WO2018190379A1 - 被験者に対する免疫チェックポイント阻害剤の奏効性を予測する方法 - Google Patents

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cell
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antibody
fluorescence
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理美 八木
勝也 遠藤
雅之 樋口
上原　寿茂
泰浩 洪
信之 山本
弘朗 赤松
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日立化成株式会社
公立大学法人和歌山県立医科大学
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer

Definitions

  • the present invention relates to a method for predicting the response of an immune checkpoint inhibitor to a subject.
  • Immune checkpoint inhibition therapy is known as one of cancer treatment methods. Immune checkpoint inhibition therapy activates immune cells by inhibiting a reaction pathway (immune checkpoint) that suppresses an immune response with an immune checkpoint inhibitor. If the patient's cancer cells do not have a target immune checkpoint, the response of the immune checkpoint inhibitor is low. Therefore, it is important to predict the response of an immune checkpoint inhibitor before actually implementing immune checkpoint inhibition therapy.
  • Non-Patent Document 1 There is a method described in Non-Patent Document 1 as a method for predicting the response of an immune checkpoint inhibitor.
  • the effectiveness of the immune checkpoint inhibitor “pembrolizumab” is detected.
  • a tissue sample is collected from a patient and cancer cells expressing PD-L1 in the sample (PD-L1-positive cancer cells) are detected. It is predicted by.
  • Pembrolizumab is a drug that inhibits the PD-1 / PD-L1 pathway that suppresses immune responses, and is the most advanced immune checkpoint inhibitor along with nivolumab that also inhibits the PD-1 / PD-L1 pathway.
  • One of the agents is a method described in Non-Patent Document 1 as a method for predicting the response of an immune checkpoint inhibitor.
  • the effectiveness of the immune checkpoint inhibitor “pembrolizumab” is detected.
  • a tissue sample is collected from a patient and cancer cells expressing PD-L1 in the sample (PD-L1
  • Non-Patent Document 1 requires a large burden on the patient because it requires collecting tumor tissue from the patient.
  • the object of the present invention is to predict the response of an immune checkpoint inhibitor without imposing a heavy burden on the subject.
  • the present invention is a method for predicting the response of an immune checkpoint inhibitor to a subject, comprising: (a) collecting cells from a blood sample of the subject; and (b1) primary recognizing PD-L1 in the cells. Contacting the antibody and then contacting a secondary antibody that recognizes the primary antibody and labeled with a fluorescent dye, or an antibody that recognizes PD-L1 and that is labeled with a fluorescent dye A step of contacting the labeled antibody; and (c) detecting fluorescence emitted from the cell by irradiating the cell with excitation light of the fluorescent dye, wherein fluorescence of the fluorescent dye is detected.
  • the present invention provides a method for predicting that an immune checkpoint inhibitor is highly effective against a subject when the cell is a PD-L1-positive cancer cell and the cell is a PD-L1-positive cancer cell.
  • the present invention also relates to a method for predicting the response of an immune checkpoint inhibitor to a subject, comprising: (a) collecting cells from a blood sample of the subject; and (b1) recognizing PD-L1 in the cells. Contacting a primary antibody that is then contacted with a secondary antibody that recognizes the primary antibody and is labeled with a first fluorescent dye, or an antibody that recognizes PD-L1 (B2) contacting a cell with a primary antibody that recognizes an epithelial cell marker protein, and then a secondary antibody that recognizes the primary antibody. Contacting a secondary antibody labeled with a second fluorescent dye, or contacting a cell with an antibody that recognizes an epithelial cell marker protein and labeled with a second fluorescent dye.
  • the ratio of the number of PD-L1-positive cancer cells to the number of cancer cells in the cell is calculated from the combination of the above, wherein the number of cancer cells is the number of cells in which fluorescence of the second fluorescent dye is detected And the number of PD-L1-positive cancer cells is the number of cells in which the combination of the fluorescence of the first and second fluorescent dyes is detected, comprising the steps (b1) and (b2) Are performed in any order, and when the ratio of the number of PD-L1-positive cancer cells to the number of cancer cells is not less than the reference value of 30% or more, it is predicted that the response of the immune checkpoint inhibitor to the subject is high It also provides a way to do this.
  • Step (a) may be a step of filtering a blood sample with a filter and capturing cells on the filter.
  • (X1) a secondary antibody that recognizes a primary antibody and then contacts a primary antibody that recognizes a leukocyte marker protein at any stage after step (a) and before step (c)
  • a step of contacting a secondary antibody labeled with a third fluorescent dye, or a step of contacting a cell with an antibody that recognizes leukocytes and is labeled with a third fluorescent dye, (x2 And a step of labeling the nucleus of the cell with the fourth fluorescent dye may be further performed in an arbitrary order.
  • the cell is subjected to the first, second, third and fourth fluorescent dyes. And the fluorescence of the first, second, third, and fourth fluorescent dyes emitted from the cells may be detected respectively.
  • the number of cancer cells is The fluorescence of the third fluorescent dye is not observed, and the second and fourth fluorescent colors
  • the number of PD-L1-positive cancer cells is the number of cells in which the fluorescence of the third fluorescent dye is not observed, and the first, second and fourth fluorescence
  • the combination of dye fluorescence may be the number of cells detected.
  • Step (x1), step (b1) and step (b2) may be performed in this order, and step (x2) may be performed simultaneously with step (b2).
  • the immune checkpoint inhibitor may be an anti-PD-1 antibody or an anti-PD-L1 antibody.
  • the leukocyte marker protein may be CD45.
  • the epithelial cell marker protein may be cytokeratin.
  • the first, second and third fluorescent dyes may be selected from the group consisting of fluorescein, Alexa Fluor (registered trademark) 594, and Alexa Fluor (registered trademark) 647, the fourth fluorescent dye being 4 ' , 6-diamidino-2-phenylindole.
  • the response of an immune checkpoint inhibitor to a subject can be predicted easily and in a short time without imposing a heavy burden on the subject.
  • FIG. 2 is a sectional view taken along line II-II in FIG. 2 is an image of cells fluorescently labeled in Example Reference Example 1.
  • 4 is an image of cells fluorescently labeled in Example Reference Example 2.
  • 4 is an image of cells fluorescently labeled in Example Reference Example 2. It is an image of the fluorescence-labeled cell in Example Example 3. It is an image of the fluorescence-labeled cell in Example Example 3.
  • FIG. 5 is an image of cells fluorescently labeled in Example Reference Example 4.
  • the method of predicting the response of an immune checkpoint inhibitor to a subject comprises (a) a step of collecting cells from a blood sample of the subject, and (b1) a primary antibody that recognizes PD-L1 in the cells. Contacting and then contacting a secondary antibody that recognizes the primary antibody and labeled with a fluorescent dye, or a cell that is an antibody that recognizes PD-L1 and labeled with a fluorescent dye And (c) a step of irradiating cells with excitation light of a fluorescent dye to detect fluorescence emitted from the cells.
  • CTC circulating tumor cells
  • CTCs are those in which cancer cells in the lungs, liver, stomach, head and neck, bladder, urothelium, esophagus, biliary tract, breast, ovary, uterus, liver, prostate, or pancreas have entered blood vessels and lymph vessels. . Therefore, PD-L1-positive cancer cells (PD-L1-positive CTC) can be detected by using a blood sample of a subject without collecting cancer tissue in these organs.
  • PD-L1-positive CTC can be detected by using a blood sample of a subject without collecting cancer tissue in these organs.
  • CTC and “cancer cells in a blood sample” are treated as synonymous.
  • the subject may be a cancer patient or a subject who may have cancer.
  • the immune checkpoint inhibitor is not particularly limited as long as it is a drug that inhibits immune checkpoint, and may be a drug that inhibits the expression or activity of proteins involved in immune checkpoint such as PD-L1 and PD-1. .
  • the immune checkpoint inhibitor is, for example, a low molecular weight compound, an antibody, a nucleic acid, or a combination thereof.
  • Specific examples of immune checkpoint inhibitors are anti-PD-1 antibodies, anti-PD-L1 antibodies, and anti-CTLA-4 antibodies.
  • Specific examples of anti-PD-1 antibodies are nivolumam and pembrolizumab.
  • Specific examples of anti-PD-L1 antibodies are atezolizumab, durvalumab, and avelumab.
  • Specific examples of anti-CTLA-4 antibodies are tremelimumab and ipilimumab.
  • blood collected from a subject may be used as it is, or blood diluted with a buffer solution such as phosphate buffered saline (PBS) or other suitable medium may be used.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the blood sample may be added with additives that are usually added to blood samples, such as anticoagulants and fixatives.
  • the cells can be collected from the blood sample by, for example, filtering the blood sample with a filter and capturing the cells in the blood sample on the filter.
  • leukocytes have the same diameter as CTC, so that some leukocytes are captured together with CTC on the filter.
  • detection of PD-L1-positive cancer cells can be performed on the filter as it is. That is, all the steps in the present invention can be performed on the cells captured on the filter.
  • Capture means that the liquid containing the cells is filtered through, leaving the cells on the filter.
  • the filter is not particularly limited as long as it can capture CTC present in the blood sample, and a conventionally known filter can be used.
  • the filter may be, for example, a metal or resin filter, and is provided with a substrate and a through-hole provided on the substrate, preferably having a pore diameter of 5 ⁇ m to 15 ⁇ m, more preferably 6 ⁇ m to 12 ⁇ m, and even more preferably 7 ⁇ m to 10 ⁇ m. You may have.
  • the hole diameter of the through hole refers to the maximum value of the diameter of a sphere that can pass through the through hole.
  • contacting a substance with a cell can be performed, for example, by immersing the cell in the substance or a solution of the substance.
  • cleaning liquid with a cell can be performed by filtering these solutions with a filter.
  • the flow rate of the solution is preferably 50 ⁇ L / min to 3000 ⁇ L / min, more preferably 100 ⁇ L / min to 1000 ⁇ L / min, and 200 ⁇ L / min to 600 ⁇ L / min. Further preferred.
