KR20090054505A - Ｒｈｏ ＧＤＩ-α를 포함하는 멜라닌 생성 조절용 조성물및 Ｒｈｏ ＧＤＩ-α를 이용하여 멜라닌 생성 조절제를스크리닝하는 방법 - Google Patents

Abstract

Rho GDI-α 단백질 또는 그 단백질을 코딩하는 유전자를 이용하여 멜라닌 생성을 억제하는 조성물과 Rho GDI-α 단백질을 이용하여 멜라닌 생성을 억제하는 물질을 스크리닝하는 방법이 개시된다. 또한, Rho GDI-α의 발현을 저해하는 siRNA 유전자를 이용하여 멜라닌 생성을 촉진하는 조성물과 siRNA 유전자를 이용하여 멜라닌 생성을 촉진하는 물질을 스크리닝하는 방법이 개시된다. 본 발명을 이용하면 멜라닌 생성을 효과적으로 촉진 또는 억제할 수 있으며 멜라닌 생성을 촉진 또는 억제하는 물질을 효과적으로 스크리닝할 수 있다.

Rho GDI-α, MITF, 타이로시나제, 멜라닌 생성 촉진, 멜라닌 생성 억제, 멜라닌

Description

Ｒｈｏ ＧＤＩ-α를 포함하는 멜라닌 생성 조절용 조성물 및 Ｒｈｏ ＧＤＩ-α를 이용하여 멜라닌 생성 조절제를 스크리닝하는 방법{Composition for controlling melanogenesis containing Rho GDI-α, and method for screening melanogenesis modulator using Rho GDI-α}

본 발명은 Rho GDI 해리 저해제(dissociation inhibitor)-알파 (Rho GDI-α, ARHGDIA) 단백질, 또는 그 단백질을 코딩하는 유전자, 또는 그 유전자에 상보적인 서열을 갖는 유전자 또는 그 단편을 이용하여 멜라닌 생성량을 조절하는 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 Rho GDI-α 단백질, 또는 그 단백질을 코딩하는 유전자, 또는 그 유전자에 상보적인 서열을 갖는 유전자 또는 그 단편을 이용하여 멜라닌 생성을 촉진하거나 억제하는 물질을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.

멜라닌은 자색에서 검은색을 띠는 유멜라닌(eumelanin)과 황색에서 적색을 띠는 페오멜라닌(pheomelanin) 두 종류가 있다. 멜라닌은 표피의 기저층에 존재하는 멜라닌 세포에 의해 생산되고 주변 각질형성세포로 전이되어 피부색을 나타낸 다. 피부색의 변화는 이러한 멜라닌 세포 수의 변화, 멜라닌 소체의 생산이나 구조의 이상, 멜라닌 소체의 멜라닌화 이상, 각질세포의 이동 정도 및 멜라닌의 소실되는 정도 등 여러 가지 요인에 의하여 결정된다. 이들은 유전, 대사, 내분비, 영양, 염증, 감염, 종양, 물리적 및 화학적 요인들에 의하여 크게 좌우된다. 이러한 멜라닌이 생성되는 것을 억제하는 것은 미백 화장품 연구의 주류를 이루어 왔다.

종래의 미백 화장품 연구는, 멜라노사이트 내에서의 멜라닌 생성을 억제하는 것과 멜라노사이트 자극 물질을 조절하는 것, 그리고 멜라닌 배설을 촉진시키는 것으로 크게 3가지 방향으로 이루어지고 있다.

멜라닌 생성을 억제하는 것은 멜라닌 생성에 관여하는 효소인 타이로시나제(tyrosinase)의 활성부위의 필수요소인 구리(Cu)를 제어하거나 타이로시나제 관련 단백질 I(TRP-1：tyrosinase related protein I) 및 타이로시나제 관련 단백질 II(TRP-2：tyrosinase related protein II)의 필수요소인 철이온(Fe)을 제어하여 효소활성을 불활성화시키거나 멜라닌 생성 중간체의 생성을 억제하는 물질의 개발이 주를 이루었다. 코지산(kojic acid), 알부틴(arbutin), 비타민 C 유도체, 루시놀(rucinol) 등이 대표적인 미백제로 알려져 있다. 미백 화장품에는 이들 미백 성분 외에도 보조성분으로 자외선 차단제가 함유되어있는 경우가 많으며, 화장품에 함유되는 기능성 성분들의 효과를 극대화하기 위한 안정성, 경피 흡수에 관한 기술개발 관련 연구가 진행되고 있다. 특히 핵심성분인 레티놀, 비타민 C, 알부틴, 스핑고리피드 등은 빛, 온도, 공기 등에 매우 불안정하므로 이를 극복하기 위한 원료 안정화 기술에 대한 연구가 활발한 편이다.

