WO2014142552A1 - 미백 효능 물질의 스크리닝 방법 - Google Patents

미백 효능 물질의 스크리닝 방법 Download PDF

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WO2014142552A1
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최현정
이태룡
조은경
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Definitions

  • the present invention relates to a method for screening a substance having a whitening effect, and more specifically, a test using Fox03a (Forkhead box 03A), which is a protein encoded by the longevity gene Fox03 (Forkhead box 03) gene.
  • the present invention relates to a method of confirming whether a substance activates Fox03a or promotes expression and confirms whether a test substance has a whitening effect.
  • Melanin is a pigment that determines the color of a person's skin.
  • the skin color is determined by the amount and distribution of this melanin.
  • the cells that make melanin are made from cells called melanocytes (Mel anocytes) under the skin's epidermis and travel to the stratum corneum by the metabolism of the skin and fall off. Regardless of the color of the skin, the number of melanin forming cells is about the same. Only because the amount, type, and distribution of melanin produced are different skin color.
  • tyrosine In the skin, tyrosine (Tyros ine) is converted to dopa (D0PA) by a human enzyme called Tyros inase, and finally a series of oxidation processes results in the formation of a brown polymer, melanin.
  • Melanin is not degraded in vivo and is removed by keratinocytes with the melanin as it leaves the skin as it leaves the epidermis. When such melanin is excessively produced, it causes hyperpigmentation such as blemishes, freckles, and spots, resulting in cosmetically unfavorable results. Therefore, to prevent melanin pigmentation caused by outdoor activities such as exercise, Increasingly, the demand for more information is increasing. Accordingly, there is a growing demand for the development of whitening agents that prevent excessive melanin production.
  • the present inventors confirmed the whitening effect using Fox03a (Forkhead box 03A), a protein encoded by the longevity gene Fox03 (Forkhead box 03) gene. With this in mind, the present invention has been completed.
  • an object of the present invention is to provide a method for screening a substance having a whitening effect using Fox03a (Forkhead box 03A).
  • the present invention provides a screening method of a test substance having a whitening efficacy, including confirming whether the activation or expression of Fox03a (Forkhead box 03A) is promoted.
  • Fox03a (Forkhead box 03A) according to the present invention is a protein encoded by Fox03 known as a longevity gene, Mn-SOD as a transcription factor located in the insulin signaling pathway (I IS, Insul in / IGF-ike signaling) It is a protein that acts on the expression of enzymes such as catalase.
  • I IS insulin signaling pathway
  • IGF-ike signaling a transcription factor located in the insulin signaling pathway
  • the activation of Fox03a can be determined by migration to the nucleus of Fox03a. In other words, Fox03 in the cytoplasm moves to the nucleus to initiate the expression of enzymes.
  • the present inventors confirmed that the degree of nuclear migration and the decrease in melanin production according to the activation of Fox03a are in proportion. Therefore, by treating candidate substances measured to have whitening efficacy on skin cells and confirming the activation or expression of Fox03a, it is possible to easily and objectively determine whether the material exhibits whitening efficacy by reducing melanin production. have.
  • the present invention is a method for screening a material having a whitening effect
  • a method for screening whitening efficacy substances characterized in that whether a test substance activates or promotes expression of a gene encoding Fox03a (Forkhead box 03A) protein.
  • whether the test substance activates Fox03a comprises: a) treating the test substance on skin cells; And
  • the screening method may further include c) determining that the Fox03a protein in the skin cell is moved to the nucleus as a whitening agent, which is activated by the Fox03a protein encoding gene through the movement of Fox03a to the nucleus. Because it can be regarded as.
  • the whitening efficacy substance determined by the screening method can initiate the expression of antioxidant enzymes by Fox03a, At the same time, it can be determined as a substance showing whitening efficacy.
