いた対照実験により、2つの検出系の間に交差反応がないことが明らかになった。
【００８６】
染色プロトコールをさらに検証するために、MCF-7またはSW-2細胞を加えたPBMCを標識した。その目標は、癌細胞から高輝度の蛍光シグナルを入手しつつ、周囲のPBMCから得られる背景シグナルは低くすることであった。この目標を達成するのに最も重要な2つの要因は、一次抗体を逐次的に適用することと、一次抗体とのインキュベーションの前に2回のブロッキング段階（20％ヒトAB血清、PBS中）を行うことであることが明らかになった。蛍光顕微鏡検査により、二重標識したMCF-7細胞は周囲のPBMCと明瞭に区別しうることが示された。より高倍率では、細胞内サイトケラチン標識およびEp-CAMの表面染色が確認された。PBMCにSW-2細胞を加え、GD2およびサイトケラチンに対して二重標識した場合にも同様の結果が得られた。
【００８７】
この二重標識プロトコールを、癌患者由来の末梢血試料および骨髄試料に対しても適用した。小細胞肺癌患者の末梢血由来のGD2／サイトケラチン陽性細胞の一例では、蛍光顕微鏡検査により、乳癌患者の骨髄からEp-CAM／サイトケラチン陽性細胞が認められた。この例では、癌細胞は周囲の骨髄細胞よりも大きいだけでなく、個々の染色の局在の違いも認められた：すなわち、サイトケラチン（赤色）は細胞質中にあり、Ep-CAM（緑色）は細胞周辺の細胞膜の箇所に集中していた。
【００８８】
正常血液試料におけるサイトケラチン陽性細胞および二重陽性細胞の検出。単一染色および二重染色プロトコールの特異性を評価するために、健康提供者からの血液試料を分析した。サイトケラチンの単一標識を用いる方法とサイトケラチン／Ep-CAMまたはサイトケラチン／GD2の二重標識法との間で「陽性」細胞の数を比較した。蛍光顕微鏡検査により、PB試料の16〜18％はいずれのプロトコールを用いてもサイトケラチンに関して陽性と評価され、CK+細胞の数は10６個の白血球当たり標識細胞1〜26個の範囲であることが示された。これに対して、試料を二重標識プロトコールで処理した場合には、陽性のものは健康被験者の試料からほぼ完全になくなった（合計77件のPB試料のうち二重陽性細胞は1個のみ観察された）。
【００８９】
試料収集の空間的および時間的ばらつきの評価。骨髄の異なる領域でCK+細胞の分布が不均一である可能性を評価するために、同じ患者の右および左の腸骨稜から一対ずつのBM試料を採取して分析した。サイトケラチン陽性に関しては、24対のうち21対で結果が一致した（フィッシャーの直接確率法）（表3A）。末梢血試料におけるCK+細胞の出現に関する時間的変動についても検討した。96例の患者の各例から、治療的介入を行わずに2つずつのSC試料を連日採取した。対をなす試料はサイトケラチン陽性に関して統計的に有意な一致を示した（表3B）。
【００９０】
（表3A）
【００９１】
（表3B）
【００９２】
癌患者の血液試料および骨髄試料におけるサイトケラチン陽性細胞の検出。レアイベント画像化システムの能力を示すために、355件の末梢血、骨髄および幹細胞試料を分析した。これらの試料は、乳癌患者から、自家骨髄移植を行う前で、しかも大量化学療法を行った後に採取した。試料はサイトケラチン単一標識法を用いてスクリーニングした。乳癌患者の末梢血からの2つのCK+細胞に関する一例では、陽性細胞は明瞭な細胞質標識を呈したが、周囲の血液細胞は染色されなかった。CK+細胞は骨髄試料の52％、末梢血試料の34％および幹細胞試料の27％に認められた（表4）。
【００９３】
（表4）
【００９４】
表4に関しては、合計156例の患者からの骨髄（BM）、末梢血（PB）および末梢血幹細胞（SC）試料をサイトケラチン陽性細胞および総細胞数に関して分析した。複数の試料を分析できた患者もあれば、1種類の試料しか分析できなかった患者もあることに注意されたい。「CK陽性試料（すべて）」とは、少なくとも1個のCK陽性細胞がみられた試料の数を指す。CK陽性試料（≧CK陽性細胞 9個／PBMC 10６個）とは、PBMC 10６個当たりのCK+細胞が9個またはそれ以上である試料の数を指す（正常PBにおけるCK+細胞の平均＋2SD；表5）。試料1件当たりの最も多いCK+細胞数は、BMでは504個／10６個、PBでは371個／10６個、SCでは1020個／10６個であった。
【００９５】
（表5）
【００９６】
表5に関しては、健康血液提供者からの血液試料をサイトケラチン単独、またはCK／Ep-CAMもしくはCK／GD2に対する二重標識によって評価した（「材料と方法」の項を参照）。陽性試料とは、CK+細胞（単一標識の場合）または二重標識細胞（二重標識の場合）を含むもののことである。各カテゴリーにおける陽性細胞の数は分析した細胞10６個当たりとして表しており、平均±SEMとして示している（7.14×10５個の細胞を含むCK／Ep-CAM群の1件の試料で陽性細胞が1個のみであった場合を除く）。DBL+は二重標識されたことを意味する。
【００９７】
表4にみられる通り、陽性試料におけるCK+細胞の頻度は1個／10６個〜1020個／10６個とさまざまであった。しかし、正常被験者からの多くのPB試料ではCK+細胞は少数であり、これらは偽陽性細胞であることが二重標識実験に基づいて明らかになった（表5）。このため、癌患者からのPB試料で明確に陽性であることを示すために、対照試料で認められたCK+細胞数の平均＋標準偏差の2倍、すなわち9個／10６個というカットオフ点を設定した。この閾値を適用しても、骨髄調製物におけるサイトケラチン陽性の程度（40％）は、末梢血調製物（24％）または幹細胞調製物（12％）よりも依然として高かった（表4）。さらに、分析したすべてのタイプの試料において、疾患の病期がステージIVの患者は、疾患の病期がステージII／IIIの患者よりもサイトケラチン陽性率が有意に高いことも明らかになった（表4）。
【００９８】
以上を要約すると、二重または多重マーカー分析を用いる、低い頻度で存在する関心対象の細胞（レアイベント）の検出のための自動分析システムを開発した。血液試料または骨髄試料の顕微鏡分析のための調製手順を自動化のために最適化したが、これは赤血球細胞の溶解、接着性スライドに対する単核細胞の付着および試料の免疫蛍光標識を含む。続いてスライドを、電動式架台を装備した蛍光顕微鏡により低倍率で観察し、すべての蛍光イベントを画像化し、後で呼び出すためにコンピュータデータベース中にカタログ化した。自動画像解析のためには、背景シグナルを低く維持しながら高輝度シグナルが得られる二次抗体を用いることが非常に重要である。本発明者らは最近、極めて高輝度かつ安定した蛍光シグナルが得られるAlexaシリーズの染色剤（Molecular Probes）を検討した。蛍光標識したスライドは1週間以内に分析する必要がある。より長期的な保存が望ましい場合には、安定な蛍光シグナルが保たれる封入剤を用いるべきである。本発明者らは、ProLong Antifade Kit（Molecular Probes）を用いると、スライドを40℃で3カ月保存した後にも優れた結果が得られることを見いだしている。
【００９９】
実施例 2 ：レアイベント画像化システムの最適化
試料の調製、細胞接着および染色のための基本的手順の適合化および最適化
用いたスライド（Paul Marienfeld GmbH & Co. KG, Bad Mergentheim, Germany）は、細胞がその上に播かれる、接着性のある各150mm２のサークルを3つ含んでいる。ヒト細胞に対して開発された接着手順を、微生物の処理に対して適合させる。検討する主なパラメーターには、接着性スライドとの接触時間、温度、pH、緩衝液の組成およびそのイオン強度が含まれる。細菌（例えば、大腸菌、枯草菌、コレラ菌）およびウイルス（例えば、レオウイルス）に対して、スライドに対する接着特性のばらつきを検証するために別々の検査を行う。検出はDAPIまたはアクリジンオレンジ（これはRNAウイルスの場合にRNAを標識する）を用いて行う。自動化のためには平坦な細胞単層が必須であるため、他の細胞付着システム（例えば、Shandon Cytocentrifugeを用いたサイトスピン法；Sakura社（Torrance, CA）によるCytotek Monoprep、およびCysyc社（Boxborough, MA）によるThinPrepなど）を用いた試験を比較のために用いる。
【０１００】
REIS 自動化のためのコンピュータソフトウエアの開発
本発明者らは、本発明者らの当初の分析装置の一連の全工程を自動化している（Kraeftら、Clin. Cancer Res. 6: 434-442, 2000）。必要に応じて、実装する特定のシステムに適したカメラドライバを入手する。この種のドライバを作ることは、コンピュータプログラミングの技術分野ではルーチンの技能の範囲に十分に含まれる。REISは、稀な蛍光イベントを検出するための画像処理アルゴリズムを含んでいる。画像は検出器によって取り込まれ、PCベースの画像化ワークステーションで処理される。このソフトウエアは、蛍光シグナル（抗原陽性生物）の検出に加えて、総細胞数の計数（例えば、DAPI／アクリジンオレンジ染色に基づく）、自動的なシグナル位置決定、画像保管および画像処理も行う。最初は、これは1つまたは2つの蛍光団（例えば、AlexaFluor488およびAlexaFluor568）を用いて行われる。多重検出システムは、多数の染色剤（例えば、最大で24種の染色剤）に適応するように拡張可能であり、ソフトウエアが各染色剤によって観察された各々の蛍光シグナルを、対応する画像、例えばDAPI／アクリジンオレンジ染色によって得られたものと重ね合わせる。
【０１０１】
多重標識システムに対する改良
本明細書の方法は、大気試料または水試料における細菌およびウイルスの存在を観測するためだけでなく、病原体、特にBW病原体として特定されているものを検出および同定するためにも有用である。これらは多種にわたっており、検査しようとする病原体と同じ数のスライドを作製することも可能ではあるが現実的ではないと考えられる。1つの面は、その代わりとして、励起／放出スペクトルを区別しうるさまざまな蛍光団を用いる多重システムの開発にかかわる。
【０１０２】
上に考察した通り、推定50,000種もの蛍光色素が利用可能である。したがって、この集団を、最も高輝度な蛍光シグナル（最大の感度のため）が得られ、その励起および放出スペクトルが区別可能であって、イソチオシアネート架橋を介して抗体と首尾良く結合させることが可能な、少なくとも24種の染色剤のセットを求めてスクリーニングすることが可能である。蛍光強度が類似している染色剤のセットも好ましいと考えられる。
【０１０３】
選択した染色剤の少なくとも放出ピークを付き合わせて区別するためのフィルターのセットを、DAPIおよびアクリジンオレンジに加えて、本方法に用いるために選択する。励起波長の調節は、フィルターの別個のセットによって行うか、または入射光に対して狭帯域プリズムを用いることによって行う。蛍光フィルターを備えたホイールを、異なる蛍光団の識別のために必要な励起および放出フィルターのすべての組み合わせに適応するように変更する。
【０１０４】
実施例 3 ：免疫細胞化学による病原体検出のための方法の開発
蛍光標識抗体の作製。免疫細胞化学アッセイのためにまず必要なことは、優れた抗体の作製である。市販のものまたは他のものが入手可能である場合には、BW病原体の表面抗原を標的とする既存の抗体を使用のために選択する。その他の場合には、照射処理を行った（死滅させた）関心対象の生物の試料（例えば、CDC、USAMRIIDなどからのもの）を使用のために選択し、露出されたエピトープに対するモノクローナル抗体（mAb）を作製する；これらの生物がいずれも交差反応の原因となりうる共通の表面エピトープを有していない場合、または確実に「死滅した」生物を入手できない場合には、その種に特異的な1つまたは複数の抗原を選択し、精製した上でそれらのクローニングされた遺伝子から発現させること、または化学合成したペプチドによって模倣させることが可能である。抗体はすべて、蛍光分子を直接結合させるか、または二次蛍光で標識した抗体と併用する。直接標識抗体の検査は、FACS分析により、他の系統学的な類縁種、特に本明細書に記載したものに対する特異性に関して行う。
【０１０５】
上に挙げたさまざまな細菌、リケッチア、ウイルスおよび真菌、または他の適したモデル微生物に対する抗体を用いて、病原体検出用のレアイベント画像化システム（REIS）を開発することができる。6種の異なる抗体のそれぞれを4種の異なる染色剤と結合させ、合計24種の識別可能な蛍光標識抗体を作製する。究極的には、24種の識別可能な蛍光団（24種の特異抗体のセットと結合させたもの）を用いる多重検出システムにより、2枚のスライド（すなわち、24種の抗体が2セット）のみで、ヒトを標的とする既知のBW病原体またはBW病原体と疑われるもののすべてを、3枚のスライドのみで本明細書に挙げたBW病原体のほぼすべてを観測し、陽性のものを同定することが可能になると考えられる。
【０１０６】
スライド上に固定化された病原体の免疫細胞化学的検出。抗体を産生させた6つの種の弱毒株または照射（死滅）生物の試料（病原性であれば、CDC、USAMRIIDなどからのもの）を、既知の数として、REISを用いた分析のために接着性スライドガラスに対して直接適用した。
【０１０７】
第1のセットの実験では、各々の種からの既知の多数の生物体を、それらのコグネイト標識抗体の感度レベルを評価する目的で、REISを用いて個別に検討する；それぞれが単一の個々の生物体を検出しうる必要があり、その計数は定量的である必要がある。DAPIを従来通りにDNAの染色に用いる、またはRNAウイルスに対してアクリジンオレンジを用いる。手順のすべてのパラメーター（温度、緩衝液の組成、抗体濃度など）を、インキュベーション時間が最短になるように特に注意を払って、各々の生物体／抗体のセットに対して最適化する。初期条件は本質的には実施例1に記載した通りである。
【０１０８】
第2のセットの実験では、10％〜90％および90％〜10％の比率でスライド上に播種した関心対象の生物体のすべての対を、REIS分析の下で交差反応性がないことを確認する目的で検討する。
【０１０９】
第3のセットの実験では、多重構成に関して検討する；すなわち、多重物を用いた検出効率の検証が可能になるように、6種の生物の混合物（細菌／リケッチア、ウイルス、およびその2つの混合物）を5、10、15、19、23および28％の比率で用いる。続いて、6種の抗体のそれぞれの4種の調製物を用い、生物体を上記と同じ比率で播種して、24通りの強力な多重実験を行う。
【０１１０】
これらの実験の全体を通じて、検出効率に関するデータを収集する。これは本明細書に記載した75種の生物体（または任意の他のBW病原体）に対して行うことができる。この種の情報は、合わせて効率的に分析しうる生物体のセットを決定するのに有用であり、この点は、スライドに対する接着性（実施例2参照）または抗体とのインキュベーションに関する必要条件に種間での差異がある場合に特に重要と思われる。
【０１１１】
環境試料またはヒト体液中の病原体の免疫細胞化学的検出。上に考察した通り、微生物の免疫細胞化学的検出のための最適化された調製手順は、環境（大気および水）試料およびヒト（血液および他の体液）試料に適用される。水中の病原体はその源から直接処理しうるが、大気中の細菌およびウイルスはそれらをスライド上に固定化するために特別な試料採取手順を必要とする。SKC社からのBioSampler（登録商標）を含め、適した大気捕集装置がいくつか市販されている。これはすべてガラスでできた真空駆動式のインピンジャー装置であり、液体に通気して泡立たせるのではなく、粒子の跳ね返りが最小限に抑えられ、再噴霧化が減少するように、収集用液体の表面に対して接線方向にある空気ノズルを用いる。水または粘度の類似した液体を収集用液体として用いて流速12.5L／分で動作させることにより、BioSamplerの収集効率は直径1μm程度の粒子に関しては100％近くになり、0.5μmでも依然として約90％、0.3μmで約80％である。このため、ほとんどの細菌は直径1〜10μmであり、多くのウイルスの大きさはこの範囲の下端である（例えば、エボラウイルスで100×80nm）ことから、BioSampler（登録商標）は大気中の細菌、真菌、花粉およびウイルスを収集するための優れた装置である。その他の大気捕集装置も適している。例えば、ある種の試料に好都合と思われるSKC社の別の製品にAir-O-Cell捕集カセット（SKC, Inc.）があり、この装置では、大気中の粒子を加速させて粘着性スライドに衝突させるが、これはさまざまな染色手順および顕微鏡検査を行うのにまさに適している。しかし、この収集方法は、2μmまたは3μmよりも小さい粒子には有効でない。
【０１１２】
環境試料の採取において調整する必要のある主なパラメーターは、試料採取時間および収集用液体の組成である。さまざまな液体を、スライドへの接着を補助する能力に関して、既知の量の生物体を用いて試験し、直接接種試験で比較することができる。
【０１１３】
ヒト体液の分析について、血液試料の分析によって例示する。第1に、提供者からの正常血液に既知の量の病原体（細菌およびウイルス）を加える。微生物の回収を分析し、検出閾値を確立した上で、手作業による分析と自動分析を比較する。微生物学研究所（例えば、Dana-Farber Cancer Institute）から第2の陽性血液培養物を入手し、本明細書に記載した細菌検出法に利用して、臨床結果（細菌培養に基づく）と比較する。これに加えて、患者からの陰性血液試料を対照として役立てることができる。
【０１１４】
インサイチューハイブリダイゼーションによる病原体検出のための方法の開発。免疫蛍光法（IF）はレアイベントの分析のために現時点で選択される方法ではあるものの、核酸プローブおよびインサイチューハイブリダイゼーション（ISH）の手法を用いた検出の方が好ましいと考えられる理由もいくつかある。これらを表7にまとめた。このように、この種の手法はIFにおける抗体の使用に代わる有用な選択肢となる。
【０１１５】
（表7）ISHがIF手順よりも優れると考えられる利点
【０１１６】
核酸プローブの作製。標的とする生物に関して入手可能な配列情報のすべてを用いることにより、それらのそれぞれに対して特異的なオリゴヌクレオチドプローブを設計することができる。他の生物と配列がたまたま一致してしまうリスクは交差反応性エピトープの場合よりもはるかに低いが（実施例2参照）、これは設計されるプローブのそれぞれを細菌／ウイルス核酸データベースの全内容と直接比較して、特定の標的に対して一意的となるように設計しうるためである。非常に短いプローブ（例えば20量体）を用いることにより、細胞壁／キャプシド浸透性および細胞内核酸標的に対する到達性を最大限に高めることができ、感度を最大限に高めるために、大量に発現されるRNAを用いることができる。この場合には、それぞれの種に対して特異的な、関心対象の細胞性生物に対するリボソームRNA中の配列を選択することが有用である。ウイルスの場合には、最も大量に発現される遺伝子に対して選択的なプローブを設計する。
