WO2018116465A1 - Ｈｅｒ２陽性癌細胞の検出方法 - Google Patents

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WO2018116465A1
WO2018116465A1 PCT/JP2016/088503 JP2016088503W WO2018116465A1 WO 2018116465 A1 WO2018116465 A1 WO 2018116465A1 JP 2016088503 W JP2016088503 W JP 2016088503W WO 2018116465 A1 WO2018116465 A1 WO 2018116465A1
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her2
fluorescent dye
cell
antibody
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清太 中村
理美 八木
勝也 遠藤
雅之 樋口
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日立化成株式会社
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    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/71—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for growth factors; for growth regulators

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting HER2-positive cancer cells.
  • Molecular targeted therapy is known as one of the treatment methods for cancer. Since molecular target therapy specifically acts on a cancer-related substance (marker protein) that is excessively expressed in cancer cells, it tends to have fewer side effects.
  • An example of a marker protein is a receptor tyrosine kinase called HER2 (Human Epidermal Growth Factor Receptor 2), and a molecular target drug “Trastuzumab” targeting HER2 has been put into practical use. Trastuzumab has been reported to respond dramatically to patients with cancer cells in which HER2 is overexpressed (HER2 positive).
  • an anticancer agent targeting HER2 such as trastuzumab
  • HER2-positive cancer cells can be detected by reacting a fluorescently labeled antibody that recognizes HER2 with cells and detecting this fluorescence (for example, Patent Document 1).
  • the present inventors have carried out immobilization and permeabilization of cells, and then fluorescently labeled HER2-positive cancer cells using a specific antibody, so that HER2 can be highly sensitive.
  • the present inventors have found that positive cancer cells can be detected and have completed the present invention.
  • the present invention is a method for detecting HER2-positive cancer cells, wherein (a) a cell is immobilized and then permeabilized, and (b) a cell is contacted with a primary antibody that recognizes an intracellular epitope of HER2. A secondary antibody that recognizes the primary antibody and then contacted with a secondary antibody that is labeled with a fluorescent dye, and (c) is emitted from the cell by irradiating the cell with excitation light of the fluorescent dye. Detecting fluorescence.
  • the cell may be a cell collected from a blood sample.
  • the fluorescent dye may be a first fluorescent dye.
  • (x1) a cell is contacted with a primary antibody that recognizes a leukocyte marker protein, and then the primary antibody is recognized.
  • the step of contacting the labeled antibody and the step of (x3) labeling the cell nucleus with a fourth fluorescent dye can be further performed in any order.
  • the cells are irradiated with the excitation light of the first, second, third and fourth fluorescent dyes, respectively, and the first, second, third and second emitted from the cells.
  • the fluorescence of each of the four fluorescent dyes is detected.
  • Primary antibodies recognizing HER2 are 4B5, EP1045Y, and K.I. It may be derived from a clone selected from the group consisting of 929.9.
  • the cell may be a cell that has been captured on a filter by filtering a blood sample.
  • the step (x1) may be performed before the step (a), and the step (x2) and the step (X3) may be performed after the step (a).
  • the leukocyte marker protein may be CD45.
  • the epithelial cell marker protein may be cytokeratin.
  • the HER2-positive cancer cell may be derived from breast cancer.
  • HER2-positive cancer cells can be detected with high sensitivity.
  • FIG. 2 is a sectional view taken along line II-II in FIG. 2 is an image of fluorescently labeled cells in Test Example 1.
  • 2 is an image of fluorescently labeled cells in Test Example 1.
  • 4 is an image of fluorescently labeled cells in Test Example 2.
  • the method for detecting HER2-positive cancer cells of the present invention comprises the steps of (a) immobilizing cells and then permeabilizing; (b) contacting the cells with a primary antibody that recognizes an intracellular epitope of HER2; A step of bringing a secondary antibody that recognizes the antibody into contact with a secondary antibody labeled with a fluorescent dye, and (c) detecting fluorescence emitted from the cell by irradiating the cell with excitation light of the fluorescent dye.
  • HER2-positive cancer cells derived from breast cancer, lung cancer, gastric cancer, salivary gland cancer, or ovarian cancer can be detected.
  • Contacting” a substance with a cell can be performed, for example, by immersing the cell in the substance or a solution of the substance.
  • step (a) cells that may contain HER2-positive cancer cells are first immobilized.
  • the cells can be fixed by contacting the cells with a known fixing agent such as formaldehyde. By fixing the cells, cell spoilage or aggregation can be further reduced.
  • the permeabilized cells are then permeabilized.
  • a cell can be permeabilized by contacting the cell with a known permeabilizing agent.
  • a permeation treatment agent for example, poly (oxyethylene) octylphenyl ether can be used.
  • the cells may be washed.
  • the washing step is performed, for example, by bringing a washing solution containing a known buffer solution such as phosphate buffered saline (PBS) into contact with the cells.
  • the washing solution may contain additives such as bovine serum albumin (BSA) or ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA). Washing is not limited to after step (a), and can be performed appropriately after each step.
  • a washing step may be performed after the cells are fixed and before permeabilization.
  • a primary antibody that recognizes an intracellular epitope of HER2 is brought into contact with a cell, and then a secondary antibody that recognizes the primary antibody and labeled with a fluorescent dye (first fluorescent dye). The next antibody is contacted.
  • HER2 is fluorescently labeled.
  • HER2 fluorescent labeling can be performed in two steps as described above, but may be performed in one step. That is, HER2 may be fluorescently labeled in one step by contacting a cell with an antibody that recognizes an intracellular epitope of HER2 and labeled with a fluorescent dye.
  • a primary antibody that recognizes an intracellular epitope of HER2 or an antibody that recognizes an intracellular epitope of HER2 and is labeled with a first fluorescent dye Preferably derived from a clone selected from the group consisting of 929.9, 4B5, EP1045Y, D8F12, 6B12, HRB2 / 451, 29D8, 4F10, 3B5, and CB11. More preferably, it is derived from a clone selected from the group consisting of 929.9, 4B5, and EP1045Y. By using antibodies derived from these clones, HER2-positive cancer cells can be detected with higher sensitivity. K.
  • the antibodies derived from 929.9, 4B5, or EP1045Y are all anti-HER2 rabbit monoclonal antibodies.
  • the fluorescent dye is not particularly limited as long as it is a fluorescent dye usually used for fluorescent labeling of antibodies.
  • the first fluorescent dye is, for example, Alexa Fluor (registered trademark) 647.
  • step (c) the cells are irradiated with excitation light of a fluorescent dye to detect fluorescence emitted from the cells.
  • a cell in which fluorescence due to the fluorescent dye (first fluorescent dye) is detected (positive) is identified as a HER2-positive cancer cell.
  • Detected HER2-positive cancer cells can then be analyzed for DNA, RNA or protein.
  • the cells used may be collected from blood or lymph, or may be collected from tissue.
  • CTC circulating tumor cells
  • blood collected from a subject can be used as it is, or blood diluted with a buffer solution such as PBS or other suitable medium can be used.
  • the blood sample may be added with additives that are usually added to blood samples, such as anticoagulants and fixatives.
  • the cells can be collected from blood by, for example, filtering a blood sample with a filter and capturing the cells in the blood sample on the filter.
  • HER2-positive cancer cells can be detected directly on the filter. That is, all the steps in the present invention (including the optional steps described below) can be performed on the cells captured on the filter. “Capture” means that the liquid containing the cells is filtered through, leaving the cells on the filter.
  • the cell can be contacted with the reaction solution or the washing solution by filtering the solution with a filter.
  • the solution flow rate is preferably 50 ⁇ L / min to 3000 ⁇ L / min, more preferably 100 ⁇ L / min to 1000 ⁇ L / min, and 200 ⁇ L / min to 600 ⁇ L / min in order to minimize damage to cells during filtration. Further preferred.