  • the test substance may be different according to the type of test substance, but it is preferable to treat it at the concentration of InM to ⁇ . Treatment with a concentration of less than InM does not reach the efficacy level of the test product, and treatment with a concentration above ⁇ may cause abnormalities in cell homeostasis due to excessive potency, and thus reduce nuclear migration and whitening efficacy.
  • the skin cells may be keratinocytes, fibroblasts or melanocytes.
  • whether the test substance promotes the expression of Fox03a may be performed using Western blot, EL ISA, or RT-PCR.
  • the test substance when the test substance promotes Fox03a expression, it may be determined as a whitening efficacy substance.
  • the whitening efficacy substance determined by the screening method can initiate the expression of antioxidant enzyme by Fox03a due to the characteristics of longevity gene Fox03, it shows not only the whitening efficacy found in the present invention but also anti-aging and antioxidant effects. It can be judged as a substance.
  • the screening method of the whitening efficacy substance according to the present invention since the reduction in melanin formation and the activation degree of Fox03a are proportional to each other, it is possible to confirm the whitening efficacy of the test substance through objective criteria, and not by methods such as clinical trials or sensory evaluation. Instead, the whitening agent can be determined quickly, easily and accurately.
  • the whitening efficacy substance determined by the screening method can initiate the expression of antioxidant enzymes by Fox03a, it is possible to screen all substances which simultaneously exhibit anti-aging and antioxidant effects and whitening efficacy.
  • FIG. La shows transfection of wild-type Fox03a plasmid (WT) in MNT-1 cells (NT), MNT-1 cells, respectively, and transfection of NLS mutant Fox03a plasmid with mutation in nuclear position sequence.
  • NLS is a photograph comparing the color of the lysate of the cell pellet.
  • FIG. Lb shows transfection of wild-type Fox03a plasmids (WT) and transfection of NLS mutant Fox03a plasmids with mutations in nuclear position sequence, respectively, in the MNT-1 cells (NT) and MNT-1 cells; Western blot results of the solution of (NLS).
  • Figure 2 Mela when treated with vitamin C, N-acetylcysteine, Tortox to ⁇ T-1 cells It is a graph showing the amount of nin and tyrosinase activity.
  • Figure 3 is a fluorescence microscope picture of the nuclear migration of Fox03a when treated with vitamin C, N-acetylcysteine, Tortox to Li T-1 cells.
  • Li T-1 cells Human melanoma cell line, Lonza, SWISS
  • 1x10 6 pieces in MEM medium 10%
  • DMEM DMEM
  • WT wild-type
  • Fox03a fulllasmid Plasmid 1787: HA-F0X03a WT, Addgene
  • NLS mutant Fox03a plasmid NLS mutant Fox03a plasmid (nuclear localization sequence mutant plasmid; Plasmid 8361: FLAG - F0X03a TM, Addegene)
  • Lipofectamin 2000 (Invitrogen) was used to transfect each T-cell of each culture and cultured for 48 hours at 37 ° C.
  • the MNT-1 cells were purified using LIPA buffer (25 mM Tris-HCl, pH).
  • MNT-1 cells Human melanoma cell line, Lonza, SWISS
  • NAC N-acetyl cysteine
  • Trolox rocks of the agent
  • the lysate was measured for absorbance at 490 nm specific to the melanin pigment, and the total protein amount was measured using a BCA protein assay kit (Pierce). The measurement thus obtained was corrected by (absorbance) / (total protein amount), and the amount of melanin was expressed as melanin Aug protein.

