CN107418997A - 一种利用鸡胚血管系统检测和评价个人护理产品和原料光毒性的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用鸡胚血管系统检测和评价个人护理产品和原料光毒性的方法，包含以下步骤：(1)鸡胚卵黄囊血管膜制备；(2)光剂量确定实验；(3)受试物制备；(4)鸡胚光刺激性试验；(5)预测模型和判定；本发明通过标准化的鸡胚为测试系统，其早期发育阶段的血管系统和红细胞对紫外线照射敏感，鸡胚标准化程度高、来源稳定且批间差异小，血管系统具有生物学活性和功能，测试系统简单、廉价，无需特殊设备，检测方法快速、灵敏、通用。本发明可从定性和定量两方面检测和评价个人护理产品和原料光毒性物质的光毒性，本发明方法还可代替活体动物和人类志愿者，直接用于化学品或化妆品等物质光毒性的检测，及其快速筛查、分类和标识。

Description

一种利用鸡胚血管系统检测和评价个人护理产品和原料光毒 性的方法
技术领域
本发明属于药品、化学品或化妆品光毒性技术领域，具体涉及一种利用鸡胚 血管系统检测和评价个人护理产品和原料光毒性的方法。
背景技术
随着全球工业化的快速发展，大量新合成化学品和进入生活和环境中。另一 方面，随着生活水平的提高，个人护理和家居清洁用品的市场也不断增长，细分 市场包括护肤品、护发产品、洗涤产品、空气清新剂和物体表面清洁剂等。消费 者普遍关心这些产品的安全性，刺激性、致敏性，还包括使用产品后暴露于阳光 下产生的刺激性，即产品的光毒性问题。因此，个人护理和清洁产品的监管要求 必须对产品的健康危害进行检测。同时，在这些产品的研发过程中，光毒性的检 测和评估也贯穿其中。例如对于候选原料(如表面活性剂、植物提取物、合成化 学品)和配方，通常需要反复测试其光刺激性，并希望能够精确定量不同配方或 产品的刺激程度。此外，对于大量未知毒性特征的化学品，也需要准确了解包括 光毒性在内的毒性特点，以用于危险化学品的分类和标识。
化学品、个人护理品或皮肤接触物质引起的光毒性，主要包括两类效应，分 别是光刺激性反应和光变应性反应。这两种不良反应的共同特点是都要在光照的 条件下才可能发生。光变应性是一种与免疫系统有关的变态反应，其临床表现与 变应性接触性皮炎相似。而光刺激性反应，也就是我们通常所说的光毒性是指皮 肤接触光毒性物质后，暴露于光照一段时间后出现红斑、水肿，继之色素沉着和 脱屑等临床表现，与免疫系统无关。由于卫生清洁、个人护理等产品使用频率的 增加，上述与光刺激相关的不良反应的发生越来越普遍。另一方面，消费者对于 产品安全性的要求也越来越高，因此有必要在现有的检测方法的基础上，建立一 些更快速和更敏感的检测和评估方法。
现有的外源物质光毒性的方法可分为化学法、动物模型、细胞法和人体试验 四类。
组氨酸光氧化试验是通过化学方式检测物质光毒性的方法。将受试物和组氨 酸共同溶解到溶剂中，检测混合物暴露于光照后溶液中剩余的组氨酸的量，计算 出受试物吸收组氨酸的量来判断外源化学物质的光毒性。除此之外，光敏性酵母 生长抑制试验、淋巴细胞有丝分裂抑制试验和光动力学DNA断裂活性试验等方 法也可以检测物质的光毒性。虽然化学方法操作简单，但是反应体系比较单一。 传统的动物模型皮肤光毒性试验是将一定量的受试物涂抹在实验动物(通常为大 鼠)背部去毛的皮肤上，经一定时间间隔后暴露于UVA光线下，观察受试动物 皮肤反应并确定该受试物是否有光毒性。采用动物作为试验对象检测消费品的安 全性，其缺点是成本高、周期长，很少使用现代生物科技发展的成果，还给动物 带来了极大痛苦，存在道德和伦理上的问题。除此之外，动物实验环境条件苛刻(动物需要饲养在恒温恒湿的室内环境)、动物质量要求严格(要求符合质量等 级的要求)、检测门槛高(检测机构需要取得实验动物使用许可证)，又与人的实 际使用情况相差太远，而且由于动物和人之间存在种属差异，使用动物皮肤评价 人体皮肤的安全风险使结果的可信度降低。
随着大量新的物质用于药品和化妆品，我们需要更多的方法来评价这些物质 的安全性。在生命和医学研究中的3R原则(减少、优化和代替动物实验)的影 响下，以及在现代生物科技成果的推动下。经过30多年的发展，大量非动物替 代方法应用于健康危害的检测和安全评估中，有的方法已被世界经济合作的发展 组织(OECD)、欧洲替代方法验证中心(ECVAM)和美国替代方法部门间协调 验证中心(ICCVAM)等机构认可并定为检测指南。
目前的体外检测化学物质光毒性的方法主要是OECD指南432，即化学品体 外3T3成纤维细胞中性红摄取光毒性试验，该方法以BALB/c小鼠3T3成纤维 细胞株为模型，将细胞株与化学物质共培养并给予不引起细胞毒性的UVA照射， 加入中性红以后用酶标仪检测OD值，计算出光照下受试物的IC50和无光照下 受试物的IC50，最后光刺激因子(PIF)和平均光效应(MPE)来判断受试物的 光毒性。另外一种检测物质光毒性的细胞方法是光溶血反应法，该方法以红细胞 为测试模型，把化学物质与红细胞混合后用UVA照射，通过观察受试物对红细 胞膜的损害，计算溶血率来判断物质的光毒性程度。单层细胞模型的优点是可以实现高通量检测，但是不适用于难溶解、有颜色的化学物，也不适用于剂型和成 份复杂的提取物、配方和成品的测试。
人体志愿者试验是评价产品安全性的最直接的方法。例如人体光斑贴试验是 将受试物直接贴在人体皮肤表面，然后用一定波长和剂量的紫外线照射一段时 间，检测使皮肤出现发红、水中或丘疹等刺激性反应的剂量，判断该受试物是否 有光毒性。
受精鸡胚胎血管系统是非常理想的测试化学品和消费品安全性的方法，首先 鸡胚是非哺乳动物，符合各国的动物福利法规要求和3R原则；其次是活的生物 体，其生长发育的不同阶段都适合用于毒性或生物活性测试；第三，成本低、标 准化程度高，培养和实验条件简单，适合大规模检测和研究。已有大量的基于鸡 胚的研究应用于生命科学领域，如胚胎发育毒性测试、促进和抑制血管生成作用 研究、评估生物材料的组织相容性等。利用鸡胚发育过程中血管系统丰富的特点 可建立检测和评估毒性的方法。
