CN101041080A - 鸡胚卵黄囊膜血管生成模型与分析方法及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明为一种鸡胚卵黄囊膜血管生成模型，本模型是用于检测或筛选对新生血管生成具有影响作用药物的活体实验模型。本发明的主要步骤是：将孵化60小时的鸡胚离壳后移入小烧杯中，继续孵育12小时，将待测药物加入到放置在卵黄囊膜上的硅胶环内，在对照液和待测药液中都含有甘油或二甲基亚砜作为渗透剂，12小时后取下硅胶环，开始动态观察药物对卵黄囊膜血管生成的影响作用。根据卵黄囊膜血管在影响血管生成药物作用下表现出相应的生长状态，判断出检测药物对血管生成具有抑制还是刺激作用或无作用，使本发明与传统的鸡胚尿囊膜血管生成试验模型相比，具有简单、直观、快速、准确等优点。

Description

鸡胚卵黄囊膜血管生成模型与分析方法及其用途

技术领域

本发明涉及一种新型血管生成活体模型的建立，提供了一种鸡胚卵黄囊膜血管生成模型，同时公开该模型在检测与筛选影响血管生成药物中的用途，属于生物技术领域。

背景技术

1971年哈佛大学医学院Folkman提出抗血管生成理论后，对血管形成机制、内源性血管生成刺激因子和抑制因子及抗血管生成活性类药物的筛选等研究已取得较大的进展。血管生成方面的研究主要依赖于针对血管内皮细胞增殖及体内外的血管生成实验方法与模型。其中，对活体血管生成影响的定性、定量研究采用兔或大鼠角膜囊、小鼠背囊、地鼠颊囊、鼠耳以及鸡胚绒毛尿囊膜等实验模型；而以鸡胚绒毛尿囊膜模型最为简便、经济，是一种实验周期较短、不需要特殊设备的实用性方法，一般实验室均可开展，但是尿囊膜血管发生模型有诸多的不足之处，如试验周期较长，一般为2周以上；难以保证给药部位的稳定性；对操作技术要求高；尿囊膜血管分布广且个体差异较大，局部给药又难以维持药物植入物部位的统一；难以对血管生成过程进行动态观察；难以对实验部位的血管生长进行量化分析等等。

发明内容

本发明的目的是建立一种新型血管生成模型—鸡胚卵黄囊膜血管生成模型，用于筛选影响血管生成的药物，解决了尿囊膜血管发生模型试验周期较长、给药部位的稳定性差的问题。

本发明鸡胚卵黄囊膜血管生成模型的建立方法如下：

1、将鸡卵置于正常孵化温度下，有加湿水盘的孵箱中孵化50-70小时，再将鸡卵内容物倾倒入有盖的无菌小玻璃烧杯中，继续孵育8-16小时。

2、挑选卵黄膜完整、血管网及胚盘发育良好的鸡胚，鸡胚随机分成对照组和测试组，将硅胶环(外径26毫米，内径22毫米)放置到鸡胚的卵黄囊血管网上。

3、对照组：胶圈中加入含有促渗透剂的PBS溶液150-220微升；

测试组：胶圈中加入含待检测药物的PBS溶液150-220微升，(也可将待测药物溶解于含渗透剂的PBS中)，继续孵育8-16小时后撤走硅胶环，对给药前后卵黄囊血管面积或密度或卵黄囊膜面积变化进行测定，测试组中卵黄囊膜血管面积或密度或卵黄囊膜面积增长率明显大于对照组的确定为血管生成刺激药物，明显低于对照组的确定为血管生成抑制药物。

4、根据下式计算对照组、测试组的卵黄囊膜血管面积与密度增长率、卵黄囊膜面积，数据比较采用t检验：

卵黄囊膜血管面积增长率＝(给药后YSM血管总面积-给药前YSM血管总面积/给药前YSM血管

                        总面积)×100％

卵黄囊膜血管密度增长率＝(给药后YSM血管密度-给药前YSM血管密度/给药前YSM血管密度)

