JP2015537210A - 循環腫瘍細胞のインビトロでの捕捉および解析 - Google Patents

Abstract

本発明は、セプラーゼ特異的親和性試薬を用いて循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）ならびに様々な派生ＣＴＣ表現型を捕捉するための方法および組成物を提供する。ＣＴＣをインビボおよびインビトロで解析しそれらの転移の可能性を評価する方法も開示する。

Description

本発明は、癌生物学の分野に関し、より具体的には、癌の転移源である循環腫瘍細胞をインビトロで捕捉および解析するための方法および組成物に関する。

癌による死亡の多くは、遠位臓器への転移によるものである。循環腫瘍細胞（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ，ＣＴＣ）は原発腫瘍に由来し、最終的な結果として転移性腫瘍が遠位部位に生じる転移カスケードを引き起こす（Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ：ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ，ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｓｓｕｅｓ，ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｒｅｌｅｖａｎｃｅ，Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１３７：１１５１−１１７３参照）。いくつかの遺伝的、形態学的、免疫学的、および生理学的検査を用いて、ＣＴＣを同定することができる（Ｉｄ．，ａｎｄ Ｍａｎ，ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｃｕｒｒｅｎｔｌｙ ｕｓｅｄ ｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ ＣＴＣ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ-ａｄｖａｎｔａｇｅｓ，ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｉｍｐａｃｔ ｏｎ ｃａｎｃｅｒ ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐｅｒ．Ｐａｔｈｏｌ．１：１参照）。進行転移性疾患を有する患者の末梢血液においてさえＣＴＣの数が正常な血液細胞の数に比べて非常に少ない（１０億個中に１個）ので、ＣＴＣを計数および単離するためには陽性選択を用いるのが一般的な方法である。多くのＣＴＣの細胞膜内で発現する上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）に対する抗体を用いてＣＴＣを捕捉することができる。選択に続き、生細胞を標的とする試薬、白血球に特異的なマーカーおよび腫瘍に特異的なマーカーの組み合わせを用いる免疫染色によってＣＴＣを最終的に同定する。例えば、ＦＤＡに承認されたＣＥＬＬＳＥＡＲＣＨ（登録商標）ＣＴＣ検査（Ｖｅｒｉｄｅｘ，ＬＬＣ，Ｒａｒｉｔａｎ，Ｎ．Ｊ．／ＵＳＡ）は、常磁性ビーズ上に結合した抗ＥｐＣＡＭモノクローナル抗体を使用してＣＴＣを検出し、その後、ＤＡＰＩ、サイトケラチン（ＣＫ）、およびＣＤ４５を使用してＣＴＣを同定する（Ｈａｙｅｓ，Ｄ．Ｆ．ａｎｄ Ｓｍｅｒａｇｅ，Ｊ．（２００８）Ｉｓ ｔｈｅｒｅ ａ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ？ Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１４：３６４６−３６５０；Ｃｒｉｓｔｏｆａｎｉｌｌｉ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ，ｄｉｓｅａｓｅ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ，ａｎｄ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｉｎ ｍｅｓｔａｔｉｃ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ．Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３５１：７８１−７９参照）。しかし、報告によると、このアプローチだとＥｐＣＡＭの発現が低いかあるいは全く発現しない細胞を捕捉しないこと、およびこのアッセイは、転移の場合の感度および特異性が悪いことが示唆されている（Ｌｕ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ａｎｄ ｔｕｍｏｒ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ａｎ ｉｎｖａｓｉｖｅ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｆｒｏｍ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｉｎｔｌ．Ｊ．ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，１２６：６６９−６８３；Ｓｉｅｕｗｅｒｔｓ，Ａ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（２００９）Ａｎｔｉ−ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｎｏｒｍａｌ−ｌｉｋｅ ｂｒｅａｓｔ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ．Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ，１０１：６１−６６参照）。しかし、ＥｐＣＡＭの発現が低いかあるいは全く発現しない細胞も、臨床的に非常に重要である可能性がある。侵襲的な表現型を発現する腫瘍細胞は、上皮間葉移行（ＥＭＴ）と呼ばれるプロセス中に（ＥｐＣＡＭを含む）上皮抗原の下方制御を行い失わせることが示唆されている（Ｍｅｇｏ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ−ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，７：６９３−７０１；Ｂｒａｂｌｅｔｚ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｉｎｖａｓｉｏｎ ａｎｄ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ｉｎ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ：Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ−ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ，ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ−ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ，ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｂｅｔａ−ｃａｔｅｎｉｎ，Ｃｅｌｌ Ｔｉｓｓｕｅｓ Ｏｒｇａｎｓ，１７９：５６−６５；Ｒａｉｍｏｎｄｉ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ−ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｔｅｍｎｅｓｓ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｉｎ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ，Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，１３０：４４９−４５５参照）。ＣＴＣは、上皮の表現型以外の様々な表現型を有する亜集団を含むことも示唆されている。従って、ＥｐＣＡＭのみを標的とすることにより、ＣＴＣの亜集団（特に、ＥｐＣＡＭを発現したとしてもその発現が非常に低い侵襲的な細胞）を全て捕捉しようとする試みはあまり効果がないおそれがある（Ｓａｂｉｌｅ，Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ Ｂｅｒ−ＥＰ４ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｏｒ ｉｓｏｌａｔｉｎｇ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ ｂｅｆｏｒｅ ＲＴ−ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．，１１２：１７１−１７８；Ｔｈｕｒｍ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｒａｒｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｏｎ ｒｅｓｉｄｕａｌ ｍｉｃｒｏｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ａｆｔｅｒ ａｄｊｕｖａｎｔ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，９：２５９８−２６０４参照）。このことは、更に、１ｇの上皮ベースの腫瘍が一日あたり１０⁶個にまで拡散しうるという観察によって裏付けられる（Ｂｕｔｌｅｒ，Ｔ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．（１９７５）Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌ ｓｈｅｄｄｉｎｇ ｉｎｔｏ ｅｆｆｅｒｅｎｔ ｂｌｏｏｄ ｏｆ ｍａｍｍａｒｙ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，３５，５１２−５１６参照）。これらの細胞の全てが転移開始能力を有しているかは明らかでないが、稀で見つけにくい亜集団の一部は転移開始能力を有している。

抗体の組み合わせ、例えば、ＨＥＲ２つまりエストロゲン受容体といった様々な腫瘍マーカーに対する抗体とＣＤ４５抗体との組み合わせを用いてＣＴＣの亜集団を選択することも可能でありうる。典型的な検査が、ＢｉｏＣｅｐｔ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／ＵＳＡ）によって提供されている。しかし、一般的にそのような検査に用いられる抗体カクテルは、不死化細胞株を用いて生成され、このような細胞は実際には患者の腫瘍から放出されたＣＴＣ内で起こる様々な変化を再現していない可能性がある（Ｐｅｃｏｔ，Ｃ．Ｖ．ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ａ ｎｏｖｅｌ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＣＫ＋ａｎｄ ＣＫ−ＣＴＣｓ，Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，１（７）：５８０−５８６参照）。従って、患者試料中に存在する稀で侵襲的なＣＴＣの亜集団を効果的に検出し標的とすることが可能な方法が必要である。

１の実施形態では、本発明は、試料から循環腫瘍細胞を捕捉する方法であって、該試料を、哺乳動物のセプラーゼ標的親和性試薬に接触させることを含む方法である。ここで、該試薬は、必要に応じて固体支持体の表面に固定されている。本実施形態の変形例では、セプラーゼ標的親和性試薬は、セプラーゼの競合的または非競合的阻害剤、セプラーゼの抗体、核酸アプタマー、またはペプチドアプタマー、またはペプチドリガンド、例えば、Ａｃ−Ｇｌｙ−プロリンボロン酸（Ａｃ−Ｇｌｙ−ＢｏｒｏＰｒｏ）またはプロリンジフェニルホスホネート（Ｇｌｙ−ＰｒｏＰ（ＯＰｈ）₂）である。セプラーゼ標的親和性試薬を担持する固体支持体が、マイクロ流体デバイスの一部であってもよい。この方法は、過剰量の可溶性セプラーゼ結合剤またはアビジン化合物の添加、あるいは循環腫瘍細胞に親和性がある試薬を固体表面に結合させる二官能性リンカーの光開裂または酵素分解により、捕捉された循環腫瘍細胞を放出する工程を更に含む。