【０１１７】
単一標識実験にはジゴキシゲニン検出システムを用いることができ、このシステムはキットとして市販されている（Boehringer Mannheim）。しかし、ほとんどの場合には多重標識が必要と思われ、これはこのシステムでは不可能である。その代わりに、蛍光色素（例えば、Genset Corp.のもの）と結合させたヌクレオチドの存在下でオリゴヌクレオチドを合成することが考えられる。シグナル増強が必要であるか求められる場合には、オリゴヌクレオチドを合成時にタグ（例えば、ビオチン）で標識してもよい。この場合、タグ標識された各プローブは、標識が例えば24種の蛍光団のいずれか1つであるような、複数の異なるストレプトアビジン標識複合体の1つと別個に反応すると考えられる。これらの事前に反応させたオリゴプローブ複合体は細菌膜を通って自由に拡散する程度に小さい必要がある。しかし、そうでない場合には、細胞をリゾチーム／EDTAによって透過化を行うことができる。
【０１１８】
スライド上に固定化された病原体のインサイチューハイブリダイゼーションによる検出。これらの実験は、上記の実施例2に記載したものと類似すると考えられる。「第1のセットの実験」は単一標識のみを要し、ジゴキシゲニンシステムによって行われる。他のすべてには、上記の蛍光標識オリゴヌクレオチドまたはビオチン化オリゴ＋ストレプトアビジン標識複合体による検出方法を用いる。この場合も同じく、これらの実験の全体を通じた検出効率に関する収集データの評価により、単一のスライド上での多重アッセイとして合わせて観測することが可能な、BW病原体の最適なセット（最大24種）を決定することができる。
【０１１９】
環境試料およびヒト体液中の病原体のインサイチューハイブリダイゼーションによる検出。これらの実験は実施例2に記載したものと類似している。環境試料およびヒト試料を、免疫細胞化学およびインサイチューハイブリダイゼーションを用いて並行的に分間析する。
【０１２０】
実施例 4 ：単一標識のプロトコール
抗体はすべて、20％ヒトAB血清を含むPBS中に希釈する。
1．血液を溶解させる：15mlコニカルチューブ内で3mlの血液に対して11mlの等張NH４Cl。室温で40分間放置する。
2．1500rpmで5分間遠心する。
3．NH４Clおよび赤血球の上清を除去し、白血球のペレットを残す。ペレットを10ml PBS中に再懸濁する。
4．1500rpmで5分間遠心する。
5．上清を除去する；ペレットのサイズに応じて、ペレットを1、0.5または0.25ml中に再懸濁する。
6．血球計算器による細胞数算定のために細胞、トリパンブルーおよびPBSの希釈液を作製する。1：100希釈：10μlトリパンブルー、10μl細胞、980μl PBS。
7．（接着スライド上の）サークル1つ当たりの細胞が5x10^5個／100μlとなるように計算して調整する。
8．接着性スライド上に細胞を播く；細胞の接着のために37℃で40分間おく。
9．サークル1つ当たり60μlの50：50培地をスライドに添加する；37℃で20分間インキュベートする。
10．スライドを2％パラホルムアルデヒド中に室温で20分間おく。
11．スライドを3分間×2回すすぎ洗いする。
12．スライドを-20℃のメタノール中に5分間おく。
13．PBSで3分間×2回すすぎ洗いする。
14．60μlの20％ヒトAB血清を各サークルに添加し、37℃で20分間おく。すすぎ洗いは行わないこと。水を切る。
15．60μlの一次抗体（例えば、抗サイトケラチン）を各サークルに添加する。37℃で1時間インキュベートする。
16．PBSで3分間×2回すすぎ洗いする。
17．60μlの二次抗体（例えば、抗ウサギローダミン）を添加する。37℃で30分間インキュベートする。
18．PBSで3分間×2回すすぎ洗いする。
19．60μlのDAPIを各サークルに添加する。室温で10分間インキュベートする。
20．PBSで1回すすぎ洗いする。
21．dH2O中におく。
22．グリセロールゼラチン中に封入する。35μlを各サークルに載せる。カバーグラスを被せる。
23．スライドはホイルで覆った上で室温で保存してよい。
【０１２１】
実施例 5 ：二重標識のプロトコール
標識のプロトコール
抗体はすべて、20％ヒトAB血清を含むPBS中に希釈する。
1．血液を溶解させる：15mlコニカルチューブ内で3mlの血液に対して11mlの等張NH４Cl。室温で40分間放置する。
2．1500rpmで5分間遠心する。
3．NH４Clおよび赤血球の上清を除去し、白血球のペレットを残す。ペレットを10ml PBS中に再懸濁する。
4．1500rpmで5分間遠心する。
5．上清を除去する；ペレットのサイズに応じて、ペレットを1、0.5または0.25mL中に再懸濁する。
6．血球計算器による細胞数算定のために細胞、トリパンブルーおよびPBSの希釈液を作製する。1：100希釈：10μlトリパンブルー、10μl細胞、980μl PBS。
7．（接着スライド上の）サークル1つ当たりの細胞が5x10^5個／100μlとなるように計算して調整する。
8．接着性スライド上に細胞を播く；細胞の接着のために37℃で40分間おく。
9．サークル1つ当たり60μlの50：50培地をスライドに添加する；37℃で20分間インキュベートする。
10．スライドを2％パラホルムアルデヒドPBS中に室温で20分間おく。
11．スライドをPBS中3分間×2回すすぎ洗いする。
12．60μlの20％ヒトAB血清を各サークルに添加し、37℃で20分間おく。水を切る。すすぎ洗いは行わないこと。
13．60μlの一次抗体（例えば、抗GD2、抗GD3、抗Her-2neuまたは抗KSA／EpCAM）を各サークルに添加する。37℃で1時間インキュベートする。
14．PBSで3分間×2回すすぎ洗いする。
15．60μlの二次抗体（例えば、抗マウスAlexa Fluor488）を添加する。37℃で30分間インキュベートする。
16．PBSで3分間×2回すすぎ洗いする。
17．スライドを-20℃メタノール中に5分間おく。
18．PBSで3分間×2回すすぎ洗いする。
19．60μlの20％ヒトAB血清を各サークルに添加する；37℃で20分間おく。水を切る。すすぎ洗いは行わないこと。
20．60μlの一次抗体（抗サイトケラチン）を各サークルに添加する。37℃で1時間インキュベートする。
21．PBSで3分間×2回すすぎ洗いする。
22．60μlの二次抗体（例えば、抗ウサギローダミン）を添加する。37℃で30分間インキュベートする。
23．PBSで3分間×2回すすぎ洗いする。
24．60μlのDAPIを各サークルに加える。室温で10分間インキュベートする。
25．PBSで1回すすぎ洗いする。
26．dH2Oですすぎ洗いする。スライドを乾燥させる。
27．スライドをPro-Long Anti-fade封入剤（Molecular Probes）で封入し、カバーグラスを被せて、無色透明のマニキュア液で封止する（選択的）。
28．アルミニウムホイルで覆い、4℃で保存する。
【０１２２】
実施例 6 ：細菌試料の調製
1．細菌を半対数期まで増殖させる（600nmでのOD＝0.5）。
2．0.5mlの細菌懸濁液を遠心する（5Krpmで5分間）。
3．細菌を1mlの10％PBS中に再懸濁する。
4．50μlの細菌再懸濁液をスライド上のウェルに添加する（Clear-CellまたはAd-Cellスライドを用いる場合はゼラチンコーティングは不要であるが、他の場合には細菌のスライドに対する結合性を高めるためにスライドをゼラチンで前処理する）。
5．細菌懸濁液を37℃で30分間乾燥させる。
6．室温のPBSですすぎ洗いした後に、4％パラホルムアルデヒド溶液中に25〜30分間おく。
7．室温のPBSですすぎ洗いした後に、100μl トリトン／ウェルを滴下して5分間おく。
8．室温のPBSですすぎ洗いする。
9．PreHyb溶液を加えて46℃で30分間おく（Prehyb溶液；50ng／μl BET42a、Hyb溶液中、Hyb溶液は以下を参照）。
10．*46℃で120分間ハイブリダイズさせる。Hyb溶液は蛍光団濃度5ng／μlおよびBET42a濃度50ng／μl。
11．*48℃で30分間洗浄する。洗浄溶液は前もって48℃に加熱しておく必要がある。スライドに少量の洗浄溶液をかけた後に洗浄溶液中に30分間浸漬する。
12．*スライドを室温のPBSですすぎ洗いする。
13．*DAPIを室温で5分間適用する。
14．*室温のPBSですすぎ洗いしてDAPIを洗い流し、風乾後にGel封入し、カバーグラスを被せて縁をマニキュア液で封止する。
*段階10以降は蛍光団が光退色しないように暗所で行う必要がある。
【０１２３】
Hyb 溶液
40％ホルムアルデヒド溶液
5M NaCl 720μl
1M Tris-HCl（pH7） 80μl
10％SDS 4μl
ddH2O 1600μl
ホルムアルデヒド 1600μl
蛍光団を濃度5ng／μlとなるまで添加する
【０１２４】
洗浄溶液
5M NaCl 2.25ml
0.1％SDS 0.1ml
1M Tris-HCl（pH7.6） 2.0ml
ddH2O 95.65ml
【０１２５】
FITC、Alexa Fluor 488、Cy 5、Cy3およびBet42aでブロッキング標識したオリゴヌクレオチドを検討した。プローブの特異性および標識のシグナル強度を確認するための実験を行った。上に挙げたプローブ配列はすべて、その標的のみと特異的に反応し、他の細菌とは反応しなかった。
【０１２６】
実施例 7 ：患者試料の採取
悪性カルチノイド腫瘍と診断された白人男性患者1例が中腸の治療を受けた（内容は不明）。標準的な治療レジメンを完了した後に、この患者は標準的な臨床検査の結果に基づいて「癌が消失した」と診断された。そこで、この患者の血液に対して、本質的には本明細書に記載した通りの方法を行ったが、この際の試料の白血球数は42×10６であった。これらの白血球の15×10６個の試料をプレーティングし、実施例5に例示した二重標識プロトコールにより、抗GD2抗体（14／18）およびAlexa Fluor 488抗体をそれぞれ一次抗体および二次抗体として用いた後に、抗サイトケラチンおよび抗ウサギローダミンをそれぞれ一次抗体および二次抗体として用いることによって染色した。患者の試料中にはサイトケラチン抗体による陽性細胞が3個認められた。この結果は、この患者が実際には癌が消失した状態にないことを示している。この検出の結果として、この患者は、転帰が改善する見込みが高まるように、癌細胞をより徹底的に排除するための治療レジメンをさらに一定期間にわたって受けることになった。
【０１２７】
その他の態様
本発明をその詳細な記載とともに説明してきたが、以上の説明は本発明を例示するためのものであって、その範囲を制限するものではなく、それは添付する特許請求の範囲によって規定されることが理解される必要があるその他の面、利点および修正は本発明の範囲に含まれる。
【０１２８】
例えば、実施例1に記載した手順は好印象を与えるが、この「第1世代」のレアイベント画像化システムに改良を加えることも可能である。いくつかの既知の細胞処理速度に関する律速因子は機械的なものであるが、これは数百万個の細胞をかなり高倍率（通常10〜20倍）で走査しなければならないためである。実際、システムの速度は問題の一つである：処理速度が細胞1000個／分であれば、5×10６個の細胞を走査するためのデータ収集時間は休まずに約3.5日を要すると考えられる。スライド上の細胞密度は幾分高めることができると思われるが、現在用いられているカメラのサイズおよび感度では倍率はせいぜい10倍または5倍に制限され、時間が重要な要因であるレアイベントの検出に用いるにはこのような遅いシステムは不十分であり、実用性の点から使用できない。これよりもかなり迅速ではあるが（約4時間で最大10７個の細胞）、「第1世代」のシステムも臨床（または環境モニタリング）の現場で真に有用なものとなるには改良が必要である。
【０１２９】
この欠点に対処するために、顕微鏡分析時間を4時間から10分間未満に短縮することを目標として、「第2世代」のREISシステムを開発することができる。急速に進歩している電子画像化およびソフトウエア業界で利用可能な技術に基づけば、この目標は妥当なものである。その鍵となるのは、非常に視野の広い極めて高感度のカメラを用いることであり、これにより、スライドを走査せずに広範囲の顕微鏡視野を取り込むことが可能と思われる。「第1の世代」システムの処理時間を短縮するために高利得デジタルカメラを用いるというアイデアは、ハッブル望遠鏡の成功によって生まれた。先進型のデジタル式（アナログではなく）電子カメラにより、遠く隔たった星々を単一のピクセルとして取り込むことができる。ある種の最新型カメラに用いられているグレード1の高量子効率バックイルミネーション型電荷結合素子（「CCD」）チップのサイズは24.5×24.5mmであり、ピクセルアレイは1024×1024である。1600×1600ピクセルアレイの新たなCCDチップも入手可能であり、これによってさらに広範囲の顕微鏡視野を調査することが可能になると考えられる。このような技術を用いることにより、スライド全体の画像で1枚のチップを構成させ、究極的には大規模な検体フィールド（例えば、細胞1×10９個）内の細胞1個ずつを単一のピクセルとして画像化することも可能と考えられる。
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2001年2月2日に提出された「レアイベント検出システム（Rare Event Detection Sysem）」と題する米国特許出願第60／265,909号の利点を請求するものであり、この出願はその全体が参照として本明細書に組み入れられる。
【０００２】
連邦政府の資金援助を受けた研究としての申告
本発明は、米国立衛生研究所（National Institutes of Health）からの助成金（第CA13849号）により、連邦政府からの資金を受けてなされたものである。政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
発明の背景
ヒトの癌のほとんどは正常および／または異常な遺伝子の異常発現を特徴としており、癌細胞に自然淘汰が作用することによって増殖制御の喪失、血管新生、浸潤および転移が引き起こされる。このため、患者の試料中の特定の表現型の癌細胞を検出することができれば、医療提供者に対して有意義な情報がもたらされる。例えば、転移性癌細胞が体内に検出されれば、医療専門家はその患者に対してより積極的な治療法を検討すると考えられる。
【０００４】
癌マーカーの発現に依拠した癌細胞の検出方法は一般に、長く手間がかかり、時には費用もかかる免疫組織化学または核酸ハイブリダイゼーションの手順を必要とし、研究所には広く普及しているが、診療施設ではそれほど利用しやすくない。さらに、多くの場合、スクリーニングされる個々のマーカーは、癌の進行の後期になって初めて、または検出可能なレベルとして産生されるため、早期発見の恩恵が得られる機会を逃してしまう。現在の技術では、1百万分率（すなわち、100万個の他の細胞の中に癌細胞が1個の割合）程度の微小転移を検出することも可能であるが、癌によっては、この検出レベルでも真の「早期発見」には不十分である。検出感度のレベルがさらに上がれば、癌細胞の増殖に対する適切でより効果的な介入を可能にし、それによってより効果的かつ適時な癌治療および疾患修飾療法が可能になるような癌細胞の検出能が効果的に得られると考えられる。したがって、診療施設での使用により適した、迅速で、効率的で、信頼性が高く、感度の高い検出方法に対しての需要がある。
【０００５】
戦場での生物兵器（BW）の検出にも同様の問題があり、すなわち、多数の粒子の中の稀な粒子（例えば、毒素またはウイルス）を検出するために適した方法も装置もない。生物兵器は、意図的に用いられると他のものに危害を及ぼす、細菌およびウイルスまたは関連毒素などの感染因子として定義され、長きにわたって人類とともに存在してきた。矢尻が、毒素を含む植物もしくは動物の抽出物；またはガス壊疸菌クロストリジウム-パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）の源であってしばしば破傷風菌C.テタニ（C. tetani）の源でもある糞便もしくは腐りかけの肉に浸されていることからみて、これらはおそらく元々は先史時代に用いられていたと思われる。BWが記録に初めて現れたのは紀元前6世紀と古く、この時期にアッシリア人が敵の井戸を麦角で汚染させている；同じくアテネのソロンはクリッサ（Krissa）包囲攻撃時に下剤性薬草ヘレボルス（ザゼンソウ）を用いて給水路を汚染させた；ローマ人および他の多くの者も同様の戦略を用いている；14世紀には蒙古人が包囲中のカッファの城壁の向こう側に疫病感染者の死体を射出機で投げ込んでおり、この出来事は欧州全域に波及した黒死病流行のきっかけになった可能性もある。BWの未成熟な用い方やより精巧な使用の例は他にも数多く、20世紀後半までに至っている。
【０００６】
現在では基礎微生物学および応用微生物学の進歩に伴い、熟練した科学者が、極めて病毒性の強い病原体および毒素を兵器として利用することが可能になっている。いくつかの国（米国を含む）は20世紀中の何らかの時点でBW計画を策定しているが、おそらく最も知られているのは日本および旧ソ連での取り組みであろう。日本陸軍は1932年から第二次世界大戦終了時まで、中国に駐屯した「731部隊」を通じて生物兵器の研究に携わった。ヒト被験者（中国およびロシアの民間人、ならびに米国、英国、中国、韓国およびロシアの捕虜）を対象にさまざまな病原体を用いた研究が行われ、これには炭疽、鼻疽、ペスト、腸チフス、パラチフスAおよびB、チフス、痘瘡、野兎病、伝染性黄疸、ガス壊疽、破傷風、コレラ、赤痢、猩紅熱、波状熱、ダニ脳炎、百日咳、ジフテリア、肺炎、性病、結核およびサルモネラが含まれていた。ソ連の計画は1928年に始まり、統治機関であった革命軍事評議会がチフス菌の形質転換株を戦場兵器として投入する非公開決議に署名している。1930年代には、北極のソロベツキー島にある施設の研究員がチフス、Q熱、鼻疽および類鼻疽の研究に携わっている。ソ連は1973年から少なくとも1990年代初期に至るまで、既存の生物兵器を近代化し、大陸間戦争に用いる強力な兵器として利用できると考えられる抗生物質およびワクチンに耐性のある遺伝子改変病原体を開発することを目標とする計画を実施していた。研究対象の病原体には、炭疽、野兎病、ペスト、鼻疽、痘瘡、エボラ出血熱、マールブルグ病、マチュポウイルス、フニンウイルスおよびベネズエラウマ脳炎が含まれる。
【０００７】
我々の社会のような開かれた社会は、まさにその本質により、国際的集団および国内集団の双方からのテロリストの攻撃を受けやすい。このような現状からみて、生物兵器による攻撃を予期して回避するため、または標的集団（軍隊または民間人）の防御を通じてそれらを無効にするために、有効な対抗手段を開発することはまさに急務である。
【０００８】
