JPWO2018190382A1 - Ｐｄ−ｌ１陽性癌細胞の検出方法 - Google Patents

Abstract

本発明に係る血液試料中のＰＤ−Ｌ１陽性癌細胞を検出する方法は、（ａ）血液試料から細胞を採取する工程と、（ｂ）細胞に、ＰＤ−Ｌ１を認識する一次抗体を接触させ、次いで一次抗体を認識する二次抗体であって蛍光色素で標識されている二次抗体を接触させる工程、又は、細胞に、ＰＤ−Ｌ１を認識する抗体であって蛍光色素で標識されている抗体を接触させる工程と、（ｃ）細胞に蛍光色素の励起光を照射して、細胞から発せられる蛍光を検出する工程と、を備える。かかる方法によれば、被験者に大きな負担をかけることなくＰＤ−Ｌ１陽性癌細胞を検出することができる。

Description

本発明は、ＰＤ−Ｌ１陽性癌細胞の検出方法に関する。

癌の治療方法の一つとして「免疫チェックポイント阻害療法」が知られている。免疫チェックポイント阻害療法では、免疫反応を抑制する反応経路（免疫チェックポイント）を阻害することにより、免疫細胞を活性化させる。免疫反応を抑制する反応経路としてＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１経路が知られており、この経路を阻害する免疫チェックポイント阻害剤「ペムブロリズマブ」及び「ニボルマブ」の開発が進んでいる。患者の癌細胞がＰＤ−Ｌ１を有さない場合、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１経路に作用する上記阻害剤の奏効性は低い。そのため、患者の癌細胞におけるＰＤ−Ｌ１を検出することにより、阻害剤の奏効性を、実際に阻害剤を投与する前に確認することが重要である。

ＰＤ−Ｌ１を発現している癌細胞（ＰＤ−Ｌ１陽性癌細胞）を検出する方法として、患者から組織検体を採取して、検体におけるＰＤ−Ｌ１を染色する方法が知られている（例えば、非特許文献１）。

"Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ"、２０１５、Ｖｏｌ．３７２、Ｎｏ．２１、ｐ．２０１８−２０２８

ＰＤ−Ｌ１陽性癌細胞を検出する従来の方法は、患者から腫瘍組織を採取することを要するため、患者への負担が大きかった。本発明は、被験者に大きな負担をかけることなくＰＤ−Ｌ１陽性癌細胞を検出することを目的とする。

本発明は、血液試料中のＰＤ−Ｌ１陽性癌細胞を検出する方法であって、（ａ）血液試料から細胞を採取する工程と、（ｂ）細胞に、ＰＤ−Ｌ１を認識する一次抗体を接触させ、次いで一次抗体を認識する二次抗体であって蛍光色素で標識されている二次抗体を接触させる工程、又は、細胞に、ＰＤ−Ｌ１を認識する抗体であって蛍光色素で標識されている抗体を接触させる工程と、（ｃ）細胞に蛍光色素の励起光を照射して、細胞から発せられる蛍光を検出する工程と、を備える方法を提供する。

上記蛍光色素は第一の蛍光色素であってよく、工程（ａ）の後かつ工程（ｃ）の前の任意の段階で、（ｘ１）細胞に、白血球のマーカータンパク質を認識する一次抗体を接触させ、次いで一次抗体を認識する二次抗体であって第二の蛍光色素で標識されている二次抗体を接触させる工程、又は、細胞に、白血球を認識する抗体であって第二の蛍光色素で標識されている抗体を接触させる工程と、（ｘ２）細胞に、上皮細胞のマーカータンパク質を認識する一次抗体を接触させ、次いで一次抗体を認識する二次抗体であって第三の蛍光色素で標識されている二次抗体を接触させる工程、又は、細胞に、上皮細胞のマーカータンパク質を認識する抗体であって第三の蛍光色素で標識されている抗体を接触させる工程と、（ｘ３）細胞の核を第四の蛍光色素で標識する工程と、を任意の順でさらに備えてもよく、工程（ｃ）において、細胞に、第一、第二、第三及び第四の蛍光色素の励起光をそれぞれ照射して、細胞から発せられる第一、第二、第三、及び第四の蛍光色素の蛍光をそれぞれ検出してもよい。