  • the cells may be washed.
  • the washing step is performed, for example, by bringing a washing solution containing a known buffer solution such as PBS into contact with the cells.
  • the washing solution may contain additives such as bovine serum albumin (BSA) or ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA). Washing is not limited to after step (a), and can be performed appropriately after each step.
  • BSA bovine serum albumin
  • EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
  • cells may be immobilized after step (a).
  • the cells can be fixed by contacting the cells with a known fixing agent such as formaldehyde. By fixing the cells, cell spoilage or aggregation can be further reduced.
  • the immobilized cells may then be permeabilized.
  • a cell can be permeabilized by contacting the cell with a known permeabilizing agent.
  • a permeation treatment agent for example, poly (oxyethylene) octylphenyl ether can be used.
  • a secondary antibody that recognizes the primary antibody is contacted with a primary antibody that recognizes PD-L1, and is then labeled with a fluorescent dye (first fluorescent dye). Is contacted (two-step fluorescent labeling).
  • an antibody that recognizes PD-L1 and is labeled with a fluorescent dye (first fluorescent dye) is brought into contact with cells (one-step fluorescent labeling).
  • PD-L1 fluorescent labeling may be performed in two steps or one step.
  • the primary antibody that recognizes PD-L1 or the antibody that recognizes PD-L1 and is labeled with a fluorescent dye is, for example, 28-8, SP142, E1L3N (registered trademark), It may be derived from a clone selected from the group consisting of EPR1161 (2) and 22C3, or may be a polyclonal antibody (for example, catalog number: 4059 from Prosci). From the viewpoint of detecting PD-L1-positive cancer cells with higher sensitivity, the primary antibody that recognizes PD-L1 or the antibody that recognizes PD-L1 is preferably derived from 28-8 or SP142.
  • the antibodies derived from these clones are all anti-PD-L1 rabbit monoclonal antibodies.
  • the fluorescent dye is not particularly limited as long as it is a fluorescent dye usually used for fluorescent labeling of antibodies.
  • the first fluorescent dye is, for example, Alexa Fluor (registered trademark) 647 or Cy (registered trademark) 5.
  • step (c) the cells are irradiated with excitation light of a fluorescent dye to detect fluorescence emitted from the cells.
  • Detection (positive) of fluorescence of the fluorescent dye indicates that the cell is a PD-L1-positive cancer cell.
  • the immune checkpoint inhibitor is highly effective against the subject.
  • an immune checkpoint inhibitor predicted to have a high response to the subject may be administered to the subject. That is, it can be said that one aspect of the present invention is a method for treating cancer patients.
  • the expression level of PD-L1 varies depending on the subject. The higher the expression level of PD-L1 in the cancer tissue, the higher the response of the immune checkpoint inhibitor to the subject. Conversely, the lower the level of PD-L1 expression in the cancer tissue, the lower the response of the immune checkpoint inhibitor to the subject, or the higher the likelihood that there will be no response.
  • the method according to one embodiment of the present invention includes (a) a step of collecting cells from a blood sample of a subject, and (b1) PD- Contacting a primary antibody that recognizes L1 and then a secondary antibody that recognizes the primary antibody and labeled with a first fluorescent dye, or recognizes PD-L1 in a cell (B2) contacting a cell with a primary antibody that recognizes a marker protein of an epithelial cell, and then recognizing a primary antibody.
  • a step of contacting a secondary antibody labeled with a second fluorescent dye, or an antibody that recognizes a marker protein of an epithelial cell and is labeled with a second fluorescent dye Contact And (c) detecting the first and second fluorescence emitted from the cells by irradiating the cells with the excitation light of the first and second fluorescent dyes, and (d) the detected fluorescence. And calculating the ratio of the number of PD-L1-positive cancer cells to the number of CTCs (cancer cells) in the cells from the combination of the above.
  • Process (a) and process (b1) are as already described.
  • the washing step and the cell immobilization and permeabilization treatment can also be appropriately performed as described in the above embodiment.
  • Step (b1) and step (b2) can be performed in any order.
  • step (b2) the cell is contacted with a primary antibody that recognizes a marker protein of epithelial cells, and then a secondary antibody that recognizes the primary antibody and is labeled with a second fluorescent dye is contacted (Two-step fluorescent labeling).
  • a secondary antibody that recognizes the primary antibody and is labeled with a second fluorescent dye is contacted.
  • cells are contacted with an antibody that recognizes epithelial cell marker protein and labeled with a second fluorescent dye (one-step fluorescent labeling).
  • CTC is fluorescently labeled.
  • CTC fluorescent labeling may be performed in either two steps or one step as described above.
  • epithelial cell marker proteins examples include cytokeratin, epithelial cell adhesion molecule (EpCAM), CD146, and CD176, with cytokeratin being preferred. Since CTC is derived from epithelial cells, it has a marker protein for these epithelial cells.
  • the second fluorescent dye is not particularly limited as long as it is a fluorescent dye that is usually used for fluorescent labeling of antibodies and is different from the first fluorescent dye.
  • the second fluorescent dye is, for example, fluorescein such as fluorescein isothiocyanate (FITC) or Alexa Fluor (registered trademark) 488.
  • a primary antibody that recognizes a marker protein of epithelial cells, a secondary antibody that is labeled with a second fluorescent dye, and an antibody that recognizes a marker protein of epithelial cells and is labeled with a second fluorescent dye may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody.
  • the animal from which the antibody is derived is not particularly limited as long as the animal from which the primary antibody is derived is different from the animal from which the secondary antibody is derived.
  • the cells are irradiated with the excitation light of the first and second fluorescent dyes to detect the first and second fluorescence emitted from the cells. Since PD-L1-positive cancer cells are labeled with the first and second fluorescent dyes, the cells in which the fluorescence of the first and second fluorescent dyes is detected can be identified as PD-L1-positive cancer cells. . Since CTC is labeled with the second fluorescent dye, a cell in which fluorescence of the second fluorescent dye is detected can be identified as CTC.
  • step (d) the ratio of the number of PD-L1-positive cancer cells to the number of CTCs in the cells is calculated from the detected fluorescence combination.
  • the percentage may be a percentage.
  • the number of PD-L1-positive cancer cells is the number of cells in which the fluorescence of the first and second fluorescent dyes was detected.
  • the number of CTC is the number of cells in which the fluorescence of the second fluorescent dye is detected.
  • the response of the immune checkpoint inhibitor to the subject is predicted to be high.
  • the reference value may be 30% or more, preferably 40% or more, and more preferably 50% or more.
  • step (b1) an antibody recognizing PD-L1 binds to PD-L1-negative cells, and fluorescence indicating PD-L1 may be observed from PD-L1-negative cells (PD- Also referred to as L1 false positive).
  • PD- Also referred to as L1 false positive
  • an antibody that recognizes cytokeratin binds to cytokeratin negative cells, and fluorescence indicating cytokeratin may be observed from cytokeratin negative cells (also called cytokeratin false positive).
  • the presence of these false positives tends to preclude adequately predicting the response of immune checkpoint inhibitors. From the viewpoint of reducing false positives and more appropriately predicting the response of immune checkpoint inhibitors, at any stage after step (a) and before step (c), the following steps (x1) and (x2) It is preferable to further perform the above.
  • the cell is contacted with a primary antibody that recognizes a marker protein of leukocytes, and then a secondary antibody that recognizes the primary antibody and is labeled with a third fluorescent dye is contacted (Two-step fluorescent labeling).
  • a secondary antibody that recognizes the primary antibody and is labeled with a third fluorescent dye is contacted.
  • cells are contacted with an antibody that recognizes leukocytes and is labeled with a third fluorescent dye (one-step fluorescent labeling).
  • leukocytes are fluorescently labeled.
  • the fluorescent labeling of leukocytes may be performed in either two steps or one step as described above.
  • Leukocyte marker protein is, for example, CD45 expressed in all hematopoietic stem cells.
  • Primary antibodies that recognize leukocyte marker proteins, secondary antibodies labeled with a third fluorescent dye, and antibodies that recognize leukocyte marker proteins and labeled with a third fluorescent dye It is not limited, A polyclonal antibody or a monoclonal antibody may be sufficient.
  • the animal from which the antibody is derived is not particularly limited as long as the animal from which the primary antibody is derived is different from the animal from which the secondary antibody is derived.
  • the third fluorescent dye is not particularly limited as long as it is a fluorescent dye usually used for fluorescent labeling of antibodies.
  • the third fluorescent dye is, for example, Alexa Fluor (registered trademark) 594 or Texas Red (registered trademark).
  • the third fluorescent dye is a fluorescent dye different from the first, second and fourth fluorescent dyes. Each fluorescent dye is distinguishable because it has a different fluorescence wavelength.
  • the first, second, and third fluorescent dyes are selected from the group consisting of fluorescein, Alexa Fluor 594, and Alexa Fluor 647, and the fourth fluorescent dye is 4 ', 6-diamidino-2-phenyl. Indole (DAPI).
  • the cell nucleus is labeled with a fourth fluorescent dye.
  • the fourth fluorescent dye for labeling the nucleus is not particularly limited as long as it is a fluorescent dye capable of binding to a nucleic acid, and a fluorescent dye usually used for fluorescently labeling a nucleus can be used.
  • Examples of the fourth fluorescent dye include DAPI and 2 ′-(4-ethoxyphenyl) -5- (4-methyl-1-piperazinyl) -2,5′-bi-1H-benzimidazole trihydrochloride (Hoechst 33342). ).
  • the order of the step (x1), the step (x2), the step (b1), and the step (b2) is not particularly limited.
  • the step (x1), the step (b1), and the step (b2) are performed in this order.
  • Step (x2) may be performed simultaneously with step (b2).
  • Cell immobilization and permeabilization may be performed between the step (x1) and the step (b1).
  • the cells are irradiated with excitation light of the first, second, third and fourth fluorescent dyes, respectively, and emitted from the cells. Fluorescence of the first, second, third and fourth fluorescent dyes to be detected is detected.