生物兵器にはそれを特に手強いものにしている独特な特徴が二、三ある。その一つは、能力のある微生物学者および機械技師を含む少人数のチームがさまざまな病原体（細菌、ウイルスまたは毒素）を増殖させて抽出し、有効な分散系を構築することに障壁がほとんどない点である：15フィート×15フィートの空間があり、10,000ドル分の装置があれば立派な生物兵器工場を建設できると推定されている。このため、BWは、敵対側に大量の犠牲者を出すことをもくろんでテロを狙う集団が選ぶ手段となっている。また、場合によっては攻撃の成果が伝染のために最初の攻撃の範囲を地理的にも時間的にもはるかに上回ることもある。さらに、BW病原体の被害者に対する作用は数時間、通常は数日間遅れることが一般的であるため、この期間中は攻撃を顕在化させずに続けられるほか（加えて、攻撃者が逃亡する機会も生じ、これは秘密裡に活動するテロリストにとってもう1つの利点となる）、種々のBW病原体への感染の初期症状は流感様であるため、BW攻撃をそれとして直ちに認識することが極めて困難になる。
【０００９】
このため、免疫のない集団に対する生物兵器攻撃に我々が効果的に対応できるかどうかは、環境内のBW病原体を、空気伝染性（室内および室外）および水系伝染性の別なく、疾患の大発生の前に迅速に検出するための新たな手法を開発することに大きくかかっている。また、臨床症状の出現前にヒトの体液中、例えば血液中の病原体を早期発見することが重要な、時間域（time window）も存在する。
【００１０】
理論的には、あらゆる病原体を生物兵器として用いることが可能である。しかし、いくつかの特徴のために、生物体または細菌毒素などの生物由来の生物活性物質（BDBS）は大量破壊用の兵器として特に適している。これらの病原体は以下のものでありうる：1）感染性、伝染性および毒性が高い（すなわち、低レベルの曝露であっても疾患を引き起こす）；2）大気中などに効率的に分散する；3）容易に増殖し、大量に生産される；4）保存下で安定である；5）環境条件、例えば長期的な影響に対する耐性がある；および6）抗生物質、抗体、他の薬剤などの投与に対する耐性がある。
【００１１】
多数の天然の病原体のほかに、遺伝的に改変されたBW病原体も加えるべきであろう。この種の病原体は、新たな疾患さえも生み出すほど（例えば、「脳痘（brainpox）」ウイルスをもたらすなど）より強力なものとして、または既存の対抗手段に対する耐性のある病原体を産生するように作製されているため特に恐ろしい。これらは予測できないため、特に障害となる。
【００１２】
上記の理由から、BW病原体を用いた秘密裡の攻撃を発見して評価することは（諜報活動がなければ）極めて困難と考えられる。現時点では公式の環境監視システムが存在しないため、攻撃が行われたとの最初の知見は、多くの場合、犠牲者が救急治療室に続々と運ばれだし、疾患の大発生が認識されてはじめて得られると考えられる。言うまでもなく、これでは遅すぎる。病原体の古典的な監視方法は、増殖培地環境試料の採取（大気、給水）または体液試料の採取（血液、尿、喀痰など）を行って試料を培養し、その後に原因を同定するために一連の微生物学検査を行うことを含む。培養が容易な作業ではない（例えば、ウイルス用の場合）という事実に加えて、この種の手順は適時に警告を得るには時間がかかりすぎる。考えられる他の分析方法には、生化学アッセイ、イムノアッセイ、「ジーンチップ（GeneChip）」スクリーニングおよびポリメラーゼ連鎖反応（PCR）が含まれるが、これらは最初の試料には存在しない可能性のある量の不純物質を必要とし（現実の脅威に見合った感度を満たすため）、このために培養がやはり必要と思われる；PCRでさえも単一の細菌またはビリオンからは現実的ではない。
【発明の開示】
【００１３】
発明の概要
本発明は、レアイベント（rare event）またはマーカーの存在の検出をもたらす技術に基づく。本発明は、ごく少量のレアイベントまたはマーカーの存在の同定、特徴分析（定量的、定性的またはその両方）、分析または判定を行うための装置および方法に関する。このようなレアイベントまたはマーカーの有無の判定、ならびにこのようなレアイベントまたはマーカーの定量化は、有毒な、または有害な可能性のある実体または状態の早期発見に有用であり、それらが後期ではなく早期に同定されれば、適切な対応、治療または他の介入計画もしくはプロトコールの適用が可能になる。レアイベントには、正常なイベント（例えば、正常な生理的状態下に存在する標的の物体（body）または細胞の有無）および異常なイベント（疾患、疾患症状または遺伝異常に伴うものといった、異常な生理的状態下に存在する標的の物体または細胞の有無）の両方が含まれる。現在の診断方法、特に癌に関するものに伴う1つの問題は、微小残存病変に関する。これはすなわち、疾患細胞または他の疾患マーカー（例えば、核酸、タンパク質、細胞表面受容体）のレベルが現在の検出方法にとっては低すぎるが、診断または治療を行わずに放置すればその後に増殖、アップレギュレーションまたは疾患の再発が起こる可能性は十分にある場合のことである。このため、多くの場合には、疾患リスク（すなわち、癌、関節硬化、中枢神経系疾患など）をより時機を逃さずに同定できれば、より早期の治療が可能になり、それがより効果的な治療につながると考えられる；または、集団に対するリスク（すなわち、生物兵器の病原体）をより早期に同定することが、曝露ならびにより多くの集団に対するそのリスクの歯止めのない波及および分散を最小限に留めることが可能になる点から望ましい。
【００１４】
本発明は、大規模な細胞集団における稀な癌細胞を検出する高感度かつ効率的な方法の発見に基づく。さらに、本明細書に組み込まれる癌細胞検出システムは、候補物体の大集団内のほぼあらゆる稀な標的物体を、同定しようとする個別の標的物体に合わせて調整したこのシステムによって検出しうるとの認識をもたらした。本発明の方法およびシステムは、検出しようとする標的物体を各サブセットが含む、大規模集団のサブセットと特異的に結合する蛍光標識に依拠している。標的物体とは、同定しようとする（例えば、標的物体に対する直接的なもの、または標識を標的物体と結合もしくは相互作用する分子と結合させるといった間接的なものを含む、標識による）、検体フィールド（specimen field）内の任意の物体（例えば、細胞、病原体、ウイルス、毒素、プリオン）のことである。候補物体とは、分析しようとする、検体フィールド内の任意の物体（例えば、細胞、病原体、ウイルス、毒素、プリオン）のことである。
【００１５】
したがって、本発明は、検体（specimen）中の標的物体（target body）（例えば、癌細胞）を検出するための方法であって、第1の蛍光団が光子を第1の波長で放出し、第2の蛍光団が光子を第2の波長で放出する、少なくとも第1の蛍光団および第2の蛍光団に対して曝露された、またはそれらによって標識された検体フィールド（例えば、ガラス表面上に塗布した末梢血液単核細胞（PBMC）または骨髄細胞）を入手すること；検体フィールドに、第1および第2の蛍光団を励起するのに十分な光を照射すること；検体フィールドを第1の光子源に関して第1の波長で、また第2の光子源に関して第2の波長で走査すること；第2の波長の光子を実質的に遮断するが第1の波長の光子は許容する光学または電子フィルターを介して生成された第1の画像である、検体フィールドの各位置での第1の画像を収集および記録すること；検体フィールド内部の対応する位置の索引付けを行うこと；第1の波長の光子を実質的に遮断するが第2の波長の光子は許容する光学または電子フィルターを介して生成された第2の画像である、検体フィールドの各位置での第2の画像を収集および記録すること；検体フィールド内部の対応する位置の索引付けを行うこと；ならびに、検体フィールド内部の単一の位置での第1の画像および第2の画像を検索（retrieve）および検査（inspect）すること、を含む方法を特徴とする。第1および第2の画像の単一の位置に候補物体が存在することにより、検体中に標的物体が存在することが示される。異なる蛍光シグナルの画像を、イベントが陽性であることの確認のため、または表現型の評価のために重ね合わせることができる。2回の走査は独立に行うことができる。
【００１６】
第1の蛍光団は、DNAと特異的に結合するDAPIなどの化合物、またはRNAと特異的に結合するアクリジンオレンジなどの化合物でありうる。第2の蛍光団は、サイトケラチンなどの癌細胞マーカーまたは別のマーカーと特異的に結合する分子（例えば、抗体または核酸）と結合させることができる。
【００１７】
いくつかの態様においては、レアイベントの検出の特異性を高めるため、または標的物体の複数のサブセット、例えば癌細胞およびウイルスを検出するために検体フィールドを第3の蛍光団で標識することができ、本方法はさらに、第3の波長で光を放出する第3の蛍光団を励起するのに十分な光を検体フィールドに照射すること；検体フィールドを第3の光子源に関して第3の波長で走査すること；検体フィールド内部の各々の第3の源の位置を登録すること；第1および第2の波長の光子を実質的に遮断するが第3の波長の光子は許容する光学または電子フィルターを介して生成された第3の画像である、検体フィールドの各位置での第3の画像を収集および記録すること；各々の第3の画像を検体フィールド内部の対応する位置に対して索引付けすること；ならびに検体フィールド内部の単一の位置での第3の画像の検索および検査を行うことを含みうる。単一の位置での第1、第2および第3の画像に候補物体が存在することにより、標的物体の存在が示される。第3の蛍光団は、上皮細胞接着分子（例えば、Ep-CAM）またはジシアロ-ガングリオシド抗原（例えば、GD2）などの第2の癌細胞マーカーと特異的に結合する分子（例えば、抗体）と結合させることができる。
【００１８】
本方法はさらに、第1の画像を生じた検体フィールド内の位置の総数を算定すること、第1の画像および第2の画像をいずれも生じた検体フィールド内の位置の総数を算定すること、または第1、第2および第3の画像を生じた検体フィールド内の位置の総数を算定することを含みうる。これに加えて、本方法は、第1の画像および第2の画像を検体フィールド内部の別の単一の位置で検査することを含むことができ、この別の方の単一の位置で第1の画像および第2の画像に候補物体が存在することにより、異なる標的物体の存在が示される。
【００１９】
本発明はさらに、以下のものを含む検出システムを特徴とする：検体フィールドを収容するための架台（stage）；検体フィールド内部の位置の画像を収集するために配置および構成された検出器（例えば、顕微鏡）；第1の蛍光団を第1の励起波長で励起するのに十分であって第2の蛍光団を第2の励起波長で励起するのに十分な光を検体フィールドに照射するために配置および構成された光源；検出器（例えば、顕微鏡）に取り付けられたカメラであって、（1）第2の蛍光団の第2の発光波長の光子を実質的に遮断するが第1の蛍光団の第1の発光波長の光子は許容する光学または電子フィルターを介して、検体フィールド内のある位置の第1の画像を取り込むため、および（2）第1の発光波長の光子を実質的に遮断するが第2の発光波長の光子は許容する光学または電子フィルターを介して、検体フィールド内のその位置の第2の画像を取り込むために配置および構成されたカメラ；ならびに、第1の画像および第2の画像を記録して、第1の画像および第2の画像を検体フィールド内部の対応する位置に対して索引付けするコンピュータであって、使用者による要求に応じて、対応する位置に関する第1の画像および第2の画像を表示するコンピュータ。
【００２０】
架台は3つの直交軸に関して動かすことができ、3つの軸の少なくとも2つでアドレス指定が可能である。または、カメラ、またはカメラおよび／もしくは画像取り込み装置を含む筐体は、3つの直交軸に関して動かすことができ、3つの軸の少なくとも2つでアドレス指定が可能である。カメラは、第1および第2の画像を取り込むための電荷結合素子、または第1および第2の画像の取り込みに用いるための多数の光学フィルターを含みうる。光学フィルターの代わりに、またはそれとともに、カメラまたはコンピュータは電子フィルターを含みうる。このようなフィルターは、一定範囲の波長（例えば、可視波長）で入手したデジタル化カラー画像を分解し、特定の波長またはより狭い範囲の波長で生成される画像にすることができる。
【００２１】
もう1つの面において、本発明は、少なくとも第1の蛍光団によって標識された検体フィールドであって、第1の蛍光団が光子を第1の波長で放出するような検体フィールドを入手すること；第1の蛍光団を励起するのに十分な光を検体フィールドに照射すること；検体フィールドを第1の光子源に関して第1の波長で低倍率で走査すること；検体フィールドの各位置での第1の画像を収集および記録すること；各々の第1の画像を検体フィールド内部の対応する位置に対して索引付けすること；ならびに検体フィールド内部の単一の位置での第1の画像の検査を行うこと、によって検体中の標的物体を検出する方法であって、その単一の位置で第1の画像に候補物体が存在することによって検体中に標的物体が存在することが示されるような方法を特徴とする。
【００２２】
本発明の方法およびシステムは、100万個の健常細胞の中にある1個の稀な癌細胞というような（これは本発明によって達成しうる感度のレベルである）、候補物体の大集団内にある稀な標的物体を迅速、高感度かつ効率的に検出することが可能である。本明細書の方法およびシステムは、約0.1百万分率程度、または相応する形でより有利には、約0.05、約0.03もしくは約0.01百万分率程度の検出レベルを可能にする。
【００２３】
1つの面において、本発明は、検体中の標的物体の有無を検出する方法であって、
少なくとも第1の蛍光団および第2の蛍光団に対して曝露された、またはそれらによって標識された検体フィールドを入手すること、この際、第1の蛍光団は光子を第1の波長で放出し、第2の蛍光団は光子を第2の波長で放出する；
検体フィールドに第1および第2の蛍光団を励起するのに十分な光を照射すること；
検体フィールドを第1の光子源に関して第1の波長で、また第2の光子源に関して第2の波長で低倍率で走査すること；
検体フィールド内部の各々の第1の源および各々の第2の源の位置を登録すること；
第2の波長の光子を実質的に遮断するが第1の波長の光子は許容する光学または電子フィルターを介して生成された第1の画像である、検体フィールドの各位置での第1の画像を収集および記録すること；
第1の波長の光子を実質的に遮断するが第2の波長の光子は許容する光学または電子フィルターを介して生成された第2の画像である、検体フィールドの各位置で高倍率の第2の画像を収集および記録すること；
各々の第1の画像および各々の第2の画像を検体フィールド内部の対応する位置に対して索引付けすること；ならびに
検体フィールド内部の単一の位置での第1の画像および第2の画像を検査すること、を含み、
単一の位置での第1および第2の画像に候補物体が存在することにより、検体中に標的物体が存在することが示されるような方法である。
【００２４】
もう1つの面において、本発明は、検体フィールドの調製が、
a．細胞試料を可溶化して試料混合物を得ること；
b．試料混合物を遠心すること；
c．試料混合物から上清を分離すること；
d．この結果得られた細胞のペレットを生理的緩衝液中に再懸濁すること；
e．細胞を接着性スライドに対してプレーティングすること；
f．細胞培養液をスライドに対して添加すること、
を含む、本明細書中の任意の方法であって、
検体フィールドの調製がさらに、
段階dの後に、細胞混合物の希釈物を作製すること、希釈物を死細胞に対する感受性のある色素で処理すること、用いるスライドの試料細胞密度を決定するために細胞数算定を行うことを含む方法である。
【００２５】
他の面において、本方法は、以下であるような本明細書中の任意のものである：標的物体が、癌細胞、上皮細胞、平滑筋細胞、樹状細胞、記憶T細胞、記憶B細胞、体細胞、正常細胞、異常細胞または幹細胞である；システムが、少なくとも1,000,000個の細胞がある検体フィールド内の少なくとも1つの標的細胞を検出しうる；システムが、少なくとも25,000,000個の細胞がある検体フィールド内の少なくとも1つの標的細胞を検出しうる；システムが、少なくとも50,000,000個の細胞がある検体フィールド内の少なくとも1つの標的細胞を検出しうる；システムが、少なくとも100,000,000個の細胞がある検体フィールド内の少なくとも1つの標的細胞を検出しうる；記録が少なくとも1024×1024ピクセルアレイの画像を含む；または、記録が少なくとも1600×1600ピクセルアレイの画像を含む。
【００２６】
他の面において、本方法は、以下であるような本明細書中の任意のものである：フィールドの検体が大多数の細胞種として白血球を含む；フィールドの検体が不均一な細胞種を含む；フィールドの検体がマクロファージを含む；検体フィールドが環境試料である；光が紫外光、赤外光または可視光である；標的物体が癌細胞であり、検体フィールドがガラス表面上に塗布された白血球または骨髄細胞である；第1の蛍光団が、DNAと特異的に結合する化合物である；第2の蛍光団が、癌細胞マーカーと特異的に結合する分子と結合している；癌細胞マーカーがサイトケラチンである；癌細胞マーカーが細胞質中に存在する；癌細胞表面マーカーが上皮細胞接着分子である；癌細胞表面マーカーがジシアロ-ガングリオシド抗原である；第1の画像を生じた検体フィールド内の位置の総数を算定することをさらに含む；第1の画像および第2の画像をともに生じた検体フィールド内の位置の総数を算定することをさらに含む；第1、第2および第3の画像を生じた検体フィールド内の位置の総数を算定することをさらに含む；第1の画像および第2の画像を検体フィールド内部の別の単一の位置で検査することをさらに含み、この別の方の単一の位置で第1の画像および第2の画像に候補物体が存在することによって別の標的物体の存在が示される。
【００２７】
もう1つの面において、本発明は、
検体フィールドを収容するための架台；
ある所定レベルおよび所定レベルの1つまたは複数の追加的な倍率で、検体フィールド内部の位置の画像を収集するために配置および構成された検出器；
第1の蛍光団を第1の励起波長で励起するのに十分であって第2の蛍光団を第2の励起波長で励起するのに十分な光を検体フィールドに照射するために配置および構成された光源；
検出器に取り付けられたカメラであって、（1）第2の蛍光団の第2の発光波長の光子を実質的に遮断するが第1の蛍光団の第1の発光波長の光子は許容する光学または電子フィルターを介して、検体フィールド内のある位置の第1の画像を取り込むため、および（2）第1の発光波長の光子を実質的に遮断するが第2の発光波長の光子は許容する光学または電子フィルターを介して、検体フィールド内のその位置の第2の画像を取り込むために配置および構成されたカメラ；ならびに
第1の画像および第2の画像を記録して、第1の画像および第2の画像を検体フィールド内部の対応する位置に対して索引付けするコンピュータであって、使用者による要求に応じて、対応する位置に関する第1の画像および第2の画像を表示するコンピュータ、
を含む検出システムである。
【００２８】