いくつかの実施形態では、本方法は、捕捉された細胞において、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ１４６、ＣＫ５、ＣＫ７、ＣＫ１８、ＣＫ１９、Ｃｄ４４ｖ６、ＥｐｈＢ４、ＦＡＰ（セプラーゼ）、ＩＧＦ−１Ｒ、ＢＣＬ２、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＣＤ１３３、ＭＵＣ１、Ｎ−カドヘリン、サバイビン、ＥＧＦＲ、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ｐ５３、Ｐｉ３ＫＣＡ、ＰＴＥＮ、ＫＲＴ１９、ＣＤ３４、ＣＤ２４、ＡＣＴ２、ＶＩＭ、ＮＡＮＯＧ、ＣＸＣＲ４およびＴＷＩＳＴ１のうち１つまたは複数のバイオマーカーを検出する工程を更に含む。

別の実施形態では、本発明は、哺乳動物のセプラーゼ標的親和性試薬を用いて患者試料から循環腫瘍細胞を捕捉することにより患者における悪性腫瘍の存在を検出する方法である。患者試料は、全血、体液、任意の細胞含有血液画分、腫瘍断片、腫瘍細胞懸濁液、または患者試料から樹立した細胞培養物、もしくは該培養物の上清、または患者の腫瘍から樹立した異種移植片を含み得る。

さらに別の実施形態では、本発明は、哺乳動物のセプラーゼ標的親和性試薬を用いて患者試料から循環腫瘍細胞を捕捉することにより、腫瘍を保有しているかまたは保有していた患者において転移性腫瘍を発症するリスクを評価する方法である。患者試料は、全血、体液、任意の細胞含有血液画分、腫瘍断片、腫瘍細胞懸濁液、または患者試料から樹立した細胞培養物、もしくは該培養物の上清、または患者の腫瘍から樹立した異種移植片を含み得る。本実施形態の変形例では、本方法は、捕捉された細胞において、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ１４６、ＣＫ５、ＣＫ７、ＣＫ１８、ＣＫ１９、ＣＤ４４、Ｃｄ４４ｖ６、ＥｐｈＢ４、ＩＧＦ−１Ｒ、ＢＣＬ２、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＣＤ１３３、ＭＵＣ１、Ｎ−カドヘリン、サバイビン、ＥＧＦＲ、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ｐ５３、Ｐｉ３ＫＣＡ、ＰＴＥＮ、ＫＲＴ１９、ＣＤ３４、ＣＤ２４、ＡＣＴ２、ＶＩＭ、ＮＡＮＯＧ、ＣＸＣＲ４およびＴＷＩＳＴ１のうち１つまたは複数のバイオマーカーを検出する工程を更に含む。

さらに別の実施形態では、本発明は、液体から選択細胞を捕捉または単離するためのマイクロ流体デバイスであって、該マイクロ流体デバイスは複数の並列チャネルを有する１つまたは複数のモジュールを含み、該チャネルは共通の入口および共通の出口に接続され、該チャネルの内側表面の少なくとも一部は哺乳動物のセプラーゼタンパク質に特異的な捕捉因子と共有結合している、マイクロ流体デバイスである。本実施形態の変形例では、上記捕捉因子は、哺乳動物のセプラーゼタンパク質に特異的なモノクローナル抗体、セプラーゼの核酸アプタマー分子またはペプチドアプタマー分子またはペプチドリガンドの分子であってもよい。本実施形態の変形例では、デバイスに含まれる少なくとも１つのモジュールは哺乳動物のセプラーゼタンパク質に特異的な捕捉因子を含み、一方、追加モジュールは、哺乳動物のＥｐＣＡＭタンパク質に特異的な捕捉因子、または異なる表現型に対する別の哺乳動物のマーカー、例えば、ＣＤ１４６タンパク質を含んでいる。本実施形態の更なる変形例では、デバイスは、単離された細胞を解析するための少なくとも１つのモジュールを更に含む。

図１は、本発明を実施するための例示的なマイクロ流体デバイスを示す図である。

図２は、血液のＥｐＣＡＭおよびセプラーゼＣＴＣの両者を単離し、続いてＣＴＣを計数するために直列に接続されたＣＴＣチップの図である。

定義
本開示の理解を容易にするために、本明細書で使用する用語について以下の定義を設ける。

本明細書に定義する用語「親和性試薬」は、標的に特異的に結合可能な試薬を指す。

用語「バイオリアクター」は、細胞または組織を生体外で増殖させることが可能で生物学的に活性な環境を支持するデバイスを指す。

用語「結合」および「特異的結合」は、交換可能に使用され、対象の標的に選択的に結合する試薬の能力を指す。典型的に、特異性とは、１０⁴Ｍ^-1〜１０¹²Ｍ^-1の解離定数を有する特徴のことである。特定の場合には、特異的か非特異的結合なのかを区別するために、適切な対照を用いた実験的な方法を用いてもよい。

用語「癌細胞」および「腫瘍細胞」は、交換可能に使用され、癌または腫瘍由来、あるいは腫瘍細胞株または腫瘍細胞培養物に由来する細胞を指す。

用語「転移性細胞」または「転移性腫瘍細胞」は、転移を生じ得る細胞、または、既に転移性腫瘍の一部である細胞を指す。

用語「循環腫瘍細胞」または「ＣＴＣ」は、腫瘍を有する患者の循環系に見られる腫瘍細胞を指す。この用語は、通常、腫瘍の大部分が循環系に見られる血液学的な腫瘍を含まない。

用語「マトリックス」または「固体支持体」は、交換可能に使用され、例えば、容器又はチャンバ内にある固体材料を指す。固体支持体には、試薬、例えば親和性試薬を施してもよい。また、固体支持体は、生物学的、化学的又は静電気的な力およびプロセスを介して細胞が付着する支持体としてもよい。

用語「原発腫瘍」は、癌の発生部位で増殖している腫瘍を指す。

用語「転移性腫瘍」は、癌の発生部位とは異なる部位で増殖している二次腫瘍を指す。

用語「細胞株」は、細胞培養により、インビトロで無限に増殖する能力を獲得した細胞集団を指す。

用語「初代細胞培養物」は、研究過程で生体から樹立した細胞培養物を指す。初代細胞培養物から、細胞株を生じてもよいしそうでなくてもよい。

用語「樹立細胞株」は、研究を行う前にインビトロで複数回増殖させた細胞株を指す。

用語「バイオマーカー」は、表現型の特徴を示す生物学的マーカーを指す。バイオマーカーには、典型的に、遺伝子または遺伝子産物が挙げられる。遺伝子によるが、「バイオマーカーを検出する」には、遺伝子発現の変化、エピジェネティックな修飾、生殖系または体細胞の変異等を検出することを含むことがある。遺伝子産物の場合、「バイオマーカーを検出する」は、細胞表面マーカー、可溶性化合物、例えばサイトカインなど、の存在、量、または量的変化を検出することを意味することがある。また、「バイオマーカーを検出する」は、遺伝子発現（ｍＲＮＡまたはタンパク質）、あるいはその遺伝子の発現または活性を反映する代謝産物を検出することを含むこともある。

用語「標的試薬」は、「親和性試薬」と同義であり、分子に特異的に結合することによりその分子を標的とすることが可能な試薬を指す。

用語「腫瘍バイオマーカー」または「癌バイオマーカー」は、腫瘍または癌に特徴的で正常組織には特徴的ではないバイオマーカーを指す。

用語「腫瘍」は、転移の可能性を有することが知られている任意の種類の悪性固形腫瘍を指し、これらに限定されないが、肺癌（例えば、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ））、骨癌、膵臓癌、頭部または頸部の癌、黒色腫、子宮癌、卵巣癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、胃癌、乳癌、子宮内膜癌、甲状腺癌、前立腺癌、膀胱癌、腎臓癌（例えば、腎細胞癌）、肝臓癌（例えば、肝細胞癌）、ならびに中枢神経系（ＣＮＳ）の癌（例えば、神経膠腫、多形性膠芽腫、または星状細胞腫）を含む。

遺伝子名およびタンパク質名である「セプラーゼ」は、交換可能に使用され、「線維芽細胞活性化タンパク質α」、「ＦＡＰα」、および「ＦＡＰ」の同義語で、これらと同じ遺伝子またはそれらのタンパク質産物を指す。