鸡胚发育过程中，血管网络是连续发展的生物学过程，4-5天时，卵黄囊血 管膜是单层血管膜，血管网刚成型，类似蛛网的形态，对光照射和外源物质刺激 反应敏感，可以用来进行光毒性、促血管生成作用、胚胎致畸等实验研究。鸡胚 发育7-9天时，形成绒毛尿囊膜血管系统，是三层的血管系统，血管网络已经形 成，其结构类似人的结膜，可以用于结膜和粘膜刺激性的评估。
因此，本发明对利用鸡胚血管系统检测和评价个人护理产品和原料光毒性的 方法方面进行了深入的研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用鸡胚血管系统检测和评价个人护理产品和 原料光毒性的方法，该方法快速、简便、成本低、标准化程度高，适用范围广泛， 可以对光毒性进行快速有效的检测和评估。
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：一种利用鸡胚血管系统检 测和评价个人护理产品和原料光毒性的方法，包含以下步骤：
(1)鸡胚卵黄囊血管膜制备
选取SPF级受精鸡胚，制备具有卵黄囊血管膜的受精鸡胚备用；
(2)光剂量确定实验
取步骤(1)中制备获得的鸡胚，在三个光照剂量强度下照射后，观察卵黄 囊血管膜、胚胎发育的变化，将无毒性的光照剂量用于后续刺激性RC50确定试 验和光刺激性RC50确定试验；
(3)受试物制备
选取受试物，用溶剂溶解后，在无血管反应的受试物最高浓度以下，配制一 组具有浓度梯度的稀释液，备用，并设置阳性对照和阴性对照；
(4)光毒性实验
1)预试验
取步骤(3)中配制的一组具有浓度梯度的稀释液、阳性对照和阴性对照， 分别加入到步骤(1)中制备的鸡胚的卵黄囊血管膜上，恒温培养箱孵育后，观 察血管、胚胎存活变化，并与阳性对照和阴性对照相比较，血管的变化按照下表 1进行判定和分级，血管反应分级在2分以上者为血管反应阳性；
2)无光刺激性RC50UV-确定试验
选取受试物，用溶剂溶解后，在无血管反应的受试物最高浓度以下，选择比 预实验更小的稀释因子，重新配制一组具有浓度梯度的稀释液，将该组稀释液、 阳性对照和阴性对照，无光照条件下分别加入到步骤(1)中制备的鸡胚的卵黄 囊血管膜上，恒温培养箱孵育后，观察血管、胚胎存活变化，并与阳性对照和阴 性对照相比较，血管的变化按照下表1进行判定和分级，血管反应分级在2级以 上者为血管反应阳性，按对数图计算刺激性RC50的值，简称RC50UV-，即在无光照 射条件下使半数鸡胚出现阳性反应的受试物浓度；
3)光刺激性RC50UV+确定试验
选取受试物，用溶剂溶解后，在无血管反应的受试物最高浓度以下，选择高 于RC50UV-的一个稀释浓度开始，采用相同的稀释因子制备一组具有浓度梯度的 稀释液，将该组稀释液、阳性对照和阴性对照，在光照条件下分别加入到步骤(1) 中制备的鸡胚的卵黄囊血管膜上，恒温培养箱孵育后，观察血管、胚胎存活变化， 并与阳性对照和阴性对照相比较，血管的变化按照下表1进行判定和分级，血管 反应分级在2级及其以上者为血管反应阳性，按对数图计算光刺激性RC50的值， 简称RC50UV+，即在有光照射条件下使半数鸡胚出现阳性反应的受试物浓度；
表1光毒性的血管反应观察及分级
(5)光刺激预测模型和判断
按以下公式计算光刺激指数PII＝RC50UV-/RC50UV+，从浓度-反应关系计算 有光照RC50UV+和无光照片情况下的RC50UV-；
根据上述预测模型得出的光刺激指数，根据以下条件作出光刺激判断：
PII＜2：预测“无光毒性”；
2≤PII且PIF＜5：预测“可能具有光毒性”；
PIF≥5，预测“光毒性”。
在上述利用鸡胚血管系统检测和评价个人护理产品和原料光毒性的方法中：
步骤(1)中优选选取胎龄0天的SPF级受精鸡胚放入恒温培养箱中孵育4～5 天后，获得具有卵黄囊血管膜的受精鸡胚备用。
步骤(1)中所述的SPF级受精鸡胚的种类优选为白莱杭鸡、星杂288、白 洛克、麻黄或岭南黄鸡。
步骤(2)中优选取步骤(1)中制备获得的鸡胚，在三个光照剂量强度下照 射20～50min后，观察卵黄囊血管膜、胚胎发育的变化。
步骤(1)～(4)优选在恒温培养箱中进行，恒温培养箱孵育时温度优选为 37℃±1℃，相对湿度优选为65％±5％。
步骤(2)中三个光照剂量强度的范围优选在4～16J/cm2，光照时采用紫外 光源，所述的紫外光源优选为金属卤化物灯、氙灯或太阳模拟仪，光源中以波长 为280～400nm的UVA为主。
步骤(3)中所述受试物优选包括个人护理产品、洗漱用品、家用洗涤产品、 化妆品或纺织品浸提物。
步骤(3)中受试物进一步优选包括：(a)单一成份化学物质，包括化学品、 药物或农药；或(b)以单一成份为主的原料，包括植物精提物、粗提物、生物 活性原料或多肽；或(c)简单配方，指由3～5种原料复配的半成品或成品，包 括防晒剂或抗氧化剂。
步骤(3)～(4)中阳性对照优选为原卟啉、乙酸或十二烷基磺酸钠SLS等， 阴性对照优选为溶解受试物的溶剂。
本发明通过标准化的鸡胚为测试系统，其发育不同阶段的血管系统与人体眼 结膜和口腔粘膜组织类似，鸡胚标准化程度高、来源稳定且批间差异小，血管系 统具有生物学活性和功能，测试系统简单、廉价，无需特殊设备，检测方法快速、 灵敏、通用。
作为本发明的一种优选的实施方式，上述利用鸡胚血管系统检测和评价个人 护理产品和原料光毒性的方法，进一步包括以下步骤：
一、鸡胚卵黄囊血管膜的制备
购买胎龄0天的SPF级受精鸡胚放入温度为37℃±1℃、相对湿度为65％± 5％的恒温培养箱中孵育。第2天，将鸡胚水平放置。第3天，将鸡胚对光检查， 弃去没有受精或发育不良的鸡胚。对正常发育的鸡胚，从鸡蛋的非气室端开一个 小孔，用酒精棉球擦去粉尘，用注射器从小孔中抽出2.5-3mL蛋清以降低胚胎和 周围的卵黄囊血管膜。用石蜡将小孔封闭。然后在鸡蛋顶端上方开一个边长 0.8-1cm的矩形小窗，用酒精棉球擦去粉尘。用保鲜膜将小窗封闭，用于每天观 察鸡胚活力。将鸡胚放回温度为37℃±1℃、相对湿度为65％±5％的恒温培养 箱孵育。第4-5天，可以开始进行试验。