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Abstract

본 발명은 미백 효능을 갖는 물질을 스크리닝하는 방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 장수 유전자인 FoxO3a(Forkhead box O3A)를 이용하여 시험 물질이 FoxO3a 를 활성화 시키거나 발현을 촉진시키는지 여부를 확인하여, 시험 물질이 미백 효능을 갖는지 여부를 판정하는 것을 특징으로 하는, 미백 효능 물질 스크리닝 방법에 관한 것이다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
미 백 효능 물질의 스크리닝 방법
【기술분야】
본 발명은 미 백 효능을 갖는 물질을 스크리닝하는 방법 에 관한 것으로서， 보 다 구체적으로는， 장수 유전자인 Fox03(Forkhead box 03) 유전자에 의해 인코딩되 는 단백질인 Fox03a(Forkhead box 03A)를 이용하여 시험 물질이 Fox03a를 활성화시 키거나 발현을 촉진시키는지 여부를 확인하여， 시험 물질이 미 백 효능을 갖는지 여 부를 확인하는 방법에 관한 것이다.
【배경기술】
멜라닌은 사람의 피부색을 결정하는 색소로 이 멜라닌의 양과 분포에 의해 피부색이 결정된다 . 멜라닌을 만드는 세포는 피부 표피 밑에 멜라닌 형성 세포 (Mel anocyte)라고 불리는 세포에서 만들어 져서 피부의 신진대사로 각질 표면으로 이동하여 떨어져 나간다 . 피부색에 관계없이 멜라닌 형성 세포의 수는 거의 동일하 다. 단지 멜라닌이 생성되는 양과 종류， 분포가 다르기 때문에 피부색이 차이가 나 는 것 이다. 피부에서 티로신 (Tyros ine)이 티로시나아제 (Tyros inase)라는 인체 효소 에 의해 도파 (D0PA)로 전환되고 , 계속되는 일련의 산화과정을 통해 최종적으로 혹 갈색의 중합체인 멜라닌이 생성된다.¬
멜라닌은 생체 내에서 분해되지 않으며， 각질형성세포가 표피에서 떨어져나갈 때 멜라닌과 함께 피부에서 떨어져나가는 것에 의해 제거된다. 이 러 한 멜라닌이 과도 하게 생성되는 경우 기미나 주근깨， 점 등과 같은 과색소침착증을 유발하여 미용상 으로 좋지 않은 결과를 가져오게 되므로， 운동 등의 야외 활동에 따른 자외선에 의 한 멜라닌 색소 침착을 막고자 하는 요구가 더욱 늘어나는 추세이다 . 이에 과도한 멜라닌 생성을 막는 미 백제의 개발의 요구가 커지는 실정 이다 .
따라서 이 러한 멜라닌 생성을 저해하여 미 백 효능을 갖는 물질을 찾는 것 이 중요한 과제로 대두되고 있으며， 관능 평가나 육안에 의한 평가가 아닌， 객관적 인 기준올 통해 시험 물질의 미 백 효능을 확인 및 판단할 수 있는 방법에 대한 필요가 요구된다.
【발명의 상세한 설명】
【기술적 과제】
이에 본 발명자들은 장수 유전자인 Fox03(Forkhead box 03) 유전자에 의해 인코딩되는 단백질인 Fox03a(Forkhead box 03A)를 이용하여 미 백 효과 여부를 확인 할 수 있음에 착안하여 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명은 Fox03a(Forkhead box 03A)를 이용하여 미 백 효능을 갖는 물질을 스크리닝하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다 .
【기술적 해결방법】
상기 목적올 달성하기 위하여， 본 발명은 Fox03a(Forkhead box 03A)의 활성 화 또는 발현 촉진 여부를 확인하는 것을 포함하는， 미 백 효능을 갖는 시험 물질의 스크리닝 방법올 제공한다.
본 발명에 따른 Fox03a(Forkhead box 03A)는 장수 유전자로 알려진 Fox03에 의해 인코딩되는 단백질이며， 인슐린 신호전달경로 ( I IS , Insul in/IGF-l ike signal ing) 에 위치하는 전사인자로서 Mn-SOD, Catalase와 같은 효소의 발현에 작용하는 단백 질이다. Fox03a가 활성화되면 생체 내 방어기 작의 활성화 등을 통해 항노화 효능을 구현한다 . 상기 Fox03a의 활성화는 Fox03a의 핵으로의 이동에 의해 판단할 수 있 다 . 즉 세포질에 존재하던 Fox03가 핵으로 이동하여 효소들의 발현을 개시하는 것 이다.