本発明は、上皮の表現型の特徴の一部または全部を欠失し、より侵襲的な挙動を示すＣＴＣの亜集団を富化する方法を含む。本発明は、更なる特徴付けのためＣＴＣを捕捉し富化するための標的分子としてセプラーゼを利用する。セプラーゼタンパク質は、米国特許第５，７６７，２４２号に開示されている。セプラーゼは、線維芽細胞活性化タンパク質α（ＦＡＰα）およびＤＰＰ−５としても知られ、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の分解に関与することが示されている、腫瘍の成長および増殖を増強するプロテアーゼ（ゼラチナーゼ）である。セプラーゼは、２つのＮ−グリコシル化された９７ｋＤａのサブユニットから成る１７０ｋＤａのホモ二量体として存在する膜係留タンパク質である。また、セプラーゼは、抗プラスミン切断酵素（ＡＰＣＥ）という名称の可溶性形態でも存在する（Ｌｅｅ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．（２００６）Ａｎｔｉｐｌａｓｍｉｎ−ｃｌｅａｖｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ ｉｓ ａ ｓｏｌｕｂｌｅ ｆｏｒｍ ｏｆ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｂｌｏｏｄ，１０７：１３９７-１４０４参照）。

構造的に、セプラーゼは、細胞外のＣ末端大ドメイン、疎水性の膜貫通ドメイン、および短い細胞質テールを含む。興味深いことに、腫瘍細胞の表面ではセプラーゼの分布が均一ではなく、大部分のセプラーゼは、ヒト悪性腫瘍細胞の侵入前面、特に細胞外マトリックスに関与し得る浸潤突起や膜突起内に存在する（Ｅｄｏｓａｄａ，Ｃ．Ｙ．，ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｂａｓｅｄ ｏｎ Ｄｉｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８１：７４３７−７４４４；Ｍｏｒｉ Ｙ．，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｔｙｐｅ ＩＩ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｓｅｒｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ（Ｓｅｐｒａｓｅ）ｉｎ ｈｕｍａｎ ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｍａ，Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，６７：４１１−４１９；Ｏ’Ｂｒｉｅｎ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｓｅｐｒａｓｅ：ａｎ ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ａｎ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｍａｔｒｉｘ ｓｅｒｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ，１７８４：１１３０−１１４５；Ｍｏｎｓｋｙ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｍａｒｋｅｒ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｏｆ ｉｎｖａｓｉｖｅｎｅｓｓ，ｓｅｐｒａｓｅ，ｉｓ ｌｏｃａｌｉｚｅｄ ｏｎ ｉｎｖａｄｏｐｏｄｉａ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｍｅｌａｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５４：５７０２−５７１０；Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｓ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ａ Ｎｏｖｅｌ Ｐｒｏｔｅａｓｅ−ｄｏｃｋｉｎｇ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｔｅｇｒｉｎ ａｔ Ｉｎｖａｄｏｐｏｄｉａ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４：２４９４７−２４９５２参照）。

セプラーゼは、ヒト上皮癌の９０％を超える細胞表面で過剰に発現されるが、非癌性組織および良性上皮性腫瘍の線維芽細胞では存在しないことが発見されている（Ａｅｒｔｇｅｅｒｔｓ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ α，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８０：１９４４１−１９４４４参照）。単離ＣＴＣの研究により、抗ＥｐＣＡＭ抗体によって捕捉された細胞集団はセプラーゼを発現しないが、細胞接着マトリックス（ＣＡＭ）タンパク質に対する親和性を利用して捕捉された細胞集団のうち一部はセプラーゼを発現することが示されている（Ｌｕ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ａｎｄ ｔｕｍｏｒ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ａｎ ｉｎｖａｓｉｖｅ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｆｒｏｍ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ，Ｉｎｔｌ Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１２６：６６９−６８３参照）。転移過程において、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）のタンパク質分解が起こること；そして、さらに、細胞接着マトリックス（ＣＡＭ）に対する結合活性を有する侵襲的なＣＴＣの亜集団の一部はセプラーゼを過剰発現することが知られている（同上参照）。

本発明は、セプラーゼに対し特異的な親和性試薬を用いてＣＴＣを捕捉する方法である。いくつかの実施形態では、ＣＴＣは、全血、体液、任意の細胞含有血液画分、腫瘍断片、腫瘍細胞懸濁液、または患者試料から樹立した細胞培養物、もしくは該培養物の上清に由来し得る患者の試料から単離される。別の実施形態では、ＣＴＣは、樹立細胞株培養物もしくは該培養物の上清、または実験動物，例えば、異種移植片腫瘍を保有する動物から単離される。いくつかの実施形態では、該方法は、セプラーゼ選択の後にＥｐＣＡＭに特異的な親和性試薬を用いて上皮様ＣＴＣを更に選択するという二重選択の構成を含む。あるいは、セプラーゼ陽性細胞とＥｐＣＡＭ陽性の細胞を、別々に単離するかまたは計数して、これらの細胞の比率を得てもよい。セプラーゼ陽性細胞とＥｐＣＡＭ陽性細胞の比率の変化は、癌転移の可能性の変化の指標となる。

いくつかの実施形態では、特定の正常組織または対応する腫瘍組織におけるセプラーゼの発現レベルを、最初に評価する。例えば、フローサイトメトリーを使用して、腫瘍においてセプラーゼを発現する細胞の割合を計算してもよい。割合が低い場合、捕捉デバイスにおけるセプラーゼ特異的な捕捉試薬の濃度または密度を調整して、セプラーゼを発現するＣＴＣの結合および捕捉に最適な動力学を確定してもよい。同様に、特定の正常組織または対応する腫瘍組織におけるセプラーゼ／ＥｐＣＡＭ比を、最初に評価する。

いくつかの実施形態では、ＥｐＣＡＭに加えて、またはＥｐＣＡＭの代わりに、上皮間葉移行に関連する他の分子を選択に用いてもよい（例えば、Ｚｅｎｇ，Ｑ．，ｅｔ ａｌ．（２０１２）ＣＤ１４６，ａｎ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ−ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｒ，ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｒｉｐｌｅ−ｎｅｇａｔｉｖｅ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ，ＰＮＡＳ １０９（４）：１１２７−３２参照）。

いくつかの実施形態では、ＣＴＣを含むセプラーゼを発現する細胞集団は、セプラーゼ特異的抗体を用いて捕捉される。セプラーゼ特異的抗体は、市販の供給元（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅｓｈｉｒｅ，ＵＫ）から入手可能である。あるいは、セプラーゼ特異的抗体は、当技術分野で公知の方法を用いデノボで生成してもよい（例えば、Ｈｏｗａｒｄ ａｎｄ Ｋａｓｅｒ，Ｅｄｓ．，（２００６）Ｍａｋｉｎｇ ａｎｄ Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ；Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ参照）。必要に応じて、抗ＥｐＣＡＭ抗体を用いた二次選択を行ってもよい。ＥｐＣＡＭ特異的抗体は、例えば、ＯｒｉＧｅｎｅ Ｔｅｃｈ．，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．／ＵＳＡなど複数の業者から広く入手可能である。別の抗体、例えば、ＣＤ１４６に特異的な抗体（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓ．／ＵＳＡ）を用いて、更なる選択を採用してもよい。

別の実施形態では、捕捉分子は、セプラーゼリガンドまたはセプラーゼの阻害剤である。いくつかの実施形態では、リガンドまたは阻害剤はペプチドである。ペプチドの例としては、Ａｃ−Ｇｌｙ−プロリンボロン酸（Ａｃ−Ｇｌｙ−ＢｏｒｏＰｒｏ）およびプロリンジフェニルホスホネート（Ｇｌｙ−ＰｒｏＰ（ＯＰｈ）₂）、オクタペプチドおよび環式オクタペプチド（米国特許第７，３７４，８９８号に記載）が挙げられる。これらのリガンドは、広範囲な特徴付けがされ、セプラーゼに好ましい親和性を示す（Ｅｄｏｓａｄａ，Ｃ．Ｙ．，ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｂａｓｅｄ ｏｎ Ｄｉｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８１：７４３７−７４４４；ａｎｄ Ａｅｒｔｇｅｅｒｔｓ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ α，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８０：１９４４１−１９４４４参照）。当業者は、例えば、Ｂａｒｔｏｌｉ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．（２００７）Ａ ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄａｓｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ａｔ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｅ ｌｅｖｅｌ，ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｍａｒ ８；８ Ｓｕｐｐｌ １：Ｓ３；ｏｒ Ｙａｇｉ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ ｐａｎｎｉｎｇ ｆｏｒ ａ ｎｏｎ−ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，Ｊａｎ １２；８：１１に記載のペプチドの選択方法を用いてインビトロでセプラーゼの他のペプチドリガンドを生成することができる。

