JPWO2020111265A1 - 色素沈着皮膚モデルおよびその製造方法、ならびに皮膚の色素沈着を治療または予防するための因子の評価方法 - Google Patents
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Abstract
Description
前記第1細胞群の上に適用された、メラノサイトとケラチノサイトとを含む第2細胞群と、
を含む、色素沈着皮膚モデル。
[2] 前記光照射により損傷が与えられた線維芽細胞が、光増感剤の存在下で、紫外光の照射により損傷が与えられた線維芽細胞である、[1]に記載の色素沈着皮膚モデル。
[3] 前記光増感剤が、ソラレン、NAD、リボフラビン、トリプトファン、葉酸、ポルフィリン、メチレンブルー、チノール基で保護された金ナノクラスター(AUxSRy)からなる群から選択される、[2]に記載の色素沈着皮膚モデル。
[4] 前記光照射が、UVAの光照射である、[1]〜[3]のいずれか1項に記載の色素沈着皮膚モデル。
[5] 前記第2細胞群が、多孔膜を有する第2細胞培養基材の上に播種された第2細胞群である、[1]〜[4]のいずれか1項に記載の色素沈着皮膚モデル。
[6] 前記第1細胞培養基材が、多孔膜を有する細胞培養基材である、[1]〜[5]のいずれか1項に記載の色素沈着皮膚モデル。
[7] 前記第1細胞群が、ハイドロゲル化剤とともに播種された第1細胞群である、[1]〜[6]のいずれか1項に記載の色素沈着皮膚モデル。
[8] 前記ハイドロゲル化剤が、コラーゲン、ゼラチン、ヒアルロナート、ヒアルロナン、フィブリン、アルギナート、アガロース、キトサン、キチン、セルロース、ペクチン、デンプン、ラミニン、フィブリノーゲン/トロンビン、フィブリリン、エラスチン、ガム、セルロース、寒天、グルテン、カゼイン、アルブミン、ビトロネクチン、テネイシン、エンタクチン/ニドジェン、糖タンパク質、グリコサミノグリカン、ポリ(アクリル酸)およびその誘導体、ポリ(エチレンオキシド)およびその共重合体、ポリ(ビニルアルコール)、ポリホスファゼン、マトリゲルならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される、[7]に記載の色素沈着皮膚モデル。
(1)光照射により損傷が与えられた線維芽細胞を含む第1細胞群を培養する工程、
(2)前記工程(1)で得られる第1細胞群を、第1細胞培養基材の上で、培養する工程、および
(3)前記工程(2)で得られる第1細胞群の上に、メラノサイトとケラチノサイトとを含む第2細胞群を適用し、培養する工程、
を含む、製造方法。
[10] 前記光照射により損傷が与えられた線維芽細胞が、光増感剤の存在下で、紫外光の照射により損傷が与えられた線維芽細胞である、[9]に記載の方法。
[11] 前記光増感剤が、ソラレン、NAD、リボフラビン、トリプトファン、葉酸、ポルフィリン、メチレンブルー、チノール基で保護された金ナノクラスター(AUxSRy)からなる群から選択される、[10]に記載の方法。
[12] 前記光照射が、UVAの光照射である、[9]〜[11]のいずれか1項に記載の方法。
[13] 前記第2細胞群が、多孔膜を有する第2細胞培養基材の上に播種された第2細胞群である、[9]〜[12]のいずれか1項に記載の方法。
[14] 前記第1細胞培養基材が、多孔膜を有する細胞培養基材である、[9]〜[13]のいずれか1項に記載の方法。
[15] 前記第1細胞群が、ハイドロゲル化剤とともに播種された第1細胞群である、[9]〜[14]のいずれか1項に記載の方法。
[16] 前記ハイドロゲル化剤が、コラーゲン、ゼラチン、ヒアルロナート、ヒアルロナン、フィブリン、アルギナート、アガロース、キトサン、キチン、セルロース、ペクチン、デンプン、ラミニン、フィブリノーゲン/トロンビン、フィブリリン、エラスチン、ガム、セルロース、寒天、グルテン、カゼイン、アルブミン、ビトロネクチン、テネイシン、エンタクチン/ニドジェン、糖タンパク質、グリコサミノグリカン、ポリ(アクリル酸)およびその誘導体、ポリ(エチレンオキシド)およびその共重合体、ポリ(ビニルアルコール)、ポリホスファゼン、マトリゲルならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される、[15]に記載の方法。