  • PD-L1-positive cancer cells are labeled with the first, second, and fourth fluorescent dyes, but are not labeled with the third fluorescent dye. Therefore, the cells in which the fluorescence of the third fluorescent dye is not detected (negative) and the fluorescence of the first, second, and fourth fluorescent dyes are detected (positive) are identified as PD-L1-positive cancer cells. be able to.
  • the number of PD-L1-positive cancer cells in step (d) is the number of such cells.
  • CTC is labeled with the second and fourth fluorescent dyes but not with the third fluorescent dye. Therefore, a cell in which the fluorescence of the third fluorescent dye is not detected (negative) and the fluorescence of the second and fourth fluorescent dyes is detected (positive) can be identified as CTC.
  • the number of CTCs in step (d) is the number of such cells.
  • the cartridge shown in FIGS. 1 and 2 can be used.
  • a method for predicting the response of an immune checkpoint inhibitor to a subject using a cartridge according to an embodiment of the present invention will be described. Unless otherwise stated, the details of each step and the order of the steps are as described in the above embodiment.
  • a CTC capturing cartridge (cartridge) 100 shown in FIGS. 1 and 2 has a housing having an inlet 130 to which an inflow pipe 125 into which liquid flows is connected and an outlet 140 to which an outflow pipe 135 from which liquid flows out is connected.
  • a body 120 and a filter 105 are provided.
  • the filter 105 is fixed by a casing 120 including an upper member 110 and a lower member 115.
  • the blood sample, the cleaning liquid, and other reaction liquids are introduced into the housing 120 through the inflow pipe 125, and are discharged to the outside through the filter 105 through the outflow pipe 135.
  • Such a liquid flow can be created, for example, by connecting a pump upstream of the inflow pipe 125 or downstream of the outflow pipe 135.
  • a cock may be provided upstream of the inflow pipe 125 and / or downstream of the outflow pipe 135 to control the flow of the liquid.
  • a blood sample is introduced into the cartridge 100 from the inflow tube 125, and the blood sample is filtered by the filter 105 (step (a)).
  • CTC and some white blood cells in the blood sample cannot pass through the through hole 106 of the filter 105 and remain on the surface of the filter 105.
  • Other components in the blood sample pass through the through hole 106 and are discharged out of the cartridge 100.
  • the filter 105 may be cleaned by passing a cleaning solution through the filter 105.
  • the filter 105 can be appropriately washed after the following steps.
  • a reaction solution containing a fixing agent and then a permeabilizing agent is optionally introduced into the cartridge 100, and held in the cartridge 100 for a predetermined time.
  • a fixing agent and a permeation treatment agent may be reacted with each other.
  • reaction solution containing a primary antibody that recognizes PD-L1 and then a secondary antibody that recognizes the primary antibody and is labeled with a fluorescent dye (first fluorescent dye) are applied to the cells.
  • the contained reaction solution is reacted with the cells captured on the filter 105.
  • a reaction solution containing an antibody that recognizes PD-L1 and is labeled with a fluorescent dye (first fluorescent dye) is allowed to react with the cells captured on the filter 105 (step (step ( b1)).
  • the cartridge 100 is irradiated with excitation light of a fluorescent dye using a fluorescence microscope to detect fluorescence emitted from the cells captured on the filter 105 (step (c)).
  • the fluorescence is detected by, for example, observing the cartridge 100 from the upper surface in the vertical direction of the cartridge 100 and processing the fluorescence observation image.
  • the cartridge can also be used in an embodiment further comprising step (b2) and step (d). Further, optional steps (x1) and (x2) can be further performed.
  • the non-small cell lung cancer cell line contained in the culture flask was cultured at 37 ° C. in a carbon dioxide incubator. Trypsin-EDTA with a concentration of 0.25% was added to the culture flask, and the cultured cells attached to the flask were detached from the flask. The detached cells were counted using a hemocytometer and a phase contrast microscope. A blood sample in which the blood of a lung cancer patient was sprinkled was prepared by adding 100 cells to the blood of a healthy person collected in a blood collection tube.
  • NCI-H820 high expression of PD-L1
  • NCI-H441 expressed in PD-L1
  • A549 low expression of PD-L1
  • NCI-H23 differed in the expression level of PD-L1, respectively.
  • Four types of blood samples were prepared using four types (PD-L1 negative).
  • a blood collection tube a blood collection tube containing EDTA-2K (ethylenediaminetetraacetic acid dipotassium salt) manufactured by Becton Dickinson & Company was used.
  • the CTC capture device includes a reservoir for introducing a blood sample and other reaction solution, and a CTC capture cartridge.
  • the CTC capture cartridge (hereinafter also referred to as cartridge) includes a thin-film metal filter (membrane area 6 mm ⁇ 6 mm, film thickness 18 ⁇ m) having a large number of through-holes having a major axis of 100 ⁇ m and a minor axis of 8 ⁇ m. This corresponds to the cartridge 100.
  • the cartridge was filled with a PBS solution containing 0.5% BSA and 2 mM EDTA (hereinafter referred to as “cleaning solution”). 7 mL of the washing solution was placed in the reservoir, and 3 mL of the blood sample was added under the washing solution so that the blood sample and the washing solution were layered.
  • the CTC capture device was activated, the blood sample and the washing solution in the reservoir were introduced into the cartridge at a flow rate of 200 ⁇ L / min, and the cells in the blood sample were captured on the filter.
  • a washing solution was introduced into the cartridge to wash away blood components remaining on the filter.
  • a reaction solution containing 1.25 mL of anti-human CD45 mouse monoclonal antibody (clone: 2D1) was introduced into the cartridge at a flow rate of 200 ⁇ L / min and reacted at room temperature for 30 minutes.
  • 1.40 mL of the washing solution was introduced into the cartridge at a flow rate of 400 ⁇ L / min, and the reaction solution in the cartridge was discharged.
  • a reaction solution containing 1.25 mL of Alexa Fluor 594-labeled anti-mouse IgG goat polyclonal antibody was introduced into the cartridge at a flow rate of 400 ⁇ L / min and reacted at room temperature for 30 minutes.
  • 1.40 mL of the washing solution was introduced into the cartridge at a flow rate of 400 ⁇ L / min, and the reaction solution in the cartridge was discharged.
  • a reaction solution containing 1.25 mL of anti-human PD-L1 rabbit monoclonal antibody (clone: 28-8) was introduced into the cartridge at a flow rate of 200 ⁇ L / min and reacted at room temperature for 60 minutes. 1.40 mL of the washing solution was introduced into the cartridge at a flow rate of 400 ⁇ L / min, and the reaction solution in the cartridge was discharged.
  • a reaction solution containing 1.25 mL of Alexa Fluor 647-labeled anti-rabbit IgG goat polyclonal antibody was introduced into the cartridge at a flow rate of 400 ⁇ L / min and reacted at room temperature for 30 minutes. 1.40 mL of the washing solution was introduced into the cartridge at a flow rate of 400 ⁇ L / min, and the reaction solution in the cartridge was discharged.
  • a reaction solution containing FITC-labeled anti-human cytokeratin mouse monoclonal antibody (clone: mixture of CK3, 6H5, AE1, and AE3) and DAPI is introduced into the cartridge at 400 ⁇ L / min and reacted at room temperature for 30 minutes. I let you. 3.00 mL of the cleaning solution was introduced into the cartridge at a flow rate of 400 ⁇ L / min, and the reaction solution in the cartridge was discharged. The cartridge was then removed from the CTC capture device.
  • the cartridge was set on a fluorescence microscope. Fluorescent mirror units (FITC, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 647, and DAPI) were each excited using a fluorescent mirror unit. The fluorescence emitted from each fluorescent dye was photographed, and the resulting images were synthesized.
  • Fluorescent mirror units FITC, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 647, and DAPI
  • H820 means NCI-H820
  • H441 means NCI-H441
  • H23 means NCI-H23 (hereinafter the same).
  • NCI-H820 and NCI-H441 which are PD-L1-positive cancer cell lines
  • the cell nucleus (DAPI), cytokeratin (FITC), and PD-L1 are positive
  • FITC cytokeratin
  • PD-L1 Alexa Fluor 647
  • a fluorescent image of cells negative for CD45 Alexa Fluor 594
  • NCI-H23 which is a PD-L1-negative cancer cell line
  • fluorescence images of cells positive for cell nuclei and cytokeratin and negative for CD45 and PD-L1 were obtained.
  • Example of Reference Example 2 NCI-H820 was used as a cell line. Cell fluorescence was observed in the same manner as in Example 1 except that the anti-human PD-L1 rabbit monoclonal antibody clone was changed to SP142.
  • FIGS. As shown in these figures, fluorescence images of cells positive for cell nuclei, cytokeratin, and PD-L1, and negative for CD45 were obtained. In the lower right of FIG. 5, leukocytes that are positive for cell nuclei and CD45, and negative for cytokeratin and PD-L1 are seen. There was no PD-L1 false positive due to non-specific binding of the antibody.
  • Example of Reference Example 3 NCI-H820 was used as a cell line.
  • Example Reference Example 1 except that the anti-human PD-L1 rabbit monoclonal antibody was changed to an antibody derived from E1L3N (registered trademark), an antibody derived from EPR1161 (2), and a polyclonal antibody (manufactured by Prosci, catalog number: 4059). Cell fluorescence was observed by the same method. The results are shown in FIGS.
  • FIG. 7 shows that non-specific binding of the antibody was observed in the experiment using any antibody.
  • Example of Reference 4 Cell fluorescence was observed in the same manner as in Example 1 except that the labeling dye of the secondary antibody against PD-L1 (anti-rabbit IgG goat polyclonal antibody) was changed to Alexa Fluor 680 and Alexa Fluor (registered trademark) 700 did.
  • Example 1 ⁇ Detection of PD-L1-positive cancer cells> Blood was collected from 30 cancer patients diagnosed with non-small cell lung cancer. Details of cancer patients are shown in Table 1.