他の面において、本システムは、以下であるような本明細書中の任意のものである：架台が3つの直交軸に関して動かすことができ、3つの軸の少なくとも2つでアドレス指定が可能である；カメラが、第1および第2の画像を取り込むための電荷結合素子を含む；カメラが多数の光学フィルターを含む；検出器が1024×1024ピクセルアレイの画像を含む；検出器が1600×1600ピクセルアレイの画像を含む；または、検出器がA×Bピクセルアレイの画像を含む、ここでAおよびBはそれぞれ独立に1000から1,000,000までの整数である。
【００２９】
本発明はまた、細胞の検体フィールド内の生物兵器（biological agent）細胞に関する分析のための方法であって、
i）検体フィールドを、生物兵器細胞を特定する第1の蛍光団によって処理すること；
ii）検体フィールドを、生物兵器細胞を特定する第2の蛍光団によって処理すること；
iii）検体フィールドに、第1の蛍光団に光子を放出させるのに適した光を照射すること；
iv）検体フィールドに、第2の蛍光団に光子を放出させるのに適した光を照射すること、
v）生物兵器細胞である、光子を放出する検体フィールド内の細胞を同定すること、
を含む方法にも関する。
【００３０】
もう1つの面において、本発明は、検体フィールド内の細胞の調製が、
a．試料混合物を遠心すること；
b．試料混合物を再懸濁すること；
c．細胞を接着性スライド上にプレーティングすること；
d．スライドを固定剤（パラホルムアルデヒド）で処理すること；
e．スライドを透過化剤（トリトン（Triton））で処理すること；
f．スライドをプレハイブリダイゼーション溶液で処理すること；
g．スライドを、蛍光団を有するハイブリダイゼーション溶液で処理すること；
h．スライドを蛍光色素で処理すること、を含み、
検体フィールドを、生物兵器細胞を特定する1つまたは複数の追加的な蛍光団によって処理すること、および検体フィールドに、1つまたは複数の追加的な蛍光団に光子を放出させるのに適した光を照射すること、
をさらに含む、本明細書中の任意の方法である。
【００３１】
他の面において、本発明は、以下のような本明細書中の任意の方法に関する：少なくとも1つの蛍光団が生物兵器細胞のDNAを特定する；少なくとも1つの蛍光団が、生物兵器細胞の表面と結合する分子を特定する；少なくとも1つの蛍光団が生物兵器細胞のDNAを特定し、少なくとも1つの蛍光団が生物兵器細胞の表面と結合する分子を特定する；または、生物兵器が細菌、リケッチア、ウイルス、真菌もしくはプリオンである。
【００３２】
もう1つの面において、本発明は、以下のような本明細書中の任意の方法である：検体フィールドの調製が、
a．血液試料を塩化アンモニウム溶液で可溶化すること；
b．試料混合物を遠心すること；
c．上清の塩化アンモニウム溶液および赤血球を分離すること；
d．この結果得られた白血球のペレットをPBS中に再懸濁すること；
e．試料混合物を遠心すること；
f．この結果得られた白血球のペレットをPBS中に再懸濁すること；
g．段階fの細胞混合物、トリパンブルーおよびPBSの希釈物を作製すること；
h．細胞を接着性スライド上にプレーティングすること；
i．細胞培養液をスライドに対して添加すること、を含み、
さらに、1つの蛍光団が標的細胞でない細胞を特定する。他の面において、本方法は、本方法が1つの検体フィールドに対して60分未満で完了する；または本方法が1つの検体フィールドに対して10分未満で完了するようなものである。
【００３３】
他の面において、本発明は、移植臓器提供者を標的物体の有無に関してスクリーニングするための方法であって、検体フィールドが臓器提供者から採取された試料（例えば、血液試料、組織試料）である、本明細書中の任意の方法を含む方法である。これは、提供者における標的物体を移植の前に同定し、それによって被提供者への物体の波及を防ぐのに有用である。本発明はまた、薬剤候補を投与された対象における疾患または疾患症状に対する薬剤候補の有効性を、その有無が疾患または疾患症状の指標となる標的物体の有無に関するスクリーニングによって評価するための方法であって、検体フィールドが対象から採取された試料である、本明細書中の任意の方法を含む方法にも関する。本発明はまた、標的物体の有無に関して血液試料をスクリーニングするための方法であって、検体フィールドが血液試料である、本明細書中の任意の方法を含む方法にも関する。これは、例えば血液銀行において、汚染された血液試料を、汚染された試料が流通する前に同定するのに有用である。また、これを用いて、提供者となる可能性のある者を提供行為の前にスクリーニングすることも可能と考えられる。本発明はまた、標的物体の有無に関して液体試料をスクリーニングするための方法であって、検体フィールドが液体試料である本明細書中の任意の方法を含む方法；および、標的物体が癌細胞である本明細書中の任意の方法を含む方法でもある。
【００３４】
もう1つの面において、本発明は、細菌の存在に関するスクリーニングの方法であって、以下のような本明細書中の任意の方法を含む方法である：少なくとも1つの蛍光団が細菌に対するDNAプローブを含む；検体フィールドが外科患者から手術後に採取される；検体フィールドが食品試料から採取される；
または、以下をさらに含む本明細書中の任意の方法である：
j．スライドを、アルデヒド系固定剤に曝露させること；
k．スライドを、リン酸緩衝食塩水（PBS）中ですすぎ洗いすること；
l．ヒトAB血清をスライドに対して添加すること；
m．一次抗体をスライドに対して添加して、スライドをインキュベートすること；
n．スライドをPBS中ですすぎ洗いすること；
o．二次抗体をスライドに対して添加して、スライドをインキュベートすること；
p．スライドを有機溶媒中で曝露させること；
q．スライドをPBS中ですすぎ洗いすること；
r．ヒトAB血清をスライドに添加すること；
s．一次抗体をスライドに添加して、スライドをインキュベートすること；
t．スライドをPBS中ですすぎ洗いすること；
u．二次抗体をスライドに添加して、スライドをインキュベートすること；
v．スライドをPBS中ですすぎ洗いすること；
w．細胞染色剤をスライドに添加して、スライドをインキュベートすること；
x．スライドをPBSですすぎ洗いすること；
y．スライドを水に曝露させること；
z．スライドをマウントすること；もしくは
段階sの一次抗体がケラチンであって、段階uの二次抗体が抗ウサギローダミンである；
または、以下をさらに含む本明細書中の任意の方法である：
j．スライドを有機溶媒中で曝露させること；
k．スライドをPBS中ですすぎ洗いすること；
l．一次抗体をスライドに添加して、スライドをインキュベートすること；
m．スライドをPBS中ですすぎ洗いすること；
n．二次抗体をスライドに添加して、スライドをインキュベートすること；
o．スライドをPBS中ですすぎ洗いすること；
p．細胞染色剤をスライドに添加して、スライドをインキュベートすること；
q．スライドをPBSですすぎ洗いすること；
r．スライドを水に曝露させること；
s．スライドをマウントすること；
または以下のようなものである：有機溶媒がアルコールもしくはアセトンである；一次抗体がケラチンである；二次抗体が抗ウサギローダミンである；蛍光団が細菌を検出する；蛍光団が核酸プローブである；もしくは核酸プローブがオリゴヌクレオチドである。
【００３５】
本発明のその他の特徴および利点は、以下の詳細な説明のほか、特許請求の範囲からも明らかになると考えられる。
【００３６】
詳細な説明
本発明は、多数の候補物体の中の稀な標的物体を検出するための、蛍光を用いる方法およびシステムに関する。非常にさまざまな蛍光団が市販されており、それらの最大発光波長が異なることから、本方法およびシステムを、候補物体の単一の大集団の中の多くの異なる標的物体を検出するように適合させることができる。例えば、蛍光団A、B、C、D、EおよびFを、それぞれ標的物体1、2、3、4、5および6と特異的に結合する分子と結合させることができる。必要なのは単に、候補物体の発光波長の取り込みおよび評価を行うこと（もしあれば）、ならびに候補物体が標的物体1、2、3、4、5または6のいずれであるかを決定するために、発光波長を蛍光団A〜Fから予想されるものと比較することのみである。事実、極めて多数の標的をこのようにして同時に検出することが可能である。 本発明における使用に適した種々の試薬および手順に関するそのほかの詳細については以下に考察する。
【００３７】
検出用の検体の調製
一般的な臨床的用途において、検体は通常、特定の表現型（例えば、抗体を用いる）または遺伝子型（例えば、オリゴヌクレオチドプローブを用いる）を有する稀な細胞の存在に関するスクリーニングを行える、体液、骨髄または組織試料中の細胞試料、例えば血液細胞試料である。
【００３８】
本明細書の細胞検体の調製方法は、分析するのに望ましい細胞種の濃縮をもたらす。これは例えば、勾配分離、または可溶化および遠心分離を含む、細胞の分離または単離に適した任意の方法によって行える。
【００３９】
末梢血液または骨髄におけるレアイベントの自動検出のためには、試料の処理時の細胞の損失ができるだけ少ない調製方法を利用することが重要である。稀な細胞を確実に最大限に回収するためには、赤血球の単純な溶解（例えば、塩化アンモニウム溶液を用いる）の方が、フィコール（Ficoll）を用いる単離方法よりも好ましい。血液試料を含む同じチューブ内で溶解処理を行った後に、同じチューブ内で分離（例えば、遠心分離、遠心沈殿）を行うこと（すなわち、溶解および分離の際に試料の移行を行わない）によっても、細胞の損失が最小限に抑えられ、試料中の細胞の構成のばらつきが最小限に抑えられる（すなわち、処理の前よび後のいずれの試料においても、稀な細胞の他の細胞に比した相対的な割合が一定に保たれる）。以下の実施例の項に記載した細胞調製／接着手順により、均一な細胞調製物が得られる。
【００４０】
これに対して、通常のサイトスピン調製では細胞の最大2／3が失われてしまう恐れがある。レアイベントの顕微鏡による検出を用いるほとんどの検査では、スライド上の実際に分析される細胞の総数をこれらの検査によって記録することはできないため、細胞数に関する情報を得ることはできない。それどころか、これらの実験は単に、回収が完全であると仮定した上で、陽性イベントの数を、処理した細胞の総数と関連づけるだけである。これは偏りを生じさせる：細胞が調製時に実際には不可避的に失われることが明らかになっただけでなく、特定の種類の試料の間（表1の「範囲」の欄を参照のこと）ならびに分析する試料の種類によって回収の程度も大きく異なる恐れがある。Marienfeld Laboratory Glassware（Paul Marienfeld GmbH & Co；www.superior.de）による接着性ガラス製顕微鏡用スライドは、これらのスライドによって均一な細胞単層（最適な細胞密度で、重複が極めて少ないもの）を取り込めたことから、以降に蛍光顕微鏡検査を行う目的で細胞検体フィールドを作製するのに優れた基質であった。ひとたび培地をスライドに投入した上で、任意のアルデヒド系固定剤（例えば、パラホルムアルデヒド、ホルマリン、グルタルアルデヒド、架橋剤）によって細胞を固定する。抗原が細胞表面にないある種の細胞種の場合には、透過化剤（例えば、メタノール、トリトン）を用いて細胞を透過化することができる。抗原が表面抗原であれば、透過化の必要はない。スライドの有機溶媒（例えば、アルコール、ケトン、メタノール、エタノール、アセトン）に対する曝露を用いて細胞を可溶化することもでき、ある種の溶媒（例えば、メタノール）では固定および透過化の両方が可能である。細胞培養液は、結合していない結合部位をカバーしうる、または、例えばRPMIもしくはDMEMを含むタンパク質を有しうる、任意の培養液であってよい。生理的緩衝液とは細胞との適合性があるものであり、これには例えば任意の等張液またはPBSが含まれる。細胞染色剤とは細胞を染色するのに適した任意の色素のことであり、これには例えば、DNA染色剤、細胞質染色剤、ミトコンドリア染色剤、DAPI、カルセインなどが含まれる。適切な検体調製を行うことにより、生物組織中または液体中の予期しないあらゆる細胞種を、本発明を用いて検出することができる。例えば、血中に平滑筋細胞が存在すれば、アテローム動脈硬化を意味すると考えられる。もう1つの例として、血液銀行の貯蔵血液を、ヒト免疫不全ウイルス、B型肝炎ウイルスまたはサイトメガロウイルスといった輸血によって伝染する主要な病原体の存在に関してスクリーニングすることもできる。
【００４１】
分析用の検体フィールドの調製にどのような方法を用いるにしても、その方法は検出しようとする標的物体を破壊したり大きく変化させたりしないことが重要である。例えば、標的物体がプリオン、細菌、ウイルス、原生動物または多細胞寄生生物であれば、単離の手順は異なると考えられる。固形組織（例えば、固形腫瘍）の分析には細胞の脱凝集が必要と思われるが、プロテアーゼは標的細胞の同定に用いられる細胞表面分子を変化させる恐れがあるため、これは例えば、トリプシン処理による代わりに物理的破壊によって行われる。ウイルス検体フィールドの調製は、検体フィールド内に細胞より小さい粒子のみが存在するように、一定のサイズの大きな粒子（例えば、細胞）を濾過によって除去することを必要とする。または、ウイルスに感染した細胞の検出が望ましい場合には、細胞を検体フィールドに含めることもできる。病理学および顕微鏡法の技術分野の当業者は、個々の生物試料に対するよく知られたさまざまな調製手順を利用することができ、これらの手順は検出しようとするいかなる標的物体に対しても適合化しうる。このような手順には、Shandon Cytocentrifugeを用いたサイトスピン法、Sakura（Torrance, CA）社によるCytotek Monoprep、およびCysyc（Boxborough, MA）社によるThinPrepが含まれる。
【００４２】
分析しようとする試料が血液などの生体液でない場合には、異なる装置を用いて大気などから試料を収集することができる。一般に大気捕集装置は、大気もしくは気体がその中もしくは傍らを通過する液体を含む、または大気もしくは気体がフィルターを通過する際に微粒子（例えば、標的物体）を捕捉する多孔性フィルターを含む、収集チャンバーを有する。液体を含む収集チャンバーの場合には、収集用液体に遠心または他の処理を行って液体から粒子を分離することができる。続いて、分離した粒子を標識または分析のために基質に沈着させる。フィルター（例えば、ニトロセルロース）を含む収集チャンバーの場合には、フィルターが、後に標識または分析を行うための基質としての役割を果たすことができる。または、粒子をフィルターから洗い流すこと、またはフィルターを溶解もしくは他の様式で粒子から除去することもできる。フィルター式収集チャンバーを、フィルターを通って流れる液体（例えば、給水試料または脳脊髄液）から粒子を収集するように適合させることもできる。さらに、上に考察したように、液体中に存在する粒子状物質を除去するために液体試料を遠心することもできる。被験物質が液体試料中に溶液として保たれ、望ましくない粒子状物質が除去される（例えば、濾過により）場合には、元の液体を分析用の試料とすることができる（溶液として、または試料溶液の真空乾燥を行う）。さまざまな試料採取器が知られており、本発明に用いることができる。SKC BioSampler（登録商標）および他の試料採取装置を販売しているSKC, Inc.（www.skc.com）を参照のこと。
【００４３】
本発明は生物兵器病原体、またはヒト、動物もしくは植物に有害な任意の病原体の検出を含むものと考えている。この点に鑑みて、本発明の方法およびシステムは、ヒト、商業的に価値のある動物または商業的に価値のある植物に有害な病原体を検出するために用いることができる。ヒトの細菌性およびリケッチア性病原体には、以下のものが非制限的に含まれる：Q熱リケッチア（Coxiella burnetii）、バルトネラ・クインタナ（Bartonella Quintana）（Rochalimea quintana、Rickettsia quintana）、リケッチア・プロワセッキ（Rickettsia prowasecki）、紅斑熱リケッチア（Rickettsia rickettsii）、炭疽菌（Bacillus anthraci）、ウシ流産菌（Brucella abortus）、ヤギ流産菌（Brucella melitensis）、ブタ流産菌（Brucella suis）、オウム病クラミジア（Chlamydia psittaci）、ボツリヌス菌（Clostridium botulinum）、野兎病菌（Francisella tularensis）、鼻疽菌（Burkholderia mallei）（Pseudomonas mallei）、類鼻疽菌（Burkholderia pseudomallei）（Pseudomonas pseudomallei）、チフス菌（Salmonella typhi）、赤痢菌（Shigella dysenteriae）、コレラ菌（Vibrio cholerae）、ペスト菌（Yersinia pestis）、ウェルシュ菌（Clostridium perfringens）、破傷風菌（Clostridium tetani）、腸管出血性大腸菌（血清型O157および他のベロ毒素産生血清型）、レジオネラ菌（Legionella pneumophila）および偽性結核菌（Yersinia pseudotuberculosis）。ヒトのウイルス性病原体には、以下のものが非制限的に含まれる：チクングンヤウイルス、コンゴ・クリミア出血熱ウイルス、デング熱ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、エボラウイルス、ハンターンウイルス、フニンウイルス、ラッサ熱ウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、マチュポウイルス、マールブルグウイルス、サル痘ウイルス、リフトバレー熱ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、痘瘡ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、白痘、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、キャサヌル森林熱ウイルス、跳躍病ウイルス、マリーバレー脳炎ウイルス、オムスク出血熱ウイルス、オロプーシェウイルス、ポワサンウイルス、ロシオウイルスおよびセントルイス脳炎ウイルス。
【００４４】
動物の細菌性およびリケッチア性病原体には、マイコプラズマ・ミコイデス（Mycoplasma mycoides）および炭疽菌が非制限的に含まれる。動物のウイルス性病原体には、以下のものが非制限的に含まれる：アフリカブタ熱ウイルス、鳥類インフルエンザウイルス2型、ブルータングウイルス、口蹄疫ウイルス、ヤギ痘ウイルス、ヘルペスウイルス（アウジェスキー病）、豚コレラウイルス（ブタ熱ウイルス）、狂犬病ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、小反芻動物病ウイルス、ブタ腸内ウイルス9型（ブタ水疱病ウイルス）、牛痘ウイルス、羊痘ウイルス、テッシェン病ウイルスおよび水疱性口内炎ウイルス。