  • the filter is not particularly limited as long as it can capture CTC present in the blood sample, and a conventionally known filter can be used.
  • the filter may be, for example, a metal filter, and preferably has a through hole having a pore diameter of 5 ⁇ m to 15 ⁇ m, more preferably 6 ⁇ m to 12 ⁇ m, and even more preferably 7 ⁇ m to 10 ⁇ m.
  • the hole diameter of the through hole refers to the maximum value of the diameter of a sphere that can pass through the through hole.
  • leukocytes have the same diameter as CTC, so leukocytes are captured together with CTC on the filter.
  • step (b) an antibody recognizing HER2 binds to a HER2-negative cell, and fluorescence indicating HER2 may be observed from the HER2-negative cell (false positive). From the viewpoint of reducing such false positives and detecting HER2-positive cancer cells more reliably, it is preferable to further perform the following steps (x1) to (x3).
  • a cell is contacted with a primary antibody that recognizes a marker protein of leukocytes, and then a secondary antibody that recognizes the primary antibody and is labeled with a second fluorescent dye is contacted .
  • leukocytes are fluorescently labeled.
  • Leukocyte fluorescent labeling can be performed in two steps as described above, but may be performed in one step. That is, leukocytes may be fluorescently labeled in one step by contacting cells with antibodies that recognize leukocyte marker proteins and labeled with a second fluorescent dye.
  • Leukocyte marker protein is, for example, CD45 expressed in all hematopoietic stem cells.
  • a primary antibody that recognizes a leukocyte marker protein, a secondary antibody that is labeled with a second fluorescent dye, and an antibody that recognizes a leukocyte marker protein and is labeled with a second fluorescent dye It is not limited, A polyclonal antibody or a monoclonal antibody may be sufficient.
  • the animal from which the antibody is derived is not particularly limited as long as the animal from which the primary antibody is derived is different from the animal from which the secondary antibody is derived.
  • the second fluorescent dye is not particularly limited as long as it is a fluorescent dye usually used for fluorescent labeling of antibodies.
  • the second fluorescent dye is a fluorescent dye different from the first, third and fourth fluorescent dyes. Each fluorescent dye is distinguishable because it has a different fluorescence wavelength.
  • the second fluorescent dye is, for example, Alexa Fluor (registered trademark) 594.
  • step (x2) the cell is contacted with an antibody that recognizes a marker protein of epithelial cells and labeled with a third fluorescent dye.
  • CTC is fluorescently labeled.
  • epithelial cell marker proteins examples include cytokeratin, epithelial cell adhesion molecule (EpCAM), CD146, and CD176, with cytokeratin being preferred. Since CTC is derived from epithelial cells, it has a marker protein for these epithelial cells.
  • the third fluorescent dye is not particularly limited as long as it is a fluorescent dye usually used for fluorescent labeling of antibodies.
  • the third fluorescent dye is, for example, fluorescein such as fluorescein isothiocyanate (FITC).
  • the antibody that recognizes the marker protein of epithelial cells is not particularly limited, and may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody.
  • the animal from which the antibody recognizing the marker protein of epithelial cells is derived is not limited.
  • the cell nucleus is labeled with a fourth fluorescent dye.
  • the fourth fluorescent dye for labeling the nucleus is not particularly limited as long as it is a fluorescent dye capable of binding to a nucleic acid, and a fluorescent dye usually used for fluorescently labeling a nucleus can be used.
  • Examples of the fourth fluorescent dye include 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) and 2 ′-(4-ethoxyphenyl) -5- (4-methyl-1-piperazinyl) -2,5. And '-bi-1H-benzimidazole trihydrochloride (Hoechst 33342).
  • Steps (x1) to (x3) can be performed at any stage before step (c) and can be performed in any order.
  • the process may be performed in the order of the process (x1), the process (a), the process (b), the process (x2), the process (x3), and the process (c).
  • the process (x2) and the process (x3) May be performed simultaneously.
  • step (c) the cells are irradiated with excitation light of the first, second, third and fourth fluorescent dyes, respectively, and the first and second emitted from the cells.
  • the fluorescence of the second, third and fourth fluorescent dyes is detected.
  • HER2 is labeled with first, third, and fourth fluorescent dyes. Accordingly, cells in which fluorescence from the second fluorescent dye is not detected (negative) and fluorescence from the first, third, and fourth fluorescent dyes are detected (positive) are identified as HER2-positive CTCs.
  • the cartridge shown in FIGS. 1 and 2 can be used.
  • a method for detecting HER2-positive cancer cells in a blood sample using a cartridge according to an embodiment of the present invention will be described. Unless otherwise stated, the details of each step and the order of the steps are as described in the above embodiment.
  • a CTC capturing cartridge (cartridge) 100 shown in FIGS. 1 and 2 has a housing having an inlet 130 to which an inflow pipe 125 into which liquid flows is connected and an outlet 140 to which an outflow pipe 135 from which liquid flows out is connected.
  • a body 120 and a filter 105 are provided.
  • the filter 105 is fixed by a casing 120 including an upper member 110 and a lower member 115.
  • the blood sample, the cleaning liquid, and other reaction liquids are introduced into the housing 120 through the inflow pipe 125, and are discharged to the outside through the filter 105 through the outflow pipe 135.
  • Such a liquid flow can be created, for example, by connecting a pump upstream of the inflow pipe 125 or downstream of the outflow pipe 135.
  • a cock may be provided upstream of the inflow pipe 125 and / or downstream of the outflow pipe 135 to control the flow of the liquid.
  • a blood sample is introduced into the cartridge 100 from the inflow tube 125, and the blood sample is filtered by the filter 105.
  • White blood cells and CTC in the blood sample cannot pass through the through hole 106 of the filter 105 and remain on the surface of the filter 105.
  • Other components in the blood sample pass through the through hole 106 and are discharged out of the cartridge 100.
  • the filter 105 may be cleaned by passing a cleaning solution through the filter 105.
  • the filter 105 can be appropriately washed after the following steps.
  • a reaction solution containing a fixing agent and then a permeabilizing agent is introduced into the cartridge 100 and held in the cartridge 100 for a predetermined time, whereby the cells, the fixing agent, The permeation treatment agent can be reacted with each other (step (a)).
  • a reaction solution containing a primary antibody that recognizes an intracellular epitope of HER2 and then a reaction solution containing a secondary antibody that recognizes the primary antibody and is labeled with a fluorescent dye are respectively filtered by a filter 105. It reacts with the cells trapped above (step (b)).
  • the fluorescence emitted from the cells captured on the filter 105 is detected by irradiating the cartridge 100 with excitation light of a fluorescent dye using a fluorescence microscope (step (c)).
  • the fluorescence is detected by, for example, observing the cartridge 100 from the upper surface in the vertical direction of the cartridge 100 and processing the fluorescence observation image.
  • the steps (x1) to (X3) can be optionally performed.
  • Example 1 SKBR3 (HER2 positive), a cell line derived from human breast cancer, contained in a culture flask was cultured at 37 ° C. in a carbon dioxide incubator. Trypsin-EDTA with a concentration of 0.25% was added to the culture flask, and the cultured cells attached to the flask were detached from the flask. The detached cells were counted using a hemocytometer and a phase contrast microscope, 1.0 ⁇ 10 6 cells were added to a centrifuge tube, and a PBS solution containing 0.5% BSA and 2 mM EDTA ( Hereinafter, it was suspended in “washing solution”.
  • the centrifuge tube was centrifuged at a centrifugal force of 400 ⁇ g, and the supernatant was removed.