ＰＤ−Ｌ１を認識する一次抗体又はＰＤ−Ｌ１を認識する抗体は、２８−８又はＳＰ１４２のクローンに由来してもよい。工程（ａ）は、血液試料をフィルターでろ過してフィルター上に細胞を捕捉する工程であってもよい。白血球のマーカータンパク質はＣＤ４５であってよい。上皮細胞のマーカータンパク質はサイトケラチンであってよい。第一、第二、及び第三の蛍光色素は、フルオレセイン、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ５９４、及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ６４７からなる群より選ばれてよく、第４の蛍光色素は４′，６−ジアミジノ−２−フェニルインドールであってよい。ＰＤ−Ｌ１陽性癌細胞は肺癌由来であってよい。工程（ｘ１）を工程（ｂ）の前に行い、工程（ｘ２）及び工程（ｘ３）を工程（ｂ）の後に、同時に行ってもよい。

本発明の方法によれば、血液試料を使用することにより、被験者に大きな負担をかけることなく、簡単かつ短時間でＰＤ−Ｌ１陽性癌細胞を検出することができる。

細胞捕捉カートリッジの一実施形態を示す斜視図である。 図１におけるＩＩ−ＩＩ線断面図である。 実施例１において蛍光標識された細胞の画像である。 実施例２において蛍光標識された細胞の画像である。 実施例２において蛍光標識された細胞の画像である。 実施例３において蛍光標識された細胞の画像である。 実施例３において蛍光標識された細胞の画像である。 実施例４において蛍光標識された細胞の画像である。

本発明の、血液試料中のＰＤ−Ｌ１陽性癌細胞を検出する方法は、（ａ）血液試料から細胞を採取する工程と、（ｂ）細胞に、ＰＤ−Ｌ１を認識する一次抗体を接触させ、次いで一次抗体を認識する二次抗体であって蛍光色素で標識されている二次抗体を接触させる工程、又は、細胞に、ＰＤ−Ｌ１を認識する抗体であって蛍光色素で標識されている抗体を接触させる工程と、（ｃ）細胞に蛍光色素の励起光を照射して、細胞から発せられる蛍光を検出する工程と、を備える。癌患者の血液中には、血中循環癌細胞（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｔｕｍｏｒ Ｃｅｌｌ、以下、「ＣＴＣ」ともいう。）と呼ばれ、血管及びリンパ管を通じて体内を循環する癌細胞が存在する場合がある。ＣＴＣは、例えば、肺、肝臓、胃、頭頸、膀胱、尿路上皮、食道、胆道、乳腺、卵巣、子宮、肝臓、前立腺、又は膵臓における癌の細胞が血管及びリンパ管に侵入したものである。したがって、これらの器官における癌組織を採取せずとも、被験者の血液試料を使用することで、ＰＤ−Ｌ１陽性癌細胞（ＰＤ−Ｌ１陽性のＣＴＣ）を検出することができる。本明細書において、「ＣＴＣ」と「血液試料中の癌細胞」は同義として扱う。

血液試料としては、被験者から採取した血液をそのまま使用してもよいし、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等の緩衝液又はその他適当な媒体で希釈された血液を使用してもよい。血液試料には、抗凝固剤及び固定剤等、通常血液試料に添加される添加剤が添加されていてもよい。

工程（ａ）において、細胞は、例えば、血液試料をフィルターでろ過して、フィルター上に血液試料中の細胞を捕捉することで、血液試料から採取することができる。血液中に含まれる細胞のうち、白血球はＣＴＣと同程度の直径を有するため、フィルター上にはＣＴＣとともに一部の白血球が捕捉される。フィルターにより血液試料中の細胞を採取する場合、ＰＤ−Ｌ１陽性癌細胞の検出は、そのままフィルター上で行うことができる。すなわち、本発明における全ての工程は、フィルター上に捕捉された細胞に対して行うことができる。「捕捉」とは、細胞を含有する液体をフィルターでろ過して、細胞をフィルター上に残留させることを意味する。

フィルターは、血液試料中に存在するＣＴＣを捕捉できるフィルターであれば特に限定されず、従来公知のフィルターを使用できる。フィルターは、例えば、金属又は樹脂製のフィルターであってよく、基板と、基板上に設けられた、好ましくは５μｍ〜１５μｍ、より好ましくは６μｍ〜１２μｍ、さらに好ましくは７μｍ〜１０μｍの孔径の貫通孔と、を有してもよい。貫通孔の孔径は、貫通孔を通過できる球の直径の最大値をいう。

