KR20100138918A

KR20100138918A - 피부 미백 방법, 및, 피부 검버섯 형성 억제 및/또는 제거 인자의 스크리닝 방법

Info

Publication number: KR20100138918A
Application number: KR1020107020262A
Authority: KR
Inventors: 히로후미 아오키; 도모코 오노데라; 기요시 사토
Original assignee: 가부시키가이샤 시세이도
Priority date: 2008-03-11
Filing date: 2009-03-05
Publication date: 2010-12-31
Also published as: WO2009113446A1; JPWO2009113446A1; US20110008273A1; CN101969915B; JP5872158B2; HK1149480A1; EP2250993A4; EP2250993A1; CN101969915A

Abstract

본 발명은 피부의 멜라닌 함유 케라티노사이트의 증식 및/또는 분화를 선택적으로 활성화하는 공정을 포함하여 이루어지는 피부 미백 방법을 제공한다.

Description

피부 미백 방법, 및, 피부 검버섯 형성 억제 및/또는 제거 인자의 스크리닝 방법{SKIN WHITENING METHOD AND SCREENING METHOD FOR FACTORS FOR SKIN WRINKLE FORMATION SUPPRESSION AND/OR REMOVAL}

본 발명은 피부 미백 방법, 및 피부 검버섯 형성 억제 및/또는 제거 인자의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

검버섯은 가령(加齡)에 의해 발증하며, 노화한 인상을 부여하여 때로는 심각한 피부 고민이 되기 때문에, 그 대응 화장품은 큰 시장을 형성하고 있다. 일과성의 선탠과는 다르게, 지속적이며 국소적으로 계속 발생하는 이 검버섯의 생성 메커니즘을 해명하는 것이, 검버섯 대응 화장품을 개발하기 위해 필요하다고 생각된다. 검버섯에는 몇가지 임상적인 종별이 있지만, 본 발명에서는 그 중, 가령에 의해 많은 사람에게 발증하는 전형적인 검버섯인 일광성 색소반을 대상으로 하였다. 일광성 색소반은, 다소 뉘앙스의 차이가 있지만, 노인성 색소반(senile lentigo, lentigo senilis)이나 일광 흑자(solar lentigo)라고도 불리며, 지루성 부위(수족의 뒤쪽 이외의 모낭 지선계가 있는 부위)의 만성적인 자외선 폭로 부위에 후천적으로 나타나는 색소반을 가리킨다. 노인의 관자놀이 등에 자주 보이는, 크고 경계가 분명한 전형적인 검버섯이 이에 포함된다. 이하 이 일광성 색소반을 편의 상 검버섯이라고 표기한다.

지금까지 검버섯의 해결을 목표로 하여, 검버섯 부위의 해석을 바탕으로 한 검버섯의 발생 용이의 평가법 및 그것을 바탕으로 한 예방법, 검버섯에 관여하는 인자의 제어에 의한 검버섯의 해소법 등이 보고되어 왔다. 검버섯이 생기기 전에 검버섯이 생기기 쉬운 상태인지의 여부를 예지할 수 있는 수단을 제공하기 위해, 검버섯 표피 부위 및 정상 부위의 샘플을 채취하고, 각각에 대해서 NT-3, ADAM9 또는 HB-EGF를 검출하는 것을 지표로 하여 상기 평가를 목표로 한 보고가 있다(일본 특허 공개 제2004-205246호 공보 참조). 또한, c-KIT나 ET를 저해함으로써 검버섯 대책을 목표로 한 보고도 있다(일본 특허 공개 제2004-83551호 공보 참조).

그러나, 이들 소수의 유전자에만 착안하여 검버섯 형성에 관한 판단이나 대처를 행하는 경우, 완전한 해결이 행하여져 있는가 라고 하는 점에는 염려가 따라다닌다. 그래서, 광범위한 유전자의 변동을 검출하여, 이들을 진단의 지표로 하는 보고가 이루어졌다(일본 특허 공개 제2003-245097호 공보 참조). 단, 이 보고는 피부에의 일광 폭로(暴露)에 의한 변동 유전자를 검출한 것이기 때문에, 검버섯 자체에의 광범한 해석에 기초한 판단이나 대처 방법의 확립이 요구되고 있었다.

그래서 본 발명자들은, 16명의 지원자로부터 검버섯의 대표예인 일광성 색소반을 채취하고, 유전자 프로파일 해석을 이용하여 근방 부위와 비교하였다(일본 특허 공개 제2007-289063호 공보 참조). 그 결과로부터, 검버섯 부위에서는 멜라닌 합성 유전자의 활성화에 더하여, 염증 관련의 유전자의 활성화, 각화 관련의 유전자의 저하와 케라티노사이트의 증식의 저하가 일어나고 있는 것이 판명되었다.

검버섯 부위의 멜라닌량은 정상 부위와 비교하여 대폭으로 많다. 그러나, 그 멜라닌을 생산하는 멜라노사이트의 수는, 검버섯 부위에서도 정상 부위의 1배에서 2배 정도에 머무른다고 보고되어 있다(Cario-Andre M, Lepreux S, Pain C et al. Perilesional vs. lesional skin changes in senile lentigo. J Cutan Pathol., 31:441-7(2004), Noblesse E, Nizard C, Cario-Andre M et al. Skin ultrastructure in senile lentigo. Skin Pharmacol Physiol, 19:95-100(2006), Unver N, Freyschmidt-Paul P, Horster S et al. Alterations in the epidermal-dermal melanin axis and factor XIIIa melanophages in senile lentigo and ageing skin. Br J Dermatol., 155:119-28(2006) 참조). 또한, 검버섯 부위의 조직상을 관찰하면, 멜라노사이트는 오히려 투명하며, 그 주위의 기저층의 케라티노사이트가 대량으로 멜라닌을 함유하고 있는 것이 관찰된다(후술하는 도 1(b) 및 (c) 참조). 즉 검버섯 부위의 착색의 대부분은, 멜라노사이트로부터 멜라닌을 전달받아 저장한 검은 케라티노사이트가 원인으로 되어 있다. 턴오버에 의해 끊임없이 신생되고 있는 표피에 있어서, 왜 이 검은 케라티노사이트가 검버섯 부위에 계속 존재하는가 라고 하는 점은, 큰 의문이었다.

멜라닌을 저장한 케라티노사이트가 계속 체류하는 원인으로서, 검버섯 부위에서는 표피의 턴오버가 저하하고 있는 것이 아닌가 라고 하는 생각이 떠오른다. 사실, 지금까지 검버섯 부위에서의 케라티노사이트의 분열 저하의 소견을 지적한 보고가 있었지만(일본 특허 공개 제2004-205246호 공보, 일본 특허 공개 제2007-289063호 공보, Noblesse E, Nizard C, Cario-Andre M et al. Skin ultrastructure in senile lentigo. Skin Pharmacol Physiol, 19:95-100(2006), Unver N, Freyschmidt-Paul P, Horster S et al. Alterations in the epidermal-dermal melanin axis and factor XIIIa melanophages in senile lentigo and ageing skin. Br J Dermatol., 155:119-28(2006) 참조), 멜라닌과의 관련 등의 세부 사항에 대해서는 불분명하였다.

또한, 지금까지 검버섯을 제거하는 방법으로서, 턴오버를 높이는 방법이 있었다(일본 특허 공개 평성 제6-72842호 공보, 일본 특허 공개 평성 제6-145038호 공보, 일본 특허 공개 제2006-45084호 공보, 일본 특허 공개 제2004-51544호 공보, 일본 특허 공개 제2001-302454호 공보 참조). 그러나, 단순한 턴오버의 항진만으로는, 피부 거칠음이나, 심한 경우에는 염증성 색소 침착 등의 부작용을 야기할 염려가 있으며, 검버섯을 제거하게 되는 것과 같은 효과적인 적용 방법은 발견되어 있지 않았다.

또한, 케미컬 필링, 레티노인산 치료, 레이저 치료 등에 의한 검버섯 제거 미용 의료 시술이 있지만(일본 특허 공개 제2003-277251호 공보 참조), 이들은 멜라닌 함유 세포를 증식 촉진이나 광흡수에 의한 발열로 파괴하여 제거하는 의료 행위이며, 일정 효과는 요구할 수 있지만, 아픔, 발적, 부기 등의 심한 부작용이 있고, 또한 염증 후 색소 침착 등에 의해 재발이 높은 빈도로 발생하는 것이나, 통원이나 요금 등에 따른 과제도 있었다.