미백 화장품은 자외선에 의한 기미, 주근깨 등을 완화시키고 멜라닌 색소의 생성을 억제하는 목적으로 개발된 제품이다. 대표적인 새로운 물질로는 타이로신의 산화를 촉매하는 효소인 타이로시나제의 활성을 저해하여 멜라닌 생성을 억제하는 상지(mulberrin) 추출물, 닥나무(kazinol F) 추출물, 반하 추출물 등이 개발되어 미백 제품의 차별화 원료로 제품에 이용되고 있다. 현재 식약청에 고시된 미백 화장품의 원료는 닥나무 추출물, 알부틴, 에틸아스코르빌 에테르, 유용성 감초 추출물 등이 있다.

멜라노사이트 세포를 활성화하는 인자들은 엔도세린 (endothelin-1), 멜라노사이트 자극 호르몬 (α-MSH), 일산화질소, 히스타민 (histamine), 피리딘 다이머(pTpT) 등을 포함하여 십 여종에 달한다. 현재 멜라노사이트 활성화를 유도하는 정보 전달 물질들의 활성을 저해하는 성분들이 식물 추출물에서 다수 발견되고 있고, 이밖에 태반 추출물은 조직대사의 항진작용이나 각질층의 박리를 촉진시켜 미백 화장품 소재로 널리 이용되고 있고, 표피세포의 분열을 촉진시키는 레티노인산이 노인성 색소반에 유효한 것으로 보고 되고 있다.

향후에는 케라티노사이트의 증식, 분화를 회복시키거나 낡은 각질층의 박리작용을 촉진시켜 결과적으로는 대사를 항진시키는 소재들이 멜라닌 배설을 촉진시키는 기능을 가질 것으로 기대된다.

최근 인간 유전체 연구가 완성단계에 도달함에 따라 피부 미백 메카니즘에서 가장 중요한 역할을 담당하고 있는 타이로시나제 유전자의 프로모터 영역을 제어하여 타이로시나제 단백질의 합성을 제어할 수 있는 저해제나 타이로시나제의 mRNA을 불활성화하는 저해제 등 유전자 레벨에서의 연구결과를 활용한 미백제의 개발이 진행될 전망이다.

본 발명의 일실시예의 목적은, 멜라닌 생성을 조절하는 것이다.

본 발명의 다른 일실시예의 목적은, 멜라닌 생성을 억제하는 것이다.

본 발명의 또 다른 일실시예의 목적은, 멜라닌 생성을 촉진하는 것이다.

본 발명의 또 다른 일실시예의 목적은, 멜라닌 생성을 조절하는 물질을 스크리닝하는 것이다.

본 발명의 또 다른 일실시예의 목적은, 멜라닌 생성을 촉진하는 물질을 스크리닝하는 것이다.

본 발명의 또 다른 일실시예의 목적은, 멜라닌 생성을 억제하는 물질을 스크리닝하는 것이다.

본 발명의 일실시예에 따른 멜라닌 생성 조절용 조성물은, Rho GDI-α 단백질, 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자, 또는 상기 유전자에 상보적인 서열을 갖는 유전자 또는 그 단편을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일실시예에 따른 멜라닌 생성 조절제 스크리닝 방법은, 시험 물질에 대하여 멜라닌 생성 조절 여부를 스크리닝하는 방법으로서, 상기 시험 물질이 Rho GDI-α의 발현, 활성 또는 기능을 조절하는지 여부를 확인하는 것을 포함하는것을 특징으로 한다.

본 발명을 이용하면, 멜라닌 생성을 억제하거나 촉진할 수 있으며, 멜라닌 생성을 억제하거나 촉진하는 물질을 스크리닝할 수 있다. 이를 통해, 멜라닌 생성 억제 또는 촉진에 유용한 물질을 얻을 수 있다.

신경 능으로부터 유래된 멜라노블라스트(Melanoblast)는 표피로 이동하여 수지상돌기(Dendrite)가 있는 세포인 멜라노사이트로 분화되고 이곳에서 멜라닌이 형성된다. 이러한 과정에서 필수적으로 작용하는 인자들에 대하여 언급하고자 한다. 멜라노사이트의 생존과 번식, 분화를 조절하는 요소들로는 Wnt, 섬유아세포 성장인자(fibroblastgrowth factor :FGF/FGF2), 골형성 단백질(bonemorphogenetic protein: BMP) 그룹, 간세포 성장 인자/소진 인자(hepatocyte growth factor/scatter factor)(HGF/SF), 비만/줄기 세포 인자(mast/stem cell factor)(M/SCF), 엔도세린, 멜라노트로핀(melanotropin) 등이다. Wnt/베타 카테닌 신호 경로가 먼저 활성화 되어지면 KIT, ET3/엔도세린(endothelin) B와 간세포 성장 인자(hepatocyte growth factor)(HGF)/MET 등이 활성화 되어진다. Wnt는 신호전달 단백질로 배발생 단계에서 줄기세포 조절과 같은 다양한 발생과정에 관여하며, Frizzled receptor 그룹을 활성화 시켜 글리코겐 신타제 키나제 3베타(glycogen synthase kinase 3β:GSK3β) 효소를 통하여 베타-카테닌(β-catenin)을 조절하게 된다. 인산화된 글리코겐 신타제 키나제 3베타 효소는 MITF의 유비퀴티오네이션(ubiquitionation) 및 분해(degradation)를 유도하게 된다. 베타-카테닌이 축적되어 핵내로 이동하게 되면 LEF/TCF 전사 인자와 결합하여 결론적으로 MITF 유전자 발현을 활성화시키게 된다. 멜라닌자극호르몬(α-MSH)이 멜라닌 자극호르몬수용체(MC1-R: melanocortin-1 receptor)와 결합하여 아데닐일 사이클레이즈(adenylyl cyclase)를 활성화시키게 되고, cAMP 수준이 증가하게되면 cAMP-dependent protienkinase(PKA)가 CREB(cAMP response element binding protein)을 인산화시켜 결국은 멜라노사이트 특이적인 MITF 프로모터를 활성화시킨다.