[17] 前記工程(2)が、アスコルビン酸、アスコルビン酸誘導体またはそれらの塩の存在下で実施される、[9]〜[16]のいずれか1項に記載の方法。
(1)[1]〜[8]および[18]のいずれか1項に記載の色素沈着皮膚モデルに、候補因子を適用し、培養する工程、
(2)前記色素沈着皮膚モデルにおける色素産生および/または色素沈着の度合いを指標として、前記候補因子の治療または予防効果を評価する工程、
を含む、方法。
(1)光照射により損傷が与えられた線維芽細胞を含む第1細胞群を培養する工程、
(2)前記工程(1)で得られる第1細胞群を、第1細胞培養基材の上で、培養する工程、
(3)前記工程(2)で得られる第1細胞群の上に、メラノサイトとケラチノサイトとを含む第2細胞群を適用し、培養する工程、
(4)候補因子を含む基材上に、前記工程(3)で得られる前記第2細胞培養群を移し替えて、培養する工程、
(5)前記第2細胞群における色素産生および/または色素沈着の度合いを指標として、前記候補因子の治療または予防効果を評価する工程
を含む、方法。
[21] 前記候補因子が、線維芽細胞である、[20]に記載の方法。
図1は、一実施形態における、色素沈着皮膚モデル1およびそれを製造する方法を説明する概略図である。一実施態様において、色素沈着皮膚モデル1は、
第1細胞培養基材11の上に播種された、光照射により損傷が与えられた線維芽細胞を含む第1細胞群100と;
前記第1細胞群100の上に適用された、メラノサイトとケラチノサイトとを含む第2細胞群200と、を含んでいる(例えば、図1(D)参照)。
(1)光照射により損傷が与えられた線維芽細胞を含む第1細胞群100を培養する工程、
(2)前記工程(1)で得られる第1細胞群100を、第1細胞培養基材11の上で、培養する工程、
(3)前記工程(2)で得られる第1細胞群100の上に、メラノサイトとケラチノサイトとを含む第2細胞群200を適用し、培養する工程、
を含む、方法によって提供することができる。
本発明は、色素沈着皮膚モデルを用いた、皮膚の色素沈着を治療または予防するための因子の評価方法を提供することができる。一実施態様において、本発明の方法は、
(1)色素沈着皮膚モデル1に、候補因子を適用し、培養する工程、
(2)記色素沈着皮膚モデル1における色素産生および/または色素沈着の度合いを指標として、前記候補因子の治療または予防効果を評価する工程、
を含んでいる。
他の実施態様において、本発明の方法は、
(1)光照射により損傷が与えられた線維芽細胞を含む第1細胞群100を培養する工程、
(2)前記工程(1)で得られる第1細胞群100を、第1細胞培養基材11上で、培養する工程、
(3)前記工程(2)で得られる第1細胞群100の上に、メラノサイトとケラチノサイトとを含む第2細胞群200を適用し、培養する工程、
(4)候補因子を含む基材上に、前記工程(3)で得られる前記第2細胞群を適用し、得られる色素沈着皮膚モデル1aを培養する工程、
(5)前記色素沈着皮膚モデル1aにおける色素産生および/または色素沈着の度合いを指標として、前記候補因子の治療または予防効果を評価する工程、
を含んでいる。
1−1.線維芽細胞の培養およびPUVA処理
1×105個の正常ヒト線維芽細胞を増殖用培地(DMEM+10%牛胎児血清)で培養した。100%コンフルエントになる前にソラレン(終濃度25ng/mL)(SigmaAldrich社製)を加えた増殖用培地に置換し、培養した。24時間後に1mLのリン酸緩衝液(PBS)で膨潤させた後、PBSを取り除き、ソラレン(終濃度25ng/mL)を加えた1mLのPBSに置換し、6J/cm2 UVA照射(SAN−EI UVE−502S)を行った(以下、「PUVA処理」という)。その後、1mLのPBSで膨潤させた後、PBSを取り除いて、増殖用培地に置換し、2〜7日程度培養した。その過程で、PUVA処理の影響で細胞が一部死滅するが、その後、生存している線維芽細胞が増殖した。PUVA未処理の同一ドナー由来線維芽細胞を上記PUVA処理線維芽細胞に対するコントロールとした(図3〜6)。
