JPH0251063A - 特異性抗原もしくはこれを有する微小物体の検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は特異性抗原それ自体、あるいはこれを有する微
生物を同定して定量分析する検出方法に関するものであ
る。

〔従来の技術〕

細菌等の微生物を同定し、定量分析することは医療ある
いは生物工学などの分野で益々重要になってきている。

従来このような同定および定量分析は、例えば第７図の
ようなコロニー計数法により行なわれている。まず、同
図（ａ）のように寒天培地１０１を入れたシャーレ１０
２を用意し、ここに細菌などの試料１０３をばらまく。

そして、例えば１日程度放置すると同図（ｂ）のように
コロニー１０３′が形成されるので、目視によって定量
することができる。しかし、このコロニー計数法では培
養のための時間が不可欠となるので、迅速な検出には適
しない。また、顕微鏡等により直接に検出する方法もあ
るが、これは熟練を要するだけでなく精度も悪い。また
、プレパラート当りの細菌数が少ないときは適用困難で
ある。

一方、例えば微生物（細菌）の産生物（毒素）を検出す
ることにより同定、定量を行なう方法や、梅毒の血清学
的診断に用いられるような感染応答として宿主が生成す
る物質から同定、定量を行なう方法もある。しかし、こ
れらは適用可能な微生物の種類が限定されるので普遍性
がなく、また手作業が複雑であって精度も低い。

他方、微生物に対して何らかの手法で発光あるいは螢光
を生じさせ、これを観測して同定ないし定量を行なう方
法もある。その第１は例えば特開昭６０−１６４４９７
号公報に示されるように、微生物を臭化エチジウムで染
色し、その螢光を観察することで迅速な検出を行なうも
のである。その第２は例えば特表昭５９−５００５４８
号公報（ＰＣＴ／ＧＢ　　８３１００１１０）に示され
るように、培地の中に螢光原性基質を含有させて微生物
の培養を迅速に行ない、培養液の螢光を調べるものであ
る。その第３は例えば特開昭５６−１６１０００号公報
に示されるように、微生物を突発的に瓦解させて光量子
バーストを生じさせ、これを観測するものである。その
第４は現在広く使われているように、細菌に螢光抗体を
結合させて螢光顕微鏡で調べるものである。

〔発明が解決しようとする課題〕

しかしながら、第１の方法では染色の前に微妙な条件下
で微生物を溶解しなければならず、また同定を行なうの
が困難である。第２の手法では、発育の有無は調べうる
が微生物種ごとに検量紙を用意する必要があり、定量は
困難である。また、培養が必要であるために迅速性が期
待できない。

第３の手法では、突発的な微生物の瓦解を生じさせるこ
とが必要になり、また微生物の同定が困難である。

上記第１ないし第３の手法に比べて、第４の手法は微生
物の有する抗原に対する抗体反応を利用するもので、微
生物の同定および同量を行なう上では、原理的に最も優
れている。しかしながら、この手法による従来の検出は
、抗体反応による螢光性の付与という点を除くと顕微鏡
による直接検出の域を出るものではない。このため、観
察者の主観によって結果が左右されたり、菌数が少ない
ときには実用的な検出が難しくなる等の問題があった。

そこで、本発明は、特異性抗原もしくはこれを有する細
菌などの微小物体を、精度よく簡単に、しかも試料が少
量であるときにもこれを同定し定量分析することのでき
る検出方法を提供することを目的とする。

〔課題を解決するための手段よび作用〕本発明者は上記
の課題に対して鋭意研究を行なった結果、細菌などが有
する抗原は特異性を有し、この特異的抗原に対しては特
異な抗体が反応するという事実に着目し、本発明を完成
するに至った。

本発明の検出方法において対象とされる試料は、主とし
て特異性抗原を有する細菌などの微生物である。特異性
抗原は文字通りこれら微生物に特異なものであって、こ
れが認識できれば微生物の同定が完全になしうる。°な
お、試料を特異性抗原自体（タンパク質、糖など）とし
てもよいことは言うまでもない。

このような試料は、まず第１のステップにおいて二次元
的に分散させられる。この分散に際しては、固相の試料
基体が用いられるが、分散方法については実施例の手法
の他、スプレー法などによってもよく、試料基体の表面
（二次元平面）に付着できるものであれば特に限定され
ない。

次に第２のステップとして、試料基体の表面に分散して
付着された試料に対して、第１抗体処理を行なう。この
処理に用いられる第１抗体は、上記試料の有する特異性
抗原とのみ結合するものである。従って、この第２のス
テップにより検出対象の試料にのみ第１抗体が結合する
ことになる。

