CN109752308A - 细胞检测方法及细胞检测系统 - Google Patents

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柳田匡俊
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Abstract

本发明提供一种能够无障碍地、良好地进行靶细胞检测，且能够缩短靶细胞检测所需的时间的细胞检测方法及细胞检测系统。细胞检测方法包含以下步骤：基于分别作用于靶细胞及非靶细胞的力的不同，从包含靶细胞及非靶细胞的生物体试样去除非靶细胞的至少一部分细胞来获得靶细胞含有试样的步骤（S1）的分离步骤；从靶细胞含有试样获得靶细胞浓度增加的测定试样的步骤（S3）的浓缩步骤；将测定试样供给至成像流式细胞仪检测出靶细胞的步骤（S4）的检测步骤。

Description

细胞检测方法及细胞检测系统
技术领域
本发明涉及细胞检测方法及细胞检测系统。
背景技术
体液中存在循环肿瘤细胞（Circulating Tumor Cell：CTC）、内皮细胞、骨髓液中的造血干细胞、孕妇血液中所含有的胎儿成红血细胞等各种各样的稀有细胞，其与种种疾病的关联性是已知的。尤其是有人报告从肿瘤渗漏至血液中的CTC作为癌症诊断因子的实用性，其作为无创癌症检查备受期待。但是CTC在血中的存在率为每10mL数个～数十个等，测定体液中稀有细胞非常困难。
测定作为稀有细胞之一的CTC的方法已知有CellSearch系统（Veridex公司制）（非专利文献1）。非专利文献1中公开一种以癌细胞中发现的细胞粘附因子（EpCAM）为靶，使用固定有抗EpCAM抗体的磁性粒子回收CTC进行测定的方法。另外，非专利文献1的方法中，基于细胞角蛋白及CD45的发现量，通过荧光显微镜将捕捉的细胞与白细胞区分开并检测出CTC。
另外，测定CTC的方法已知有使用成像流式细胞仪的方法（专利文献1）。专利文献1中公开一种通过具备时间延迟积分（TDI, Time Delay Integration）相机的成像流式细胞仪根据细胞的形态特征和光学特征来区分白细胞和CTC的方法。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1 "CELLSEARCH System Overview | CELLSEARCH"、［online］、［2017年10月26日检索］、因特网<URL：https://www.cellsearchctc.com/product-systems-overview/cellsearch-system-overview>
专利文献
专利文献1 美国专利第8885913号说明书。
发明内容
发明要解决的技术问题
非专利文献1公开的方法通过抗EpCAM抗体来捕捉CTC，因此不显示EpCAM发现的癌症种类的癌细胞、EpCAM发现量少的癌细胞的回收变得困难。并且，由于使用抗体捕捉作为靶细胞的CTC，会对靶细胞施加压力，这样的压力可能成为检测出捕捉后的细胞的障碍。
另外在专利文献1公开的方法中，虽然血液所含有的红细胞会通过过滤器、溶血、声波等被去除，但是白细胞和CTC不会分离并通过成像流式细胞仪被测定。如上所述10mL血液中所含有的CTC仅为数个～数十个，与之相对白细胞存在3000万个～9000万个。并且成像流式细胞仪的拍摄速度是有限度的。因此在实际临床中难以用恰当的时间完成测定。
解决技术问题的技术手段
本发明第1技术方案涉及细胞检测方法。本技术方案所涉及的细胞检测方法包含以下步骤：基于分别作用于靶细胞及非靶细胞的力的不同，从包含靶细胞及非靶细胞的生物体试样21去除非靶细胞的至少一部分细胞获得靶细胞含有试样22的步骤S1；从靶细胞含有试样22获得靶细胞浓度增加的测定试样23的步骤S3；将测定试样23供给至成像流式细胞仪13来检测出靶细胞的步骤S4。
本技术方案所涉及的细胞检测方法基于分别作用于靶细胞及非靶细胞的力的不同，从生物体试样去除非靶细胞的至少一部分细胞。由此不会对靶细胞施加压力，能够无障碍地良好地进行靶细胞检测。并且，浓缩靶细胞含有试样而成的测定试样供给至成像流式细胞仪，因此能够通过小容量的测定试样正确地检测出靶细胞。因此能够缩短靶细胞检测所需的时间。
本技术方案所涉及的细胞检测方法中，分别作用于靶细胞及非靶细胞的力的不同是由于靶细胞及非靶细胞的形态不同而产生的。
此时形态可以是细胞的大小。
本技术方案所涉及的细胞检测方法中，在获得靶细胞含有试样的步骤S1中，在不对靶细胞进行染色的情况下分离靶细胞和非靶细胞。在获得靶细胞含有试样的步骤之前染色靶细胞的话，细胞会由于染色处理而变小。因此在不对靶细胞进行染色的情况下分离靶细胞和非靶细胞的话，能够基于分别作用于靶细胞及非靶细胞的力的不同正确地进行分离。
本技术方案所涉及的细胞检测方法中，也可以在获得靶细胞含有试样的步骤S1之前染色靶细胞。这样一来，例如能够一起进行在染色靶细胞的步骤中进行的清洗和在获得靶细胞含有试样的步骤中进行的清洗。这样能够缩短靶细胞检测所需的时间。
本技术方案所涉及的细胞检测方法中，也可以在获得靶细胞含有试样的步骤S1之前及获得靶细胞含有试样的步骤S1之后染色靶细胞。
本技术方案所涉及的细胞检测方法中，在获得靶细胞含有试样22的步骤S1中，通过让生物体试样21在微流路110流动来分离靶细胞和非靶细胞。这样一来能够实现用于分离靶细胞和非靶细胞的结构的小型化。
本实施方式所涉及的细胞检测方法中，在获得靶细胞含有试样22的步骤S1中，通过让生物体试样21在具有曲线部111的流路110中流动来分离靶细胞和非靶细胞。这样一来，能够通过精简的结构有效地分离靶细胞和非靶细胞。
本技术方案所涉及的细胞检测方法中，在获得靶细胞含有试样22的步骤S1中，基于在供生物体试样21流动的流路110内产生的速度分布分离靶细胞和非靶细胞。这样一来，仅让生物体试样在流路流动就能分离靶细胞和非靶细胞。
本技术方案所涉及的细胞检测方法中，在获得测定试样23的步骤S3中，浓缩靶细胞含有试样22。这样一来能够正确并高效地进行通过成像流式细胞仪进行的检测。
此时，测定试样23所含有的细胞浓度设定为4.5×109个／mL以下。
本技术方案所涉及的细胞检测方法中，在获得测定试样23的步骤S3中，浓缩靶细胞含有试样并使测定试样23为一定容量。
此时，一定容量是由检测出靶细胞的步骤S4中测定试样23的测定时间所规定的容量。
另外，一定容量是成像流式细胞仪13的最大被摄体移动速度、最大景深、最大拍摄区域宽度及测定时间相乘所得值以下的容量。这样一来能够在一定测定时间内完成检测。
本技术方案所涉及的细胞检测方法中，在获得测定试样23的步骤S3中，通过对靶细胞含有试样22进行离心并去除上清来浓缩靶细胞含有试样22。
本技术方案所涉及的细胞检测方法中，还包括为进行成像流式细胞仪13中的拍摄而至少染色靶细胞的步骤S2。
此时，染色靶细胞的步骤S2在获得靶细胞含有试样22的步骤S1之后进行。这样一来能够减少染色试剂的使用量。
在染色靶细胞的步骤S2中，染色基因及蛋白质的至少一者。
在染色靶细胞的步骤S2中，染色细胞核及细胞质的至少一者。
在染色靶细胞的步骤S2中，用荧光色素标记靶细胞。
本技术方案所涉及的细胞检测方法中，在检测出靶细胞的步骤S4中，将在获得测定试样23的步骤S3中所获得的测定试样23的实质上全部量供给至成像流式细胞仪13进行测定。这样一来能够将很少的靶细胞几乎没有剩余地检测出来。
本技术方案所涉及的细胞检测方法中，生物体试样21可以是血液试样。