【００４５】
植物の細菌性およびリケッチア性病原体には、 ザントモナス・アルビリネアンス（Xanthomonas albilineans）、柑橘潰瘍病菌（Xanthomonas campestris pv. Citri）、イネ白葉枯病菌（Xanthomonas campestris pv. Oryzae）および柑橘班入病菌（Xylella fastidiosa）が非制限的に含まれる。植物のウイルス性病原体には、バナナ萎縮病ウイルスが非制限的に含まれる。
【００４６】
プリオンは、ウシ海綿状脳症、スクレイピーおよびクロイツフェルト・ヤコブ病を非制限的に含む疾患と相互に関係している。
【００４７】
ある具体的な例としては、試料を以下のように調製することができる。微生物の免疫細胞化学的検出のための最適化された調製手順を、環境性（大気および水）およびヒト（血液および他の体液）試料に適用することができる。大気試料の収集には、SKC社（SKC, Inc.）のBioSampler（登録商標）を用いる。BioSampler（登録商標）はすべてガラスでできた真空駆動式のインピンジャー装置であり、液体に通気して泡立たせるのではなく、収集用液体の表面に対して接線方向にノズルを介して大気を通過させる。この設計のため、粒子の跳ね返りが最小限に抑えられ、再噴霧化が減る。水または粘度の類似した液体を収集用液体として用いて流速12.5L／分で動作させることにより、BioSamplerの収集効率は直径1μm程度の粒子に関しては100％近くになり、0.5μmでも依然として約90％、0.3μmで約80％である。このため、ほとんどの細菌は直径1〜10μmであり、多くのウイルスの大きさはこの範囲の下端である（例えば、エボラウイルスは1000×80nm）ことから、BioSampler（登録商標）は大気中の細菌、真菌、花粉およびウイルスを収集するための優れた装置である。
【００４８】
その他の大気捕集装置を用いることもできる。例えば、代替的な装置の一つにAir-O-Cell捕集カセット（SKC, Inc.）がある。この装置では、大気中の粒子を加速させて粘着性スライドに衝突させるが、これはさまざまな染色手順および顕微鏡検査を行うのにまさに適している。しかし、この収集方法は、2μmまたは3μmよりも小さい粒子には有効でない。
【００４９】
環境試料の採取において調整する必要のある主なパラメーターは、試料採取時間および収集用液体の組成である。さまざまな液体を、スライドへの接着を補助する能力に関して、既知の量の生物体を用いて試験し、直接接種試験で比較することができる。
【００５０】
ヒト体液の分析については、以下の実施例1の記載のように血液試料の分析によって例示する。
【００５１】
蛍光染色
本発明の1つの利点は、本発明を、よく知られた公的に入手可能な蛍光分子の大規模ライブラリーを用いて実施しうることである。その供給元には例えば、Molecular Probes社（Eugene, OR）、Jackson Immuno Research社（West Grove, PA）、Sigma社（St. Louis, MO）が含まれる。これらの分子は単独で標的物体（例えば、蛍光性DNA染色剤）の一部と特異的に結合しうるか、または標的物体の部分と特異的に結合する抗体もしくは核酸と結合させることができる。例えば、Fluorescent and Luminescent Probes for Biological Activity、WT Mason編、Academic Press, London, 1993、およびRP HauglandによるHandbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals、MTZ Spence編、Molecular Probes, 1996を参照のこと。一般に、抗体を免疫蛍光法に用いる場合には、蛍光色素を、標的物体上の抗原に対して特異的な一次抗体と結合する二次抗体に化学的に結合させる、または一次抗体に直接結合させる。一次抗体は多岐にわたる抗原に対して入手可能である。例えば、標的物体がプリオンであれば、クロイツフェルト・ヤコブ病の診断を目的として患者の脳脊髄液中のプリオンを検出するために、プリオン特異的抗体を用いることができる。用いるのに適した一次抗体には、抗GD2抗体および抗GD-3抗体（Matreya Inc., Pleasant Gap, PA）、抗HER-2neu抗体（Dako, Carpinteria, CA）、抗KSA／EpCAM抗体（Dako）および抗サイトケラチン抗体（Sigma, St. Louis, MO）が含まれる。用いるのに適した二次抗体には、Molecular Probes社（Eugene, OR）およびJackson Immuno Research社（West Grove, PA）から入手しうるものが含まれる。スライド調製の際の抗体導入段階の間にはPBSによる洗浄を行うべきである。しかし、抗体導入が血清遮断試薬である場合、すなわち、抗体を試料中の非特異的な結合部位を遮断するために導入する場合には、PBSによる洗浄は不要である、または有害ですらありうる。
【００５２】
異なる蛍光団が非常に多く存在し、その多くが異なる最大励起波長または最大発光波長を有することから、検体フィールド内の多数（例えば、24種またはそれ以上）の標的物体の多重的な検出が可能となる。この態様において、各抗体は1種類の標的物体のみに対して特異的でありうる。さらに、多重化によって標的物体の入れ子式（nested）グループの検出が可能になり、検出精度が高まる（例えば、偽陽性を最小限に抑えられる）。以下の実施例では、試料における総細胞数を示すことができ、蛍光マーカーが断片または細胞片ではなく実際に細胞と会合していることを確認するのに有用なDNA染色剤であるDAPIを用いて、有核細胞である標的物体を同定している。続いて、抗サイトケラチン抗体を用いて、DAPI陽性細胞の標的グループ内の癌細胞標的の候補を同定した。そして最後に、癌細胞表面マーカーに対する抗体を用いて、DAPI、サイトケラチンおよび細胞表面抗原に関して陽性である真の癌細胞のサブグループを同定して算定した。この入れ子式の蛍光染色により、偽陽性の結果は事実上なくなった。他の考察については以下に述べる。
【００５３】
免疫細胞化学アッセイにまず必要なことは抗体の作製である。市販のものまたは他のものが入手可能である場合には、表面または細胞内の標的に対する既存の抗体を得ることができる。その他の場合には、抗体を新規に作製する必要がある。照射処理を行った（死滅させた）関心対象の生物の試料を入手し（例えば、CDC、USAMRIIDなどからの病原体）、これを例えばA&G Pharmaceutical, Inc.（Baltimore, MD）に提供し、露出されたエピトープに対するモノクローナル抗体（mAb）を作製してもらうことができる。この企業は、ハイブリドーマの迅速な開発（60日未満）が妥当なコストで得られるmAb作製のための方法を開発している。これらの生物がいずれも交差反応の原因となりうる共通の表面エピトープを有していない場合、または確実に「死滅した」生物を入手できない場合には、その種に特異的な1つまたは複数の抗原を入手することができる。場合によっては、検出しようとする標的物体はあるクラスの標的であってそのクラス内の個々の種ではない。このため、種特異的ではなくクラス特異的な抗体が望ましいことも考えられる。抗原を精製し、それらのクローニングされた遺伝子から発現させること、または化学合成したペプチドによって模倣させることが可能である。抗体は蛍光分子を直接結合させること、または二次蛍光標識抗体と併用することが可能である。直接標識抗体はFACS分析により、他の系統学的な類縁種に対する特異性に関して検討することができる。
【００５４】
血液または骨髄調製物における癌細胞の検出の特異性は一般に、マーカーおよび抗体を手順に用いた場合にのみ優れている。最も広く用いられているマーカーは、上皮細胞および癌由来細胞の細胞骨格成分であるサイトケラチンである。サイトケラチンが乳癌、前立腺癌、胃癌および結腸直腸癌に関する有用なマーカーであることは数多くの臨床試験で立証されているが、これは真の腫瘍細胞特異的マーカーではなく、サイトケラチン細片または染色剤粒子を含む表皮細胞、貪食細胞も染色しうる。このような場合には、免疫染色された細胞が悪性細胞であることを顕微鏡で厳密に確認することが重要である。偽陽性イベントのもう1つの原因は、上皮細胞または癌細胞マーカーによる血液細胞または骨髄細胞の交差反応性染色であり、例えばムチン上皮膜マーカーは造血細胞と交差反応を生じうる。実際に、サイトケラチン抗体が健康な血液提供者からのPBMCを標識しうることが明らかになった（実施例1における表4）。正常血液提供者の末梢血試料のうち約17％は、低レベルではあるものの（平均は1.18CK+／10６個であった）、サイトケラチン陽性を示した。「正常」試料中のこれらのCK+細胞が、良性上皮細胞、交差反応性の造血細胞、または診断されていない原発癌から播種した癌細胞のいずれであるかは不明である。
【００５５】
癌細胞検出の特異性を向上させるために、サイトケラチンならびに上皮表面マーカーEpCAMおよびGD2の同時検出のための二重標識プロトコールを開発した。この手順によって偽陽性は劇的に減少し、検討した77個の試料のうち二重標識された細胞は1つのみであり（CK／Ep-CAMおよびCK／GD2；実施例の項の表5）、このことから正常試料中に検出された少数のCK+細胞は癌由来ではないことが示唆された。血液または骨髄試料中の癌細胞を単に検出することに加えて、稀な腫瘍細胞の表現型を、例えばその悪性度、細胞周期の時期または増殖挙動に関してさらに特徴付けるための取り組みも行われている（Allgayerら、J. Histochem. Cytochem. 45: 203-212, 1997；Allgayerら、Cancer Res. 57: 1394-1399, 1997；Pantelら、J. Natl. Cancer Inst. 85: 1419-1424, 1993；およびRiesenbergら、Histochem. 99: 61-66, 1993）。乳癌試料の分析を目的としてサイトケラチン標識を増殖因子受容体または増殖関連抗原と併用する（Pantelら、前記）、または前立腺癌の分析を目的としてサイトケラチン標識を前立腺特異抗原と併用する（Riesenbergら、前記）、多重マーカー分析のためのプロトコールも開発されている。また、胃癌患者において、サイトケラチンおよびウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター受容体に関して二重陽性であった細胞は高い転移能と相関していた（Allgayerら、Cancer Res. 57: 1394-1399, 1997）。有望なそのほかのさまざまな（癌特異的）マーカーも記載されており、これには例えば、糖タンパク質（Franklinら、Breast Cancer Res. Treat 41: 1-13, 1996）、ガングリオシド（Mossら、N. Engl. J. Med. 324: 219-226, 1991）、細胞接着分子（Rossら、Exp. Hematol. 23: 1478-1483, 1995；およびRossら、Bone Marrow Transplant. 15: 929-933, 1995）および他の分子（Vrendenburghら、J. Hematother. 5: 57-62, 1996）がある。新たなマーカーが利用可能になれば、癌細胞の検出方法の感度、質および特異性が向上する可能性がある。
【００５６】
一次抗体はさまざまな抗原に関して入手可能である。例えば、標的物体がプリオンであれば、クロイツフェルト・ヤコブ病の診断を目的として患者の脳脊髄液中のプリオンを検出するために、プリオン特異的抗体を用いることができる。
【００５７】
抗体の代わりに、蛍光標識した核酸を標的物体特異的プローブとして用いることができる。実際に、インサイチューハイブリダイゼーション（ISH）における核酸プローブを用いた検出が望ましい理由はいくつかある：（1）核酸（NA）プローブの方が抗体（Ab）よりも容易、迅速かつ安価に作製できる；（2）NAプローブは自在かつ安価に増やせる（モノクローナルAbも同じであるが、ポリクローナル抗体はそうでない）；（3）NAプローブはAbよりも均一である（特にポリクローナル；多重標識（多重）実験のために、Tmの一致したプローブを選択することすら可能である）；（4）NAプローブのコグネイトRNAまたはDNA標的とのハイブリダイゼーションは、抗体のエピトープとの相互作用よりもうまく制御できる（例えば、ハイブリダイゼーション温度、イオン強度などによる）；（5）NAプローブの方が多重標識実験を実施しやすい（異なる標識と結合させたヌクレオチドを単に組み入れる、またはビオチンに続いてさまざまなストレプトアビジン標識複合体を組み入れる；免疫蛍光法（IF）では、一次Abの標識がその結合を妨げることがあり、第2のAbを検出用に用いる場合、IFでは異なる種において産生させた一次Abを用いる必要がある）；および（6）NAプローブを用いて得られたシグナルは、特に直接標識の場合、Abによるものよりも定量的であると考えられ、さらに必要に応じて増幅することも可能である（ビオチンなど）。
【００５８】
標的物体（例えば、生物兵器用の生物）に関して入手可能な配列情報のすべてを用いることにより、それらのそれぞれに対して特異的なオリゴヌクレオチドプローブを設計することができる。他の生物と配列がたまたま一致してしまうリスクは交差反応性エピトープの場合よりもはるかに低いが、これは設計されるプローブのそれぞれを細菌／ウイルス核酸データベースの全内容と直接比較して、特定の標的に対して一意的となるように設計しうるためである。非常に短いプローブ（例えば20量体）を用いることにより、細胞壁／キャプシド浸透性および細胞内核酸標的に対する到達性を最大限に高めることができる。標的物体に対して一意的な標的配列としては、感度を最大限に高めるために、大量に発現されるRNA上にあるもの、例えば、リボソームRNA中の配列などを選択することができる。ウイルスの場合には、最も大量に発現される遺伝子に対して選択的なプローブを設計することができる。
【００５９】
単一標識実験には、ジゴキシゲニン検出システム（Zardaら、J. Gen. Microbiol. 137: 2823-2830, 1991）を用いることができる。このシステムはBoehringer Mannheim社からキットとして市販されている。しかし、ほとんどの場合には多重標識が必要と思われ、これはこのシステムでは不可能である。その代わりに、蛍光色素（例えば、Genset Corp.のもの）と結合させたヌクレオチドの存在下でオリゴヌクレオチドを合成することができる。シグナル増強が必要であるか求められる場合には、オリゴヌクレオチドを合成時にタグ（例えば、ビオチン）で標識しうる。この場合、タグ標識された各プローブは、標識が例えば24種の蛍光団のいずれか1つであるような、複数の異なるストレプトアビジン標識複合体の1つと別個に反応すると考えられる。これらの事前に反応させたオリゴプローブ複合体は細菌膜を通って自由に拡散する程度に小さい必要がある。しかし、そうでない場合には、細胞をリゾチーム／EDTAによって透過化することができる。
【００６０】
上記の通り、さまざまな蛍光分子が知られており、利用可能である。50,000種を上回る染色剤が、Eastman Kodak社、Polaroid社、Fuji Film社およびMolecular Probes社（www.probes.com）から販売されている。有核細胞標的に適した分子の例には、DAPI、ヨウ化プロピジウム、アクリジンオレンジおよびYOPROが含まれる。
【００６１】
検出システムの構成要素
検出システムに必要な種々の構成要素は市販されている。検出器は、光、蛍光、または励起、放出などを含む他のエネルギー伝達の測定、記録、画像化または検出を行うための任意の手段であってよい（例えば、装置、適した鏡および／もしくはレンズの組み合わせ、光電子増倍管または他の検出手段）。一般に、本システムは、電動式架台（例えば、いずれもNikon, Japan製のNikon Microphot-FXAもしくはNikon Eclipse 1000；Ludl Electronic Products Ltd., Hawthorne, NY製の架台またはZeiss, Germany製のAxioplan 2IE MOT）、蛍光フィルター（組み込まれたもの、またはOmega Optical, Brattleboro, VTに発注）、カメラ（例えば、DAGE-MIT, Inc., Michigan City, IN製のCCD 72カメラ；Zeiss, Germany製のAxioCam；またはPixelvision（www.pixelvision.com）製のSpectraVideoカメラ）、ならびにプリンタ、モニタ、記憶媒体、ディスプレイおよび本発明を実施するのに必要なソフトウエアを有するコンピュータを備えた蛍光顕微鏡を含む。上に挙げた構成要素の多くは、Nikon、Zeiss、Georgia Instruments（Roswell, GA）、Vaytek（Fairfield, IA）、Applied Imaging, Inc.（www.micrometastasis.org/metfs1.htm）およびChromavision Medical Systems, Inc.（www.chromavision.com）などの製造元から入手可能である。
【００６２】
どの構成要素を用いるにせよ、本システムは、以下の段階またはその変形物および同等物を行えるべきであると考えられる：
1）検体フィールド（例えば、顕微鏡用スライドガラス）当たりの標的物体（例えば、癌細胞）の数を、第2もしくは第3の蛍光団またはその両方を含む物体のカテゴリーに細分して算定すること；
2）各標的物体の画像を保存すること（例えば、記録、画像化、データ記憶媒体への保管）；
3）各標的物体のx、y座標を記録すること；
4）スライド上の物体の総数を算定すること。分析は検体フィールドを走査することによって行われる。走査は顕微鏡のハードウエアによって規定されるすべての倍率で行うことができる。使用者は何らかのフィルターセット（単一、二重または三重）を用いて検体フィールドを走査することを選択できる。走査は独立に行うことができる。
【００６３】
標的物体の検出および同定のためのアルゴリズムは、生物学的画像解析のための市販のソフトウエアに基づく（例えば、Media Cybernetics, www.mediacy.com製のImage Pro Plus；またはKontron, Germany製のKS 400）。標的物体の検出に関する選択基準は、例えば、以下のものでありうる：
a） 第2および第3の蛍光チャンネルにおける蛍光強度の閾値；
b）真の標的物体（例えば、完全な細胞）を偽標的物体（例えば、夾雑物、残渣）と識別するための、第2および第3の蛍光チャンネルにおける面積および形状；ならびに