멜라닌 합성의 주요한 3가지의 효소인 타이로시나제, 타이로시나제 관련 단백질 I, 타이로시나제 관련 단백질 II는 모두 MITF DNA 결합 부위를 지니고 있어 이들 프로모터 영역과 MITF DNA의 결합으로 이들 멜라닌 합성 관련 효소들의 유전자가 활성화 되어진다. Steel factor/C-kit receptor는 초기 멜라노사이트 전구체의 발달에 필수적인 역할을 한다. C-kit은 혈소판 유래 성장 인자(platelet-derived growth factor)(PDGF)에 속하는 타이로신 카이네이즈(tyrosine kinase)로써 배아 멜라노블라스트(embryonic melanoblast)의 성장과 분화에 영향을 미친다. 다시 말하면, 세포벽의 표면에서 스틸 인자(steel factor)는 KIT 수용체와 결합하여 타이로신 잔기에 포스페이트기를 대체하고 타이로신은 비활성(inactive)에서 활성(active) 형태로 전환하여 줌으로써 배아 멜라노블라스트(embryonic melanoblast)의 성장과 분화를 조절한다

멜라노사이트는 발달하는 동안 생존과 번식은 활성화된 MET가 간세포 성장 인자(hepatocyte growth factor(HGF)) 리간드와의 결합에 의해 나타나는데, 멜라노블라스트에서 MET 유전자가 손실되면 초기 신경능의 이동에 문제가 나타나게 되고 HGF가 과발현되거나 피부 표피의 멜라노사이트 분포가 증가하게 된다. 엔도세린(endothelins)은 성장인자(growth factor)로 엔도세린 단백질은 ET1, ET2, ET3 3개로 구분되어져 있고, EDNRA,EDNRB의 엔도세린 수용체(endothelin receptor)가 존재하고 있다. ET3는 EDNRB와의 결합은 멜라노블라스트의 생존과 이동에 매우 필수적인 요소로 작용하여 돌연변이가 생길 경우 멜라노사이트의 손실을 초래하게 된다.

위에서 언급한 멜라노사이트 활성인자들에 의해 멜라노사이트 특이적인 최종 목표 유전자가 활성화되고 결국은 멜라닌 합성 관련 효소들이 형성이 되는 것이다.핵에서 만들어진 멜라닌 관련 효소 유전자들이 소포체(endoplasmic reticulum)와 골지(golgi)를 통하여 이동하면서 당화(glycosylation)가 이루어지는데 이때 완성된 단백질의 형태를 지니게 되어 멜라닌 합성에 중요한 인자로 작용한다. 이는 세포벽과 결합된 소기관인 멜라노좀으로 이동하여 멜라닌을 형성하게 된다. 결국 멜라노사이트에서 형성된 멜라닌은 멜라노좀을 통하여 케라티노사이트로 이동하여 피부표피의 색을 결정하게 되는 것이다. 멜라노좀이 이동하는데 관여하는 인자로는 Rab 27a, Myosin Va 등이 있고, 멜라노좀의 케라티노사이트로의 이동에는 3가지 가설이 제기되고 있다. 멜라노사이트로부터 세포간으로 방출된 후 케라티노사이트에의 흡수, 멜라노사이트와 케라니토사이트의 혈장 막 융합(plasma membrane fusion), 멜라노사이트 수지상 돌기부분의 케라티노사이트로의 함몰(exocytosis)이 그것이다.