本技术方案所涉及的细胞检测方法中，靶细胞可以是在血中循环的稀有细胞。在血中循环的稀有细胞能够列举出循环肿瘤细胞（CTC）、内皮细胞（CEC）和造血干细胞（HSC）等。
本技术方案所涉及的细胞检测方法中，非靶细胞可以是红细胞。
此时，在获得靶细胞含有试样22的步骤S1中，溶血并去除红细胞后，去除非靶细胞的至少一部分细胞。血液试样含有大量作为非靶细胞的红细胞。在去除非靶细胞之前预先溶血并去除红细胞的话，能够顺利地去除非靶细胞。
本技术方案所涉及的细胞检测方法中，非靶细胞可以是血小板。
本技术方案所涉及的细胞检测方法中，非靶细胞可以是白细胞。
本技术方案所涉及的细胞检测方法中，靶细胞可以是异常淋巴细胞，非靶细胞可以是除此之外的白细胞。
本技术方案所涉及的细胞检测方法中，成像流式细胞仪13具备用于拍摄细胞的TDI相机354。这样一来能够提高细胞的拍摄图像的品质。
本技术方案所涉及的细胞检测方法中，收纳生物体试样21、靶细胞含有试样22及测定试样23的容器T1、T2、T3已用阻断剂进行处理。这样一来，能够防止靶细胞附着于容器内壁而导致靶细胞不供给至检测。因此能够切实地检测出生物体试样、靶细胞含有试样及测定试样所含有的很少的靶细胞。
本发明第2技术方案涉及细胞检测方法。本技术方案所涉及的细胞检测方法包含以下步骤：在不对靶细胞进行染色的情况下从包含靶细胞及非靶细胞的生物体试样21去除非靶细胞的至少一部分细胞获得靶细胞含有试样22的步骤S1；从靶细胞含有试样22获得靶细胞浓度增加的测定试样23的步骤S3；将测定试样23供给至成像流式细胞仪13检测出靶细胞的步骤S4。
本技术方案所涉及的细胞检测方法与第1技术方案所涉及的细胞检测方法有同样的效果。并且，本技术方案所涉及的细胞检测方法在不对靶细胞进行染色的情况下分离靶细胞和非靶细胞，因此能够避免在细胞因染色处理而变小的状态下进行分离处理。因此能够正确地进行分离。
本发明第3技术方案涉及细胞检测系统。本技术方案所涉及的细胞检测系统10具备：分离部100，基于分别作用于靶细胞及非靶细胞的力的不同，从包含靶细胞及非靶细胞的生物体试样21去除非靶细胞的至少一部分细胞获得靶细胞含有试样22；浓缩部205，从靶细胞含有试样22获得靶细胞浓度增加的测定试样23；拍摄部354，拍摄在流动池310流动的测定试样23所含有的靶细胞；检测部301，基于通过拍摄部354获取的拍摄图像检测出靶细胞。
本技术方案所涉及的细胞检测系统与第1技术方案有同样的效果。
发明效果
本发明能够无障碍且良好地进行靶细胞检测，并能够缩短靶细胞检测所需的时间。
附图说明
图1是实施方式所涉及的细胞检测方法的步骤的流程图；
图2是用于说明实施方式所涉及的分离步骤的示意图；
图3（a）是实施方式所涉及的分离部的结构的示意图；
图3（b）是实施方式所涉及的微流路的截面的示意图；
图4（a）是实施方式所涉及的微流路的输出端部侧的端部的示意图；
图4（b）是实施方式所涉及的白细胞及癌细胞的直径和细胞数的关系的图表；
图5是用于说明实施方式所涉及的染色及浓缩步骤的示意图；
图6是用于说明实施方式所涉及的染色及浓缩步骤的示意图；
图7是用于说明实施方式所涉及的检测步骤的示意图；
图8是实施方式所涉及的细胞检测系统的结构的示意图；
图9是实施方式所涉及的分离装置的结构的示意图；
图10是实施方式所涉及的染色浓缩装置的结构的示意图；
图11是实施方式所涉及的成像流式细胞仪的结构的示意图；
图12（a）、（b）是变更例所涉及的细胞检测方法的步骤的流程图。
具体实施方式
以下实施方式将本发明适用于从包含靶细胞及非靶细胞的生物体试样检测出靶细胞的方法。以下实施方式中，生物体试样为血液。生物体试样不限于血液，如果是体液试样的话，例如也可以是尿、骨髓液等。靶细胞是在血中循环的稀有细胞。以下实施方式中，靶细胞是循环肿瘤细胞（CTC），非靶细胞是红细胞、白细胞及血小板。靶细胞不限于CTC，也可以是CTC以外的癌细胞、内皮细胞（Circulating Endothelial Cell：CEC）、造血干细胞（Hematopoietic Stem Cell：HSC）等。另外，靶细胞也可以是异常淋巴细胞。靶细胞是异常淋巴细胞时，非靶细胞是除此之外的白细胞。
＜细胞检测方法＞
如图1所示，实施方式的细胞检测方法包含步骤S1～S5的步骤。以下将针对操作人员将指示输入至细胞检测系统，细胞检测系统与输入的指示相应地执行图1的步骤S1～S5构成的检测方法的情况进行说明。关于细胞检测系统将在之后参照图8及以后进行说明。
在步骤S1的分离步骤中，细胞检测系统基于分别作用于靶细胞及非靶细胞的力的不同从包含靶细胞及非靶细胞的生物体试样去除非靶细胞的至少一部分细胞获得靶细胞含有试样。分别作用于靶细胞及非靶细胞的力的不同是由于靶细胞及非靶细胞的形态不同而产生的。此时的细胞的形态指的是形态特性，例如细胞的大小、重量、比重等。细胞的大小例如是细胞的直径、半径、平面视图中的面积、周长等。
参照图2说明步骤S1的分离步骤。如第1状态所示，实施方式的生物体试样为血液。血液例如是全血。血液包含靶细胞即CTC、非靶细胞即红细胞、血小板及白细胞。图2中，CTC用黑圆表示，红细胞用圆表示，血小板用三角表示，白细胞用四角表示。
步骤S1中，细胞检测系统在第1状态的生物体试样中使红细胞溶血再进行离心分离去除上清。由此，如第2状态所示，红细胞几乎从第1状态的生物体试样消失。进一步地在步骤S1中，细胞检测系统在第2状态的生物体试样中分离靶细胞和非靶细胞。具体来说，细胞检测系统基于分别作用于CTC、红细胞、血小板及白细胞的力的不同，从第2状态的生物体试样分离并去除红细胞、血小板及白细胞的一部分细胞。实施方式中利用作用于细胞的力的不同是由于细胞直径的不同而产生的这一点来进行分离。由此，从第2状态的试样去除非靶细胞的一部分，如第3状态所示，获取靶细胞含有试样。
如上所述，在第1状态的血液中溶血并去除红细胞后再去除非靶细胞的话，在去除非靶细胞时为血液所含有的大量红细胞预先被除掉的状态。由此，在去除非靶细胞时能够顺利地去除非靶细胞。
从图2的第2状态的生物体试样去除非靶细胞时，例如使用图3（a）所示分离部100。
如图3（a）所示，分离部100具备微流路110、输入端部120和输出端部130。微流路一般来说指的是深度及宽度在10μm～1000μm的范围内的流路。分离部100例如如下构成：在形成有与微流路110、输入端部120及输出端部130相对应的沟的薄板状构件上重叠其他板状构件。实施方式的非靶细胞的分离基于被称作迪恩流分离（Dean Flow Fractionation）的分离原理。
微流路110具有螺旋形状的曲线部111。输入端部120设于微流路110的螺旋形状的中心侧端部，输出端部130设于微流路110的与输入端部120相反侧的端部。输入端部120具备入口121、122。入口121、122由设于构成分离部100的构件上的孔构成。入口121在螺旋形状的外周侧与微流路110连接。入口122在螺旋形状的内周侧与微流路110连接。输出端部130具备出口131、132。出口131、132由设于构成分离部100的构件上的孔构成。出口131在螺旋形状的内周侧与微流路110连接。出口132在螺旋形状的外周侧与微流路110连接。
去除非靶细胞时，向入口121注入图2所示的第2状态的生物体试样，向入口122注入鞘液。然后，通过介由管与入口121、122连接的泵对入口121、122施加正压。由此，注入至入口121的试样和注入至入口122的鞘液在微流路110内向输出端部流动。用于收纳靶细胞含有试样的容器介由管与出口131连接，用于回收包含分离出来的非靶细胞的液体的容器介由管与出口132连接。