  • a blood collection tube a blood collection tube containing EDTA-2K (ethylenediaminetetraacetic acid dipotassium salt) manufactured by Becton Dickinson & Company was used.
  • EDTA-2K ethylenediaminetetraacetic acid dipotassium salt
  • EGFR mutation means a mutation of the epidermal growth factor receptor gene
  • AK translocation means a translocation of the anaplastic lymphoma kinase gene
  • PD-L1-positive cancer cells were detected in the blood sample. Detection was performed in the same manner as in Example 1 except that the above blood sample was used.
  • the number of cells ie, the number of CTCs
  • DAPI cell nucleus
  • FITC cytokeratin
  • CD45 Alexa Fluor 594
  • the number of cells that are positive for cell nuclei, cytokeratin, and PD-L1 and negative for CD45 was determined from the fluorescence composite image. From these values, the ratio (%) of the number of PD-L1-positive cancer cells to the number of CTCs was calculated.
  • nivolumum response> Of the 30 patients, 28 patients who were able to calculate the ratio of the number of PD-L1-positive cancer cells to the number of CTCs were administered nivolumam 3 mg / kg at 2-week intervals. The administration was continued until it was judged clinically ineffective or impossible to administer due to side effects, and the administration period ranged from about 6 to 8 weeks. Approximately 42 days after administration, the size of the patient's tumor (target lesion) was measured from a cross-sectional image of computed tomography (CT) and compared with the size of the tumor before administration, and the efficacy of nivolum was evaluated.
  • CT computed tomography
  • CR Complete response, complete response
  • PR Partial Response
  • PD progressive disease: compared to the smallest sum of diameters in progress (if the baseline sum is the smallest value in progress, this is the smallest sum of diameters) Increased by 20% or more, and diameter sum increased by 5mm or more even in absolute value SD (stable disease): There is no reduction corresponding to PR and no increase corresponding to PD as compared with the minimum diameter sum in progress.
  • Table 2 to Table 4 show the response of nivolumam in patient groups in which the ratio (%) of PD-L1-positive cancer cells to the number of CTCs was 50%, 40%, 30% or more, respectively. It is a summary of sex. These results indicate that nivolumam was effective for many patients whose ratio of the number of PD-L1-positive cancer cells to the number of CTCs was 30% or more. This indicates the validity of predicting that the immune checkpoint inhibitor is highly responsive to subjects with a proportion of PD-L1-positive cancer cells of 30% or higher.

Abstract

本発明に係る被験者に対する免疫チェックポイント阻害剤の奏効性を予測する方法は、（ａ）被験者の血液試料から細胞を採取する工程と、（ｂ１）細胞に、ＰＤ－Ｌ１を認識する一次抗体を接触させ、次いで一次抗体を認識する二次抗体であって蛍光色素で標識されている二次抗体を接触させる工程、又は、細胞に、ＰＤ－Ｌ１を認識する抗体であって蛍光色素で標識されている抗体を接触させる工程と、（ｃ）細胞に蛍光色素の励起光を照射して、細胞から発せられる蛍光を検出する工程と、を備え、細胞がＰＤ－Ｌ１陽性癌細胞である場合に、被験者に対する免疫チェックポイント阻害剤の奏効性が高いと予測する。かかる方法によれば、被験者に大きな負担をかけることなく、免疫チェックポイント阻害剤の奏効性を予測することができる。

Description

被験者に対する免疫チェックポイント阻害剤の奏効性を予測する方法
　本発明は、被験者に対する免疫チェックポイント阻害剤の奏効性を予測する方法に関する。
　癌の治療方法の一つとして「免疫チェックポイント阻害療法」が知られている。免疫チェックポイント阻害療法は、免疫反応を抑制する反応経路（免疫チェックポイント）を免疫チェックポイント阻害剤で阻害することにより、免疫細胞を活性化させる。患者の癌細胞が標的の免疫チェックポイントを有さない場合、免疫チェックポイント阻害剤の奏効性は低い。そのため、免疫チェックポイント阻害療法を実際に実施する前に、免疫チェックポイント阻害剤の奏効性を予測することが重要である。
　免疫チェックポイント阻害剤の奏効性を予測する方法として、非特許文献１に記載される方法がある。この文献では、免疫チェックポイント阻害剤「ペムブロリズマブ」の奏功性を、患者から組織検体を採取して、検体中のＰＤ－Ｌ１を発現している癌細胞（ＰＤ－Ｌ１陽性癌細胞）を検出することにより予測している。ペムブロリズマブは、免疫反応を抑制するＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１経路を阻害する薬剤であり、同じくＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１経路を阻害するニボルマブと並んで、開発が最も進んでいる免疫チェックポイント阻害剤の一つである。
"Ｔｈｅ　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ"、２０１５、Ｖｏｌ．３７２、Ｎｏ．２１、ｐ．２０１８－２０２８
　非特許文献１の方法は、患者から腫瘍組織を採取することを要するため、患者への負担が大きかった。本発明は、被験者に大きな負担をかけることなく、免疫チェックポイント阻害剤の奏効性を予測することを目的とする。
　本発明は、被験者に対する免疫チェックポイント阻害剤の奏効性を予測する方法であって、（ａ）被験者の血液試料から細胞を採取する工程と、（ｂ１）細胞に、ＰＤ－Ｌ１を認識する一次抗体を接触させ、次いで一次抗体を認識する二次抗体であって蛍光色素で標識されている二次抗体を接触させる工程、又は、細胞に、ＰＤ－Ｌ１を認識する抗体であって蛍光色素で標識されている抗体を接触させる工程と、（ｃ）細胞に蛍光色素の励起光を照射して、細胞から発せられる蛍光を検出する工程と、を備え、蛍光色素の蛍光が検出されることが、細胞がＰＤ－Ｌ１陽性癌細胞であることを示し、細胞がＰＤ－Ｌ１陽性癌細胞である場合に、被験者に対する免疫チェックポイント阻害剤の奏効性が高いと予測する方法を提供する。