                        ×100％

卵黄囊膜面积增长率＝(给药后YSM总面积-给药前YSM总面积/给药前YSM总面积)×100％

所述硅胶环的外径为26毫米，内径为22毫米，既能限定给药部位又能承载药液。

所述的促渗透剂为5-10％的甘油或0.4-0.8％的二甲基亚砜，能够提高试验药物的吸收作用。

本发明的优点和效果在于：与传统的鸡胚尿囊膜(CAM)血管生成试验相比，本模型具有利于给药部位的确定、药物作用的观察及拍摄、确定最佳的给药时间和保证给药部位的一致性等。通过在体外培养鸡胚，用卵黄囊膜代替尿囊膜进行血管生成实验，使操作更为简单、结果更为直观。采用无毒的硅胶环作为试验药物的载体，该载体既能限定给药部位又能承载药液。由于硅胶环有一定的重量，会在环周围形成凹陷，使环内药液与卵黄囊膜紧密接触，减少了药液的外溢，有利于药物的吸收。在硅胶环内给药的方法避免了以贴片作为药物载体带来的贴片移位及粘连等方面的问题。

由于本试验针对的是整个卵黄囊膜血管网，从而避免了尿囊膜试验中仅针对局部血管所带来的选点误差。尿囊膜本身的血管分布个体差异很大，而尿囊膜气室给药区局部血管的变异更大，局部给药很难保证给药部位的一致性。由于鸡胚YSM血管上覆盖有羊膜和浆膜层，可在不同程度上影响待测药物的渗透与吸收。通过不同的渗透剂对比，选用5-10％的甘油或0.4-0.8％的二甲基亚砜作为本模型的渗透剂，在此浓度下的甘油和二甲基亚砜既对鸡胚胎既没有表现出明显毒性，又能通过其促渗透作用促进卵黄囊血管对药物的吸收，同时甘油也是一种良好的保湿剂，能够使待测药物保持一定浓度。在给药期间取出箱内水盘，也能使甘油溶液中的待侧药物保持一定浓度，不会因吸湿而使药物浓度下降。以上措施均能使血管生成实验更加敏感。

综上所述，本发明的卵黄囊膜血管生成模型可使实验周期大为缩短，实验结果更为客观准确，是一种值得推广的活体血管生成实验模型。与尿囊膜实验中采用的一次性取膜检测相比，具有可动态观测的特点。该模型将极大地提高影响血管生成药物筛选的效率，为影响血管生成药物的活性检测提供了更为有效、实用的技术方法。

附图说明

图1.硅胶环(外径26毫米，内径22毫米)置于卵黄囊膜上形成圆形隔离区，将待侧药物加入硅胶环内。

图2.PBS对照组，血管网正常生长，血管粗壮，血流充盈，分支稠密。

图3：2微克/卵，血管网发育迟缓，血管分支密度较对照减少。

图4.20微克/卵，血管网发育不良，外周血管萎缩细弱，血管分支稀少且不规则。

图5.2微克/卵组，血管网发育受阻，边缘血管分支密度减少。

图6.20微克/卵组，血管网发育不良，外周血管萎缩细弱，血管分支稀少且不规则。

图7.重组人血管内皮细胞生长因子(2微克/卵)给药12-16小时后，对鸡胚YSM血管生成的影响，鸡胚卵黄囊血管生长与对照组相比更加茂盛，血管网扩展迅速，血管分支更加稠密。

图8.图像分析软件操作界面

鸡胚：周长10.81毫米，面积6.9平方毫米，形状系数1.16；

净卵黄囊膜：周长54.9毫米，面积236.01平方毫米，形状系数1.01；

血管面积：28.36平方毫米；

血管密度：12.38。

图9.血管抑素对卵黄囊膜血管发生和卵黄囊膜发育的抑制作用：

1、卵黄囊膜血管面积增长率

2、卵黄囊膜面积增长率

3、卵黄囊膜血管密度增长率。**P＜0.01，*P＜0.05，n＝10

具体实施方式：

下列实施例旨在进一步举例描述本发明，而不是以任何方式限制本发明，在不背离本发明的精神和原则的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的待批权利要求范围之内。

实施例1

重组人血管抑素K1-3

材料：

鸡蛋来源：本地养鸡场；重组人血管抑素K1-3；

步骤：

1、鸡卵准备：用75％酒精消毒鸡蛋表面，晾干后将鸡卵气室向上，长轴与蛋托呈45°放入37.8℃、60％相对湿度的孵箱中。

2.鸡卵孵化：孵化过程中，每8小时转蛋一次，转蛋角度以水平位置前俯后仰各45度为宜。孵化至2.5天时，在超净台中用75％酒精消毒鸡卵外壳，在鸡卵中间部位轻轻磕出裂口，迅速掰开卵壳(以免卵壳划伤卵黄)，将鸡胚倾入无菌玻璃烧杯中。由于重力及卵系带的固定作用，鸡卵的胚盘可自动翻转到卵黄表面，烧杯加盖后放入37.8℃、60％相对湿度的孵箱中继续孵育12小时。