上記1−1.においてPUVA処理、またはPUVA未処理(コントロール)の線維芽細胞をそれぞれ用いて真皮モデルを作製した。簡単に述べると、上記1.の手順後、増殖用培地を取り除いて1mLのPBSで膨潤させた。その後、PBSを取り除き、細胞剥離剤(TrypLE SELECT、Thermo Fisher Scientific社製)を6穴プレートの1ウェルあたり300μL添加し、37℃ 5%CO2インキュベーター内に5分間静置し、細胞剥離処理を行った。増殖用培地を添加して反応を停止させ、15ml遠沈管に細胞懸濁液を回収した。1000rpmで5分間遠心後、上清を除去し、細胞ペレットを増殖用培地で再懸濁し、5×105個の細胞/mLとなるように調整した。6穴プレートの各ウェルに適用可能な真皮モデルを作製するにあたり、表1の組成からなるゲル懸濁液を氷上にて調製した。
上記真皮モデルとは別に、メラノサイトとケラチノサイトで構成された市販の表皮モデル(MatTek社製)を使用した(図1(C)参照)。
PUVA処理線維芽細胞を用いて作製した真皮モデルと組み合わせて10日間培養した表皮モデルを、PUVA未処理の正常線維芽細胞を用いて作製した真皮モデルと置き換え、さらに10日間培養を行った(図2(E)および(F)参照)。なお、置き換え用真皮モデル(PUVA未処理の線維芽細胞を用いて作製した真皮モデル)は、置き換える前日に作製した。
2−1.PUVA処理後の線維芽細胞
図3は、PUVA処理後及び未処理の線維芽細胞を示している。PUVA処理後の線維芽細胞は、伸長していた(図3(A))。PUVA処理後及び未処理の線維芽細胞の増殖数の変動を調べたところ、PUVA処理後の線維芽細胞は増殖速度が著しく低下していた(図3(B))。
PUVA処理後及び未処理の線維芽細胞それぞれの細胞溶解物中の老化関連因子SA−β−galの酵素活性値について調べたところ、PUVA処理後の線維芽細胞はSA−β−galの酵素活性値が著しく増加していた(図4(A))。また、SA−β−galの染色を行ったところ、PUVA処理後の線維芽細胞は著しく多数のSA−β−gal陽性細胞(青緑色)が観察された(図4(B))。
PUVA処理後及び未処理の線維芽細胞それぞれ単層培養し、PUVA処理1日前、PUVA処理0、1、3、7、14、21日目に培養上清に含まれるSCF量をELISA法で測定し、1細胞あたりの分泌量として算出したところ、PUVA処理後の線維芽細胞のSCFレベルは著しく増加していた(図5(A))。また、SCF抗体を用いてSCF染色、DAPIによる核染色を行い、SCF染色および核染色の融合画像(Merge)を作成した結果、PUVA処理後の線維芽細胞においてSCF陽性細胞が多数観察された(図5(B))。
PUVA処理後及び未処理の線維芽細胞それぞれ単層培養し、HGF抗体を用いてHGF染色、DAPIによる核染色を行い、HGF染色および核染色の融合画像(Merge)を作成した結果、PUVA処理後の線維芽細胞においてHGF陽性細胞が多数観察された(図6(A))。
図7は、PUVA処理後(A)または未処理(B)の色素沈着皮膚モデルにおける、表皮モデルの色素沈着を示す図である。PUVA処理を行った色素沈着皮膚モデルにおける、表皮モデルは、色素沈着が促進されていることが観察された。
PUVA処理線維芽細胞を用いて作製した真皮モデルと組み合わせて10日間培養した表皮モデルを、PUVA未処理の正常線維芽細胞を用いて作製した真皮モデルと置き換え、さらに10日間培養を行った結果、PUVA処理を行った色素沈着皮膚モデルにおける表皮モデルの色素沈着(図7(A))に比べて色素沈着が抑制されていることが観察された(図8)。
PUVA処理または未処理(コントロール)の色素沈着皮膚モデル、およびPUVA処理の色素沈着皮膚モデルの表皮モデルを、PUVA未処理の真皮モデル上に移し替えて培養した表皮モデル(Replace)の外観について観察したところ、PUVA処理の色素沈着皮膚モデルの表皮モデルで色素沈着が促進したのに対し、Replace条件の表皮モデルでは色素沈着が緩和している様子が観察された(図9(A))。図9(A)の画像を元に定量化を行ったところ、PUVA処理の色素沈着皮膚モデルで最も色素濃化領域の割合が高いのに対して、Replace条件の色素沈着皮膚モデルでは色素濃化領域が減少することが示された(図9(B))。