일반적으로 Aplysia Ras-related homologs(ARHs)들은 소위 Rho 유전자로 불리며, 작은 구아닌 뉴클레오티드(small guanine nucleotide) 교환(GTP/GDP) 인자를 암호화하는 Ras Superfamily 유전자 계열에 속한다. ARH 단백질들은 Rho GDI-α 단백질과의 상호작용을 통해 GDP-부착상태에서 불활성화 상태를 유지한다. Rho GDI-α (ARHGDIA)의 유전자는 6개의 액손들로 이루어져 있으며, 각종 조직과 세포에서 발현되고 있는 것이 알려져있다. 진핵세포의 단백질이나 지질은 세포가 분화될 때 두배의 단백질과 지질을 필요로 하며, 이외에도 손상을 받은 단백질인 경우는 지속적으로 대체되어야 한다. 따라서 합성된 단백질은 그들이 가진 신호에 따라 세포 내 소기관으로 이동하여 세포내 소기관의 구성단백질로 이용되거나 또는 조절단백질로서 활성을 조절함으로써 세포의 생명현상의 유지에 참여한다. 합성된 단백질은 다른 최종 목적지인 소기관으로 이동하게 되는데, 이때 비히클을 이용하여 수송된다. 비히클-결합 형태(Vesicle-binding form)와 GDP-결합 형태(GDP-binding form)를 순환(cycling) 하면서 단백질 수송에 관여한다.

단일 폴리펩티드로 된 소 GTPase(small GTPases)는 20~40 KDa의 저분자량으로 GTP를 가수분해하여, 소 GTP-결합 단백질(small GTP-binding proteins) (small G proteins)이라고도 한다. 이들 소 GTPase(small GTPases)는 다양한 기능을 가지고 있어, 유전자 표현조절(gene expression), 세포증식(proliferation), 세포이동(chemotaxis), 세포골격 재배열(cytoskeletal rearrangement) 등과 관련되어 있다. 세포의 신호전달시 소 GTPase(small GTPases)는 분자 스위치로 작용하여, 비 활성화된 GDP 결합상태 (세포질 내에 대부분 존재)와 활성화된 GTP 결합상태 (세포막에 주로 존재)를 오고 가게 된다. 대부분의 소 GTPases는 C-말단에 이소프레노이드(isoprenoid)들이 결합, 번역후 변형(post-translational modification)되어 활성화된다. 이소프레노이드(Isoprenoid)는 파네실(farnesyl)과 제라닐(geranyl)의 두 종류가 있어, Ras는 파네실화(farnesylation)에 의하여, Rho는 제라닐화( geranylation)에 의하여 활성화된다. 활성화에는 구아닌 뉴클레오티드 교환 인자 (guanine nucleotide exchange factor) (GEF) 가 필요하며, 비활성화 GTPases를 활성화 상태로 변환시킨다. 비활성화에는 GTPase 활성화 단백질 (GAP)이 필요하며, GTP 가수분해를 촉진시켜 GTPase가 비활성화된 GDP 결합상태로 변환시킨다. 또한 GTPase 기능 조절 인자로 GDP 해리 인자(dissociation inhibitor) (GDI)가 있으며 이들의 기능연구도 활발히 되고 있다.

Rho GTPase의 종류와 기능을 살펴보면,지금까지 Rho는 인체 내에 20여 가지가 알려져 있다. Rho는 액틴 세포골격 어셈블리(actin cytoskeleton assembly), 평활근 (SMC) 수축, 세포와 세포의 부착 (adhesion), 세포 운동과 이동, 유전자 전사, 효소 활성화 등의 여러 가지 기능을 가지고 있다. Rho는 Rac, Rho, Cdc42 세 가지로 크게 나눌 수 있고, 각각은 서로의 기능에 영향을 미친다. RhoA, B, C, Rac 1, 2, 3, Cdc42, RhoD, Rnd1, Rnd2, PhoE/Rnd3, RhoG, TC10 등이 밝혀져 있다. 액틴 세포골격 어셈블리에서 Rho는 스트레스 섬유 (stress fiber)와 국소 유착 (focal adhesion)을, Rac는 세포 주변에 라멜리포디아(lamellipodia)를 형성하고, Cdc42는 마이크로스파이크(microspikes) 혹은 필로포디아(filopodia)를 형성한다. 성장인자나 자극물질에 의하여 이러한 기능을 나타내는데 Rho는 리소파티딕산(lysophatidic acid) (LPA), Rac는 PDGF, 인슐린, Cdc42는 브라디키닌(bradykinin), IL-1 등에 의하여 유발된다. 인체내 Rho는 85 가지의 활성자들 (GEFs)과 70 가지의 비활성자들 (GAPs) 에 의하여 조절된다. GDIs는 현재 Rho GDI-α, b, g 세 종류가 알려져 있다. 이들 조절인자는 아직까지도 그 기능이 정확하게 알려진 게 많지 않다.

본 발명자들은 Rho GDI-α의 증가는 멜라닌 합성을 저해하며, Rho GDI-α의 감소는 멜라닌 합성을 증가시킨다는 사실을 밝혀내었다. Rho GDI-α의 감소는 MITF 및 타이로시나제의 발현과 활성의 증가를 촉진함으로써 멜라닌 생성을 촉진하고, Rho GDI-α 의 증가는 MITF 및 타이로시나제의 발현과 활성의 증가를 억제함으로써 멜라닌 생성을 억제할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따른 멜라닌 생성 조절용 조성물은 멜라닌 생성을 억제하는 조성물이며, 상기 유효성분은 Rho GDI-α 단백질 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자일 수 있다. 여기에서, Rho GDI-α 단백질을 암호화하는 유전자는 유리된 상태일 수도 있고 벡터에 삽입되어 있는 형태일 수 있다.