第2状态的生物体试样向微流路110流动的话，如图3（b）所示，在微流路110内会在与流路的朝向正交的方向产生使细胞的流动位置变化的力。具体来说，会与细胞的直径相应地产生不同大小的升力FL和迪恩（Dean）阻力FD。一般来说，微流路中流速的分布为：流路的截面中心的速度大、壁附近的速度小。螺旋状的微流路110中，还由于上述流速分布，如图3（b）中椭圆状的箭头所示，产生被称作迪恩（Dean）涡的二次流。迪恩（Dean）阻力FD和升力FL能够由下述数1的公式（11）、（12）表示。
数1
（11）
（12）
：流体粘度 ：流体密度 ：迪恩（Dean）速度
：剪切速度 ：粒径 ：升力系数
：微流路的最大流速 ：水力直径
生物体试样内的细胞沿微流路110被推着流动，由于升力FL和迪恩（Dean）阻力FD，生物体试样内的细胞在微流路110内会按照直径的值分布。如图4（a）所示，这样一来细胞在微流路110的输出端部130侧的端部会按照直径的值分布。这样从出口131获取一定直径以上的细胞。从出口131获取的试样是图2的第3状态的靶细胞含有试样。
由此，微流路110能够以精简的结构分离靶细胞和非靶细胞，能够实现用于分离靶细胞和非靶细胞的结构的小型化。另外，微流路110能够基于曲线部111内产生的速度分布分离靶细胞和非靶细胞，因此仅让生物体试样向微流路110流动就能执行分离步骤。
图4（b）是发明者们预先调查得到的白细胞及癌细胞的直径。图4（b）中，左侧的纵轴表示白细胞的细胞数，右侧的纵轴表示癌细胞的细胞数。调查所用癌细胞来自于包含癌细胞的细胞株。
如图4（b）所示，大部分的白细胞的直径为10μm～15μm附近的值以下，大部分的癌细胞的直径为10μm～15μm附近的值以上。因此从图2的第2状态去除非靶细胞时，优选以10μm～15μm附近的值作为临界值，去除直径比临界值小的细胞，取出直径为临界值以上的细胞。
以下表1表示针对健康的正常人的5mL全血让临界值变化为10μm～15μm时的临界值以上的白细胞的个数。另外，健康的正常人的白细胞数的基准值为3500～9000个／μL。
表1
如表1所示，临界值大的话取出的白细胞数变少，但去除癌细胞的可能性变高。另一方面，临界值小的话取出的白细胞数变多，但去除癌细胞的可能性变低。另外，临界值小的话，供给至检测步骤的细胞数变多，因此可能造成在检测步骤中无法顺利检测出细胞。因此在考虑如上情况之上，使用微流路110决定分离的细胞数。用分离部100分离的细胞数能够根据微流路110的长度、截面积、截面形状、微流路110的流速等来调整。
返回图1，在步骤S2的染色步骤中，细胞检测系统为成像流式细胞仪中的拍摄而染色靶细胞含有试样所含有的标记细胞。
参照图5说明步骤S2的染色步骤。在步骤S2中，细胞检测系统将用于染色的试剂与第3状态的靶细胞含有试样混合来染色靶细胞的靶部位。具体来说，靶部位被荧光色素荧光标记。实施方式中，染色对象靶部位是细胞核、Her2基因及17号染色体的着丝粒区域（CEP17）。如图5上方的图所示，第3状态下，细胞核、Her2基因及CEP17均未被染色。如图5下方的图所示，通过进行步骤S2的染色步骤，细胞核、Her2基因及CEP17分别被不同的荧光色素染色。这样靶细胞含有试样从第3状态变为第4状态。
实施方式的染色步骤在用于获得靶细胞含有试样的分离步骤之后进行。由此，能够在除去不需要的细胞之后进行染色，因此能够减少染色试剂的使用量。另外，染色步骤在分离步骤之前进行的话，细胞会由于染色处理而变小。但是，实施方式的分离步骤中在不对靶细胞进行染色的情况下分离靶细胞和非靶细胞。由此在分离步骤中，一定大小以上的细胞能够正确地分离。
另外在上述染色步骤中，染色的靶部位是细胞的部位即可。染色的靶部位不限于基因、细胞核，例如也可以是细胞的蛋白质、细胞质、细胞膜、细胞膜上的表面抗原。靶部位的染色不限于基于原位杂交、特异性染色来进行，也可以通过基于抗原抗体反应的免疫染色来进行。当靶部位是基因时，不限于Her2基因、CEP17，也可以是其他基因区域。实施方式中，如上所述，细胞的染色意味着染色细胞的基因、细胞核、蛋白质、细胞质、细胞膜、表面抗原等。
上述染色步骤中，可以进行细胞的蛋白质及细胞质的染色来代替细胞的基因及细胞核的染色。另外，也可以和细胞的基因及细胞核的染色一起进行细胞的蛋白质及细胞质的染色。染色存在于细胞质内的蛋白质时，优选染色细胞质。存在于细胞质内的蛋白质能够列举出存在于来自于前列腺癌的CTC中的PSA、存在于来自于肺癌的CTC中的细胞角蛋白等。
返回图1，在步骤S3的浓缩步骤中，细胞检测系统从靶细胞含有试样获得靶细胞浓度增加的测定试样。
参照图6说明步骤S3的浓缩步骤。在步骤S3中，细胞检测系统针对第4状态的靶细胞含有试样进行离心分离等处理，并去除离心分离后的靶细胞含有试样的上清。由此，在第4状态的靶细胞含有试样所含有的细胞残留的状态下液量降低，靶细胞浓度增加。这样第4状态的靶细胞含有试样变成第5状态的测定试样。浓缩步骤中浓缩靶细胞含有试样以使测定试样所含有的细胞浓度为一定浓度。
通过浓缩步骤使测定试样所含有的细胞浓度为一定浓度，因此在之后的检测步骤中，能够正确且高效地进行成像流式细胞仪的检测。
另外，在步骤S2的染色步骤中也通过进行去除上清等处理减少试样的液量。与减少用于染色的液量不同，步骤S3的浓缩步骤中，与检测步骤中应该使用的测定试样的液量相应地提高靶细胞浓度。
并且，浓缩步骤中，从离心分离后的靶细胞含有试样去除上清，从而获得靶细胞浓度增加的测定试样，但在浓缩步骤所进行的处理不限于此。例如，也可以通过去除靶细胞含有试样的上清来浓缩靶细胞含有试样以使测定试样为一定容量。另外，也可以从离心分离后的靶细胞含有试样去除全部液体成分，向去除后的容器混合一定量的悬浊液来得到测定试样。
返回图1，在步骤S4的检测步骤中，细胞检测系统将在浓缩步骤获得的测定试样供给至成像流式细胞仪来检测出靶细胞。
参照图7说明步骤S4的检测步骤。步骤S4中，细胞检测系统将第5状态的测定试样供给至成像流式细胞仪，通过设于成像流式细胞仪的拍摄部拍摄从测定试样所含有的细胞产生的荧光。由此获取分别针对每个测定试样所含有的细胞的荧光图像。并且，成像流式细胞仪基于获取的荧光图像判断Her2基因是否有扩增，将Her2基因扩增的阳性细胞作为CTC检测出来。
返回图1，在步骤S5的解析步骤中，细胞检测系统进行在检测步骤检测出的靶细胞的解析。具体来说，进行靶细胞检测的成像流式细胞仪获取靶细胞数、由拍摄部拍摄得的全部细胞中的靶细胞的比例等。
另外，当靶细胞为内皮细胞（CEC）时，解析步骤中解析CEC所含有的蛋白质即NFκB在细胞内的局部存在。具体来说，在染色步骤中，CEC介由与CEC中发现的抗体特异性结合的CD146的标记抗体被荧光标记，NFκB介由与NFκB特异性结合的标记抗体被荧光标记。检测步骤中，拍摄基于CEC的荧光，并拍摄基于NFκB的荧光。然后基于荧光图像检测出CEC。解析步骤中，判断信号分子即NFκB是否局部存在于细胞核内，判断CEC是否有活化。
另外，当靶细胞是来自于肺癌的CTC，靶部位是细胞角蛋白时，检测步骤中，基于细胞角蛋白存在于细胞质内的量进行靶细胞的检测。然后解析步骤中获取靶细胞数、靶细胞的比例。
如上所述，基于分别作用于靶细胞及非靶细胞的力的不同，从生物体试样除掉非靶细胞的至少一部分细胞。由此不会对靶细胞施加压力，且能够无障碍地良好地进行靶细胞检测。并且，将浓缩靶细胞含有试样而成的测定试样供给至成像流式细胞仪，因此能够通过小容量的测定试样正确地检测出靶细胞。因此能够缩短靶细胞检测所需的时间。
