JP2016142565A

JP2016142565A - 目的細胞の検出方法および目的細胞検出システム

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Publication number: JP2016142565A
Application number: JP2015016739A
Authority: JP
Inventors: 久美子星; Kumiko Hoshi; 淳吾荒木; Jungo Araki
Original assignee: Konica Minolta Inc
Current assignee: Konica Minolta Inc
Priority date: 2015-01-30
Filing date: 2015-01-30
Publication date: 2016-08-08
Anticipated expiration: 2035-01-30
Also published as: JP6459568B2

Abstract

【課題】目的細胞に短時間で簡単に焦点を合わせることができる目的細胞の検出方法、および該方法を実施するための目的細胞検出システムを提供する。
【解決手段】目的細胞を非目的細胞より少ない割合で含む細胞懸濁液を細胞展開用基板に展開後、展開した細胞層を単層化し、非目的細胞に結合している蛍光色素の励起光で細胞展開用基板に展開された細胞群を照射し、蛍光を発している非目的細胞に受光光学系の焦点を合わせた後、目的細胞に結合している別の蛍光色素の励起光で細胞群を照射しつつ、合わせた焦点の位置を基準として、第１の蛍光を発している目的細胞を探索する方法および該方法を実施するシステムとする。
【選択図】なし

Description

本発明は、血液などの細胞懸濁液から検出対象である目的の細胞（例；血中循環がん細胞（Circulating Tumor Cell））等を検出する方法、およびこの方法の実施するための目的細胞検出システムに関する。

血液１ｍＬには、通常の細胞が１０×⁹個程度存在するが、血中循環腫瘍細胞〔ＣＴＣ〕、末梢循環血管内皮前駆細胞〔ＣＥＣ〕、末梢循環血管内皮前駆細胞〔ＣＥＰ〕、各種幹細胞等の細胞は数〜十数個程度しか存在しないため、希少細胞と称される。例えば、ＣＴＣは、乳がんや前立腺がん、大腸がんなどの転移性のがん症例において治療効果の判定や予後予測因子として有用である。また、ＣＥＣは、血管新生および血管壁の維持に重要な役割を果たしており、循環器疾患や感染症、免疫疾患、移植後検査、癌など多くの病態では、血中に含まれるＣＥＣの数が増加するため、がん症例において治療効果の判定や予後予測因子として有用であるだけでなく、循環器疾患などによる血管へのダメージを迅速に測定することが可能である。また、ＣＥＰは骨髄由来の細胞であり、血液中に含まれるＣＥＰの数が、血管新生阻害効果（がん抑制効果）を定量化するためのバイオマーカーとして有用である。このように疾患（特に転移性のがん）に関係する希少細胞を、精度よく検出することは臨床的な有用であることが明らかであるが、その検出は極めて難しい。

特許文献１には、希少細胞を検出する方法として、汎用の蛍光物質および蛍光顕微鏡、希少ではない細胞を用いて希少細胞を検出する方法が開示されている。具体的には、希少細胞を検出するために、蛍光標識された陽性マーカー、蛍光標識された陰性マーカーを試料である細胞群に接触させ、この細胞群を基板上に展開し、展開された細胞の画像を取得し、この細胞画像に映る個々の細胞を解析（例；ある一の細胞とその他の細胞の細胞形態を比較）することにより、試料に含まれる希少細胞を検出する方法である。

特表２０１３−５０８７２９号公報

特許文献１の方法では、基板上に展開された多数の細胞について、細胞画像を取得し、細胞画像中の個々の細胞について他の細胞と比較して目的の細胞を検出する。細胞画像の焦点が合っていないと希少細胞の判別・判定が困難となるため、焦点の合った画像を取得する必要がある。

細胞画像を取得する方法として、先ず明視野において、基板上に展開されている細胞または基板に付したマークに焦点を合わせておき、その焦点のまま暗視野において、基板上に展開されている細胞群中の各細胞に付されている標識用の蛍光色素を励起・発光させて細胞画像を取得し、該細胞画像から目的細胞を探索する方法が考えられる。しかしながら、明視野の場合には全ての波長の光が含まれているため、暗視野において特定の蛍光波長（各細胞から発した各種蛍光）で焦点を合わせる場合と比べて、焦点深度（画像のピントがシャープと感じる範囲）が広くなっていることから、暗視野に移行して焦点深度が狭まると、細胞画像を取得したときに焦点が合っていない状態となって、目的細胞を探索ひいては検出する際の精度が不足してしまう場合がある。

一方で、目的細胞に焦点の合った画像を取得するために、目的細胞を標識している蛍光色素を励起して、目的細胞から発する蛍光を頼りに目的細胞に直接焦点を合わせることも考えられる。しかしながら、目的細胞は希少であるため、多数の細胞の中からそれを見つけ出して焦点を合わせることは困難である。

特に、基板をいくつかの領域（視野）に分割し、その全てについて細胞画像を取得する場合に、各領域において撮像ごとに目的細胞と非目的細胞を標識しているそれぞれの蛍光で焦点を合わせる方法では、全ての撮像を終えるまでに時間を要するのみならず、一領域で焦点を調整するのにも時間を要し、その間励起光が照射され続けることで、撮像される領域（視野）において目的細胞を標識した蛍光色素の褪色が進むのみならず、その周辺にある（後に撮像される）領域にある細胞の蛍光色素まで褪色する可能性があり、目的細胞を検出するための微弱な蛍光シグナルをロストしてしまう虞がある。

本発明は、上記課題に鑑みてなされたものであって、目的細胞に短時間で簡単に焦点を合わせることができる目的細胞の検出方法、および該方法を実施するための目的細胞検出システムを提供することを目的とする。

本発明者らは、検出しようとしている目的の細胞が非目的細胞よりも少ない場合に、細胞群を基板上に展開および単層化し、非目的細胞とほぼ同じ焦点位置に存在する非目的細胞に対し、目的細胞を検出するための光学系（顕微鏡等）の焦点を合わせておくことで、目的細胞を探索する前の段階で簡単に目的細胞の焦点またはこれに非常に近い焦点位置に焦点位置を調節することができ、目的細胞を探索しやすくなることを見出し、本発明を完成させるに至った。

本発明により、以下の［１］〜［１４］の目的細胞の検出方法および目的細胞検出システムが提供される。

［１］検出しようとしている目的細胞が非目的細胞より少ない数で含まれる細胞懸濁液を細胞展開用基板の表面に展開し、該表面に設けられた細胞を検出するための領域（細胞検出領域）に単層の細胞層を形成する細胞展開工程と、
前記目的細胞に特異的に結合する抗体と第１蛍光色素との複合体である第１蛍光標識体を用いて、前記細胞懸濁液中の細胞または前記展開後の細胞群を蛍光染色する第１蛍光標識処理工程と、
前記非目的細胞に特異的に結合する抗体と第２蛍光色素との複合体である第２蛍光標識体を用いて、前記細胞懸濁液中の細胞または前記展開後の細胞群を蛍光染色する第２蛍光標識処理工程、
および／または、
前記目的細胞と前記非目的細胞の両方に結合する第３Ａ蛍光色素である、もしくは前記目的細胞と前記非目的細胞の両方に結合する抗体と第３Ｂ蛍光色素との複合体である、第３蛍光標識体を用いて、前記細胞懸濁液中の細胞または前記展開後の細胞群を蛍光染色する第３蛍光標識処理工程と、
を順不同で含む目的細胞の検出方法であって、
第２蛍光色素または第３Ａもしくは第３Ｂ蛍光色素の励起光で前記細胞検出領域に展開された細胞群を照射し、第２の蛍光または第３Ａもしくは第３Ｂの蛍光を発している非目的細胞に受光光学系の焦点を合わせる処理を行う焦点位置調節工程と、
第１蛍光色素の励起光で前記細胞検出領域に展開された細胞群を照射しつつ、前記焦点位置調節工程で合わせた焦点位置を基準として、第１の蛍光を発している目的細胞を探索する目的細胞探索工程と、
を含むことを特徴とする目的細胞の検出方法。

［２］前記目的細胞が、血液中の細胞の総数に対して０．０１％未満の含有率で前記血液に含まれる希少細胞である、［１］に記載の目的細胞の検出方法。

［３］前記焦点位置調節工程において焦点を合わせる際に用いられる前記第２の蛍光または前記第３Ａもしくは第３Ｂの蛍光の波長が、前記第１の蛍光の波長と重複しない、［１］または［２］に記載の目的細胞の検出方法。

［４］前記目的細胞がＣＴＣであり、
前記非目的細胞が白血球であり、
前記第１蛍光標識体が、前記第１蛍光色素で標識された抗サイトケラチン抗体であり、
前記第２蛍光標識体が、前記第２蛍光色素で標識された白血球を特異的に認識する抗体である、および／または、前記第３蛍光標識体が、細胞核に結合するヘキスト系蛍光色素である、
［１］〜［３］のいずれかに記載の目的細胞の検出方法。

［５］前記細胞展開用基板の細胞検出領域の表面が平面状であり、
前記細胞展開工程では、細胞用スクレーパーを用いて該平面状の基板の表面に展開された２層以上の細胞層を単層化させる、［１］〜［４］のいずれかに記載の目的細胞の検出方法。

［６］前記細胞展開用基板の細胞検出領域の表面が、細胞を格納するためのマイクロチャンバーまたは凹凸を有しており、
前記細胞展開工程では、液流によって細胞を単層化させる、［１］〜［４］のいずれかに記載の目的細胞の検出方法。

［７］前記焦点位置調節工程と前記目的細胞探索工程との間に、
前記受光光学系に設けられている受光素子により受光する光が、前記第２の蛍光または前記第３Ａもしくは第３Ｂの蛍光から前記第１の蛍光に変化することにより生じる前記受光光学系の焦点位置のズレ量を算出し、前記焦点位置調節工程で合わせた焦点位置を補正する焦点位置補正工程をさらに含む、［１］〜［６］のいずれかに記載の目的細胞の検出方法。

［８］前記焦点位置調節工程の直後に、前記受光光学系を第２の蛍光を受光可能な状態にして前記細胞検出領域を撮像する第２細胞画像取得工程、および／または、前記受光光学系を第３Ａもしくは第３Ｂの蛍光を受光可能な状態にして前記細胞検出領域を撮像する第３細胞画像取得工程をさらに含み、
前記目的細胞探索工程として、
前記受光光学系を第１の蛍光を受光可能な状態にして前記細胞検出領域を撮像する第１細胞画像取得工程、
第２細胞画像取得工程および／または第３細胞画像取得工程と第１細胞画像取得工程で撮像した各画像を重ね合わせて合成する処理を行う画像形成工程と、
を含む、［１］〜［７］のいずれかに記載の目的細胞の検出方法。

［９］前記焦点位置調節工程を、前記細胞検出領域の異なる位置における２つ以上の視野のそれぞれで、非目的細胞に焦点を合わせて各視野の焦点距離の情報を得ることによって行い、これら焦点距離が相違する場合、その差分から、前記２つ以上の視野以外の他の視野における焦点距離の変化を表す近似式を求め、
当該他の視野においては、それぞれの焦点距離を前記近似式から算出して、この算出された焦点距離に前記受光光学系の焦点距離を設定する工程を、前記焦点位置調節工程として行う、［１］〜［８］のいずれかに記載の目的細胞の検出方法。

［１０］検出しようとしている目的細胞が非目的細胞より少ない数で含まれる細胞懸濁液を表面に展開可能な細胞検出領域を有する細胞展開用基板と、
前記細胞展開用基板の細胞検出領域に単層の細胞層を形成する細胞展開手段と、
前記目的細胞に特異的に結合する抗体と第１蛍光色素との複合体である第１蛍光標識体を用いて、前記細胞懸濁液中の細胞または前記展開後の細胞群を蛍光染色する第１蛍光標識処理手段と、
前記非目的細胞に特異的に結合する抗体と第２蛍光色素との複合体である第２蛍光標識体を用いて、前記細胞懸濁液中の細胞または前記展開後の細胞群を蛍光染色する第２蛍光標識処理手段、
および／または、
前記目的細胞と前記非目的細胞の両方に結合する第３Ａ蛍光色素である、もしくは前記目的細胞と前記非目的細胞の両方に結合する抗体と第３Ｂ蛍光色素との複合体である、第３蛍光標識体を用いて、前記細胞懸濁液中の細胞または前記展開後の細胞群を蛍光染色する第３蛍光標識処理手段と、
前記細胞展開用基板の細胞検出領域に対して、所定波長の励起光を照射可能な照射光学系と、
前記細胞検出領域からの光を波長帯域別に受光可能な受光光学系と、
少なくとも前記受光光学系および照射光学系を制御する制御手段と、
を備えた、目的細胞検出システムであって、
前記制御手段は、少なくとも、
前記照射光学系により第２蛍光色素または第３Ａもしくは第３Ｂ蛍光色素の励起光で前記細胞検出領域に展開された細胞群を照射し、第２の蛍光または第３Ａもしくは第３Ｂの蛍光を発している非目的細胞に前記受光光学系の焦点を合わせる焦点位置調節手段と、
前記照射光学系により第１蛍光色素の励起光で前記細胞検出領域に展開された細胞を照射しつつ、前記焦点位置調節手段で合わせた焦点の位置を基準として、前記受光光学系で第１の蛍光を発している目的細胞を探索する処理を行う目的細胞探索手段と、
を備えたことを特徴とする目的細胞検出システム。

［１１］前記目的細胞が、血液中の細胞の総数に対して０．０１％未満の含有率で前記血液に含まれる希少細胞である、［１０］に記載の目的細胞検出システム。

［１２］前記焦点位置調節手段によって焦点を合わせる際に用いられる前記第２の蛍光または前記第３Ａもしくは第３Ｂの蛍光の波長が、前記第１の蛍光の波長と重複しない、［１０］または［１１］に記載の目的細胞検出システム。

［１３］前記目的細胞がＣＴＣであり、
前記非目的細胞が白血球であり、
前記第１蛍光標識体が、前記第１蛍光色素で標識された抗サイトケラチン抗体であり、
前記第２蛍光標識体が、前記第２蛍光色素で標識された白血球を特異的に認識する抗体である、および／または、前記第３蛍光標識体が、細胞核に結合するヘキスト系蛍光色素である、
［１０］〜［１２］のいずれかに記載の目的細胞検出システム。