　また、本発明は、被験者に対する免疫チェックポイント阻害剤の奏効性を予測する方法であって、（ａ）被験者の血液試料から細胞を採取する工程と、（ｂ１）細胞に、ＰＤ－Ｌ１を認識する一次抗体を接触させ、次いで一次抗体を認識する二次抗体であって第一の蛍光色素で標識されている二次抗体を接触させる工程、又は、細胞に、ＰＤ－Ｌ１を認識する抗体であって第一の蛍光色素で標識されている抗体を接触させる工程と、（ｂ２）細胞に、上皮細胞のマーカータンパク質を認識する一次抗体を接触させ、次いで一次抗体を認識する二次抗体であって第二の蛍光色素で標識されている二次抗体を接触させる工程、又は、細胞に、上皮細胞のマーカータンパク質を認識する抗体であって第二の蛍光色素で標識されている抗体を接触させる工程と、（ｃ）細胞に、第一及び第二の蛍光色素の励起光を照射して、細胞から発せられる第一及び第二の蛍光を検出する工程と、（ｄ）検出された蛍光の組み合わせから、細胞における、癌細胞の数に対するＰＤ－Ｌ１陽性癌細胞の数の割合を算出する工程であって、癌細胞の数は、第二の蛍光色素の蛍光が検出された細胞の数であり、ＰＤ－Ｌ１陽性癌細胞の数は、第一及び第二の蛍光色素の蛍光の組み合わせが検出された細胞の数である、工程と、を備え、工程（ｂ１）及び工程（ｂ２）を任意の順で行い、癌細胞の数に対するＰＤ－Ｌ１陽性癌細胞の数の割合が、３０％以上の基準値以上である場合に、被験者に対する免疫チェックポイント阻害剤の奏効性が高いと予測する方法も提供する。
　工程（ａ）は、血液試料をフィルターでろ過してフィルター上に細胞を捕捉する工程であってもよい。
　工程（ａ）の後かつ工程（ｃ）の前の任意の段階で、（ｘ１）細胞に、白血球のマーカータンパク質を認識する一次抗体を接触させ、次いで一次抗体を認識する二次抗体であって第三の蛍光色素で標識されている二次抗体を接触させる工程、又は、細胞に、白血球を認識する抗体であって第三の蛍光色素で標識されている抗体を接触させる工程と、（ｘ２）細胞の核を第四の蛍光色素で標識する工程と、を任意の順でさらに行ってもよく、工程（ｃ）において、細胞に、第一、第二、第三及び第四の蛍光色素の励起光をそれぞれ照射して、細胞から発せられる第一、第二、第三、及び第四の蛍光色素の蛍光をそれぞれ検出してもよく、工程（ｄ）において、癌細胞の数は、第三の蛍光色素の蛍光が観察されず、かつ、第二及び第四の蛍光色素の蛍光の組み合わせが検出された細胞の数であってよく、ＰＤ－Ｌ１陽性癌細胞の数は、第三の蛍光色素の蛍光が観察されず、かつ、第一、第二及び第四の蛍光色素の蛍光の組み合わせが検出された細胞の数であってよい。
　工程（ｘ１）、工程（ｂ１）及び工程（ｂ２）をこの順で行ってもよく、工程（ｘ２）を工程（ｂ２）と同時に行ってもよい。免疫チェックポイント阻害剤は、抗ＰＤ－１抗体又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体であってよい。白血球のマーカータンパク質はＣＤ４５であってよい。上皮細胞のマーカータンパク質はサイトケラチンであってよい。第一、第二、及び第三の蛍光色素は、フルオレセイン、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）　５９４、及びＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）　６４７からなる群より選ばれてもよく、第４の蛍光色素は４′，６－ジアミジノ－２－フェニルインドールであってもよい。
　本発明の方法によれば、血液試料を使用することにより、被験者に大きな負担をかけることなく、簡単かつ短時間で、被験者に対する免疫チェックポイント阻害剤の奏効性を予測することができる。
細胞捕捉カートリッジの一実施形態を示す斜視図である。 図１におけるＩＩ－ＩＩ線断面図である。 実施参考例１において蛍光標識された細胞の画像である。 実施参考例２において蛍光標識された細胞の画像である。 実施参考例２において蛍光標識された細胞の画像である。 実施参考例３において蛍光標識された細胞の画像である。 実施参考例３において蛍光標識された細胞の画像である。 実施参考例４において蛍光標識された細胞の画像である。
　本発明の、被験者に対する免疫チェックポイント阻害剤の奏効性を予測する方法は、（ａ）被験者の血液試料から細胞を採取する工程と、（ｂ１）細胞に、ＰＤ－Ｌ１を認識する一次抗体を接触させ、次いで一次抗体を認識する二次抗体であって蛍光色素で標識されている二次抗体を接触させる工程、又は、細胞に、ＰＤ－Ｌ１を認識する抗体であって蛍光色素で標識されている抗体を接触させる工程と、（ｃ）細胞に蛍光色素の励起光を照射して、細胞から発せられる蛍光を検出する工程と、を備える。癌患者の血液中には、血中循環癌細胞（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ　Ｔｕｍｏｒ　Ｃｅｌｌ、以下、「ＣＴＣ」ともいう。）と呼ばれ、血管及びリンパ管を通じて体内を循環する癌細胞が存在する場合がある。ＣＴＣは、例えば、肺、肝臓、胃、頭頸、膀胱、尿路上皮、食道、胆道、乳腺、卵巣、子宮、肝臓、前立腺、又は膵臓における癌の細胞が血管及びリンパ管に侵入したものである。したがって、これらの器官における癌組織を採取せずとも、被験者の血液試料を使用することで、ＰＤ－Ｌ１陽性癌細胞（ＰＤ－Ｌ１陽性のＣＴＣ）を検出することができる。本明細書において、「ＣＴＣ」と「血液試料中の癌細胞」は同義として扱う。
　被験者は、癌患者又は癌を患っている可能性のある対象であってよい。
　免疫チェックポイント阻害剤は、免疫チェックポイントを阻害する薬剤であれば特に制限されず、ＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－１等、免疫チェックポイントに関与するタンパク質の発現又は活性を阻害する薬剤であってよい。免疫チェックポイント阻害剤は、例えば、低分子化合物、抗体、核酸、又はこれらの組み合わせである。免疫チェックポイント阻害剤の具体例は、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、及び抗ＣＴＬＡ－４抗体である。抗ＰＤ－１抗体の具体例は、ニボルマム及びペムブロリズマブである。抗ＰＤ－Ｌ１抗体の具体例は、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、及びアベルマブである。抗ＣＴＬＡ－４抗体の具体例は、トレメリムマブ及びイピリムマブである。
　血液試料としては、被験者から採取した血液をそのまま使用してもよいし、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等の緩衝液又はその他適当な媒体で希釈された血液を使用してもよい。血液試料には、抗凝固剤及び固定剤等、通常血液試料に添加される添加剤が添加されていてもよい。
　工程（ａ）において、細胞は、例えば、血液試料をフィルターでろ過して、フィルター上に血液試料中の細胞を捕捉することで、血液試料から採取することができる。血液中に含まれる細胞のうち、白血球はＣＴＣと同程度の直径を有するため、フィルター上にはＣＴＣとともに一部の白血球が捕捉される。フィルターにより血液試料中の細胞を採取する場合、ＰＤ－Ｌ１陽性癌細胞の検出は、そのままフィルター上で行うことができる。すなわち、本発明における全ての工程は、フィルター上に捕捉された細胞に対して行うことができる。「捕捉」とは、細胞を含有する液体をフィルターでろ過して、細胞をフィルター上に残留させることを意味する。
　フィルターは、血液試料中に存在するＣＴＣを捕捉できるフィルターであれば特に限定されず、従来公知のフィルターを使用できる。フィルターは、例えば、金属又は樹脂製のフィルターであってよく、基板と、基板上に設けられた、好ましくは５μｍ～１５μｍ、より好ましくは６μｍ～１２μｍ、さらに好ましくは７μｍ～１０μｍの孔径の貫通孔と、を有してもよい。貫通孔の孔径は、貫通孔を通過できる球の直径の最大値をいう。
　本明細書において、細胞に物質を「接触させる」ことは、例えば、細胞をその物質若しくはその物質の溶液に浸すことにより行うことができる。細胞の採取にフィルターを使用する場合、細胞に反応液又は洗浄液を接触させることは、これらの溶液をフィルターでろ過することにより行うことができる。ろ過の際、細胞へのダメージを最小限に抑える観点から、溶液の流速は、５０μＬ／分～３０００μＬ／分が好ましく、１００μＬ／分～１０００μＬ／分がより好ましく、２００μＬ／分～６００μＬ／分がさらに好ましい。
　工程（ａ）の後、細胞を洗浄してもよい。洗浄工程は、例えば、ＰＢＳ等の既知の緩衝液を含む洗浄液を、細胞に接触させることで行う。洗浄液には、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）又はエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等の添加物が含まれていてよい。洗浄は、工程（ａ）の後に限らず、各工程の後に適宜行うことができる。
　さらに、工程（ａ）の後、細胞を固定化してもよい。ホルムアルデヒド等の公知の固定剤を細胞に接触させることで、細胞を固定化できる。細胞を固定化することにより、細胞の腐敗又は凝集をより軽減することができる。
　固定化した細胞を、次いで透過処理してもよい。公知の透過処理剤を細胞に接触させることで、細胞を透過処理することができる。透過処理剤としては、例えば、ポリ（オキシエチレン）オクチルフェニルエーテルを使用することができる。
　工程（ｂ１）では、細胞に、ＰＤ－Ｌ１を認識する一次抗体を接触させ、次いで一次抗体を認識する二次抗体であって蛍光色素（第一の蛍光色素）で標識されている二次抗体を接触させる（二段階の蛍光標識）。あるいは、細胞に、ＰＤ－Ｌ１を認識する抗体であって蛍光色素（第一の蛍光色素）で標識されている抗体を接触させる（一段階の蛍光標識）。この工程によりＰＤ－Ｌ１が蛍光標識される。ＰＤ－Ｌ１の蛍光標識は、上記のように、二段階又は一段階のいずれで行ってもよい。
　ＰＤ－Ｌ１を認識する一次抗体又はＰＤ－Ｌ１を認識する抗体であって蛍光色素（第一の蛍光色素）で標識されている抗体は、例えば、２８－８、ＳＰ１４２、Ｅ１Ｌ３Ｎ（登録商標）、ＥＰＲ１１６１（２）、及び２２Ｃ３からなる群より選ばれるクローンに由来してもよく、ポリクローナル抗体（例えば、Ｐｒｏｓｃｉ社のカタログ番号：４０５９）であってもよい。より高い感度でＰＤ－Ｌ１陽性癌細胞を検出する観点から、ＰＤ－Ｌ１を認識する一次抗体又はＰＤ－Ｌ１を認識する抗体は、２８－８又はＳＰ１４２に由来することが好ましい。また、２８－８に由来する抗体又はＳＰ１４２に由来する抗体を使用することで、抗体の非特異的な結合を低減することができ、したがって、偽陽性を減らすことができる。これらのクローンに由来する抗体は、いずれも抗ＰＤ－Ｌ１ウサギモノクローナル抗体である。