본 발명의 다른 일실시예에 따른 멜라닌 생성 조절용 조성물은 멜라닌 생성을 촉진하는 조성물이며, 유효성분은 Rho GDI-α 단백질을 암호화하는 유전자 서열에 상보적인 서열을 갖는 유전자 또는 그 단편일 수 있다. 단편인 경우, 바람직한 길이는 19~40bp이다. 더 바람직하게는 19~30bp이며, 보다 바람직하게는 19~25bp 이다. 상기 유효성분은 Rho GDI-α의 mRNA에 결합하는 siRNA(small interfering RNA)일 수 있다.

siRNA의 세포 내로의 도입은 미세 주입법 (Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980)), 칼슘 포스페이트 공동-침전법 (Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973)), 전기 천공법 (Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982)) 또는 리포좀 이용법 (Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980)) 등을 이용하여 실시할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일실시예에 따른 조성물이 화장품 제형인 경우에는, 화장품학적으로 허용가능한 매질 또는 기제를 함유한다. 이는 국소적용에 적합한 모든 제형으로, 예를 들면 용액, 겔, 고체 또는 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀) 및/또는 비이온형의 소낭 분산제의 형태로, 또는 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실 스틱의 형태로 제공될 수 있다. 이들 조성물은 당해 분야의 통상적 방법에 따라 제조될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따른 조성물이 의약품 제형인 경우에는, 본 발명의 일실시예에 따른 Rho GDI-α을 암호화하는 유전자 혹은 단백질을 유효성분으로 하여 상용되는 무기 또는 유기의 담체를 가하여 고체, 반고체 또는 액상의 형태로 비경구 투여제(주사, 경피 투여 또는 외용도포)로 제제화할 수 있다. 비경구 투여를 위한 제재로는 국소 주사용 제제, 연고, 로션, 스프레이, 현탁제 등을 들 수가 있다.

본 발명의 일실시예에 따른 조성물의 유효성분을 제제화 하기 위해서는 통상의 방법에 따라서 실시하면 용이하게 제제화할 수 있으며 계면활성제, 부형제, 착색료, 향신료, 보존료, 안정제, 완충제, 현탁제, 기타 상용하는 보조제를 적당히 사용할 수 있다.

적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remingon's Pharmaceutical Sciences (19^th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 일실시예에 따른 Rho GDI-α 및 그 유전자의 투여량은 치료 받을 대상의 연령, 성별, 체중과, 치료할 특정 질환 또는 병리 상태, 질환 또는 병리 상태의 심각도, 투여경로 및 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 주사제를 제외한 제재에 대해서는 멜라닌 억제가 발생되는 부위에 외용 도포하는 식으로 당업자의 수준에서 적용할 수 있고, 주사제의 경우에는 멜라닌 억제가 진행된 피부에 국소적으로 주사할 수 있다. 일반적으로 투여량은 0.001ng/kg/일 내지 대략 2000mg/kg/일의 범위이다. 더 바람직한 투여량은 단백질의 경우 1㎍/kg/일 내지 1mg/kg/일이며, 유전자의 경우 50ng/kg/일 내지 200ng/kg/일이다.

본 발명의 일실시예에 따른 조성물의 유효성분인 Rho GDI-α 단백질은 멜라닌 생성 억제 또는 멜라닌 생성 촉진을 할 수 있는 한 천연의 아미노산 서열의 아미노산 잔기가 다른 잔기로 치환, 결실 또는/및 첨가되어 다양하게 변형된 형태일 수 있으며, 또한 인산화, 당화, 메틸화, 파네실화 등의 변형이 일어난 형태일 수도 있다.

본 발명의 유전자 및 그 단편은, 변형된 뉴클레오타이드로 이루어질 수도 있다. 예컨대, 2'-O-알킬 (예: 메틸, 에틸), 2'-O-알릴, 2'-O-알릴과 같은 2'-치환된 라이보스를 포함하는 뉴클레오타이드를 부분적으로 또는 전체적으로 포함할 수 있다. 또한, 치환된 염기를 갖는 뉴클레오타이드를 부분적으로 또는 전체적으로 포함할 수도 있다.