PUVA処理または未処理(コントロール)の色素沈着皮膚モデル、およびPUVA処理の色素沈着皮膚モデルの表皮モデルを、PUVA未処理の真皮モデル上に移し替えて培養した表皮モデル(Replace)で切片を作成し、フォンタナマッソン染色法により表皮モデル切片のメラニン顆粒を染色した(図10(A))。また、図10(A)の染色像を二値化処理し、メラニン顆粒領域の割合を定量化したところ、PUVA処理の色素沈着皮膚モデルで最もメラニン領域の割合が高いのに対して、Replace条件の色素沈着皮膚モデルではメラニン領域が減少することが示された(図10(B))。
PUVA処理または未処理(コントロール)の色素沈着皮膚モデル、およびPUVA処理の色素沈着皮膚モデルの表皮モデルを、PUVA未処理の真皮モデル上に移し替えて培養した表皮モデル(Replace)で切片を作成し、TRP2抗体を用いて表皮モデル切片の活性化メラノサイトを染色し、およびヘマトキシリン染色法で核を染色した(図11(A))。図11(A)の画像から活性化メラノサイトの割合を定量化したところ、PUVA処理の色素沈着皮膚モデルで最も活性化メラノサイト数の割合が高いのに対して、Replace条件の色素沈着皮膚モデルでは活性化メラノサイト数が減少することが示された(図11(B))。
10 第1真皮モデル
100 第1細胞群
11 第1細胞培養基材
110 第1多孔膜
12 第1細胞培養容器
13 第1培地
14 第2培地
10a 第2真皮モデル
100a 第3細胞群
11a 第3細胞培養基材
110a 第3多孔膜
20 表皮モデル
200 第2細胞群
21 第2細胞培養基材
210 第2多孔膜
22 第2細胞培養容器
23 第3培地
24 第4培地
RD 光照射
FB 線維芽細胞
bFB 光照射による損傷を受けた線維芽細胞
KC ケラチノサイト
MC メラノサイト
Claims (21)
- 第1細胞培養基材の上に播種された、光照射により損傷が与えられた線維芽細胞を含む第1細胞群と;
前記第1細胞群の上に適用された、メラノサイトとケラチノサイトとを含む第2細胞群と、
を含む、色素沈着皮膚モデル。 - 前記光照射により損傷が与えられた線維芽細胞が、光増感剤の存在下で、紫外光の照射により損傷が与えられた線維芽細胞である、請求項1に記載の色素沈着皮膚モデル。
- 前記光増感剤が、ソラレン、NAD、リボフラビン、トリプトファン、葉酸、ポルフィリン、メチレンブルー、チノール基で保護された金ナノクラスター(AUxSRy)からなる群から選択される、請求項2に記載の色素沈着皮膚モデル。
- 前記光照射が、UVAの光照射である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の色素沈着皮膚モデル。
- 前記第2細胞群が、多孔膜を有する第2細胞培養基材の上に播種された第2細胞群である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の色素沈着皮膚モデル。
- 前記第1細胞培養基材が、多孔膜を有する細胞培養基材である、請求項1〜5のいずれか1項に記載の色素沈着皮膚モデル。
- 前記第1細胞群が、ハイドロゲル化剤とともに播種された第1細胞群である、請求項1〜6のいずれか1項に記載の色素沈着皮膚モデル。
- 前記ハイドロゲル化剤が、コラーゲン、ゼラチン、ヒアルロナート、ヒアルロナン、フィブリン、アルギナート、アガロース、キトサン、キチン、セルロース、ペクチン、デンプン、ラミニン、フィブリノーゲン/トロンビン、フィブリリン、エラスチン、ガム、セルロース、寒天、グルテン、カゼイン、アルブミン、ビトロネクチン、テネイシン、エンタクチン/ニドジェン、糖タンパク質、グリコサミノグリカン、ポリ(アクリル酸)およびその誘導体、ポリ(エチレンオキシド)およびその共重合体、ポリ(ビニルアルコール)、ポリホスファゼン、マトリゲルならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項7に記載の色素沈着皮膚モデル。