　蛍光色素（第一の蛍光色素）は、抗体の蛍光標識に通常使用される蛍光色素であれば特に限定されない。第一の蛍光色素は、例えば、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）　６４７又はＣｙ（登録商標）５である。
　最後に、工程（ｃ）において、細胞に蛍光色素の励起光を照射して、細胞から発せられる蛍光を検出する。蛍光色素（第一の蛍光色素）の蛍光が検出される（陽性）ことは、細胞がＰＤ－Ｌ１陽性癌細胞であることを示す。細胞がＰＤ－Ｌ１陽性癌細胞である場合、被験者に対する免疫チェックポイント阻害剤の奏効性が高いと予測する。その後、被験者に対する奏効性が高いと予測された免疫チェックポイント阻害剤を、その被験者に投与してもよい。すなわち、本発明の一側面は、癌患者を治療する方法であるともいえる。
　ＰＤ－Ｌ１の発現量は被験者によって異なる。癌組織におけるＰＤ－Ｌ１の発現の程度が高いほど、被験者に対する免疫チェックポイント阻害剤の奏効性は高い傾向にある。逆に、癌組織におけるＰＤ－Ｌ１の発現の程度が低いほど、被験者に対する免疫チェックポイント阻害剤の奏効性は低いか、奏効性が全くない可能性が高い傾向にある。免疫チェックポイント阻害剤の奏効性をより適格に予測する観点から、本発明の一形態に係る方法は、（ａ）被験者の血液試料から細胞を採取する工程と、（ｂ１）細胞に、ＰＤ－Ｌ１を認識する一次抗体を接触させ、次いで一次抗体を認識する二次抗体であって第一の蛍光色素で標識されている二次抗体を接触させる工程、又は、細胞に、ＰＤ－Ｌ１を認識する抗体であって第一の蛍光色素で標識されている抗体を接触させる工程と、（ｂ２）細胞に、上皮細胞のマーカータンパク質を認識する一次抗体を接触させ、次いで一次抗体を認識する二次抗体であって第二の蛍光色素で標識されている二次抗体を接触させる工程、又は、細胞に、上皮細胞のマーカータンパク質を認識する抗体であって第二の蛍光色素で標識されている抗体を接触させる工程と、（ｃ）細胞に、第一及び第二の蛍光色素の励起光を照射して、細胞から発せられる第一及び第二の蛍光を検出する工程と、（ｄ）検出された蛍光の組み合わせから、細胞における、ＣＴＣ（癌細胞）の数に対するＰＤ－Ｌ１陽性癌細胞の数の割合を算出する工程と、を備えてもよい。
　工程（ａ）及び工程（ｂ１）は既に説明したとおりである。洗浄工程並びに細胞の固定化及び透過処理も、上記実施形態において説明したとおり、適宜行うことができる。工程（ｂ１）と工程（ｂ２）は、任意の順で行うことができる。
　工程（ｂ２）では、細胞に、上皮細胞のマーカータンパク質を認識する一次抗体を接触させ、次いで一次抗体を認識する二次抗体であって第二の蛍光色素で標識されている二次抗体を接触させる（二段階の蛍光標識）。あるいは、細胞に、上皮細胞のマーカータンパク質を認識する抗体であって第二の蛍光色素で標識されている抗体を接触させる（一段階の蛍光標識）。この工程により、ＣＴＣが蛍光標識される。ＣＴＣの蛍光標識は、上記のように二段階又は一段階のいずれで行ってもよい。
　上皮細胞のマーカータンパク質としては、例えば、サイトケラチン、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、ＣＤ１４６、及びＣＤ１７６が挙げられ、サイトケラチンが好ましい。ＣＴＣは上皮細胞に由来するため、これら上皮細胞のマーカータンパク質を有する。
　第二の蛍光色素は、抗体の蛍光標識に通常使用される蛍光色素であって、第一の蛍光色素とは別の蛍光色素であれば特に限定されない。第二の蛍光色素は、例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）等のフルオレセイン又はＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）　４８８である。
　上皮細胞のマーカータンパク質を認識する一次抗体、第二の蛍光色素で標識されている二次抗体、及び上皮細胞のマーカータンパク質を認識する抗体であって第二の蛍光色素で標識されている抗体は、特に限定されず、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体であってよい。抗体が由来する動物は、一次抗体が由来する動物と二次抗体が由来する動物とが異なる動物である限り、特に限定されない。
　本実施形態において、工程（ｃ）では、細胞に、第一及び第二の蛍光色素の励起光を照射して、細胞から発せられる第一及び第二の蛍光を検出する。ＰＤ－Ｌ１陽性癌細胞は第一及び第二の蛍光色素で標識されているため、第一及び第二の蛍光色素の蛍光が検出される細胞をＰＤ－Ｌ１陽性癌細胞と同定することができる。ＣＴＣは第二の蛍光色素で標識されているため、第二の蛍光色素の蛍光が検出される細胞を、ＣＴＣと同定することができる。
　最後に、工程（ｄ）において、検出された蛍光の組み合わせから、細胞における、ＣＴＣの数に対するＰＤ－Ｌ１陽性癌細胞の数の割合を算出する。割合は百分率であってもよい。ＰＤ－Ｌ１陽性癌細胞の数は、第一及び第二の蛍光色素の蛍光が検出された細胞の数である。ＣＴＣの数は、第二の蛍光色素の蛍光が検出された細胞の数である。
　ＣＴＣの数に対するＰＤ－Ｌ１陽性癌細胞の数の割合が基準値以上である場合に、被験者に対する免疫チェックポイント阻害剤の奏効性が高いと予測する。免疫チェックポイント阻害剤の奏効性をより適格に予測する観点から、基準値は３０％以上であってよく、４０％以上であることが好ましく、５０％以上であることがより好ましい。その後、被験者に対する奏効性が高いと予測された免疫チェックポイント阻害剤を、その被験者に投与してもよい。
　血液試料中には、ＰＤ－Ｌ１陽性癌細胞の他に、ＰＤ－Ｌ１陰性癌細胞、白血球等のその他の細胞が多数存在する。このため、工程（ｂ１）において、ＰＤ－Ｌ１を認識する抗体がＰＤ－Ｌ１陰性の細胞に結合し、ＰＤ－Ｌ１陰性の細胞からＰＤ－Ｌ１を示す蛍光が観察される場合がある（ＰＤ－Ｌ１偽陽性ともいう）。同様に、サイトケラチンを認識する抗体がサイトケラチン陰性の細胞に結合し、サイトケラチン陰性の細胞からサイトケラチンを示す蛍光が観察される場合もある（サイトケラチン偽陽性ともいう）。これら偽陽性の存在は、免疫チェックポイント阻害剤の奏効性を適格に予測することを、妨げる傾向にある。偽陽性を減らし、免疫チェックポイント阻害剤の奏効性をより適格に予測する観点から、工程（ａ）の後かつ工程（ｃ）の前の任意の段階で、以下の工程（ｘ１）及び（ｘ２）をさらに行うことが好ましい。
　工程（ｘ１）では、細胞に、白血球のマーカータンパク質を認識する一次抗体を接触させ、次いで一次抗体を認識する二次抗体であって第三の蛍光色素で標識されている二次抗体を接触させる（二段階の蛍光標識）。あるいは、細胞に、白血球を認識する抗体であって第三の蛍光色素で標識されている抗体を接触させる（一段階の蛍光標識）。この工程により、白血球が蛍光標識される。白血球の蛍光標識は、上記のように二段階又は一段階のいずれで行ってもよい。
　白血球のマーカータンパク質は、例えば、全造血幹細胞に発現するＣＤ４５である。
　白血球のマーカータンパク質を認識する一次抗体、第三の蛍光色素で標識されている二次抗体、及び白血球のマーカータンパク質を認識する抗体であって第三の蛍光色素で標識されている抗体は、特に限定されず、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体であってよい。抗体が由来する動物は、一次抗体が由来する動物と二次抗体が由来する動物とが異なる動物である限り、特に限定されない。
　第三の蛍光色素は、抗体の蛍光標識に通常使用される蛍光色素であれば特に限定されない。第三の蛍光色素は、例えば、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）　５９４又はＴｅｘａｓ　Ｒｅｄ（登録商標）である。第三の蛍光色素は、第一、第二及び第四の蛍光色素とは別の蛍光色素である。各蛍光色素は異なる蛍光波長を有するため、識別可能である。好ましくは、第一、第二、及び第三の蛍光色素は、フルオレセイン、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　５９４、及びＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　６４７からなる群より選ばれ、第４の蛍光色素は４′，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）である。
　工程（ｘ２）では、細胞の核を第四の蛍光色素で標識する。核を標識する第四の蛍光色素は、核酸に結合することができる蛍光色素であれば特に限定されず、核を蛍光標識するのに通常用いられる蛍光色素を使用することができる。第四の蛍光色素としては、例えば、ＤＡＰＩ及び２′－（４－エトキシフェニル）－５－（４－メチル－１－ピペラジニル）－２，５′－ビ－１Ｈ－ベンゾイミダゾール三塩酸塩（Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２）が挙げられる。
　工程（ｘ１）、工程（ｘ２）、工程（ｂ１）、及び工程（ｂ２）の順番は特に限定されず、例えば、工程（ｘ１）、工程（ｂ１）及び工程（ｂ２）をこの順で行い、工程（ｘ２）を工程（ｂ２）と同時に行ってもよい。工程（ｘ１）と工程（ｂ１）との間に、細胞の固定化及び透過処理を行ってもよい。
　任意である工程（ｘ１）及び（ｘ２）を行う場合、工程（ｃ）では、細胞に、第一、第二、第三及び第四の蛍光色素の励起光をそれぞれ照射して、細胞から発せられる第一、第二、第三及び第四の蛍光色素の蛍光をそれぞれ検出する。ＰＤ－Ｌ１陽性癌細胞は、第一、第二、及び第四の蛍光色素で標識されているが、第三の蛍光色素では標識されていない。したがって、第三の蛍光色素の蛍光が検出されず（陰性）、第一、第二、及び第四の蛍光色素の蛍光が検出される（陽性）細胞を、ＰＤ－Ｌ１陽性癌細胞と同定することができる。工程（ｄ）におけるＰＤ－Ｌ１陽性癌細胞の数は、このような細胞の数である。ＣＴＣは、第二及び第四の蛍光色素で標識されているが、第三の蛍光色素では標識されていない。したがって、第三の蛍光色素の蛍光が検出されず（陰性）、第二、及び第四の蛍光色素の蛍光が検出される（陽性）細胞を、ＣＴＣと同定することができる。工程（ｄ）におけるＣＴＣの数は、このような細胞の数である。