상기 과제를 감안하여, 본 발명은 부작용을 억제하면서 효율적으로 피부 검버섯 형성의 예방 및/또는 피부 검버섯의 개선을 행하는 것이 가능한 피부 미백 방법을 제공하며, 부작용이 적은 피부 검버섯 형성 억제 및/또는 제거 인자를 높은 정밀도로 선정하는 것이 가능한 스크리닝 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자들은 이러한 종래의 피부 미백 방법에 따른 과제나, 색소 침착 현상의 의문에 답하기 위해, 16명의 지원자로부터 채취한 일광성 색소반의 유전자 프로파일 해석이나 면역 항체 염색에 의한 해석을 통해, 검버섯 부위가 근방의 정상부 부위와 비교하여 무엇이 다른지를 철저하게 추궁하였다. 그 결과, 검버섯 부위의 기저층 케라티노사이트는 일률적으로 증식 및/또는 분화(본 명세서에서는 이것을 적절하게 「증식·분화」라고 약칭함)가 저하하고 있는 것은 아니며, 멜라닌을 저장한 케라티노사이트에만 증식·분화의 현저한 저하가 보인다고 하는 실태를 발견하였다.

또한, 배양 케라티노사이트에서 멜라닌을 탐식시킴으로써, 검버섯의 기저층의 상태를 제작하여 그 증식·분화성을 조사한 바, 마찬가지로 증식·분화가 저하하고 있으며, 사이클린 등의 감소가 보여지는 것을 발견하였다. 이들 결과로부터, 검버섯 부위에서는 멜라닌을 저장한 기저층 케라티노사이트의 증식·분화가 저하하여 버려, 정상적인 턴오버로 배출되지 않고, 기저층 일면에 머물러 버리는 것이, 검버섯 부위의 색소 침착의 만성화를 야기하는 원인이라고 생각되었다.

검버섯을 제거하기 위해, 단순한 표피 턴오버의 항진을 행한 경우는, 피부의 두께를 유지하고 있는 정상적인 케라티노사이트의 지나친 증식·분화의 경향을 더욱 늘려 버려, 피부 거칠음이나, 심한 경우에는 염증성 색소 침착 등의 부작용을 야기할 염려가 있다. 이에 대하여, 검버섯 부위의 색소 침착 및 그 만성화의 원인인, 증식·분화가 정체된 검은 케라티노사이트의 턴오버만을 특이적으로 항진시켜 정상화하고, 저장된 멜라닌을 배출하면, 부작용을 억제하면서 검버섯을 효과적으로 제거할 수 있다고 생각된다.

이상의 지견에 기초하여, 본 발명자들은 본 발명을 완성시켰다.

제1 관점으로서, 본 발명은 피부의 멜라닌 함유 케라티노사이트의 증식 및/또는 분화를 선택적으로 활성화하는 공정을 포함하여 이루어지는 피부 미백 방법을 제공한다.

적합한 양태에 따르면, 상기 선택적 활성화 공정은, 피부 검버섯 형성 억제 및/또는 제거 인자를 포함하여 이루어지는 약제를 대상으로 투여하여 행한다.

더욱 적합한 양태에 따르면, 상기 피부 검버섯 형성 억제 및/또는 제거 인자는, 쑥 엑기스, 사철쑥 엑기스, 및 복숭아 잎 엑기스에서 선택된다.

제2 관점으로서, 본 발명은 피부 검버섯 형성 억제 및/또는 제거 인자를 스크리닝하는 방법으로서, 배양 케라티노사이트에 미립자를 함유시켜, 증식 및/또는 분화가 저하한 상태의 케라티노사이트 집단을 제작하는 공정과, 상기 집단의 증식 및/또는 분화의 선택적인 활성화 능력을 지표로 하여 후보 화합물을 평가하고, 상기 활성화 능력을 갖는 화합물을 피부 검버섯 형성 억제 및/또는 제거 인자로서 선정하는 공정을 포함하여 이루어지는 방법을 제공한다.

적합한 양태에 따르면, 상기 미립자는, 천연 혹은 합성의 멜라닌, 멜라노솜, 또는, 성질이 균질한 마이크로 비드이다.

적합한 양태에 따르면, 상기 증식의 활성화 능력의 측정은, 세포수 카운트법, 알라마 블루 분석, MTT(3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨브로마이드) 분석, 훽스트 분석, BrdU(5-브로모-2'-데옥시우리딘) 취득량 측정법, 및, 세포 증식, 세포 분열 혹은 세포 주기에 관한 항체를 이용한 면역 조직학적 측정법에서 선택되는 방법으로 행해진다.

적합한 양태에 따르면, 상기 분화의 활성화 능력의 측정은, 세포 형태 관찰법, 및 세포 분화에 관한 항체를 이용한 면역 조직학적 측정법에서 선택되는 방법으로 행해진다.

적합한 양태에 따르면, 이 방법은, 상기 활성화 능력을 갖는 화합물을, 멜라닌 함유 케라티노사이트를 구성 요소로 하는 피부 모델에 적용하여, 피부 검버섯 형성 억제 및/또는 제거 효과를 갖는 화합물을 선정하는 공정을 더 포함하여 이루어진다.

적합한 양태에 따르면, 이 방법은, 상기 증식 및/또는 분화가 저하한 상태의 케라티노사이트 집단을 이용하여 3차원 피부 모델을 구축하는 공정을 더 포함하여 이루어지며, 상기 3차원 피부 모델을 이용하여 상기 후보 화합물의 평가를 행함으로써, 피부 검버섯 형성 억제 및/또는 제거 효과를 갖는 화합물을 선정한다.

본 발명의 피부 미백 방법에 따르면, 부작용을 억제하면서 효율적으로, 피부에서의 검버섯의 형성을 예방하고, 및/또는 기존의 검버섯을 개선하는 것이 가능하게 된다.

또한, 본 발명의 피부 검버섯 형성 억제 및/또는 제거 인자의 스크리닝 방법에 따르면, 부작용이 적은 피부 검버섯 형성 억제 및/또는 제거 인자를, 높은 정밀도로 선정할 수 있다.

[도 1] 도 1(a)∼도 1(c)는 모두, 피부 조직의 현미경 사진이다. 도 1(a)는 정상 부위의 피부 조직의 HE 염색상의 예이며, 도 1(b)는 일광성 색소반 부위의 피부 조직의 HE 염색상의 예이고, 도 1(c)는 일광성 색소반 부위의 피부 조직의 투과광상과 멜라노사이트 마커(TRP-1)에 의한 면역 조직 염색상의 중합 화상의 예이다.
[도 2] 도 2(a)∼도 2(c)는 모두, 피부의 검버섯 부위의 조직의 분열 세포의 염색 화상이다. 도 2(a)는 분열 세포핵을 Ki67 염색(녹색)한 검버섯 부위 조직의 면역 조직 염색상의 예이다. 도 2(b)는 세포핵을 DAPI 염색(청색)으로, 분열 세포의 핵을 Ki67 염색(녹색)으로, 멜라닌을 의사(擬似) 컬러 염색(적색)으로 염색한, 검버섯 부위 조직의 3중 염색상의 예이다. 도 2(c) 및 도 2(d)는 각각, 도 2(b)에서의 멜라닌을 포함하지 않는 기저층 케라티노사이트의 예, 및 멜라닌을 포함하는 기저층 케라티노사이트의 예를, 부분적으로 확대하여 나타내는 도면이다.
[도 3] 도 3(a)∼도 3(c)는 모두, 멜라닌 함유 케라티노사이트의 증식 저하를 설명하기 위한 도면이다. 도 3(a)는 멜라닌원 첨가 3일 후의 케라티노사이트의 위상차 현미경상의 예이다. 도 3(b)는 도 3(a)와 동시야의 투과광 현미경상이며, 멜라닌은 흑색으로 나타내고 있다. 도 3(c)는 멜라닌원의 첨가 후 0, 2, 4 및 7일째에서의 각 멜라닌 농도에서의 증식 지표(알라마블루 측정값)를 나타내는 그래프이다.
[도 4] 도 4(a), 도 4(b)는 모두, 멜라닌 함유 케라티노사이트에의 쑥 엑기스 첨가의 영향을 나타내는 도면이다. 구체적으로, 도 4(a)는 멜라닌을 함유하지 않는 케라티노사이트에, 쑥 엑기스를 첨가하였을 때의 증식 지표(알라마 블루 분석)의 값을 나타내는 그래프이며, 도 4(b)는 멜라닌 함유 케라티노사이트에 쑥 엑기스를 첨가하였을 때의 증식 지표의 값을 나타내는 그래프이다.
[도 5] 사철쑥 엑기스 및 복숭아 잎 엑기스가 미립자(마이크로 비드) 함유 케라티노사이트에 부여하는 영향을 나타내는 증식 지표(알라마 블루 분석)의 그래프이다. 도면 중, a는 마이크로 비드를 포함하지 않는 케라티노사이트의 결과를 나타내며, b∼d는 마이크로 비드 함유 케라티노사이트에 대하여, 약제 무첨가의 경우(b), 사철쑥 엑기스 0.2％ 첨가의 경우(c), 복숭아 잎 엑기스 0.2％ 첨가의 경우(d)의 결과를 나타낸다.