［１４］前記細胞展開用基板の細胞検出領域の表面が平面状であり、
前記細胞展開手段が、前記表面部に展開された２層以上の細胞層を単層化させるための細胞用スクレーパーを備えた、［１０］〜［１３］のいずれかに記載の目的細胞検出システム。

［１５］前記細胞展開用基板の細胞検出領域の表面が、細胞を格納するためのマイクロチャンバーまたは凹凸を有しており、
前記細胞展開手段が、細胞を単層化させるための液流を発生させる送液系機構を備えた、［１０］〜［１３］のいずれかに記載の目的細胞検出システム。

［１６］前記制御手段は、
前記受光光学系に設けられている受光素子により受光する光が、前記第２の蛍光または前記第３Ａもしくは第３Ｂの蛍光から前記第１の蛍光に変化することにより生じる焦点位置のズレ量を算出し、前記焦点位置調節手段で合わせた焦点位置を補正する焦点位置補正手段をさらに備えた、［１０］〜［１５］のいずれかに記載の目的細胞検出システム。

［１７］前記焦点位置調節手段により前記受光光学系の焦点を合わせた直後に、前記受光光学系を第２の蛍光を受光可能な状態にして前記細胞検出領域を撮像する第２細胞画像取得手段、および／または、前記受光光学系を第３Ａもしくは第３Ｂの蛍光を受光可能な状態にして前記細胞検出領域を撮像する第３細胞画像取得手段をさらに備え、
前記目的細胞探索手段として、
前記受光光学系を第１の蛍光を受光可能な状態にして前記細胞検出領域を撮像する第１細胞画像取得手段と、
前記第１細胞画像取得手段と前記第２細胞画像取得手段で撮像した各画像を重ね合わせて合成する処理を行う画像形成手段と、
を備えた、［１０］〜［１６］のいずれかに記載の目的細胞検出システム。

［１８］前記細胞検出領域の異なる位置における２つ以上の視野のそれぞれで、非目的細胞に焦点を合わせて焦点距離の情報を得た後、
これら焦点距離が相違する場合、その差分から、前記２つ以上の視野以外の他の視野における焦点距離の変化を表す近似式を求め、
当該他の視野においては、それぞれの焦点距離を前記近似式から算出して、この算出された焦点距離に前記受光光学系の焦点距離を設定する手段を、前記焦点位置調節手段として含む、［１０］〜［１７］のいずれかに記載の目的細胞検出システム。

本発明によれば、目的細胞に短時間で簡単に焦点を合わせることができる目的細胞の検出方法、および該方法を実施するための目的細胞検出システムが提供される。それにより、目的細胞を標識した蛍光色素の褪色を極力抑え、目的細胞の検出精度を向上させるとともに、検出工程全体の所用時間も短縮化することができる。

図１は、本発明に係る目的細胞検出システムの一例を示した図である。図２は、細胞展開手段により細胞展開工程が行われている状態を説明した図である。（Ａ）は、細胞懸濁液を流路へ流し込んでいる状態を示した図である。（Ｂ）は、往復送液により細胞をマイクロチャンバー内に格納しつつ、細胞層を単層化している状態を示した図である。（Ｃ）は、単層化後の細胞回収デバイスの状態を示した図である。なお、図２中、「●」は検出対象の目的細胞（例；ＣＴＣ細胞）を示している。また、第１〜第３蛍光標識体の図示は省略されている（他の図も同様である）。図３は、表面に凹凸を有する細胞展開用基板を示した部分断面斜視図である。図４は、細胞回収デバイスの細胞展開用基板に展開した細胞群に対して細胞用スクレーパーで細胞を単層化している状態を示した図である。図５は、目的細胞検出システムの照射光学系および受光光学系の模式図を示している。この例では、細胞展開用デバイスは、細胞回収デバイスホルダーにより保持され、細胞回収デバイスホルダーが駆動することにより、光軸（縦方向の一点鎖線）に対してＸ，Ｙ，Ｚの方向に位置調節可能に設けられている。図６は、マイクロチャンバーが形成された細胞展開用基板の表面が製造誤差・公差等により傾斜している場合に、その傾斜が一様であるので、マイクロチャンバー内の非目的細胞に複数個所で焦点を合わせ、得られる複数の焦点距離から焦点距離を表す線形近似式を作成し、焦点を合わせていない他のマイクロチャンバー内の非目的細胞の焦点距離を近似式から算出し焦点位置を設定し、この焦点位置を基準に目的細胞を検出する場合の説明図である。図７は、本発明に係る目的細胞の探索方法のメインフローチャートを示した図である。ここで、焦点位置補正工程（破線部分）は任意に実行されることが示されている。図８（Ａ）は、細胞展開工程のフローの一例を示した図であり、表面にマイクロチャンバーまたは凹凸が形成された細胞展開用基板を使用した場合に、マイクロチャンバー内に積層された細胞を単層化するための工程が示されている。図８（Ｂ）は、細胞展開工程のフローの他の一例を示した図であり、表面に平面状である細胞展開用基板を使用した場合に、細胞用スクレーパーを使用して積層された細胞層を単層化するための工程が示されている。図９は、蛍光標識処理工程の一例を示した図である。細胞懸濁液を細胞展開用基板に展開する前と展開した後によってフローが分かれる。展開する前の場合のフローが図９右側に示されており、展開した後の場合のフローが図９左側に示されている。図１０は、細胞展開用基板を上方から平面視した図であり、仮想設定される複数の視野がマス目状に示されており、１つの矩形（□）が１つの視野を示している。アルファベットＡ〜Ｉは、焦点位置調節工程で非目的細胞に焦点を合わせた位置を示している。細胞展開用基板の表面が製造誤差・公差により傾斜している場合に、各点（例えば点Ａ、Ｂ、Ｃ）で合わせた焦点距離を使用して線形近似がなされ、例えば相関係数がＲ²＞０．９０以上である場合には、線形近似式からＡ−Ｂ間の視野、またはＢ−Ｃ間の視野の焦点距離が算出される。図１０では細胞検出領域全域を網羅するように焦点が調べられていることを示している。図１１は、目的細胞検出システムにより行われる焦点位置調節工程のフローの一例を示した図である。ある視野で得られた非目的細胞についての受光光学系の焦点位置でもって、予め決められた基板上の複数の視野について非目的細胞が検出できるか確認し（細胞展開用基板に歪みが有無を確認し）、検出できる場合（歪みがない場合）には近似式を作成しない。一方、検出できない場合（細胞展開用基板に歪みがある場合）には、複数の視野３つ以上において非目的細胞に焦点を合わせて焦点距離をそれぞれ取得してこの焦点距離の情報に基づいて近似式を作成し、調べた視野間にある他の視野について焦点距離を設定するものである。図１２は、目的細胞探索工程のフローの一例を示した図である。図１３は、本発明の作用・効果を説明した図面である。各マイクロチャンバーの底面の高さ位置は略同じであり、各マイクロチャンバーの底面に存在する単層の細胞層についても高さ位置が略同じとなることから、視野１と２において非目的細胞と目的細胞についての受光光学系の焦点位置は略同じとなる。そのため、視野１において非目的細胞（○）に事前に焦点を合わせて、この状態を維持することで、視野２においても目的細胞（●）を検出することができる。図１４は、本発明の作用・効果を説明した図面である。細胞展開用基板が平面状で水平であり、視野１と２において非目的細胞と目的細胞についての受光光学系の焦点位置は略同じとなる。そのため、視野１において非目的細胞（○）に事前に受光光学系の焦点を合わせて、この状態を維持することで、視野２においても目的細胞（●）を検出することができる。

以下、本発明に係る目的細胞検出システムについて図面を参照しながら説明した後、該システムを使用する場合を例として、本発明に係る目的細胞の検出方法について説明する。

《目的細胞検出システム》
本発明に係る目的細胞検出システムは、検出しようとしている目的細胞が非目的細胞より少ない数で含まれる細胞懸濁液を表面に展開可能な細胞検出領域を有する細胞展開用基板と、前記細胞展開用基板の細胞検出領域に単層の細胞層を形成する細胞展開手段と、前記目的細胞に特異的に結合する抗体と第１蛍光色素との複合体である第１蛍光標識体を用いて、前記細胞懸濁液中の細胞または前記展開後の細胞群を蛍光染色する第１蛍光標識処理手段と、前記非目的細胞に特異的に結合する抗体と第２蛍光色素との複合体である第２蛍光標識体を用いて、前記細胞懸濁液中の細胞または前記展開後の細胞群を蛍光染色する第２蛍光標識処理手段、および／または、前記目的細胞と前記非目的細胞の両方に結合する第３Ａ蛍光色素である、もしくは前記目的細胞と前記非目的細胞の両方に結合する抗体と第３Ｂ蛍光色素との複合体である、第３蛍光標識体を用いて、前記細胞懸濁液中の細胞または前記展開後の細胞群を蛍光染色する第３蛍光標識処理手段と、前記細胞展開用基板の細胞検出領域に対して、所定波長の励起光を照射可能な照射光学系と、前記細胞検出領域からの光を波長帯域別に受光可能な受光光学系と、少なくとも前記受光光学系および照射光学系を制御する制御手段と、を備え、前記制御手段は、少なくとも、前記照射光学系により第２蛍光色素または第３Ａもしくは第３Ｂ蛍光色素の励起光で前記細胞検出領域に展開された細胞群を照射し、第２の蛍光または第３Ａもしくは第３Ｂの蛍光を発している非目的細胞に前記受光光学系の焦点を合わせる焦点位置調節手段と、前記照射光学系により第１蛍光色素の励起光で前記細胞検出領域に展開された細胞を照射しつつ、前記焦点位置調節手段で合わせた焦点の位置を基準として、前記受光光学系で第１の蛍光を発している目的細胞を探索する処理を行う目的細胞探索手段と、を備えている。

図１に目的細胞検出システムの一例を示す。この目的細胞検出システム１００は、細胞展開用基板１１、細胞展開手段，第１〜第３蛍光標識処理手段としての送液系機構９、照射光学系６、受光光学系７、制御手段８等を備えている。なお、図１において、符号１３は試薬収容器を示し、細胞懸濁液ＣＬ、第１蛍光標識体ＦＬ１、第２蛍光標識体ＦＬ２、第３Ａ蛍光標識体ＦＬ３Ａおよび第３Ｂ蛍光標識体ＦＬ３Ｂを格納している。また、試薬収容器１３は、遮光部材で全体が覆われて遮光されている（不図示）。

（細胞懸濁液）
細胞懸濁液は、検出しようとしている目的細胞が検出対象外の非目的細胞より少ない数で含まれるものであり、希少細胞またはその他の目的細胞を含んでいる可能性がある、血液、尿、リンパ液、組織液、体腔液等の検体、あるいはそれらの検体から得られた細胞画分や精製物などの前処理物を、ＰＢＳ等の適切な溶媒で希釈することにより調製することができる。細胞懸濁液は、例えば、末梢血そのものでもよいし、末梢血から白血球の画分を分離し、これを適切な緩衝液（例えばリン酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ））等で希釈したものであってもよい。この分離を行う場合、ヒトリンパ球分離用媒体（例えばFicoll-paque(GE社)）を用いた密度勾配遠心分離が好適であり、遠心分離により血漿層の下に分離されるリンパ球を含む血球層から上記細胞懸濁液を調製することができる。なお、上記「希少細胞」とは、血液中の細胞の総数に対して０．０１％未満の含有率で前記血液に含まれる細胞である。

また、細胞懸濁液は、試験、研究等のために培養した、希少細胞またはその他の目的細胞の細胞株、あるいは目的細胞を含む細胞集団を、ＰＢＳ等に分散させて調製したものであってもよい。患者の血中細胞モデルとして、健常者から採取された血中細胞の懸濁液にＣＴＣ等の希少細胞の細胞株を添加したものを細胞懸濁液として用いてもよい。

細胞懸濁液としては、細胞固定化処理およびタンパク質除去処理を経たもの、すなわち所定の固定化剤により処理されたＣＴＣ等の目的細胞を含み、かつブロッキング効果を付与してしまうようなタンパク質が除去されている細胞懸濁液が好適である。なお、細胞懸濁液には、後述する第１蛍光標識体、第２蛍光標識体、第３Ａ蛍光色素および第３Ｂ蛍光標識体のいずれかを含有するものも含まれる。

＜細胞展開用基板＞
細胞展開用基板は、細胞懸濁液を展開することができる基板であればよく、典型的には、図１に示した例においては細胞回収デバイス１０のマイクロチャンバーチップ１１が該当する。図１に例示した目的細胞検出システム１００では、細胞回収デバイス１０として、マイクロチャンバーチップ１１と流路形成部材１２とをシール部材１２ａで気密性を維持した状態で組み合わせたものが設けられており、送液系機構９が、デバイス１０の流入口２から内部空間の流路１に細胞懸濁液ＣＬを導入することにより、マイクロチャンバーチップ１１の表面に細胞懸濁液ＣＬ中の細胞を展開することができるように構成されている。

しかしながら、本発明に使用することできる細胞展開用基板は、そのような実施形態に限定されるものではなく、表面に細胞懸濁液を展開してその中に含まれる細胞を吸着させることができるものであればよい。例えば、細胞展開用基板はスライドグラスや細胞培養用のシャーレの底面であってもよい。また、細胞展開用基板は必ずしも流路形成部材１２とシール部材１２ａの両方を組み合わせ、流路が形成された状態で用いなくてもよく、例えばシール部材１２ａのみを細胞展開用基板と組み合わせ、開放されている上部から細胞懸濁液ＣＬ等を滴下し、細胞を展開するような実施形態であってもよい。

（材質）
細胞展開用基板上に展開された細胞群は、後述するように液流等により細胞展開用基板上の所定の表面範囲に集められて細胞観察等に供されるが、この所定の範囲が細胞検出領域であり、基板のあらゆる方向から基板の中を観察用の励起光または蛍光が通過できるように光学的に透明な部材で形成されていることが好ましい。図１において細胞展開用基板１１の細胞検出領域を符号ＣＤＲで示す。