二、光剂量确定实验
取步骤(一)中制备获得的鸡胚，用镊子沿开好的窗口将蛋壳剥开至2×2.5cm2大小。在光照剂量4-16J/cm2范围内设置三个剂量浓度，每组鸡胚分别在三个光 照剂量浓度下照射20-50min。观察卵黄囊血管膜、胚胎发育的变化，将无毒性 的光照剂量用于后续试验。
三、受试物制备
3.1原料和化学品制备
称取一定量的受试物加入到玻璃管，然后加入一定体积的溶剂，使其完全溶 解。化学品和原料的起始浓度为0.01％，作为储备液备用，实验时把储备液进行 连续梯度稀释。溶剂选择的优先顺序为水、PBS(极性物质)和玉米油、橄榄油 (非极性物质)。对于难溶或不溶于水和玉米油的物质，则应在将受试物稀释或 者加到血管膜之前，充分振荡使液体充分均匀。
3.2成品制备
3.2.1水或PBS为溶剂制备受试物
配制受试物贮备液前，先了解物质的溶解性。对于水或PBS可溶解的物质， 称取一定量的受试物加入到玻璃管，然后加入一定体积的纯净水、双蒸水或 PBS，使其混匀。在无血管反应的受试物最高浓度以下，分别配制浓度5个浓度 (w/v)的稀释液，例如血管对受试物无反应的最高浓度在70％，则配制浓度为 70％、50％、30％、10％和5％这个5个浓度(w/v)的稀释液。
3.2.2油为溶剂制备受试物
对于水和PBS不溶解的物质，可选择玉米油或橄榄油为溶剂，制备成混悬 液，尽量使受试物在溶解体系中均匀分布。在无血管反应的受试物最高浓度以 下，分别配制浓度5个浓度(w/v)的稀释液，例如血管对受试物无反应的最高 浓度在70％，则配制浓度为70％、50％、30％、10％和5％这个5个浓度(w/v) 的稀释液。
3.3阳性对照
以原卟啉为光毒性阳性对照。
3.4阴性对照
以溶解受试物所用溶剂作为对照，其中以纯净水、双蒸水、PBS和玉米油、 橄榄油为溶剂时，可以直接用100％(w/v)的该溶剂作为溶剂对照。
四、光毒性测试
4.1受试物毒性范围确定试验
将受试物按照步骤(三)制备储备液，从用水或玉米油从最高浓度按梯度向 下连续稀释5个浓度。取步骤1.1制备获得的鸡胚，用镊子沿开好的窗口将蛋壳 剥开至2×2.5cm2大小。用移液枪吸取1mL上述各浓度梯度的溶液，加入到形 成的卵黄囊血管膜上。轻轻晃动鸡胚，使溶液完全覆盖整个血管膜。放入温度为 37℃±1℃、相对湿度为65％±5％的恒温培养箱孵育30min±1min，观察记录血 管、胚胎存活的变化。并与对照组相比较。每个浓度3只鸡胚。血管的变化按照 表1进行判定和分级，血管反应分级在2级和2级以上为血管反应阳性。
4.2刺激性RC50确定试验
RC50确定试验要求比预实验使用一个更小的稀释因子，如采用十进制几何 浓度系列稀释法，可选择稀释因子3.16、2.15、1.78、1.47。稀释浓度3-5个，应 覆盖(4.1)预实验确定的浓度范围，每个浓度10只鸡胚。取步骤(一)中制备获 得的鸡胚，用镊子沿开好的窗口将蛋壳剥开至2×2.5cm2大小。用移液枪吸取1mL 上述各浓度梯度的溶液，加入到形成的卵黄囊血管膜上。轻轻晃动鸡胚，使溶液 完全覆盖整个血管膜。立即用黑色的遮光膜覆盖窗口，放入温度为37℃±1℃、 相对湿度为65％±5％的恒温培养箱孵育30min±1min，观察记录血管、胚胎存 活的变化。并与对照组相比较。血管的变化按照表1进行判定和分级，血管反应 分级在2级和2级以上为血管反应阳性，按对数图计算刺激性RC50的值，简称 RC50UV-，即在无光照射条件下使半数鸡胚出现阳性反应的受试物浓度。加受试 物和孵育时应尽量避免光照。
4.3光刺激性RC50确定试验
鸡胚光毒性试验采用的受试物浓度应以仅高于RC50UV-的一个稀释浓度开 始，连续向下采用相同的稀释因子再制备2-4个浓度，共4-6个浓度。取步骤(一) 中制备的40-60只鸡胚，每个浓度使用10只鸡胚。用镊子沿开好的窗口将蛋壳 剥开至2×2.5cm2大小。用移液枪吸取1ml稀释好的受试物溶液，加入到形成的 卵黄囊血管膜上。轻轻晃动鸡胚，使溶液完全覆盖整个血管膜。按照步骤2.1得 到的无毒性的光照剂量照射鸡胚20-50min，观察记录血管、胚胎变化。血管的 变化按照表1进行判定和分级，血管反应分级在2级和2级以上为血管反应阳 性，按对数图计算光刺激RC50的值，即在有光照射条件下使半数鸡胚出现阳性 反应的受试物浓度，计为RC50UV+。
五、光刺激性预测模型
5.1血管阳性反应分级
观察血管膜血管反应，分级描述如表1。
5.2预测模型
按以下公式计算光刺激指数(photo irritation index)
PII＝RC50UV-/RC50UV+
从浓度-反应关系计算有光照(RC50UV+)和无光照片情况下的(RC50UV-)。 推荐采用以下2种方法进行统计分析，其它专业统计学方法也可应用。
(1)图表法或对数-概率单位法计算RC50UV-和RC50UV+。
(2)用非线性的回归方程计算RC50，推荐采用Probit回归模型，该模型是 毒理学、药理学领域计算半数致死量和半数有效剂量等剂量关系统计指标的常用 统计模型。统计学软件(例如，SPSS 20.0)进行。
六、光刺激性分类
根据上述5.2预测模型得出光刺激指数，根据以下条件作出光刺激性判断：
如果：PII＜2：预测“无光毒性”；
PII≥2，且PIF＜5：预测“可能具有光毒性”；
PIF≥5，预测“光毒性”。
在该利用鸡胚血管系统检测和评价个人护理产品和原料光毒性的方法中：
步骤(一)中所述的鸡胚为育龄为0天的SPF级(无特定病原微生物)的白莱 杭鸡(White Leghorn chicken)或星杂288(Shaver Starcross)受精鸡胚，也可选 用白洛克(White Plymouth Rock)、麻黄(spotted-brown chickens)或岭南黄鸡 (Lingnan Yellowchicken)等品种受精鸡胚。
步骤(一)、步骤(二)中所述的检测光毒性使用的是4-5天龄鸡胚，指鸡 胚发育至第4-5天时，卵黄囊形成，胚胎与卵黄囊血管形成类似蜘蛛的形态。