본 발명의 일실시예에서, Rho GDI-α 또는 그 유사 단백질을 암호화하는 유전자 또는 Rho GDI-α의 발현을 억제하는 siRNA를 투여하기 위하여 여러가지 방법을 사용할 수 있다. 바이러스성 벡터 또는 비바이러스성 벡터를 이용하여 유전자를 투여할 수 있는데, 바이러스성 벡터로는, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스 등이 있고, 비바이러스성 벡터로는, 마이셀 또는 리포좀과 같은 구조 등이 있으며, DNA를 벡터 없이 전기 천공법(electroporation) 또는 유전자총(gene gun)을 이용하여 투여할 수도 있다. 특히, 리포좀에 Rho GDI-α 또는 그 유사 단백질을 암호화하는 유전자를 운반하여 투여할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따른 멜라닌 생성 조절제 스크리닝 방법에 있어서, 상기 Rho GDI-α의 발현을 조절하는지 여부는 당업계에 널리 공지된 방법인 RT-PCR 또는 ELISA 및 웨스턴블럿(immuno blot)을 이용하여 결정될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따른 멜라닌 생성 조절제 스크리닝 방법에 있어서, 상기 확인 결과, 상기 시험 물질이 Rho GDI-α의 발현, 활성 또는 기능을 촉진하는 경우 멜라닌 생성 억제제로 판정하는 것을 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 일실시예에 따른 멜라닌 생성 조절제 스크리닝 방법에 있어서, 상기 확인 결과, 상기 시험 물질이 Rho GDI-α의 발현, 활성 또는 기능을 억제하는 경우 멜라닌 생성 촉진제로 판정하는 것을 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 일실시예에 따른 멜라닌 생성 조절제 스크리닝 방법은, Rho GDI-α의 프로모터 및 리포터 유전자를 포함하는 플라스미드를 세포에 트랜스펙션시키는 단계; 상기 세포에 시험 물질을 처리하는 단계; 및 상기 시험 물질이 상기 리포터 유전자의 발현을 촉진하는지 또는 억제하는지의 여부를 확인하는 단계를 포함할 수 있다.

Rho GDI-α의 발현 정도를 이용한 멜라닌 생성 억제제 혹은 촉진제 스크리닝은 시험 물질이 Rho GDI-α 단백질의 발현을 촉진 혹은 억제하는지를 면역검정법(예를 들어 ELISA 또는 Immunoblot)으로 확인하거나, Rho GDI-α 의 프로모터를 포함하는 리포터 유전자를 포함하는 플라스미드를 세포에 트랜스펙션(transfection)시키고 상기 세포에 시험 물질을 처리하여 상기 시험 물질이 상기 리포터 유전자의 발현을 촉진 혹은 억제하는지 여부를 확인하는 방법으로 수행될 수 있다.

상기 멜라닌 억제제 혹은 촉진제 스크리닝을 위한 리포터 유전자 분석(assay)법은, 일반적인 분자생물학 기법에 의해 제조된 리포터 유전자 벡터를 이용한다. 리포터 유전자로는 반딧불(firefly) 루시퍼라제(luciferase) 유전자 또는 가우시아 루시퍼라제 유전자 (GLuc) 등을 사용할 수 있다. Rho GDI-α 의 프로모터 는 당업자가 미국 NCBI 데이터베이스로부터 유전자 ID를 이용하여 쉽게 디자인하여 얻을 수 있다. 일차 배양한 멜라노사이트 혹은 불멸화된 멜라노사이트나 멜라노마 세포에 상기 준비된 플라스미드를 트랜스펙션시킨 후 12시간이 경과된 시점에 멜라닌 생성 억제제 혹은 촉진제 후보 약물을 처리하고 루시퍼라제 활성을 루미노미터(Luminometer)로 측정하면, 억제제 또는 촉진제 후보 약물이 Rho GDI-α 의 발현에 미치는 영향을 확인할 수 있다.

이하, 하기 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명이 이들 예로만 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1] Rho GDI-α의 발현량 변화에 따른 멜라닌 생성 억제 및 생성확인

본 실험에서는 C57/BL 마우스에서 유래한 Melan-a 멜라노사이트 세포(D.C.Bettett, St.George's hospital medical school, USA) 를 배양하여 RT-PCR을 수행하였다. 세포는 우태아혈청이 10% 들어 있는 RPMI-1640 배지에 6개의 구멍을 가진 플레이트 구멍 하나 당 세포수가 1X10⁵ 이 되도록 깔았다. 24시간 동안 세포가 기벽에 붙도록 한 후 각기 실험군의 실험시료를 투여하였다.

Rho GDI-α 가 실제로 멜라닌 합성 (melanogensis)을 촉진 혹은 감소시켜줄 수 있는지를 알아보았다. 우선, 멜라닌 합성에 있어서 초기 단계에 중요하다고 알려진 MITF (Microphthalmia-associated transcription factor)와 타이로시나제 (Tyrosinase)와 관련하여 이 유전자의 활성을 변화시켜는지를 알아보고, 또한 멜라닌 합성의 최종 생성물인 멜라닌의 생성량도 측정을 하였다.