細胞展開用基板の材質としては、例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリジメチルシロキサン〔ＰＤＭＳ〕、ポリメチルメタクリレート〔ＰＭＭＡ〕、環状オレフィンコポリマー〔ＣＯＣ〕などの透明なポリマーが挙げられる。細胞展開用基板は、成形された前記ポリマーに、金属、ガラス、石英ガラスなどからなる基板を貼り合わせたような複数の材料を組み合わせたものであってもよい。

細胞検出領域の寸法（縦幅、横幅）は特に限定されないが、展開したい細胞懸濁液の量または細胞懸濁液の展開のしやすさに基づいて設定することができる。好適な例として、縦幅（図１において流路１の方向の長さ）が１０ｍｍ以上、横幅は５０ｍｍ以下に設定する例が挙げられる。

（形状）
細胞展開用基板は、その細胞検出領域に該当する細胞展開用基板の表面部分がマイクロチャンバーまたは凹凸を有していてもよい。細胞展開用基板としては、図１に示すようにマイクロチャンバー５を有する細胞展開用基板１１や、図３に示すように凹凸を有する細胞展開用基板１１ａが挙げられる。

（マイクロチャンバー）
マイクロチャンバーとは、一個以上の細胞を「収容」し、「保持」することができる凹状の微細穴をいい、有底であることが好ましい。また、マイクロチャンバーの形状は、好適には底部が平坦な逆円錐形であるが、これに限定されない。図１および図２に示す例では、逆円錐台形のマイクロチャンバー５・・・が設けられている。ここで、上述した「保持」とは、マイクロチャンバーに収容された細胞が、細胞展開用基板上の流路に対する染色液または洗浄液の通液等によってマイクロチャンバーの外に出難いことをいう。

マイクロチャンバーの開口上部の直径は、２０〜５００μｍであることが好ましい。該直径が２０〜５００μｍの範囲内であると、マイクロチャンバー内に好適に細胞を収容、保持することができる。マイクロチャンバーの深さは、マイクロチャンバー１個あたりに細胞を１０〜１５個程度収容できることが好ましく、典型的には、マイクロチャンバーの深さは、１０〜２５０μｍである。マイクロチャンバーの数は、とくに限定されないが、細胞検出領域に１０００〜３００００個以上形成する例を挙げることができる。

（凹凸）
細胞展開用基板に凹凸を設ける場合、凹部と凸部の間隔は特に限定されないが、より多くの細胞を格納・保持する観点から、図３に例示したように、凹凸を連続形成した細胞展開用基板１１ａが好ましい。なお、細胞展開用基板に凹凸を設ける場合、展開した細胞の層が極力２層以上とならず、且つ、目的細胞を格納・保持できる範囲に凹部の深さ（凸部の高さ）を設定することが好ましい。具体的には、目的細胞の最大粒径〜最大粒径の９０％程度の深さが好ましい。

ＣＴＣ等の希少細胞の直径（平均直径）は、例えば、ＡｍｅｒｉｃａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＰａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１５６，Ｎｏ．１，５７−６３，Ｊａｎｕａｒｙ２０００には、以下のように報告されている。複数種の循環がん細胞について光学顕微鏡写真を撮影し、各種の循環がん細胞（ＣＴＣ）の平均的な投影面積を３９６μｍ²〜７９６μｍ²であると測定している。よって、各種の循環がん細胞の形状を球と仮定すると、循環がん細胞の直径は２２〜３２μｍであると算出されるとしている。また、血球細胞の直径を下表１に示す。したがって、細胞展開用基板の凹部の深さまたは凸部の高さは２０〜３０μｍ程度であることが好ましい。

＜細胞展開手段＞
細胞展開手段は、細胞展開用基板の細胞検出領域に単層の細胞層を形成する手段である。
図１〜図３に例示したように、細胞展開用基板１１がマイクロチャンバー５または凹凸を有している場合、細胞展開手段は、２層以上の細胞層を単層化させるための液流を発生させる送液機能を有していることが望ましい。この理由は、マイクロチャンバー５または凹凸を有している細胞展開用基板１１（または１１ａ）に対して細胞懸濁液ＣＬを展開すると、マイクロチャンバー５または凹部の中で細胞が積層されてしまうため、細胞用スクレ―パー１４（図４参照）では積層された細胞の層を単層化することが困難であるからである。

図１の例では、送液系機構９が細胞展開手段に該当し、図２（Ａ）〜（Ｃ）に示すように、この送液系機構９が細胞を単層化させるための液流を発生させて細胞の単層化を行うことができる送液機能を有していることが望ましい。

送液系機構９は、制御手段８に記憶された制御プログラムにより動作制御されて細胞を単層化させるための液流を発生させるものでもよく、これとは別に、細胞を単層化させるための液流を発生することができるように機械的に構成されたもの（ピペット等）であって、ユーザーによって操作されるものであってもよい。さらに、送液系機構９は、細胞を単層化させるための液流を発生することができれば、特開2012-000065号公報に開示されているように送液機構と供給槽と備えたものであってもよい。

（液流による細胞の単層化）
細胞を単層化させるための液流としては、少なくとも展開された細胞を移動させる液流であり、具体的には、流束（単位時間に流路断面単位面積当たりに流れる流体の量）が（１ｍｍ／分）〜（１００００ｍｍ／分）であることが望ましい。なお、液流は、細胞懸濁液ＣＬ自体の液流でも、細胞懸濁液ＣＬとは別の等張液（生理食塩水）の液流でもよい。

（細胞用スクレーパーによる単層化）
一方、図４に例示したように、細胞展開用基板が平板状である場合も、細胞同士が接着して積層されるため、細胞展開手段として細胞展開用スクレーパーを用いることにより積層された細胞の層を単層化することができる。このように単層化する方式は、ギャップコート方式と称され、図４の例で説明すれば、細胞懸濁液ＣＬを細胞展開用基板１１上に滴下した後、細胞展開用基板１１の上面に対して一定のギャップ（塗布ギャップ）を開けたバー状の細胞用スクレーパー１４（ブロッキング処理したもの）をスライド（図４においては白抜矢印方向にスライド）させる。

この塗布ギャップは、目的細胞（例；ＣＴＣ）の最大径（ＣＴＣの例では２２〜３２μｍ）の１〜３倍程度（ＣＴＣの例では２０〜１００μｍ程度）であることが好ましい。また、塗布ギャップを目的細胞の平均粒子径〜その９０％に設定してもよい。また、細胞用スクレーパー１４は、細胞展開用基板１１の表面に沿って（典型的には水平方向に）往復移動可能に構成されている。

（ワイヤーバーによる単層化）
単層の細胞層を形成する別の方法としては、ワイヤーバー方式による方法が挙げられる。この方法は、例えば、目的細胞の最大粒子径〜最大粒子径の２倍程度の太さのワイヤ（例；目的細胞がＣＴＣである場合、ＣＴＣの最大粒子径２２〜３２μｍの１倍〜２倍、具体的には３２〜６５μｍのワイヤ（例；０．０５号または０．０８号のナイロン繊維等））を、例えばガラス製の丸棒部分を有する細胞用スクレーパーに巻き付けてこれをブロッキング処理した後、細胞展開用基板１１ｂの上面に接触させた状態でスライドさせて展開された積層の細胞を単層化させる方法である。
上述した方式以外にも細胞の単層化ができる公知の方法を使用して積層された細胞を単層化してもよい。

＜第１蛍光標識処理手段＞
第１蛍光標識処理手段は、細胞懸濁液に含まれる細胞群、または細胞展開用基板の表面に展開された細胞群に対して、目的細胞に特異的に結合する抗体と第１蛍光色素との複合体である第１蛍光標識体を接触させる処理を行う手段である。

第１蛍光標識処理手段は、図１の例では、ユーザーまたは制御手段８により動作制御され、細胞群に対して第１蛍光標識体を接触させる処理を行う送液系機構９が該当する。図１の例では、第１蛍光標識処理手段としての送液系機構９は、試薬収容器１３に収容されている第１蛍光標識体ＦＬ１を含む溶液を吸引して、同じく試薬収容器１３にある展開前の細胞懸濁液ＣＬに混合してその中に含まれる細胞群に第１蛍光標識体ＦＬ１を接触させるか、または、既に細胞展開用基板１１に展開された細胞群に対して第１蛍光標識体ＦＬ１を含む溶液を送液する。

〔第１蛍光標識体〕
第１蛍光標識体とは、検出対象である希少細胞等の目的細胞に特異的に結合する抗体と第１蛍光色素との複合体である。この抗体としては、目的細胞に特異的に発現している抗原を特異的に認識する抗体であり、目的細胞別にターゲットとなる特異抗原が異なる（下記表２参照）。なお、第１標識蛍光体は等張液（ＰＢＳ等）に溶解されていることが好ましい。

例えば、目的細胞がＣＴＣの場合、抗サイトケラチン抗体が上記抗体として好適に用いられる。目的細胞がＣＥＣの場合、抗ＣＤ３４抗体が上記抗体として好適に用いられる。目的細胞がＣＥＰの場合には、抗ＣＤ３４抗体、抗ＣＤ１３３抗体、抗ＶＥＧＦＲ−２抗体が上記抗体として好適に用いられる（表２参照）。目的細胞に特異的に結合する抗体であれば、上記抗体は表２に例示されたものに限定されない。

（第１蛍光色素）
第１蛍光色素は、検出対象である目的細胞の標識に用いられる蛍光色素であり、その蛍光波長は、検出対象外の細胞（非目的細胞）の標識に用いられる後述の第２蛍光色素、または目的細胞と非目的細胞との双方の標識に用いられる第３Ａ，第３Ｂ蛍光色素とは、蛍光波長が重複しないものである。

第１蛍光色素として使用可能なものは、特に限定されず有機蛍光色素または無機蛍光色素を使用することができる。有機蛍光色素としては、例えばＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ３５０、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４０５、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４３０、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５００、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５１４、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５３２、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５４６、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５５５、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５６８、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６１０、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６３３、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６３５、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６６０、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６８０、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７００、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０が挙げられる。

＜第２蛍光標識処理手段＞
第２蛍光標識処理手段は、細胞懸濁液に含まれる細胞群または細胞展開用基板の表面に展開された細胞群に対して、非目的細胞に特異的に結合する抗体と第２蛍光色素との複合体である第２蛍光標識体を接触させる処理を行う手段である。

第２蛍光標識処理手段は、図１の例では、ユーザーまたは制御手段８により動作制御され、細胞群に対して第２蛍光標識体を接触させる処理を行う送液系機構９が該当する。図１の例では、第２蛍光標識処理手段としての送液系機構９は、試薬収容器１３に収容されている第２蛍光標識体ＦＬ２を含む溶液を吸引して、同じく試薬収容器１３にある展開前の細胞懸濁液ＣＬに混合してその中に含まれる細胞群に第２蛍光標識体ＦＬ２を接触させるか、または、既に細胞展開用基板１１に展開された細胞群に対して第２蛍光標識体ＦＬ２を含む溶液を送液する。

〔第２蛍光標識体〕
第２蛍光標識体とは、検出対象外である白血球等の非目的細胞に特異的に結合する抗体と第２蛍光色素との複合体である。第１標識蛍光体は等張液（ＰＢＳ等）に溶解されていることが好ましい。

上記抗体として使用可能な抗体は、非目的細胞に特異的に発現している抗原を特異的に認識する抗体であり、非目的細胞の種類に特異抗原が異なるので、使用可能な抗体もそれにより異なってくる（下記表３参照）。非目的細胞が白血球の場合、抗CD４５抗体等の白血球を特異的に認識する抗体が上記抗体として好適に用いられる。非目的細胞が赤血球の場合、抗D抗体が上記抗体として好適に用いられる。この他にも、例えば、ベックマン・コールターのCD分類チャートに従って、目的に応じて適切に抗原を選択することができる（参照ＵＲＬｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｃ−ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．ｃｏｍ／ＣＤ＿Ｃｈａｒｔ．ｈｔｍｌ）。

（第２蛍光色素）
第２蛍光色素は、検出対象外の非目的細胞の標識に用いられる蛍光色素であり、その蛍光波長は、検出対象の細胞（非目的細胞）の標識に用いられる前述の第１蛍光色素、または目的細胞と非目的細胞との双方の標識に用いられる第３Ａ蛍光色素，第３Ｂ蛍光色素とは、蛍光波長が重複しないものが好ましい。第２蛍光色素として、第１蛍光色素、第３Ａ蛍光色素または第３Ｂ蛍光色素と蛍光波長が部分的に重複する蛍光色素を使用してもよいが、その場合には受光光学系に蛍光フィルターを設置して重複する蛍光波長の帯域をカットして受光することが好ましい。

第２蛍光色素として使用可能なものは、特に限定されず、例えば第１蛍光色素として列挙した有機蛍光色素の中から選択して使用することができる。また、非目的細胞という括りで、共通の蛍光色素を使用してもよい。

＜第３蛍光標識処理手段＞
第３蛍光標識処理手段は、細胞懸濁液に含まれる細胞群または細胞展開用基板の表面に展開された細胞群に対して、非目的細胞と目的細胞の両方に結合する蛍光色素（第３Ａ蛍光色素）、または、非目的細胞と目的細胞の両方に結合する抗体と蛍光色素（第３Ｂ蛍光色素）との複合体である第３蛍光標識体を接触させる処理を行う手段である。

第３蛍光標識処理手段は、図１の例では、ユーザーまたは制御手段８により動作制御され、細胞群に対して第３Ａ蛍光色素または第３Ｂ蛍光標識体を接触させる処理を行う送液系機構９が該当する。図１の例では、第３蛍光標識処理手段としての送液系機構９は、試薬収容器１３に収容されている第３Ａ蛍光色素ＦＬ３Ａまたは第３Ｂ蛍光標識体ＦＬ３Ｂを含む溶液を吸引して、同じく試薬収容器１３にある展開前の細胞懸濁液ＣＬに混合してその中に含まれる細胞群に第３Ａ蛍光色素ＦＬ３Ａまたは第３Ｂ蛍光標識体ＦＬ３を接触させるか、または、既に細胞展開用基板１１に展開された細胞群に対して第３Ａ蛍光色素ＦＬ３Ａまたは第３Ｂ蛍光標識体ＦＬ３を含む溶液を送液する。