이하, 구체적인 실시형태를 들어, 본 발명을 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들 실시의 양태에 한정되는 것이 아니며, 그 요지를 일탈하지 않는 한에서, 임의의 변경을 부가하여 실시하는 것이 가능하다.

1. 피부 미백 방법:

본 발명의 피부 미백 방법은, 피부에서의 멜라닌을 함유하는 케라티노사이트(적절하게 「멜라닌 함유 케라티노사이트」라고 약칭함)의 증식·분화를 선택적으로 활성화하는 공정을 포함하여 이루어진다. 또한, 본 명세서에서 「피부 미백 방법」이란, 피부에서의 검버섯의 형성을 예방하고, 및/또는 기존의 검버섯을 개선함으로써, 피부의 지나친 색소 침착을 예방, 및/또는 제거하는 방법을 가리키는 것으로 한다.

본 발명자들의 지견에 따르면, 전술한 바와 같이, 피부의 기저층 케라티노사이트 중, 멜라닌 함유 케라티노사이트의 증식·분화가 특이적으로 저하하여 버려, 정상적인 턴오버로 배출되지 않고, 기저층 일면에 머물러 버리는 것이, 검버섯 부위의 색소 침착의 만성화를 야기하는 원인이라고 추측된다. 단, 단순히 검버섯 부위의 여러가지 세포의 턴오버를 비선택적으로 항진하여 버리면, 멜라노사이트의 과잉 증식·분화를 촉진하여 버려, 검버섯을 억제할 수 없을 뿐만 아니라, 오히려 검버섯의 확대 등을 초래하여 버릴 염려도 있다. 또한, 기저층 케라티노사이트의 턴오버를 일률적으로 항진한 경우에도, 피부의 두께를 유지하고 있는 정상적인 케라티노사이트의 과잉 증식·분화를 촉진하여 버려, 피부 거칠음이나 염증성 색소 침착 등의 부작용을 야기할 염려가 있다.

이에 대하여, 본 발명의 미백 방법에서는, 멜라노사이트나 정상적인 케라티노사이트 등의 턴오버를 항진하는 일 없이, 검버섯 부위의 색소 침착 및 그 만성화의 원인인, 증식·분화가 정체된 멜라닌 함유 케라티노사이트의 증식·분화만을 선택적으로 활성화하며, 멜라닌 함유 케라티노사이트의 턴오버만을 특이적으로 항진시켜 정상화한다. 이에 따라 검버섯 부위에 축적된 멜라닌을 배출하며, 부작용을 억제하면서 피부에서의 검버섯의 형성을 예방하고, 및/또는 기존의 검버섯을 개선하는 것이 가능하게 된다.

피부의 기저층에서의 멜라닌 함유 케라티노사이트의 증식·분화를 선택적으로 활성화하기 위한 구체적인 방법은 특별히 제한되지 않지만, 예로서는, 멜라닌 함유 케라티노사이트의 증식·분화를 선택적으로 활성화하는 능력을 갖는 화합물(후술하는 피부 검버섯 형성 억제 및/또는 제거 인자)을 포함하여 이루어지는 약제를, 대상에 투여한다고 하는 방법을 들 수 있다. 이러한 피부 검버섯 형성 억제 및/또는 제거 인자는, 본 발명의 스크리닝 방법에 따라, 효율적으로 선정하는 것이 가능하다. 피부 검버섯 형성 억제 및/또는 제거 인자의 구체예, 및 본 발명의 스크리닝 방법의 세부 사항에 대해서는, 다음 난(欄) 「2. 피부 검버섯 형성 억제 및/또는 제거 인자의 스크리닝 방법」에서 설명한다. 또한, 피부 검버섯 형성 억제 및/또는 제거 인자를 함유하는 약제(후술하는 미백 조성물) 및 그 투여법에 대해서는, 다다음 난 「3. 미백용 조성물」에서 설명한다.

2. 피부 검버섯 형성 억제 및/또는 제거 인자의 스크리닝 방법:

본 발명의 피부 검버섯 형성 억제 및/또는 제거 인자의 스크리닝 방법(적절하게 「본 발명의 스크리닝 방법」이라고 약칭함)은, 배양 케라티노사이트에 미립자를 함유시켜, 증식·분화가 저하한 상태의 케라티노사이트 집단을 제작하는 공정과, 상기 집단의 증식·분화의 선택적인 활성화 능력을 지표로 하여 후보 화합물을 평가하고, 상기 활성화 능력을 갖는 화합물을 피부 검버섯 형성 억제 및/또는 제거 인자로서 선정하는 공정을 포함하여 이루어진다.

또한, 본 명세서에서는, 피부에서의 검버섯의 형성을 억제하는 작용, 및/또는 피부에서의 기존의 검버섯을 제거하는 작용을 갖는 인자를, 「피부 검버섯 형성 억제 및/또는 제거 인자」 등으로 약칭하는 것으로 한다.

미립자는 통상, 천연 혹은 합성의 멜라닌, 멜라노솜, 또는 성질이 균질한 마이크로 비드에서 선택된다.

멜라닌 또는 멜라노솜으로서는, 인간, 마우스, 오징어 등의 배양 멜라노사이트로부터 추출·정제한 멜라닌 또는 멜라노솜 등을 들 수 있다. 시판의 멜라닌의 예로서는, 예컨대 Sigma사 제조 Sepia melanin(오징어 유래)을 들 수 있다.

또한, 「성질이 균질한 마이크로 비드」란, 질량, 입자 직경, 경도 등의 물리적 성질, 및 표면 반응성, 응집성 등의 화학적 성질이 균질한 합성 비드를 말한다. 성질이 균질한 마이크로 비드의 재료는 특별히 제한되지 않지만, 예로서는, 폴리스티렌, 폴리에틸렌 등의 수지에서 선택되는 일종 또는 이종 이상의 재료를 들 수 있다.

마이크로 비드의 형상이나 사이즈도 특별히 제한되지 않지만, 일반적으로는 그 평균 직경이 통상 0.1 ㎛ 이상, 바람직하게는 1 ㎛ 이상, 또한 통상 10 ㎛ 이하, 바람직하게는 3 ㎛ 이하의 구형 또는 대략 구형이다. 시판의 성질이 균질한 마이크로 비드의 예로서는, 예컨대 Polyscience사의 Polybead 등을 들 수 있다.

미립자의 형태는 특별히 제한되지 않지만, 통상은 세포의 크기에 대하여 충분히 작은(예컨대 직경이 통상 2 ㎛ 이하의) 입자로 한다.

또한, 미립자의 사용 비율도 특별히 제한되지 않지만, 통상은, 세포에 분명한 증식·분화의 저하가 보여지며, 현저한 세포 독성(예컨대, 세포가 박리되어 버리는, 호흡 활성이 보여지지 않게 되는 등)이 발생하지 않는 것과 같은 범위로 한다. 구체적으로는, 미립자로서 멜라닌을 사용하는 경우, 세포 배양액에 대한 멜라닌의 비율은, 통상 0.0001 질량％ 이상, 그 중에서도 0.001 질량％ 이상, 또한 통상 0.1 질량％ 이하, 그 중에서도 0.04 질량％ 이하로 하는 것이 바람직하다.

증식의 활성화 능력을 측정하는 방법으로서는, 세포수 카운트법, 알라마 블루 분석, MTT 분석, 훽스트 분석, BrdU 취득량 측정법, 및 세포 증식, 세포 분열 혹은 세포 주기에 관한 항체(예컨대, BrdU, Ki67, PCNA 등)를 이용한 면역 조직학적 측정법 등을 들 수 있다. 이들 측정법의 조건 및 절차는, 당업자에게는 주지이다.