本明細書において、細胞に物質を「接触させる」ことは、例えば、細胞をその物質若しくはその物質の溶液に浸すことにより行うことができる。細胞の採取にフィルターを使用する場合、細胞に反応液又は洗浄液を接触させることは、これらの溶液をフィルターでろ過することにより行うことができる。ろ過の際、細胞へのダメージを最小限に抑える観点から、溶液の流速は、５０μＬ／分〜３０００μＬ／分が好ましく、１００μＬ／分〜１０００μＬ／分がより好ましく、２００μＬ／分〜６００μＬ／分がさらに好ましい。

工程（ａ）の後、細胞を洗浄してもよい。洗浄工程は、例えば、ＰＢＳ等の既知の緩衝液を含む洗浄液を、細胞に接触させることで行う。洗浄液には、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）又はエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等の添加物が含まれていてよい。洗浄は、工程（ａ）の後に限らず、各工程の後に適宜行うことができる。

さらに、工程（ａ）の後、細胞を固定化してもよい。ホルムアルデヒド等の公知の固定剤を細胞に接触させることで、細胞を固定化できる。細胞を固定化することにより、細胞の腐敗又は凝集をより軽減することができる。

固定化した細胞を、次いで透過処理してもよい。公知の透過処理剤を細胞に接触させることで、細胞を透過処理することができる。透過処理剤としては、例えば、ポリ（オキシエチレン）オクチルフェニルエーテルを使用することができる。

工程（ｂ）では、細胞に、ＰＤ−Ｌ１を認識する一次抗体を接触させ、次いで一次抗体を認識する二次抗体であって蛍光色素（第一の蛍光色素）で標識されている二次抗体を接触させる（二段階の蛍光標識）。あるいは、細胞に、ＰＤ−Ｌ１を認識する抗体であって蛍光色素（第一の蛍光色素）で標識されている抗体を接触させる（一段階の蛍光標識）。この工程によりＰＤ−Ｌ１が蛍光標識される。ＰＤ−Ｌ１の蛍光標識は、上記のように、二段階又は一段階のいずれで行ってもよい。

ＰＤ−Ｌ１を認識する一次抗体又はＰＤ−Ｌ１を認識する抗体であって蛍光色素（第一の蛍光色素）で標識されている抗体は、例えば、２８−８、ＳＰ１４２、Ｅ１Ｌ３Ｎ（登録商標）、及びＥＰＲ１１６１（２）からなる群より選ばれるクローンに由来してもよく、ポリクローナル抗体（例えば、Ｐｒｏｓｃｉ社のカタログ番号：４０５９）であってもよい。より高い感度でＰＤ−Ｌ１陽性癌細胞を検出する観点から、ＰＤ−Ｌ１を認識する一次抗体又はＰＤ−Ｌ１を認識する抗体は、２８−８又はＳＰ１４２に由来することが好ましい。また、２８−８に由来する抗体又はＳＰ１４２に由来する抗体を使用することで、抗体の非特異的な結合を低減することができ、したがって、偽陽性の少ない、より信頼性の高い検出結果を得ることができる。これらのクローンに由来する抗体は、いずれも抗ＰＤ−Ｌ１ウサギモノクローナル抗体である。

蛍光色素（第一の蛍光色素）は、抗体の蛍光標識に通常使用される蛍光色素であれば特に限定されない。第一の蛍光色素は、例えば、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ６４７又はＣｙ（登録商標）５である。

最後に、工程（ｃ）において、細胞に蛍光色素の励起光を照射して、細胞から発せられる蛍光を検出する。蛍光色素（第一の蛍光色素）による蛍光が検出される（陽性）細胞が、ＰＤ−Ｌ１陽性癌細胞として同定される。