본 발명자들은 Fox03a의 활성화에 따른 핵이동 정도와 멜라닌 생성 감소 정도가 비 례하는 것을 확인하였다. 따라서 피부 세포에 미 백 효능을 지니는 것으로 측정되는 후보 물질을 처 리하여 Fox03a의 활성화 또는 발현 촉진 여부를 확인함으로써 상기 물질이 멜라닌 생성을 감소시켜 미 백 효능을 나타내는 물질인지 여부를 간편하고 객관적으로 확인할 수 있다.
따라서 본 발명은 미 백 효과를 갖는 물질을 스크리닝하는 방법으로서 ,
시험 물질이 Fox03a(Forkhead box 03A) 단백질을 코딩하는 유전자를 활성화하거나 상기 유전자의 발현을 촉진시 키는지 여부를 확인하는 것을 특징으로 하는 미백 효 능 물질 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시 예에서 상기 시험 물질이 Fox03a를 활성화시키는지 여부의 확인은 a) 피부 세포에 시험 물질을 처 리하는 단계 ; 및
b) 상기 a) 단계에서 시험 물질을 처 리한 피부 세포에서의 Fox03a의 이동을 관찰하 는 단계를 포함할 수 있다 .
상기 스크리닝 방법은 c) 상기 피부 세포에서 Fox03a 단백질이 핵으로 이동하는 경 우 미 백 효능 물질로 판정하는 단계를 더 포함할 수 있으며， 이는 Fox03a가 핵으로 이동하는 것을 통하여 Fox03a 단백질 인코딩 유전자가 활성화 되는 것으로 간주할 수 있기 때문이다. 또한 상기 스크리닝 방법에 의해 판정된 미 백 효능 물질은 Fox03a에 의해 항산화 효소의 발현을 개시시킬 수 있기 때문에 항노화 및 항산화와 동시에 미백 효능을 나타내는 물질로서 판정할 수 있다.
상기 a) 단계에서 시험 물질은 시험 물질의 종류에 따라 상이할 수 있지만, InM 내 지 ΙΟΟηΜ의 농도로 처리하는 것이 바람직하다. InM 미만의 농도로 처리하면 시험물 질의 효능농도에 미치지 못하고， ΙΟΟηΜ 초과의 농도로 처리하면 과도한 효능으로 인해 세포 항상성에 이상이 생길 수 있어， 오히려 핵이동 및 미백 효능이 감소하게 된다.
상기 피부 세포는 각질형성세포， 섬유아세포 또는 멜라닌형성세포일 수 있다. 또한 본 발명의 일실시예에서 상기 시험 물질이 Fox03a의 발현을 촉진시키는지 여 부의 확인은 웨스턴블랏 (Western blot), EL ISA 또는 RT-PCR를 이용하여 수행할 수 있다.
상기 확인 결과를 통하여 시험물질이 Fox03a 발현올 촉진시키는 경우 미백 효능 물질로 판정할 수 있다. 또한 상기 스크리닝 방법에 의해 판정된 미백 효능 물질은 장수 유전자인 Fox03의 특성상 Fox03a에 의해 항산화 효소의 발현을 개시시 킬 수 있기 때문에 본 발명에서 발견한 미백 효능 뿐 아니라 항노화 및 항산화 효 과를 동시에 나타내는 물질로서 판정할수 있다.