분화의 활성화 능력을 측정하는 방법으로서는, 세포 형태 관찰법, 및 세포 분화에 관한 항체(예컨대, Keratin 1, Keratin 10, 필라그린, 인보루크린, 롤리크린, 트랜스글루타미네이즈 등)를 이용한 면역 조직학적 측정법 등을 들 수 있다. 이들 측정법의 조건 및 절차도, 당업자에게는 주지이다.

또한, 본 발명의 스크리닝 방법은, 상기 활성화 능력을 갖는 화합물을 피부 모델에 적용하여, 피부 검버섯 형성 억제 및/또는 제거 효과를 갖는 화합물을 선정하는 공정을 더 포함하여 이루어지는 것이 바람직하다. 피부 모델로서는, 멜라닌 함유 케라티노사이트를 구성 요소로 하는 피부 세포의 단층 배양물, 공배양물, 혹은 3차원 배양물, 검버섯 모델 마우스(일본 특허 공개 제2005-106745호 공보 참조) 등을 들 수 있지만, 그 중에서도 피부 세포의 단층 배양물이 바람직하다. 또한, 이들 피부 모델의 구축 방법이나 이용 방법도, 당업자에게는 주지이다.

특히, 본 발명의 스크리닝 방법은, 상기 증식·분화가 저하한 상태의 케라티노사이트 집단을 이용하여 3차원 피부 모델을 구축하는 공정을 더 포함하여 이루어지며, 상기 3차원 피부 모델을 이용하여 상기 후보 화합물의 평가를 행함으로써, 피부 검버섯 형성 억제 및/또는 제거 효과를 갖는 화합물을 선정하는 것이 바람직하다. 3차원 피부 모델로서는, 전술한 피부 모델 중, 3차원 배양물, 검버섯 모델 마우스 등을 들 수 있지만, 그 중에서도 3차원 배양물이 바람직하다.

본 발명의 스크리닝 방법은, 구체적으로는, 예컨대 하기의 절차로 실시할 수 있다.

(1) 인간 정상 케라티노사이트를, 적절한 배양액(예컨대, Defined Keratinocyte-SFM 배양액(Invitrogen사 제조 Gibco) 등)을 이용하여, 적절한 배양 조건(예컨대, 5％의 CO₂ 가스를 함유하는 공기 분위기 하, 온도 37℃, 습도 95％의 인큐베이터 내에서 수일간)에서 배양한다.

(2) 미립자를, 적절한 버퍼(예컨대 PBS 버퍼 등)에 멸균 하에서 확산시켜, 적당한 농도의 현탁액을 제작한다.

(3) (1)의 세포 배양액을, (2)의 현탁액을 적절한 농도로 포함하는 배양액(예컨대, 배양액에 대한 멜라닌 최종 농도 0.001∼0.04％ W/V)과 교환하고, 인큐베이션(예컨대 상기 배양 조건에서 2∼3일)을 행하여 케라티노사이트에 멜라닌을 탐식시킨다. 그 때에 대조군으로서, 미립자를 첨가하지 않는 세포도 준비해 둔다.

(4) (3)의 조작에 의해 증식·분화 저하 상태로 만든 케라티노사이트의 단층 배양물을, 필요에 따라 피부 모델의 구축에 제공한 후, 이 단층 배양물 또는 피부 모델의 배양액을, 피검 성분(후보 화합물)을 포함하는 배양액과 교환하고, 더욱 배양을 계속한다(예컨대 단층 배양의 경우, 상기 배양 조건에서 2∼3일). 그 때에 대조군으로서, 피검 성분을 첨가하지 않는 세포를 준비해 두어도 좋다.

(5) (4)의 조작 후에 있어서의 세포의 증식률을 측정한다.

(6) (5)의 측정에 의해, 미립자를 탐식시켜 증식·분화가 저하한 케라티노사이트의 증식을 촉진시키는 성분(화합물)을 선출한다. 더욱, 미립자를 첨가하지 않는 정상 케라티노사이트의 증식률에 대한 상기 성분의 효과도 고려하여, 정상 세포에 대한 증식 촉진 효과가 낮은, 혹은 없는 성분을 선출한다.

(7) (4)의 조작 후에 있어서의 세포의 분화 지표를 측정한다.

(8) (7)의 측정에 의해, 미립자를 탐식시켜 증식·분화가 저하한 케라티노사이트의 분화를 촉진시키는 성분을 선출한다. 이때, 미립자를 첨가하지 않는 정상 케라티노사이트의 분화 지표 항진률에 대한 상기 성분의 효과도 고려하여, 정상 세포에 대한 분화 촉진 효과가 낮은, 혹은 없는 성분을 선출한다.

케라티노사이트의 증식 또는 분화의 촉진의 판단 기준으로서는, 통상은, 피검 성분을 첨가하지 않는 경우를 기준으로 하며, 피검 성분의 첨가에 의해 증식률 또는 분화율이 통계 처리 상 유의하게 상승한 경우에, 상기 성분에 의해 증식 또는 분화가 촉진된 것으로 판단한다. 단, 피검 성분의 첨가는, 현저한 세포 독성이 일어나지 않는 농도 범위에서 행하는 것으로 한다.

이상 설명한 본 발명의 스크리닝 방법에 따르면, 증식·분화가 저하한 상태의 케라티노사이트 집단의 증식·분화의 선택적인 활성화 능력을 지표로 하여 후보 화합물을 평가함으로써, 부작용이 적은 피부 검버섯 형성 억제 및/또는 제거 인자를, 높은 정밀도로 선정할 수 있다. 또한, 복수의 피부 모델을 사용한 평가를 조합함으로써, 부작용이 적은 피부 검버섯 형성 억제 및/또는 제거 효과를 갖는 화합물을, 높은 정밀도로 선정하는 것이 가능하게 된다.

본 발명의 스크리닝 방법에 따라, 피부 검버섯 형성 억제 및/또는 제거 인자로서 선정된 성분(화합물)을 이용하면, 멜라닌을 저장하여 증식·분화가 저하한, 검버섯 부위의 색소 침착의 만성화 요인인 검은 케라티노사이트의 증식·분화를 특이적으로 정상적으로 되돌리고, 저장된 멜라닌을 해방함으로써, 부작용이 적은 검버섯을 효과적으로 예방, 개선할 수 있는 것으로 생각된다. 또한, 티로시나아제 조해제 등으로는 어려웠던, 기존의 검버섯(즉, 검은 케라티노사이트)의 제거가 가능해지는 것으로 생각된다. 따라서, 본 발명의 스크리닝 방법에 따라 선정된 피부 검버섯 형성 억제 및/또는 제거 인자는, 미백 유효 성분으로서의 용도가 기대된다.

본 발명자들은, 전술한 본 발명의 스크리닝 방법에 따라, 피부 검버섯 형성 억제 및/또는 제거 인자의 선정을 행한 결과, 쑥 엑기스, 사철쑥 엑기스, 및 복숭아 잎 엑기스가, 멜라닌 함유 케라티노사이트의 증식·분화를 촉진하는 효과를 갖는 것을 발견하였다.

쑥(학명 Artemisia princeps) 및 사철쑥(학명 Artemisia capillaris)은, 모두 국화과 쑥속의 다년초이다.

「복숭아 잎」이란, 장미과 복숭아속의 낙엽 소고목인 복숭아(복숭아, 학명 Amygdalus persica)의 잎을 말한다.

쑥, 사철쑥 및 복숭아 잎의 「엑기스」는, 통상법에 따라 얻을 수 있고, 예컨대 이들 식물을 추출 용매와 함께 침지 또는 가열 환류한 후, 여과하고, 농축하여 얻을 수 있다. 추출 용매로서는, 추출에 통상 이용되는 용매이면, 임의의 것을 이용할 수 있다. 예로서는, 물, 메탄올, 에탄올, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 글리세린 등의 알코올류, 함수 알코올류, 클로로포름, 디클로로에탄, 4염화탄소, 아세톤, 초산에틸, 헥산 등의 유기 용매 등을, 각각 단독으로, 혹은 이종 이상을 조합하여 이용할 수 있다. 상기 용매로 추출하여 얻어진 엑기스를 그대로, 혹은 농축한 엑기스를 흡착법, 예컨대 이온 교환 수지를 이용하여 불순물을 제거한 것이나, 다공성 폴리머(예컨대 앰버라이트 XAD-2)의 컬럼으로 흡착시킨 후, 메탄올 또는 에탄올로 용출하여, 농축한 것도 사용할 수 있다. 또한, 분배법, 예컨대 물/초산에틸로 추출한 엑기스 등도 이용된다.