步骤(二)中所述的受试物的皮肤光刺激性是指由于紫外线照射导致接触皮 肤的受试物质的毒性增强，对人体皮肤产生健康危害，这些物质如酚噻嗪、补骨 脂类等。
步骤(二)中所述的紫外光源为金属卤化物灯、氙灯或太阳模拟仪。光谱中以 UVA为主，其覆盖波长范围为320-400nm。
步骤(二)的光剂量确定实验的具体过程为：取步骤(一)中制备获得的鸡胚， 用镊子沿开好的窗口将蛋壳剥开直至露出全部卵黄囊血管膜，此时窗口大小大概 为2×2.5cm2。共三组鸡胚，每组12个。第一组鸡胚在剂量为5J/cm2的光照下照 射30min，第二组鸡胚在剂量为10J/cm2的光照下照射30min，第三组鸡胚在剂 量为15J/cm2的光照下照射30min。光源采用的是太阳模拟仪，波长在 280-400nm，强度在4-16J/cm2。
步骤3.1中所述的可能需要测试光毒性的化学品和原料：包括(1)单一成 份化学物质，包括化学品、药物、农药，如盐酸氯丙嗪、原卟啉、盐酸胺碘酮、 诺氟沙星、喹诺酮类抗菌素、布洛芬、四环素类、磺胺类、米诺环类、格列苯脲、 多西环素等；或(2)以单一成份为主的原料：如植物精提物、粗提物、生物活 性原料、多肽等；或(3)简单配方：指由3-5种原料复配的半成品和成品，如 防晒剂、抗氧化剂等。
步骤3.2中所述的可能需要测试光毒性的产品，包括个人护理产品、家用洗 涤产品、化妆品、纺织品浸提物等。本发明所述个人护理产品包括：洗发水、护 发素、染发剂、护发精油、沐浴乳、身体乳等；洗涤产品包括：洗衣液、洗衣粉、 肥皂、洗洁精、漂白剂、消毒液、柔顺剂等；化妆品包括：粉底、BB霜、CC 霜、眼影、唇彩等。
步骤(三)中所述的受试物的制备，所选溶剂可以为超纯水、PBS或玉米油。 溶剂与受试物的混匀可借助研磨、加热、震荡、搅拌等方式，直到受试物与溶剂 完全混匀。
步骤(二)、步骤(三)和步骤(四)所述的鸡胚血管阳性反应，是指鸡胚发 育4-5天的卵黄囊血管膜。可能发生的刺激性反应，包括鬼影血管、充血、出血， 并根据不同反应涉及的面积、严重程度进行分级，分级步骤(二)、(三)、(五) 所述的RC50，是指使鸡胚血管系统发生阳性反应的受试物的稀释浓度。经过统 计得出的化学品和植物提取物的RC50值精确到小数点后3位，原料和成品的RC50值精确到小数点后2位。
步骤5.1所述的光刺激性的模型是指通过无光照条件下鸡胚发生刺激性反应 的RC50UV-，与有光照条件下鸡胚发生刺激反应的RC50UV+进行比较，得出刺激指 数PII，PII超过一定的比例则判断其为光毒性物质。对于RC50≥100％的物质，默 认RC50为100％。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
(1)本发明使用的SPF级受精胚，是标准化程度高，无病原微生物污染， 批次质量稳定的活性生物系统；
(2)本发明使用鸡胚卵黄囊血管膜为试验系统检测物质的光毒性，适用于 任何原料、混合物、配方和产品的测试，且不受样品溶解性、颜色等物理性状的 影响；
(3)本发明使用鸡胚卵黄囊血管膜为试验系统利用了早期鸡胚发育阶段血 管系统比较简单易观察，方法敏感，与体内实验的一致性程度高，可直接代替动 物实验进行初步筛查，减少动物使用；
(4)本发明使用的鸡胚胎血管系统及建立的检测评估方法，解决了单层细 胞培养只能检测可溶解原料而不能检测不溶解原料、产品和有色物质的局限性， 解决了体外构建三维组织工角膜和皮肤模型成本昂贵、批次不稳定的局限性，更 加稳定、经济和快速；
(5)本发明建立的方法可以代替活体动物和人类皮肤，直接用于化学品、 化妆品、药品等产品的光毒性的预测；
(6)本发明利用鸡胚卵黄囊血管膜检测物质的光毒性，既能判断物质是否 具有光毒性，又能确定其产生光毒性的浓度范围。
附图说明
图1是实施例1中用于化学品原料光毒性的试验结果，其中A图空白对照 组的卵黄囊血管膜，B图是经光照产生刺激性的血管变化；
图2是实施例2中用于化妆品成品光毒性的试验结果，其中A图是空白对 照组的卵黄囊血管膜，B图经光照产生刺激性的血管变化；
图3是实施例3中用于防晒化妆品的防晒剂原料光毒性的试验结果，其中A 图是未经光照的血管图，B图经光照的血管变化。
具体实施方式
实施例1利用鸡胚血管系统检测和评价盐酸氯丙嗪的光毒性的方法
1、卵黄囊血管膜的制备
购买胚龄0天的SPF级受精鸡胚放入温度为37℃±1℃、相对湿度为65％±5％ 的恒温培养箱中孵育。第2天，将鸡胚水平放置。第3天，将鸡胚对光检查，弃 去没有受精或发育不良的鸡胚。对正常发育的鸡胚，从鸡蛋的非气室端开一个小 孔，用酒精棉球擦去粉尘，用注射器从小孔中抽出2.5-3mL蛋清以降低胚胎和周 围的卵黄囊血管膜。用石蜡将小孔封闭。然后在鸡蛋顶端上方开一个边长0.8-1cm 的矩形小窗，用酒精棉球擦去粉尘。用保鲜膜将小窗封闭，用于每天观察鸡胚活 力。将鸡胚放回温度为37℃±1℃、相对湿度为65％±5％的恒温培养箱孵育。第 4-5天，可以开始进行试验。
2、鸡胚光照剂量确定
取4天龄鸡胚，用镊子沿开好的窗口将蛋壳剥开至2×2.5cm2大小。在剂量 4-16J/cm2范围内设置三个剂量浓度分别为5J/cm2、10J/cm2和15J/cm2，每组 三只鸡胚，各组分别在三个光照剂量浓度下照射30min。观察卵黄囊血管膜的变 化，根据试验结果选择10J/cm2为不引起鸡胚光毒性的最高光照剂量，用于后续 试验。
3、受试物制备
3.1所测产品为纯化学品，称取一定量的盐酸氯丙嗪加入到玻璃管，然后加 入一定体积的PBS，使其完全溶解。盐酸氯丙嗪的起始浓度为20mg/mL，作为 储备液备用，实验时把储备液用水进行连续梯度稀释。尽量使受试物在溶解体系 中均匀分布。
3.2阳性对照为原卟啉，浓度为0.1mM(56.3mg/L)，阴性对照为PBS。
3.3根据文献资料预测，估计该化合物对血管无反应的最高浓度约在 0.02mg/mL，RC的范围在0.02mg/mL到0.05mg/mL之间，因此配制预备实验 的浓度为0.06、0.03、0.015、0.0075共4个浓度(mg/mL)。正式实验根据预实 验的结果调整。