  • a reaction solution containing 1.25 mL of an anti-human CD45 mouse monoclonal antibody (clone: 2D1) was added to the pellet in the centrifuge tube and reacted at room temperature for 30 minutes. After removing the reaction solution by centrifugation, 1.40 mL of washing solution was added to wash the pellet. After removing the washing solution by centrifugation, a reaction solution containing 1.25 mL of Alexa Fluor (registered trademark) 594-labeled anti-mouse IgG goat polyclonal antibody was added and reacted at room temperature for 30 minutes. After removing the reaction solution by centrifugation, 1.40 mL of washing solution was added to wash the pellet.
  • Alexa Fluor registered trademark
  • a reaction solution containing 1.25 mL of anti-human HER2 rabbit monoclonal antibody (clone: 4B5) was added and reacted at room temperature for 30 minutes. After removing the reaction solution by centrifugation, 1.40 mL of washing solution was added to wash the pellet. After removing the washing solution by centrifugation, a reaction solution containing 1.25 mL of Alexa Fluor (registered trademark) 647-labeled anti-rabbit IgG goat polyclonal antibody was added and reacted at room temperature for 30 minutes. After removing the reaction solution by centrifugation, 1.40 mL of washing solution was added to wash the pellet.
  • Alexa Fluor registered trademark
  • Example 2 An experiment was conducted in the same manner as in Example 1 except that the clone of the anti-human HER2 rabbit monoclonal antibody was changed to EP1045Y, and the fluorescence intensity of the cells was analyzed.
  • Example 3 A clone of the anti-human HER2 rabbit monoclonal antibody The experiment was performed in the same manner as in Example 1 except that the cell was changed to 929.9, and the fluorescence intensity of the cells was analyzed.
  • Example 1 An experiment was conducted in the same manner as in Example 1 except that the clone of the anti-human HER2 rabbit monoclonal antibody was changed to SP3, and the fluorescence intensity of the cells was analyzed.
  • the antibody derived from clone SP3 is an antibody that recognizes an extracellular epitope of HER2.
  • Examples 1 to 3 and Comparative Examples 1 and 2 are shown in Table 1 and FIG. Since SKBR3 is a HER2-positive cancer cell line, fluorescence images of DAPI (nuclear) positive, FITC (cytokeratin) positive, Alexa Fluor594 (CD45) negative, and Alexa Fluor647 (HER2) positive should be obtained. Here, “positive” and “negative” are determined by the intensity of fluorescence luminance (RFU). In Examples 1 to 3, since an antibody that recognizes an intracellular epitope of HER2 was used, and the cells were immobilized and permeabilized before HER2 fluorescent labeling, the fluorescence intensity of Alexa Fluor 647 was compared with Comparative Example 1.
  • SKBR3 which is much larger and positive for HER2, could be detected with high sensitivity.
  • the fluorescence intensity of Alexa Fluor 647 in Comparative Example 1 using an antibody that recognizes an extracellular epitope of HER2 and Comparative Example 2 in which cells were immobilized and permeabilized after HER2 fluorescence labeling was small, and SKBR3 was It could not be detected.
  • Example 4 Experiments were conducted in the same manner as in Example 1 except that the cell line derived from human breast cancer was changed to MDA-MB-231 (HER2 negative), and the fluorescence intensity of the cells was analyzed.
  • Example 5 An experiment was conducted in the same manner as in Example 2 except that the cell line was changed to MDA-MB-231, and the fluorescence intensity of the cells was analyzed.
  • Example 6 An experiment was conducted in the same manner as in Example 3 except that the cell line was changed to MDA-MB-231, and the fluorescence intensity of the cells was analyzed.
  • Comparative Example 3 An experiment was conducted in the same manner as in Comparative Example 1 except that the cell line was changed to MDA-MB-231, and the fluorescence intensity of the cells was analyzed.
  • Comparative Example 4 Experiments were conducted in the same manner as in Comparative Example 2 except that the cell line was changed to MDA-MB-231, and the fluorescence intensity of the cells was analyzed.
  • MDA-MB-231 is a HER2-negative cancer cell line
  • fluorescence images of DAPI (nuclear) positive, FITC (cytokeratin) positive, Alexa Fluor594 (CD45) negative, and Alexa Fluor647 (HER2) negative are obtained. It should be.
  • the fluorescence intensity of Alexa Fluor 647 was weak in all examples and comparative examples.
  • SKBR3 (HER2 positive), a cell line derived from human breast cancer, contained in a culture flask was cultured at 37 ° C. in a carbon dioxide incubator. Trypsin-EDTA with a concentration of 0.25% was added to the culture flask, and the cultured cells attached to the flask were detached from the flask. The detached cells were counted using a hemocytometer and a phase contrast microscope.
  • a blood sample was prepared by adding 10,000 cells to the blood of a healthy person collected in a blood collection tube. As a blood collection tube, a Cell-Free DNA block collection tube manufactured by Streck was used.
  • HER2-positive cancer in the above blood sample using a CTC capture cartridge in which a thin-film metal filter (membrane area 6 mm ⁇ 6 mm, film thickness 18 ⁇ m) having many through-holes having a major axis of 100 ⁇ m and a minor axis of 8 ⁇ m is incorporated in the cartridge.
  • Cells were detected as follows.
  • the CTC capture cartridge corresponds to the cartridge 100 described in the above embodiment.
  • the CTC capture device includes a reservoir for introducing a blood sample and other reaction solutions.
  • the cartridge was filled with a PBS solution containing 0.5% BSA and 2 mM EDTA (hereinafter referred to as “cleaning solution”). 7 mL of the washing solution was placed in the reservoir, and 3 mL of the blood sample was added under the washing solution so that the blood sample and the washing solution were layered.
  • the CTC capture device was activated, the blood sample and the washing solution in the reservoir were introduced into the cartridge at a flow rate of 600 ⁇ L / min, and the white blood cells in the blood sample were captured on the filter.
  • a washing solution was introduced into the cartridge to wash away blood components remaining on the filter.
  • a reaction solution containing 1.25 mL of anti-human CD45 mouse monoclonal antibody (clone: 2D1) was introduced into the cartridge at a flow rate of 200 ⁇ L / min and reacted at room temperature for 30 minutes.
  • 1.40 mL of the washing solution was introduced into the cartridge at a flow rate of 400 ⁇ L / min, and the reaction solution in the cartridge was discharged.
  • a reaction solution containing 1.25 mL of Alexa Fluor (registered trademark) 594-labeled anti-mouse IgG goat polyclonal antibody was introduced into the cartridge at a flow rate of 400 ⁇ L / min and reacted at room temperature for 30 minutes.
  • 1.40 mL of the washing solution was introduced into the cartridge at a flow rate of 400 ⁇ L / min, and the reaction solution in the cartridge was discharged.
  • a reaction solution containing 1.25 mL of anti-human HER2 rabbit monoclonal antibody (clone: K.929.9) was introduced into the cartridge at a flow rate of 400 ⁇ L / min and reacted at room temperature for 30 minutes.
  • 1.40 mL of the washing solution was introduced into the cartridge at a flow rate of 400 ⁇ L / min, and the reaction solution in the cartridge was discharged.
  • a reaction solution containing 1.25 mL of Alexa Fluor (registered trademark) 647-labeled anti-rabbit IgG goat polyclonal antibody was introduced into the cartridge at a flow rate of 400 ⁇ L / min and reacted at room temperature for 30 minutes.
  • 1.40 mL of the washing solution was introduced into the cartridge at a flow rate of 400 ⁇ L / min, and the reaction solution in the cartridge was discharged.
  • a reaction solution containing FITC-labeled anti-human cytokeratin mouse monoclonal antibody (clone: mixture of CK3 / 6H5 / AE1 / AE3), DAPI, and washing solution is introduced into the cartridge at 400 ⁇ L / min, and 30 at room temperature. It was made to react for minutes. 3.00 mL of the cleaning solution was introduced into the cartridge at a flow rate of 400 ⁇ L / min, and the reaction solution in the cartridge was discharged. The cartridge was then removed from the CTC capture device.