〔第３Ａ蛍光色素〕
第３Ａ蛍光色素は、非目的細胞と目的細胞の両方に共通して存在する細胞器官に結合する蛍光色素である。

例えば、目的細胞がＣＴＣ等の希少細胞であり、非目的細胞が希少細胞以外の細胞（白血球等）である場合、上記第３Ａ蛍光色素としては、染色された物体が核を有する細胞である（核を有さない細胞断片等ではない）ことを判別するために用いられる、非目的細胞よび目的細胞の細胞核に共通して結合するヘキスト系蛍光色素またはＤＡＰＩが好適に用いられる（下記表４参照）。

〔第３Ｂ蛍光標識体〕
第３蛍光標識体とは、目的細胞と非目的細胞との両方に共通して発現している抗原に結合する抗体と第３Ｂ蛍光色素との複合体である。第３Ｂ蛍光標識体は等張液（ＰＢＳ等）に溶解されていることが好ましい。例えば、非目的細胞と目的細胞の両方に共通して発現している抗原に結合する抗体としては、測定される各種の蛍光の強度を標準化するための基準として蛍光染色される、細胞内で構成的に発現しているハウスキーピング遺伝子の産物（シトクロムｃ、アクチン等）に対する抗体が好適に用いられる（下記表４参照）。

（第３Ａ，第３Ｂ蛍光色素）
第３Ａ蛍光色素としてヘキスト系蛍光色素を使用する場合、例えば、Hoechst 33258、Hoechst 33342を使用することができる。第３Ｂ蛍光色素としては、目的細胞と非目的細胞の両方の標識に用いられる蛍光色素であり、その蛍光波長は、検出対象の細胞（非目的細胞）の標識に用いられる前述の第１蛍光色素、または目的細胞と非目的細胞との双方の標識に用いられる第３蛍光色素とは、蛍光波長が重複しないものが好ましい。第３Ｂ蛍光色素として、第１蛍光色素、第２蛍光色素または第３Ａ蛍光色素と蛍光波長が部分的に重複する蛍光色素を使用してもよいが、その場合には受光光学系に蛍光フィルターを設置して重複する蛍光波長の帯域をカットして受光することが好ましい。

＜照射光学系＞
照射光学系は、前述した各蛍光色素を励起させる波長帯域の光を細胞展開用基板の細胞検出領域に対して照射することが可能なものである。ここで、照射光学系の光軸上に励起波長以外の光をカットする光学フィルターを設けてもよい。図１の例では、細胞回収デバイス１０の上方に照射光学系６及び受光光学系７が設けられている（図１および図５参照）。図５に示したように、光照射装置（光源）１５から細胞展開用デバイス１０までの励起光の光路上には、照射レンズ群２０、ダイクロイックミラー１７および対物レンズ１８が配置されている。光照射装置（光源）１５から出射された励起用の光は、照射用レンズ群２０、ダイクロイックミラー１７、対物レンズ１８を通って細胞展開用デバイス１０内に展開された単層の細胞に向けて集光される。一方、細胞展開用デバイス１０から撮像部２１までの蛍光の光路上（図５の上下方向の一点鎖線）には、対物レンズ１８、ダイクロイックミラー１７、蛍光フィルター１９、レンズ１６が、細胞展開用デバイス１０側からこの順に配置されている。細胞展開用デバイス１０から放出された蛍光（第１〜第３Ｂの蛍光の少なくともいずれか）は、対物レンズ１８、ダイクロイックミラー１７、蛍光フィルター１９を通過した後、レンズ１６により光検出部としての撮像部２１の受光面（ＣＣＤ等の受光素子）に結像させられる。蛍光フィルター１９には、例えば、励起光カットフィルターや減光フィルター等が用いられる。このうち励起光カットフィルターは、励起光や外光などを遮断してＳ／Ｎ比を向上させる。一方、減光フィルターは、蛍光強度を光検出部に合わせて調整する。なお、ダイクロイックミラー１７で不要な波長を取り除いてもよい。

細胞展開用デバイス１０は、設置された細胞回収デバイスホルダー２６を移動させることでＸ軸方向，Ｙ軸方向に移動させて位置調節することができる。また、Ｚ軸方向に移動して位置調節する場合には、細胞展開用デバイス１０を移動（図５において上下方向に移動）するか、または、不図示のアクチュエータにより対物レンズ１８Ａを、光軸上で前後に移動させて調整する。

＜制御手段＞
制御手段は、受光光学系の焦点を合わせる焦点位置調節手段と、合わせた焦点を基準にして目的細胞を探索する処理を行う目的細胞探索手段とを備え、任意に、後述の焦点位置補正手段を有している。ここで、制御手段は、プログラム自身、またはプログラムにより自動的に実行されるものであってもよい。

図１に示した例では、制御手段８の一部として受光光学系の焦点位置の調節を行うプログラムが記憶されており、このプログラム（の実行体）２３が焦点位置調節手段に該当する。同様に、制御手段８の一部として目的細胞の探索を行う制御プログラムが記憶されており、この第２プログラム（の実行体）２４が目的細胞探索手段に該当する。

（焦点位置調節手段）
焦点位置調節手段は、照射光学系により第２蛍光色素または第３Ａもしくは第３Ｂ蛍光色素の波長光を前記細胞検出領域に展開された細胞群を照射させて、第２の蛍光または第３Ａもしくは第３Ｂの蛍光を発している非目的細胞に焦点を合わせる処理を行う手段である。

図１および図５に示した例では、焦点位置調節手段としてのプログラム２３は、受光光学系７にある蛍光フィルター１９の交換等を行うことで受光光学系７を第２の蛍光を受光する状態にした後、不図示のアクチュエータ等を介して前述の位置調節を行い、これにより、第２の蛍光で細胞展開用基板１１（または１１ａ）上の細胞検出領域ＣＤＲに展開され単層化されている非目的細胞に焦点を合わせる処理を行う。

さらに、焦点位置調節手段が以下の手段、すなわち、前記細胞検出領域の異なる位置における２つ以上の視野のそれぞれで、非目的細胞に焦点を合わせて焦点距離の情報を得た後、これら焦点距離が相違する場合、その差分から、前記２つ以上の視野以外の他の視野における焦点距離の変化を表す近似式を求め、当該他の視野においては、それぞれの焦点距離を前記近似式から算出して、この算出された焦点距離に前記受光光学系の焦点距離を設定する手段（焦点距離情報補完手段）を有していてもよい。

図１の例では、制御手段８の一部として、所定の視野についての焦点距離情報を補完するプログラムが記憶されており、このプログラム２５が焦点距離情報補完手段に該当する。詳細は後記の焦点位置調節工程で詳述するが、図６に示す例で説明すれば、先ず、焦点位置調節手段が視野１で非目的細胞に焦点を合わせて焦点Ａの情報を得た後、視野１以外の視野（例えば動作ロスの少なくするために隣接する視野２）において同様に非目的細胞を検出可能か調べる処理を行う。細胞展開用基板１１の細胞検出領域（図６の部分を含む）が製造段階の寸法誤差または公差により水平面に対して傾斜している場合には、焦点距離が視野１〜４間で異なるために視野１以外の視野（図６では視野２〜４）では焦点距離Ａで非目的細胞が全く検出されない結果となる。このことは、視野１以外の他の視野２〜４も同様である。その場合、焦点位置調節手段が、例えば視野２，４で焦点距離Ｂ，Ｄを得て、視野１，２，４の焦点情報（焦点距離Ａ，Ｂ，およびＤ）から焦点距離を示す近似式を作成し、この近似式に基づいて残りの視野（図６の例では視野２，４の間にある視野３）における非目的細胞の焦点距離Ｃの情報を算出し、各視野での適正な焦点位置を設定する。この場合、後述する目的細胞探索手段が、視野別に算出・設定された適正な焦点位置の情報を参照し、目的細胞探索手段が各視野の適正な焦点位置を基準にして各視野について目的細胞を探索することが望ましい。

なお、非目的細胞の検出の有無を確認処理する視野の順序は限定されず、ユーザーが細胞展開用基板の全体を網羅するように焦点を合わせる視野の順序を設定して（例えば、図１０に示したように、細胞展開用基板の細胞検出領域の全体を網羅するように視野のポイントＡ→Ｂ→Ｃ、Ｃ→Ｉ→Ｇを設定して）、近似式を作成するための焦点情報を得ることとしてもよい。細胞展開用基板の全体を網羅するように確認する視野の順序を設定すれば、細胞展開用基板が部分的に歪んでいてもその歪みが発見されやすくなる。また、細胞展開用基板が歪んでいる等の場合に、上記近似式を作成するための焦点情報は２以上であればよく、３つの焦点情報に基づく場合に限られない。また、焦点情報を得る視野は、同一の視野位置でさえなければ、撮像漏れのないよう視野の一部が互いに重複していてもよい。

近似式から算出した焦点情報を設定する視野は、焦点距離を調べた視野間に存在することが望ましく、設定する視野の数は２以上であってもよい。この他にも、例えば、細胞展開用基板が樹脂製であり、細胞検出領域が曲面状に歪んでいる場合等、多次曲線等の他の近似線により近似できる場合には、その近似式に基づいて上記同様に焦点距離を算出して設定してもよい。

（目的細胞探索手段）
目的細胞探索手段は、前記照射光学系により第１蛍光色素の励起光で前記細胞検出領域に展開された細胞を照射しつつ、前記焦点位置調節手段で合わせた焦点の位置を基準として、受光光学系で第１の蛍光を発している目的細胞を探索する処理を行う手段である。ここで、「基準とする」とは、焦点位置調節手段で得られた焦点位置をそのまま保持して用いてもよいし、焦点位置補正手段により補正された後の焦点位置を用いてもよいが、少なくとも目的細胞に焦点を合わせる（合わせ直す）ことで設定される焦点位置は用いない、ということを意味する。

「目的細胞を探索する処理」の例としては、受光光学系（例；顕微鏡）で得られる情報をユーザーに対してモニター表示してもよいし、ユーザーに顕微鏡で目視観察するよう動作を促すこととしてもよいし、全視野について（連続的にまたは一体的に）画像撮影処理してもよい。さらに、撮像した画像中の各ピクセルについて、目的細胞を撮像した場合に得られる基準のピクセル情報（輝度、色彩）と比較演算して目的細胞を検出するように処理をしてもよい。「目的細胞を探索する処理」は、複数の視野を処理する場合、１視野ごとに連続して行われることが好ましい。

目的細胞探索手段としての実行されているプログラム２４が、受光光学系７の焦点を非目的細胞に合わせた状態で、第１の蛍光色素の励起光を照射して細胞展開用基板上を走査していくとともに、第１の蛍光を発している目的細胞を探索する処理を行う。ここで、例えば目的細胞が検出された場合には、目的細胞探索手段は、その旨を表示部に表示する処理を行うこととしてもよい。

目的細胞探索手段は、さらに、前記焦点位置調節手段により受光光学系７の焦点を合わせた直後に、受光光学系７を第２の蛍光を受光可能な状態にして前記細胞検出領域を撮像する第２細胞画像取得手段、および／または、受光光学系７を第３Ａもしくは第３Ｂの蛍光を受光可能な状態にして前記細胞検出領域を撮像する第３細胞画像取得手段と、受光光学系７を第１の蛍光を受光可能な状態にして前記細胞検出領域を撮像する第１細胞画像取得手段と、前記第１細胞画像取得手段と前記第２細胞画像取得手段で撮像した各画像を重ね合わせて合成する処理を行う画像形成手段とを有していてもよい。

図１に示した例の場合、目的細胞探索手段としてのプログラム２４は、蛍光フィルター１９を交換して、受光光学系７を第２の蛍光を受光可能な状態にした上で、細胞展開用基板１１上に第２の蛍光色素の励起光を照射するとともに、前述したように細胞展開用基板１１上の細胞検出領域ＣＤＲを撮像する処理を行う第２画像取得手段、さらに、上記同様に、受光光学系７を第１の蛍光を受光可能な状態とし、第１の蛍光色素の励起光により前述と同様に細胞検出領域の撮像を行う第１細胞画像取得手段、さらに各撮像で得られた画像を合成する画像形成手段を有する。ここでの合成とは、例えば目的細胞と非目的細胞とに由来する蛍光輝点が一つの画像内に同時に表示されるように細胞画像を合成する処理を行う。なお、第２の蛍光色素の代わりに第３Ａの蛍光色素、第３Ｂの蛍光色素を用いる場合も同様である。

（焦点位置補正手段）
焦点位置補正手段は、受光光学系に設けられている光学フィルターを通過した後の光が、前記第２の蛍光または前記第３Ａもしくは第３Ｂの蛍光から前記第１の蛍光に変化することにより生じる焦点位置のズレ量を算出し、前記焦点位置調節手段で合わせた焦点の距離を補正する手段である。

同じ受光光学系であっても受光する蛍光の波長が変わると屈折率が変化するため、波長ごとに焦点位置が変わる色収差が生じる。そのため、受光光学系で受光している光が、目的細胞の標識に用いられる第１蛍光色素から発する第１の蛍光、非目的細胞の標識に用いられる第２蛍光色素から発する第２の蛍光、目的細胞および非目的細胞の標識に用いられる第３蛍光色素から発する第３Ａの蛍光または第３Ｂの蛍光の間で変化して受光する蛍光の波長が変化すると、非目的細胞に合わされている受光光学系の焦点の位置がズレてしまう。したがって、焦点位置補正手段は、この焦点位置のズレ量を公知の焦点距離の算出式に基づき算出し、次に使用する蛍光の波長に合わせてあらかじめ上記焦点位置のズレ量を解消するように焦点位置を調節する処理を行う。この調節する処理としては、細胞展開用基板とともに対象物をズレた後の焦点位置に移動させる処理か、受光光学系のレンズの位置を移動させて受光光学系の焦点位置を非目的細胞に合わせる処理を行う。

《目的細胞の検出方法》
本発明に係る目的細胞の検出方法は、以下の、細胞展開工程と、第１蛍光標識処理工程と、蛍光標識工程（第２蛍光標識処理工程および／または第３蛍光標識処理工）と、を順不同で含む目的細胞の検出方法であって、焦点位置調節工程と、目的細胞探索工程とを含むことを特徴としている（図７参照）。また、任意に後述する焦点位置補正工程を含んでいてもよい。