4、光毒性试验
4.1预试验确定毒性范围
将制备的受试物储备液，用水从最高浓度按梯度向下连续稀释4个浓度。取 4天龄鸡胚，用镊子沿开好的窗口将蛋壳剥开至2×2.5cm2大小。用移液枪吸取 1mL上述各浓度梯度的溶液，加入到形成的卵黄囊血管膜上。轻轻晃动鸡胚， 使溶液完全覆盖整个血管膜。放入温度为37℃±1℃、相对湿度为65％±5％的恒 温培养箱孵育30min±1min，观察记录血管变化。每个浓度3只鸡胚。血管的变 化按照表1进行判定和分级，血管反应分级在2级和2级以上为血管反应阳性。
预实验结果如下。
浓度(mg/mL) 0.1(n＝3) 0.05(n＝3) 0.025(n＝3) 0.0125(n＝3)
阳性反应比例(≥2级) 3/3 3/3 1/3 0/3
4.2刺激性RC50确定试验
根据4.1结果，正式实验选择的稀释因子为2，在4.1预实验的浓度范围内 配制4个梯度浓度，分别为0.05mg/mL、0.025mg/mL、0.0125mg/mL、0.006255 mg/mL，每个浓度10只鸡胚。取4天龄鸡胚，用镊子沿开好的窗口将蛋壳剥开 至2×2.5cm2大小。用移液枪吸取1mL上述各浓度梯度的溶液，加入到形成的卵 黄囊血管膜上。轻轻晃动鸡胚，使溶液完全覆盖整个血管膜。立即用黑色的遮光 膜覆盖窗口，放入温度为37℃±1℃、相对湿度为65％±5％的恒温培养箱孵育 30min±1min，观察记录血管变化。并与对照组相比较。血管的变化按照表1进 行判定和分级，血管反应分级在2级和2级以上为血管反应阳性，按对数图计算 刺激性RC50的值，简称RC50UV-，即使半数鸡胚出现阳性反应的受试物浓度。加 受试物和孵育时应尽量避免光照。正式实验无光照射条件下鸡胚反应结果及 RC50值如下：
无UVA光照射条件下，该化合物引起鸡胚血管发生阳性反应的RC50UV-为 0.033mg/mL。
4.3光刺激性RC50确定试验
根据4.2结果，有UVA光照条件下的正式实验的浓度范围为0.048mg/mL、 0.024mg/mL、0.012mg/mL、0.006mg/mL、0.003mg/mL共5个浓度，每个浓度 10只鸡胚。采用分步的方法，先从浓度0.048mg/mL开始，逐一向下进行测试， 直到可以得出RC50。例如，假设检测至0.006mg/ml时鸡胚阳性反应仍明显(＞ 3/10)，则再进行0.003mg/mL的测试，依次进行；否则，如果浓度为0.006mg/mL 时鸡胚阳性反应已不明显(≤3/10)，足以得出RC50值，则为实验终点，0.003 mg/mL的测试可不进行。
取步骤1中制备的40-60只鸡胚，每个浓度使用10只鸡胚。用镊子沿开好 的窗口将蛋壳剥开至2×2.5cm2大小。用移液枪吸取1mL稀释好的受试物溶液， 加入到形成的卵黄囊血管膜上。轻轻晃动鸡胚，使溶液完全覆盖整个血管膜。按 照步骤2.1得到的无毒性的光照剂量照射鸡胚20-50min，观察记录血管、胚胎变 化。如图1所示，血管的变化按照表1进行判定和分级，血管反应分级在2级和 2级以上为血管反应阳性，按对数图计算光刺激RC50的值，即在光照射的情况 下使半数鸡胚出现阳性反应的受试物浓度，计为RC50UV+。
正式实验有光照射条件下鸡胚反应结果及RC50值如下：
有UVA光照射条件下，该化合物引起鸡胚血管发生阳性反应的RC50UV+为 0.006mg/mL。
5、光毒性预测及分类
根据实验结果，经对数-概率单位法计算，分别得出无UVA照射条件下的 RC50UV-为0.033mg/mL，有UVA照射条件下的RC50UV+为0.006mg/mL，代入 公式PII＝RC50UV-/RC50UV+。得出PII＝0.033/0.006＝5.5。
根据光刺激性分类标准，如果PII≥5，预测“光毒性”。该化合物PII＝5.5＞5， 预测其为光毒性物质。
实施例2利用鸡胚血管系统检测和评价防晒霜的光毒性的方法
1、卵黄囊血管膜的制备
购买胚龄0天的SPF级受精鸡胚放入温度为37℃±1℃、相对湿度为65％±5％ 的恒温培养箱中孵育。第2天，将鸡胚水平放置。第3天，将鸡胚对光检查，弃 去没有受精或发育不良的鸡胚。对正常发育的鸡胚，从鸡蛋的非气室端开一个小 孔，用酒精棉球擦去粉尘，用注射器从小孔中抽出2.5-3mL蛋清以降低胚胎和周 围的卵黄囊血管膜。用石蜡将小孔封闭。然后在鸡蛋顶端上方开一个边长0.8-1cm 的矩形小窗，用酒精棉球擦去粉尘。用保鲜膜将小窗封闭，用于每天观察鸡胚活 力。将鸡胚放回温度为37℃±1℃、相对湿度为65％±5％的恒温培养箱孵育。第 4-5天，可以开始进行试验。
2、鸡胚光照剂量确定
取4天龄鸡胚，用镊子沿开好的窗口将蛋壳剥开至2×2.5cm2大小。在剂量 4-16J/cm2范围内设置三个剂量浓度分别为5J/cm2、10J/cm2和15J/cm2，每组 三只鸡胚，各组分别在三个光照剂量浓度下照射30min。观察卵黄囊血管膜的变 化，根据试验结果选择10J/cm2为不引起鸡胚光毒性的最高光照剂量，用于后续 试验。
3、受试物制备
3.1所测产品为不溶于水的膏状样品，称取一定量的防晒剂(市场防晒乳) 加入到玻璃管，然后加入一定体积的玉米油，制备成混悬液，尽量使受试物在溶 解体系中均匀分布。
3.2阳性对照为原卟啉，浓度为0.1mM。
3.3根据防晒剂刺激性的经验预测，估计该防晒剂对血管无反应的最高浓度 约在70％，RC的范围在40-60％之间，因此配制预备实验的浓度为70％、50％、 30％、10％共4个浓度(w/v)。正式实验根据预实验的结果调整。
4、光毒性试验
4.1预试验确定毒性范围
取4天龄鸡胚，用镊子沿开好的窗口将蛋壳剥开至2×2.5cm2大小。用移液 枪吸取1mL上述3.3各浓度溶液，加入到形成的卵黄囊血管膜上。轻轻晃动鸡 胚，使溶液完全覆盖整个血管膜。放入温度为37℃±1℃、相对湿度为65％±5％ 的恒温培养箱孵育30min±1min，观察记录血管变化，每个浓度3只鸡胚。血管 的变化按照表1进行判定，血管反应分级在2级和2级以上为血管反应阳性。预 实验结果如下。