c）第2および／または第3の蛍光チャンネルのシグナルが、常に第1の蛍光チャンネルからのシグナル（例えば、DAPIシグナル）と共存すべきであること。
【００６４】
各走査の前に、使用者が標的物体に対する選択基準を定義する。走査の後に、選択基準（上記参照）を満たすすべての標的物体の数を表示し、第2、第3またはその両方の蛍光標識を示す標的物体に細分する必要がある。選択基準を満たすすべての標的物体を画像化し、三色RGB画像として保存する（上記の段階2）。走査の終了時に、すべての画像を画像の一覧として表示し、オプションとして各画像の拡大を用意する。選択基準（上記参照）を満たすすべての標的物体についてx,y座標を記録し、使用者が各位置を呼び出して架台がその位置に自動的に移動するようにすることができる（上記の段階3）。このオプションにより、使用者は検出されたすべての標的物体を顕微鏡の高倍率下で調べ直すことができる。また、指定された位置で入手した対応する画像を呼び出すことも可能である。各走査時には、細胞の総数（第1の蛍光団、例えば、DAPIシグナルを計数し、走査終了時に表示する必要がある（上記の段階4）。
【００６５】
検出システムのユーザーインターフェース
1．走査の設定。走査の開始時に、使用者は以下の情報を入力し、走査のパラメーターを選択するように促される：
1．スライドの識別情報；
2．走査するスライドの数；
3．走査の倍率（対物レンズを選択）；および
4．走査のフィルター設定（走査中の単一、二重／三重フィルター、またはフィルターの交互使用を選択）。
【００６６】
入力した情報に基づいて初期画像が表示され、カメラが設定される（輝度およびコントラストを調整する）。使用者は陽性細胞に関する選択基準を定義し、以下を選択しなければならない：
1．強度の閾値；
2．面積の下限および上限；ならびに
3．形状の基準。
【００６７】
2．走査。初期設定の後に、走査が自動的に始まり、仕様に従ってスライドを分析する。
3．データの出力および記憶。各スライドに関して、以下の情報を表示して保存する：
1．標的物体の数；
2．各標的物体の画像および架台上での対応する座標；ならびに
3．スライド上の標的物体の総数。
【００６８】
上の情報1〜3は、使用者が命名して定義したフォルダ（スライドの識別情報）に保存される。
【００６９】
4．陽性細胞の手作業による確認。使用者は保存された画像を手作業で選択し、画像を入手した位置を呼び出すことができる。架台が自動的にその位置に移動し、接眼レンズを通してフィールドを観察することができる。
【００７０】
速度は、レアイベントの自動分析システムを評価するための基本的なパラメーターである。以下の実施例1に記載したシステムは、100万個の細胞を陽性イベント（例えば、CK陽性）に関して走査し、総細胞数を算定するのに約1時間を要する。より高感度の電荷結合素子（CCD）カメラおよびより高速なコンピュータを用いて、はるかに高速なシステムを利用することもできる。このようなシステムは、細胞100万個当たりの処理時間を数分程度に短縮させうると考えられる。このフロースルー速度はフローサイトメトリーと同程度であり、さらに必要に応じて形態学的確認のために、各々の陽性イベントをより高倍率で、または異なる光学素子を用いて観察しうる能力も保っている。
【００７１】
これ以上の詳述は行わないが、当業者は上記の開示および下記の説明に基づいて本発明を十二分に利用しうると考えられる。以下の説明は、当業者がいかにして本発明を実施しうるかを単に例示するためのものとみなされるべきであり、いかなる意味においても開示の残る部分を制限するものではない。本明細書中に引用した参考文献は、印刷物、電子形態、コンピュータが読める記憶媒体またはその他の形態のいずれかにかかわらず、要約書、論文、専門誌、刊行物、教科書、論説、インターネットのウェブサイト、データベース、特許および特許公報を非制限的に含む、その全体が明示的に参照として本明細書に組み入れられる。
【００７２】
実施例 1 ：癌細胞に関するレアイベント画像化システム
材料と方法
血液検体および骨髄検体の収集。5〜10mlの血液または骨髄を、対照被験者または乳癌もしくは小細胞肺癌と診断された患者から採取し、EDTAを抗凝固薬として含むヴァキュテーナー採血管（Becton Dickinson, Franklin Lakes, NY）に入れた。試料はすべて被験者または患者からインフォームドコンセントを得た上で採取し、収集して24時間以内に顕微鏡分析用に処理した。
【００７３】
細胞株。乳癌細胞株MCF-7および小細胞肺癌細胞株SW2をAmerican Type Culture Collection（ATCC）, Manassas, VAから購入し、以下の染色プロトコールの評価およびレアイベント画像化システムの感度の決定のために用いた。細胞株は、10％ウシ胎仔血清、100U／mlペニシリンおよび0.1mg／mlストレプトマイシンを含むダルベッコ変法イーグル培地（MCF-7）またはRPMI 1640（SW2）。
【００７４】
顕微鏡分析のための試料の調製。血液試料または骨髄試料を2倍容積の0.17M塩化アンモニウムと混合し、室温（RT）で40分間インキュベートした上で、800×gで室温にて10分間遠心した。続いて、細胞ペレットを洗浄し、リン酸緩衝食塩水（PBS）中に再懸濁した。生存している末梢血単核細胞（PBMC）または有核骨髄細胞の総数を、トリパンブルー色素排除法を用いて算定した。続いて細胞を接着性スライド（Paul Marienfeld GmbH & Co., KG, Bad Mergentheim, Germany）に37℃で40分間かけて接着させ、その後にスライドを細胞培養液により37℃で20分間かけてブロックした。スライド1枚当たりに適用された細胞の総数は約1.5×10６個であった。3つの別々のサークルに分割された総接着面積は約530mm２であった。
【００７５】
サイトケラチンの単一標識のために、細胞を氷冷メタノール中で5分間固定し、PBSですすぎ洗いした上で、クラスIおよびIIサイトケラチンを標的とするウサギ抗サイトケラチン抗血清（Biomedical Technologies, Stoughton, MA）とともに37℃で1時間インキュベートした。その後、スライドをPBSで洗浄し、ローダミン結合抗ウサギ抗体（Jackson Immuno Research, West Grove, PA）とともに37℃で30分間インキュベートした上で、0.5μg／ml 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI；Molecular Probes, Eugene, OR）（PBS中）による対比染色を室温で10分間行い、グリセロール-ゼラチン（Sigma, St. Louis, MO）中にマウントした。処理したスライドは室温で保存し、1カ月以内に顕微鏡分析を行った。
【００７６】
サイトケラチンと細胞表面抗原Ep-CAMまたはGD2との二重標識のためには、細胞を1％パラホルムアルデヒド（PBS中、pH 7.4）中で室温にて5分間固定し、PBSで洗浄した上で、20％ヒトAB血清（Nabi Diagnostics, Boca Raton, FL）（PBS中）により37℃で20分間かけてブロックした。その後に、Ep-CAM（モノクローナルマウスKS1／4抗体）またはGD2（モノクローナルマウス1418抗体）を標的とする一次抗体を37℃で1時間適用した（抗体はいずれもKim-Ming Lo博士、Lexigen Pharmaceuticals, Lexington, MA.により寄贈された）。Ep-CAMを標的とする抗体は複数の製造元から入手可能であり、例えば、モノクローナルマウス抗ヒト上皮特異抗原はBiomeda社、Foster City, CAから販売されている；モノクローナル抗ヒト上皮抗原（Ber-EP4）はAccurate Chemical & Scientific Corp., Westbury, NYから販売されており、モノクローナルHEA-FITC抗体はMiltenyi Biotec社、Bergisch Gladbach, Germanyから販売されている。GD2に対する抗体はMatreya, Inc., Pleasant Gap, PAから販売されている。続いて、細胞を洗浄し、氷冷メタノール中で5分間固定した上で20％ヒトAB血清によりブロックし、抗サイトケラチン抗血清とともに37℃で1時間インキュベートした。二次抗体（FITC結合抗マウス抗体およびローダミン結合抗ウサギ抗体；Jackson Immuno Research）を混合し、37℃で30分間適用した。核を0.5μg／ml DAPI（PBS中）により対比染色した。二重標識細胞をGel/Mount（Biomeda, Foster City, CA）中にマウントした。スライドは40℃で保存し、1週間以内に顕微鏡分析を行った。
【００７７】
感度の決定のための腫瘍細胞の希釈。サイトケラチン陽性（CK+）細胞の検出の感度を決定するために、MCF-7乳癌細胞を健康血液提供者のPBMCにより連続希釈した。検討した希釈度は1：10３、1：10４、1：10５、1：2×10５、1：5×10５および1：10６である。溶液を接着性スライドに接触させ、上記の通りにサイトケラチン標識のための処理を行った。希釈度毎に最大8枚の接着性スライドを調製して走査した。試料をスライド1枚当たりの腫瘍細胞の数に関して分析し、総細胞数との関係をみた。
【００７８】
腫瘍細胞および総細胞数の顕微鏡による自動検出。画像化システム、例えば、Georgia Instruments, Inc.（Roswell, GA）により開発されたレアイベント画像化システム（Rare Event Imaging System）などを用いて、スライドを自動的に走査した。このシステムは、同社が権利を持つ、稀な蛍光イベントを検出して、分析した細胞の総数を決定する画像処理アルゴリズムを利用している。これは、自動焦点式でX、YおよびZ軸の電動制御、電動式フィルター選択および電子シャッターを備えた先進型コンピュータ制御式顕微鏡（Nikon Microphot-FXA, Nikon, Japan）から構成される。画像は積算式冷却型CCD検出器によって取り込まれ、60MHzペンティアム画像化ワークステーションによって処理される。
【００７９】
第1の段階では、陽性イベント（例えば、CK+細胞）の検出に関して、ローダミンフィルターセットを用いて、スライドを自動的に走査した。陽性イベントは蛍光強度および面積に基づく。各陽性イベントの（x,y）座標をコンピュータのメモリに格納し、画像を保管した。第2の段階では、スライド1枚当たりのDAPI標識された核の総数（これは総細胞数を表す）に関してスライドを走査した。スライド1枚当たりの総走査面積は、周辺効果を避けるために448mm２とした（接着面積の84％）。2回の走査が終了すると、陽性イベントの数および総細胞数が得られ、すべての陽性イベントを含む画像の一覧が表示される。使用者はこれらの画像を観察し、各画像に添付された記憶済みの座標を用いて、任意のイベントを以降の検討のために呼び出す。続いて、関心対象のフィールドを、より高倍率および追加のフィルターセット（例えば、フルオレセイン用またはUV用のフィルター）を用いて画像化することが可能と考えられる。イベントが陽性であることの確認および表現型の評価のために、異なる蛍光色の画像を電子的に重ね合わせることも可能と考えられる（多重標識）。1枚のスライドに対する総走査時間（2回の走査）は約1時間であった。2回の走査は独立に行えるため、陽性イベントのみをスクリーニングするという選択肢が得られ、これによってスライド1枚当たりの走査時間を30分間に短縮することもできる。
【００８０】
結果
細胞付着手順の評価。試料調製時に最も重要な段階の一つは、スライドに対する細胞の付着である。ポリ-L-リジン／PBSでコーティングされたスライド（0.1％；Sigma, St. Louis）、SectionLockスライド（Polysciences, Inc., Warrington, PA）および接着性スライド（Paul Marienfeld GmbH & Co., KG）に接着させた細胞調製物の顕微鏡下での定性的比較により、最も均一な細胞単層（最適な細胞密度で、重複が極めて少ないもの）が得られるのはPaul Marienfeld社製のスライドであることが明らかになった。このスライドは生細胞が接着するように荷電表面を含む。異なる種類の試料で本発明者らの付着技法を検証するために、レアイベント画像化システムによって決定された細胞の総数を、スライドに最初に付着した細胞の数と比較した。最適化を行うと、いずれの接着性表面（例えば、ポリ-L-リジンなどの正荷電物質でコーティングされたもの）も用いることができる。表1は、健康血液提供者の末梢血では細胞回収率が高いが（89％）。癌患者の試料では細胞の損失が幾分多いことを示している（PB、BMおよびSC試料のそれぞれの回収率は64、58および73％；PBおよびBMは正常PBとの比較でp＜0.05、t検定による）。
【００８１】
（表1）
健康被験者（正常）または癌患者からの末梢血（PB）、骨髄（BM）または末梢血幹細胞（SC）試料を「材料と方法」の項に記載した通りに調製し、1.5×10６個の細胞を接着性顕微鏡スライドのそれぞれに適用した。各群に指定された数（n）のスライドに関して細胞を計数し（DAPI標識に基づく）、その結果を平均±SEMとして表す。回収率の算出に関しては、各スライドの走査面積が総接着面積の84％であることに注意されたい（「材料と方法」の項を参照）。星印は、t検定による正常PBとの比較でp＜0.05であることを意味する。
【００８３】
検出方法の感度。レアイベント画像化システムの感度を調べる目的で、乳癌細胞（MCF-7）を加えたPBMC試料を調製し、サイトケラチン標識のための処理を行った。高輝度に染色された上皮MCF-7細胞は間葉由来の白血球と容易に区別することができる。CK+細胞の検出感度を、「材料と方法」の項に記載したように、種々の希釈度の腫瘍細胞（MCF-7／PBMC）を用いて検討した。10６個のPBMC当たりのMCF-7細胞が1個という、検討した中で最も希釈度の高い試料でも、予想された量の癌細胞を検出することができた（表2；予想曲線と観測曲線との間に有意差がない、χ２検定）。
【００８４】
（表2）
腫瘍細胞の二重標識。レアイベントの検出の特異性を高め、同定された癌細胞の特徴をさらに分析するために、細胞内サイトケラチンおよび癌細胞表面マーカーの同時検出を可能にする染色プロトコールを開発した。この二重標識手順は、第1に細胞表面を固定してEp-CAMまたはGD2に対する標識を行い、第2に細胞を透過化して細胞内サイトケラチンに対する染色を行うという2つの逐次的な段階からなる。この二重標識プロトコールを癌細胞株MCF-7（乳癌）およびSW2（小細胞肺癌）に対して最適化した。蛍光顕微鏡検査により、SW2細胞が抗GD2抗体および抗サイトケラチン抗血清によって効率的に標識されることが示された。この逐次的固定では、共焦点レーザー走査顕微鏡によって入手した光学切片で示されたように、どちらのタンパク質の抗原部位も細胞内局在の点で維持されていた。染色された細胞には明らかに、細胞質中のサイトケラチン（赤色）および細胞表面のGD2（緑色）が認められた。いずれのタンパク質も細胞集団内での発現レベルは非常に不均一であった。MCF7細胞を抗Ep-CAM抗体および抗サイトケラチン抗血清で二重標識した場合にも同様の結果が得られた。一次抗体の一方を用いずに両方の二次抗体を用いた対照実験により、2つの検出系の間に交差反応がないことが明らかになった。
【００８６】
染色プロトコールをさらに検証するために、MCF-7またはSW-2細胞を加えたPBMCを標識した。その目標は、癌細胞から高輝度の蛍光シグナルを入手しつつ、周囲のPBMCから得られる背景シグナルは低くすることであった。この目標を達成するのに最も重要な2つの要因は、一次抗体を逐次的に適用することと、一次抗体とのインキュベーションの前に2回のブロッキング段階（20％ヒトAB血清、PBS中）を行うことであることが明らかになった。蛍光顕微鏡検査により、二重標識したMCF-7細胞は周囲のPBMCと明瞭に区別しうることが示された。より高倍率では、細胞内サイトケラチン標識およびEp-CAMの表面染色が確認された。PBMCにSW-2細胞を加え、GD2およびサイトケラチンに対して二重標識した場合にも同様の結果が得られた。
【００８７】
この二重標識プロトコールを、癌患者由来の末梢血試料および骨髄試料に対しても適用した。小細胞肺癌患者の末梢血由来のGD2／サイトケラチン陽性細胞の一例では、蛍光顕微鏡検査により、乳癌患者の骨髄からEp-CAM／サイトケラチン陽性細胞が認められた。この例では、癌細胞は周囲の骨髄細胞よりも大きいだけでなく、個々の染色の局在の違いも認められた：すなわち、サイトケラチン（赤色）は細胞質中にあり、Ep-CAM（緑色）は細胞周辺の細胞膜の箇所に集中していた。
【００８８】
正常血液試料におけるサイトケラチン陽性細胞および二重陽性細胞の検出。単一染色および二重染色プロトコールの特異性を評価するために、健康提供者からの血液試料を分析した。サイトケラチンの単一標識を用いる方法とサイトケラチン／Ep-CAMまたはサイトケラチン／GD2の二重標識法との間で「陽性」細胞の数を比較した。蛍光顕微鏡検査により、PB試料の16〜18％はいずれのプロトコールを用いてもサイトケラチンに関して陽性と評価され、CK+細胞の数は10６個の白血球当たり標識細胞1〜26個の範囲であることが示された。これに対して、試料を二重標識プロトコールで処理した場合には、陽性のものは健康被験者の試料からほぼ完全になくなった（合計77件のPB試料のうち二重陽性細胞は1個のみ観察された）。
【００８９】
試料収集の空間的および時間的ばらつきの評価。骨髄の異なる領域でCK+細胞の分布が不均一である可能性を評価するために、同じ患者の右および左の腸骨稜から一対ずつのBM試料を採取して分析した。サイトケラチン陽性に関しては、24対のうち21対で結果が一致した（フィッシャーの直接確率法）（表3A）。末梢血試料におけるCK+細胞の出現に関する時間的変動についても検討した。96例の患者の各例から、治療的介入を行わずに2つずつのSC試料を連日採取した。対をなす試料はサイトケラチン陽性に関して統計的に有意な一致を示した（表3B）。
【００９０】
（表3A）
（表3B）
癌患者の血液試料および骨髄試料におけるサイトケラチン陽性細胞の検出。レアイベント画像化システムの能力を示すために、355件の末梢血、骨髄および幹細胞試料を分析した。これらの試料は、乳癌患者から、自家骨髄移植を行う前で、しかも大量化学療法を行った後に採取した。試料はサイトケラチン単一標識法を用いてスクリーニングした。乳癌患者の末梢血からの2つのCK+細胞に関する一例では、陽性細胞は明瞭な細胞質標識を呈したが、周囲の血液細胞は染色されなかった。CK+細胞は骨髄試料の52％、末梢血試料の34％および幹細胞試料の27％に認められた（表4）。
【００９３】
（表4）