- 色素沈着皮膚モデルの製造方法であって、
(1)光照射により損傷が与えられた線維芽細胞を含む第1細胞群を培養する工程、
(2)前記工程(1)で得られる第1細胞群を、第1細胞培養基材の上で、培養する工程、および
(3)前記工程(2)で得られる第1細胞群の上に、メラノサイトとケラチノサイトとを含む第2細胞群を適用し、培養する工程、
を含む、製造方法。 - 前記光照射により損傷が与えられた線維芽細胞が、光増感剤の存在下で、紫外光の照射により損傷が与えられた線維芽細胞である、請求項9に記載の方法。
- 前記光増感剤が、ソラレン、NAD、リボフラビン、トリプトファン、葉酸、ポルフィリン、メチレンブルー、チノール基で保護された金ナノクラスター(AUxSRy)からなる群から選択される、請求項10に記載の方法。
- 前記光照射が、UVAの光照射である、請求項9〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第2細胞群が、多孔膜を有する第2細胞培養基材の上に播種された第2細胞群である、請求項9〜12のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第1細胞培養基材が、多孔膜を有する細胞培養基材である、請求項9〜13のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第1細胞群が、ハイドロゲル化剤とともに播種された第1細胞群である、請求項9〜14のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ハイドロゲル化剤が、コラーゲン、ゼラチン、ヒアルロナート、ヒアルロナン、フィブリン、アルギナート、アガロース、キトサン、キチン、セルロース、ペクチン、デンプン、ラミニン、フィブリノーゲン/トロンビン、フィブリリン、エラスチン、ガム、セルロース、寒天、グルテン、カゼイン、アルブミン、ビトロネクチン、テネイシン、エンタクチン/ニドジェン、糖タンパク質、グリコサミノグリカン、ポリ(アクリル酸)およびその誘導体、ポリ(エチレンオキシド)およびその共重合体、ポリ(ビニルアルコール)、ポリホスファゼン、マトリゲルならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項15に記載の方法。
- 前記工程(2)が、アスコルビン酸、アスコルビン酸誘導体またはそれらの塩の存在下で実施される、請求項9〜16のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項9〜17のいずれか1項に記載の方法により得られる、色素沈着皮膚モデル。
- 皮膚の色素沈着を治療または予防するための因子の評価方法であって、
(1)請求項1〜8および請求項18のいずれか1項に記載の色素沈着皮膚モデルに、候補因子を適用し、培養する工程、
(2)前記色素沈着皮膚モデルにおける色素産生および/または色素沈着の度合いを指標として、前記候補因子の治療または予防効果を評価する工程、
を含む、方法。 - 皮膚の色素沈着を治療または予防するための因子の評価方法であって、
(1)光照射により損傷が与えられた線維芽細胞を含む第1細胞群を培養する工程、
(2)前記工程(1)で得られる第1細胞群を、第1細胞培養基材の上で、培養する工程、
(3)前記工程(2)で得られる第1細胞群の上に、メラノサイトとケラチノサイトとを含む第2細胞群を適用し、培養する工程、
(4)候補因子を含む基材上に、前記工程(3)で得られる前記第2細胞群を適用し、得られる色素沈着皮膚モデルを培養する工程、
(5)前記色素沈着皮膚モデルにおける色素産生および/または色素沈着の度合いを指標として、前記候補因子の治療または予防効果を評価する工程
を含む、方法。 - 前記候補因子が、線維芽細胞である、請求項20に記載の方法。
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