【유리한 효과】
본 발명에 따른 미백 효능 물질 스크리닝 방법은 실제 멜라닌 형성 감소와 Fox03a의 활성화 정도가 비례하기 때문에， 객관적인 기준을 통하여 시험 물질의 미 백 효능 여부를 확인할 수 있어， 임상실험이나 관능 평가와 같은 방법에 의하지 않 고 미백 효능 물질올 신속하고 간편하며 정확하게 판단할 수 있다. 또한 상기 스크 리닝 방법에 의해 판정된 미백 효능 물질은 Fox03a에 의해 항산화 효소의 발현올 개시시킬 수 있기 때문에 항노화 및 항산화 효과와 미백 효능을 동시에 나타내는 물질올 스크리닝할수 있다.
【도면의 간단한 설명】
도 la는 MNT-1 세포 (NT), MNT-1 세포에 각각 야생형 Fox03a플라스미드를 트 랜스펙션한 경우 (WT), 및 핵위치서열에 돌연변이가 있는 NLS 돌연변이 Fox03a 플라 스미드를 트랜스펙션한 경우 (NLS)의 세포 펠렛의 용해액의 색상을 비교한 사진이 다.
도 lb는 상기 MNT-1 세포 (NT), MNT-1 세포에 각각 야생형 Fox03a 플라스미드를 트 랜스펙션한 경우 (WT) 및 핵위치서열에 돌연변이가 있는 NLS 돌연변이 Fox03a 플라 스미드를 트랜스펙션한 경우 (NLS)의 용해액의 웨스턴블랏 결과사진이다.
도 2는 顯 T-1 세포에 비타민 C, N-아세틸시스테인， 트를톡스를 처리한 경우의 멜라 닌 양과 티로시나아제 활성을 나타낸 그래프이다.
도 3은 丽 T-1 세포에 비타민 C, N-아세틸시스테인, 트를톡스를 처리한 경우 의 Fox03a의 핵이동을 관찰한 형광현미경 사진이다.
【발명의 실시를 위한 최선의 형태】
이하， 본 발명의 내용을 실시예 및 시험예를 통하여 보다 구체적으로 설명한 다. 이들 실시예는 본 발명의 내용을 이해하기 위해 제시되는 것일 뿐 본 발명의 권리범위가 이들 실시예 및 시험예로 한정되는 것은 아니고, 당업계에서 통상적으 로 주지된 변형， 치환 및 삽입 등을 수행할 수 있으며， 이에 대한 것도 본 발명의 범위에 포함된다.
[시험예 1] Fox03a 활성화와 멜라닌 생성 감소 실험
丽 T-1 세포 (Human melanoma cell line, Lonza, SWISS) 1X106개를 MEM 배지 (10%
DMEM)에 첨가하고, 야생형 (WT) Fox03a 풀라스미드 (Plasmid 1787： HA-F0X03a WT, Addgene사)， NLS 돌연변이 Fox03a 들라스미드 (nuclear localization sequence mutant plasmid; Plasmid 8361: FLAG~F0X03a TM, Addegene사)를 Lipofectamin 2000(Invitrogen)을 이용하여 각각 匪 T-1 세포에 트랜스펙션하여 37°C에서 48시간 동안 배양하였다. 상기 MNT-1 세포를 의 LIPA buffer(25 mM Tris-HCl, pH
7.4， 0.1% SDS, 0.1% Triton X— 100， 1% sodium deoxycholate, 150 mM NaCl , 1 tnM, EDTA, 1 mM Na3V04,lmMPMSF,10mg/mLaprotinin,5mg/mLleupeptin)로 용해 (lysis)시킨 후， 세포 용해질을 원심분리 (Centrifuge 5415R, Eppendorf 제품， Germany)하고， 얻 은 펠렛을 분리하여 색상을 관찰하였으며， 1N 수산화나트륨 로 상기 펠렛 속 의 내용물을 용해시켜 얻은 용해액의 색상올 찍은 사진을 도 la에 나내었다. 대조 군으로는 플라스미드를 트랜스펙션하지 않은 MNT-1세포를사용하였다.