4.2刺激性RC50确定试验
根据4.1结果，正式实验选择的浓度范围为50％、30％、15％共3个浓度， 每个浓度10只鸡胚。取4天龄鸡胚，用镊子沿开好的窗口将蛋壳剥开至2×2.5cm2大小。用移液枪吸取1mL上述各浓度梯度的溶液，加入到形成的卵黄囊血管膜 上。轻轻晃动鸡胚，使溶液完全覆盖整个血管膜。立即用黑色的遮光膜覆盖窗口， 放入温度为37℃±1℃、相对湿度为65％±5％的恒温培养箱孵育30min±1min，观 察记录血管变化。并与对照组相比较。血管的变化按照表1进行判定和分级，血 管反应分级在2级和2级以上为血管反应阳性，按对数图计算刺激性RC50的值， 简称RC50UV-，即使半数鸡胚出现阳性反应的受试物浓度。加受试物和孵育时应 尽量避免光照。正式实验无光照射条件下鸡胚反应结果及RC50值如下：
无UVA光照射条件下，防晒剂引起鸡胚血管发生阳性反应的RC50UV-为45.32％。
4.3光刺激性RC50确定试验
根据4.2结果，有UVA光照条件下的正式实验的浓度范围为50％、30％、 15％、10％共4个浓度，每个浓度10只鸡胚。采用分步的方法，先从50％浓度 开始，逐一浓度进行测试，直到可以得出RC50。例如，假设检测至15％时鸡胚 阳性反应仍明显(＞3/10)，则再进行10％浓度的测试；否则，如果15％时鸡胚 阳性反应已不明显(≤3/10)，足以得出RC50值，则实验终点，10％的测试可不 进行。
取4天龄鸡胚，用镊子沿开好的窗口将蛋壳剥开至2×2.5cm2大小。用移液 枪吸取1ml稀释好的受试物溶液，加入到形成的卵黄囊血管膜上。轻轻晃动鸡 胚，使溶液完全覆盖整个血管膜。按照步骤2.1得到的无毒性的光照剂量照射鸡 胚30min，观察记录血管、胚胎变化。如图2所示，血管的变化按照表1进行判 定和分级，血管反应分级在2级和2级以上为血管反应阳性，按对数图计算光刺 激RC50的值，即在光照射的情况下使半数鸡胚出现阳性反应的受试物浓度，计 为RC50UV+。正式实验有光照射条件下鸡胚反应结果及RC50值见下表：
有UVA光照射条件下，防晒剂引起鸡胚血管发生阳性反应的RC50UV+为 43.82％。
5、光毒性预测及分类
根据实验结果，经对数-概率单位法计算，分别得出无UVA照射条件下的 RC50UV-为45.32％，有UVA照射条件下的RC50UV+为43.82％，代入公式PII＝ RC50UV-/RC50UV+。
得出PII＝44.27/42.24＝1.034。
根据光刺激性分类标准，如果＜2：预测“无光毒性”。该防晒剂PII＝1.034 ＜2，预测该产品无光毒性。
实施例3利用鸡胚血管系统检测和评价水杨酸三甲环已酯光毒性的方法
1、卵黄囊血管膜的制备
购买胚龄0天的SPF级白莱杭受精鸡胚放入温度为37℃±1℃、相对湿度为 65％±5％的恒温培养箱中孵育。第2天，将鸡胚水平放置。第3天，将鸡胚对光 检查，弃去没有受精或发育不良的鸡胚。对正常发育的鸡胚，从鸡蛋的非气室端 开一个小孔，用酒精棉球擦去粉尘，用注射器从小孔中抽出2.5-3mL蛋清以降低 胚胎和周围的卵黄囊血管膜。用石蜡将小孔封闭。然后在鸡蛋顶端上方开一个边 长0.8-1cm的矩形小窗，用酒精棉球擦去粉尘。用保鲜膜将小窗封闭，用于每天 观察鸡胚活力。将鸡胚放回温度为37℃±1℃、相对湿度为65％±5％的恒温培养 箱孵育。第4-5天，可以开始进行试验。
2、鸡胚光照剂量确定
取4天龄鸡胚，用镊子沿开好的窗口将蛋壳剥开至2×2.5cm2大小。在剂量 4-16J/cm2范围内设置三个剂量浓度分别为5J/cm2、10J/cm2和15J/cm2，每组 三只鸡胚，各组分别在三个光照剂量浓度下照射30min。观察卵黄囊血管膜的变 化，根据试验结果选择9J/cm2为不引起鸡胚光毒性的最高光照剂量，用于后续 试验。
3、受试物制备
3.1所测产品理化特性为不溶于水和甘油，溶于乙醇，防晒产品中的使用量 不超过10％。因此称取一定量的防晒剂水杨酸三甲环已酯加入到玻璃管，与一定 体积的玉米油混合制备成混悬液，尽量使受试物在溶解体系中均匀分布，水杨酸 三甲环已酯的浓度为10％。
3.2阳性对照为原卟啉，浓度为0.1mM。
3.3根据防晒剂的实际使用量和经验预测，该防晒剂作用于血管的最高浓度 假设为10％，配制预备实验的浓度为10％、5％、1％共3个浓度(w/v)。正式实 验根据预实验的结果调整。
4、光毒性试验
4.1预试验确定毒性范围
取4天龄鸡胚，用镊子沿开好的窗口将蛋壳剥开至2×2.5cm2大小。用移液 枪吸取1mL上述3.3各浓度溶液，加入到形成的卵黄囊血管膜上。轻轻晃动鸡 胚，使溶液完全覆盖整个血管膜。放入温度为37℃±1℃、相对湿度为65％±5％ 的恒温培养箱孵育30min±1min，观察记录血管变化，每个浓度3只鸡胚。血管 的变化按照表1进行判定，血管反应分级在2级和2级以上为血管反应阳性。预 实验结果如下。
浓度 10％(n＝3) 5％(n＝3) 1％(n＝3)
阳性反应比例(≥2级) 1/3 0/3 0/3
4.2刺激性RC50确定试验
根据4.1结果，正式实验选择的浓度范围为10％、5％、1％共3个浓度，每 个浓度10只鸡胚。取4天龄鸡胚，用镊子沿开好的窗口将蛋壳剥开至2×2.5cm2大小。用移液枪吸取1mL上述各浓度梯度的溶液，加入到形成的卵黄囊血管膜 上。轻轻晃动鸡胚，使溶液完全覆盖整个血管膜。立即用黑色的遮光膜覆盖窗口， 放入温度为37℃±1℃、相对湿度为65％±5％的恒温培养箱孵育30min±1min，观 察记录血管变化。并与对照组相比较。血管的变化按照表1进行判定和分级，血 管反应分级在2级和2级以上为血管反应阳性，按对数图计算刺激性RC50的值， 简称RC50UV-，即使半数鸡胚出现阳性反应的受试物浓度。加受试物和孵育时应 尽量避免光照。正式实验无光照射条件下鸡胚反应结果及RC50值如下：
无UVA光照射条件下，防晒剂引起鸡胚血管发生阳性反应的RC50UV-为＞ 10％。
4.3光刺激性RC50确定试验