以下、本発明に係る目的細胞の検出方法を前述の目的細胞検出システム１００により行う例を含めて工程別に説明する。

〔細胞展開工程〕
細胞展開工程は、検出しようとしている目的細胞が非目的細胞より少ない数で含まれる細胞懸濁液を、少なくとも細胞検出領域は細胞展開用基板の表面に展開し、該細胞検出領域に単層の細胞層を形成する工程であり、蛍光標識工程の第１蛍光標識処理工程、第２蛍光標識処理工程または第３蛍光標識処理工程と順不同で行われる（図７参照）。

図８（Ａ），（Ｂ）に示す細胞展開用工程の２つの具体例を示す。
（細胞懸濁液の送液・展開：ステップ１Ａ−１）
ステップ１Ａ−１では、制御手段８からの動作命令またはユーザーの操作により送液系機構９（図１参照）が操作されて、試薬収容器１３の一の容器に格納されている細胞懸濁液ＣＬを吸い上げた後、細胞展開用基板１１（または１１ａ）に細胞懸濁液ＣＬを送液して細胞検出領域ＣＤＲ内に細胞懸濁液ＣＬを展開する処理を行う。ここで細胞検出領域ＣＤＲに細胞群が収まらない場合には、任意に、等張液（ＰＢＳ等）を後記の所定の送液により、細胞検出領域ＣＤＲ内に細胞を移動させる処理を行う。この処理は、細胞展開用基板の細胞検出領域ＣＤＲの表面が、細胞を格納するためのマイクロチャンバー５または凹凸を有している場合には、マイクロチャンバー５内または凹部内へ細胞を移動させる処理としてもよい。

上記所定の送液としては、細胞展開用基板１１へ等張液を間欠的に送液して細胞を細胞検出領域内に移動させる方法（例；１〜５０μＬの送液後、５〜１５秒の送液停止を１セットとしてこのセットを繰り返す送液方法）、送液系機構の送液方向を所定間隔で反転して細胞を細胞検出領域内に移動させる方法、細胞展開用基板１１を物理的に（図１において）右下がりまたは左下がりに傾斜させて細胞を細胞検出領域内に移動させる方法、細胞展開用基板１１上の細胞懸濁液ＣＬの一部を例えば下流から上流（または下流から上流）に還流させて細胞を細胞検出領域内に移動させる方法（例；流出口３からリザーバー４に溜まった、細胞が存在しない上澄液を流入口２へ一部還流させて細胞を細胞検出領域内に移動させる方法）、細胞展開用基板１１に遠心力を与えて細胞を細胞検出領域内に移動させる方法、さらにはこれらを組み合わせた方法、等が挙げられる。なお、所定の送液における送液量、停止時間等の各種送液条件は、細胞の位置や移動量などを考慮して任意に変更することができる。

（細胞懸濁液の送液・展開：ステップ１Ａ−１（図８（Ｂ））
ステップ１Ｂ−１では、制御手段８からの動作命令またはユーザーの操作により送液系機構９（図１参照）が操作されて、試薬収容器１３の一の容器に格納されている細胞懸濁液ＣＬを吸い上げた後、細胞展開用基板１１ｂの上方から細胞懸濁液ＣＬを滴下して細胞検出領域ＣＤＲ内に細胞懸濁液ＣＬを展開する処理を行う。

（液流による細胞の単層化；ステップ１Ａ−２（図８（Ａ）））
ステップ１Ａ−２では、図２（Ａ）〜（Ｃ）に示すように、細胞展開手段またはユーザーが送液系機構の送液を制御し、細胞を単層化させるための液流を発生させて細胞を単層化する処理を行う。ユーザー自身が送液する場合、送液系機構（この場合はピペット等）による送液の程度が機械的に制御されて、展開された細胞層を単層化させるための液流が発生するように構成されていてもよい。液流により単層化させるのは、細胞展開用基板１１の細胞検出領域の表面が、細胞を格納するためのマイクロチャンバー５または凹凸を有している場合に、細胞用スクレーパー１４等で凹部内またはマイクロチャンバー５内で積層された細胞を単層化することは困難であるためである。

（細胞用スクレーパーによる単層化；ステップ１Ｂ−２（図８（Ｂ）））
ステップ１Ｂ−２では、細胞用スクレーパー１４で細胞の単層化を行う。細胞展開手段が、図４に示すように細胞用スクレーパー１４の動作を制御して、細胞展開用基板１１の表面に沿って細胞用スクレーパー１４を平行移動させることにより、細胞展開用基板１１の表面に展開された２層以上の細胞層を単層化させる処理を行う。

（細胞の単層化の確認；ステップ１Ａ−３，１Ｂ−３（図８（Ａ）、（Ｂ））
その後、ステップ１Ａ−３，１Ｂ−３において、細胞が単層化されたか否かの確認を行う。細胞の単層化がなされておりＹｅｓの場合には次ステップに遷移し、細胞が単層化されていないＮｏの場合にはステップ１Ａ−２、ステップ１Ｂ−２に戻り、再び細胞の単層化処理が行われる。細胞が単層化されていることは、例えば、明視野での観察または蛍光観察において、非目的細胞の重なりが実質的に見られない（許容される水準の重なりに留まる）ことによって確認することができる。この確認は、プログラムにより上記観察により得られるリアルタイム画像において非目的細胞の重なりが実質的に見られるか否かを自動判別する処理をすることとしてもよい。

（蛍光標識処理の確認；ステップ１Ａ−４，１Ｂ−４（図８（Ａ），（Ｂ））
ステップ１Ａ−４，１Ｂ−４では、蛍光体標識処理が行われているか否かが確認され、蛍光体標識処理が行われておりＹｅｓの場合は、細胞展開工程を行ったことを記憶手段に記録等して、焦点位置調節工程に処理が遷移し、蛍光体標識処理が行われておらずＮｏの場合には蛍光標識処理工程に遷移する。

〔蛍光標識処理工程〕
蛍光標識処理工程は、（１）目的細胞に特異的に結合する抗体と第１蛍光色素との複合体である第１蛍光標識体を用いて、前記細胞懸濁液ＣＬ中の細胞または前記展開後の細胞群を蛍光染色する第１蛍光標識処理工程と、（２）前記非目的細胞に特異的に結合する抗体と第２蛍光色素との複合体である第２蛍光標識体を用いて、前記細胞懸濁液ＣＬ中の細胞または前記展開後の細胞群を蛍光染色する第２蛍光標識処理工程と、（３）前記目的細胞と前記非目的細胞の両方に結合する第３Ａ蛍光色素である、もしくは前記目的細胞と前記非目的細胞の両方に結合する抗体と第３Ｂ蛍光色素との複合体である、第３蛍光標識体を用いて、前記細胞懸濁液ＣＬ中の細胞または前記展開後の細胞群を蛍光染色する第３蛍光標識処理工程とから少なくとも構成される。なお、第１〜第３Ｂ蛍光標識体の詳細については前述した通りであるため、その説明を省略する。

図９に蛍光標識処理工程の一例を示す。
（細胞懸濁液の展開の確認；ステップ２Ａ−１（図９））
この図９の例では、先ず、ステップ２Ａ−１において、細胞懸濁液ＣＬが既に展開されているか否かを判断される。細胞懸濁液ＣＬが展開されておりＹｅｓの場合はステップ２Ａ−２に進み、細胞懸濁液ＣＬが展開されておらずＮｏの場合はステップ２Ａ−５に進む。

（遮光処理；ステップ２Ａ−２）
ステップ２Ａ−２では、蛍光標識処理が行われる細胞展開用基板１１（または１１ａ，１１ｂ）を含む細胞回収デバイス１０の全体を遮光する遮光処理がなされる。例えば、制御手段８により、細胞展開用基板１１の全体を覆う遮光ボックスの開口部を閉じる動作がなされる。

（蛍光標識体混合液の送液処理；ステップ２Ａ−３）
ステップ２Ａ−３では、目的細胞に特異的に結合する第１蛍光色素標識体（ＦＬ１）、非目的細胞のみに特異的に結合する第２蛍光標識体（ＦＬ２）及び／又は目的細胞と非目的細胞の両方に結合する核染色試薬で例示される第３Ａ蛍光色素（ＦＬ３Ａ）もしくは第３Ｂ蛍光標識体（ＦＬ３Ｂ）を含む混合液を遮光した細胞展開用基板１１に送液する。ここで、各蛍光標識体等を混合液とせずに個別に順不同で送液してもよい（第１〜第３標識処理工程を順不同で個別に行ってもよい）が、蛍光色素の褪色を極力低減させる観点から、混合液として同時に送液することが好ましい。

（結合反応；ステップ２Ａ−４）
最後にステップ２Ａ−４にて結合反応が行われ、この結合反応により第１蛍光標識体を目的細胞に結合させるとともに、第２蛍光標識体または第３Ａ蛍光色素もしくは第３Ｂ蛍光色素標識体を非目的細胞等に結合させる。結合反応としては、例えば、室温暗所で２０分〜４０分程度の反応を行う例が挙げられる。その後、焦点位置調節工程に遷移する。

（蛍光標識体の送液処理；ステップ２Ａ−５）
一方、細胞懸濁液ＣＬが細胞展開用基板１１上に展開されていない場合には、ステップ２Ａ−５において、第１蛍光色素標識体と、第２蛍光標識体，第３Ａ色素及び／又は第３Ｂ蛍光標識体とを遮光されている細胞懸濁液ＣＬに混合し、次ステップに移動する。

（結合反応；ステップ２Ａ−６）
ステップ２Ａ−６では、ステップ２Ａ−５の混合を行った状態のまま、所定温度および時間において結合反応（例；室温暗所で２０分〜４０分程度）を行った後、細胞展開工程に遷移する。

〔焦点位置調節工程〕
焦点位置調節工程は、第２蛍光色素または第３Ａもしくは第３Ｂ蛍光色素の励起光で前記細胞検出領域に展開された細胞群を照射し、第２の蛍光または第３Ａもしくは第３Ｂの蛍光を発している非目的細胞に受光光学系の焦点を合わせる処理を行う工程である。

焦点位置調節工程は、以下の工程、すなわち、前記細胞検出領域の異なる位置における２つ以上の視野のそれぞれで、非目的細胞に焦点を合わせて各視野の焦点距離の情報を得ることによって行い、これら焦点距離が相違する場合、その差分から、前記２つ以上の視野以外の他の視野における焦点距離の変化を表す近似式を求め、当該他の視野においては、それぞれの焦点距離を前記近似式から算出して、この算出された焦点距離に受光光学系の焦点距離を設定する工程を含んでいてもよい。

例えば図１０に示すように、細胞検出領域を区画して得られる視野１〜１００が存在し、視野のスポットＡ〜Ｃの焦点情報が５０３００μｍ、５０６００μｍ、５１２００μｍである場合に、これら焦点情報から線形近似式を作成し、該近似式から視野Ａ〜Ｃ間にある視野（Ａ−Ｂ間のマス目とＢ−Ｃ間のマス目）について焦点情報を算出する例が挙げられる。同様に視野Ｃ〜Ｅ、Ｅ〜Ｇ、Ａ〜Ｇ・・・等の焦点情報から線形近似式を作成し、同様に焦点情報を算出して取得することができる。細胞展開用基板１１の歪みが一様でない場合もあるため、図１０に示した細胞検出領域全体を網羅するように（例えば視野のスポットＡ〜Ｃ、Ｃ〜Ｅ、Ｅ〜Ｇ、Ｇ〜Ｃ、Ｈ〜Ｄの各セットでそれぞれ近似式を作成してスポット間に存在する視野について近似式から焦点距離を算出して焦点距離を設定というように）、あらかじめ視野別に焦点距離を設定しておくことが望ましい。ここで、近似式から算出して焦点距離を設定した視野について、非目的細胞が検出されるか否かを確認する工程を含んでもよい。

図１１に焦点位置調節工程の一例を示す。以下、図１１を参照しつつ、細胞展開用基板１１に歪みがなく、細胞検出領域全域で非目的細胞が確認できる基板を焦点位置調節工程に供した場合の流れについて説明する。
なお、非目的細胞の検出の有無を検査する視野数は全部で「５」であり、リスト配列には、第１配列として視野Ａ〜Ｃ、第２配列として視野Ｃ〜Ｇとその座標（ｘ、ｙ）が含まれ（図１０参照）、カウンタ（ｍ）は初期化された状態で「０」であるとする。

（リスト配列の情報の読み込み；ステップ３Ａ−１）
先ず、ステップ３Ａ−１では、目的細胞検出システム１００が、非目的細胞に焦点を合せることが可能か否かを調べる視野の情報をリスト（下記表５参照）として読み込む。

なお、処理の順番は配列の若い要素から行われるものとする。

（合焦点処理；ステップ３Ａ−２）
次に、ステップ３Ａ−２では、読み込んだ情報から照射光学系と受光光学系の走査する最初の視野が選択され、走査が当該視野に移動した後、第２蛍光色素及び／又は第３Ａ蛍光色素もしくは第３Ｂ蛍光色素の励起光で細胞群を照射した状態で非目的細胞に焦点を合わせる処理（合焦点処理）を行う。図１１の具体例では、視野Ａ（０，０）が選択され、視野Ａ（０，０）で合焦点処理が行われる。

（焦点情報、視野ｎの情報の取得；ステップ３Ａ−３）
次に、ステップ３Ａ−３では、当該視野における焦点情報、視野情報を取得する。具体例では、視野Ａの非目的細胞の焦点距離（焦点距離Ａ）＝５００００μｍを取得する。

（使用する焦点距離の設定；ステップ３Ａ−４）
次に、ステップ３Ａ−４では、他の視野で使用する焦点距離として、ステップ３Ａ−３で得られた焦点距離を設定する。具体例では、使用する焦点距離＝焦点距離Ａに設定する。さらに、一時的なカウンタ（ｍ）を１増加する。

（近似式作成の要否判断；ステップ３Ａ−５）
次に、カウンタ（ｍ）が配列要素数以上であるか確認し、近似式が作成されているか否かを確認する。具体例では、視野配列［０］［］の配列要素数が３であり、カウンタ（ｍ）＝１であるので条件を満たさずＮｏとなって次ステップに移動する。