　上記のいずれかの方法により血液試料中のＰＤ－Ｌ１陽性癌細胞を検出するときは、例えば、図１及び図２に示すカートリッジを用いることができる。以下、本発明の一実施形態であって、カートリッジを使用して被験者に対する免疫チェックポイント阻害剤の奏効性を予測する方法について述べる。別段の記載がない限り、各工程についての詳細及び工程の順番は、上記実施形態で述べたとおりである。
　図１及び図２に示すＣＴＣ捕捉カートリッジ（カートリッジ）１００は、液体が流入する流入管１２５が接続された流入口１３０と、液体が流出する流出管１３５が接続された流出口１４０とを有する筐体１２０と、フィルター１０５とを備える。フィルター１０５は、上部部材１１０及び下部部材１１５から構成される筐体１２０により固定されている。血液試料、洗浄液及びその他の反応液は、流入管１２５を通って筐体１２０の内部に導入され、フィルター１０５を通って、流出管１３５から外部に排出される。このような液体の流れは、例えば、流入管１２５の上流又は流出管１３５の下流にポンプを接続することにより作り出すことができる。また、流入管１２５の上流及び／又は流出管１３５の下流にコックを設け、液体の流れを制御してもよい。
　はじめに、血液試料を流入管１２５からカートリッジ１００内に導入して、血液試料をフィルター１０５でろ過する（工程（ａ））。血液試料中のＣＴＣ及び一部の白血球は、フィルター１０５の貫通孔１０６を通過できず、フィルター１０５の表面に残留する。血液試料中のその他の成分は、貫通孔１０６を通過し、カートリッジ１００の外へと排出される。次いで、洗浄液をフィルター１０５に通液してフィルター１０５を洗浄してもよい。フィルター１０５の洗浄は、以下の各工程の後にも、適宜行うことができる。
　さらに、フィルター１０５上に細胞が捕捉された後、固定剤、次いで透過処理剤を含む反応液を、それぞれカートリッジ１００内に任意で導入して、カートリッジ１００内に所定時間保持することで、細胞と固定剤及び透過処理剤とをそれぞれ反応させてもよい。
　同様にして、細胞に、ＰＤ－Ｌ１を認識する一次抗体を含む反応液、次いで一次抗体を認識する二次抗体であって蛍光色素（第一の蛍光色素）で標識されている二次抗体を含む反応液を、それぞれフィルター１０５上に捕捉された細胞と反応させる。あるいは、細胞に、ＰＤ－Ｌ１を認識する抗体であって蛍光色素（第一の蛍光色素）で標識されている抗体を含む反応液を、フィルター１０５上に捕捉された細胞と反応させる（工程（ｂ１））。
　最後に、蛍光顕微鏡を使用してカートリッジ１００に蛍光色素の励起光を照射して、フィルター１０５上に捕捉された細胞から発せられる蛍光を検出する（工程（ｃ））。蛍光の検出は、例えば、カートリッジ１００の垂直方向上面からカートリッジ１００を観察し、蛍光観察像を処理することにより行う。
　カートリッジは、工程（ｂ２）及び工程（ｄ）をさらに備える実施形態においても使用可能である。また、任意の工程（ｘ１）及び（ｘ２）をさらに行うこともできる。
（実施参考例１）
　培養フラスコに入った非小細胞肺癌細胞株を、二酸化炭素インキュベーター内で、３７℃で培養した。培養フラスコに、濃度０．２５％のトリプシン－ＥＤＴＡを添加し、フラスコに張り付いた培養細胞をフラスコから剥離した。剥離させた細胞を血球計算盤及び位相差顕微鏡を用いて計数した。採血管に採血した健常人の血液に、１００個の細胞を添加することで、肺癌患者の血液を摸した血液試料を調製した。細胞株としては、それぞれＰＤ－Ｌ１の発現程度の異なる、ＮＣＩ－Ｈ８２０（ＰＤ－Ｌ１高発現）、ＮＣＩ－Ｈ４４１（ＰＤ－Ｌ１中発現）、Ａ５４９（ＰＤ－Ｌ１低発現）、及びＮＣＩ－Ｈ２３（ＰＤ－Ｌ１陰性）の４種類を用いて、４種類の血液試料を準備した。採血管としては、ベクトン・ディッキンソンアンドカンパニー社製のＥＤＴＡ－２Ｋ（エチレンジアミン四酢酸二カリウム塩）入り採血管を使用した。
　採血から１時間以内に、ＣＴＣ捕捉装置を用いて上記４種類の血液試料中のＰＤ－Ｌ１陽性癌細胞を以下のように検出した。ＣＴＣ捕捉装置は、血液試料及びその他の反応液を導入するリザーバーと、ＣＴＣ捕捉カートリッジとを備える。ＣＴＣ捕捉カートリッジ（以下、カートリッジともいう）は、長径１００μｍ、短径８μｍの貫通孔を多数有する薄膜の金属フィルター（膜面積６ｍｍ×６ｍｍ、膜厚１８μｍ）を内部に備え、上記実施形態で説明したカートリッジ１００に相当する。
　まず、カートリッジを、０．５％ＢＳＡ及び２ｍＭ　ＥＤＴＡを含有したＰＢＳ溶液（以下、「洗浄液」という。）で満たした。リザーバーに、洗浄液を７ｍＬ入れ、洗浄液の下に、上記血液試料を３ｍＬ、血液試料と洗浄液が層をなすように加えた。ＣＴＣ捕捉装置を作動させ、流速２００μＬ／分でリザーバー中の血液試料及び洗浄液をカートリッジに導入し、血液試料中の細胞をフィルター上に捕捉した。カートリッジに洗浄液を導入し、フィルターに残留した血液成分を洗い流した。
　１．２５ｍＬの抗ヒトＣＤ４５マウスモノクローナル抗体（クローン：２Ｄ１）を含む反応液を流速２００μＬ／分でカートリッジに導入し、室温にて３０分反応させた。１．４０ｍＬの洗浄液を流速４００μＬ／分でカートリッジに導入し、カートリッジ内の上記反応液を排出した。１．２５ｍＬのＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　５９４標識抗マウスＩｇＧヤギポリクロナール抗体を含む反応液を流速４００μＬ／分でカートリッジに導入し、室温にて３０分反応させた。１．４０ｍＬの洗浄液を流速４００μＬ／分でカートリッジに導入し、カートリッジ内の上記反応液を排出した。
　ホルムアルデヒドを０．５質量％～４質量％含有するＰＢＳ溶液１．２５ｍＬを、流速４００μＬ／分でカートリッジに導入し、室温にて１０分反応させることにより、細胞を固定化した。１．４０ｍＬの洗浄液を流速４００μＬ／分でカートリッジに導入し、カートリッジ内の上記反応液を排出した。
　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００（シグマアルドリッチ社製）を０．０５質量％～０．１質量％含有するＰＢＳ溶液１．２５ｍＬを、流速４００μＬ／分でカートリッジに導入し、室温にて１０分反応させることにより、細胞を透過処理した。１．４０ｍＬの洗浄液を流速４００μＬ／分でカートリッジに導入し、カートリッジ内の上記反応液を排出した。
　１．２５ｍＬの抗ヒトＰＤ－Ｌ１ウサギモノクローナル抗体（クローン：２８－８）を含む反応液を流速２００μＬ／分でカートリッジに導入し、室温にて６０分反応させた。１．４０ｍＬの洗浄液を流速４００μＬ／分でカートリッジに導入し、カートリッジ内の上記反応液を排出した。１．２５ｍＬのＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　６４７標識抗ウサギＩｇＧヤギポリクロナール抗体を含む反応液を流速４００μＬ／分でカートリッジに導入し、室温にて３０分反応させた。１．４０ｍＬの洗浄液を流速４００μＬ／分でカートリッジに導入し、カートリッジ内の上記反応液を排出した。
　ＦＩＴＣ標識抗ヒトサイトケラチンマウスモノクローナル抗体（クローン：ＣＫ３、６Ｈ５、ＡＥ１、及びＡＥ３の混合物）、及びＤＡＰＩを含む反応液１．２５ｍＬを、４００μＬ／分でカートリッジに導入し、室温にて３０分反応させた。３．００ｍＬの洗浄液を流速４００μＬ／分でカートリッジに導入し、カートリッジ内の上記反応液を排出した。次いで、カートリッジをＣＴＣ捕捉装置から外した。
　カートリッジを蛍光顕微鏡に設置した。蛍光ミラーユニットを使用して、細胞上の蛍光色素（ＦＩＴＣ、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　５９４、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　６４７、及びＤＡＰＩ）をそれぞれ励起させた。それぞれの蛍光色素から発せられた蛍光を撮影し、得られた画像を合成した。
　結果を図３に示す。図中、Ｈ８２０はＮＣＩ－Ｈ８２０、Ｈ４４１はＮＣＩ－Ｈ４４１、Ｈ２３はＮＣＩ－Ｈ２３を、それぞれ意味する（以下、同じ）。ＰＤ－Ｌ１陽性の癌細胞株であるＮＣＩ－Ｈ８２０及びＮＣＩ－Ｈ４４１を用いた実験においては、細胞核（ＤＡＰＩ）、サイトケラチン（ＦＩＴＣ）、及びＰＤ－Ｌ１（Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　６４７）が陽性であり、かつ、ＣＤ４５（Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　５９４）が陰性である細胞の蛍光画像が得られた。ＰＤ－Ｌ１陰性の癌細胞株であるＮＣＩ－Ｈ２３を用いた実験においては、細胞核及びサイトケラチンが陽性であり、かつ、ＣＤ４５及びＰＤ－Ｌ１が陰性である細胞の蛍光画像が得られた。一方、いずれの実験においても、細胞核及びＣＤ４５が陽性であり、かつ、サイトケラチン及びＰＤ－Ｌ１が陰性である、白血球の蛍光画像も得られた（図には示していない）。抗体の非特異的な結合によるＰＤ－Ｌ１偽陽性はみられなかった。なお、「陽性」とは蛍光が検出されたことを意味し、「陰性」とは蛍光が検出されなかったことを意味する。
（実施参考例２）
　細胞株としてＮＣＩ－Ｈ８２０を用いた。抗ヒトＰＤ－Ｌ１ウサギモノクローナル抗体のクローンをＳＰ１４２に変更した以外は実施参考例１と同様の方法により、細胞の蛍光を観察した。
　結果を図４及び図５に示す。これらの図に示すように、細胞核、サイトケラチン、及びＰＤ－Ｌ１が陽性であり、かつ、ＣＤ４５が陰性である細胞の蛍光画像が得られた。また、図５の右下には、細胞核及びＣＤ４５が陽性であり、かつ、サイトケラチン及びＰＤ－Ｌ１が陰性である、白血球がみられる。抗体の非特異的な結合によるＰＤ－Ｌ１偽陽性はみられなかった。
（実施参考例３）
　細胞株としてＮＣＩ－Ｈ８２０を用いた。抗ヒトＰＤ－Ｌ１ウサギモノクローナル抗体を、Ｅ１Ｌ３Ｎ（登録商標）由来の抗体、ＥＰＲ１１６１（２）由来の抗体、及びポリクローナル抗体（Ｐｒｏｓｃｉ社製、カタログ番号：４０５９）に変更した以外は実施参考例１と同様の方法により、細胞の蛍光を観察した。結果を図６及び図７に示す。
　図６及び図７に示すように、いずれの抗体を用いた実験においても、細胞核、サイトケラチン、及びＰＤ－Ｌ１が陽性であり、かつ、ＣＤ４５が陰性である細胞の蛍光画像が得られた。ＰＤ－Ｌ１の蛍光強度は、Ｅ１Ｌ３Ｎ由来の抗体を用いた実験において高く、ポリクローナル抗体を用いた実験において低かった。ＥＰＲ１１６１（２）由来の抗体を用いた実験においては、ＰＤ－Ｌ１の蛍光は僅かに確認できる程度であった。