さらに別の実施形態では、捕捉分子は、ペプチドまたは核酸アプタマーである。このようなアプタマーは、該分野で公知の任意の方法によって、オリゴヌクレオチドまたはペプチドライブラリーから選択することができる。核酸アプタマーは、ＳＥＬＥＸ法（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）により選択することができる（Ｏｌｉｐｈａｎｔ ＡＲ，ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｄｅｆｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ ｓｅｌｅｃｔｉｎｇ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅｓ ｆｒｏｍ ｒａｎｄｏｍ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ：ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｙｅａｓｔ ＧＣＮ４ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．．９：２９４４−２９４９参照）。ペプチドアプタマーは、酵母または細菌ツーハイブリッドシステムを使用して選択することができる（Ｆｉｅｌｄｓ，Ｓ．，Ｓｏｎｇ，Ｏ．（１９８９）Ａ ｎｏｖｅｌ ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｙｓｔｅｍ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，Ｎａｔｕｒｅ ３４０（６２３０）：２４５-６；Ｊｏｕｎｇ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ａ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｓｔｕｄｙｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ−ＤＮＡ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９７（１３）：７３８２-７参照）。

いくつかの実施形態では、本発明は、患者試料からＣＴＣを捕捉することができるデバイスである。デバイスは、固体表面上に固定されたセプラーゼ標的親和性試薬を備える。固体表面は、セプラーゼ、並びに必要に応じて、追加的または平行してＥｐＣＡＭ、を標的とする親和性試薬を施したポリマーベースのマトリックスを含んでもよい。いくつかの実施形態では、ＣＴＣを含むセプラーゼを発現する細胞集団は、抗セプラーゼ抗体を施した表面を備えるデバイスに捕捉される。必要に応じて、デバイスが抗ＥｐＣＡＭまたは抗ＣＤ１４６抗体または目的の任意の追加の抗体を施した表面を有する二次選択を行ってもよい。いくつかの実施形態では、親和性試薬（例えば、セプラーゼ特異的およびＥｐＣＡＭ特異的抗体）を混合して混合単膜を形成してもよいし、更に別の実施形態ではセプラーゼ特異的およびＥｐＣＡＭ特異的抗体を連続床に配置してもよい（いずれかの順番で配置する）。更に別の実施形態では、セプラーゼを発現するＣＴＣは、例えば、Ａｃ−Ｇｌｙ−プロリンボロン酸（Ａｃ−Ｇｌｙ−ＢｏｒｏＰｒｏ）およびプロリンジフェニルホスホネート（Ｇｌｙ−ＰｒｏＰ（ＯＰｈ）₂）等のセプラーゼのペプチドリガンドを施したまたは被覆した表面を備えるデバイスに捕捉される。他の適切なペプチドを、当技術分野で公知のインビトロやインシリコのペプチド選択方法に従って選択してもよい。さらに別の実施形態では、セプラーゼを発現するＣＴＣは、セプラーゼに特異的なペプチドまたは核酸アプタマーを用いて捕捉される。いくつかの実施形態では、デバイスは、自動ワークフローを有する機能システムに組み込まれた流体マザーボードと接してもよいマイクロ流体デバイスである。かかるデバイスでは、細胞が放出された際に更なる富化ならびに免疫学的および分子的プロファイリングができるように、１つまたは複数のＣＴＣ選択モジュールが流体マザーボード上に構成されている。

典型的には、マイクロ流体デバイスは、患者試料内で非常に低い割合で発生するＣＴＣを検出するのに必要な大量の試料を収容および処理するのに適している。そのために、デバイスは、試料を線状の流れとして収容する複数のチャネルを備えていてもよい。セプラーゼまたはＥｐＣＡＭを発現する細胞を最大限回収するために最適な線形流速は、マイクロ流体の分野の当業者によって実験的に決定することができる。

いくつかの実施形態では、分析的細胞捕捉デバイスは、デバイスの表面にセプラーゼを発現する細胞の接着を最大にするように構成されている。例えば、ＵＶ光を用いて表面を粗面化してもよい。さらに、いくつかの実施形態では、ＣＴＣの捕捉および保持を容易にする微細構造を作るように、デバイスの表面をナノテクスチャ化することができる。例えば、Ｗａｎｇ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｎａｎｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ ｔｏｗａｒｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｃａｐｔｕｒｅ ｏｆ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ Ｉｎｔ’ｌ．Ｅｄｉｔｉｏｎ，４８：８９７０−８９７３に記載のように、ナノピラーを作るように表面を処理してもよい。循環腫瘍細胞を選択するのに一般的に適切なデバイスの例が、例えば２００９年１１月１９日に公開された国際出願ＷＯ２００９／１４０３２６号に記載されている。

デバイスの例を図１に示す。図１のデバイスは、選択に使用する親和性試薬を施した内面を含む正弦曲線状のチャネルをそれぞれ取り囲む複数の捕捉モジュールを備える。図１のデバイスは、２つの捕捉モジュールを備え、その１つはセプラーゼ用であり、もう１つはＥｐＣＡＭ用であり、これらは直列に配置されている（１つ目のモジュールの出口が２つ目のモジュールの入口となる）。当業者は、追加的なモジュールを追加できることを理解するであろう。本発明によれば、親和性選択工程の順序を逆にすることもできる。さらに別の代替例では、選択モジュールは、入口で試料が分かれて同時に各ＣＴＣ選択モジュールに入るという並列構成で動作させてもよい。さらに別の代替例では、単一のモジュールを２つ以上の抗体の混合物に使用してもよい。デバイスは、洗浄緩衝液、廃棄物回収、および他の試薬用の容器を有する。デバイスは、直接流すための複数のバルブ（Ｖ）を有する。選択後、細胞は、任意の計数モジュールおよび任意の染色モジュールに向かうようになっている。種々な細胞計数装置および方法が、当技術分野で周知であり、それらは当業者によって採用できる。例えば、計数モジュールは、単一の細胞インピーダンスを使用して細胞が同定および計数できるように、電極対を含んでもよい（Ｔ．Ｓｕｎ ａｎｄ Ｈ．Ｍｏｒｇａｎ（２０１０）Ｓｉｎｇｌｅ−Ｃｅｌｌ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ Ｉｍｐｅｄａｎｃｅ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ，Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄ Ｎａｎｏｆｌｕｉｄ，８：４２３−４４３およびそれらに記載の参考文献を参照）。染色モジュールは、様々な染色試薬、例えば、色素（ＤＡＰＩ）および標識抗体（サイトケラチン（ＣＫ）、ＣＤ４５、および目的の任意の他の標的に特異的なもの）を受けるように構成されている。デバイスの出口から、選択細胞が出て、本発明に係る更なる処理、例えば、分子解析に用いるようになっている。

いくつかの実施形態では、固体表面に結合したセプラーゼ標的親和性試薬、そして更に、必要に応じて、更なる解析用に固体表面に結合したＥｐＣＡＭ標的親和性試薬を用いて捕捉されたＣＴＣ含有細胞亜集団を放出することが望ましい場合がある。親和性試薬を固体マトリックスに係留させている結合を切断すること、または親和性試薬から捕捉された細胞を外すことのいずれかにより放出が達成できる。

１の実施形態では、本発明の方法は、捕捉抗体に関し切断可能な二官能性リンカー、例えば、二官能性リンカー内に含まれる光切断または化学基により捕捉された細胞の放出を可能にするものを利用する。いくつかの光切断可能なリンカーが、当業者に利用可能である（例えば、Ｋａｎｏｈ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｃｌｅａｖａｂｌｅ ｌｉｎｋｅｒ ｆｏｒ ｐｈｏｔｏ−ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｄ ｓｍａｌｌ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｒｉｘ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．２１：１８２−１８６およびそれらに記載の参考文献参照）。光切断可能なリンカーは、細胞選択モジュールを一度の使用で廃棄する臨床応用に理想的な候補である。これらの二官能性リンカーには、光切断可能な残基または酵素的に切断可能な塩基部位を含む一本鎖オリゴヌクレオチドなど、異なる長さや組成の構成があり得る。

別の実施形態では、本発明は、細胞の捕捉および放出を可能にするために、ビオチン化捕捉抗体と相互作用し細胞の捕捉および放出を可能にするアビジン化合物、例えば、アビジン、ストレプトアビジン、ニトロアビジン、または中性アビジンを利用する。アビジン化合物は、ニトロアビジンの場合、溶液のｐＨが中性からアルカリ性に変化すると、ビオチン化抗体のビオチン部分から解離する。本実施形態の利点は、結合表面が再生可能なことである。