  • the cartridge was set on a fluorescence microscope. Using fluorescent mirror units, fluorescent dyes on cells (FITC, Alexa Fluor594, Alexa Fluor647, and DAPI) were each excited. Fluorescence emitted from each fluorescent dye was photographed, and each fluorescence brightness was analyzed from the obtained image using Columnbus (manufactured by PerkinElmer) as image analysis software. More specifically, first, the nuclear region of each cell is recognized by DAPI fluorescence, and then the cytoplasmic region of each cell is identified by the fluorescence of FITC, Alexa Fluor 594, and Alexa Fluor 647 around the recognized nuclear region. Recognized. The average luminance in the recognized nucleus region was defined as the fluorescence luminance of DAPI, and the average luminance in the recognized cytoplasm region was defined as the fluorescence luminance of other fluorescent dyes.
  • Example 8 Experiments were conducted in the same manner as in Example 7 except that the cell line derived from human breast cancer was changed to MDA-MB-231 (HER2 negative), and the fluorescence intensity of the cells was analyzed.
  • Example 9 Experiments were conducted in the same manner as in Example 7 except that the blood collection tube was changed to a blood collection tube containing EDTA-2K (ethylenediaminetetraacetic acid dipotassium salt) manufactured by Becton Dickinson & Company, and the fluorescence intensity of the cells was analyzed.
  • EDTA-2K ethylenediaminetetraacetic acid dipotassium salt
  • Example 10 Experiments were conducted in the same manner as in Example 9 except that the human breast cancer-derived cell line was changed to ZR-75-1 (HER2 positive), and the fluorescence intensity of the cells was analyzed.
  • Example 11 Experiments were conducted in the same manner as in Example 9 except that the human breast cancer-derived cell line was changed to MDA-MB-231 (HER2 negative), and the fluorescence intensity of the cells was analyzed.
  • Table 3 shows the results of Examples 7 to 11. The results for Examples 9 to 11 are also shown in FIG. Since SKBR3 is a cell line that overexpresses HER2, Alexa Fluor647 has the strongest trend luminance (Examples 7 and 9). ZR-75-1 overexpresses HER2, but because the degree of expression is not as high as SKBR3, the trend luminance was not as high as SKBR3 (Example 10). Since MDA-MB-231 is a HER2-negative cell line, Alexa Fluor 647 has a low tendency luminance (Examples 8 and 11). According to the method of the present invention, it was shown that HER2-positive cancer cells can be detected with a fluorescence luminance corresponding to the expression level of HER2.

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Abstract

ＨＥＲ２陽性癌細胞を検出する方法であって、（ａ）細胞を固定化し、次いで透過処理する工程と、（ｂ）細胞に、ＨＥＲ２の細胞内エピトープを認識する一次抗体を接触させ、次いで一次抗体を認識する二次抗体であって蛍光色素で標識されている二次抗体を接触させる工程と、（ｃ）細胞に、蛍光色素の励起光を照射して、細胞から発せられる蛍光を検出する工程と、を備える方法を提供する。かかる方法によれば、ＨＥＲ２陽性癌細胞を高い感度で検出することができる。

Description

ＨＥＲ２陽性癌細胞の検出方法
　本発明は、ＨＥＲ２陽性癌細胞の検出方法に関する。
　癌の治療方法の一つとして「分子標的療法」が知られている。分子標的療法は、癌細胞で過剰に発現している癌関連物質（マーカータンパク質）に特異的に作用するため、副作用が少ない傾向にある。マーカータンパク質の例として、ＨＥＲ２（Ｈｕｍａｎ　Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　２）と呼ばれる受容体型チロシンキナーゼが挙げられ、ＨＥＲ２を標的とする分子標的薬「トラスツズマブ」が実用化されている。トラスツズマブは、ＨＥＲ２が過剰に発現している（ＨＥＲ２陽性）癌細胞を有する患者に対して劇的に奏効することが報告されている。トラスツズマブのようなＨＥＲ２を標的とする抗癌剤の奏効性を、実際に抗癌剤を投与する前に確認するために、患者の癌細胞におけるＨＥＲ２の過剰発現を検出する必要性は高い。
　ＨＥＲ２陽性癌細胞の検出は、ＨＥＲ２を認識する蛍光標識された抗体を細胞に反応させ、この蛍光を検出することにより行うことができる（例えば、特許文献１）。
特開２００８－１１６４６６号公報
　本発明者らが、ＨＥＲ２陽性癌細胞を蛍光標識して、その検出を試みたところ、ＨＥＲ２を示す蛍光が検出されないか、検出されても蛍光輝度が弱く、ＨＥＲ２陽性癌細胞を検出できない場合があった。
　このような状況に鑑み、本発明者らは鋭意検討を行った結果、細胞を固定化及び透過処理した後に、特定の抗体を用いてＨＥＲ２陽性癌細胞を蛍光標識することで、高い感度でＨＥＲ２陽性癌細胞を検出することができることを見出し、本発明を完成させるに至った。