＜细胞检测系统＞
接下来说明用于进行图1的步骤S1～S5的各步骤的细胞检测系统10。
如图8所示，细胞检测系统10具备分离装置11、染色浓缩装置12和成像流式细胞仪13。
靶细胞即CTC的血中浓度极低。因此，为检测出稀有细胞即CTC，供给至细胞检测系统10的第1状态的生物体试样21即血液为5mL以上，优选为7.5mL以上。
分离装置11使用收纳于容器T1的生物体试样21进行步骤S1的分离步骤，获得收纳于容器T2的靶细胞含有试样22。染色浓缩装置12使用收纳于容器T2的靶细胞含有试样22进行步骤S2的染色步骤及步骤S3的浓缩步骤，获得收纳于容器T3的测定试样23。成像流式细胞仪13使用收纳于容器T3的测定试样23进行步骤S4的检测步骤及步骤S5的解析步骤。
容器T1、T2、T3已用阻断剂进行处理。阻断剂是泊洛沙姆（Poloxamer）或者2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱单体（2－Methacryloyloxyethyl Phosphorylcholine monomer）聚合物。用阻断剂处理容器T1、T2、T3的话会防止非特异吸附，因此能够防止靶细胞附着于容器内壁从而靶细胞不供给至检测。因此，能够切实地检测出生物体试样21、靶细胞含有试样22及测定试样23所含有的很少的靶细胞。
另外，细胞检测系统10由数个装置构成，但也可以由1个装置构成。染色浓缩装置12也可以由染色装置和浓缩装置构成。
如图9所示，分离装置11具备控制部101、存储部102、显示输入部103、试样制备部104和分离部100。
控制部101由CPU构成。控制部101也可以由微机构成。控制部101基于存储于存储部102的程序进行各种处理。控制部101与分离装置11内的各部连接，接受来自各部的信号并控制各部。存储部102由RAM、ROM、硬盘等构成。显示输入部103由触摸屏式显示器构成。另外，也可以设置由显示器构成的显示部和由鼠标、键盘构成的输入部来代替显示输入部103。
试样制备部104具备无图示的分装部及混合室等。如图2说明过的那样，试样制备部104针对第1状态的生物体试样21进行用于进行红细胞溶血及去除的试样制备处理，获取第2状态的生物体试样21。在试样制备部104获取的第2状态的生物体试样21移送至分离部100。另外，分离装置11中试样制备部104也可以省略。此时，第2状态的生物体试样21供给至分离装置11。
分离部100除具备图3（a）说明过的微流路110、输入端部120及输出端部130之外，还具备用于向输入端部120施加正压的无图示的泵。分离部100让第2状态的生物体试样21向入口121流动，并让鞘液向入口122流动。此时，分离部100通过驱动泵来向入口121、122施加与要去除的细胞数相应的正压。由此决定在微流路110流动的生物体试样21的速度，从而去除一定数量的细胞。
另外，操作人员能够介由显示输入部103输入由分离部100获取的细胞数或细胞大小。控制部101接收要获取的细胞数或细胞大小后，将接收的值存储于存储部102，并与存储的值相应地决定在微流路110流动的生物体试样21的速度，即施加于入口121、122的正压。另外，如上所述，由分离部100获取的细胞数及细胞大小也能够根据微流路110的长度、截面积、截面形状进行调整。操作人员也可以通过更换形成有微流路110、输入端部120及输出端部130的板状构件来变更由分离部100获取的细胞数及细胞大小。
分离部100将从出口131出来的生物体试样21作为靶细胞含有试样22移送至容器T2。这样一来，获取第3状态的靶细胞含有试样22，分离装置11的处理结束。
如图10所示，染色浓缩装置12具备控制部201、存储部202、显示输入部203、染色部204和浓缩部205。
控制部201由CPU构成。控制部201也可以由微机构成。控制部201基于存储于存储部202的程序进行各种处理。控制部201与染色浓缩装置12内的各部连接，接受来自各部的信号并控制各部。存储部202由RAM、ROM、硬盘等构成。显示输入部203由触摸屏式显示器构成。另外，也可以设置由显示器构成的显示部和由鼠标、键盘构成的输入部来代替显示输入部203。
操作人员介由显示输入部203输入在分离装置11中分离并获取的细胞数，即第3状态的靶细胞含有试样22所含有的细胞数。控制部201将输入的细胞数存储于存储部202，在对染色处理后的靶细胞含有试样22进行浓缩时使用。另外，控制部201也可以通过通信从分离装置11接受在分离装置11分离并获取的细胞数。
染色部204具备无图示的分装部及加热部等。如图5说明过的那样，染色部204针对第3状态的靶细胞含有试样22进行染色处理，获取第4状态的靶细胞含有试样22。在染色部204获取的第4状态的靶细胞含有试样22移送至浓缩部205。
浓缩部205具备离心分离器205a和分装部205b。浓缩部205将第4状态的靶细胞含有试样22分装至一定容器，通过离心分离器205a进行第4状态的靶细胞含有试样22的离心分离。然后，浓缩部205通过分装部205b去除离心分离后的容器内的上清。详细来说，控制部201从存储部202读取在分离装置11中获取的细胞数，基于所读取的细胞数通过分装部205b去除上清以使离心分离后的容器内的细胞浓度为一定浓度。由此，如用图6说明过的那样，第4状态的靶细胞含有试样22被浓缩。由浓缩部205制成的测定试样23的细胞浓度将在之后说明。
浓缩部205将去除上清之后的靶细胞含有试样22作为测定试样23移送至容器T3。这样一来，获取第5状态的测定试样23，染色浓缩装置12的处理结束。
另外，由浓缩部205制成的测定试样23的细胞浓度不限于在染色浓缩装置12中自动设定，也可以是操作人员介由显示输入部103进行设定。
如图11所示，成像流式细胞仪13具备检测部301、存储部302、显示输入部303和测定部304。此外，成像流式细胞仪13包含：用于吸移容器T3内的测定试样23的吸移管；将吸移的测定试样23移送至流动池310的流路；用于回收从流动池310排出的测定试样23的流路。
检测部301由CPU构成。检测部301也可以由微机构成。检测部301基于存储于存储部302的程序进行各种处理。检测部301与成像流式细胞仪13内的各部连接，接受来自各部的信号并控制各部。存储部302由RAM、ROM、硬盘等构成。显示输入部303由触摸屏式显示器构成。另外，也可以设置由显示器构成的显示部和由鼠标、键盘构成的输入部来代替显示输入部303。
测定部304具备流动池310、光源321～324、聚光镜331～334、分色镜341～343、聚光镜351、光学单元352、聚光镜353和拍摄部354。测定部304用光照射包含被荧光标记的数种靶部位的测定试样23，检测出波长不同的数种荧光。图11的测定部304中表示有互相正交的XYZ轴。
在染色浓缩装置12中获得的测定试样23的实质上全部量在流动池310的流路311中向Z轴正方向流动。在这里会想到在容器T3内和从吸移容器T3内的测定试样23的吸移管到流动池310的流路中会稍稍残留测定试样23。因此“在染色浓缩装置12中获得的测定试样23的实质上全部量”意味着除去容器T3内和从吸移管到流动池310的流路中残留的、未供给至流动池310的容量之外的全部量。具体来说，容器T3内的测定试样23的90％（v／v）以上会供给至流动池310。像这样，测定试样23的实质上全部量向流动池310流动的话，能够将很少的靶细胞几乎没有剩余地检测出来。