さらに別の実施形態では、細胞の放出を可能にするために、ペプチド阻害剤、リガンドまたは他の結合パートナーを用いて細胞を捕捉する場合、可溶性形態の結合剤を過剰量で添加することにより、マトリックスから細胞を解離させる。

さらに別の実施形態では、親和性試薬としての核酸アプタマーと共に、親和性アプタマーに相補的な可溶性形態を過剰量で用いて、選択ＣＴＣを放出できる。熱変性の後、そのようなアプタマーを施した捕捉表面を容易に再生できる。

いくつかの実施形態では、捕捉されたＣＴＣを含む細胞亜集団は、親和性試薬から放出され、さらなる解析に供される。いくつかの実施形態では、細胞は、例えばヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）による染色、またはＰＲＯＴＯＣＯＬ（登録商標）ＨＥＭＡ３染色など他の差動染色後、顕微鏡検査に供される。細胞と細胞の破片とを区別しやすくするために、全ての細胞はヘキスト３３３４２またはＤＡＰＩなどの蛍光核酸結合色素で染色してもよい。以下に説明する種々のマーカーに対し陽性染色を示す細胞を、ＣＴＣとして同定、計数、および更なる特徴付けをしてもよい。

いくつかのバイオマーカー、ならびに、形態学的、免疫学的、および生理学的検査またはそれらの組み合わせを用いて、本発明の方法を使用して捕捉された細胞からＣＴＣを同定してもよい（例えば、Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．（２０１１），Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ：ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ，ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｓｓｕｅｓ，ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｒｅｌｅｖａｎｃｅ，Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１３７：１１５１−１１７３；Ｍａｎ，ｅｔ ａｌ．（２０１１）；Ｃｕｒｒｅｎｔｌｙ ｕｓｅｄ ｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ ＣＴＣ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ-ａｄｖａｎｔａｇｅｓ，ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｉｍｐａｃｔ ｏｎ ｃａｎｃｅｒ ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐｅｒ．Ｐａｔｈｏｌ．１：１参照）。例えば、ＣＴＣは細胞接着分子（ＣＡＭ）への結合能、並びにＥｐＣＡＭ、サイトケラチン（ＣＫ）、５、７、１８、および１９、ＣＤ４４ｖ６またはＮ−カドヘリンなどの特定の特異的バイオマーカーの存在によって同定することができる。腫瘍源によっては、ＣＴＣは、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ１４６、ＣＫ５、ＣＫ７、ＣＫ１８、ＣＫ１９、ＣＤ４４、Ｃｄ４４ｖ６、ＥｐｈＢ４、ＦＡＰ（セプラーゼ）、ＩＧＦ−１Ｒ、ＢＣＬ２、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＣＤ１３３、ＭＵＣ１、Ｎ−カドヘリン、サバイビン、ＥＧＦＲ、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ｐ５３、Ｐｉ３ＫＣＡ、ＰＴＥＮ、ＫＲＴ１９、ＣＤ３４、ＣＤ２４、ＡＣＴ２、ＶＩＭ、ＮＡＮＯＧ、ＣＸＣＲ４およびＴＷＩＳＴなどの腫瘍特異的バイオマーカーの存在に基づいて同定してもよい。

例えば、膵臓起源のＣＴＣは、標準的な上皮マーカーおよびヒト膵臓腫瘍マーカー（ＥｐＣＡＭおよびＣＡ１９−９）により陽性染色を示すであろう。本発明のいくつかの実施形態では、ＣＴＣは、市販のアッセイ、例えばＶＩＴＡ−ＡＳＳＡＹ(商標）ＡＲ１６プラットフォーム（Ｖｉｔａｔｅｘ，Ｉｎｃ．，Ｓｔｏｎｙ Ｂｒｏｏｋ，Ｎ．Ｙ．／ＵＳＡ）を用いて同定される。

別の実施形態では、本発明は、患者試料においてセプラーゼを発現する細胞を検出することによって、患者における悪性腫瘍の存在を検出するか、あるいは既存するまたは切除後の腫瘍の転移の可能性を評価する方法である。試料は、全血、体液、任意の細胞含有血液画分、腫瘍断片、腫瘍細胞懸濁液、または患者試料から樹立した細胞培養物、もしくは該培養物の上清を含み得る。

本実施形態では、捕捉されたセプラーゼを発現する細胞を更にＣＴＣとして特徴付けて、その数と、例えばＡＣＴ２、ＩＧＦ−１Ｒ、ＢＣＬ２、ＨＥＲ２、ＥｐｈＢ４、ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＣＤ２４、ＣＤ４４、ＣＤ１３３、ＣＤ１４６、ＣＸＣＲ４、ＴＷＩＳＴ１、ＶＩＭ、ＮＡＮＯＧ、ＫＲＴ１９、ＭＵＣ１、サバイビン、ＥＧＦＲ、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ｐ５３、Ｐｉ３ＫＣＡおよびＰＴＥＮのうちの１つまたは複数のバイオマーカーを含む遺伝子発現プロファイルを評価してもよい。

別の実施形態では、本発明は、本発明の方法を用いて腫瘍または腫瘍に由来するＣＴＣにおいて、ＥｐＣＡＭ発現に対するセプラーゼ発現を比較する方法である。ＥｐＣＡＭを発現するＣＴＣに対するセプラーゼを発現するＣＴＣの比率を、腫瘍の転移の可能性を決定するために使用してもよい。

さらに別の実施形態では、本発明は、腫瘍を有する患者の予後を決定する方法であって、ＥｐＣＡＭを発現するＣＴＣに対するセプラーゼを発現するＣＴＣの比率を評価することにより腫瘍の転移の可能性を決定することを含み、該比率の増加は患者の腫瘍の転移の可能性が増加する、つまり予後が不良であること示す方法である。ＥｐＣＡＭを発現するＣＴＣに対するセプラーゼを発現するＣＴＣの比率の増加は、特定の腫瘍型についてＥｐＣＡＭを発現するＣＴＣに対するセプラーゼを発現するＣＴＣの比率が記載されている文献に対し実験的に決定された比率を比較することによって検出することができる。代替的に、ＥｐＣＡＭを発現するＣＴＣに対するセプラーゼを発現するＣＴＣの比率は、特定の患者について該比率の増加を検出できるように繰り返し評価（モニター）を行ってもよい。本方法に従って、これらに限定されないが、肺癌（例えば、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ））、骨癌、膵臓癌、頭部または頸部の癌、黒色腫、子宮癌、卵巣癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、胃癌、乳癌、子宮内膜癌、甲状腺癌、前立腺癌、膀胱癌、腎臓癌（例えば、腎細胞癌）、肝臓癌（例えば、肝細胞癌）、ならびに中枢神経系（ＣＮＳ）の癌（例えば、神経膠腫、多形性膠芽腫、または星状細胞腫）等の転移の可能性を有することが知られている任意の悪性固形腫瘍についての予後を求めてもよい。

実施例１
膵臓癌患者の末梢血液からセプラーゼ（陽性）およびＥｐＣＡＭ（陽性）循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）の選択
以下の臨床測定は、承認されたＩＲＢ（ノースカロライナ大学チャペルヒル、ラインバーガー癌センター）からの認定を得たものである。これらの測定は、本発明の実施形態を説明する意図であり、本発明の範囲を限定する意図ではない。本発明は、全ての腺癌または固形腫瘍を包含する意図である。

材料および方法
セプラーゼおよびＥｐＣＡＭ陽性細胞を選択するために使用されるＣＴＣマイクロチップは、熱可塑性に作製された（環状オレフィンコポリマーＣＯＣまたはポリ（メチルメタクリレート）ＰＭＭＡ）。ＣＴＣマイクロチップは、共通の１つの入口から延伸し共通の１つの出口へと流れ出る約５０個の正弦曲線状のチャネルから成る構造により構成される（Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．，Ｈｉｇｈｌｙ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｔｕｍｏｒ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｆｏｒｍ Ｗｈｏｌｅ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ Ｌａｂｅｌ−Ｆｒｅｅ Ｅｎｕｍｅｒａｔｉｏｎ Ｕｓｉｎｇ Ｐｏｌｙｍｅｒ−ｂａｓｅｄ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ ｗｉｔｈ ａｎ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ Ｓｅｎｓｏｒ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，１３９（２００８）８６３３−８６４１参照）。正弦曲線状チャネルの幅は３０μｍで深さは１５０μｍである。