상기 용해액 20 g을 로딩하여 웨스턴블랏으로 Fox03a의 단백질 발현량을 확인하였 고 세포질 성분의 마커 단백질로 Gapdh, 핵 성분의 마커 단백질로 Lamin B를 사용 하여 결과를 도 lb에 나타내었다.
도 la의 결과에서， 야생형 Fox03a 플라스미드를 트랜스펙션한 경우 Foxo3a의 과발 현에 의해 멜라닌 생성이 현저히 감소함을 확인할 수 있으며, 핵위치서열에 돌연변 이가 있는 NLS 돌연변이 Fox03a 풀라스미드를 트랜스펙션한 경우에는 Fox03a가 핵 으로 이동하지 않기 때문에 멜라닌 생성 감소가 나타나지 않음을 확인할 수 있다. 또한， 도 lb의 결과에서 야생형 Fox03a 플라스미드를 트랜스펙션한 경우 Fox03a가 활성화되어 핵으로 이동함이 나타났음을 확인할 수 있다. 따라서 Fox03a의 활성화 가 일어나지 않으면 멜라닌 생성에 영향을 미치지 않으며， Fox03a의 핵으로의 이동 이 멜라닌 감소에 작용함을 확인할 수 있다. 즉 Fox03a의 활성화가 피부세포에서 멜라닌 생성을 효과적으로 저해할수 있는 중요한 인자라는 점을 알 수 있다.
[시험예 2] 미백물질 처리에 따른 멜라닌 생성 감소 실험
MNT-1 세포 (Human melanoma cell line, Lonza, SWISS) 1X106개에 공지의 미백물질인 비타민 C, N-아세틸시스테인 (N-acetyl cysteine; NAC), 트를록스 (Trolox)를 각각 0， ΙηΜ, ΙΟηΜ, ΙΟΟηΜ, ΙμΜ, ΙΟμΜ, ΙΟΟμΜ의 농도로 처리한 후， 37°C에서 48시간 동안 배양하였다. 상기 배양된 세포를 의 LIPA buffer로 용해 (lysis)시킨 후， 상기 세포 용해질 중 500^를 원심분리 (Centrifuge 5415R, Eppendorf 제품， Germany)하고, 얻은 펠렛을 분리하여 색상을 관찰하였으며， 1N 수산화나트륨 200 로 상기 펠렛 속의 내용물을 용해시켰다. 상기 용해액을 멜라닌 색소에 특이적인 490nm에서 흡광도를 측정하고， BCA protein assay kit (Pierce)를 이용하여 총 단 백질양을 측정하였다. 이렇게 얻은 측정값을 (흡광도) /(총 단백질 양)으로 보정하 여， 멜라닌의 양을 멜라닌 Aug 단백질로 나타내었다. 각 미백물질 실험군에서 비처 리군 (OnM)의 멜라닌 양을 1로 보았을 때의 실험군의 멜라닌 양의 상대값을 계산하 여 이를 도 2에 나타내었다.
[시험예 3] 미백물질 처리에 따른 티로시나아제 활성 억제 평가
상기 시험예 2에서의 세포 용해질 100 ^에 10 mM D0PA(d i hydr oxypheny 1 a 1 an i ne ) 를 첨가하여 37°C에서 1시간 동안 반응시킨 후， 490nm에서 흡광도를 측정하여 티로시나아제의 작용으로 생성된 도파크름 (dopachrome)의 양을 구하였다. 비처리 군 (OnM)의 OD490 값을 1로 보았올 때， 각 실험군의 흡광도의 상대값을 계산하여 티 로시나아제 활성 억제능을 구하였으며， 이를 도 2에 나타내었다.