表4に関しては、合計156例の患者からの骨髄（BM）、末梢血（PB）および末梢血幹細胞（SC）試料をサイトケラチン陽性細胞および総細胞数に関して分析した。複数の試料を分析できた患者もあれば、1種類の試料しか分析できなかった患者もあることに注意されたい。「CK陽性試料（すべて）」とは、少なくとも1個のCK陽性細胞がみられた試料の数を指す。CK陽性試料（≧CK陽性細胞 9個／PBMC 10６個）とは、PBMC 10６個当たりのCK+細胞が9個またはそれ以上である試料の数を指す（正常PBにおけるCK+細胞の平均＋2SD；表5）。試料1件当たりの最も多いCK+細胞数は、BMでは504個／10６個、PBでは371個／10６個、SCでは1020個／10６個であった。
【００９５】
（表5）
表5に関しては、健康血液提供者からの血液試料をサイトケラチン単独、またはCK／Ep-CAMもしくはCK／GD2に対する二重標識によって評価した（「材料と方法」の項を参照）。陽性試料とは、CK+細胞（単一標識の場合）または二重標識細胞（二重標識の場合）を含むもののことである。各カテゴリーにおける陽性細胞の数は分析した細胞10６個当たりとして表しており、平均±SEMとして示している（7.14×10５個の細胞を含むCK／Ep-CAM群の1件の試料で陽性細胞が1個のみであった場合を除く）。DBL+は二重標識されたことを意味する。
【００９７】
表4にみられる通り、陽性試料におけるCK+細胞の頻度は1個／10６個〜1020個／10６個とさまざまであった。しかし、正常被験者からの多くのPB試料ではCK+細胞は少数であり、これらは偽陽性細胞であることが二重標識実験に基づいて明らかになった（表5）。このため、癌患者からのPB試料で明確に陽性であることを示すために、対照試料で認められたCK+細胞数の平均＋標準偏差の2倍、すなわち9個／10６個というカットオフ点を設定した。この閾値を適用しても、骨髄調製物におけるサイトケラチン陽性の程度（40％）は、末梢血調製物（24％）または幹細胞調製物（12％）よりも依然として高かった（表4）。さらに、分析したすべてのタイプの試料において、疾患の病期がステージIVの患者は、疾患の病期がステージII／IIIの患者よりもサイトケラチン陽性率が有意に高いことも明らかになった（表4）。
【００９８】
以上を要約すると、二重または多重マーカー分析を用いる、低い頻度で存在する関心対象の細胞（レアイベント）の検出のための自動分析システムを開発した。血液試料または骨髄試料の顕微鏡分析のための調製手順を自動化のために最適化したが、これは赤血球細胞の溶解、接着性スライドに対する単核細胞の付着および試料の免疫蛍光標識を含む。続いてスライドを、電動式架台を装備した蛍光顕微鏡により低倍率で観察し、すべての蛍光イベントを画像化し、後で呼び出すためにコンピュータデータベース中にカタログ化した。自動画像解析のためには、背景シグナルを低く維持しながら高輝度シグナルが得られる二次抗体を用いることが非常に重要である。本発明者らは最近、極めて高輝度かつ安定した蛍光シグナルが得られるAlexaシリーズの染色剤（Molecular Probes）を検討した。蛍光標識したスライドは1週間以内に分析する必要がある。より長期的な保存が望ましい場合には、安定な蛍光シグナルが保たれる封入剤を用いるべきである。本発明者らは、ProLong Antifade Kit（Molecular Probes）を用いると、スライドを40℃で3カ月保存した後にも優れた結果が得られることを見いだしている。
【００９９】
実施例 2 ：レアイベント画像化システムの最適化
試料の調製、細胞接着および染色のための基本的手順の適合化および最適化
用いたスライド（Paul Marienfeld GmbH & Co. KG, Bad Mergentheim, Germany）は、細胞がその上に播かれる、接着性のある各150mm２のサークルを3つ含んでいる。ヒト細胞に対して開発された接着手順を、微生物の処理に対して適合させる。検討する主なパラメーターには、接着性スライドとの接触時間、温度、pH、緩衝液の組成およびそのイオン強度が含まれる。細菌（例えば、大腸菌、枯草菌、コレラ菌）およびウイルス（例えば、レオウイルス）に対して、スライドに対する接着特性のばらつきを検証するために別々の検査を行う。検出はDAPIまたはアクリジンオレンジ（これはRNAウイルスの場合にRNAを標識する）を用いて行う。自動化のためには平坦な細胞単層が必須であるため、他の細胞付着システム（例えば、Shandon Cytocentrifugeを用いたサイトスピン法；Sakura社（Torrance, CA）によるCytotek Monoprep、およびCysyc社（Boxborough, MA）によるThinPrepなど）を用いた試験を比較のために用いる。
【０１００】
REIS 自動化のためのコンピュータソフトウエアの開発
本発明者らは、本発明者らの当初の分析装置の一連の全工程を自動化している（Kraeftら、Clin. Cancer Res. 6: 434-442, 2000）。必要に応じて、実装する特定のシステムに適したカメラドライバを入手する。この種のドライバを作ることは、コンピュータプログラミングの技術分野ではルーチンの技能の範囲に十分に含まれる。REISは、稀な蛍光イベントを検出するための画像処理アルゴリズムを含んでいる。画像は検出器によって取り込まれ、PCベースの画像化ワークステーションで処理される。このソフトウエアは、蛍光シグナル（抗原陽性生物）の検出に加えて、総細胞数の計数（例えば、DAPI／アクリジンオレンジ染色に基づく）、自動的なシグナル位置決定、画像保管および画像処理も行う。最初は、これは1つまたは2つの蛍光団（例えば、AlexaFluor488およびAlexaFluor568）を用いて行われる。多重検出システムは、多数の染色剤（例えば、最大で24種の染色剤）に適応するように拡張可能であり、ソフトウエアが各染色剤によって観察された各々の蛍光シグナルを、対応する画像、例えばDAPI／アクリジンオレンジ染色によって得られたものと重ね合わせる。
【０１０１】
多重標識システムに対する改良
本明細書の方法は、大気試料または水試料における細菌およびウイルスの存在を観測するためだけでなく、病原体、特にBW病原体として特定されているものを検出および同定するためにも有用である。これらは多種にわたっており、検査しようとする病原体と同じ数のスライドを作製することも可能ではあるが現実的ではないと考えられる。1つの面は、その代わりとして、励起／放出スペクトルを区別しうるさまざまな蛍光団を用いる多重システムの開発にかかわる。
【０１０２】
上に考察した通り、推定50,000種もの蛍光色素が利用可能である。したがって、この集団を、最も高輝度な蛍光シグナル（最大の感度のため）が得られ、その励起および放出スペクトルが区別可能であって、イソチオシアネート架橋を介して抗体と首尾良く結合させることが可能な、少なくとも24種の染色剤のセットを求めてスクリーニングすることが可能である。蛍光強度が類似している染色剤のセットも好ましいと考えられる。
【０１０３】
選択した染色剤の少なくとも放出ピークを付き合わせて区別するためのフィルターのセットを、DAPIおよびアクリジンオレンジに加えて、本方法に用いるために選択する。励起波長の調節は、フィルターの別個のセットによって行うか、または入射光に対して狭帯域プリズムを用いることによって行う。蛍光フィルターを備えたホイールを、異なる蛍光団の識別のために必要な励起および放出フィルターのすべての組み合わせに適応するように変更する。
【０１０４】
実施例 3 ：免疫細胞化学による病原体検出のための方法の開発
蛍光標識抗体の作製。免疫細胞化学アッセイのためにまず必要なことは、優れた抗体の作製である。市販のものまたは他のものが入手可能である場合には、BW病原体の表面抗原を標的とする既存の抗体を使用のために選択する。その他の場合には、照射処理を行った（死滅させた）関心対象の生物の試料（例えば、CDC、USAMRIIDなどからのもの）を使用のために選択し、露出されたエピトープに対するモノクローナル抗体（mAb）を作製する；これらの生物がいずれも交差反応の原因となりうる共通の表面エピトープを有していない場合、または確実に「死滅した」生物を入手できない場合には、その種に特異的な1つまたは複数の抗原を選択し、精製した上でそれらのクローニングされた遺伝子から発現させること、または化学合成したペプチドによって模倣させることが可能である。抗体はすべて、蛍光分子を直接結合させるか、または二次蛍光で標識した抗体と併用する。直接標識抗体の検査は、FACS分析により、他の系統学的な類縁種、特に本明細書に記載したものに対する特異性に関して行う。
【０１０５】
上に挙げたさまざまな細菌、リケッチア、ウイルスおよび真菌、または他の適したモデル微生物に対する抗体を用いて、病原体検出用のレアイベント画像化システム（REIS）を開発することができる。6種の異なる抗体のそれぞれを4種の異なる染色剤と結合させ、合計24種の識別可能な蛍光標識抗体を作製する。究極的には、24種の識別可能な蛍光団（24種の特異抗体のセットと結合させたもの）を用いる多重検出システムにより、2枚のスライド（すなわち、24種の抗体が2セット）のみで、ヒトを標的とする既知のBW病原体またはBW病原体と疑われるもののすべてを、3枚のスライドのみで本明細書に挙げたBW病原体のほぼすべてを観測し、陽性のものを同定することが可能になると考えられる。
【０１０６】
スライド上に固定化された病原体の免疫細胞化学的検出。抗体を産生させた6つの種の弱毒株または照射（死滅）生物の試料（病原性であれば、CDC、USAMRIIDなどからのもの）を、既知の数として、REISを用いた分析のために接着性スライドガラスに対して直接適用した。
【０１０７】
第1のセットの実験では、各々の種からの既知の多数の生物体を、それらのコグネイト標識抗体の感度レベルを評価する目的で、REISを用いて個別に検討する；それぞれが単一の個々の生物体を検出しうる必要があり、その計数は定量的である必要がある。DAPIを従来通りにDNAの染色に用いる、またはRNAウイルスに対してアクリジンオレンジを用いる。手順のすべてのパラメーター（温度、緩衝液の組成、抗体濃度など）を、インキュベーション時間が最短になるように特に注意を払って、各々の生物体／抗体のセットに対して最適化する。初期条件は本質的には実施例1に記載した通りである。
【０１０８】
第2のセットの実験では、10％〜90％および90％〜10％の比率でスライド上に播種した関心対象の生物体のすべての対を、REIS分析の下で交差反応性がないことを確認する目的で検討する。
【０１０９】
第3のセットの実験では、多重構成に関して検討する；すなわち、多重物を用いた検出効率の検証が可能になるように、6種の生物の混合物（細菌／リケッチア、ウイルス、およびその2つの混合物）を5、10、15、19、23および28％の比率で用いる。続いて、6種の抗体のそれぞれの4種の調製物を用い、生物体を上記と同じ比率で播種して、24通りの強力な多重実験を行う。
【０１１０】
これらの実験の全体を通じて、検出効率に関するデータを収集する。これは本明細書に記載した75種の生物体（または任意の他のBW病原体）に対して行うことができる。この種の情報は、合わせて効率的に分析しうる生物体のセットを決定するのに有用であり、この点は、スライドに対する接着性（実施例2参照）または抗体とのインキュベーションに関する必要条件に種間での差異がある場合に特に重要と思われる。
【０１１１】
環境試料またはヒト体液中の病原体の免疫細胞化学的検出。上に考察した通り、微生物の免疫細胞化学的検出のための最適化された調製手順は、環境（大気および水）試料およびヒト（血液および他の体液）試料に適用される。水中の病原体はその源から直接処理しうるが、大気中の細菌およびウイルスはそれらをスライド上に固定化するために特別な試料採取手順を必要とする。SKC社からのBioSampler（登録商標）を含め、適した大気捕集装置がいくつか市販されている。これはすべてガラスでできた真空駆動式のインピンジャー装置であり、液体に通気して泡立たせるのではなく、粒子の跳ね返りが最小限に抑えられ、再噴霧化が減少するように、収集用液体の表面に対して接線方向にある空気ノズルを用いる。水または粘度の類似した液体を収集用液体として用いて流速12.5L／分で動作させることにより、BioSamplerの収集効率は直径1μm程度の粒子に関しては100％近くになり、0.5μmでも依然として約90％、0.3μmで約80％である。このため、ほとんどの細菌は直径1〜10μmであり、多くのウイルスの大きさはこの範囲の下端である（例えば、エボラウイルスで100×80nm）ことから、BioSampler（登録商標）は大気中の細菌、真菌、花粉およびウイルスを収集するための優れた装置である。その他の大気捕集装置も適している。例えば、ある種の試料に好都合と思われるSKC社の別の製品にAir-O-Cell捕集カセット（SKC, Inc.）があり、この装置では、大気中の粒子を加速させて粘着性スライドに衝突させるが、これはさまざまな染色手順および顕微鏡検査を行うのにまさに適している。しかし、この収集方法は、2μmまたは3μmよりも小さい粒子には有効でない。
【０１１２】
環境試料の採取において調整する必要のある主なパラメーターは、試料採取時間および収集用液体の組成である。さまざまな液体を、スライドへの接着を補助する能力に関して、既知の量の生物体を用いて試験し、直接接種試験で比較することができる。
【０１１３】
ヒト体液の分析について、血液試料の分析によって例示する。第1に、提供者からの正常血液に既知の量の病原体（細菌およびウイルス）を加える。微生物の回収を分析し、検出閾値を確立した上で、手作業による分析と自動分析を比較する。微生物学研究所（例えば、Dana-Farber Cancer Institute）から第2の陽性血液培養物を入手し、本明細書に記載した細菌検出法に利用して、臨床結果（細菌培養に基づく）と比較する。これに加えて、患者からの陰性血液試料を対照として役立てることができる。
【０１１４】
インサイチューハイブリダイゼーションによる病原体検出のための方法の開発。免疫蛍光法（IF）はレアイベントの分析のために現時点で選択される方法ではあるものの、核酸プローブおよびインサイチューハイブリダイゼーション（ISH）の手法を用いた検出の方が好ましいと考えられる理由もいくつかある。これらを表7にまとめた。このように、この種の手法はIFにおける抗体の使用に代わる有用な選択肢となる。
【０１１５】
（表7）ISHがIF手順よりも優れると考えられる利点
核酸プローブの作製。標的とする生物に関して入手可能な配列情報のすべてを用いることにより、それらのそれぞれに対して特異的なオリゴヌクレオチドプローブを設計することができる。他の生物と配列がたまたま一致してしまうリスクは交差反応性エピトープの場合よりもはるかに低いが（実施例2参照）、これは設計されるプローブのそれぞれを細菌／ウイルス核酸データベースの全内容と直接比較して、特定の標的に対して一意的となるように設計しうるためである。非常に短いプローブ（例えば20量体）を用いることにより、細胞壁／キャプシド浸透性および細胞内核酸標的に対する到達性を最大限に高めることができ、感度を最大限に高めるために、大量に発現されるRNAを用いることができる。この場合には、それぞれの種に対して特異的な、関心対象の細胞性生物に対するリボソームRNA中の配列を選択することが有用である。ウイルスの場合には、最も大量に発現される遺伝子に対して選択的なプローブを設計する。
【０１１７】
単一標識実験にはジゴキシゲニン検出システムを用いることができ、このシステムはキットとして市販されている（Boehringer Mannheim）。しかし、ほとんどの場合には多重標識が必要と思われ、これはこのシステムでは不可能である。その代わりに、蛍光色素（例えば、Genset Corp.のもの）と結合させたヌクレオチドの存在下でオリゴヌクレオチドを合成することが考えられる。シグナル増強が必要であるか求められる場合には、オリゴヌクレオチドを合成時にタグ（例えば、ビオチン）で標識してもよい。この場合、タグ標識された各プローブは、標識が例えば24種の蛍光団のいずれか1つであるような、複数の異なるストレプトアビジン標識複合体の1つと別個に反応すると考えられる。これらの事前に反応させたオリゴプローブ複合体は細菌膜を通って自由に拡散する程度に小さい必要がある。しかし、そうでない場合には、細胞をリゾチーム／EDTAによって透過化を行うことができる。
【０１１８】
スライド上に固定化された病原体のインサイチューハイブリダイゼーションによる検出。これらの実験は、上記の実施例2に記載したものと類似すると考えられる。「第1のセットの実験」は単一標識のみを要し、ジゴキシゲニンシステムによって行われる。他のすべてには、上記の蛍光標識オリゴヌクレオチドまたはビオチン化オリゴ＋ストレプトアビジン標識複合体による検出方法を用いる。この場合も同じく、これらの実験の全体を通じた検出効率に関する収集データの評価により、単一のスライド上での多重アッセイとして合わせて観測することが可能な、BW病原体の最適なセット（最大24種）を決定することができる。
【０１１９】
環境試料およびヒト体液中の病原体のインサイチューハイブリダイゼーションによる検出。これらの実験は実施例2に記載したものと類似している。環境試料およびヒト試料を、免疫細胞化学およびインサイチューハイブリダイゼーションを用いて並行的に分間析する。
【０１２０】
実施例 4 ：単一標識のプロトコール
抗体はすべて、20％ヒトAB血清を含むPBS中に希釈する。
1．血液を溶解させる：15mlコニカルチューブ内で3mlの血液に対して11mlの等張NH４Cl。室温で40分間放置する。
2．1500rpmで5分間遠心する。
3．NH４Clおよび赤血球の上清を除去し、白血球のペレットを残す。ペレットを10ml PBS中に再懸濁する。
4．1500rpmで5分間遠心する。
5．上清を除去する；ペレットのサイズに応じて、ペレットを1、0.5または0.25ml中に再懸濁する。
6．血球計算器による細胞数算定のために細胞、トリパンブルーおよびPBSの希釈液を作製する。1：100希釈：10μlトリパンブルー、10μl細胞、980μl PBS。
7．（接着スライド上の）サークル1つ当たりの細胞が5x10^5個／100μlとなるように計算して調整する。
8．接着性スライド上に細胞を播く；細胞の接着のために37℃で40分間おく。
9．サークル1つ当たり60μlの50：50培地をスライドに添加する；37℃で20分間インキュベートする。
10．スライドを2％パラホルムアルデヒド中に室温で20分間おく。
11．スライドを3分間×2回すすぎ洗いする。
12．スライドを-20℃のメタノール中に5分間おく。
13．PBSで3分間×2回すすぎ洗いする。
14．60μlの20％ヒトAB血清を各サークルに添加し、37℃で20分間おく。すすぎ洗いは行わないこと。水を切る。
15．60μlの一次抗体（例えば、抗サイトケラチン）を各サークルに添加する。37℃で1時間インキュベートする。
16．PBSで3分間×2回すすぎ洗いする。