検出されたＰＤ−Ｌ１陽性癌細胞に、その後、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はタンパク質の解析を行うことができる。例えば、検出されたＰＤ−Ｌ１陽性癌細胞に対し、シークエンサー、次世代シークエンサー、ＤＮＡチップ、マイクロアレイ、比較ゲノムハイブリダイゼーション、蛍光インサイツハイブリダイゼーション、デジタルＰＣＲ、定量逆転写ＰＣＲ、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンプロッティング、ＴＯＦ−ＭＳ、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ、ラマン分光スペクトル、クロマトグラフィー、Ｘ線結晶解析、二次元電気泳動、核磁気共鳴分光法、フローサイトメーター（ＦＣＭ）等を利用した解析を行うことができる。

血液試料中には、ＰＤ−Ｌ１陽性癌細胞の他に、ＰＤ−Ｌ１陰性癌細胞、白血球等のその他の細胞が多数存在する。このため、工程（ｂ）において、ＰＤ−Ｌ１を認識する抗体がＰＤ−Ｌ１陰性の細胞に結合し、ＰＤ−Ｌ１陰性の細胞からＰＤ−Ｌ１を示す蛍光が観察される場合がある（偽陽性）。このような偽陽性を減らし、より信頼性の高い検出結果を得る観点から、工程（ａ）の後かつ工程（ｃ）の前の任意の段階で、以下の工程（ｘ１）〜（ｘ３）をさらに行うことが好ましい。

工程（ｘ１）では、細胞に、白血球のマーカータンパク質を認識する一次抗体を接触させ、次いで一次抗体を認識する二次抗体であって第二の蛍光色素で標識されている二次抗体を接触させる（二段階の蛍光標識）。あるいは、細胞に、白血球を認識する抗体であって第二の蛍光色素で標識されている抗体を接触させる（一段階の蛍光標識）。この工程により、白血球が蛍光標識される。白血球の蛍光標識は、上記のように二段階又は一段階のいずれで行ってもよい。

白血球のマーカータンパク質は、例えば、全造血幹細胞に発現するＣＤ４５である。

白血球のマーカータンパク質を認識する一次抗体、第二の蛍光色素で標識されている二次抗体、及び白血球のマーカータンパク質を認識する抗体であって第二の蛍光色素で標識されている抗体は、特に限定されず、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体であってよい。抗体が由来する動物は、一次抗体が由来する動物と二次抗体が由来する動物とが異なる動物である限り、特に限定されない。

第二の蛍光色素は、抗体の蛍光標識に通常使用される蛍光色素であれば特に限定されない。第二の蛍光色素は、例えば、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ５９４又はＴｅｘａｓ Ｒｅｄ（登録商標）である。第二の蛍光色素は、第一、第三及び第四の蛍光色素とは別の蛍光色素である。各蛍光色素は異なる蛍光波長を有するため、識別可能である。好ましくは、第一、第二、及び第三の蛍光色素は、フルオレセイン、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４、及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７からなる群より選ばれ、第４の蛍光色素は４′，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）である。

工程（ｘ２）では、細胞に、上皮細胞のマーカータンパク質を認識する一次抗体を接触させ、次いで一次抗体を認識する二次抗体であって第三の蛍光色素で標識されている二次抗体を接触させる（二段階の蛍光標識）。あるいは、細胞に、上皮細胞のマーカータンパク質を認識する抗体であって第三の蛍光色素で標識されている抗体を接触させる（一段階の蛍光標識）。この工程により、ＣＴＣが蛍光標識される。ＣＴＣの蛍光標識は、上記のように二段階又は一段階のいずれで行ってもよい。

上皮細胞のマーカータンパク質としては、例えば、サイトケラチン、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、ＣＤ１４６、及びＣＤ１７６が挙げられ、サイトケラチンが好ましい。ＣＴＣは上皮細胞に由来するため、これら上皮細胞のマーカータンパク質を有する。

第三の蛍光色素は、抗体の蛍光標識に通常使用される蛍光色素であれば特に限定されない。第三の蛍光色素は、例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）等のフルオレセイン又はＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ４８８である。

上皮細胞のマーカータンパク質を認識する一次抗体、第三の蛍光色素で標識されている二次抗体、及び上皮細胞のマーカータンパク質を認識する抗体であって第三の蛍光色素で標識されている抗体は、特に限定されず、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体であってよい。抗体が由来する動物は、一次抗体が由来する動物と二次抗体が由来する動物とが異なる動物である限り、特に限定されない。