3. 미백용 조성물:

본 발명의 스크리닝 방법에 따라 선정된 피부 검버섯 형성 억제 및/또는 제거 인자(예컨대, 전술한 쑥 엑기스, 사철쑥 엑기스, 및 복숭아 잎 엑기스 등)는, 통상은 미백용 조성물(또는 미백용 피부 외용제)의 미백 유효 성분으로서, 전술한 본 발명의 피부 미백 방법에 이용할 수 있다. 또한, 본 발명의 스크리닝 방법에 따라 선정된 피부 검버섯 형성 억제 및/또는 제거 인자를 미백 유효 성분으로서 함유하는 미백용 조성물을, 본 명세서에서는 적절하게 「본 발명의 미백용 조성물」이라고 한다.

본 발명의 미백용 조성물에 대한 피부 검버섯 형성 억제 인자 및/또는 피부 검버섯 제거 인자의 비율은, 그 형태나 제형에 따라서도 다르며, 한정되는 것이 아니지만, 통상 0.001 질량％ 이상, 그 중에서도 0.01 질량％ 이상, 더욱 0.1 질량％ 이상, 또한 통상 10 질량％ 이하, 그 중에서도 5 질량％ 이하, 더욱 1 질량％ 이하의 범위로 하는 것이 바람직하다.

본 발명의 미백용 조성물에는, 원하는 제형에 따라, 종래 공지의 부형제나 향료 등을 비롯하여, 유지류, 계면 활성제, 방부제, 금속 이온 봉쇄제, 수용성 고분자, 증점제, 안료 등의 분말 성분, 자외선 방어제, 보습제, 산화 방지제, pH 조정제, 세정제, 건조제, 유화제 등을 적절하게 배합하여도 좋다. 또한, 소기의 효과를 손상시키지 않는 범위 내이면, 이 외에의 약효 성분을 본 발명의 미백용 조성물에 배합하는 것도 가능하다.

본 발명의 미백용 조성물은, 예컨대 수용액, 오일액, 그 외의 용액, 유액, 크림, 겔, 현탁액, 마이크로 캡슐, 분말, 과립, 캡슐, 고형제 등의 형태로 적용된다. 종래 공지의 방법에 따라 이들 형태로 조제한 뒤에, 로션제제, 유액제, 크림제, 연고제, 경고제, 찜질제, 에어졸제, 물-오일 2층계, 물-오일-분말 3층계, 주사제, 내복제(예컨대 정제, 산제, 과립제, 환제, 시럽제, 트로키제 등), 좌제 등으로서, 신체에 도포, 첩부, 분무, 주사, 음용, 삽입 등을 함으로써, 인간이나 동물 등의 대상에게 투여할 수 있다.

이들 제형 중에서도, 본 발명의 미백용 조성물은, 로션제제, 유액제, 크림제, 연고제, 경고제, 찜질제, 에어졸제 등의 피부 외용제로 하는 것이, 본 발명의 목적에 적합하다. 본 발명의 미백용 조성물 중, 특히 피부 외용제의 제형으로 한 것을, 본 명세서에서는 적절하게 「본 발명의 미백용 피부 외용제」라고 한다.

또한, 여기서 기재하는 피부 외용제에는, 의약품, 의약 부외품(연고제 등), 화장료[세안료, 유액, 크림, 젤, 에센스(미용액), 팩·마스크 등의 기초 화장품; 파운데이션, 립스틱 등의 메이크업 화장품; 구강 화장품, 방향 화장품, 모발 화장품, 바디 화장품 등]가 포함된다. 특히 본 발명의 미백용 조성물은, 피부 검버섯 형성을 예방하고, 및/또는 피부 검버섯을 개선하는 화장료로서의 적용이 적합하다.

본 발명의 미백용 조성물(특히 본 발명의 미백용 피부 외용제)을 이용하여, 그 제형에 따른 적절한 방법으로 대상에 투여함으로써, 부작용을 억제하면서 효율적으로 피부 검버섯 형성을 예방하고, 및/또는 피부 검버섯을 개선하는 것이 가능하다.

실시예

이하, 실시예를 이용하여 본 발명을 더 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 한정되는 것이 아니다.

[실시예 1]

인간 검버섯 조직의 해석 결과

일광성 색소반 부위 조직 샘플

조직 샘플은, 사전 동의를 행한 40대 이상의 남성 지원자 16명의 등에 있는 검버섯 중, 일광성 색소반을 피부과의의 감별에 의해 선정하고, 그 일광성 색소반 부위의 표피 및 진피 상층의 조직을 국소 마취 하 3 ㎜ 바이옵시에 의해 채취하였다. 채취에 있어서는 시세이도 윤리 위원회에 의한 가이드포스트에 따랐다. 비교 부위로서, 일광성 색소반 부위의 외에, 동일인의 배부 근방의 정상 부위, 및 둔부(비노광 부위)의 정상 부위로부터도, 표피 및 진피 상층의 조직을 마찬가지로 채취하였다.

피부 조직 절편 의 염색

비교 부위에 대한 검버섯 부위의 변동 단백질의 피부 조직 내에서의 분포나 발현을 관찰하기 위해, 채취 조직을 동결 블록으로 하여 박절(薄切) 절편을 제작하고, 이하에 나타내는 HE 염색이나 면역 조직 염색 등의 각종 세포 염색을 행하였다. 변동을 막기 위해, 동일인의 3부분의 부위(일광성 색소반 부위, 정상 부위, 비노광 부위)의 조직을 1조로 하여 하나의 블록에 포매(包埋)하고, 1슬라이드 위에 절편을 올려 동시에 염색 조작을 행하였다.

또한, 면역 조직 염색에는 티라마이드 증감법(TSA-plus Fluorescein System:Perkin Elmer Life and Analytical Sciences, Boston, MA, U.S.A 참조)을 병용하고, 항TRP-1 항체(Mel-5:Signet Laboratories Inc., Dedham, MA, U.S.A. 참조) 및 Ki-67 항체(BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA, U.S.A. 참조)를 이용하였다. 양성 세포수로서는, 표피의 길이 1 ㎜당에의 양성 세포의 개수를 세었다.

해석 결과

우선, 각 부위에 대해서 HE(헤마톡실린·에오신) 염색을 행하였다. 도 1(a)는, 정상 부위의 피부 조직의 HE 염색상의 예이며, 도 1(b)는 일광성 색소반 부위의 피부 조직의 HE 염색상의 예이다. 도 1(a) 및 (b) 모두, 배율이 다른 2개의 화상을 상하로 겹쳐 나타내고 있으며, 각 화상 중 흑선분의 길이가 50 ㎛에 상당한다.

계속해서, 검버섯 부위에서의 멜라노사이트 관련 유전자의 항진을 확인하기 위해, 멜라노사이트 마커인 TRP-1 단백질의 조직 중에서의 발현 양식을, 항TRP-1 항체를 이용한 면역 조직 염색법으로 조사하였다. TRP-1 양성의 형광 시그널을 발하는 세포는 기저막의 멜라노사이트에서 검출되고, 9예 중 9예로, 일광성 색소반 부위에서의 각 층의 단위 길이당의 형광 시그널을 발하는 세포의 수가, 근방 정상 부위에 비해 2배 정도 많은 것을 확인할 수 있었다. 이는, 상기 「배경기술」의 란에 기재된 기보고의 결과군과 일치하고 있다.

도 1(c)는 이렇게 해서 얻어진 일광성 색소반 부위의 피부 조직의 멜라노사이트 마커(TRP-1)에 의한 면역 조직 염색상과, 동일한 부위의 피부 조직의 투과광상을 중합시킨 화상의 예이다. 도 1(c) 중, 흑선분의 길이가 50 ㎛에 상당한다. 화살표는 TRP-1 양성 멜라노사이트(녹색)를 나타내고, *는 멜라닌을 함유하는 기저층 케라티노사이트(흑색)를 나타낸다. 도 1(c)에서, 멜라노사이트는 오히려 투명하고, 기저층 케라티노사이트가 흑색을 나타내며, 멜라닌을 함유하고 있는 것을 알 수 있다.