[시험예 4] 미백물질 처리에 의한 Fox03a의 핵이동 관찰
匪 T-1 세포 (Human melanoma cell line, Lonza, SWISS) 1X1()6개에 공지의 미백물질인 비타민 Cᅳ N-아세틸시스테인 (N-acetyl cysteine; NAC), 트를록스 (Trolox)를 각각 미리 결정된 농도 (즉， ΙηΜ, ΙΟηΜ, ΙΟΟηΜ, ΙμΜ, 10 μ 또는 ΙΟΟμΜ의 농도)로 처리 한 후， 37°C에서 48시간동안 배양하였다. 대조군으로는 비처리군을 사용하였다. 배 양된 세포를 각각 DAPI (핵 염색제 -blue), Fox03a IF antibody (red) (Cell Signaling Technology)로 염색하고, 형광현미경 (EVOSfl digital fluorescence microscope, Advanced Microscopy Group)으로 관찰하여 그 결과를 도 3에 나타내었 다.
도 3의 결과에서， 비타민 C, N-아세틸시스테인 (N-acetyl cysteine; NAC), 트롤록스 (Trolox) 처리시 Fox03a의 핵이동이 관찰됨을 알 수 있으며， 각 경우에서 ΙΟΟμΜ에 서는 핵이동이 관찰되지 않는 반면， ΙΟΟηΜ에서 극명하게 관찰되는 것을 알 수 있 다. 상기 시험예 2~4의 결과로부터， Fox03a의 핵이동이 관찰된 물질 농도에서 미 백 효능을 나타내며， Fox03a의 활성화를 매개하는 물질은 항노화， 항산화 효능 및 미백 효능을 동시에 구현하는 항노화 -미백 물질임을 확인할 수 있다. 따라서 본 발 명에 따른 스크리닝 방법에 의하여 시험 물질의 항노화렷瘤位 효과와 동시에 미백 효과를 객관적으로 정확하게 스크리닝할 수 있음을 알 수 있다.

Claims

【청구의 범위】
【청구항 1】
미백 효능 물질을 스크리닝하는 방법으로서，
시험하고자 하는 물질이 Fox03a(Forkhead box 03A)를 활성화 또는 발현을 촉진시키 는지 여부를 확인하는 것을 특징으로 하는， 미백 효능 물질 스크리닝 방법.
【청구항 2]
제 1항에 있어서，
상기 확인은 ·
a) 피부 세포에 시험하고자 하는 물질을 처리하는 단계; 및
b) 상기 a) 단계에서 시험 물질을 처리한 피부 세포에서의 Fox03a의 이동을 관찰하 는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 미백 효능 물질 스크리닝 방법.
【청구항 3】
제 2항에 있어서，
c) 상기 피부 세포에서 Fox03a가 핵으로 이동하는 경우， 미백 효능 물질로 판정하 는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 미백 효능 물질 스크리닝 방법 .
【청구항 4】
제 2항 또는 제 3항에 있어서，
상기 피부 세포는 각질형성세포， 섬유아세포 또는 멜라닌형성세포인 것을 특징으로 하는 미백 효능 물질 스크리닝 방법 .
【청구항 5】
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한항에 있어서，
상기 스크리닝 방법은 미백 효능 및 항노화 효능을 모두 지니는 물질을 스크리닝할 수 있는 것을 특징으로 하는 미백 효능 물질 스크리닝 방법.
【청구항 6】
제 1항에 있어서，
상기 Fox03a의 활성화 또는 발현 촉진은 웨스턴블랏 (Western blot), ELISA 또는 RT-PCR를 이용하여 확인하는 것을 특징으로 하는 미백 효능 물질 스크리닝 방법 .
【청구항 7】
제 6항에 있어서，
상기 시험물질이 Fox03a 발현을 촉진시키는 경우 미백 효능 물질로 판정하는 것을 특징으로 하는 미백 효능 물질 스크리닝 방법 .
【청구항 8】 제 6항 또는 제 7항에 있어서,
상기 스크리닝 방법은 미백 효능 및 항노화 효능을 모두 지니는 물질을 스크 리닝할 수 있는 것을 특징으로 하는 미백 효능 물질 스크리닝 방법 .
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