6공 세포배양 플레이트에 Rho GDI-α 유전자가 삽입된 pCMV-SPORT6 벡터(invitrogen, USA) 0.5 및 1μg/ml의 농도 각각을 Fugene 6 HD(Roche ,USA)를 이용하여 세포내로 주입하였다. 대조군은 pCMV-SPORT6에 Rho GDI-α 유전자가 없는 벡터를 도입하였다. 주입 후 각각 12, 24, 48 시간 동안의 MITF와 타이로시나제의 mRNA를 RT-PCR로 확인하였다. 이때 MITF와 타이로시나제의 어닐링 온도는 각각 58도, 60도이며 싸이클수는 각각 27과 24이었다.

그 결과, Rho GDI-α를 일시적으로(transiently) 발현시키면 MITF와 타이로시나제의 mRNA의 양이 감소하는 것을 볼 수 있다. 이는 멜라닌 합성이 저해되고 있음을 간접적으로 증명하고 있는 것이다(도 1의 a).

또한 Rho GDI-α 의 siRNA (invirogen, USA) 20nmol/ml을 Fugene 6 HD(Roche ,USA)를 이용하여 Rho GDI-α의 mRNA 의 발현을 감소시켰다. 이때 대조군은 Rho GDI-α Scrambled siRNA (invitrogen, USA)를 도입하였다. 그 결과, MITF와 티로시나아제의 mRNA의 양이 증가하는 것을 관찰할 수 있다. 이는 멜라닌 합성이 증가되고 있음을 간접적으로 증명하고 있는 것이다(도 1의 b).

한편, Rho GDI-α가 멜라닌 합성에 관련한 중요한 단백질인 타이로시나제 의 발현과 활성에 미치는 영향에 대하여도 실험을 수행하였다. Rho GDI-α가 삽입 된 pCMV-SPORT6 벡터(invitrogen,USA) 1 μg/ml를 이용하여 일시적으로(transiently) 발현시켰다. 이렇게 준비된 세포를 이용, 타이로시나제의 발현량과 활성의 변화 및 총멜라닌 양을 측정하였다. 타이로시나제(tyrosinase) 발현량은 Immuno Blotting을 이용하여 측정하였고, 활성 저해 측정은 Dopa 염색법을 이용하여 측정하였으며, 총멜라닌 양은 1N NaOH로 녹여 405nm 에서 흡광도를 측정하였다.

상기 단계에서 확보된 Rho GDI-α를 일시적으로(transiently) 발현시킨 melan-a 세포와 Rho GDI-α 의 siRNA를 처리한 melan-a 세포에 차가운 PBS로 한 번 씻은 후, 세포를 용해하여 일부는 Immunoblot을 수행하여 티로시나아제의 단백질 발현을 확인하고, 일부는 Tris - Glycine 젤에 로딩하여 Dopa 염색을 실시하여 티로시나아제의 활성을 확인하였다. 이 때 Dopa 염색은 0.5M 포스페이트 버퍼와 0.1% Dopa/80mM 포스페이트 용액을 사용해서 인큐베이션 한 후 젤을 건조하여 확인하였다.

또한 세포를 용해하고 남은 펠릿을 1N NaOH에 녹여 405nm에서 흡광도를 측정하여 총 단백질 대비 총 멜라닌 양을 측정하였다. 그 결과는 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타난 바와 같이, MITF와 같이 Rho GDI-α 의 양을 증가시키면 타이로시나제의 발현(도 2의 a) 과 활성(도 2의 b)이 모두 감소되는 것을 관찰할 수 있다. 이는 멜라닌 합성이 저해되고 있음을 간접적으로 증명하고 있는 것이다.

또한 Rho GDI-α 의 siRNA (invirogen, USA) 10 과 20nmol/ml을 이용하여 Rho GDI-α의 mRNA 의 발현을 감소시키면 티로시나아제의 단백질 발현(도 2a) 및 활성(도 2b)이 증가하는 것을 관찰할 수 있다. 이는 멜라닌 합성이 증가되고 있음 을 간접적으로 증명하고 있는 것이다.

직접적으로 멜라닌 합성 억제 및 증가를 살펴보기 위해 멜라닌의 총량을 측정하였다(도 2의 c). 대조군에 비해 Rho GDI-α 클론을 처리한 결과 약 30% 정도의 멜라닌 생성이 줄어드는 것을 관찰할 수 있으며, Rho GDI-α의 siRNA(20nmol/ml)를 처리하면 약 90%의 멜라닌 생성이 증가하는 것을 관찰할 수 있다.

[실시예 2] Rho GDI-α의 MITF 프로모터 활성 효과

본 실험에서는 MITF 프로모터가 포함된 melan-a 세포 시스템을 이용하여 Rho GDI-α 에 대한 MITF 활성을 GLuc 분석을 이용하여 측정하였다. 그리고 이때 사용된 세포를 이용하여 멜라닌 양 또한 정량하였다.