根据4.2结果，有UVA光照条件下的正式实验的浓度范围为10％、5％、1％、 共4个浓度，每个浓度10只鸡胚。采用分步的方法，先从10％浓度开始，逐一 浓度进行测试，直到可以得出RC50。例如，假设10％时鸡胚阳性反应仍明显(＞3/10)，则再进行5％浓度的测试；如果5％时鸡胚阳性反应已不明显(≤3/10)， 足以得出RC50值，则实验终点，1％的测试可不进行。
取4天龄鸡胚，用镊子沿开好的窗口将蛋壳剥开至2×2.5cm2大小。用移液 枪吸取1mL稀释好的受试物溶液，加入到形成的卵黄囊血管膜上。轻轻晃动鸡 胚，使溶液完全覆盖整个血管膜。按照步骤2得到的无毒性的光照剂量照射鸡胚 30min，观察记录血管的变化。如图3所示，血管的变化按照表1进行判定和分 级，血管反应分级在2级和2级以上为血管反应阳性，按对数图计算光刺激RC50 的值，即在光照射的情况下使半数鸡胚出现阳性反应的受试物浓度，计为 RC50UV+。正式实验有光照射条件下鸡胚反应结果及RC50值见下表：
有UVA光照射条件下，未观察到防晒剂引起鸡胚血管明显变化，其发生阳 性反应的RC50UV+为＞10％。
5、光毒性预测及分类
根据实验结果，经对数-概率单位法计算，分别得出无UVA照射条件下的 RC50UV-为＞10％，有UVA照射条件下的RC50UV+为＞10％，代入公式PII＝RC50UV- /RC50UV+。
得出PII＝1。
根据光刺激性分类标准，如果＜2：预测“无光毒性”。该防晒剂在正常使用 范围内(＜10％)PII＝1＜2，预测该产品无光毒性。
实施例4利用鸡胚血管系统检测和评价婴儿按摩油的光毒性的方法
步骤1-3.1同实施例1-3。
3.2阳性对照为原卟啉，浓度为0.1mM(56.3mg/L)，阴性对照为PBS。
3.3根据文献资料预测，估计该化合物对血管无反应的最高浓度约在 0.02mg/mL，RC的范围在0.02mg/mL到0.05mg/mL之间，因此配制预备实验 的浓度为0.06、0.03、0.015、0.0075共4个浓度(mg/mL)。正式实验根据预实 验的结果调整。
4、光毒性试验
4.1预试验确定毒性范围
将制备的受试物储备液，用水从最高浓度按梯度向下连续稀释4个浓度。取 4天龄鸡胚，用镊子沿开好的窗口将蛋壳剥开至2×2.5cm2大小。用移液枪吸取 1mL上述各浓度梯度的溶液，加入到形成的卵黄囊血管膜上。轻轻晃动鸡胚， 使溶液完全覆盖整个血管膜。放入温度为37℃±1℃、相对湿度为65％±5％的恒 温培养箱孵育30min±1min，观察记录血管变化。每个浓度3只鸡胚。血管的变 化按照表1进行判定和分级，血管反应分级在2级和2级以上为血管反应阳性。
预实验结果如下。
浓度(mg/mL) 0.1(n＝3) 0.05(n＝3) 0.025(n＝3) 0.0125(n＝3)
阳性反应比例(≥2级) 3/3 3/3 1/3 0/3
4.2刺激性RC50确定试验
根据4.1结果，正式实验选择的稀释因子为2，在4.1预实验的浓度范围内 配制4个梯度浓度，分别为0.05mg/mL、0.025mg/mL、0.0125mg/mL、0.006255 mg/mL，每个浓度10只鸡胚。取4天龄鸡胚，用镊子沿开好的窗口将蛋壳剥开 至2×2.5cm2大小。用移液枪吸取1mL上述各浓度梯度的溶液，加入到形成的卵 黄囊血管膜上。轻轻晃动鸡胚，使溶液完全覆盖整个血管膜。立即用黑色的遮光 膜覆盖窗口，放入温度为37℃±1℃、相对湿度为65％±5％的恒温培养箱孵育 30min±1min，观察记录血管变化。并与对照组相比较。血管的变化按照表1进 行判定和分级，血管反应分级在2级和2级以上为血管反应阳性，按对数图计算 刺激性RC50的值，简称RC50UV-，即使半数鸡胚出现阳性反应的受试物浓度。加 受试物和孵育时应尽量避免光照。正式实验无光照射条件下鸡胚反应结果及 RC50值如下：
无UVA光照射条件下，该化合物引起鸡胚血管发生阳性反应的RC50UV-为 0.033mg/mL。
4.3光刺激性RC50确定试验
根据4.2结果，有UVA光照条件下的正式实验的浓度范围为0.048mg/mL、 0.024mg/mL、0.012mg/mL、0.006mg/mL、0.003mg/mL共5个浓度，每个浓度 10只鸡胚。采用分步的方法，先从浓度0.048mg/mL开始，逐一向下进行测试， 直到可以得出RC50。例如，假设检测至0.006mg/ml时鸡胚阳性反应仍明显(＞ 3/10)，则再进行0.003mg/mL的测试，依次进行；否则，如果浓度为0.006mg/mL 时鸡胚阳性反应已不明显(≤3/10)，足以得出RC50值，则为实验终点，0.003 mg/mL的测试可不进行。
取步骤1中制备的40-60只鸡胚，每个浓度使用10只鸡胚。用镊子沿开好 的窗口将蛋壳剥开至2×2.5cm2大小。用移液枪吸取1mL稀释好的受试物溶液， 加入到形成的卵黄囊血管膜上。轻轻晃动鸡胚，使溶液完全覆盖整个血管膜。按 照步骤2得到的无毒性的光照剂量照射鸡胚20-50min，观察记录血管、胚胎变 化。血管的变化按照表1进行判定和分级，血管反应分级在2级和2级以上为血 管反应阳性，按对数图计算光刺激RC50的值，即在光照射的情况下使半数鸡胚 出现阳性反应的受试物浓度，计为RC50UV+。
正式实验有光照射条件下鸡胚反应结果及RC50值如下：
有UVA光照射条件下，该化合物引起鸡胚血管发生阳性反应的RC50UV+为0.006 mg/mL。
5、光毒性预测及分类
根据实验结果，经对数-概率单位法计算，分别得出无UVA照射条件下的 RC50UV-为0.033mg/mL，有UVA照射条件下的RC50UV+为0.006mg/mL，代入 公式PII＝RC50UV-/RC50UV+。得出PII＝0.033/0.006＝5.5。