工程（ｘ３）では、細胞の核を第四の蛍光色素で標識する。核を標識する第四の蛍光色素は、核酸に結合することができる蛍光色素であれば特に限定されず、核を蛍光標識するのに通常用いられる蛍光色素を使用することができる。第四の蛍光色素としては、例えば、ＤＡＰＩ及び２′−（４−エトキシフェニル）−５−（４−メチル−１−ピペラジニル）−２，５′−ビ−１Ｈ−ベンゾイミダゾール三塩酸塩（Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２）が挙げられる。

任意であるこれらの工程（ｘ１）〜（ｘ３）を行う場合、工程（ｃ）では、細胞に、第一、第二、第三及び第四の蛍光色素の励起光をそれぞれ照射して、細胞から発せられる第一、第二、第三及び第四の蛍光色素の蛍光をそれぞれ検出する。ＰＤ−Ｌ１陽性癌細胞は、第一、第三、及び第四の蛍光色素で標識されているが、第二の蛍光色素では標識されていない。したがって、第二の蛍光色素の蛍光が検出されず（陰性）、第一、第三、及び第四の蛍光色素の蛍光が検出される（陽性）細胞が、ＰＤ−Ｌ１陽性癌細胞として同定される。

上記の方法により血液試料中のＰＤ−Ｌ１陽性癌細胞を検出するときは、例えば、図１及び図２に示すカートリッジを用いることができる。以下、本発明の一実施形態であって、カートリッジを使用して血液試料中のＰＤ−Ｌ１陽性癌細胞を検出する方法について述べる。別段の記載がない限り、各工程についての詳細及び工程の順番は、上記実施形態で述べたとおりである。

図１及び図２に示すＣＴＣ捕捉カートリッジ（カートリッジ）１００は、液体が流入する流入管１２５が接続された流入口１３０と、液体が流出する流出管１３５が接続された流出口１４０とを有する筐体１２０と、フィルター１０５とを備える。フィルター１０５は、上部部材１１０及び下部部材１１５から構成される筐体１２０により固定されている。血液試料、洗浄液及びその他の反応液は、流入管１２５を通って筐体１２０の内部に導入され、フィルター１０５を通って、流出管１３５から外部に排出される。このような液体の流れは、例えば、流入管１２５の上流又は流出管１３５の下流にポンプを接続することにより作り出すことができる。また、流入管１２５の上流及び／又は流出管１３５の下流にコックを設け、液体の流れを制御してもよい。

はじめに、血液試料を流入管１２５からカートリッジ１００内に導入して、血液試料をフィルター１０５でろ過する（工程（ａ））。血液試料中のＣＴＣ及び一部の白血球は、フィルター１０５の貫通孔１０６を通過できず、フィルター１０５の表面に残留する。血液試料中のその他の成分は、貫通孔１０６を通過し、カートリッジ１００の外へと排出される。次いで、洗浄液をフィルター１０５に通液してフィルター１０５を洗浄してもよい。フィルター１０５の洗浄は、以下の各工程の後にも、適宜行うことができる。

さらに、フィルター１０５上に細胞が捕捉された後、固定剤、次いで透過処理剤を含む反応液を、それぞれカートリッジ１００内に任意で導入して、カートリッジ１００内に所定時間保持することで、細胞と固定剤及び透過処理剤とをそれぞれ反応させてもよい。

同様にして、細胞に、ＰＤ−Ｌ１を認識する一次抗体を含む反応液、次いで一次抗体を認識する二次抗体であって蛍光色素（第一の蛍光色素）で標識されている二次抗体を含む反応液を、それぞれフィルター１０５上に捕捉された細胞と反応させる。あるいは、細胞に、ＰＤ−Ｌ１を認識する抗体であって蛍光色素（第一の蛍光色素）で標識されている抗体を含む反応液を、フィルター１０５上に捕捉された細胞と反応させる（工程（ｂ））。

最後に、蛍光顕微鏡を使用してカートリッジ１００に蛍光色素の励起光を照射して、フィルター１０５上に捕捉された細胞から発せられる蛍光を検出する（工程（ｃ））。蛍光の検出は、例えば、カートリッジ１００の垂直方向上面からカートリッジ１００を観察し、蛍光観察像を処理することにより行う。上記実施形態で述べたとおり、工程（ｘ１）〜（ｘ３）を任意でさらに行うこともできる。