　すなわち、本発明は、ＨＥＲ２陽性癌細胞を検出する方法であって、（ａ）細胞を固定化し、次いで透過処理する工程と、（ｂ）細胞にＨＥＲ２の細胞内エピトープを認識する一次抗体を接触させ、次いで一次抗体を認識する二次抗体であって蛍光色素で標識されている二次抗体を接触させる工程と、（ｃ）細胞に、蛍光色素の励起光を照射して、細胞から発せられる蛍光を検出する工程と、を備える方法を提供する。
　細胞は血液試料から採取された細胞であってよい。上記蛍光色素は第一の蛍光色素であってよく、工程（ｃ）の前の任意の段階で、（ｘ１）細胞に、白血球のマーカータンパク質を認識する一次抗体を接触させ、次いで一次抗体を認識する二次抗体であって第二の蛍光色素で標識されている二次抗体を接触させる工程と、（ｘ２）細胞に、上皮細胞のマーカータンパク質を認識する抗体であって第三の蛍光色素で標識されている抗体を接触させる工程と、（ｘ３）細胞の核を第四の蛍光色素で標識する工程と、を任意の順でさらに行うことができる。この場合、工程（ｃ）においては、細胞に、第一、第二、第三及び第四の蛍光色素の励起光をそれぞれ照射して、細胞から発せられる第一、第二、第三及び第四の蛍光色素の蛍光をそれぞれ検出する。
　ＨＥＲ２を認識する一次抗体は、４Ｂ５、ＥＰ１０４５Ｙ、及びＫ．９２９．９からなる群より選ばれるクローンに由来してもよい。細胞は、血液試料をフィルターでろ過することによりフィルター上に捕捉された細胞であってよい。工程（ｘ１）を工程（ａ）の前に行い、工程（ｘ２）及び工程（Ｘ３）を工程（ａ）の後に行ってもよい。白血球のマーカータンパク質はＣＤ４５であってよい。上皮細胞のマーカータンパク質はサイトケラチンであってよい。ＨＥＲ２陽性癌細胞は乳癌由来であってよい。
　本発明によれば、ＨＥＲ２陽性癌細胞を高い感度で検出することができる。
細胞捕捉カートリッジの一実施形態を示す斜視図である。 図１におけるＩＩ－ＩＩ線断面図である。 試験例１において蛍光標識された細胞の画像である。 試験例１において蛍光標識された細胞の画像である。 試験例２において蛍光標識された細胞の画像である。
　本発明のＨＥＲ２陽性癌細胞を検出する方法は、（ａ）細胞を固定化し、次いで透過処理する工程と、（ｂ）細胞に、ＨＥＲ２の細胞内エピトープを認識する一次抗体を接触させ、次いで一次抗体を認識する二次抗体であって蛍光色素で標識されている二次抗体を接触させる工程と、（ｃ）細胞に、蛍光色素の励起光を照射して、細胞から発せられる蛍光を検出する工程と、を備える。この方法によれば、例えば、乳癌、肺癌、胃癌、唾液腺癌又は卵巣癌に由来するＨＥＲ２陽性癌細胞を検出することができる。細胞に物質を「接触させる」ことは、例えば、細胞をその物質若しくはその物質の溶液に浸すことにより行うことができる。
　工程（ａ）では、まず、ＨＥＲ２陽性癌細胞を含む可能性のある細胞を固定化する。ホルムアルデヒド等の公知の固定剤を細胞に接触させることで、細胞を固定化できる。細胞を固定化することにより、細胞の腐敗又は凝集をより軽減することができる。
　固定化した細胞を、次いで透過処理する。公知の透過処理剤を細胞に接触させることで、細胞を透過処理することができる。透過処理剤としては、例えば、ポリ（オキシエチレン）オクチルフェニルエーテルを使用することができる。
　工程（ａ）の後、細胞を洗浄してもよい。洗浄工程は、例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等の既知の緩衝液を含む洗浄液を、細胞に接触させることで行う。洗浄液には、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）又はエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等の添加物が含まれていてよい。洗浄は、工程（ａ）の後に限らず、各工程の後に適宜行うことができる。細胞を固定化した後、透過処理する前に、洗浄工程を行ってもよい。
　工程（ｂ）では、細胞に、ＨＥＲ２の細胞内エピトープを認識する一次抗体を接触させ、次いで一次抗体を認識する二次抗体であって蛍光色素（第一の蛍光色素）で標識されている二次抗体を接触させる。この工程により、ＨＥＲ２が蛍光標識される。ＨＥＲ２の蛍光標識は、上記のように二段階で行うことができるが、一段階で行ってもよい。すなわち、細胞に、ＨＥＲ２の細胞内エピトープを認識する抗体であって蛍光色素で標識されている抗体を接触させることによって、ＨＥＲ２を一段階で蛍光標識してもよい。
　ＨＥＲ２の細胞内エピトープを認識する一次抗体又はＨＥＲ２の細胞内エピトープを認識する抗体であって第一の蛍光色素で標識されている抗体は、Ｋ．９２９．９、４Ｂ５、ＥＰ１０４５Ｙ、Ｄ８Ｆ１２、６Ｂ１２、ＨＲＢ２／４５１、２９Ｄ８、４Ｆ１０、３Ｂ５、及びＣＢ１１からなる群より選ばれるクローンに由来することが好ましく、Ｋ．９２９．９、４Ｂ５、及びＥＰ１０４５Ｙからなる群より選ばれるクローンに由来することがより好ましい。これらのクローンに由来する抗体を使用することで、より高い感度でＨＥＲ２陽性癌細胞を検出することができる。Ｋ．９２９．９、４Ｂ５、又はＥＰ１０４５Ｙに由来する抗体は、いずれも抗ＨＥＲ２ウサギモノクローナル抗体である。
　蛍光色素（第一の蛍光色素）は、抗体の蛍光標識に通常使用される蛍光色素であれば特に限定されない。第一の蛍光色素は、例えば、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７である。
　最後に、工程（ｃ）において、細胞に蛍光色素の励起光を照射して、細胞から発せられる蛍光を検出する。蛍光色素（第一の蛍光色素）による蛍光が検出される（陽性）細胞が、ＨＥＲ２陽性癌細胞として同定される。
　検出されたＨＥＲ２陽性癌細胞に、その後、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はタンパク質の解析を行うことができる。例えば、検出されたＨＥＲ２陽性癌細胞に対し、シークエンサー、次世代シークエンサー、ＤＮＡチップ、マイクロアレイ、比較ゲノムハイブリダイゼーション、蛍光インサイツハイブリダイゼーション、デジタルＰＣＲ、定量逆転写ＰＣＲ、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンプロッティング、ＴＯＦ－ＭＳ、ＭＡＬＤＩ－ＭＳ、ラマン分光スペクトル、クロマトグラフィー、Ｘ線結晶解析、二次元電気泳動、核磁気共鳴分光法、又はフローサイトメーター（ＦＣＭ）等を利用した解析を行うことができる。
　本発明の検出方法において、使用する細胞は、血液又はリンパ液から採取されたものであってよく、組織から採取されたものであってもよい。癌患者の血液中には、血中循環癌細胞（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ　Ｔｕｍｏｒ　Ｃｅｌｌ、以下、「ＣＴＣ」ともいう。）と呼ばれ、血管及びリンパ管を通じて体内を循環する癌細胞が存在する場合がある。ＨＥＲ２を過剰に発現するＣＴＣを検出することは、癌を早期に、かつ効果的に治療するのに有効である。
　以下、本発明の一実施形態であって、血液試料中のＨＥＲ２陽性癌細胞を検出する方法について述べる。この実施形態では、血液から採取した細胞に対して、上記工程（ａ）～（ｃ）を行う。
　血液試料としては、被験者から採取した血液をそのまま使用することもできるし、ＰＢＳ等の緩衝液又はその他適当な媒体で希釈された血液を使用することもできる。血液試料には、抗凝固剤及び固定剤等、通常血液試料に添加される添加剤が添加されていてもよい。
　細胞は、例えば、血液試料をフィルターでろ過して、フィルター上に血液試料中の細胞を捕捉することで、血液から採取することができる。フィルターにより血液中の細胞を採取する場合、ＨＥＲ２陽性癌細胞の検出は、そのままフィルター上で行うことができる。すなわち、本発明における全ての工程（以下に述べる任意工程を含む）は、フィルター上に捕捉された細胞に対して行うことができる。「捕捉」とは、細胞を含有する液体をフィルターでろ過して、細胞をフィルター上に残留させることを意味する。
　細胞に反応液又は洗浄液を接触させることは、これらの溶液をフィルターでろ過することにより行うことができる。ろ過の際、細胞へのダメージを最小限に抑える点から、溶液の流速は、５０μＬ／分～３０００μＬ／分が好ましく、１００μＬ／分～１０００μＬ／分がより好ましく、２００μＬ／分～６００μＬ／分がさらに好ましい。