3.鸡卵筛选：挑选卵黄膜完整、血管网呈近似圆形、胚盘位于卵黄膜中央且心搏良好、卵黄囊膜直径接近上样硅胶环直径的鸡胚进入实验。

4.给药：冲洗完毕后，将鸡卵随机分成三组，每组10个。对照组在每只位于卵黄囊膜上的硅胶环内加入200微升含8％甘油的磷酸缓冲液(图1)，给药组加入溶解于上述磷酸缓冲液，终浓度分别为每毫升含10微克和100微克的血管抑素200微升，将加湿水盘从孵箱中移出，继续孵育12小时后小心撤走硅胶环观察实验结果。此后每隔4小时观察一次。

结论：重组人血管抑素K1-3具有血管生成抑制作用。

实施例2

内皮抑素

材料

鸡蛋来源：本地养鸡场；内皮抑素；

步骤：

1.鸡卵准备：用75％酒精消毒鸡蛋表面，晾干后将鸡卵气室向上，长轴与蛋托呈45°放入37.8℃、60％相对湿度的孵箱中。

2.鸡卵孵化：孵化过程中，每8小时转蛋一次，转蛋角度以水平位置前俯后仰各45度为宜。孵化至2.5天时，在超净台中用75％酒精消毒鸡卵外壳，在鸡卵中间部位轻轻磕出裂口，迅速掰开卵壳(以免卵壳划伤卵黄)，将鸡胚倾入无菌玻璃烧杯中。由于重力及卵系带的固定作用，鸡卵的胚盘可自动翻转到卵黄表面，烧杯加盖后放入37.8℃、60％相对湿度的孵箱中继续孵育12小时。

3.鸡卵筛选：挑选卵黄膜完整、血管网呈近似圆形、胚盘位于卵黄膜中央且心搏良好、卵黄囊膜直径接近上样硅胶环直径的鸡胚进入实验。

4.给药：冲洗完毕后，将鸡卵随机分成三组，每组10个。对照组在每只位于卵黄囊膜上的硅胶环内加入200微升含0.4-0.8％二甲基亚砜的磷酸缓冲液，给药组加入溶解于上述磷酸缓冲液，终浓度分别为每毫升含10微克和100微克的内皮抑素200微升，将加湿水盘从孵箱中移出，继续孵育12小时后小心撤走硅胶环观察实验结果。此后每隔4小时观察一次。

结论：内皮抑素对血管生成具有抑制作用。

实施例3

重组人血管内皮细胞生长因子

材料

鸡蛋来源：本地养鸡场；重组人血管内皮细胞生长因子(购自美国R&D SYSTEM)。

步骤：

1.鸡卵准备：用75％酒精消毒鸡蛋表面，晾干后将鸡卵气室向上，长轴与蛋托呈45°放入37.8℃、60％相对湿度的孵箱中。

2.鸡卵孵化：孵化过程中，每8小时转蛋一次，转蛋角度以水平位置前俯后仰各45度为宜。孵化至2.5天时，在超净台中用75％酒精消毒鸡卵外壳，在鸡卵中间部位轻轻磕出裂口，迅速掰开卵壳(以免卵壳划伤卵黄)，将鸡胚倾入无菌玻璃烧杯中。由于重力及卵系带的固定作用，鸡卵的胚盘可自动翻转到卵黄表面，烧杯加盖后放入37.8℃、60％相对湿度的孵箱中继续孵育12小时。

3.鸡卵筛选：挑选卵黄膜完整、血管网呈近似圆形、胚盘位于卵黄膜中央且心搏良好、卵黄囊膜直径接近上样硅胶环直径的鸡胚进入实验。

4.给药：冲洗完毕后，将鸡卵随机分成三组，每组10个。对照组在每只位于卵黄囊膜上的硅胶环内加入200微升含5-10％甘油的磷酸缓冲液，给药组加入溶解于上述磷酸缓冲液，终浓度为每毫升含10微克的血管内皮细胞生长因子200微升，将加湿水盘从孵箱中移出，继续孵育12小时后小心撤走硅胶环观察实验结果。此后每隔4小时观察一次。