光源321～324用光照射在流动池310流动的测定试样23。光源321～324由半导体激光光源构成。从光源321～324射出的光分别是波长为λ11～λ14的激光。聚光镜331～334分别聚集从光源321～324射出的光。分色镜341让波长为λ11的光透射，反射波长为λ12的光。分色镜342让波长为λ11、λ12的光透射，反射波长为λ13的光。分色镜343让波长为λ11～λ13的光反射，透射波长为λ14的光。这样一来，波长为λ11～λ14的光向Y轴正方向照射到在流动池310的流路311流动的测定试样23。
这里，分别用于标记细胞核和2个基因的荧光色素从以下荧光色素中选择：通过照射波长为λ11的激发光从而产生波长为λ21的荧光的荧光色素；通过照射波长为λ12的激发光从而产生波长为λ22的荧光的荧光色素；通过照射波长为λ13的激发光从而产生波长为λ23的荧光的荧光色素。通过分别拍摄波长为λ21～λ23的荧光来获取靶部位即细胞核和2个基因的相关荧光图像。
用波长为λ11～λ14的光照射在流动池310流动的测定试样23的话，会从标记CTC的靶部位的荧光色素产生荧光。另外，用波长为λ14的光照射在流动池310流动的测定试样23的话，该光会透射细胞。透射过细胞的波长为λ14的光用于制成明视野图像。
聚光镜351聚集从测定试样23产生的波长为λ21～λ23的荧光和透射过测定试样23的波长为λ14的光。光学单元352具有4枚分色镜组合而成的结构。光学单元352的4枚分色镜以互相稍稍不同的角度反射波长为λ21～λ23的荧光和波长为λ14的光，并在拍摄部354的光接收面上使其分离。聚光镜353聚集波长为λ21～λ23的荧光和波长为λ14的光。
拍摄部354由时间延迟积分（TDI, Time Delay Integration）相机构成。拍摄部354拍摄波长为λ21～λ23的荧光和波长为λ14的光，制成分别与波长为λ21～λ23的荧光相对应的荧光图像和与波长为λ14的光相对应的明视野图像。检测部301使存储部302存储由拍摄部354制成的荧光图像及明视野图像。
这里由于拍摄部354由TDI相机构成，因此会累计拍摄部354的光接收面接收的荧光制成荧光图像及明视野图像。由此，能够提高细胞的荧光图像及明视野图像的品质。
检测部301基于存储于存储部302的荧光图像，如用图7说明过的那样进行阳性判断、检测出CTC。具体来说，检测部301在从标记Her2基因的荧光色素产生的荧光图像和从标记CEP17的荧光色素产生的荧光图像中提取出光点。检测部301分别针对每个细胞用基于Her2基因的光点数除以基于CEP17的光点数，计算出的值比1大的话，则判断为该细胞中Her2基因有扩增。然后，检测部301将Her2基因有扩增的阳性细胞作为CTC检测出来。然后，检测部301获取检测出来的CTC数、拍摄部354拍摄得的全部细胞中的CTC的比例等。
接下来说明供给至成像流式细胞仪13的测定试样23的浓度。
如上所述，染色浓缩装置12的浓缩部205浓缩由染色部204染色后的靶细胞含有试样22来制成测定试样23。此时，浓缩部205浓缩第4状态的靶细胞含有试样22来获取测定试样23并使测定试样23流动至成像流式细胞仪13的流路系统时细胞不会堵塞。成像流式细胞仪13的流路系统指的是：供给至成像流式细胞仪13的测定试样23从用于吸移测定试样23的吸移管经由流动池310到最终被回收的流路。为使得测定试样23的细胞不会在成像流式细胞仪13的流路系统中堵塞，控制部201将测定试样23的细胞浓度设定为适合流路系统的浓度的上限以下。例如，测定试样23的细胞浓度设定为4.5×109个／mL以下。
这样一来，通过设定测定试样23的细胞浓度，能够使测定试样23正确地向成像流式细胞仪13的流路系统流动。因此能够良好地进行由成像流式细胞仪13进行的检测。
另外，向流动池310流动的测定试样23的每单位时间的流量为V1、让测定试样23向流动池310流动的时间即测定时间为T、向流动池310流动的测定试样23的容量为V，那么V1、T、V的关系用以下公式（21）表示。
V＝V1×T （21）
向流动池310流动的测定试样23的流速即最大被摄体移动速度为V2、流动池310的最大拍摄区域宽度为W、最大景深为DOF，那么V1、V2、W、DOF的关系用以下公式（22）表示。另外，如图11所示，最大拍摄区域宽度W相当于流路311在X轴方向的宽度，最大景深DOF相当于流路311在Y轴方向的宽度。DOF×W的值为核心截面积。
V1＝V2×DOF×W （22）
测定试样23所含有的细胞数为N、测定试样23的浓度为C，那么V、N、C的关系用以下公式（23）表示。
C＝N／V （23）
基于上述公式（21）～（23），浓度C用以下公式（24）表示。
C＝N／（V2×DOF×W×T） （24）
上述公式（24）中，最大被摄体移动速度V2是由检测部301控制用于让测定试样23向流动池310流动的无图示的泵等来决定的。最大景深DOF和最大拍摄区域宽度W是由流动池310的形状、透镜的倍率、透镜的NA、拍摄部354的光接收面的尺寸等来决定的。测定时间T是由检测部301进行让测定试样23向流动池310流动的控制的时间来决定的。最大被摄体移动速度V2和测定时间T可以由操作人员介由显示输入部303设定，也可以由成像流式细胞仪13的检测部301自动设定，也可以预先存储于成像流式细胞仪13的存储部302。
如上述公式（24）所示，染色浓缩装置12的控制部201基于在分离装置11获取的第3状态的靶细胞含有试样22所含有的细胞数N和成像流式细胞仪13中设定的最大被摄体移动速度V2及测定时间T决定要制成的测定试样23的浓度C。另外，最大被摄体移动速度V2及测定时间T可以由操作人员介由显示输入部203输入至染色浓缩装置12，也可以通过通信从成像流式细胞仪13发送至染色浓缩装置12，也可以预先存储于染色浓缩装置12的存储部202。
染色浓缩装置12的控制部201去除离心分离后的上清，浓缩第4状态的靶细胞含有试样22以使测定试样23的浓度成为基于上述公式（24）的浓度C，换言之，使测定试样23成为一定容量。此时，浓缩后的测定试样23的容量相当于上述公式（21）的容量V，因此测定试样23的一定容量由测定试样23的测定时间T规定。
更加详细来说，基于上述公式（21）、（22），容量V由V2×DOF×W×T表示。即，测定试样23的一定容量是最大被摄体移动速度V2、最大景深DOF、最大拍摄区域宽度W及测定时间T相乘得到的值。因此，测定试样23的一定容量是V2×DOF×W×T的值以下的容量。如此规定测定试样23的容量的话，能够在一定的测定时间内完成检测。
＜验证＞
接下来说明发明者们进行的实施方式的验证。该验证由以下所示的流程1～4构成。
1.生物体试样的制备
按照CellHunt Green的附加流程，对细胞进行染色所制成的对象作为CTC。将该CTC添加到7.5mL人新鲜血并将其作为第1状态的生物体试样。另外，此时的CTC是从乳腺癌细胞株即SK-BR3取出的细胞。另外，为方便起见，此时的CTC为与原来血液中所含有的细胞区分开而预先进行染色，实际基于采自被检者的生物体试样检测出CTC时可以将该染色省略。
2.分离步骤
添加生物体试样的3倍的量的CBB公司的红细胞裂解缓冲液（RBC lysis buffer），在室温下震动10分钟。然后进行离心并去除上清。通过该处理红细胞溶血，溶血的红细胞被去除。用4mLCBB公司的再悬浮缓冲液（Resuspension buffer）再次悬浮并将其作为第2状态的生物体试样。通过图3（a）所示的分离部100分离并去除一定数的细胞。分离浓缩完成后，回收用管内的靶细胞含有试样的体积变成10mL。然后进行离心并去除上清。使用280μL0.2％（v／v）普朗尼克/磷酸缓冲盐溶液（Pluronic/PBS）再次悬浮并将其作为第3状态的靶细胞含有试样。