次に第３のステップとして、第１抗体を抗原としたとき
にこれと特異的に結合する第２抗体による第２抗体処理
を行なう。この第２抗体は複数種類の第１抗体に対して
共通的に用意することができる。すなわち、第１抗体は
抗原として把えたときには特異性を有するものではなく
、従って複数種類の第１抗体に対して一種類の第２抗体
を結合させることができる。また、この第２抗体は発光
もしくは螢光を伴った反応を触媒する酵素を人工的に結
合させておく。なお、第２のステップにおける第１抗体
に上記の酵素を結合させておけば、この第３のステップ
は省略されることになる。

次に第４のステップとして、上記酵素の基質を含む反応
液に試料基体を浸潤させる。これにより、発光あるいは
螢光反応が生じる。そこで、第５のステップとしてこれ
を光学的に撮像し、発光もしくは螢光の基点の二次元的
な分布を観測する。このようにすれば、上記の基点の数
から試料を定量分析できる。

〔実施例〕

以下、添付図面を参照して本発明の詳細な説明する。

第１図は実施例の手順を示している。まず、第１図（ａ
）のように真空吸引器１００を用意し、これに試料基体
としてのニトロセルロースフィルタ１をセットするそし
て、特異性抗原を有する細菌ヲ含んだ試料液２をニトロ
セルロースフィルタ１の表面に垂らし、真空引きを行な
う。すると、試料液２中の媒体は吸い出され、細菌３の
みがニトロセルロースフィルタ１上に分散して付着する
ことになる。この状態では、付着状態を模式的にミクロ
表現すると、第２図（ａ）のようになる。

ここで、細菌Ａは検出対象の細菌であり、細菌Ｂは細菌
Ａと別種の検出対象でない細菌である。そして、細菌Ａ
は特異性抗原１ａを有し、細菌Ｂは特異性抗原１ｂを有
している。

次に、ニトロセルロースフィルタ１を真空吸引器１００
から取り出し、これを第１図（ｂ）のように第１抗体液
４中にに浸漬する。ここで、第１抗体液４は細菌Ａの特
異性抗原１ａとのみ結合する第１抗体４１を含んでいる
。この第１抗体４１は第２図（ｂ）のように、特異性抗
原１ｂとは結合することがない。次いで、ニトロセルロ
ースフィルタ１を第１抗体液４がら取り出して洗浄し、
第１図（ｃ）にように第２抗体液５中に浸漬する。

この第２抗体液５中には第１抗体４１を抗原としてこれ
に結合する第２抗体５１を含んでおり、第２図（ｃ）の
ように細菌Ａに結合した第１抗体４１に更に結合する。

ここで、第２抗体５１は酵素５２とあらかじめ人工的に
結合されており、従って結果として細菌Ａにのみ酵素５
２が結合することになる。

そこで、このように処理したニトロセルロースフィルタ
１を第２抗体液５から取り出して洗浄し、第１図（ｄ）
のように反応液６中に浸潤させる。

ここで、反応液６は酵素５２の基質を含んでいるので、
第２図（ｄ）に示すように、反応物６１が酵素５２を触
媒として反応生成物６２に変化させられる過程で発光（
ｈν）することになる。この発光は高感度撮像装置７で
撮像される。そして、後述の計数処理がされることにな
る。

上記の実施例において、細菌３の同定は第１図（ｂ）お
よび第２図（ｂ）に示す第１抗体処理によりなされ、次
の第２抗体処理で発光触媒機能が付与される訳であるが
、これを模式的に示すと第３図のようになる。すなわち
、３種類の細菌Ａ。

Ｂ、Ｃが存在するときに、これらはそれぞれ特異性抗原
１ａ、ｌｂ、ｌｃを有している。そして、この特異性抗
原１ａ、ｌｂ、ｌｃはそれぞれ別異の第１抗体４１ａ、
４１ｂ、４１．ｃとのみ結合する。これに対し、第１抗
体４１．　ａ〜４１ｃは抗原としてみたときには特異的
ではなく、これらには酵素５２と結合された第２抗体５
１が共通的に結合する。従って、同定と発光触媒機能の
付与がされることになる。