　図７に示すように、いずれの抗体を用いた実験においても、細胞核及びＣＤ４５が陽性であり、かつ、サイトケラチン及びＰＤ－Ｌ１が陰性である、白血球がみられる。一方、図７は、いずれの抗体を用いた実験においても、抗体の非特異的な結合が観察されたことをも示す。
（実施参考例４）
　ＰＤ－Ｌ１に対する二次抗体（抗ウサギＩｇＧヤギポリクロナール抗体）の標識色素をＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　６８０及びＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）　７００に変更した以外は実施参考例１と同様の方法により、細胞の蛍光を観察した。
　結果を図８に示す。Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　６８０及びＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　７００を用いた場合、ＰＤ－Ｌ１の蛍光強度が低かった。
（実施例１）
＜ＰＤ－Ｌ１陽性癌細胞の検出＞
　非小細胞肺癌と診断された癌患者３０名から採血した。癌患者の詳細を表１に示す。採血管としては、ベクトン・ディッキンソンアンドカンパニー社製のＥＤＴＡ－２Ｋ（エチレンジアミン四酢酸二カリウム塩）入り採血管を使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 　表中、「ＥＧＦＲ変異」は上皮成長因子受容体遺伝子の変異を、「ＡＬＫ転座」は未分化リンパ腫キナーゼ遺伝子の転座を、それぞれ意味する。
　採血から１時間以内に、血液試料中のＰＤ－Ｌ１陽性癌細胞を検出した。検出は、上記血液試料を用いたこと以外は、実施参考例１と同様の方法により行った。
　検出された蛍光の合成画像から、細胞核（ＤＡＰＩ）及びサイトケラチン（ＦＩＴＣ）が陽性であり、かつ、ＣＤ４５（Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　５９４）が陰性である細胞の数（すなわち、ＣＴＣの数）を求めた。同様に、蛍光の合成画像から、細胞核、サイトケラチン、及びＰＤ－Ｌ１が陽性であり、かつ、ＣＤ４５が陰性である細胞の数（すなわち、ＰＤ－Ｌ１陽性癌細胞の数）を求めた。これらの値から、ＣＴＣの数に対するＰＤ－Ｌ１陽性癌細胞の数の割合（％）を算出した。
＜ニボルマムの奏効性の評価＞
　３０名の患者のうち、ＣＴＣの数に対するＰＤ－Ｌ１陽性癌細胞の数の割合を算出することができた患者２８名に、ニボルマム３ｍｇ／ｋｇを２週間間隔で投与した。投与は、臨床的に無効又は副作用により投与不可と判断されるまで続け、投与期間は約６週間から８週間にわたった。投与から約４２日経過後、患者の腫瘍（標的病変）の大きさをコンピュータ断層撮影（ＣＴ）の横断面像から計測し、投与前の腫瘍の大きさと比べることによりニボルマムの奏効性を評価した。具体的には、奏効性は、「固形がんの治療効果判定のための新ガイドライン（ＲＥＣＩＳＴガイドライン）改訂版ｖｅｒｓｉｏｎ　１．１」に従って評価した。以下が、ガイドラインに示される、腫瘍縮小効果の判定に使用する規準である。
　ＣＲ（完全奏効、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ　Ｒｅｓｐｏｎｓｅ）：すべての標的病変の消失。標的病変として選択したすべてのリンパ節病変は、短径で１０ｍｍ未満に縮小しなくてはならない。
　ＰＲ（部分奏効、Ｐａｒｔｉａｌ　Ｒｅｓｐｏｎｓｅ）：ベースライン径和に比して、標的病変の径和が３０％以上減少。
　ＰＤ（進行、Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ　Ｄｉｓｅａｓｅ）：経過中の最小の径和（ベースライン径和が経過中の最小値である場合、これを最小の径和とする）に比して、標的病変の径和が２０％以上増加、かつ、径和が絶対値でも５ｍｍ以上増加。
　ＳＤ（安定、Ｓｔａｂｌｅ　Ｄｉｓｅａｓｅ）：経過中の最小の径和に比して、ＰＲに相当する縮小がなくＰＤに相当する増大がない。
　結果を表２～表４に示す。表２、表３、表４は、それぞれＣＴＣの数に対するＰＤ－Ｌ１陽性癌細胞の数の割合（％）が、５０％以上、４０％以上、３０％以上であった患者群におけるニボルマムの奏効性をまとめたものである。これらの結果は、ＣＴＣの数に対するＰＤ－Ｌ１陽性癌細胞の数の割合（％）が３０％以上であった患者の多くに対して、ニボルマムの投与が有効であったことを示す。これは、免疫チェックポイント阻害剤が、ＰＤ－Ｌ１陽性癌細胞の割合が３０％以上である被験者に対して高い奏効性を示すと予測することの妥当性を示している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　１００…ＣＴＣ捕捉カートリッジ、１０５…フィルター、１０６…貫通孔、１１０…上部部材、１１５…下部部材、１２０…筐体、１２５…流入管、１３０…流入口、１３５…流出管、１４０…流出口。

Claims (9)

  1. 　被験者に対する免疫チェックポイント阻害剤の奏効性を予測する方法であって、
    　（ａ）被験者の血液試料から細胞を採取する工程と、
    　（ｂ１）細胞に、ＰＤ－Ｌ１を認識する一次抗体を接触させ、次いで一次抗体を認識する二次抗体であって蛍光色素で標識されている二次抗体を接触させる工程、又は、細胞に、ＰＤ－Ｌ１を認識する抗体であって蛍光色素で標識されている抗体を接触させる工程と、
    　（ｃ）細胞に蛍光色素の励起光を照射して、細胞から発せられる蛍光を検出する工程と、を備え、
    　蛍光色素の蛍光が検出されることが、細胞がＰＤ－Ｌ１陽性癌細胞であることを示し、
    　細胞がＰＤ－Ｌ１陽性癌細胞である場合に、被験者に対する免疫チェックポイント阻害剤の奏効性が高いと予測する、
    方法。
  2. 　被験者に対する免疫チェックポイント阻害剤の奏効性を予測する方法であって、
    　（ａ）被験者の血液試料から細胞を採取する工程と、
    　（ｂ１）細胞に、ＰＤ－Ｌ１を認識する一次抗体を接触させ、次いで一次抗体を認識する二次抗体であって第一の蛍光色素で標識されている二次抗体を接触させる工程、又は、細胞に、ＰＤ－Ｌ１を認識する抗体であって第一の蛍光色素で標識されている抗体を接触させる工程と、
    　（ｂ２）細胞に、上皮細胞のマーカータンパク質を認識する一次抗体を接触させ、次いで一次抗体を認識する二次抗体であって第二の蛍光色素で標識されている二次抗体を接触させる工程、又は、細胞に、上皮細胞のマーカータンパク質を認識する抗体であって第二の蛍光色素で標識されている抗体を接触させる工程と、
    　（ｃ）細胞に、第一及び第二の蛍光色素の励起光を照射して、細胞から発せられる第一及び第二の蛍光を検出する工程と、
    　（ｄ）検出された蛍光の組み合わせから、細胞における、癌細胞の数に対するＰＤ－Ｌ１陽性癌細胞の数の割合を算出する工程であって、
    　癌細胞の数は、第二の蛍光色素の蛍光が検出された細胞の数であり、
    　ＰＤ－Ｌ１陽性癌細胞の数は、第一及び第二の蛍光色素の蛍光の組み合わせが検出された細胞の数である、工程と、を備え、
    　工程（ｂ１）及び工程（ｂ２）を任意の順で行い、
    　癌細胞の数に対するＰＤ－Ｌ１陽性癌細胞の数の割合が、３０％以上の基準値以上である場合に、被験者に対する免疫チェックポイント阻害剤の奏効性が高いと予測する、
    方法。
  3. 　工程（ａ）が、血液試料をフィルターでろ過してフィルター上に細胞を捕捉する工程である、請求項２に記載の方法。
  4. 　工程（ａ）の後かつ工程（ｃ）の前の任意の段階で、
    　　（ｘ１）細胞に、白血球のマーカータンパク質を認識する一次抗体を接触させ、次いで一次抗体を認識する二次抗体であって第三の蛍光色素で標識されている二次抗体を接触させる工程、又は、細胞に、白血球を認識する抗体であって第三の蛍光色素で標識されている抗体を接触させる工程と、
    　　（ｘ２）細胞の核を第四の蛍光色素で標識する工程と、
    を任意の順でさらに行い、
    　工程（ｃ）において、細胞に、第一、第二、第三及び第四の蛍光色素の励起光をそれぞれ照射して、細胞から発せられる第一、第二、第三、及び第四の蛍光色素の蛍光をそれぞれ検出し、
    　工程（ｄ）において、
    　癌細胞の数は、第三の蛍光色素の蛍光が観察されず、かつ、第二及び第四の蛍光色素の蛍光の組み合わせが検出され細胞の数であり、
    　ＰＤ－Ｌ１陽性癌細胞の数は、第三の蛍光色素の蛍光が観察されず、かつ、第一、第二及び第四の蛍光色素の蛍光の組み合わせが検出された細胞の数である、請求項２又は３に記載の方法。
  5. 　工程（ｘ１）、工程（ｂ１）及び工程（ｂ２）をこの順で行い、
    　工程（ｘ２）を工程（ｂ２）と同時に行う、請求項４に記載の方法。
  6. 　免疫チェックポイント阻害剤が、抗ＰＤ－１抗体又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体である、請求項４又は５に記載の方法。
  7. 　白血球のマーカータンパク質がＣＤ４５である、請求項４～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 　上皮細胞のマーカータンパク質がサイトケラチンである、請求項４～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 　第一、第二、及び第三の蛍光色素が、フルオレセイン、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）　５９４、及びＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）　６４７からなる群より選ばれ、第４の蛍光色素が４′，６－ジアミジノ－２－フェニルインドールである、請求項４～８のいずれか一項に記載の方法。
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