다음에, 세포 분열 마커인 Ki67 항체를 이용하여, 증식 중인 세포를 검출하여 마찬가지로 비교하였다. 그 결과, 상기와는 반대로, 일광성 색소반 부위의 양성 세포수는 근방 정상 부위에 비해 0.58배(n=10, p=0.021)이며, 감소 경향에 있는 것이 관찰되었다. 또한, 이들 양성 세포의 대부분이 케라티노사이트이다. 도 2(a)는 검버섯 부위 조직의 면역 조직 염색(Ki67 염색)상의 예이며, 분열 세포핵이 녹색으로 염색되어 있다. 도 2(a) 중, 백선분의 길이가 100 ㎛에 상당한다.

검버섯 부위에서 양성 세포가 적은 이유로서, 멜라닌에 의한 형광 시그널의 차광 효과가 생각되었기 때문에, 이 Ki67 양성 세포상을 자세하게 관찰하였다. 그 결과, Ki67의 시그널은 세포핵에서 검출되지만, 멜라닌은 세포핵의 주위의 세포질에 분포하고 있기 때문에, 형광 시그널의 차광은 우려할 만큼 발생하고 있지 않은 것을 알 수 있었다. 오히려, 양성 세포 내의 핵의 주위에 분포되여야 하는 멜라닌을 잘 관찰하면, 처음부터 Ki67 양성 세포, 즉 분열 세포의 대부분은, 도 2(a)에 나타내는 바와 같이, 세포 내(녹색으로 염색된 핵의 주위)에 멜라닌을 거의 포함하고 있지 않은 것이 관찰되었다.

계속해서, 이 현상이 검버섯 부위에 특유의 현상인지의 여부를 조사하기 위해, 이하의 측정을 행하였다.

우선, 검버섯 부위의 조직 절편에서 세포의 위치를 판정하기 위해, 핵을 DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole) 염색에 의해 청색으로 염색하고, 분열 세포를 Ki67 염색에 의해 녹색으로 염색하며, 멜라닌을 의사 컬러에 의해 적색으로 염색함으로써, 이들의 식별을 가능하게 한 3중 염색상을 제작하였다. 이렇게 해서 얻어진 검버섯 부위 조직의 3중 염색상에서, 단위 각 층 길이당, 멜라닌을 포함하는 기저층 세포의 총수와, 멜라닌을 포함하지 않는 기저층 세포의 총수를 계수하였다. 또한, 이들 중 Ki67 양성의 분열 세포의 수를 계수하고, 멜라닌을 포함하는 기저층 세포 및 멜라닌을 포함하지 않는 기저층 세포의 각각의 총수로 나눔으로써, 각각의 분열 세포의 비율을 계산하였다.

도 2(b)는 검버섯 부위 조직의 3중 염색상의 예이다. 멜라닌을 포함하지 않는 기저층 세포에 흰색 동그라미를, 멜라닌을 포함하는 기저층 세포에는 분홍색 동그라미를, 각각 붙여 나타내고 있다. 또한, 도 2(b)에 흰색 포위선으로 나타내는 부분(멜라닌을 포함하지 않는 기저층 케라티노사이트의 예, 및 멜라닌을 포함하는 기저층 케라티노사이트의 예)의 부분 확대도를, 각각 도 2(c) 및 (d)로서 나타낸다. 도 2(c) 및 (d)에서는, 케라티노사이트의 윤곽을 흰색 점선으로 나타내고 있다.

멜라닌을 포함하지 않는 세포와 멜라닌을 포함하는 세포의 판정 기준으로서는, 멜라닌이 거의 관찰되지 않는 세포(예컨대 도 2(c)에 나타내는 세포)를, 멜라닌을 포함하지 않는 세포로 판정하고, 그 이외의 세포(예컨대 도 2(d)에 나타내는 세포)를, 멜라닌을 포함하는 세포로 판정하였다. 또한, Ki67 양성 세포는 그 특성 상, 엄밀하게는 기저층이 아니라, 기저층의 1층 위의 층에 검출되는 경우도 있지만, 이것들도 기저층에서 검출되고 있는 것으로 간주하고 계산하였다.

멜라닌을 포함하는 기저층 세포, 및 멜라닌을 포함하지 않는 기저층 세포의 각각에서의 Ki67 양성 세포의 비율은, 각각 하기의 식 (1) 및 (2)에 따라 산출하였다.

Rm=Dm/Bm (1)

상기 식 (1)에서, Rm은 멜라닌을 포함하는 기저층 세포(melanin)에서의 Ki67 양성 세포의 비율(Ratio)을 나타내고, Dm은 멜라닌을 포함하는 기저층 세포 중, Ki67 양성의 분열 세포수(Divide)를 나타내며, Bm은 멜라닌을 포함하는 총기저층 세포수(Basal)를 나타낸다.

Rc=Dc/Bc (2)

상기 식 (2)에서, Rc는 멜라닌을 포함하지 않는 기저층 세포(clear)에서의 Ki67 양성 세포의 비율을 나타내고, Dc는 멜라닌을 포함하지 않는 기저층 세포 중, Ki67 양성의 분열 세포수를 나타내며, Bc는 멜라닌을 포함하지 않는 총기저층 세포수를 나타낸다.

이상의 절차에 따라, 멜라닌을 포함하는 기저층 세포 및 멜라닌을 포함하지 않는 기저층 세포의 각각의 세포수(도 2(b)에서는, 흰색 동그라미와 분홍색 동그라미의 각각의 세포수)를 계수하고, 멜라닌을 포함하는 경우 및 포함하지 않는 경우의 각각에서의 분열 세포(도 2(b)에서는, 녹색으로 염색된 핵을 갖는 세포)의 비율(Rm, Rc)을 산출하여 비교하였다. 그렇게 하면, 멜라닌을 포함하는 기저층 세포에서의 분열 세포의 비율은, 멜라닌을 포함하지 않는 기저층 세포에서의 분열 세포의 비율과 비교하여, 대폭으로 적기 때문에, 멜라닌 함유 케라티노사이트의 분열이 대폭으로 저하하고 있는 것이 판명되었다(Rm/Rc=0.16배, N=14, P=0.007).

즉, 검버섯 부위에서의 멜라닌을 저장한 기저층 케라티노사이트가, 현저하게 증식·분화가 저하한 상태에 빠져 있다고 생각되었다. 이 검은 케라티노사이트가 좀처럼 분열하지 않는 것이면, 기저층에서의 분열과 턴오버에 의해 끊임없이 교체되고 있는 통상의 케라티노사이트의 상태와는 달리, 장기간에 걸쳐 기저층에 계속 분포하게 된다. 그렇게 되면 결과적으로, 멜라노사이트로부터 멜라닌을 전달 받는 물리적인 시간도 증가하며, 높은 멜라닌 함유량이 유지되어 버린다. 이와 같은 증식·분화의 저하 상태에 빠진 검은 케라티노사이트가 기저층 일면에 존재하여 버리는 것이, 검버섯 부위의 색소 침착의 만성화 요인이라고 생각되었다. 사실, TRP-1에 의해 염색한 조직상(전술한 도 1(b) 및 (c) 참조)을 보면, 멜라닌 함유 케라티노사이트는 기저층 일면에 분포되며, 검버섯 부위의 주된 착색을 담당하고 있다.

[실시예 2]

배양 인간 정상 케라티노사이트를 이용한 해석 결과

검버섯 부위의 조직(in vivo)의 해석에서 관찰된 멜라닌 함유 케라티노사이트의 증식·분화의 저하 현상이, 배양 세포(in vitro)계에서도 관찰되는지의 여부를 확인하기 위해, 배양 인간 정상 케라티노사이트에 미립자를 탐식시켜, 검버섯 부위 기저층과 비슷한 상태를 만들어, 해석을 행하였다.

세포 배양과 미립자의 첨가

(1) 인간 정상 케라티노사이트를, 5％의 CO₂ 가스를 함유하는 공기 분위기 하, 온도 37℃, 습도 95％의 인큐베이터 내에서, Defined Keratinocyte-SFM 배양액(Invitrogen사 제조 Gibco)을 이용하여 배양하였다.

(2) 미립자로서 멜라닌(Sepia melanin(오징어 유래), 파우더형, Sigma사 제조)을 이용하며, PBS 버퍼에 멸균 하에서 확산시켜, 적당한 농도의 현탁액을 제작하였다.