従って、この第１、第２抗体処理を単一の処理で済ませ
ることも可能である。すなわち。第４図に示すようにそ
れぞれ特異性抗原１　ａ　、１　ｂ　ｒＩＣを有する細
菌Ａ、Ｂ、Ｃに対して３種類の抗体５１ａ、５１ｂ、５
１ｃを用意する。そして、抗体５１ａ〜５１ｃはそれぞ
れ特異性抗原１ａ〜１ｃとのみ結合するものとしておき
、更に抗体５１ａ〜５１ｃには酵素５２をあらかじめ人
工的に結合させておけばよい。

次に、第５図および第６図を参照して定量法につき説明
する。

第５図に示すように、暗室中でニトロセルロースフィル
タ１を反応液６に浸潤しておき、その前面にレンズ８を
介して高感度撮像装置７を対向させる。そして、その出
力信号を二次元メモリ７１に記憶させ、その記憶内容を
計数装置７２が読み出せるようにしておく。いま、試料
である細菌が第６図（ａ）に点３１．．３２．３３で示
す試料基体平面１′上にあると仮定する。すると、第５
図のような処理を行なうことで、二次元メモリ７１には
発光に対応するデータが蓄積されることになる。その発
光ヒストグラムは第６図（ｂ）、（Ｃ）に符号３１’、
３１’、３２’　、３２’、３３’３３′で示すように
時間と共に増大する。これに対し、細菌の存在しない位
置でも第６図（ｂ）。

（ｃ）に符号３４で示すような発光データ（雑音）か蓄
積されるが、そのレベルは細菌の存在する位置（座標）
に比べて十分に小さい。従って、適当なレベルで閾値処
理をすることにより、検出対象の細菌に対応した基点３
１〜３３（第６図（ａ））を知ることができる。そこで
、計数装置７２はその基点数をカウントし、これによっ
て細菌の定量がなされることになる。

なお、この高感度撮像装置７については例えばイメージ
インテンシファイヤとビジコンなどの撮像管を組み合わ
せて構成できるが、光量が少ないときには公知のフォト
ンカウンタなどを用いることも可能である。また、前面
に顕微鏡を取り付けてもよい。

基点の検出および計数については、種々の手法が考えら
れる。まず、試料が細菌などの微生物であるときには、
これは空間的に一定の大きさをもっている。従って、単
一の特異性抗原のみを試料とする場合（極めて微小な試
料の場合）と異なり、ある程度の大きさを持ちかつ複数
の抗原をもった細菌などを試料とするときには、同一の
試料（細菌）についてであってもわずかに異なった位置
（最大で試料の大きさだけ異なった位置）からの発光あ
るいは螢光が観測される。そこで、ある座標からの発光
が観測されたときは、その座標の近傍からの別の発光は
同一の微生物の異なる抗体に結合した酵素による発光と
みなし、これを基点とすることができる。

また、ある座標での発光ないし螢光が１回あるいは数回
観測されたときは、この座標には基点があるものとみな
し、次からの撮像管のスキャンにおいては読み出しを省
略してもよい。この場合、例えば撮像装置が光電変換膜
、マイクロチャンネルプレート（ＭＣＰ）等を有すると
きには、これらからの雑音が問題となる。光電変換膜か
ら雑音としての電子が放出されたときには、この電子は
ＭＣＰで増倍されて検出されるので、検出対象からの光
量子に起因する電子であるのか雑音であるかの判別が困
難である。しかし、光電変換材料を雑音電子をほとんど
放出しないものとすることは十分に可能であり、またこ
の雑音成分は光電変換膜から一様に放出されるものであ
る（同一座標から複数の雑音電子が放出される確率は極
めて少ない。）ので、例えば同一座標から２個以上の電
子が検出されたらこれを基点とするようにすれば、正確
に検出することが可能である。一方、ＭＣＰで生じる雑
音については、光電変換膜から雑音が生じた場合と比べ
て検出レベルが十分に低いので、基点を正確に検知する
ことが可能である。

次に、本発明者による具体的な実施例について説明する
。

実施例 まず、大腸菌を生育させた培養液を適当な緩衝液で希釈
し、１　ｍｌあたり５０個の大腸菌を含むサンプルとす
る。次に、このサンプルの１　ｍｌをニトロセルロース
フィルタに垂らし、真空吸引によって付着させる。そし
て、ニトロセルロースフィルタ表面へ抗体が非特異的に
付着する部分（抗体反応によらずに物理的等の原因で抗
体が付着しうる部分）に、後の第１抗体処理で第１抗体
が非特異的に付着しないようにするため、牛血清アルブ
ミン処理を施して異質のタンパク質をあらかじめ付着さ
せておく。