ポリマー基板およびカバープレート（厚さ０．５ｍｍ）は、Ｇｏｏｄ Ｆｅｌｌｏｗ（Ｂｅｒｗｙｎ，ＰＡ／ＵＳＡ）から購入した。白金線は、Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ（Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ／ＵＳＡ）から購入した。ポリイミド被覆溶融シリカキャピラリは、Ｐｏｌｙｍｉｃｒｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｐｈｏｅｎｉｘ，ＡＺ／ＵＳＡ）から購入した。ＣＯＣ表面の洗浄および改変に使用される化学物質には、試薬グレードのイソプロピルアルコール、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、ウシ胎児血清、および２−（４−モルホリノ）−エタンスルホン酸（ＭＥＳ）が含まれ、これらはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ／ＵＳＡ）から購入した。モノクローナル抗ＥｐＣＡＭ抗体および抗セプラーゼ抗体は、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ／ＵＳＡ）から入手した。

ＣＴＣマイクロチップは、マイクロレプリケーションにより金属原盤から製造した。金属原盤の微細構造は、従前に公開されている手順（Ｈｕｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｍｉｌｌｅｄ Ｍｅｔａｌ Ｍｏｌｄ Ｍａｓｔｅｒｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｃｈｉｐ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ ａｎｄ Ｎａｎｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，（２００７）３：１−１１）に従って、高精度マイクロミリング機（ＫＥＲＮ ＭＭＰ ２５２２，ＫＥＲＮ Ｍｉｃｒｏｕｎｄ Ｆｅｉｎｗｅｒｋｔｅｃｈｎｉｋ ＧｍｂＨ ＆ Ｃｏ．ＫＧ；Ｇｅｒｍａｎｙ）で真鍮板の表面をミリングした。このマイクロミリング機には、ツールの長さおよび半径を自動測定するためのレーザ測定システム（ＬａｓｅｒＣｏｎｔｒｏｌ ＮＴ，Ｂｌｕｍ−Ｎｏｖｏｔｅｓｔ ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、およびミリング工程をモニターするための光学顕微鏡（倍率６０００倍、Ｎａｖｉｔａｒ，Ｉｎｃ．Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ／ＵＳＡ）を装着した。マイクロミリングは４０，０００ｒｐｍで実施した。供給速度は、ミリングツールのサイズに依存しているが、典型的には５００μｍビットの場合２００ｍｍ／分、２００μｍビットの場合１００〜１５０ｍｍ／分、１００μｍビットの場合５０〜７５ｍｍ／分、そして５０μｍビットの場合１０〜２０ｍｍ／分の範囲内であった。典型的なミリングサイクルは、真鍮板の両面を平行に保ち、かつパターン全体にわたり最終的にミリングされた微細構造の高さが均一になるような５００μｍビットの全面プレカット、５００μｍまたは２００μｍいずれかのビットでの微細構造の粗ミリング、より小さい径のミリングビットでの仕上げカットから成る。原盤製造の最終工程において、バリを機械研磨によって除去した。研磨は、３μｍの粒子サイズの研磨紙（Ｆｉｂｒｍｅｔ Ｄｉｓｃｓ−ＰＳＡ，Ｂｕｅｈｌｅｒ，Ｌａｋｅ Ｂｌｕｆｆ，ＩＬ）を用い、その後、ポリプロピレン布（Ｅｎｇｉｓ，Ｗｈｅｅｌｉｎｇ，ＩＬ）および１μｍ粒子のダイヤモンド懸濁液（Ｍｅｔａｄｉ Ｄｉａｍｏｎｄ Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ，Ｂｕｅｈｌｅｒ）を用いて手で行った。

ポリマー基板及びカバープレートのＵＶ改変により、表面の物理化学的特性を効果的に変化させカバープレートと基板との界面におけるガラス転移温度（Ｔ_g）を穏やかに減少させた。熱融着は、ポリマーカバープレートおよび表面が開口するようにホットエンボス加工したポリマー基板を用いてガスクロマトグラフ（ＧＣ）オーブン（Ｖａｒｉａｎ３４００，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ／ＵＳＡ）内で行った。二枚のホウケイ酸ガラス板の間で、基板およびカバープレートを位置決めし一緒にクランプして、この集合体を温度プログラム可能なＧＣオーブンに入れ、このオーブン内の温度を２０℃／分の速度で５０℃から１５０℃に上昇させた。温度を１５分間１５０℃に保持し、その後室温まで冷却した。

ポリマー基板およびカバープレートのレジオ特異的紫外線（ＵＶ）改変は、対象抗体がＣＴＣマイクロチップの細胞選択床内でのみ係留するようなカルボキシル化足場の形成を容易にするために、アルミニウムフォトマスクを介して行った。熱融着による最終的な組み立ての前に、カバープレートおよび基板を、ＵＶ露光機（ＡＢＭ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ／ＵＳＡ）により１０分間２５４ｎｍ、１５ｍＷｃｍ^-2フルエンスで局所的に照射した。

抗体の固定は、二段階法を用いて行った。最初に、ＵＶ改変したＣＴＣデバイスを熱組み立てした後、４．０ｍｇ／ｍＬの１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）および６．０ｍｇ／ｍＬのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を含む１５０ｍＭの２−（４−モルホリノ）−エタンスルホン酸溶液（ｐＨ＝６）（ＭＥＳ，Ｆｉｓｈｅｒ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｆａｉｒ Ｌａｗｎ，ＮＪ）、ならびに緩衝生理食塩水（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ／ＵＳＡ）を１０時間充填し、スクシンイミジルエステル中間体を形成した。その後、ＥＤＣ／ＮＨＳ溶液を流体力学的手法で、ＥｐＣＡＭに対するモノクローナル抗体またはモノクローナル抗セプラーゼ抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ／ＵＳＡ）にを１．０ｍｇ／ｍＬで含む１５０ｍＭのＰＢＳ溶液（ｐＨ＝７．４）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ／ＵＳＡ）に置換し、４時間反応させてから、ＣＴＣマイクロチップをＰＢＳ溶液（ｐＨ＝７．４）でリンスして、非特異的に結合した全ての抗体を除去した。

ＰＨＤ２０００シリンジポンプ（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ，Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，ＭＡ／ＵＳＡ）による流体力学的手法で、ＣＴＣマイクロチップを用いて試料を処理した。ポンプとマイクロチップを相互作用させるために、ルアーロックシリンジ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｒｅｎｏ，ＮＶ／ＵＳＡ）にルアー・ツー・キャピラリアダプタ（ＩｎｎｏｖａＱｕａｒｔｚ，Ｐｈｏｅｎｉｘ，ＡＺ／ＵＳＡ）を取り付けた。シリンジポンプは、ＣＴＣの細胞捕捉効率および捕捉後の細胞保持を評価するのに適切な体積流量を生ずるようプログラムした。線速度は、それぞれのＨＴＭＳＵ捕捉チャネルの断面積およびプログラムされた体積流量から計算した。二重選択工程は、セプラーゼＣＴＣマイクロチップを直接シリンジポンプに接することによって行った。その後、セプラーゼチップの出口を、ＥｐＣＡＭマイクロチップ内に導いた。したがって、血液試料は、直列に配置された２つのマイクロチップを用いた単一のアッセイ内で処理された。

同意を得た膵癌患者の血液試料を全容量が約１０ｍｌのＥＤＴＡチューブに回収した。試料を回収後、直ちにＣＴＣマイクロチップを用いて処理した。典型的には、３ｍｌの全血をＥＤＴＡチューブから取り出し、滅菌プラスチック製シリンジに投入し、シリンジポンプを取り付けて、ＣＴＣのマイクロチップに接続した。血液試料を１５０μｌ／分以内の体積流量で処理した。この体積流量だと、３ｍｌの入口容量がある試料を処理するのに２０分を要した。血液処理に続いて、マイクロチップを等張緩衝液（ＰＢＳ、１．５ｍｌ）で洗浄した。

選択細胞（マイクロチップをＰＢＳで洗浄した後の表面上に残ったもの）は、ＤＡＰＩ（核染色）、ＣＤ４５に対する蛍光標識抗体、フィコエリトリン（ＰＥ）で標識した抗サイトケラチン（８，１８，１９）抗体、Ｃｙ７で標識した抗ＥｐＣＡＭ抗体（セプラーゼ陽性チップ）またはＣｙ７で標識した抗セプラーゼ抗体（ＥｐＣＡＭ陽性チップ）を用いて直接染色した。染色及び洗浄後、４０倍の顕微鏡用対物レンズおよびＥＭＣＣＤカメラを用いてＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ ２００Ｍによりチップを画像化した。我々は、Ｃｙ７蛍光色素で標識した抗ＥｐＣＡＭ抗体を用いたチップ上の染色から、セプラーゼ陽性細胞の９５％超が目に見えるレベルのＥｐＣＡＭを発現していないことを発見した。ＥｐＣＡＭ陽性細胞も、同様にＣｙ７で標識した抗セプラーゼ抗体を用いたところ、同様の免疫表現型であり、同様の結果であることが確定された（９５％超のＥｐＣＡＭ陽性細胞がセプラーゼを発現しないことを発見した）。