结论：重组人血管内皮细胞生长因子具有血管生成刺激作用。

实施例4

材料

鸡蛋来源：本地养鸡场；重组人血管抑素K1-3；

步骤：

1.鸡卵准备：用75％酒精消毒鸡蛋表面，晾干后将鸡卵气室向上，长轴与蛋托呈45°放入37.8℃、60％相对湿度的孵箱中。

2.鸡卵孵化：孵化过程中，每8小时转蛋一次，转蛋角度以水平位置前俯后仰各45度为宜。孵化至2.5天时，在超净台中用75％酒精消毒鸡卵外壳，在鸡卵中间部位轻轻磕出裂口，迅速掰开卵壳(以免卵壳划伤卵黄)，将鸡胚倾入无菌玻璃烧杯中。由于重力及卵系带的固定作用，鸡卵的胚盘可自动翻转到卵黄表面，烧杯加盖后放入37.8℃、60％相对湿度的孵箱中继续孵育12小时。

3.鸡卵筛选：挑选卵黄膜完整、血管网呈近似圆形、胚盘位于卵黄膜中央且心搏良好、卵黄囊膜直径接近上样硅胶环直径的鸡胚进入实验。

4.给药：冲洗完毕后，将鸡卵随机分成三组，每组10个。对照组在每只位于卵黄囊膜上的硅胶环内加入200微升0.4-0.8％二甲基亚砜的磷酸缓冲液，给药组加入溶解于上述磷酸缓冲液，终浓度分别为每毫升含10微克和100微克的血管抑素200微升，将加湿水盘从孵箱中移出，继续孵育12小时后小心撤走硅胶环观察实验结果。此后每隔4小时观察一次。

结论：重组人血管抑素K1-3对血管生长具有抑制作用。

结果分析：

1.形态学观察

通过上述实施例1-4表明，以重组人血管抑素和内皮抑素以及血管内皮细胞生长因子作用于鸡胚YSM，选用血管生长影响药物的溶剂磷酸盐缓冲液作对照(图2)。作用12小时后给药组与对照组相比，两者血管生成状态差异显著。在摄影体视显微镜下可观察到对照组血管正常生长，血管粗壮，血流充盈，分支稠密，卵黄动脉及静脉呈规则生长对称分布；重组人血管抑素和内皮抑素组周围血管呈弥散不连续状，且卵黄囊血管和毛细血管生长缓慢，卵黄动脉及静脉常呈杂乱、不对称生长，毛细血管分支稀少。结果表明两种血管生长抑制剂组的血管生长受到一定程度的抑制(图3-图6)。血管内皮细胞生长因子组的卵黄囊膜血管密度分布及血管网面积都明显高于对照，结果表明血管内皮细胞生长因子对卵黄囊膜血管生长有明显的刺激作用(图7)。

2.图像统计分析

采用为本实验专门设计的图像分析软件针对重组人血管抑素对鸡胚血管生成抑制活性进行定量分析。本实验采用卵黄囊膜血管面积增长率，卵黄囊膜血管密度增长率及卵黄囊膜面积增长率作为血管生成定量指标(图8)。重组人血管抑素组的卵黄囊膜血管密度增长率显著小于对照组(P均＜0.05)；而重组人血管抑素组的卵黄囊膜血管面积增长率及卵黄囊膜面积增长率也都极显著小于对照组(P均＜0.01)。实验结果显示，鸡胚YSM的血管生成能被重组人血管抑素显著抑制(图9)。

Claims (2)

1、一种鸡胚卵黄囊膜血管生成试验模型的方法建立，包括以下步骤：

1)将鸡卵置于正常孵化温度下、有加湿水盘的孵箱中孵化50-70小时，再将鸡卵内容物倾倒入有盖的无菌小玻璃烧杯中，继续孵育8-16小时；

2)挑选卵黄膜完整、血管网及胚盘发育良好的鸡胚，鸡胚随机分成对照组和测试组，将硅胶环放置到鸡胚的卵黄囊血管网上；

3)对照组：胶圈中加入含有促渗透剂的PBS溶液150-220微升；测试组：胶圈中加入含待检测药物的上述对照溶液150-220微升，继续孵育8-16小时后撤走硅胶环，对给药前后卵黄囊血管面积或密度或卵黄囊膜面积变化进行测定，测试组中卵黄囊膜血管面积或密度或卵黄囊膜面积增长率明显大于对照组的确定为血管生成刺激药物，明显低于对照组的确定为血管生成抑制药物。

2、卵黄囊膜血管生成试验模型在检测和筛选影响血管生成药物中的应用。

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