次に、ウサギを免疫して得た大腸菌抗体を含む第１抗体
液を用意し、これに上記のニトロセルロースフィルタを
浸漬する。これにより、大腸菌の有する特異性抗原には
第１抗体が結合する。このとき、ニトロセルロースフィ
ルタの表面には前述の牛血清アルブミン処理がされてい
るので、第１抗体が非特異的に付着することはない。

次に、このニトロセルロースフィルタを第２抗体液で処
理する。その第２抗体液はウサギ抗体に対するグルコー
ス・オキシダーゼ・コンジュゲート・マウス抗体を含ん
でおり、従って発光反応の触媒となる酵素をもった第２
抗体が、第１抗体を抗原として結合することになる。

次に、反応液を用意してこれにニトロセルロースフィル
タを浸潤させ、発光を観測する。ここで、反応液はグル
コース、ルミノール、フェリシアン化カリを含んでいる
。観測の結果、４９±３個の基点が計数され、極めて精
度が良かった。

比較例 実施例と同様のサンプルを用い、コロニー計数法を用い
て調べた。その結果、４８±５個の精度で計数できた。

本発明の実施例によれば、従来のコロニー計数法と同等
程度以上の精度で、しかも短時間で細菌の同定および定
量分析ができることがわかった。

〔発明の効果〕

以上、詳細に説明した通り本発明によれば、特異性抗原
自体もしくはこれを有する細菌などの微小物体を、精度
よく簡単に、しかも試料が少量であるときにもこれを同
定し定量分析することができる。

本発明方法は、緊急の病原細菌検査微生物の生態学領域
での基礎研究およびその応用としての環境評価、腸内細
菌叢の基礎研究、食品をはじめとする微生物によって劣
化する物の品質管理、クリーンルームなどの管理、微生
物の浄化能力を利用した廃水処理施設における指標微生
物の同定および定量、施設の管理など、広い範囲わたっ
て応用することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の実施例の手順を説明する図、第２図
は、実施例における”抗体反応の順序を説明する図、第
３図は、実施例における抗体反応の概念を説明する図、
第４図は、別の実施例における抗体反応の概念を説明す
る図、第５図は、実施例に用いる観測系の一例の構成図
、第６図は、ヒストグムによる基点の検出を説明する図
、第７図は、来のコロニー計数法の説明図である。 １・・・ニトロセルロースフィルタ、２・・・試料液、
３・・・細菌、４・・・第１抗体液、４１・・・第１抗
体、５・・・第２抗体液、５１・・・第２抗体、５２・
・・酵素、６・・・反応液、７・・・高感度撮像装置、
７１・・・二次元メモリ、７２・・・計数装置。 特許出願人　　浜松ホトニクス株式会社代理人弁理士　
　　長谷用　　芳　　樹（ｄ） 実施例の手順 第１図 観測系の構成図 第５図 ヒヌトグラムによる基点の検出 第６図 １０３′ 第７ 図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、特異性抗原もしくはこれを有する微小物体を試料と
   し、この試料を同定して定量する検出方法において 平面状の表面を有する試料基体の表面に前記試料を二次
   元的に分散して付着させる第１のステップと、 前記試料基体に付着された前記試料に特異的な第１抗体
   を前記試料基体に付着された前記試料に結合させる第２
   のステップと、 前記第１抗体を抗原としたときにこれに特異的であって
   、発光反応もしくは螢光反応を触媒する酵素と結合され
   た第２抗体を、前記試料に結合された前記第１抗体を抗
   原として結合させる第３のステップと、 前記酵素の基質を含む反応媒体に前記試料基体を浸潤さ
   せる第４のステップと、 前記試料基体の表面を撮像して発光もしくは螢光を観測
   し、二次元的に分散した前記発光もしくは螢光の基点の
   数から前記試料を定量する第５のステップと を備える特異性抗原もしくはこれを有する微小物体の検
   出方法。 ２、前記試料は所定の媒体中に含まれて試料液をなし、
   前記試料基体は前記試料を透過させずに前記媒体を透過
   させるフィルタからなり、前記第１のステップは前記フ
   ィルタの表面に前記試料液を垂らして反対面から真空吸
   引することを特徴とする請求項１記載の特異性抗原もし
   くはこれを有する微小物体の検出方法。 ３、前記第４のステップは前記撮像を所定の時間にわた
   って継続して得られた検出信号を二次元メモリに蓄積し
   、この二次元メモリに蓄積された検出信号が所定レベル
   を越えるものを前記基点とすることを特徴とする請求項
   １記載の特異性抗原もしくはこれを有する微小物体の検
   出方法。