いくつかの臨床試料による結果を表１に示す。表１において、「病理」欄は、試料が採取された時点における疾患の段階を示す。「親和性抗体」は、試料からＣＴＣを捕捉するのに使用された抗体を示す。細胞数は、７．５ｍｌの血液当たりの数である。「純度」は、選択細胞（白血球（ＣＤ４５陽性）＋ＣＴＣ＋三重染色された細胞-それらの細胞（ＣＤ４５陽性、ＤＡＰＩ陽性、およびＣＫ陽性）の総数に対するＣＴＣ（セプラーゼ陽性またはＥｐＣＡＭ陽性）の比率として計算される。分析した試料には、転移性の患者の試料と限局性疾患を有する患者の試料が含まれていた。また、限局性疾患を有する一人の患者については、手術（病変組織の切除）前および３週間後の両方について追跡した。また、ＥｐＣＡＭ陽性ＣＴＣに対するセプラーゼ陽性ＣＴＣの比率を、病理関数として示す。

実施例２
様々な癌患者の末梢血液のセプラーゼ（陽性）およびＥｐＣＡＭ（陽性）ＣＴＣの比率の決定
ＣＴＣマイクロ流体チップをＣＯＣ基板内に作製した。チップの設計は２６．３×２０．５ｍｍのフットプリント、入口および出口連通チャネル（長さ２０．５ｍｍ、幅４００μｍ、深さ１５０μｍ）、そして該チャネルに接続する５０個の曲線状の一連のチャネルから構成され、これらが集合して細胞選択用の床を形成している。図１は、ＣＴＣ選択チップの設計を示す。曲線状の選択チャネルは、それぞれ、長さ３０．６ｍｍ、深さ１５０μｍ、幅２５μｍであった。ＣＴＣ選択床の表面積は５９６ｍｍ²（チャネル当たり１１ｍｍ²）で、連通チャネル内におけるその表面積は４５．１ｍｍ²であった。チップの全容量は９．４μＬ（１３８ｎＬ／チャネル）で、連通チャネルの容量は２．５μＬであった。

これらのチャネルの深さにより、スループットを増加させ、また、特に捕捉されたＣＴＣで占められるときに選択チャネル全体にわたる圧力を減少させる。マイクロチャネルの幅は、平均して、回収率を最大にするためにＣＴＣの平均直径（１２〜２０μｍ）よりほんの少し大きく、白血球の平均直径（７〜１５μｍ）よりかなり大きい。チャネルの幅は、細胞と壁が相互作用する確率を最大限にする役割を果たし、ＣＴＣの収率を高くしつつも小さな細胞と相互作用する確率を低くすることを可能にする。赤血球のような小さな細胞については、チャネルの壁に接近する可能性は非常に制限される。この理由の一つとして境界に無細胞層が形成されることがある。

図２に示すように、ＵＶで活性化したＣＯＣチップに、抗ヒトＦＡＰα（ＭＡＢ３７１５Ｒ＆Ｄ）および抗ヒトＥｐＣＡＭ（ＭＡＢ９６０，Ｒ＆Ｄ）を施した。抗体の付着は、以下のプロトコルにより行った：１５〜２０分インキュベーションによる２０ｍｇ／ｍＬのＥＤＣおよび２ｍｇ／ｍＬのＮＨＳ（ｐＨ４．８）でのＵＶ−ＣＯＣ表面を活性化し、その後チャネルを空にして０．５ｍｇ／ｍＬの抗体を含むｐＨ７．４のＰＢＳで置換し、４℃で一晩インキュベーションした。血液処理の前に、チップを２ｍＬのＰＢＳ／０．２５％ＢＳＡでリンスした。

チップはシリカキャピラリを備えており、これらがチップ＃１の入口でシリンジポンプに接続されていた。チップ＃１の出口は、ガラスコネクタによりチップ＃２の入口に接続されていた。５０個のチャネルを有するＣＯＣチップの細胞捕捉プロトコルには、チップを介した２５μＬ／分（２ｍｍ／秒）での（希釈されていないかまたは固定されていない）全血の注入、およびその後の１〜２ｍＬのＰＢＳ／ＢＳＡ溶液による５５μＬ／分（４ｍｍ／秒）でのチップの洗浄が含まれていた。

選択細胞を、以下の免疫染色により分析および同定した：（ｉ）Ｆｃブロッカー（ＩｇＧ）による処理；（ｉｉ）抗マウスまたは抗ヒトＣＤ４５−ＦＩＴＣ抗体を用いた３０分間のインキュベーション；（ｉｉｉ）２％ＰＦＡを用いた細胞の固定；（ｉｖ）０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を用いたポレーション；並びに、（ｖ）ＣＫ８／１９−ＰＫ抗体および核染料ＤＡＰＩとのインキュベーション。染色細胞の画像は、１０倍、２０倍、および４０倍の乾燥対物レンズ、水銀アーク灯照明光源、２台のカメラ（高感度Ｈａｍａｍａｔｓｕ ＥＭＣＣＤ、および高解像Ｈａｍａｍａｔｓｕ ＯＲＣＡ−０３Ｇ ＣＣＤ）、ならびにＤＡＰＩ、ＦＩＴＣ、ＴＲＩＴＣ、およびＣｙ５のフィルターセットを備えＭｅｔａＭｏｒｐｈソフトウェアを介して制御されるオリンパスＩＸ７１−ＤＳＵスピニングディスク共焦点倒立顕微鏡を用いて得られた。

表２に、臨床試料から捕捉されたＣＴＣのデータをまとめる。患者および健康なドナー（陰性対照）の血液試料は、ＩｇＧまたはＦＡＰα／ＥｐＣＡＭで処理したＣＴＣチップ上で注入した。血液１ｍＬ当たりＣＴＣとして分類された細胞数を示す。細胞は染色（ＤＡＰＩ陽性；ＣＫ陽性；ＣＤ４５陰性）によりＣＴＣとして分類された。測定回数を、括弧内に示す。

転移性ＰＤＡＣ、黒色腫、および結腸直腸癌から採取した全ての検査血液試料において、ＣＴＣが両方の親和性床上で検出された。抗ＦＡＰα床では、結腸直腸癌患者の血液から採取したＣＴＣが最も高い感度で観察された。転移性黒色腫およびＰＤＡＣの中央値は似通っていたが、黒色腫のほうが高い平均値を示した。抗ＥｐＣＡＭ床では、ＣＴＣ検出の感度は、黒色腫で最も高く、結腸直腸癌およびＰＤＡＣ転移性患者がそれに続いた。全ての転移性疾患関連のＣＴＣについて、陰性対照と良性腫瘍とを比較すると、これらの細胞数が有意に異なっていた。

当初限局性かつ手術可能なＰＤＡＣ癌を有すると同定／診断された４人の患者の血液を、計画手術日（ＯＲ）に分析し、ＣＴＣを計数した。しかし、ＣＴＣ数は、転移性ＰＤＡＣ疾患で観察されるものと同等であった。患者の膵臓および腹部の手術および腹腔鏡検査を開始する時に、診断を転移性ＰＤＡＣに変更した。

また、本明細書に記載の方法を、腫瘍に由来するＥｐＣＡＭ陽性ＣＴＣに対しセプラーゼ陽性細胞の数を比較するために使用してもよい。ＥｐＣＡＭを発現するＣＴＣに対するセプラーゼを発現するＣＴＣの比率を使用して、腫瘍の転移の可能性を決定してもよい。異なる疾患を示す個々の患者について両方の親和性床で計数したＣＴＣの分析により、優勢な細胞亜集団が異なることが示された。データを表３に要約する。限局性ＰＤＡＣおよび転移性結腸直腸癌ではＦａｐ陽性ＣＴＣの数が多く、転移性黒色腫および転移性ＰＤＡＣではＥｐＣＡＭ陽性細胞が優勢であることが観察された。ＦＡＰα／ＥｐＣＡＭ比の中央値は、限局性ＰＤＡＣ、転移性結腸直腸癌、転移性ＰＤＡＣ、および転移性黒色腫でそれぞれ１．２１、１．１６、０．８７、および０．６９であった。これら二つの亜集団を計数値および割合を、疾患段階を示すマーカーとしてもよい。