（実施例１）
培養フラスコに入った非小細胞肺癌細胞株を、二酸化炭素インキュベーター内で、３７℃で培養した。培養フラスコに、濃度０．２５％のトリプシン−ＥＤＴＡを添加し、フラスコに張り付いた培養細胞をフラスコから剥離した。剥離させた細胞を血球計算盤及び位相差顕微鏡を用いて計数した。採血管に採血した健常人の血液に、１００個の細胞を添加することで、肺癌患者の血液を摸した血液試料を調製した。細胞株としては、それぞれＰＤ−Ｌ１の発現程度の異なる、ＮＣＩ−Ｈ８２０（ＰＤ−Ｌ１高発現）、ＮＣＩ−Ｈ４４１（ＰＤ−Ｌ１中発現）、Ａ５４９（ＰＤ−Ｌ１低発現）、及びＮＣＩ−Ｈ２３（ＰＤ−Ｌ１陰性）の４種類を用いて、４種類の血液試料を準備した。採血管としては、ベクトン・ディッキンソンアンドカンパニー社製のＥＤＴＡ−２Ｋ（エチレンジアミン四酢酸二カリウム塩）入り採血管を使用した。

採血から１時間以内に、ＣＴＣ捕捉装置を用いて上記４種類の血液試料中のＰＤ−Ｌ１陽性癌細胞を以下のように検出した。ＣＴＣ捕捉装置は、血液試料及びその他の反応液を導入するリザーバーと、ＣＴＣ捕捉カートリッジとを備える。ＣＴＣ捕捉カートリッジ（以下、カートリッジともいう）は、長径１００μｍ、短径８μｍの貫通孔を多数有する薄膜の金属フィルター（膜面積６ｍｍ×６ｍｍ、膜厚１８μｍ）を内部に備え、上記実施形態で説明したカートリッジ１００に相当する。

まず、カートリッジを、０．５％ＢＳＡ及び２ｍＭ ＥＤＴＡを含有したＰＢＳ溶液（以下、「洗浄液」という。）で満たした。リザーバーに、洗浄液を７ｍＬ入れ、洗浄液の下に、上記血液試料を３ｍＬ、血液試料と洗浄液が層をなすように加えた。ＣＴＣ捕捉装置を作動させ、流速２００μＬ／分でリザーバー中の血液試料及び洗浄液をカートリッジに導入し、血液試料中の細胞をフィルター上に捕捉した。カートリッジに洗浄液を導入し、フィルターに残留した血液成分を洗い流した。

１．２５ｍＬの抗ヒトＣＤ４５マウスモノクローナル抗体（クローン：２Ｄ１）を含む反応液を流速２００μＬ／分でカートリッジに導入し、室温にて３０分反応させた。１．４０ｍＬの洗浄液を流速４００μＬ／分でカートリッジに導入し、カートリッジ内の上記反応液を排出した。１．２５ｍＬのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４標識抗マウスＩｇＧヤギポリクロナール抗体を含む反応液を流速４００μＬ／分でカートリッジに導入し、室温にて３０分反応させた。１．４０ｍＬの洗浄液を流速４００μＬ／分でカートリッジに導入し、カートリッジ内の上記反応液を排出した。

ホルムアルデヒドを０．５質量％〜４質量％含有するＰＢＳ溶液１．２５ｍＬを、流速４００μＬ／分でカートリッジに導入し、室温にて１０分反応させることにより、細胞を固定化した。１．４０ｍＬの洗浄液を流速４００μＬ／分でカートリッジに導入し、カートリッジ内の上記反応液を排出した。

Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（シグマアルドリッチ社製）を０．０５質量％〜０．１質量％含有するＰＢＳ溶液１．２５ｍＬを、流速４００μＬ／分でカートリッジに導入し、室温にて１０分反応させることにより、細胞を透過処理した。１．４０ｍＬの洗浄液を流速４００μＬ／分でカートリッジに導入し、カートリッジ内の上記反応液を排出した。