　フィルターは、血液試料中に存在するＣＴＣを捕捉できるフィルターであれば特に限定されず、従来公知のフィルターを使用できる。フィルターは、例えば、金属製のフィルターであってよく、好ましくは５μｍ～１５μｍ、より好ましくは６μｍ～１２μｍ、さらに好ましくは７μｍ～１０μｍの孔径の貫通孔を有する。貫通孔の孔径は、貫通孔を通過できる球の直径の最大値をいう。血液中に含まれる細胞のうち、白血球はＣＴＣと同程度の直径を有するため、フィルター上にはＣＴＣとともに白血球が捕捉される。
　癌患者の血液中には、ＨＥＲ２陽性のＣＴＣの他に、ＨＥＲ２陰性のＣＴＣ及び白血球等のその他の細胞が多数存在する。このため、工程（ｂ）において、ＨＥＲ２を認識する抗体がＨＥＲ２陰性の細胞に結合し、ＨＥＲ２陰性の細胞からＨＥＲ２を示す蛍光が観察される場合がある（偽陽性）。このような偽陽性を減らし、より確実にＨＥＲ２陽性癌細胞を検出する点から、次の工程（ｘ１）～（ｘ３）をさらに行うことが好ましい。
　工程（ｘ１）では、細胞に、白血球のマーカータンパク質を認識する一次抗体を接触させ、次いで一次抗体を認識する二次抗体であって第二の蛍光色素で標識されている二次抗体を接触させる。この工程により、白血球が蛍光標識される。白血球の蛍光標識は、上記のように二段階で行うことができるが、一段階で行ってもよい。すなわち、細胞に、白血球のマーカータンパク質を認識する抗体であって第二の蛍光色素で標識されている抗体を接触させることによって、白血球を一段階で蛍光標識してもよい。
　白血球のマーカータンパク質は、例えば、全造血幹細胞に発現するＣＤ４５である。
　白血球のマーカータンパク質を認識する一次抗体、第二の蛍光色素で標識されている二次抗体、及び白血球のマーカータンパク質を認識する抗体であって第二の蛍光色素で標識されている抗体は、特に限定されず、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体であってよい。抗体が由来する動物は、一次抗体が由来する動物と二次抗体が由来する動物とが異なる動物である限り、特に限定されない。
　第二の蛍光色素は、抗体の蛍光標識に通常使用される蛍光色素であれば特に限定されない。第二の蛍光色素は、第一、第三及び第四の蛍光色素とは別の蛍光色素である。各蛍光色素は異なる蛍光波長を有するため、識別可能である。第二の蛍光色素は、例えば、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４である。
　工程（ｘ２）では、細胞に、上皮細胞のマーカータンパク質を認識する抗体であって第三の蛍光色素で標識されている抗体を接触させる。この工程により、ＣＴＣが蛍光標識される。
　上皮細胞のマーカータンパク質としては、例えば、サイトケラチン、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、ＣＤ１４６、及びＣＤ１７６が挙げられ、サイトケラチンが好ましい。ＣＴＣは上皮細胞に由来するため、これら上皮細胞のマーカータンパク質を有する。
　第三の蛍光色素は、抗体の蛍光標識に通常使用される蛍光色素であれば特に限定されない。第三の蛍光色素は、例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）等のフルオレセインである。
　上皮細胞のマーカータンパク質を認識する抗体は、特に限定されず、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体であってよい。上皮細胞のマーカータンパク質を認識する抗体の由来となる動物は限定されない。
　工程（ｘ３）では、細胞の核を第四の蛍光色素で標識する。核を標識する第四の蛍光色素は、核酸に結合することができる蛍光色素であれば特に限定されず、核を蛍光標識するのに通常用いられる蛍光色素を使用することができる。第四の蛍光色素としては、例えば、４′，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）及び２′－（４－エトキシフェニル）－５－（４－メチル－１－ピペラジニル）－２，５′－ビ－１Ｈ－ベンゾイミダゾール三塩酸塩（Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２）が挙げられる。
　工程（ｘ１）～（ｘ３）は、工程（ｃ）の前の任意の段階で行うことができ、かつ、任意の順で行うことができる。例えば、工程（ｘ１）、工程（ａ）、工程（ｂ）、工程（ｘ２）、工程（ｘ３）、工程（ｃ）の順で工程を行ってもよく、工程（ｘ２）及び工程（ｘ３）は同時に行ってもよい。
　任意であるこれらの工程を行う場合、工程（ｃ）では、細胞に、第一、第二、第三及び第四の蛍光色素の励起光をそれぞれ照射して、細胞から発せられる第一、第二、第三及び第四の蛍光色素の蛍光をそれぞれ検出する。ＨＥＲ２は第一、第三、及び第四の蛍光色素で標識されている。したがって、第二の蛍光色素による蛍光が検出されず（陰性）、第一、第三、及び第四の蛍光色素による蛍光が検出される（陽性）細胞が、ＨＥＲ２陽性のＣＴＣとして同定される。
　上記の方法で血液試料中のＨＥＲ２陽性のＣＴＣを検出するときは、例えば、図１及び図２に示すカートリッジを用いることができる。以下、本発明の一実施形態であって、カートリッジを使用して血液試料中のＨＥＲ２陽性癌細胞を検出する方法について述べる。別段の記載がない限り、各工程についての詳細及び工程の順番は、上記実施形態で述べたとおりである。
　図１及び図２に示すＣＴＣ捕捉カートリッジ（カートリッジ）１００は、液体が流入する流入管１２５が接続された流入口１３０と、液体が流出する流出管１３５が接続された流出口１４０とを有する筐体１２０と、フィルター１０５とを備える。フィルター１０５は、上部部材１１０及び下部部材１１５から構成される筐体１２０により固定されている。血液試料、洗浄液及びその他の反応液は、流入管１２５を通って筐体１２０の内部に導入され、フィルター１０５を通って、流出管１３５から外部に排出される。このような液体の流れは、例えば、流入管１２５の上流又は流出管１３５の下流にポンプを接続することにより作り出すことができる。また、流入管１２５の上流及び／又は流出管１３５の下流にコックを設け、液体の流れを制御してもよい。
　はじめに、血液試料を流入管１２５からカートリッジ１００内に導入して、血液試料をフィルター１０５でろ過する。血液試料中の白血球及びＣＴＣはフィルター１０５の貫通孔１０６を通過できず、フィルター１０５表面に残留する。血液試料中のその他の成分は、貫通孔１０６を通過し、カートリッジ１００の外へと排出される。次いで、洗浄液をフィルター１０５に通液してフィルター１０５を洗浄してもよい。フィルター１０５の洗浄は、以下の各工程の後にも、適宜行うことができる。
　フィルター１０５上に細胞が捕捉された後は、固定剤、次いで透過処理剤を含む反応液を、それぞれカートリッジ１００内に導入して、カートリッジ１００内に所定時間保持することで、細胞と固定剤及び透過処理剤とをそれぞれ反応させることができる（工程（ａ））。同様にして、ＨＥＲ２の細胞内エピトープを認識する一次抗体を含む反応液、次いで一次抗体を認識する二次抗体であって蛍光色素で標識されている二次抗体を含む反応液を、それぞれフィルター１０５上に捕捉された細胞と反応させる（工程（ｂ））。最後に、蛍光顕微鏡を使用して、カートリッジ１００に蛍光色素の励起光を照射して、フィルター１０５上に捕捉された細胞から発せられる蛍光を検出する（工程（ｃ））。蛍光の検出は、例えば、カートリッジ１００の垂直方向上面からカートリッジ１００を観察し、蛍光観察像を処理することにより行う。上記実施形態で述べたとおり、工程（ｘ１）～（Ｘ３）を任意で行うこともできる。
＜試験例１＞
（実施例１）
　培養フラスコに入ったヒト乳癌由来の細胞株であるＳＫＢＲ３（ＨＥＲ２陽性）を、二酸化炭素インキュベーター内で３７℃で培養した。培養フラスコに、濃度０．２５％のトリプシン－ＥＤＴＡを添加し、フラスコに張り付いた培養細胞をフラスコから剥離した。剥離させた細胞を血球計算盤及び位相差顕微鏡を用いて計数し、遠心チューブ中に１．０×１０６個の細胞を添加して、０．５％ＢＳＡ及び２ｍＭ　ＥＤＴＡを含有したＰＢＳ溶液（以下、「洗浄液」という。）で懸濁した。