（次の所定視野へ移動；ステップ３Ａ−６）
ステップ３Ａ−６では、測定すべき次の視野の情報を得て各光学系の走査が移動する。具体例では、視野Ｂ（０，２）が選択され、照射光学系と受光光学系の走査が視野Ｂ（０，２）に移動する。

（別視野での非目的細胞の検出；ステップ３Ａ−７）
次に、ステップ３Ａ−７では、上記「使用する焦点距離」にて非目的細胞を検出できるか判断する。具体例では、視野（０，２）において、視野（０，０）で設定した焦点距離Ａにて非目的細胞が検出されるか否か判断される。ここで、細胞展開用基板１１には歪みがないため焦点距離Ａにて非目的細胞が検出されＹｅｓと判断されて、次のステップに移動する。

（走査状況の確認；ステップ３Ａ−８）
ステップ３Ａ−８では、配列内の全ての視野を走査したか判断される。具体例では、視野配列［０］［］に含まれる視野（視野Ａ〜Ｃ）のうち、２つの視野（視野Ａ（０，０）と視野Ｂ（０，２））しか調べていないため、Ｎｏと判断されて前のステップ３Ａ−６へ戻ることになる。

（次の所定視野へ移動〜別視野での非目的細胞の検出；ステップ３Ａ−６〜７）
そして、調べていない視野Ｃ（０，４）へ移動して視野Ｃ（０，４）において非目的細胞が検出されるか否かが確認される。上述したように細胞展開用基板１１には歪みがないので視野Ｃ（０，４）でも非目的細胞が確認される。

（走査状況の確認；ステップ３Ａ−８）
ステップ３Ａ−８で、リスト（上記表のリスト）内の配列の全てが調べられたか判断され、調べていなければ、元に戻り次の配列も同様に処理する。具体例では、視野配列［０］［］の要素の全て（視野Ａ〜Ｃ）について非目的細胞に焦点を合わせられるか確認されたので、次の目的細胞探索工程に移行することになる。したがって、細胞展開用基板に歪みがない場合には、近似式が作成されずに次の目的細胞探索工程に遷移することになる。

以下、図１１を参照しつつ、上記例と異なり細胞展開用基板１１に歪みがある基板を焦点位置調節工程に供した場合の流れについて説明する（図１１）。なお、カウンタ（ｍ）等の初期条件は前述の場合と同一であるとする。

（配列のリスト情報の読み込み；ステップ３Ａ−１）
先ず、ステップ３Ａ−１では、目的細胞の焦点合わせが可能か否かを調べる視野の情報を含む視野配列（上記表５参照）が読みこまれる。

（焦点情報、視野ｎの情報の取得；ステップ３Ａ−３）
次に、当該視野Ａにおける焦点情報、視野情報を取得する。具体例では、視野Ａの非目的細胞の焦点距離を取得し、視野Ａでの焦点距離（焦点距離Ａ）５００００μｍを取得する。

（近似式作成の要否判断；ステップ３Ａ−５）
次に、ｍが配列要素数以上であるか判断し、近似式が作成されているか否かを確認する。ここでは、視野配列［０］［］の配列要素数が３であり、ｍ＝１であるので条件を満たさずＮｏとなって次ステップに移動する。

（別視野での非目的細胞の検出；ステップ３Ａ−７）
次に、上記「使用する焦点距離」にて非目的細胞を検出できるか判断する。具体例では、視野Ｂ（０，２）において、視野Ａ（０，０）で設定した焦点距離Ａにて非目的細胞を検出するか否か判断される。具体例では、細胞展開用基板１１には歪みがあるため焦点距離Ａで非目的細胞が検出されず、Ｎｏと判断されて、ステップ３Ａ−２の合焦点処理に戻る。

（合焦点処理；ステップ３Ａ−２）
次に、ステップ３Ａ−２では、ステップ３Ａ−７で非目的細胞が検出されなかった当該視野Ｂ（０，２）において非目的細胞に焦点が合わせる処理がなされる。

（焦点情報、視野ｎの情報の取得；ステップ３Ａ−３）
次に、ステップ３Ａ−３では、当該視野における焦点情報、視野情報を取得する。具体例では、視野Ｂの非目的細胞の焦点距離（焦点距離Ｂ）＝５０４００μｍを取得する。

（使用する焦点距離の設定；ステップ３Ａ−４）
次に、ステップ３Ａ−４では、他の視野で使用する焦点距離として、ステップ３Ａ−３で得られた焦点距離Ｂを設定する。具体例では、使用する焦点距離＝焦点距離Ｂに設定する。さらに、一時的なカウンタ（ｍ）を１増加し、ｍ＝２となる。

（近似式作成の要否判断；ステップ３Ａ−５）
次に、ｍが配列要素数以上であるか判断し、近似式が作成されているか否かを確認する。ここでは、視野配列［０］［］の配列要素数が３であり、ｍ＝２であるので条件を満たさずNoとなって次ステップに移動する。

（次の所定視野へ移動；ステップ３Ａ−６）
ステップ３Ａ−６では、測定すべき次の視野の情報を得て各光学系の走査が移動する。具体例では、視野Ｃ（０，４）が選択され、照射光学系と受光光学系の走査が視野Ｃ（０，４）に移動する。

（別視野での非目的細胞の検出；ステップ３Ａ−７）
次に、上記「使用する焦点距離」にて非目的細胞を検出できるか判断する。具体例では、視野Ｃ（０，４）において、視野Ｂ（０，２）で設定した焦点距離Ｂにて非目的細胞を検出するか否か判断される。具体例では、細胞展開用基板１１には歪みがあるため焦点距離Ｂで非目的細胞が検出されず、Ｎｏと判断されて、ステップ３Ａ−２の合焦点処理に戻る。

（合焦点処理；ステップ３Ａ−２）
次に、ステップ３Ａ−２では、ステップ３Ａ−７で非目的細胞が検出されなかった当該視野Ｃ（０，４）において非目的細胞に焦点が合わせる処理がなされる。

（焦点情報、視野ｎの情報の取得；ステップ３Ａ−３）
次に、ステップ３Ａ−３では、当該視野における焦点情報、視野情報を取得する。具体例では、視野Ｃの非目的細胞の焦点距離（焦点距離Ｃ）＝５０８００μｍを取得する。

（使用する焦点距離の設定；ステップ３Ａ−４）
次に、ステップ３Ａ−４では、他の視野で使用する焦点距離として、ステップ３Ａ−３で得られた焦点距離を設定する。具体例では、使用する焦点距離＝焦点距離Ｃに設定する。さらに、一時的なカウンタ（ｍ）を１増加し、ｍ＝３となる。

（近似式作成の要否判断；ステップ３Ａ−５）
次に、ステップ３Ａ−５では、ｍが配列要素以上であるか判断し、近似式が作成されているか否かを確認する。ここでは、視野配列［０］［］の配列要素が３であり、ｍ＝３であるので条件を満たしＹｅｓと判断されて、次ステップ３Ａ−１０に移動する。

（近似式作成、焦点距離の算出、設定；ステップ３Ａ−１０〜１１）
ステップ３Ａ−１０では、収集した複数の点の焦点距離の情報（不図示）から線形近似式を作成し、焦点距離を調べた視野間にある別の視野についての焦点距離をそれぞれ算出する。具体例では、収集した視野Ａ〜Ｃの焦点距離の情報（５００００μｍ，５０４００μｍ、５０８００μｍ）から線形近似式：焦点距離ｆ（ｙ）=200ｙ+ 50000を作成し、焦点距離を調べた視野間にある別の視野（視野（０，１）、視野（０，３））についての焦点距離（５０２００μｍ、５０６００μｍ）をそれぞれ設定する。そして、ステップ３Ａ−１１にて、算出した焦点距離（５０２００μｍ、５０６００μｍ）がそれぞれ各視野（０，１）、視野（０，３）に設定される。

次に、上記表５のリスト内のすべての配列を走査したか判断される。視野配列［１］［］については調べていないため、その配列の各視野について同様に調べられ、（場合によっては近似式が作成されて）、その後、目的細胞探索工程に移行する。

〔焦点位置補正工程〕
焦点位置補正工程は、受光光学系に設けられている蛍光フィルターを通過した後の光が、前記第２の蛍光または前記第３Ａもしくは第３Ｂの蛍光から前記第１の蛍光に変化することにより生じる焦点位置のズレ量を算出し、前記焦点位置調節工程で合わせた焦点位置を補正する工程であり、前記焦点位置調節工程と後記目的細胞探索工程との間に必要に応じて行われる。

レンズ１枚の光学系の場合、焦点距離は、式１／ｆ＝（ｎ_c−１）（１／ｒ₁−１／ｒ₂）で表される。ここで、ｒ₁はレンズの一方の面の曲率、ｒ₂はレンズの他方の面の曲率、ｎ_cはレンズの屈折率である。さらに、合成焦点距離は、１／ｆ合成＝１／ｆ₁＋１／ｆ₂−ｄ／ｆ₁ｆ₂で表される。ここで、ｄは1枚目のレンズの第2主点と2枚目のレンズの第1主点の間の距離である。

受光光学系の接眼レンズと対物レンズの各レンズの曲率は一定であるので、接眼レンズと対物レンズとの主点間距離を変えずに、受光光学系を通過する蛍光の波長のみを変えた場合には、その受光光学系の焦点位置が変わる。例えば、レンズを通過する光が赤系の蛍光色素から青系の蛍光色素に変わった場合、青系の蛍光の方が強く屈折するため、レンズの屈折率が変わり受光光学系の焦点距離が短くなる。レンズが複数枚となった場合も同様に色収差が発生する。そのため、焦点を合わせるには、光軸上にある観察対象の位置を変更して、変化してしまった後の受光光学系の焦点位置に移動させるか、焦点位置の変化量を相殺するように受光光学系のレンズの主点間距離を変更する必要がある。

本発明においては、焦点距離調節工程から目的細胞探索工程に遷移するときに、受光光学系で受光する光が、第２の蛍光（または第３Ａの蛍光もしくは第３Ｂの蛍光）から第１の蛍光に切り替わるので、上述したように受光光学系の焦点距離が変わり（増減してしまい）焦点位置がズレてしまう。そのため、第１の蛍光で焦点を合わせるためには、光軸上にある観察対象（細胞群）の位置を変更して、変化してしまった受光光学系の焦点位置まで移動させるか、焦点距離の変化分（増分、減分）を相殺するように受光光学系のレンズの主点間距離を変更する処理をする必要がある。そのため、これらのうち、いずれかの処理を両工程の間に行っておくことで、受光光学系で受光する蛍光が上述のように切り替ったとしても、目的細胞を検出可能な状態（目的細胞に焦点が合った状態）が確保されることになる。

〔目的細胞探索工程〕
目的細胞探索工程は、第１蛍光色素の励起光で前記細胞検出領域に展開された細胞群を照射しつつ、前記焦点位置調節工程で合わせた焦点位置を基準として、第１の蛍光を発している目的細胞を探索する工程である。

目的細胞探索工程として、例えば、受光光学系７を第１の蛍光を受光可能な状態とし、焦点位置調整工程で設定した焦点位置を基準として（目的細胞を検出可能な状態(目的細胞に焦点が合った状態）で)、細胞検出領域の各視野について目的細胞を探索して目的細胞の輝点を検出して目的細胞の数を計測するか、または、細胞検出領域全域または各視野について後述するように各細胞画像（第１細胞画像等）を取得して画像の各ピクセルについて第１の蛍光の色彩であるか否かを判断することにより、目的細胞の存在の有無について判断し、目的細胞の数を計測する例が挙げられる。

（細胞画像取得工程）
細胞画像を取得する後者の場合、目的細胞探索工程は、前記焦点位置調節工程の直後に、下記の細胞画像取得工程（少なくとも第１細胞画像取得工程）と画像形成工程等とをさらに含む。

図１２に細胞画像取得工程の一例を示す。この細胞画像取得工程は、下記の第１細胞画像取得工程および／または、第２細胞画像取得工程もしくは第３細胞画像取得工程で構成されている。

第２細胞画像取得工程（ステップ４Ａ−１）は、受光光学系７を第２の蛍光を受光可能な状態にして前記細胞検出領域を撮像する工程であり、第２蛍光標識処理工程が行われた場合に実行される。ここで、細胞展開用基板１１（または１１ａ）に歪みがあること等の事情により、視野ごとに焦点距離が異なり、前述の焦点位置調節工程で視野ごとに焦点距離が設定されている場合には、その視野、焦点距離ごとに第２細胞画像が取得される。

第３細胞画像取得工程（ステップ４Ａ−２）は、受光光学系７を第３Ａ及び／又は第３Ｂの蛍光を受光可能な状態にして前記細胞検出領域を撮像する工程であり、第３蛍光標識処理工程が行われた場合に実行される。ここで、細胞展開用基板１１に歪みがあること等の事情により、視野ごとに焦点距離が異なり、前述の焦点位置調節工程で視野ごとに焦点距離が設定されている場合には、同様に、その視野、焦点距離ごとに第３細胞画像が取得される。

第１細胞画像取得工程は、受光光学系７を第１の蛍光を受光可能な状態にして前記細胞検出領域を撮像する工程である。この工程では、前述したように、焦点位置調節工程にて非目的細胞に合わせた焦点位置で細胞画像の取得がなされる。ここで、細胞展開用基板１１に歪みがあること等の事情により、視野ごとに焦点距離が異なり、前述の焦点位置調節工程で視野ごとに焦点距離が設定されている場合には、設定されている各焦点距離にて第１細胞画像が取得される。

画像形成工程は、第１細胞画像取得工程、第２細胞画像取得工程および／または第３細胞画像取得工程で撮像した各画像を重ね合わせて合成する処理をする工程である。

画像合成は、画像を重ねる際に目印となる基点（例えば、細胞展開用基板１１の細胞検出領域内に設けられたマークであり、使用する可能性がある第１〜３Ｂ蛍光色素を含み、各種励起光で励起されたときに特定の形状（例えば星型）で発光するマーク等）を一致させた上で、第１細胞画像と第２、第３細胞画像とをピクセル単位で比較して、例えば比較したピクセルが同じ明るさのピクセル（例；背景として共通する黒い部分等）である場合は、両ピクセルの輝度平均を取ってその比較している位置の一のピクセルを形成する。また、比較したピクセルのうち、一方のピクセルが他方のピクセルよりも明らかに明るい場合については、明るいピクセルでもってその一のピクセル部分を形成する処理がなされる、といった例が考えられる。