3.FISH染色步骤及浓缩步骤
向1.5mL管添加包含2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱单体（2－MethacryloyloxyethylPhosphorylcholine monomer）聚合物的溶液。该试剂相当于阻断剂。翻转混合之后，自旋向下去除涂层剂。由于为防止细胞的吸附损失，要在染色步骤使用的管的壁面施以亲水涂层。
将在流程2的分离步骤中获取的第3状态的靶细胞含有试样的全部量移到施有防止吸附的涂层的1.5mL管。添加冷藏卡诺氏（carnoys）液，即甲醇75％（v／v）／乙酸25％（v／v）并悬浮以使最终浓度为30％（v／v）。之后，添加冷藏卡诺氏（carnoys）液，即甲醇75％（v／v）／乙酸25％（v／v）并悬浮以使最终浓度为70%（v／v）。之后进行离心并去除上清。
添加1mL0.2％（v／v）Pluronic/PBS，进行离心并去除上清，将其作为第1次清洗。添加1mL0.2％（v／v）Pluronic/PBS，进行离心并去除上清，将其作为第2次清洗。添加1mLVentana公司 1x 反应缓冲液（Reaction buffer），进行离心并去除上清，将其作为第3次清洗。添加100μL0.2％（v／v）Pluronic/PBS并再次悬浮。
离心及去除上清后，按照OGT公司的Cytocell荧光原位杂交探针（Cytocell FISHprobe）的附加资料添加OGT公司的Cytocell FISH probe反应液。该反应液是用于荧光标记细胞的靶部位的基因的试剂。具体来说，通过该反应液，Her2基因被荧光标记。基于OGT公司的Cytocell FISH probe的附加资料实施热变性步骤及混合步骤。使用0.4x枸橼酸钠溶液（SSC）／0.2％（v／v）Pluronic/PBS进行清洗。添加预先加热到72℃的0.4x SSC／0.2％（v／v）Pluronic/PBS，并进行搅拌。进行离心并去除上清。使用2x SSC／0.05％（v／v）吐温-20（Tween20）／0.2％（v／v）Pluronic/PBS进行清洗。进行离心并去除上清。添加100μL DRAQ5／0.2％（v／v）Pluronic/PBS。该试剂是用于荧光标记细胞的细胞核的试剂。进行离心并去除上清。这样一来，容器内的靶细胞变成了与第４状态同样地被染色的状态。
添加200μL0.2％（v／v）Pluronic/PBS并进行悬浮。通过该处理，获取变成一定浓度的第5状态的测定试样。
如上所述，流程3中，并列进行图1的步骤S2的染色步骤及步骤S3的浓缩步骤。即流程3的荧光原位杂交（FISH）染色步骤及浓缩步骤是包含步骤S2、S3的步骤的步骤。
4.检测步骤
将在流程3获取的测定试样供给至成像流式细胞仪。使用Ammnis公司的ImageStream作为成像流式细胞仪。将测定量设定为投入的测定试样的全部量。基于获得的图像信息，通过成像流式细胞仪进行CTC的检测。
通过以上的流程1～4，发明者们确认能够正确地检测出靶细胞即CTC。
另外，在上述流程3中进行荧光原位杂交（FISH）染色，发明者们也探讨进行免疫染色来代替荧光原位杂交（FISH）染色。进行免疫染色时，上述流程1中的CTC为从肺癌细胞株即A549取出的细胞。然后进行以下流程5来替代上述流程3。
5.免疫染色步骤及浓缩步骤
向1.5mL管添加包含2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱单体（2－MethacryloyloxyethylPhosphorylcholine monomer）聚合物的溶液。翻转混合之后，自旋向下去除涂层剂。由此为防止细胞的吸附损失，要在染色步骤使用的管的壁面施以亲水涂层。
将在流程2的分离步骤获取的第3状态的靶细胞含有试样的全部量移到施有防止吸附的涂层的1.5mL管。通过用包含多聚甲醛的溶液进行处理来固定细胞。使用0.2％（v／v）Pluronic/PBS进行清洗，进行离心并去除上清。使用包含聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）的溶液进行膜渗透处理。进行离心并去除上清。添加1mL 0.2％（v／v）Pluronic/PBS并清洗，进行离心并去除上清。添加1％（w／v）牛血清白蛋白（BSA）／0.2％（v／v）Pluronic/PBS并进行阻断。进行离心并去除上清。
添加100μL抗体染色液并悬浮。抗体染色液包含CK Alexa647、CD45 PE-Cy7鼠免疫球蛋白（mouse IgG）、HOECHST及封闭液（Blocking buffe）。抗体染色液是用于荧光标记细胞的靶部位的试剂。具体来说，通过抗体染色液，CTC的细胞角蛋白（CK）被荧光标记，白细胞的CD45抗原被荧光标记，细胞核内的DNA被荧光标记。进行离心并去除上清。添加1mL0.2％（v／v）Pluronic/PBS，进行离心并去除上清，将其作为染色后的清洗。这样一来，容器内的靶细胞变成与第４状态同样地靶细胞被染色的状态。
添加200μL0.2％（v／v）Pluronic/PBS并悬浮。通过该处理，获取变成一定浓度的第5状态的测定试样。
如上所述，流程5中也并列进行图1的步骤S2的染色步骤及步骤S3的浓缩步骤。即流程5的免疫染色步骤及浓缩步骤是包含步骤S2、S3的步骤的步骤。
此时流程4的检测步骤中，与上述FISH染色时同样地将在流程5获取的测定试样供给至成像流式细胞仪，进行CTC的检测及解析。此时，成像流式细胞仪基于细胞角蛋白存在于细胞内的量，进行CTC检测。
进行如上免疫染色步骤时，通过流程1、2、5、4，发明者们也确认能够正确地检测出靶细胞即CTC。
＜细胞检测系统评价＞
发明者们通过比较比较例和实施方式的细胞回收率评价实施方式的细胞检测系统。
比较例使用Veridex公司制的CellSearch系统。实施方式使用图8所示的细胞检测系统10。细胞回收率为以下表2所示的值。
表2
表2中，细胞株“HCC1569”表示使用向血液添加基于乳腺癌细胞株的癌细胞而成的生物体试样的情况。细胞株“A549”表示使用向血液添加基于肺癌细胞株的癌细胞而成的生物体试样的情况。比较例的生物体试样所含有的癌细胞数和实施方式的生物体试样所含有的癌细胞数相同。
比较例中，将癌细胞中发现的细胞粘附因子（EpCAM）作为靶，使用固定有抗EpCAM抗体的磁性粒子回收癌细胞，通过荧光显微镜检测出回收的癌细胞。实施方式中进行图1的步骤S1～S4的处理。实施方式中，当为细胞株“HCC1569”时，荧光标记Her2基因，并基于Her2基因的扩增检测出癌细胞。当为细胞株“A549”时，荧光标记细胞角蛋白，并基于细胞角蛋白的存在量检测出癌细胞。
另外，比较例的“显微镜检测后”一列所示的细胞回收率是用“CellSearch中通过显微镜检测出的癌细胞数”除以“生物体试样所含有的癌细胞数”得到的值。实施方式的“细胞分离后”一列所示的细胞回收率是用“分离步骤后回收的癌细胞数”除以“生物体试样所含有的癌细胞数”得到的值。实施方式的“FCM检测后”一列所示的细胞回收率是用“成像流式细胞仪中在与实施方式同样的检测步骤检测出的癌细胞数”除以“染色步骤后靶细胞含有试样所含有的癌细胞数”得到的值。实施方式的“整体”一列所示的细胞回收率是用“细胞分离后一列所示的细胞回收率”乘以“FCM检测后一列所示的细胞回收率”得到的值。