　遠心チューブを遠心力４００×ｇで遠心し、上清を除去した。遠心チューブ内のペレットに、１．２５ｍＬの抗ヒトＣＤ４５マウスモノクローナル抗体（クローン：２Ｄ１）を含む反応液を添加し、室温にて３０分反応させた。遠心により反応液を除去した後、１．４０ｍＬの洗浄液を添加してペレットを洗浄した。遠心により洗浄液を除去した後、１．２５ｍＬのＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４標識抗マウスＩｇＧヤギポリクロナール抗体を含む反応液を添加し、室温にて３０分反応させた。遠心により反応液を除去した後、１．４０ｍＬの洗浄液を添加してペレットを洗浄した。
　遠心により洗浄液を除去した後、ホルムアルデヒドを０．５質量％～４質量％含有するＰＢＳ溶液を１．２５ｍＬ添加し、室温にて１０分反応させて、細胞を固定化した。遠心により反応液を除去した後、１．４０ｍＬの洗浄液を添加してペレットを洗浄した。
　遠心により洗浄液を除去した後、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００（シグマアルドリッチ社製）を０．０５質量％～０．１質量％含有するＰＢＳ溶液を１．２５ｍＬ添加し、室温にて１０分反応させて、細胞を透過処理した。遠心により反応液を除去した後、１．４０ｍＬの洗浄液を添加してペレットを洗浄した。
　遠心により洗浄液を除去した後、１．２５ｍＬの抗ヒトＨＥＲ２ウサギモノクローナル抗体（クローン：４Ｂ５）含む反応液を添加し、室温にて３０分反応させた。遠心により反応液を除去した後、１．４０ｍＬの洗浄液を添加してペレットを洗浄した。遠心により洗浄液を除去した後、１．２５ｍＬのＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７標識抗ウサギＩｇＧヤギポリクロナール抗体を含む反応液を添加し、室温にて３０分反応させた。遠心により反応液を除去した後、１．４０ｍＬの洗浄液を添加してペレットを洗浄した。
　遠心により洗浄液を除去した後、ＦＩＴＣ標識抗ヒトサイトケラチンマウスモノクロナール抗体（クローン：ＣＫ３／６Ｈ５／ＡＥ１／ＡＥ３の混合物）、ＤＡＰＩ及び洗浄液を含む反応液を１．２５ｍＬ添加し、室温にて３０分反応させた。遠心により反応液を除去した後、３．００ｍＬの洗浄液を添加してペレットを洗浄し、細胞懸濁液を得た。
　得られた細胞懸濁液１０μＬをスライドガラスに滴下し、カバーガラスでカバーをした。スライドガラスを蛍光顕微鏡に設置し、蛍光ミラーユニットを使用して、細胞上の蛍光色素（ＦＩＴＣ、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ５９４、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ６４７、及びＤＡＰＩ）をそれぞれ励起させた。それぞれの蛍光色素から発せられた蛍光を撮影し、得られた画像から、それぞれの蛍光輝度を、画像解析ソフトであるＣｏｌｕｍｂｕｓ（パーキンエルマー社製）を用いて解析した。
（実施例２）
　抗ヒトＨＥＲ２ウサギモノクローナル抗体のクローンをＥＰ１０４５Ｙに変更した以外は実施例１と同様にして実験を行い、細胞の蛍光輝度を解析した。
（実施例３）
　抗ヒトＨＥＲ２ウサギモノクローナル抗体のクローンをＫ．９２９．９に変更した以外は実施例１と同様にして実験を行い、細胞の蛍光輝度を解析した。
（比較例１）
　抗ヒトＨＥＲ２ウサギモノクローナル抗体のクローンをＳＰ３に変更した以外は実施例１と同様にして実験を行い、細胞の蛍光輝度を解析した。クローンＳＰ３に由来する上記抗体は、ＨＥＲ２の細胞外のエピトープを認識する抗体である。
（比較例２）
　細胞を固定化及び透過処理する前に、ＨＥＲ２を蛍光標識した以外は実施例３と同様にして実験を行い、細胞の蛍光輝度を解析した。
　実施例１～３、比較例１及び２の結果を表１及び図３に示す。ＳＫＢＲ３はＨＥＲ２陽性の癌の細胞株であるため、ＤＡＰＩ（核）陽性、ＦＩＴＣ（サイトケラチン）陽性、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ５９４（ＣＤ４５）陰性、かつＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ６４７（ＨＥＲ２）陽性の蛍光画像が得られるはずである。ここで、「陽性」及び「陰性」は、蛍光輝度（ＲＦＵ）の強さにより判定される。実施例１～３では、ＨＥＲ２の細胞内のエピトープを認識する抗体を使用し、かつ、ＨＥＲ２の蛍光標識の前に細胞の固定化及び透過処理を行ったため、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ６４７の蛍光輝度が比較例１及び比較例２と比較して遙かに大きく、ＨＥＲ２陽性であるＳＫＢＲ３を高い感度で検出することができた。ＨＥＲ２の細胞外のエピトープを認識する抗体を使用した比較例１、及びＨＥＲ２の蛍光標識の後に細胞の固定化及び透過処理を行った比較例２におけるＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ６４７の蛍光輝度はいずれも小さく、ＳＫＢＲ３を検出することができなかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
（実施例４）
　ヒト乳癌由来の細胞株をＭＤＡ－ＭＢ－２３１（ＨＥＲ２陰性）に変更した以外は実施例１と同様にして実験を行い、細胞の蛍光輝度を解析した。
（実施例５）
　細胞株をＭＤＡ－ＭＢ－２３１に変更した以外は実施例２と同様にして実験を行い、細胞の蛍光輝度を解析した。
（実施例６）
　細胞株をＭＤＡ－ＭＢ－２３１に変更した以外は実施例３と同様にして実験を行い、細胞の蛍光輝度を解析した。
（比較例３）
　細胞株をＭＤＡ－ＭＢ－２３１に変更した以外は比較例１と同様にして実験を行い、細胞の蛍光輝度を解析した。
（比較例４）
　細胞株をＭＤＡ－ＭＢ－２３１に変更した以外は比較例２と同様にして実験を行い、細胞の蛍光輝度を解析した。
　実施例４～６、比較例３及び４の結果を表２及び図４に示す。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１はＨＥＲ２陰性の癌の細胞株であるため、ＤＡＰＩ（核）陽性、ＦＩＴＣ（サイトケラチン）陽性、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ５９４（ＣＤ４５）陰性、かつＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ６４７（ＨＥＲ２）陰性の蛍光画像が得られるはずである。期待されたとおり、いずれの実施例及び比較例においても、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ６４７の蛍光輝度は弱かった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
＜試験例２＞
（実施例７）
　培養フラスコに入ったヒト乳癌由来の細胞株であるＳＫＢＲ３（ＨＥＲ２陽性）を、二酸化炭素インキュベーター内で３７℃で培養した。培養フラスコに、濃度０．２５％のトリプシン－ＥＤＴＡを添加し、フラスコに張り付いた培養細胞をフラスコから剥離した。剥離させた細胞を血球計算盤及び位相差顕微鏡を用いて計数した。採血管に採血した健常人の血液に、１００００個の細胞を添加することで、血液試料を調製した。採血管は、Ｓｔｒｅｃｋ社製のＣｅｌｌ－Ｆｒｅｅ　ＤＮＡ　ｂｌｏｏｄ　ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ｔｕｂｅを使用した。
　長径１００μｍ、短径８μｍの貫通孔を多数有する薄膜の金属フィルター（膜面積６ｍｍ×６ｍｍ、膜厚１８μｍ）をカートリッジに組み込んだＣＴＣ捕捉カートリッジ（カートリッジ）を用いて、上記血液試料中のＨＥＲ２陽性癌細胞を以下のように検出した。ＣＴＣ捕捉カートリッジは、上記実施形態で説明したカートリッジ１００に相当する。ＣＴＣ捕捉装置は、血液試料及びその他の反応液を導入するリザーバーを備える。
　まず、カートリッジを、０．５％ＢＳＡ及び２ｍＭ　ＥＤＴＡを含有したＰＢＳ溶液（以下、「洗浄液」という。）で満たした。リザーバーに、洗浄液を７ｍＬ入れ、洗浄液の下に、上記血液試料を３ｍＬ、血液試料と洗浄液が層をなすように加えた。ＣＴＣ捕捉装置を作動させ、流速６００μＬ／分でリザーバー中の血液試料及び洗浄液をカートリッジに導入し、血液試料中の白血球をフィルター上に捕捉した。カートリッジに洗浄液を導入し、フィルターに残留した血液成分を洗い流した。