(3) (1)의 세포 배양액을, (2)의 현탁액을 첨가한 배양액(배양액에 대한 멜라닌의 최종 농도 0.001, 0.02, 및 0.04％ W/V)과 교환하여 인큐베이션을 행하고, 케라티노사이트에 멜라닌을 탐식시켰다. 그 후, 상기 배양 조건으로 1∼3일 후에, 멜라닌을 포함하지 않는 신선한 배양액으로 교환하여, 여분의 멜라닌을 씻어냈다. 그리고, 더욱 정기적으로(2∼3일마다) 배지를 교환하면서, 배양을 계속하였다. 이때, 대조군으로서 멜라닌을 첨가하지 않는 세포도 준비하였다.

분열의 관찰과 증식률의 측정

(1) 멜라닌의 첨가 후, 세포 상태의 위상차 현미경상 및, 위상차 없는 투과광 현미경상(멜라닌 분포를 선명하게 보기 위해)을 정기적으로 촬영하여, 세포의 분열의 모습을 관찰하였다.

(2) 멜라닌의 첨가 후, 정기적으로 알라마 블루 분석에 의해 세포 증식률을 측정하였다. 알라마 블루 분석은, 세포 배양액에 1/10 용량의 알라마블루 용액(Bio Source사)을 첨가한 후, 배양용 인큐베이터 내에서 1시간 정치한 후, 배양 상청의 일부를 채취하여 96구멍 플레이트 등에 옮기고, 형광 플레이트 리더에 의해 544 ㎚로 여기하며, 590 ㎚로 측정을 행하였다. 알라마블루 용액을 첨가하여 측정이 끝난 세포 배양 용액은, 즉시 신선한 배양액으로 교환하여, 배양을 계속하였다.

멜라닌 첨가 세포의 변동 유전자의 해석

(1) 멜라닌을 첨가하고, 분열이 저하한 상태의 인간 정상 케라티노사이트와, 멜라닌을 첨가하지 않은 대조군으로부터, ISOGEN(닛폰 진사, 메이커 추장 프로토콜)에 의해 RNA를 추출하여, RNeasy(Qiagen사)에 의해 정제하였다. 얻어진 RNA를 바이오 애널라이저(애질런트 테크놀러지사)로 전기 영동하여, 그 품질 및 정제도를 확인하였다.

(2) 조제한 RNA를 이용하여, DNA 마이크로 어레이에 의한 유전자 프로파일 해석을 행하였다. 샘플의 조제 및 하이브리디제이션(hybridization)은, 애질런트사 추장 프로토콜에 준하여 행하였다. 총량 100∼300 ng의 RNA로부터, Low RNA Input 리니어 증폭 & 라벨화 키트(애질런트사)를 이용하여, 라벨 cRNA를 합성하였다. RNeasy(Qiagen사, 메이커 추장 프로토콜)로 정제한 후, Whole Human Genome 올리고 어레이(애질런트사, G4112A)와의 하이브리디제이션 및 세정을 행하여, 애질런트사 스캐너에 의해 데이터 판독을 행하였다.

멜라닌 첨가 세포의 변동 단백질의 해석

멜라닌을 첨가하고, 분열이 저하한 상태의 인간 정상 케라티노사이트와, 멜라닌을 첨가하지 않은 대조군으로부터 단백질을 추출하여, 웨스턴 블로팅에 의해 타겟 단백질의 양을 비교하였다.

해석 결과

멜라닌 첨가 3일 후의 케라티노사이트의 위상차 현미경상의 예를 도 3(a)에 나타낸다. 또한, 도 3(a)와 동시야의 투과광 현미경상을 도 3(b)에 나타낸다. 도 3(b)에서, 멜라닌은 흑색으로 나타내고 있다. 도 3(a) 및 (b) 중, 흑선분의 길이가 100 ㎛에 상당한다. 도 3(a) 및 (b)에 나타내는 바와 같이, 인간 정상 케라티노사이트에 멜라닌을 첨가하면, 조속히 멜라닌을 탐식한 후, 핵의 주위에 집적하였다. 그 후, 배양 2일째 이후부터는, 현미경상에 의해, 세포 분열의 정체가 관찰되었다.

도 3(c)는 멜라닌의 첨가 후 0, 2, 4, 및 7일째에서의, 각 멜라닌 농도에서의 세포 증식 지표(알라마블루 측정값)를 나타내는 그래프이다. 도 3(c)에 나타내는 바와 같이, 멜라닌 무첨가(멜라닌 농도 0.00％)의 경우는 배양 7일째까지 세포의 증식이 관찰되지만, 멜라닌 농도가 0.01％의 경우에는, 4일째부터 세포 증식의 저하가 관찰되고, 멜라닌 농도를 0.04％까지 인상하면, 농도 의존적으로 첨가 2일째부터 세포 증식의 현저한 저하가 관찰되었다. 또한, 멜라닌 농도를 0.04％로 한 경우에는, 2일째 이후의 알라마블루값은 거의 변하지 않게 되며, 멜라닌 첨가 시의 값을 거의 유지하고 있다. 알라마블루는 세포의 호흡 활성을 검출하고 있기 때문에, 세포가 사멸하여 버린 것이 아닌 것을 알 수 있다. 즉, 세포는 증식도 분화도 하지 않고, 멈춘 상태로 생존하고 있다고 생각된다.

또한, 멜라닌의 첨가에 의해, 배양액의 성분이 멜라닌에 흡착하는 등의 영향이 발생하지 않는 것을 확인하고자, 배양액을 멜라닌과 함께 미리 인큐베이트(3일)한 후, 멜라닌을 제거한 배양액을 사용하여 세포를 배양하고, 관찰을 행한 바, 세포의 증식에 그와 같은 영향은 나타나지 않았다.

또한, 미립자로서, 마이크로 비드(평균 직경 2 ㎛의 폴리스티렌비드, Polyscience사로부터 구입) 및 멜라노솜(인간 정상 멜라노사이트로부터 초원심 분화법에 따라 조제)을 이용하여, 전술한 것과 같은 실험을 행한 바, 역시 동일한 현상이 발생하는 것이 관찰되었다.

멜라닌을 탐식하고, 분열이 저하한 케라티노사이트의 상태를 더 자세하게 해석하기 위해, 분열 저하 케라티노사이트와 정상 케라티노사이트의 쌍방으로부터 전체 RNA를 추출하여, 이들의 유전자 발현 프로파일를 비교하였다. 해석에는, 인간의 전체 유전자가 수재된 DNA 마이크로 어레이를 이용하였다. 그 결과, 세포의 분열에 필요한 사이클린 관계 유전자 중, 다수의 유전자의 발현이 저하하고 있는 것을 알 수 있었다. 세포 증식 마커인 PCNA도 0.53배로 저하하고 있었다. 더욱 사이클린 인히비터군을 보면, 이들은 반대로 발현 항진 하고 있는 것이 판명되었다.

이들 사이클린의 저하가 단백질 레벨에서도 일어나고 있는지의 여부를 조사하기 위해, 웨스턴 블로팅을 이용하여 사이클린 D 및 사이클린 B의 단백질 발현을 조사하였다. 그 결과, 이들 사이클린은, 단백질 레벨에서도 발현이 저하하고 있는 것이 확인되었다.

상기 결과로부터, 멜라닌을 저장한 케라티노사이트의 분열 저하는, 단순한 독성이라고 하기 보다는, 셀사이클 결정 기구가 관여하는 능동적인 증식 저하 현상인 것이 시사된다.

이와 같이, 멜라닌을 탐식시킨 배양 케라티노사이트의 분열이 저하하였다고 하는 결과는, 검버섯 부위의 멜라닌을 저장한 기저층 케라티노사이트의 분열이 저하하고 있었다고 하는 전술한 관찰 지견과 완전히 합치하고 있다. 즉, 검버섯 조직에서 관찰된 멜라닌 함유 케라티노사이트의 증식 분화 저하 현상이, 배양 세포의 계에서도 재현되었다고 생각된다. 이와 같이 멜라닌을 저장하여 증식도 분화도 하지 않는, 증식 분화 저하 상태에 빠진 검은 케라티노사이트가 기저층 일면에 존재하여 버리는 것이, 검버섯 부위의 색소 침착의 만성화 요인이라고 생각된다.