根据光刺激性分类标准，如果PII≥5，预测“光毒性”。该化合物PII＝5.5＞5， 预测其为光毒性物质。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施 例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替 代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围。例如本 发明虽然仅列举了部分化学品原料、防晒剂为光刺激的样品。但本发明中提到的 其他物质如化学品(氯丙嗪、原卟啉、盐酸胺碘酮、诺氟沙星等)、个人洗护产 品(洗发水、护发素、染发剂、护发精油、沐浴乳、身体乳等)、家用洗涤产品 (洗衣液、洗衣粉、肥皂、洗洁精、漂白剂、消毒液、柔顺剂等)、化妆品(护 肤类、防晒类、粉底、BB霜、CC爽、眼影、唇彩等)、药品(喹诺酮类抗菌素、 布洛芬、四环素类、磺胺类、米诺环类、格列苯脲、多西环素等)、植物提取物 (粗提取物、精提取物及其混合物)、生物活性原料、多肽、其它皮肤接触产品 (衣服、内衣等纺织品浸提物)等也可以用本发明所述方法进行光毒性检测。此 处不再一一列举。

Claims (9)

1.一种利用鸡胚血管系统检测和评价个人护理产品和原料光毒性的方法，其特征是包含以下步骤：
(1)鸡胚卵黄囊血管膜制备
选取SPF级受精鸡胚，制备具有卵黄囊血管膜的受精鸡胚备用；
(2)光剂量确定实验
取步骤(1)中制备获得的鸡胚，在三个光照剂量强度下照射后，观察卵黄囊血管膜、胚胎发育的变化，将无毒性的光照剂量用于后续刺激性RC50确定试验和光刺激性RC50确定试验；
(3)受试物制备
选取受试物，用溶剂溶解后，在无血管反应的受试物最高浓度以下，配制一组具有浓度梯度的稀释液，备用，并设置阳性对照和阴性对照；
(4)光毒性实验
1)预试验
取步骤(3)中配制的一组具有浓度梯度的稀释液、阳性对照和阴性对照，分别加入到步骤(1)中制备的鸡胚的卵黄囊血管膜上，恒温培养箱孵育后，观察血管、胚胎存活变化，并与阳性对照和阴性对照相比较，血管的变化按照下表1进行判定和分级，血管反应分级在2分以上者为血管反应阳性；
2)无光刺激性RC50UV-确定试验
选取受试物，用溶剂溶解后，在无血管反应的受试物最高浓度以下，选择比预实验更小的稀释因子，重新配制一组具有浓度梯度的稀释液，将该组稀释液、阳性对照和阴性对照，无光照条件下分别加入到步骤(1)中制备的鸡胚的卵黄囊血管膜上，恒温培养箱孵育后，观察血管、胚胎存活变化，并与阳性对照和阴性对照相比较，血管的变化按照下表1进行判定和分级，血管反应分级在2级以上者为血管反应阳性，按对数图计算刺激性RC50的值，简称RC50UV-，即在无光照射条件下使半数鸡胚出现阳性反应的受试物浓度；
3)光刺激性RC50UV+确定试验
选取受试物，用溶剂溶解后，在无血管反应的受试物最高浓度以下，选择高于RC50UV-的一个稀释浓度开始，采用相同的稀释因子制备一组具有浓度梯度的稀释液，将该组稀释液、阳性对照和阴性对照，在光照条件下分别加入到步骤(1)中制备的鸡胚的卵黄囊血管膜上，恒温培养箱孵育后，观察血管、胚胎存活变化，并与阳性对照和阴性对照相比较，血管的变化按照下表1进行判定和分级，血管反应分级在2级及其以上者为血管反应阳性，按对数图计算光刺激性RC50的值，简称RC50UV+，即在有光照射条件下使半数鸡胚出现阳性反应的受试物浓度；
表1 光毒性的血管反应观察及分级
分级 观察描述 0 观察不到血管褪色或者出血，血管膜正常 1 血管白色无血液，管壁清晰；或/和毛细血管充血 2 毛细胞血管可见细小出血点，出血面积＜20％ 3 明显的血管出血，散在或出血区域＞20％，＜50％ 4 严重出血，出血区域超过50％
(5)光刺激预测模型和判断
按以下公式计算光刺激指数PII＝RC50UV-/RC50UV+，从浓度-反应关系计算有光照RC50UV+和无光照片情况下的RC50UV-；
根据上述预测模型得出的光刺激指数，根据以下条件作出光刺激判断：
PII＜2：预测“无光毒性”；
2≤PII且PIF＜5：预测“可能具有光毒性”；
PIF≥5，预测“光毒性”。
2.根据权利要求1所述的利用鸡胚血管系统检测和评价个人护理产品和原料光毒性的方法，其特征是：步骤(1)中选取胎龄0天的SPF级受精鸡胚放入恒温培养箱中孵育4～5天后，获得具有卵黄囊血管膜的受精鸡胚备用。
3.根据权利要求1所述的利用鸡胚血管系统检测和评价个人护理产品和原料光毒性的方法，其特征是：步骤(1)中所述的SPF级受精鸡胚的种类为白莱杭鸡、星杂288、白洛克、麻黄或岭南黄鸡。
4.据权利要求1所述的利用鸡胚血管系统检测和评价个人护理产品和原料光毒性的方法，其特征是：步骤(2)中取步骤(1)中制备获得的鸡胚，在三个光照剂量强度下照射20～50min后，观察卵黄囊血管膜、胚胎发育的变化。
5.根据权利要求1所述的利用鸡胚血管系统检测和评价个人护理产品和原料光毒性的方法，其特征是：步骤(1)～(4)在恒温培养箱中进行，恒温培养箱孵育时温度为37℃±1℃，相对湿度为65％±5％。
6.根据权利要求1所述的利用鸡胚血管系统检测和评价个人护理产品和原料光毒性的方法，其特征是：步骤(2)中三个光照剂量强度的范围在4～16J/cm2，光照时采用紫外光源，所述的紫外光源为金属卤化物灯、氙灯或太阳模拟仪，光源中以波长为280～400nm的UVA为主。
7.根据权利要求1所述的利用鸡胚血管系统检测和评价个人护理产品和原料光毒性的方法，其特征是：步骤(3)中所述受试物包括个人护理产品、洗漱用品、家用洗涤产品、化妆品或纺织品浸提物。
8.根据权利要求1所述的利用鸡胚血管系统检测和评价个人护理产品和原料光毒性的方法，其特征是：步骤(3)中受试物包括：(a)单一成份化学物质，包括化学品、药物或农药；(b)以单一成份为主的原料，包括植物精提物、粗提物、生物活性原料或多肽；或(c)简单配方，指由3～5种原料复配的半成品或成品，包括防晒剂或抗氧化剂。
9.根据权利要求1所述的利用鸡胚血管系统检测和评价个人护理产品和原料光毒性的方法，其特征是：步骤(3)～(4)中阳性对照原卟啉、乙酸或十二烷基磺酸钠，阴性对照为溶解受试物的溶剂。
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