　１．２５ｍＬの抗ヒトＣＤ４５マウスモノクローナル抗体（クローン：２Ｄ１）を含む反応液を流速２００μＬ／分でカートリッジに導入し、室温にて３０分反応させた。１．４０ｍＬの洗浄液を流速４００μＬ／分でカートリッジに導入し、カートリッジ内の上記反応液を排出した。１．２５ｍＬのＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４標識抗マウスＩｇＧヤギポリクロナール抗体を含む反応液を流速４００μＬ／分でカートリッジに導入し、室温にて３０分反応させた。１．４０ｍＬの洗浄液を流速４００μＬ／分でカートリッジに導入し、カートリッジ内の上記反応液を排出した。
　ホルムアルデヒドを０．５質量％～４質量％含有するＰＢＳ溶液１．２５ｍＬを、流速４００μＬ／分でカートリッジに導入し、室温にて１０分反応させて、細胞を固定化した。１．４０ｍＬの洗浄液を流速４００μＬ／分でカートリッジに導入し、カートリッジ内の上記反応液を排出した。
　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００（シグマアルドリッチ社製）を０．０５質量％～０．１質量％含有するＰＢＳ溶液１．２５ｍＬを、流速４００μＬ／分でカートリッジに導入し、室温にて１０分反応させて、細胞を透過処理した。１．４０ｍＬの洗浄液を流速４００μＬ／分でカートリッジに導入し、カートリッジ内の上記反応液を排出した。
　１．２５ｍＬの抗ヒトＨＥＲ２ウサギモノクローナル抗体（クローン：Ｋ．９２９．９）を含む反応液を流速４００μＬ／分でカートリッジに導入し、室温にて３０分反応させた。１．４０ｍＬの洗浄液を流速４００μＬ／分でカートリッジに導入し、カートリッジ内の上記反応液を排出した。１．２５ｍＬのＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７標識抗ウサギＩｇＧヤギポリクロナール抗体を含む反応液を流速４００μＬ／分でカートリッジに導入し、室温にて３０分反応させた。１．４０ｍＬの洗浄液を流速４００μＬ／分でカートリッジに導入し、カートリッジ内の上記反応液を排出した。
　ＦＩＴＣ標識抗ヒトサイトケラチンマウスモノクロナール抗体（クローン：ＣＫ３／６Ｈ５／ＡＥ１／ＡＥ３の混合物）、ＤＡＰＩ、及び洗浄液を含む反応液１．２５ｍＬを、４００μＬ／分でカートリッジに導入し、室温にて３０分反応させた。３．００ｍＬの洗浄液を流速４００μＬ／分でカートリッジに導入し、カートリッジ内の上記反応液を排出した。次いで、カートリッジをＣＴＣ捕捉装置から外した。
　カートリッジを蛍光顕微鏡に設置した。蛍光ミラーユニットを使用して、細胞上の蛍光色素（ＦＩＴＣ、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ５９４、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ６４７、及びＤＡＰＩ）をそれぞれ励起させた。それぞれの蛍光色素から発せられた蛍光を撮影し、得られた画像から、それぞれの蛍光輝度を、画像解析ソフトであるＣｏｌｕｍｂｕｓ（パーキンエルマー社製）を用いて解析した。より具体的には、まず、ＤＡＰＩの蛍光により各細胞の核の領域を認識し、次に認識した核の領域の周辺において、ＦＩＴＣ、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ５９４及びＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ６４７の蛍光により各細胞の細胞質の領域を認識した。認識した核の領域内の平均輝度をＤＡＰＩの蛍光輝度とし、認識した細胞質の領域内の平均輝度をその他の蛍光色素の蛍光輝度とした。
（実施例８）
　ヒト乳癌由来の細胞株をＭＤＡ－ＭＢ－２３１（ＨＥＲ２陰性）に変更した以外は実施例７と同様にして実験を行い、細胞の蛍光輝度を解析した。
（実施例９）
　採血管をベクトン・ディッキンソンアンドカンパニー社製のＥＤＴＡ－２Ｋ（エチレンジアミン四酢酸二カリウム塩）入り採血管に変更した以外は実施例７と同様にして実験を行い、細胞の蛍光輝度を解析した。
（実施例１０）
　ヒト乳癌由来の細胞株をＺＲ－７５－１（ＨＥＲ２陽性）に変更した以外は実施例９と同様にして実験を行い、細胞の蛍光輝度を解析した。
（実施例１１）
　ヒト乳癌由来の細胞株をＭＤＡ－ＭＢ－２３１（ＨＥＲ２陰性）に変更した以外は実施例９と同様にして実験を行い、細胞の蛍光輝度を解析した。
　実施例７～１１の結果を表３示す。また、実施例９～１１については、結果を図５にも示す。ＳＫＢＲ３はＨＥＲ２を過剰に発現する細胞株であるため、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ６４７の傾向輝度が最も強かった（実施例７及び９）。ＺＲ－７５－１はＨＥＲ２を過剰に発現するが、発現の度合いがＳＫＢＲ３ほど高くないため、傾向輝度がＳＫＢＲ３ほど高くなかった（実施例１０）。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１はＨＥＲ２陰性の細胞株であるため、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ６４７の傾向輝度が小さかった（実施例８及び１１）。本発明の方法によれば、ＨＥＲ２の発現量に応じた蛍光輝度で、ＨＥＲ２陽性癌細胞を検出することができることが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　１００…ＣＴＣ捕捉カートリッジ、１０５…フィルター、１０６…貫通孔、１１０…上部部材、１１５…下部部材、１２０…筐体、１２５…流入管、１３０…流入口、１３５…流出管、１４０…流出口。

Claims (8)

  1. 　ＨＥＲ２陽性癌細胞を検出する方法であって、
    　（ａ）細胞を固定化し、次いで透過処理する工程と、
    　（ｂ）細胞に、ＨＥＲ２の細胞内エピトープを認識する一次抗体を接触させ、次いで一次抗体を認識する二次抗体であって蛍光色素で標識されている二次抗体を接触させる工程と、
    　（ｃ）細胞に、蛍光色素の励起光を照射して、細胞から発せられる蛍光を検出する工程と、を備える
    方法。
  2. 　細胞が血液試料から採取された細胞であり、
    　前記蛍光色素が第一の蛍光色素であり、
    　工程（ｃ）の前の任意の段階で、
    （ｘ１）細胞に、白血球のマーカータンパク質を認識する一次抗体を接触させ、次いで一次抗体を認識する二次抗体であって第二の蛍光色素で標識されている二次抗体を接触させる工程と、
    （ｘ２）細胞に、上皮細胞のマーカータンパク質を認識する抗体であって第三の蛍光色素で標識されている抗体を接触させる工程と、
    （ｘ３）細胞の核を第四の蛍光色素で標識する工程と、
    を任意の順でさらに行い、
    　工程（ｃ）において、細胞に、第一、第二、第三及び第四の蛍光色素の励起光をそれぞれ照射して、細胞から発せられる第一、第二、第三及び第四の蛍光色素の蛍光をそれぞれ検出する、請求項１に記載の方法。
  3. 　ＨＥＲ２を認識する一次抗体が、４Ｂ５、ＥＰ１０４５Ｙ、及びＫ．９２９．９からなる群より選ばれるクローンに由来する、請求項２に記載の方法。
  4. 　細胞が、血液試料をフィルターでろ過することによりフィルター上に捕捉された細胞である、請求項２又は３に記載の方法。
  5. 　工程（ｘ１）を工程（ａ）の前に行い、
    　工程（ｘ２）及び工程（Ｘ３）を工程（ａ）の後に行う、請求項２～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 　白血球のマーカータンパク質がＣＤ４５である、請求項２～４のいずれか一項に記載の方法。
  7. 　上皮細胞のマーカータンパク質がサイトケラチンである、請求項２～５のいずれか一項に記載の方法。
  8. 　ＨＥＲ２陽性癌細胞が乳癌由来である、請求項２～６のいずれか一項に記載の方法。
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