〔解析工程〕
解析工程は、画像合成して得られる細胞画像、第１細胞画像、または第１蛍光で受光しているリアルタイム画像について、目的細胞を検出する工程である。具体的には、例えば、第１の蛍光を撮像したときに得られる目的細胞の色彩、輝度等、目的細胞を検出する際に判断基準となるピクセル情報を用いて、ピクセルごとに第１の蛍光のピクセルが存在するか調べ、目的細胞を検出する工程とする例が挙げられる。ここで、検出されたピクセルが隣接して連続している場合には、連続するピクセルにより構成される１つの島が１個の目的細胞として検出されることになる。

以下、本発明に係る目的細胞の検出方法および目的細胞検出システムによる作用・効果について図面を参照しながら説明する。
（１）前述した細胞展開工程、第１蛍光標識処理工程および第２（又は第３）蛍光標識処理工程を順不同で含む目的細胞の検出方法であって、第２蛍光色素または第３Ａもしくは第３Ｂ蛍光色素の励起光で前記細胞検出領域に展開された細胞群を照射し、第２の蛍光または第３Ａもしくは第３Ｂの蛍光を発している非目的細胞に受光光学系７の焦点を合わせる処理を行う焦点位置調節工程と、第１蛍光色素の励起光で前記細胞検出領域に展開された細胞群を照射しつつ、前記焦点位置調節工程で合わせた焦点位置を基準として、第１の蛍光を発している目的細胞を探索する目的細胞探索工程と、を含む。細胞展開用基板１１上では目的細胞と非目的細胞とがほぼ同じ高さ位置にあるため、非目的細胞に事前に焦点を合わせておくことにより、目的細胞に焦点を合わせなくとも目的細胞を検出可能な焦点位置の受光光学系の状態が得られる。そのため、目的細胞を標識している第１蛍光色素を励起して第１の蛍光で目的細胞に焦点を合わせる手間を省略することができる。したがって、目的細胞に焦点を合わせる作業に起因した第１蛍光色素の褪色を抑えることができる。目的細胞に焦点を合わせる手間が省略され、第１の蛍光色素の褪色が抑えることができる結果、目的細胞の検出率が向上し、検出までの時間も短縮することができる。

（２）前記目的細胞が、血液中の細胞の総数に対して０．０１％未満の含有率で前記血液に含まれる希少細胞であれば、血中にほとんど存在しない希少細胞をいち早く検出することができる。また、希少細胞に関連する疾病等の早期発見に資するデータの提供を達成することができる。

（３）前記焦点位置調節工程において焦点を合わせる際に用いられる第２の蛍光または第３Ａもしくは第３Ｂの蛍光の波長が、第１の蛍光の波長と重複しなければ、目的細胞のみが第１の蛍光を発するため、重複帯域をカットするための蛍光フィルターを使用しなくとも目的細胞を検出することができるようになり、目的細胞を標識している第１蛍光色素から発する本来の蛍光量を得ることができる。その結果、目的細胞を検出しやすくなる。

（４）前記目的細胞がＣＴＣであり、前記非目的細胞が白血球であり、前記第１蛍光標識体が、前記第１蛍光色素で標識された抗サイトケラチン抗体であり、前記第２蛍光標識体が、前記第２蛍光色素で標識された白血球を特異的に認識する抗体である、および／または、前記第３蛍光標識体が、細胞核に結合するヘキスト系蛍光色素であることとすれば、末梢血等のサンプル中にＣＴＣが含まれている場合、いち早くＣＴＣを検出することができ、また、ＣＴＣに関連する転移性のがんの早期発見に資するデータ提供が達成される。

（５）細胞展開用基板の細胞検出領域の表面が平面状であり、細胞展開工程では、細胞用スクレーパーを用いて該平面状の上記表面に展開された２層以上の細胞層を単層化させることとすれば、展開された細胞が単層化されて目的細胞と非目的細胞が同じ高さ位置に配置される結果、非目的細胞に焦点を合わせることで目的細胞を検出可能な焦点位置の受光光学系の状態が得られる（図４，１４参照）。

（６）細胞展開用基板の細胞検出領域の表面が、細胞を格納するためのマイクロチャンバーまたは凹凸を有しており、細胞展開工程で液流によって格納された細胞を単層化させるものであれば、マイクロチャンバー内または凹部内で局所的に積層されている細胞を取り除いて細胞を単層化させることができるとともに、細胞を格納していないマイクロチャンバーまたは凹部へと取り除いた細胞を配置させることができ、細胞展開用基板の全域に一様に単層の細胞層を形成することができる。この結果、マイクロチャンバー内または凹部内において非目的細胞に焦点を合わせることで、目的細胞を検出可能な焦点位置の受光光学系の状態が得られる（図２，１３参照）。

（７）前記焦点位置調節工程と前記目的細胞探索工程との間に、受光光学系に設けられている蛍光フィルターを通過した後の光が、前記第２の蛍光または前記第３Ａもしくは第３Ｂの蛍光から前記第１の蛍光に変化することにより生じる焦点位置のズレ量を算出し、前記焦点位置調節工程で合わせた焦点位置を補正する焦点位置補正工程をさらに含むこととすれば、受光光学系を通過する蛍光が切り替わって受光光学系の焦点位置が色収差により変わってしまっても補正がなされて、非目的細胞に焦点を合わせた状態（目的細胞を検出可能な焦点位置）が維持される。

（８）前記焦点位置調節工程の直後に、受光光学系を第２の蛍光を受光可能な状態にして前記細胞検出領域を撮像する第２細胞画像取得工程、および／または、前記受光光学系７を第３Ａもしくは第３Ｂの蛍光を受光可能な状態にして前記細胞検出領域を撮像する第３細胞画像取得工程をさらに含み、前記目的細胞探索工程として、受光光学系を第１の蛍光を受光可能な状態にして前記細胞検出領域を撮像する第１細胞画像取得工程、第２細胞画像取得工程および／または第３細胞画像取得工程と第１細胞画像取得工程で撮像した各画像を重ね合わせて合成する処理を含むこととすれば、非目的細胞と目的細胞とが同一画像内に表示される。したがって、目的細胞のみを細胞展開用基板からピックアップする場面において、非目的細胞を標識している蛍光色素を励起した状態で、前記合成した画像を参照しながら、細胞展開用基板における目的細胞の位置を簡単に把握することができる。その結果、目的細胞を標識している第１の蛍光色素を励起する時間を極力短くして短時間で目的細胞をピックアップすることができる。

（９）前記焦点位置調節工程を、前記細胞検出領域の異なる位置における２つ以上の視野のそれぞれで、非目的細胞に焦点を合わせて各視野の焦点距離の情報を得ることによって行い、これら焦点距離が相違する場合、その差分から、前記２つ以上の視野以外の他の視野における焦点距離の変化を表す近似式を求め、当該他の視野においては、それぞれの焦点距離を前記近似式から算出して、この算出された焦点距離に受光光学系の焦点距離を設定する工程を、前記焦点位置調節工程として行うこととすれば、仮に細胞展開用基板の表面が製造誤差等で傾斜しており、視野ごとに焦点距離がずれてしまうような場合であっても、全ての視野について非目的細胞に対して焦点を合わせる必要がなく、非目的細胞に焦点を合わせる手間を極力軽減させることができる。この結果、第２（または第３Ａもしくは第３Ｂ）蛍光色素の褪色を抑制することができる。
なお、本発明に係る目的細胞検出システムは、上述した（１）〜（９）の方法を手段として実行するシステムであるので、（１）〜（９）で説明した効果を奏する。

以下、目的細胞の検出方法の実施例および比較例について図面を参照しながら説明する。

＜細胞懸濁液の調製＞
末梢血から密度勾配遠心分離法により単離して得られた白血球をＰＢＳに対して懸濁し、白血球を所定濃度（＞１０⁶個／mL）で含む懸濁液Ａを調製した。次に、この懸濁液Ａに対して、がん細胞としてのＣＴＣ細胞を希少数（白血球数比１００００分の１）添加した（以下、懸濁液Ｂという）。次に、懸濁液Ｂに対して、細胞組織の固定処理、および後述の第１〜第３蛍光標識処理工程を行った。該工程を経て得られた懸濁液の白血球濃度を１０⁶個／ｍＬに調整し（希少細胞を１０個含む）、これを細胞懸濁液として後述の実施例等で用いた。

（細胞組織の固定処理）
上記懸濁液Ｂ（１ｍＬ）に、細胞・組織固定化剤としてのパラホルムアルデヒド（和光純薬工業社製）を４％になるように加えて緩やかに混和し、室温暗所にて１５分間反応させた。この反応液に、リン酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ）を十分量加えて混和し、遠心分離処理（（３００）×ｇ、（１）分）後、上澄みを捨てて細胞のみを回収し、再度ＰＢＳを十分量添加した。遠心分離処理からＰＢＳの添加までの洗浄処理を３回繰り返した。

（第１〜第３蛍光標識処理工程）
細胞膜透過処理用として０．１％Ｔｗｅｅｎを含むＰＢＳを１ｍＬ、およびがん細胞（目的細胞）を標識するためにＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７（第１蛍光色素）で標識した抗サイトケラチン抗体（抗ＣＫ抗体）（Micromet社製）（第１蛍光標識体）の溶液１０μＬと、白血球（非目的細胞）を標識するためにＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８（インビトロジェン社製）で標識した抗ＣＤ４５抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌоｇｙ社製）（第２蛍光標識体）の溶液１０μＬとを、細胞組織の固定処理で洗浄処理を行った上記細胞の懸濁液に添加して緩やかに混和しながら室温で３０分間反応させ、最後の５分間、細胞核染色用にHoechist（第３Ａ蛍光色素）（インビトロジェン社製）溶液１０μＬを添加して反応させた。

反応後、上記遠心分離処理を行い、細胞に結合していない第１，２蛍光標識体および第３Ａ蛍光色素を除去し、新たにＰＢＳを添加して再度懸濁させた。この後、遠心分離により細胞に結合していない抗体試薬を除去し、新たにリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を添加して再懸濁させた。

［実施例１］（マイクロチャンバー５上の細胞の検出）
流路天板（流路形成部材）１２とマイクロチャンバーチップ（細胞展開用基板）１１とを組みわせることで、流路１を有する細胞回収デバイス１０を作製した。なお、マイクロチャンバーチップ１１には、２０ｍｍ×５０ｍｍの細胞検出領域（ＣＤＲ）に２００００個のマイクロチャンバー５（チャンバー深さ５０μｍ，チャンバー径１００μφ）が形成されており、また、流路１の寸法を幅２５ｍｍ、長さ７０ｍｍ、高さ１０μｍに形成した。

次に、細胞回収デバイス１０の流入口２から流路１へブロッキング液（３％BSA含有ＰＢＳ）を高流量（１６ｍＬ／分）で送液した。その後、ＰＢＳを流路１へ送液することにより流路１内に存在するブロッキング剤を流路１の内部から除去した。その後、第１〜第３蛍光標識処理した細胞懸濁液ＣＬを０．１ｍＬ／分の流速にて１００μＬ流路１内へ送液した後、間欠送液（０．５μＬ送液後１０秒間送液停止）を１００回繰り返すことで、マイクロチャンバー５内に細胞を格納するとともに単層化した。その後、マイクロチャンバーチップ１１内の９か所で、白血球に結合したＣＤ４５抗体に結合している第２蛍光色素の励起光（波長４８８ｎｍの光）でもってマイクロチャンバー５に格納された細胞群を照射しつつ、非目的細胞に受光光学系７の焦点を合わせた。

その後、励起光をＣＴＣ検出用の光（波長６３５ｎｍの光）に切り替えるとともに、発光波長を受光可能にして、マイクロチャンバーチップ１１の細胞検出領域ＣＤＲの全面を撮影した（第１細胞画像を取得した）。
次に、前記励起光をＣＤ４５検出用の光（波長４８８ｎｍの光）に変更してＣＤＲ全面を撮影した（第２細胞画像を取得した）
次に、前記励起光を細胞核検出用の光（波長３５０〜３５２ｎｍの光）に変更してＣＤＲ全面を撮影した（第３細胞画像を取得した）。
最後に、明視野観察用の光（全波長）でＣＤＲ全面を撮影した。

なお、励起光の切替えに際して、各蛍光波長の差異に起因する色素収差の量（焦点位置のズレ量）を解消するように受光光学系７の焦点位置を調整した。判定の結果、検出開始から検出完了までの時間は５４分であり、がん細胞の検出率は９０％であった。なお、検出開始から検出完了までの時間とは、フォーカス調整の時間も含まれる。

［実施例２］（平面上に展開した細胞の検出）
実施例１のマイクロチャンバーチップ１１の代わりに２５ｍｍ×５０ｍｍの平面基板（細胞展開用基板）１１ｂを使用して、平面状の細胞展開用基板の表面に第１〜第３蛍光標識処理した上記細胞懸濁液１００μＬを滴下し、細胞用スクレーパー１４で細胞を単層化した。その後、細胞展開用基板上に存在するＨｏｅｃｈｓｔ染色された細胞群の細胞核をHoechst（第３Ａ蛍光色素）の励起光（波長４００ｎｍの光）で照射しつつ、撮像エリア（受光光学系の視野）ごとに該細胞群に含まれる一の細胞の細胞核に対して受光光学系７の焦点を合わせた。

次に、上記励起光をＣＴＣ検出用の光（波長６３５ｎｍの光）に切り替え、受光光学系について発光波長の光を受光可能に設定するとともに、受光光学系の焦点位置を励起波長４００ｎｍで合わせた焦点位置に対して光軸上で２０μｍ接近する位置に調節して、細胞展開用基板の細胞検出領域ＣＤＲの全面を撮影した（第１細胞画像を取得した）。

次に、上記励起光を白血球検出用の励起光（波長４８８ｎｍの光）に切り替えて、受光光学系について発光波長の光を受光可能に設定するとともに、受光光学系の焦点位置を励起波長４００ｎｍで合わせた焦点位置に対して光軸上で２０μｍ接近する位置に調節して、細胞展開用基板の細胞検出領域全面を撮影した（第２細胞画像を取得した）。
そして、演算処理により第１，２細胞画像を瞬時に合成して解析処理を行った。判定した結果、検出開始から検出完了までの時間は約６７分であり、がん細胞の検出率は８０％であった。