実施例３
セプラーゼ標的親和性試薬により捕捉されたＣＴＣの発現解析
本明細書に記載の方法を使用して、インピーダンス検出（染色は行わない）を介してＣＴＣを捕捉、放出、計数し、マイクロチューブに回収した。回収したＣＴＣの回転をスピンダウンし、市販のＣｅｌｌ−ｔｏ−ＣＴ(商標）キット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，Ｎ，Ｙ）の溶解液を２０μＬ以下で用いて溶解した。Ｃｅｌｌ−ｔｏ−ＣＴ(商標）技術により、ＲＮＡを単離または精製することなく、１０〜１０⁵個の細胞の溶解物の逆転写が可能になる。ＲＮＡ単離工程を排除することで、細胞の遺伝子発現解析を実質的に促進し簡略化する。代替として、ＣＴＣの溶解およびＲＮＡの単離をＣＴＣ捕捉床を用いて直接行った。これは、ＦＡＰαおよびＥｐＣＡＭを施し直列に接続された別のチップセットを用いて免疫染色により細胞を計数しそれらの表現型の特徴付けをする際に実施してもよい。

溶解後の試料をＤＮａｓｅで処理して、残留ｇＤＮＡを全ＲＮＡ（ＴＲＮＡ）試料から除去した。陽性および陰性（ＲＴ酵素なし）両方の逆転写反応を、ＣＴＣのＴＲＮＡを１０μＬ用いて５０μＬの全容量で行った。ＲＴ反応は、Ｍ−ＭｕｌＶを用い、３７℃で６０分間行った。１５個の遺伝子の発現レベルを評価するために、３８４ウェルのプレートを備えた７９００ＨＴ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ機によりＳＹＢＲグリーンアッセイを用いた定量的リアルタイムＰＣＲを行った。捕捉したセプラーゼ陽性およびＥｐＣＡＭ陽性ＣＴＣの遺伝子発現プロファイルを両方収集した。ＥｐＣＡＭ、ＫＲＡＳ、ＣＤ１３３、ＣＤ１４６、ＫＲＴ１９、ＣＤ３４、ＧＡＰＤＨ、ＣＤ２４、ＦＡＰ、ＡＣＴ２、ＶＩＭ、ＮＡＮＯＧ、ＣＤ４４、ＣＸＣＲ４、およびＴＷＩＳＴ１の遺伝子（すなわち、上皮、間葉、ＥＭＴ、およびＣＳＣ（癌幹細胞）マーカー）を評価した（表４）。

全ての遺伝子発現の値を、ＧＡＰＤＨハウスキーピング遺伝子の発現レベルに対し正規化した。異なるアニーリング温度における各プライマー対に対する増幅効率をまず評価し、それを踏まえて、ＣＴＣ’のｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡの定量ＰＣＲに最適な熱サイクル条件を決定した。ＰＣＲ液の１０μＬ容量に、１〜２μＬの合成ｃＤＮＡを含んでいた。

ＥｐＣＡＭ陽性ＣＴＣにおけるＥｐＣＡＭのｍＲＮＡの発現レベルを、様々な疾患の間で比較した。転移性黒色腫および転移性結腸直腸癌において最も高い発現が観察された。限局性および転移性ＰＤＡＣの両者では、ＥｐＣＡＭのｍＲＮＡ発現レベルは低く、転移性ＰＤＡＣでは最低であった。ＥｐＣＡＭのｍＲＮＡを定量化により、単離ＣＴＣにおいて広い範囲の発現レベル（４桁）が示された。ｍＲＮＡおよびタンパク質発現が相関すると仮定すると、上述した観察事項により、ＣＴＣ捕捉デバイスは、細胞表面上の抗原の発現が低くてもＣＴＣを単離可能であることが示唆される。

本発明を特定の実施例を参照して詳細に説明してきたが、本発明の範囲内で種々の改変が可能であることが当業者には明らかであろう。

Claims (21)

1. 試料から循環腫瘍細胞を捕捉する方法であって、該試料を、哺乳動物のセプラーゼ標的親和性試薬に接触させることを含む方法。
2. セプラーゼ標的親和性試薬は、固体支持体の表面に固定されている、請求項１に記載の方法。
3. セプラーゼ標的親和性試薬は、セプラーゼの競合的または非競合的阻害剤である、請求項１または２に記載の方法。
4. セプラーゼ標的親和性試薬は、セプラーゼの抗体、核酸アプタマー、またはペプチドアプタマーまたはペプチドリガンドである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. セプラーゼのペプチドリガンドは、Ａｃ−Ｇｌｙ−プロリンボロン酸（Ａｃ−Ｇｌｙ−ＢｏｒｏＰｒｏ）およびプロリンジフェニルホスホネート（Ｇｌｙ−ＰｒｏＰ（ＯＰｈ）₂）から選択される、請求項４に記載の方法。
6. 前記試料を、哺乳動物のＥｐＣＡＭ標的親和性試薬に接触させることを更に含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
7. ＥｐＣＡＭ標的親和性試薬は、抗体である、請求項６に記載の方法。
8. セプラーゼ標的親和性試薬およびＥｐＣＡＭ標的親和性試薬を、連続的または同時に施す、請求項６に記載の方法。
9. セプラーゼ標的親和性試薬を担持する固体支持体が、マイクロ流体デバイスの一部である、請求項２に記載の方法。
10. 捕捉された循環腫瘍細胞を放出する工程を更に含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
11. 放出は、過剰量の可溶性セプラーゼ結合剤の添加、アビジン化合物の添加、あるいは二官能性リンカーの光開裂または酵素分解により行われる、請求項１０に記載の方法。
12. 前記二官能性リンカーは、酵素的または化学的に切断可能な部位を有する、請求項１１に記載の方法。
13. 前記試料は、腫瘍試料または腫瘍を有する患者の血液試料である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
14. 請求項１に記載の方法で患者試料から循環腫瘍細胞を捕捉することにより、患者における悪性腫瘍の存在を検出する方法。
15. 請求項１に記載の方法で患者試料から循環腫瘍細胞を捕捉することにより、腫瘍を保有しているかまたは保有していた患者において転移性腫瘍を発症するリスクを評価する方法。
16. 前記患者試料は、全血、体液、任意の細胞含有血液画分、腫瘍断片、腫瘍細胞懸濁液、または患者試料から樹立した細胞培養物、もしくは該培養物の上清、または患者の腫瘍から樹立した異種移植片を含む、請求項１４または１５に記載の方法。
17. 捕捉された細胞において、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ１４６、ＣＫ５、ＣＫ７、ＣＫ１８、ＣＫ１９、ＣＤ４４、Ｃｄ４４ｖ６、ＥｐｈＢ４、ＩＧＦ−１Ｒ、ＢＣＬ２、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＣＤ１３３、ＭＵＣ１、Ｎ−カドヘリン、サバイビン、ＥＧＦＲ、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ｐ５３、Ｐｉ３ＫＣＡ、ＰＴＥＮ、ＫＲＴ１９、ＣＤ３４、ＣＤ２４、ＡＣＴ２、ＶＩＭ、ＮＡＮＯＧ、ＣＸＣＲ４およびＴＷＩＳＴ１のうち１つまたは複数のバイオマーカーを検出する工程を更に含む、請求項１または１５に記載の方法。
18. 液体から選択細胞を捕捉または単離するためのマイクロ流体デバイスであって、該マイクロ流体デバイスは複数の並列チャネルを有する１つまたは複数のモジュールを含み、該チャネルは共通の入口および共通の出口に接続され、該チャネルの内側表面の少なくとも一部は二官能性リンカーを用いて哺乳動物のセプラーゼタンパク質に特異的な捕捉因子と共有結合している、マイクロ流体デバイス。
19. 前記捕捉因子は、哺乳動物のセプラーゼタンパク質に特異的なモノクローナル抗体、セプラーゼの核酸アプタマー分子またはペプチドアプタマー分子またはペプチドリガンドの分子である、請求項１８に記載のマイクロ流体デバイス。
20. 少なくとも１つのモジュールは哺乳動物のセプラーゼタンパク質に特異的な捕捉因子を含み、一方、追加モジュールは、哺乳動物のＥｐＣＡＭタンパク質に特異的な捕捉因子、または異なる表現型に対する別の哺乳動物のマーカーを含む、請求項１８に記載のマイクロ流体デバイス。
21. 単離された細胞を解析するための少なくとも１つのモジュールを更に含む、請求項１８に記載のマイクロ流体デバイス。