当为细胞株“A549”时，比较例中，检测出的癌细胞数非常少，为生物体试样所含有的癌细胞数的1.0％。这是因为肺癌细胞中EpCAM的发现量少。另一方面，实施方式中，检测出的癌细胞数为生物体试样所含有的癌细胞数的约40.0％，与比较例相比明显变多。像这样，即使是EpCAM的发现量少的癌细胞的情况下，与比较例相比实施方式能够切实地进行检测。
当为细胞株“HCC1569”时，比较例中，检测出的癌细胞数较多，为生物体试样所含有的癌细胞数的53.1％。另一方面，实施方式中，检测出的癌细胞为生物体试样所含有的癌细胞数的约32.8％，与比较例相比稍微变少。但是，实施方式和比较例的差为20.3％左右，其止于一个很小的值，因此可以说实施方式足以检测出基于细胞株“HCC1569”的癌细胞。
另外，关于细胞株“A549”的细胞回收率和细胞株“HCC1569”的细胞回收率的差，比较例中“显微镜检测后”一列中很大，为52.1％，但实施方式中“整体”一列中是7.2％左右，明显很小。因此可以说即使癌细胞的种类不同，实施方式也能稳定地检测出癌细胞数。
＜变更例＞
上述实施方式中，在不对靶细胞进行染色的情况下进行步骤S1的分离步骤，但进行染色的顺序不限于此。
图12（a）所示的变更例中，与图1的各步骤相比，在步骤S1的分离步骤之前追加步骤S6的染色步骤。该变更例中，例如步骤S6的染色步骤中染色靶细胞细胞核，步骤S2的染色步骤中染色基因。一般来说，用于染色基因的试剂比用于染色细胞核的试剂贵。因此，优选基因染色在分离步骤之后进行，抑制用于染色基因的试剂的消耗。
图12（b）所示的变更例中，与图12（a）的各步骤相比，省略步骤S2的染色步骤。该变更例中，全部染色在分离步骤之前的步骤S6进行。此时，虽然试剂的消耗量变多，但是例如染色靶细胞的步骤S6的染色步骤中进行的清洗和获得靶细胞含有试样的步骤S1的分离步骤中进行的清洗能够在分离步骤后一起进行。由此能够缩短靶细胞检测所需的时间。
编号说明
10 细胞检测系统
13 成像流式细胞仪
21 生物体试样
22 靶细胞含有试样
23 测定试样
100 分离部
110 微流路
111 曲线部
205 浓缩部
301 检测部
310 流动池
354 拍摄部
T1、T2、T3 容器

Claims (32)

1.一种细胞检测方法，其特征在于，所述方法包括：
基于分别作用于靶细胞及非靶细胞的力的不同，从包含所述靶细胞及所述非靶细胞的生物体试样去除所述非靶细胞的至少一部分细胞来获得靶细胞含有试样的步骤；
从所述靶细胞含有试样获得所述靶细胞浓度增加的测定试样的步骤；
将所述测定试样供给至成像流式细胞仪检测出所述靶细胞的步骤。
2.根据权利要求1所述的细胞检测方法，其特征在于：
分别作用于所述靶细胞及所述非靶细胞的力的不同是由于所述靶细胞及所述非靶细胞的形态不同而产生的。
3.根据权利要求2所述的细胞检测方法，其特征在于：
所述形态为细胞的大小。
4.根据权利要求1所述的细胞检测方法，其特征在于：
在获得所述靶细胞含有试样的步骤中，在不对所述靶细胞进行染色的情况下将所述靶细胞和所述非靶细胞分离。
5.根据权利要求1所述的细胞检测方法，其特征在于：
在获得所述靶细胞含有试样的步骤前染色所述靶细胞。
6.根据权利要求1所述的细胞检测方法，其特征在于：
在获得所述靶细胞含有试样的步骤前及获得所述靶细胞含有试样的步骤后染色所述靶细胞。
7.根据权利要求1所述的细胞检测方法，其特征在于：
在获得所述靶细胞含有试样的步骤中，通过让所述生物体试样向微流路流动来分离所述靶细胞和所述非靶细胞。
8.根据权利要求1所述的细胞检测方法，其特征在于：
在获得所述靶细胞含有试样的步骤中，通过让所述生物体试样向具有曲线部的流路流动来分离所述靶细胞和所述非靶细胞。
9.根据权利要求1所述的细胞检测方法，其特征在于：
在获得所述靶细胞含有试样的步骤中，基于供所述生物体试样流动的流路内产生的速度分布分离所述靶细胞和所述非靶细胞。
10.根据权利要求1所述的细胞检测方法，其特征在于：
在获得所述测定试样的步骤中，浓缩所述靶细胞含有试样。
11.根据权利要求10所述的细胞检测方法，其特征在于：
所述测定试样所含有的细胞浓度设定为4.5×109个／mL以下。
12.根据权利要求1所述的细胞检测方法，其特征在于：
在获得所述测定试样的步骤中，浓缩所述靶细胞含有试样以使所述测定试样为一定容量。
13.根据权利要求12所述的细胞检测方法，其特征在于：
所述一定容量是由检测出所述靶细胞的步骤中所述测定试样的测定时间所规定的容量。
14.根据权利要求13所述的细胞检测方法，其特征在于：
所述一定容量是所述成像流式细胞仪的最大被摄体移动速度、最大景深、最大拍摄区域宽度及所述测定时间相乘所得值以下的容量。
15.根据权利要求1所述的细胞检测方法，其特征在于：
在获得所述测定试样的步骤中，对所述靶细胞含有试样进行离心并去除上清，由此浓缩所述靶细胞含有试样。
16.根据权利要求1所述的细胞检测方法，其特征在于：
还包含为进行所述成像流式细胞仪中的拍摄而至少染色所述靶细胞的步骤。
17.根据权利要求16所述的细胞检测方法，其特征在于：
染色所述靶细胞的步骤在获得所述靶细胞含有试样的步骤之后进行。
18.根据权利要求16所述的细胞检测方法，其特征在于：
在染色所述靶细胞的步骤中，染色基因及蛋白质的至少一者。
19.根据权利要求16所述的细胞检测方法，其特征在于：
在染色所述靶细胞的步骤中，染色细胞核及细胞质的至少一者。
20.根据权利要求16所述的细胞检测方法，其特征在于：
在染色所述靶细胞的步骤中，用荧光色素标记所述靶细胞。
21.根据权利要求1所述的细胞检测方法，其特征在于：
在检测出所述靶细胞的步骤中，将在获得所述测定试样的步骤获得的测定试样的实质上全部量供给至所述成像流式细胞仪进行测定。
22.根据权利要求1所述的细胞检测方法，其特征在于：
所述生物体试样为血液试样。
23.根据权利要求1所述的细胞检测方法，其特征在于：
所述靶细胞为在血中循环的稀有细胞。
24.根据权利要求1所述的细胞检测方法，其特征在于：
所述非靶细胞为红细胞。
25.根据权利要求24所述的细胞检测方法，其特征在于：
在获得所述靶细胞含有试样的步骤中，在溶血并去除红细胞后去除所述非靶细胞的至少一部分细胞。
26.根据权利要求1所述的细胞检测方法，其特征在于：
所述非靶细胞为血小板。
27.根据权利要求1所述的细胞检测方法，其特征在于：
所述非靶细胞为白细胞。
28.根据权利要求1所述的细胞检测方法，其特征在于：
所述靶细胞为异常淋巴细胞，所述非靶细胞为除此之外的白细胞。
29.根据权利要求1所述的细胞检测方法，其特征在于：
所述成像流式细胞仪具备用于拍摄细胞的TDI相机。
30.根据权利要求1所述的细胞检测方法，其特征在于：
收纳所述生物体试样、所述靶细胞含有试样及所述测定试样的容器已用阻断剂进行处理。
31.一种细胞检测方法，其特征在于，所述方法包括：
在不对靶细胞进行染色的情况下从包含所述靶细胞及非靶细胞的生物体试样去除所述非靶细胞的至少一部分细胞来获得靶细胞含有试样的步骤；
从所述靶细胞含有试样获得所述靶细胞浓度增加的测定试样的步骤；
将所述测定试样供给至成像流式细胞仪检测出所述靶细胞的步骤。
32.一种细胞检测系统，其特征在于，所述系统包括：
分离部，基于分别作用于靶细胞及非靶细胞的力的不同，从包含所述靶细胞及所述非靶细胞的生物体试样去除所述非靶细胞的至少一部分细胞获得靶细胞含有试样；
浓缩部，从所述靶细胞含有试样获得所述靶细胞浓度增加的测定试样；