［比較例１］
実施例１と同様にブロッキング処理とＰＢＳによる洗浄とを行い、第１〜第３蛍光標識処理をした細胞懸濁液を流路１へ送液し、実施例１と同様に間欠送液により細胞の単層化を行った。

先ず、細胞展開用基板上の非目的細胞に明視野で焦点を合わせた後、励起光（波長４００ｎｍの光）で展開された細胞群を照射しつつ、Hoechst染色した細胞（＝Hoechst33242（第３Ａ色素）で染色した細胞群の一の細胞（非目的細胞））に焦点を合わせて細胞検出領域全域を撮像して第３細胞画像を取得した。

次に、上記励起光をＣＴＣ検出用の励起光（波長６３５ｎｍの光）に切り替えるとともに受光光学系について発光波長の光を受光可能に設定し、目的細胞に焦点を合わせて、細胞検出領域ＣＤＲの全域を撮像して第１細胞画像の撮像を行った。

最後に、上記励起光を白血球検出用の励起光（波長４８８ｎｍの光）に切り替えるとともに、受光光学系について発光波長の光を受光可能に設定し、白血球（非目的細胞）に焦点を合わせて細胞検出領域ＣＤＲの全域を撮像して第２細胞画像の撮像を行った。第１〜第３の細胞画像を演算処理にて瞬時に合成し、判定した結果、ＣＴＣ検出率は３０％であった。

［比較例２］
実施例１と同様にブロッキング処理とＰＢＳによる洗浄とを行い、第１〜第３蛍光標識処理をした細胞懸濁液を流路１へ送液し、実施例１と同様に細胞の単層化を行った。その後、細胞展開用基板上に設定した撮像エリア（受光光学系の視野）ごとに、以下の通りに撮像を行った。

先ず、励起光（波長４００ｎｍの光）で展開された細胞群を照射しつつ、Hoechst染色した細胞（＝Hoechst33342（第３Ａ色素）で染色した細胞群の一の細胞（非目的細胞））に焦点を合わせるとともに、受光光学系について発光波長の光を受光可能に設定し、第３細胞画像を取得した。

次に、上記励起光をＣＴＣ検出用の励起光（波長６３５ｎｍの光）に切り替えるとともに、受光光学系について発光波長の光を受光可能に設定し、目的細胞に焦点を合わせて第１細胞画像の撮像を行った。

最後に、上記励起光を白血球検出用の励起光（波長４８８ｎｍの光）に切り替えるとともに、受光光学系について発光波長の光を受光可能に設定し、白血球（非目的細胞）に焦点を合わせて第２細胞画像の撮像を行った。第１〜第３の細胞画像を演算処理にて瞬時に合成し、判定した結果、検出開始から検出完了までの時間は約１０６分であり、がん細胞の検出率は９０％であった。

以上、本発明に係る目的細胞の検出方法および目的細胞検出システムについて、図面を参照しながら実施の形態および実施例を説明してきたが、本発明はこれら実施の形態および実施例に限定されず、特許請求の範囲に記載されて本発明の要旨を逸脱しない限り、設計変更は許容される。

１流路
２流入口
３流出口
４リザーバー
５マイクロチャンバー
６照射光学系
７受光光学系
８制御手段
９送液系機構（細胞展開手段、第１〜３蛍光標識処理手段）
１０細胞回収デバイス
１１細胞展開用基板（マイクロチャンバーチップを含む）
１１ａ，１１ｂ細胞展開用基板
１２流路形成部材
１２ａシール部材
１３試薬収容器
１４細胞用スクレーパー
１５光源
１６レンズ
１７ダイクロイックミラー
１８対物レンズ
１９光学フィルター
２０照射用レンズ群
２１撮像部
２２解析部
２３プログラム（焦点位置調節手段）
２４プログラム（目的細胞探索手段）
２５プログラム（焦点距離情報補完手段）
２６細胞回収デバイスホルダー
１００目的細胞検出システム
ＣＬ細胞懸濁液
ＣＤＲ細胞検出領域

Claims

検出しようとしている目的細胞が非目的細胞より少ない数で含まれる細胞懸濁液を細胞展開用基板の表面に展開し、該表面に設けられた細胞を検出するための領域（細胞検出領域）に単層の細胞層を形成する細胞展開工程と、
前記目的細胞に特異的に結合する抗体と第１蛍光色素との複合体である第１蛍光標識体を用いて、前記細胞懸濁液中の細胞または前記展開後の細胞群を蛍光染色する第１蛍光標識処理工程と、
前記非目的細胞に特異的に結合する抗体と第２蛍光色素との複合体である第２蛍光標識体を用いて、前記細胞懸濁液中の細胞または前記展開後の細胞群を蛍光染色する第２蛍光標識処理工程、
および／または、
前記目的細胞と前記非目的細胞の両方に結合する第３Ａ蛍光色素である、もしくは前記目的細胞と前記非目的細胞の両方に結合する抗体と第３Ｂ蛍光色素との複合体である、第３蛍光標識体を用いて、前記細胞懸濁液中の細胞または前記展開後の細胞群を蛍光染色する第３蛍光標識処理工程と、
を順不同で含む目的細胞の検出方法であって、
第２蛍光色素または第３Ａもしくは第３Ｂ蛍光色素の励起光で前記細胞検出領域に展開された細胞群を照射し、第２の蛍光または第３Ａもしくは第３Ｂの蛍光を発している非目的細胞に受光光学系の焦点を合わせる処理を行う焦点位置調節工程と、
第１蛍光色素の励起光で前記細胞検出領域に展開された細胞群を照射しつつ、前記焦点位置調節工程で合わせた焦点位置を基準として、第１の蛍光を発している目的細胞を探索する目的細胞探索工程と、
を含むことを特徴とする目的細胞の検出方法。
前記目的細胞が、血液中の細胞の総数に対して０．０１％未満の含有率で前記血液に含まれる希少細胞である、請求項１に記載の目的細胞の検出方法。
前記焦点位置調節工程において焦点を合わせる際に用いられる前記第２の蛍光または前記第３Ａもしくは第３Ｂの蛍光の波長が、前記第１の蛍光の波長と重複しない、請求項１または２に記載の目的細胞の検出方法。
前記目的細胞がＣＴＣであり、
前記非目的細胞が白血球であり、
前記第１蛍光標識体が、前記第１蛍光色素で標識された抗サイトケラチン抗体であり、
前記第２蛍光標識体が、前記第２蛍光色素で標識された、白血球を特異的に認識する抗体である、および／または、前記第３蛍光標識体が、細胞核に結合するヘキスト系蛍光色素である、
請求項１〜３のいずれか一項に記載の目的細胞の検出方法。
前記細胞展開用基板の細胞検出領域の表面が平面状であり、
前記細胞展開工程では、細胞用スクレーパーを用いて該平面状の基板の表面に展開された２層以上の細胞層を単層化させる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の目的細胞の検出方法。
前記細胞展開用基板の細胞検出領域の表面が、細胞を格納するためのマイクロチャンバーまたは凹凸を有しており、
前記細胞展開工程では、液流によって細胞を単層化させる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の目的細胞の検出方法。
前記焦点位置調節工程と前記目的細胞探索工程との間に、
前記受光光学系に設けられている受光素子により受光する光が、前記第２の蛍光または前記第３Ａもしくは第３Ｂの蛍光から前記第１の蛍光に変化することにより生じる焦点位置のズレ量を算出し、前記焦点位置調節工程で合わせた焦点位置を補正する焦点位置補正工程をさらに含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の目的細胞の検出方法。
前記焦点位置調節工程の直後に、前記受光光学系を第２の蛍光を受光可能な状態にして前記細胞検出領域を撮像する第２細胞画像取得工程、および／または、前記受光光学系を第３Ａもしくは第３Ｂの蛍光を受光可能な状態にして前記細胞検出領域を撮像する第３細胞画像取得工程をさらに含み、
前記目的細胞探索工程として、
前記受光光学系を第１の蛍光を受光可能な状態にして前記細胞検出領域を撮像する第１細胞画像取得工程、
第２細胞画像取得工程および／または第３細胞画像取得工程と第１細胞画像取得工程で撮像した各画像を重ね合わせて合成する処理を含む画像形成工程と、
を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の目的細胞の検出方法。
前記焦点位置調節工程を、前記細胞検出領域の異なる位置における２つ以上の視野のそれぞれで、非目的細胞に焦点を合わせて各視野の焦点距離の情報を得ることによって行い、これら焦点距離が相違する場合、その差分から、前記２つ以上の視野以外の他の視野における焦点距離の変化を表す近似式を求め、
当該他の視野においては、それぞれの焦点距離を前記近似式から算出して、この算出された焦点距離に前記受光光学系の焦点距離を設定する工程を、前記焦点位置調節工程として行う、請求項１〜８のいずれか一項に記載の目的細胞の検出方法。
検出しようとしている目的細胞が非目的細胞より少ない数で含まれる細胞懸濁液を表面に展開可能な細胞展開用基板と、
前記細胞展開用基板の細胞検出領域に単層の細胞層を形成する細胞展開手段と、
前記目的細胞に特異的に結合する抗体と第１蛍光色素との複合体である第１蛍光標識体を用いて、前記細胞懸濁液中の細胞または前記展開後の細胞群を蛍光染色する第１蛍光標識処理手段と、
前記非目的細胞に特異的に結合する抗体と第２蛍光色素との複合体である第２蛍光標識体を用いて、前記細胞懸濁液中の細胞または前記展開後の細胞群を蛍光染色する第２蛍光標識処理手段、
および／または、
前記目的細胞と前記非目的細胞の両方に結合する第３Ａ蛍光色素である、もしくは前記目的細胞と前記非目的細胞の両方に結合する抗体と第３Ｂ蛍光色素との複合体である、第３蛍光標識体を用いて、前記細胞懸濁液中の細胞または前記展開後の細胞群を蛍光染色する第３蛍光標識処理手段と、
前記細胞展開用基板の細胞検出領域に対して、所定波長の励起光を照射可能な照射光学系と、
前記細胞検出領域からの光を波長帯域別に受光可能な受光光学系と、
少なくとも前記受光光学系および照射光学系を制御する制御手段と、
を備えた、目的細胞検出システムであって、
前記制御手段は、少なくとも、
前記照射光学系により第２蛍光色素または第３Ａもしくは第３Ｂ蛍光色素の励起光で前記細胞検出領域に展開された細胞群を照射し、第２の蛍光または第３Ａもしくは第３Ｂの蛍光を発している非目的細胞に前記受光光学系の焦点を合わせる焦点位置調節手段と、
前記照射光学系により第１蛍光色素の励起光で前記細胞検出領域に展開された細胞を照射しつつ、前記焦点位置調節手段で合わせた焦点の位置を基準として、前記受光光学系で第１の蛍光を発している目的細胞を探索する処理を行う目的細胞探索手段と、
を備えたことを特徴とする目的細胞検出システム。
前記目的細胞が、血液中の細胞の総数に対して０．０１％未満の含有率で前記血液に含まれる希少細胞である、請求項１０に記載の目的細胞検出システム。
前記焦点位置調節手段によって焦点を合わせる際に用いられる前記第２の蛍光または前記第３Ａもしくは第３Ｂの蛍光の波長が、前記第１の蛍光の波長と重複しない、請求項１０または１１に記載の目的細胞検出システム。
前記目的細胞がＣＴＣであり、
前記非目的細胞が白血球であり、
前記第１蛍光標識体が、前記第１蛍光色素で標識された抗サイトケラチン抗体であり、
前記第２蛍光標識体が、前記第２蛍光色素で標識された白血球を特異的に認識する抗体である、および／または、前記第３蛍光標識体が、細胞核に結合するヘキスト系蛍光色素である、
請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の目的細胞検出システム。
前記細胞展開用基板の細胞検出領域の表面が平面状であり、
前記細胞展開手段が、前記表面部に展開された２層以上の細胞層を単層化させるための細胞用スクレーパーを備えた、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の目的細胞検出システム。
前記細胞展開用基板の細胞検出領域の表面が、細胞を格納するためのマイクロチャンバーまたは凹凸を有しており、
前記細胞展開手段が、細胞を単層化させるための液流を発生させる送液系機構を備えた、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の目的細胞検出システム。
前記制御手段は、
前記受光光学系に設けられている受光素子により受光する光が、前記第２の蛍光または前記第３Ａもしくは第３Ｂの蛍光から前記第１の蛍光に変化することにより生じる焦点位置のズレ量を算出し、前記焦点位置調節手段で合わせた焦点位置を補正する焦点位置補正手段をさらに備えた、請求項１０〜１５のいずれか一項に記載の目的細胞検出システム。
前記焦点位置調節手段により前記受光光学系の焦点を合わせた直後に、前記受光光学系を第２の蛍光を受光可能な状態にして前記細胞検出領域を撮像する第２細胞画像取得手段、および／または、前記受光光学系を第３Ａもしくは第３Ｂの蛍光を受光可能な状態にして前記細胞検出領域を撮像する第３細胞画像取得手段をさらに備え、
前記目的細胞探索手段として、
前記受光光学系を第１の蛍光を受光可能な状態にして前記細胞検出領域を撮像する第１細胞画像取得手段と、
前記第１細胞画像取得手段と前記第２細胞画像取得手段で撮像した各画像を重ね合わせて合成する処理を行う画像形成手段と、
を備えた、請求項１０〜１６のいずれか一項に記載の目的細胞検出システム。
前記細胞検出領域の異なる位置における２つ以上の視野のそれぞれで、非目的細胞に焦点を合わせて焦点距離の情報を得た後、
これら焦点距離が相違する場合、その差分から、前記２つ以上の視野以外の他の視野における焦点距離の変化を表す近似式を求め、
当該他の視野においては、それぞれの焦点距離を前記線似式から算出して、この算出された焦点距離に前記受光光学系の焦点距離を設定する手段を、前記焦点位置調節手段として含む、請求項１０〜１７のいずれか一項に記載の目的細胞検出システム。