１．２５ｍＬの抗ヒトＰＤ−Ｌ１ウサギモノクローナル抗体（クローン：２８−８）を含む反応液を流速２００μＬ／分でカートリッジに導入し、室温にて６０分反応させた。１．４０ｍＬの洗浄液を流速４００μＬ／分でカートリッジに導入し、カートリッジ内の上記反応液を排出した。１．２５ｍＬのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７標識抗ウサギＩｇＧヤギポリクロナール抗体を含む反応液を流速４００μＬ／分でカートリッジに導入し、室温にて３０分反応させた。１．４０ｍＬの洗浄液を流速４００μＬ／分でカートリッジに導入し、カートリッジ内の上記反応液を排出した。

ＦＩＴＣ標識抗ヒトサイトケラチンマウスモノクローナル抗体（クローン：ＣＫ３、６Ｈ５、ＡＥ１、及びＡＥ３の混合物）、及びＤＡＰＩを含む反応液１．２５ｍＬを、４００μＬ／分でカートリッジに導入し、室温にて３０分反応させた。３．００ｍＬの洗浄液を流速４００μＬ／分でカートリッジに導入し、カートリッジ内の上記反応液を排出した。次いで、カートリッジをＣＴＣ捕捉装置から外した。

カートリッジを蛍光顕微鏡に設置した。蛍光ミラーユニットを使用して、細胞上の蛍光色素（ＦＩＴＣ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７、及びＤＡＰＩ）をそれぞれ励起させた。それぞれの蛍光色素から発せられた蛍光を撮影し、得られた画像を合成した。

結果を図３に示す。図中、Ｈ８２０はＮＣＩ−Ｈ８２０、Ｈ４４１はＮＣＩ−Ｈ４４１、Ｈ２３はＮＣＩ−Ｈ２３を、それぞれ意味する（以下、同じ）。ＰＤ−Ｌ１陽性の癌細胞株であるＮＣＩ−Ｈ８２０及びＮＣＩ−Ｈ４４１を用いた実験においては、細胞核（ＤＡＰＩ）、サイトケラチン（ＦＩＴＣ）、及びＰＤ−Ｌ１（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７）が陽性であり、かつ、ＣＤ４５（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４）が陰性である細胞の蛍光画像が得られた。ＰＤ−Ｌ１陰性の癌細胞株であるＮＣＩ−Ｈ２３を用いた実験においては、細胞核及びサイトケラチンが陽性であり、かつ、ＣＤ４５及びＰＤ−Ｌ１が陰性である細胞の蛍光画像が得られた。一方、いずれの実験においても、細胞核及びＣＤ４５が陽性であり、かつ、サイトケラチン及びＰＤ−Ｌ１が陰性である、白血球の蛍光画像も得られた（図には示していない）。抗体の非特異的な結合による偽陽性はみられなかった。なお、「陽性」とは蛍光が検出されたことを意味し、「陰性」とは蛍光が検出されなかったことを意味する。

（実施例２）
細胞株としてＮＣＩ−Ｈ８２０を用いた。抗ヒトＰＤ−Ｌ１ウサギモノクローナル抗体のクローンをＳＰ１４２に変更した以外は実施例１と同様の方法により、細胞の蛍光を観察した。

結果を図４及び図５に示す。これらの図に示すように、細胞核、サイトケラチン、及びＰＤ−Ｌ１が陽性であり、かつ、ＣＤ４５が陰性である細胞の蛍光画像が得られた。また、図５の右下には、細胞核及びＣＤ４５が陽性であり、かつ、サイトケラチン及びＰＤ−Ｌ１が陰性である、白血球がみられる。抗体の非特異的な結合による偽陽性はみられなかった。

（実施例３）
細胞株としてＮＣＩ−Ｈ８２０を用いた。抗ヒトＰＤ−Ｌ１ウサギモノクローナル抗体を、Ｅ１Ｌ３Ｎ（登録商標）由来の抗体、ＥＰＲ１１６１（２）由来の抗体、及びポリクローナル抗体（Ｐｒｏｓｃｉ社製、カタログ番号：４０５９）に変更した以外は実施例１と同様の方法により、細胞の蛍光を観察した。結果を図６及び図７に示す。

図６及び図７に示すように、いずれの抗体を用いた実験においても、細胞核、サイトケラチン、及びＰＤ−Ｌ１が陽性であり、かつ、ＣＤ４５が陰性である細胞の蛍光画像が得られた。ＰＤ−Ｌ１の蛍光強度は、Ｅ１Ｌ３Ｎ由来の抗体を用いた実験において高く、ポリクローナル抗体を用いた実験において低かった。ＥＰＲ１１６１（２）由来の抗体を用いた実験においては、ＰＤ−Ｌ１の蛍光は僅かに確認できる程度であった。