拍摄部，拍摄在流动池流动的所述测定试样所含有的所述靶细胞；
检测部，基于通过所述拍摄部获取的拍摄图像检测出所述靶细胞。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2017159225A (ja) * 2016-03-08 2017-09-14 公立大学法人首都大学東京 粒子分別装置及び粒子分別方法
CN110205244A (zh) * 2019-05-22 2019-09-06 晶准生物医药集团有限公司 高通量微流控芯片及其用于分选癌细胞的方法

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3675768A (en) * 1969-03-17 1972-07-11 Gildardo Legorreta Sanchez Method and apparatus for classifying and segregating particles with electrical and optical means
CN101765762A (zh) * 2007-04-16 2010-06-30 通用医疗公司以马萨诸塞州通用医疗公司名义经营 使粒子在微通道中聚集的系统和方法
US20120304749A1 (en) * 2007-12-19 2012-12-06 Los Alamos National Security, Llc Particle Analysis in an Acoustic Cytometer
CN104949945A (zh) * 2014-03-28 2015-09-30 希森美康株式会社 细胞分析方法
US20150293010A1 (en) * 2012-10-29 2015-10-15 The Regents Of The University Of Michigan Microfluidic Device And Method For Detecting Rare Cells
US20150308941A1 (en) * 2010-10-29 2015-10-29 The Regents Of The University Of California Systems and methods for particle classification and sorting
CN105683750A (zh) * 2013-10-16 2016-06-15 明策生物医学科技私人有限公司 用于细胞检测和分离的微流体分拣器
WO2017003380A1 (en) * 2015-07-02 2017-01-05 Nanyang Technological University Leukocyte and microparticles fractionation using microfluidics

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8885913B2 (en) * 1999-01-25 2014-11-11 Amnis Corporation Detection of circulating tumor cells using imaging flow cytometry
SG10201403138WA (en) * 2009-07-02 2014-08-28 Sanofi Sa Novel 2,3-dihydro-1h-imidazo(1,2-a)pyrimidin-5-one derivatives, preparation thereof and pharmaceutical use thereof
CN107604039B (zh) * 2010-03-04 2022-04-15 新加坡国立大学 检测和分离细胞的微流体分选器
US9133499B2 (en) * 2010-09-14 2015-09-15 The Regents Of The University Of California Method and device for isolating cells from heterogeneous solution using microfluidic trapping vortices
JP6713730B2 (ja) * 2015-05-20 2020-06-24 シスメックス株式会社 細胞検出装置および細胞検出方法

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3675768A (en) * 1969-03-17 1972-07-11 Gildardo Legorreta Sanchez Method and apparatus for classifying and segregating particles with electrical and optical means
CN101765762A (zh) * 2007-04-16 2010-06-30 通用医疗公司以马萨诸塞州通用医疗公司名义经营 使粒子在微通道中聚集的系统和方法
US20120304749A1 (en) * 2007-12-19 2012-12-06 Los Alamos National Security, Llc Particle Analysis in an Acoustic Cytometer
US20150308941A1 (en) * 2010-10-29 2015-10-29 The Regents Of The University Of California Systems and methods for particle classification and sorting
US20150293010A1 (en) * 2012-10-29 2015-10-15 The Regents Of The University Of Michigan Microfluidic Device And Method For Detecting Rare Cells
CN105683750A (zh) * 2013-10-16 2016-06-15 明策生物医学科技私人有限公司 用于细胞检测和分离的微流体分拣器
CN104949945A (zh) * 2014-03-28 2015-09-30 希森美康株式会社 细胞分析方法
WO2017003380A1 (en) * 2015-07-02 2017-01-05 Nanyang Technological University Leukocyte and microparticles fractionation using microfluidics

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2017159225A (ja) * 2016-03-08 2017-09-14 公立大学法人首都大学東京 粒子分別装置及び粒子分別方法
CN110205244A (zh) * 2019-05-22 2019-09-06 晶准生物医药集团有限公司 高通量微流控芯片及其用于分选癌细胞的方法
CN110205244B (zh) * 2019-05-22 2020-12-11 晶准生物医药集团有限公司 高通量微流控芯片及其用于分选癌细胞的方法

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