[실시예 3]

멜라닌 함유 케라티노사이트의 분열 정상화 약제의 스크리닝

실시예 2와 동일한 절차에 따라, 배양 인간 정상 케라티노사이트에 미립자를 탐식시켜 세포분열이 저하한 상태를 제작하고, 그 정상화, 즉 세포 분열의 촉진을 지표로 한 약제 스크리닝계의 구축을 행하며, 그 계를 이용하여 약제 스크리닝을 시도하였다.

스크리닝계의 구축

(1) 인간 정상 케라티노사이트를, 5％의 CO₂ 가스를 함유하는 공기 분위기 하, 온도 37℃, 습도 95％의 인큐베이터 내에서, Defined Keratinocyte-SFM 배양액(Invitrogen사 제조 Gibco)을 이용하여 배양하였다. 또한, 인간 정상 멜라노사이트를, 상기와 동일한 환경 하에서, Medium 254+HMGS 배양액(KURABO)을 이용하여 배양하였다.

(2) 미립자로서 멜라닌(Sigma사 제조 Sepia melanin(오징어 유래), 파우더형)을 이용하고, PBS 버퍼에 멸균 하에서 확산시켜, 적당한 농도의 현탁액을 제작하였다.

(3) (2)의 현탁액을 첨가한 배양액(배양액에 대한 멜라닌 최종 농도 0.001∼0.04％ W/V, 세포수가 절반 정도로 증식하는 농도)을, (1)의 세포 배양액과 교환하여 인큐베이션을 행하고, 멜라닌을 3일간 탐식시켰다(또한, 멜라닌의 첨가에 의해, 배양액의 성분이 멜라닌에 흡착하는 등의 영향이 발생하지 않는 것을, 실시예 2와 동일한 방법에 따라 미리 확인하였다.). 그 후, 멜라닌을 포함하지 않는 신선한 배양액으로 교환하여, 여분의 멜라닌을 씻어냈다. 이에 평가 대상이 되는 후술하는 약제(후보 화합물)를 여러가지 농도(0.1∼0.8％ W/V)로 첨가하여, 상기 배양 조건으로 더욱 2∼3일간 배양을 계속하였다. 이때, 대조군으로서 멜라닌을 첨가하지 않는 세포도 준비하여, 동일하게 처리하였다.

(4) 약제 첨가 후 2∼3일째에, 알라마 블루 분석에 의해 세포 증식 지표를 측정하였다. 알라마 블루 분석은, 세포 배양액에 1/10 용량의 알라마블루 용액(Bio Source사)을 첨가한 후, 배양용 인큐베이터 내에서 1시간 정치 후, 배양 상청의 일부를 채취하여 96구멍 플레이트에 옮기고, 형광 플레이트 리더에 의해 544 ㎚로 여기하며, 590 ㎚로 측정을 하였다.

약제 스크리닝

각종 식물 추출액 등 약 200품의 약제에 대해서, 상기 스크리닝계를 이용하여 실제로 스크리닝을 행하였다. 그 결과, 쑥 엑기스, 사철쑥 엑기스, 및 복숭아 잎 엑기스가, 멜라닌 함유 케라티노사이트의 분열을 촉진하는 효과를 갖는 것을 발견하였다(이들 약제를 적절하게 「선정 약제」라고 칭함).

선정 약제 중 쑥 엑기스를, 멜라닌을 함유하지 않는 케라티노사이트에 첨가하였을 때의 증식 지표(알라마 블루 분석)의 그래프를 도 4(a)에, 멜라닌 함유 케라티노사이트에 첨가하였을 때의 증식 지표의 그래프를 도 4(b)에 나타낸다. 쑥 엑기스는, 멜라닌을 함유하지 않는 케라티노사이트에 첨가하여도 증식을 항진하지 않지만, 멜라닌 함유 케라티노사이트에 대해서는 세포 증식을 항진시키는 효과가 있는 것을 알 수 있다.

도 5는 별도의 선정 약제인 사철쑥 엑기스 및 복숭아 잎 엑기스가, 미립자로서 마이크로 비드를 함유하는 케라티노사이트에 부여하는 영향을 나타내는 증식 지표(알라마 블루 분석)의 그래프이다. 그래프 중, a는 마이크로 비드를 함유하지 않는 케라티노사이트에 대하여, 선정 약제를 첨가하지 않은 상태로 배양한 경우의 증식 지표(알라마 블루 분석)의 값을 나타낸다. b, c, 및 d는 미립자로서 마이크로 비드(φ 2 ㎛, 배양액에 대하여 2.2×10⁷ 개/㎖)를 이용하여 얻어진 마이크로 비드 함유 케라티노사이트에 대하여, 약제를 첨가하지 않는 경우(b), 사철쑥 엑기스 0.2％를 첨가한 경우(c), 및 복숭아 잎 엑기스 0.2％를 첨가한 경우(d)의 증식 지표(알라마 블루 분석)의 값을 나타낸다. 도 5로부터, 사철쑥 엑기스 및 복숭아 잎 엑기스가, 마이크로 비드를 탐식하여 증식이 저하한 케라티노사이트에 대하여, 증식을 항진시키는 효과를 갖는 것을 알 수 있다.

이상의 결과로부터, 상기 스크리닝계를 이용하여 얻어진 선정 약제는, 멜라닌을 함유하여 분열이 저하한 케라티노사이트를 특이적으로 분열시키는 한편으로, 정상적인 케라티노사이트나 멜라노사이트에는 이러한 영향을 부여하지 않는, 즉 증식 항진 작용을 검버섯 부위의 색소 침착의 만성화 요인인 멜라닌 함유 케라티노사이트에 국한하여 부여할 수 있다. 따라서 이들 선정 약제를 이용하면, 부작용을 억제하면서 효과적으로 검버섯에 대처하는 것이 가능하다고 생각된다.

본 발명은 의약품이나 화장품에 관한 분야, 특히, 피부 검버섯 형성을 예방하고, 및/또는 피부 검버섯을 개선하는 의약품이나 화장품의 분야에서, 적합하게 이용할 수 있다.

Claims

피부의 멜라닌 함유 케라티노사이트의 증식 및/또는 분화를 선택적으로 활성화하는 공정을 포함하여 이루어지는 피부 미백 방법.
피부 검버섯 형성 억제 및/또는 제거 인자를 스크리닝하는 방법으로서, 배양 케라티노사이트에 미립자를 함유시켜, 증식 및/또는 분화가 저하한 상태의 케라티노사이트 집단을 제작하는 공정과, 상기 집단의 증식 및/또는 분화의 선택적인 활성화 능력을 지표로 하여 후보 화합물을 평가하고, 상기 활성화 능력을 갖는 화합물을 피부 검버섯 형성 억제 및/또는 제거 인자로서 선정하는 공정을 포함하여 이루어지는 방법.
제2항에 있어서, 상기 미립자가 천연 혹은 합성의 멜라닌, 멜라노솜 또는 성질이 균질한 마이크로 비드인 방법.
제2항에 있어서, 상기 증식의 활성화 능력의 측정을 세포수 카운트법, 알라마 블루 분석(alamar blue assay), MTT(3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨브로마이드) 분석, 훽스트 분석, BrdU(5-브로모-2'-데옥시우리딘) 취득량 측정법 및 세포 증식, 세포 분열 혹은 세포 주기에 관한 항체를 이용한 면역 조직학적 측정법에서 선택되는 방법으로 행하는 것인 방법.
제2항에 있어서, 상기 분화의 활성화 능력의 측정을 세포 형태 관찰법 및 세포 분화에 관한 항체를 이용한 면역 조직학적 측정법에서 선택되는 방법으로 행하는 것인 방법.
제2항에 있어서, 상기 활성화 능력을 갖는 화합물을 멜라닌 함유 케라티노사이트를 구성 요소로 하는 피부 모델에 적용하여, 피부 검버섯 형성 억제 및/또는 제거 효과를 갖는 화합물을 선정하는 공정을 더 포함하여 이루어지는 것인 방법.
제2항에 있어서, 상기 증식 및/또는 분화가 저하한 상태의 케라티노사이트 집단을 이용하여 3차원 피부 모델을 구축하는 공정을 더 포함하여 이루어지며, 상기 3차원 피부 모델을 이용하여 상기 후보 화합물의 평가를 행함으로써, 피부 검버섯 형성 억제 및/또는 제거 효과를 갖는 화합물을 선정하는 것인 방법.