図７に示すように、いずれの抗体を用いた実験においても、細胞核及びＣＤ４５が陽性であり、かつ、サイトケラチン及びＰＤ−Ｌ１が陰性である、白血球がみられる。一方、図７は、いずれの抗体を用いた実験においても、抗体の非特異的な結合が観察されたことをも示す。

（実施例４）
ＰＤ−Ｌ１に対する二次抗体（抗ウサギＩｇＧヤギポリクロナール抗体）の標識色素をＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ７００に変更した以外は実施例１と同様の方法により、細胞の蛍光を観察した。

結果を図８に示す。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００を用いた場合、ＰＤ−Ｌ１の蛍光強度が低かった。

１００…ＣＴＣ捕捉カートリッジ、１０５…フィルター、１０６…貫通孔、１１０…上部部材、１１５…下部部材、１２０…筐体、１２５…流入管、１３０…流入口、１３５…流出管、１４０…流出口。

Claims (9)

1. 血液試料中のＰＤ−Ｌ１陽性癌細胞を検出する方法であって、
   （ａ）血液試料から細胞を採取する工程と、
   （ｂ）細胞に、ＰＤ−Ｌ１を認識する一次抗体を接触させ、次いで一次抗体を認識する二次抗体であって蛍光色素で標識されている二次抗体を接触させる工程、又は、細胞に、ＰＤ−Ｌ１を認識する抗体であって蛍光色素で標識されている抗体を接触させる工程と、
   （ｃ）細胞に蛍光色素の励起光を照射して、細胞から発せられる蛍光を検出する工程と、を備える
   方法。
2. 前記蛍光色素が第一の蛍光色素であり、
   工程（ａ）の後かつ工程（ｃ）の前の任意の段階で、
   （ｘ１）細胞に、白血球のマーカータンパク質を認識する一次抗体を接触させ、次いで一次抗体を認識する二次抗体であって第二の蛍光色素で標識されている二次抗体を接触させる工程、又は、細胞に、白血球を認識する抗体であって第二の蛍光色素で標識されている抗体を接触させる工程と、
   （ｘ２）細胞に、上皮細胞のマーカータンパク質を認識する一次抗体を接触させ、次いで一次抗体を認識する二次抗体であって第三の蛍光色素で標識されている二次抗体を接触させる工程、又は、細胞に、上皮細胞のマーカータンパク質を認識する抗体であって第三の蛍光色素で標識されている抗体を接触させる工程と、
   （ｘ３）細胞の核を第四の蛍光色素で標識する工程と、
   を任意の順でさらに備え、
   工程（ｃ）において、細胞に、第一、第二、第三及び第四の蛍光色素の励起光をそれぞれ照射して、細胞から発せられる第一、第二、第三、及び第四の蛍光色素の蛍光をそれぞれ検出する、請求項１に記載の方法。
3. ＰＤ−Ｌ１を認識する一次抗体又はＰＤ−Ｌ１を認識する抗体が、２８−８又はＳＰ１４２のクローンに由来する、請求項２に記載の方法。
4. 工程（ａ）が、血液試料をフィルターでろ過してフィルター上に細胞を捕捉する工程である、請求項２又は３に記載の方法。
5. 白血球のマーカータンパク質がＣＤ４５である、請求項２〜４のいずれか一項に記載の方法。
6. 上皮細胞のマーカータンパク質がサイトケラチンである、請求項２〜５のいずれか一項に記載の方法。
7. 第一、第二、及び第三の蛍光色素が、フルオレセイン、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ５９４、及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ６４７からなる群より選ばれ、第４の蛍光色素が４′，６−ジアミジノ−２−フェニルインドールである、請求項２〜６のいずれか一項に記載の方法。
8. ＰＤ−Ｌ１陽性癌細胞が肺癌由来である、請求項２〜７のいずれか一項に記載の方法。
9. 工程（ｘ１）を工程（ｂ）の前に行い、
   工程（ｘ２）及び工程（ｘ３）を工程（ｂ）の後に、同時に行う、請求項２〜８のいずれか一項に記載の方法。