17．60μlの二次抗体（例えば、抗ウサギローダミン）を添加する。37℃で30分間インキュベートする。
18．PBSで3分間×2回すすぎ洗いする。
19．60μlのDAPIを各サークルに添加する。室温で10分間インキュベートする。
20．PBSで1回すすぎ洗いする。
21．dH2O中におく。
22．グリセロールゼラチン中に封入する。35μlを各サークルに載せる。カバーグラスを被せる。
23．スライドはホイルで覆った上で室温で保存してよい。
【０１２１】
実施例 5 ：二重標識のプロトコール
標識のプロトコール
抗体はすべて、20％ヒトAB血清を含むPBS中に希釈する。
1．血液を溶解させる：15mlコニカルチューブ内で3mlの血液に対して11mlの等張NH４Cl。室温で40分間放置する。
2．1500rpmで5分間遠心する。
3．NH４Clおよび赤血球の上清を除去し、白血球のペレットを残す。ペレットを10ml PBS中に再懸濁する。
4．1500rpmで5分間遠心する。
5．上清を除去する；ペレットのサイズに応じて、ペレットを1、0.5または0.25mL中に再懸濁する。
6．血球計算器による細胞数算定のために細胞、トリパンブルーおよびPBSの希釈液を作製する。1：100希釈：10μlトリパンブルー、10μl細胞、980μl PBS。
7．（接着スライド上の）サークル1つ当たりの細胞が5x10^5個／100μlとなるように計算して調整する。
8．接着性スライド上に細胞を播く；細胞の接着のために37℃で40分間おく。
9．サークル1つ当たり60μlの50：50培地をスライドに添加する；37℃で20分間インキュベートする。
10．スライドを2％パラホルムアルデヒドPBS中に室温で20分間おく。
11．スライドをPBS中3分間×2回すすぎ洗いする。
12．60μlの20％ヒトAB血清を各サークルに添加し、37℃で20分間おく。水を切る。すすぎ洗いは行わないこと。
13．60μlの一次抗体（例えば、抗GD2、抗GD3、抗Her-2neuまたは抗KSA／EpCAM）を各サークルに添加する。37℃で1時間インキュベートする。
14．PBSで3分間×2回すすぎ洗いする。
15．60μlの二次抗体（例えば、抗マウスAlexa Fluor488）を添加する。37℃で30分間インキュベートする。
16．PBSで3分間×2回すすぎ洗いする。
17．スライドを-20℃メタノール中に5分間おく。
18．PBSで3分間×2回すすぎ洗いする。
19．60μlの20％ヒトAB血清を各サークルに添加する；37℃で20分間おく。水を切る。すすぎ洗いは行わないこと。
20．60μlの一次抗体（抗サイトケラチン）を各サークルに添加する。37℃で1時間インキュベートする。
21．PBSで3分間×2回すすぎ洗いする。
22．60μlの二次抗体（例えば、抗ウサギローダミン）を添加する。37℃で30分間インキュベートする。
23．PBSで3分間×2回すすぎ洗いする。
24．60μlのDAPIを各サークルに加える。室温で10分間インキュベートする。
25．PBSで1回すすぎ洗いする。
26．dH2Oですすぎ洗いする。スライドを乾燥させる。
27．スライドをPro-Long Anti-fade封入剤（Molecular Probes）で封入し、カバーグラスを被せて、無色透明のマニキュア液で封止する（選択的）。
28．アルミニウムホイルで覆い、4℃で保存する。
【０１２２】
実施例 6 ：細菌試料の調製
1．細菌を半対数期まで増殖させる（600nmでのOD＝0.5）。
2．0.5mlの細菌懸濁液を遠心する（5Krpmで5分間）。
3．細菌を1mlの10％PBS中に再懸濁する。
4．50μlの細菌再懸濁液をスライド上のウェルに添加する（Clear-CellまたはAd-Cellスライドを用いる場合はゼラチンコーティングは不要であるが、他の場合には細菌のスライドに対する結合性を高めるためにスライドをゼラチンで前処理する）。
5．細菌懸濁液を37℃で30分間乾燥させる。
6．室温のPBSですすぎ洗いした後に、4％パラホルムアルデヒド溶液中に25〜30分間おく。
7．室温のPBSですすぎ洗いした後に、100μl トリトン／ウェルを滴下して5分間おく。
8．室温のPBSですすぎ洗いする。
9．PreHyb溶液を加えて46℃で30分間おく（Prehyb溶液；50ng／μl BET42a、Hyb溶液中、Hyb溶液は以下を参照）。
10．*46℃で120分間ハイブリダイズさせる。Hyb溶液は蛍光団濃度5ng／μlおよびBET42a濃度50ng／μl。
11．*48℃で30分間洗浄する。洗浄溶液は前もって48℃に加熱しておく必要がある。スライドに少量の洗浄溶液をかけた後に洗浄溶液中に30分間浸漬する。
12．*スライドを室温のPBSですすぎ洗いする。
13．*DAPIを室温で5分間適用する。
14．*室温のPBSですすぎ洗いしてDAPIを洗い流し、風乾後にGel封入し、カバーグラスを被せて縁をマニキュア液で封止する。
*段階10以降は蛍光団が光退色しないように暗所で行う必要がある。
【０１２３】
Hyb 溶液
40％ホルムアルデヒド溶液
5M NaCl 720μl
1M Tris-HCl（pH7） 80μl
10％SDS 4μl
ddH2O 1600μl
ホルムアルデヒド 1600μl
蛍光団を濃度5ng／μlとなるまで添加する
【０１２４】
洗浄溶液
5M NaCl 2.25ml
0.1％SDS 0.1ml
1M Tris-HCl（pH7.6） 2.0ml
ddH2O 95.65ml
【０１２５】
FITC、Alexa Fluor 488、Cy 5、Cy3およびBet42aでブロッキング標識したオリゴヌクレオチドを検討した。プローブの特異性および標識のシグナル強度を確認するための実験を行った。上に挙げたプローブ配列はすべて、その標的のみと特異的に反応し、他の細菌とは反応しなかった。
【０１２６】
実施例 7 ：患者試料の採取
悪性カルチノイド腫瘍と診断された白人男性患者1例が中腸の治療を受けた（内容は不明）。標準的な治療レジメンを完了した後に、この患者は標準的な臨床検査の結果に基づいて「癌が消失した」と診断された。そこで、この患者の血液に対して、本質的には本明細書に記載した通りの方法を行ったが、この際の試料の白血球数は42×10６であった。これらの白血球の15×10６個の試料をプレーティングし、実施例5に例示した二重標識プロトコールにより、抗GD2抗体（14／18）およびAlexa Fluor 488抗体をそれぞれ一次抗体および二次抗体として用いた後に、抗サイトケラチンおよび抗ウサギローダミンをそれぞれ一次抗体および二次抗体として用いることによって染色した。患者の試料中にはサイトケラチン抗体による陽性細胞が3個認められた。この結果は、この患者が実際には癌が消失した状態にないことを示している。この検出の結果として、この患者は、転帰が改善する見込みが高まるように、癌細胞をより徹底的に排除するための治療レジメンをさらに一定期間にわたって受けることになった。
【０１２７】
その他の態様
本発明をその詳細な記載とともに説明してきたが、以上の説明は本発明を例示するためのものであって、その範囲を制限するものではなく、それは添付する特許請求の範囲によって規定されることが理解される必要があるその他の面、利点および修正は本発明の範囲に含まれる。
【０１２８】
例えば、実施例1に記載した手順は好印象を与えるが、この「第1世代」のレアイベント画像化システムに改良を加えることも可能である。いくつかの既知の細胞処理速度に関する律速因子は機械的なものであるが、これは数百万個の細胞をかなり高倍率（通常10〜20倍）で走査しなければならないためである。実際、システムの速度は問題の一つである：処理速度が細胞1000個／分であれば、5×10６個の細胞を走査するためのデータ収集時間は休まずに約3.5日を要すると考えられる。スライド上の細胞密度は幾分高めることができると思われるが、現在用いられているカメラのサイズおよび感度では倍率はせいぜい10倍または5倍に制限され、時間が重要な要因であるレアイベントの検出に用いるにはこのような遅いシステムは不十分であり、実用性の点から使用できない。これよりもかなり迅速ではあるが（約4時間で最大10７個の細胞）、「第1世代」のシステムも臨床（または環境モニタリング）の現場で真に有用なものとなるには改良が必要である。
【０１２９】
この欠点に対処するために、顕微鏡分析時間を4時間から10分間未満に短縮することを目標として、「第2世代」のREISシステムを開発することができる。急速に進歩している電子画像化およびソフトウエア業界で利用可能な技術に基づけば、この目標は妥当なものである。その鍵となるのは、非常に視野の広い極めて高感度のカメラを用いることであり、これにより、スライドを走査せずに広範囲の顕微鏡視野を取り込むことが可能と思われる。「第1の世代」システムの処理時間を短縮するために高利得デジタルカメラを用いるというアイデアは、ハッブル望遠鏡の成功によって生まれた。先進型のデジタル式（アナログではなく）電子カメラにより、遠く隔たった星々を単一のピクセルとして取り込むことができる。ある種の最新型カメラに用いられているグレード1の高量子効率バックイルミネーション型電荷結合素子（「CCD」）チップのサイズは24.5×24.5mmであり、ピクセルアレイは1024×1024である。1600×1600ピクセルアレイの新たなCCDチップも入手可能であり、これによってさらに広範囲の顕微鏡視野を調査することが可能になると考えられる。このような技術を用いることにより、スライド全体の画像で1枚のチップを構成させ、究極的には大規模な検体フィールド（例えば、細胞1×10９個）内の細胞1個ずつを単一のピクセルとして画像化することも可能と考えられる。
Claims (28)
- 検体中の標的物体の有無を検出する方法であって、
第1の蛍光団が光子を第1の波長で放出し、第2の蛍光団が光子を第2の波長で放出する、少なくとも第1の蛍光団および第2の蛍光団に対して曝露された、またはそれらによって標識された検体フィールドを入手する段階；
検体フィールドに、第1および第2の蛍光団を励起するのに十分な光を照射する段階；
検体フィールドを第1の光子源に関して第1の波長で、また第2の光子源に関して第2の波長で低倍率で走査する段階；
検体フィールド内部の各々の第1の源および各々の第2の源の位置を登録する段階；
第2の波長の光子を実質的に遮断するが第1の波長の光子は許容する光学または電子フィルターを介して生成された第1の画像である、検体フィールドの各位置での第1の画像を収集および記録する段階；
第1の波長の光子を実質的に遮断するが第2の波長の光子は許容する光学または電子フィルターを介して生成された第2の画像である、検体フィールドの各位置で高倍率の第2の画像を収集および記録する段階；
各々の第1の画像および各々の第2の画像を検体フィールド内部の対応する位置に対して索引付けする段階；ならびに
検体フィールド内部の単一の位置での第1の画像および第2の画像を検査する段階、を含み、
単一の位置での第1および第2の画像に候補物体が存在することにより、検体中に標的物体が存在することが示されるような方法。 - 検体フィールドの調製が、
a．細胞試料を可溶化して試料混合物を得る段階；
b．試料混合物を遠心する段階；
c．試料混合物から上清を分離する段階；
d．この結果得られた細胞のペレットを生理的緩衝液中に再懸濁する段階；
e．細胞を接着性スライドに対してプレーティングする段階；
f．細胞培養液をスライドに対して添加する段階
を含む、請求項1記載の方法。 - 検体フィールドの調製が、
段階dの後に、細胞混合物の希釈物を作製する段階、希釈物を死細胞に対する感受性のある染色剤で処理する段階、および用いるスライドの試料細胞密度を決定するために細胞数算定を行う段階、
をさらに含む、請求項2記載の方法： - 標的物体が、癌細胞、上皮細胞、平滑筋細胞、樹状細胞、記憶T細胞、記憶B細胞、体細胞、正常細胞、異常細胞または幹細胞である、請求項2記載の方法。
- システムが、少なくとも1,000,000個の細胞がある検体フィールド内の少なくとも1つの標的細胞を検出しうる、請求項2記載の方法。
- 記録が少なくとも1024×1024ピクセルアレイの画像を含む、請求項2記載の方法。
- フィールドの検体が大多数の細胞種として白血球を含む、請求項2記載の方法。
- 検体フィールドを収容するための架台；
ある所定レベルおよび所定レベルの1つまたは複数の追加的な倍率で、検体フィールド内部の位置の画像を収集するために配置および構成された検出器；
第1の蛍光団を第1の励起波長で励起するのに十分であって第2の蛍光団を第2の励起波長で励起するのに十分な光を検体フィールドに照射するために配置および構成された光源；
検出器に取り付けられたカメラであって、（1）第2の蛍光団の第2の発光波長の光子を実質的に遮断するが第1の蛍光団の第1の発光波長の光子は許容する光学または電子フィルターを介して、検体フィールド内のある位置の第1の画像を取り込むため、および（2）第1の発光波長の光子を実質的に遮断するが第2の発光波長の光子は許容する光学または電子フィルターを介して、検体フィールド内のその位置の第2の画像を取り込むために配置および構成されたカメラ；ならびに
第1の画像および第2の画像を記録して、第1の画像および第2の画像を検体フィールド内部の対応する位置に対して索引付けするコンピュータであって、使用者による要求に応じて、対応する位置に関する第1の画像および第2の画像を表示するコンピュータ、
を含む検出システム。 - 細胞の検体フィールド内の生物兵器細胞に関する分析のための方法であって、
i）検体フィールドを、生物兵器細胞を特定する第1の蛍光団によって処理する段階；
ii）検体フィールドを、生物兵器細胞を特定する第2の蛍光団によって処理する段階；
iii）検体フィールドに、第1の蛍光団に光子を放出させるのに適した光を照射する段階；
iv）検体フィールドに、第2の蛍光団に光子を放出させるのに適した光を照射する段階、
v）生物兵器細胞である、光子を放出する検体フィールド内の細胞を同定する段階、
を含む方法。 - 検体フィールド内の細胞の調製が、
i．試料混合物を遠心する段階；
j．試料混合物を再懸濁する段階；
k．細胞を接着性スライド上にプレーティングする段階；
l．スライドをパラホルムアルデヒドで処理する段階；
m．スライドをトリトンで処理する段階；
n．スライドをプレハイブリダイゼーション溶液で処理する段階；
o．スライドを、蛍光団を有するハイブリダイゼーション溶液で処理する段階；
p．スライドを蛍光色素で処理する段階、
を含む、請求項9記載の方法。 - 検体フィールドを、生物兵器細胞を特定する1つまたは複数の追加的な蛍光団によって処理する段階、および検体フィールドに、1つまたは複数の追加的な蛍光団に光子を放出させるのに適した光を照射する段階をさらに含む、請求項10記載の方法。
- 少なくとも1つの蛍光団が、生物兵器細胞のDNAを特定する、請求項11記載の方法。
- 生物兵器が、細菌、リケッチア、ウイルス、真菌またはプリオンである、請求項10記載の方法。
- 検体フィールドの調製が、
a．血液試料を塩化アンモニウム溶液で可溶化する段階；
b．試料混合物を遠心する段階；
c．上清の塩化アンモニウム溶液および赤血球を分離する段階；
d．この結果得られた白血球のペレットをPBS中に再懸濁する段階；
e．試料混合物を遠心する段階；
f．この結果得られた白血球のペレットをPBS中に再懸濁する段階；
g．段階fの細胞混合物、トリパンブルーおよびPBSの希釈物を作製する段階；
h．細胞を接着性スライド上にプレーティングする段階；
i．細胞培養液をスライドに対して添加する段階、
を含む、請求項1記載の方法。 - 請求項2記載の方法を含む、移植臓器提供者を標的物体の有無に関してスクリーニングするための方法であって、検体フィールドが臓器提供者から採取された試料であるような方法。
- 請求項2記載の方法を含む、薬剤候補を投与された対象における疾患または疾患症状に対する薬剤候補の有効性を、その有無が疾患または疾患症状の指標となる標的物体の有無に関するスクリーニングによって評価するための方法であって、検体フィールドが対象から採取された試料であるような方法。
- 請求項2記載の方法を含む、標的物体の有無に関して血液試料をスクリーニングするための方法であって、検体フィールドが血液試料であるような方法。
- 請求項2記載の方法を含む、標的物体の有無に関して液体試料をスクリーニングするための方法であって、検体フィールドが液体試料であるような方法。
- 標的物体が癌細胞である、請求項15〜18のいずれか一項記載の方法。
- 請求項2記載の方法を含む、細菌の存在に関するスクリーニングの方法であって、少なくとも1つの蛍光団が細菌に対するDNAプローブを含むような方法。
- 検体フィールドが外科患者から手術後に採取される、請求項20記載の方法。
- 検体フィールドが食品試料から採取される、請求項20記載の方法。
- j．スライドを、アルデヒド系固定剤に曝露させる段階；
k．スライドを、リン酸緩衝食塩水（PBS）中ですすぎ洗いする段階；
l．ヒトAB血清をスライドに対して添加する段階；
m．一次抗体をスライドに対して添加して、スライドをインキュベートする段階；
n．スライドをPBS中ですすぎ洗いする段階；
o．二次抗体をスライドに対して添加して、スライドをインキュベートする段階；
p．スライドを有機溶媒中で曝露させる段階；
q．スライドをPBS中ですすぎ洗いする段階；
r．ヒトAB血清をスライドに添加する段階；
s．一次抗体をスライドに添加して、スライドをインキュベートする段階；
t．スライドをPBS中ですすぎ洗いする段階；
u．二次抗体をスライドに添加して、スライドをインキュベートする段階；
v．スライドをPBS中ですすぎ洗いする段階；
w．細胞染色剤をスライドに添加して、スライドをインキュベートする段階；
x．スライドをPBSですすぎ洗いする段階；
y．スライドを水に曝露させる段階；
z．スライドをマウントする段階、
をさらに含む、請求項10記載の方法。 - j．スライドを有機溶媒中で曝露させる段階；
k．スライドをPBS中ですすぎ洗いする段階；
l．一次抗体をスライドに添加して、スライドをインキュベートする段階；
m．スライドをPBS中ですすぎ洗いする段階；
n．二次抗体をスライドに添加して、スライドをインキュベートする段階；
o．スライドをPBS中ですすぎ洗いする段階；
p．細胞染色剤をスライドに添加して、スライドをインキュベートする段階；
q．スライドをPBSですすぎ洗いする段階；
r．スライドを水に曝露させる段階；
s．スライドをマウントする段階、
をさらに含む、請求項10記載の方法。 - 有機溶媒がアルコールまたはアセトンである、請求項23または24のいずれかに記載の方法。
- 一次抗体がケラチンである、請求項23または24のいずれかに記載の方法。
- 二次抗体が抗ウサギローダミンである、請求項23または24のいずれかに記載の方法。
- 段階sにおける一次抗体がケラチンであって、段階uにおける二次抗体が抗ウサギローダミンである、請求項23記載の方法。
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