구체적으로는 세포 배양 접시에서 소량의 배지를 따서 측정 플레이트로 옮긴 후, 이 배지에 1X GLuc assay working solution(NEB)을 4:1의 비율로 넣고 루미노미터를 이용해서 470nM에서 발생하는 빛의 양을 측정하였다. 24공 평판 플레이트를 이용하여 5X10⁴개의 세포를 깐 뒤에 Rho GDI-α의 siRNA는 20nmol/ml을 Fugene 6 HD (Roche, USA)를 이용하여 처리하였다. Rho GDI-α가 삽입된 pCMV-SPORT6 벡터(invitrogen, USA)는 IBMX 100μM과 함께 0.5mg/ml을 Fugene 6 HD (Roche, USA)를 이용하여 처리하였다. IBMX 100μM 은 양성 대조군으로 사용되었다. 물질 처리 후 배양 12시간, 24시간, 48시간에 GLuc 분석을 하였다. 상기 분석 결과는 도 3의 a 에 나타나 있다.

여기에 1N NaOH를 첨가하여 세포를 녹인 후에 OD 405 nm 파장에서 흡광도를 측정하여 멜라닌의 양을 측정하였다. 멜라닌 양 측정 결과는 도 3의 b 에 나타나 있다.

도 3a 및 3b의 결과에서 알 수 있듯이, siRNA 에 의한 Rho GDI-α의 mRNA 및 단백질 감소는 MITF 프로모터 활성을 약 100~200% 정도 증가시키고 멜라닌 생성량도 약 50 % 이상을 증가시킨다. 따라서, Rho GDI-α의 감소가 멜라닌 합성을 증가시키는 효과를 갖는다는 것을 보여준다.

또한 Rho GDI-α의 mRNA 및 단백질의 증가는 IBMX에 의한 MITF 프로모터 활성을 약 80% 정도 감소시키고 멜라닌 생성량도 약 40 % 이상을 감소시킴으로써 Rho GDI-α의 증가가 멜라닌 합성을 감소시키는 효과를 갖는다는 것을 보여준다.

[실시예 3] Rho GDI-α의 발현 감소로 유도한 멜라닌 생성 억제 물질 스크리닝

본 실험은 Melan-a 세포를 이용하여, Rho GDI-α의 발현이 감소된 조건 하에서 증가된 MITF와 타이로시나제의 발현을 다시 감소시킬 수 있는 물질을 RT-PCR을 이용하여 스크리닝하는 것이다. 즉, 멜라닌 생성을 억제하는 물질을 스크리닝하는 것이다.

Rho GDI-α 의 siRNA (invirogen, USA) 20nmol/ml을 Fugene 6 HD(Roche ,USA)를 이용하여 Rho GDI-α의 mRNA 의 발현을 감소시킨 후 증가된 타이로시나제의 발현량과 활성 및 총 멜라닌 양을 감소시키는 물질을 스크리닝 하였 다. 타이로시나제(tyrosinase) 발현량은 Immuno Blotting, 활성 저해 측정은 Dopa 염색, 총멜라닌 양은 1N NaOH로 녹여 405nm 에서 흡광도를 측정하였다.

자세히 기술하면, 6공 세포배양 플레이트에 Rho GDI-α 유전자의 siRNA 20nmol/ml (invitrogen, USA)을 Fugene 6 HD(Roche ,USA)를 이용하여 세포내로 도입하였다. 대조군은 동량의 Rho GDI-α Scrambled siRNA (invitrogen,USA)를 도입하였다. 주입 후 각각 12, 24, 48 시간 동안의 MITF와 타이로시나제의 mRNA를 RT-PCR로 확인하였다. 이때 MITF와 타이로시나제의 어닐링 온도는 각각 58도, 60도 이며 싸이클수는 각각 27과 24이다.

상기 단계에서 확보된 siRNA를 처리한 melan-a 세포에 차가운 PBS로 씻은 후, 세포를 용해하고 남은 펠릿은 1N NaOH에 녹여 405nm에서 흡광도를 측정하여 총 단백질 대비 총 멜라닌 양을 측정하였다. 그 결과는 도 2에 나타내었다.

그 결과, Rho GDI-α의 감소로 증가된 MITF 와 티로시나아제 (Tyrosinase)의 발현이 하기 화학식 1의 구조를 갖는 ISAO-03 (IUPAC name : 3-(3,4-dihydroxyphenyl)-N-adamantyl-propanamide, CTFA에 등록된 INCI name : adamntyl dihydrocaffeamide)에 의해 억제되는 것을 확인하였다. 이는 도 4의 a에 나타나 있다. 이는 Rho GDI-α의 감소로 증가된 멜라닌 합성이 ISAO-03에 의해 저해되는 것을 나타내는 것이다.

한편, 총 멜라닌 량을 측정한 결과를 도 4의 b에 나타내었다. 도 4의 b를 통해서도 역시 ISAO-03에 의해 멜라닌 합성량이 감소된 것을 확인할 수 있었다.

결론적으로, 본 실험을 통해 멜라닌 생성을 억제하는 물질로서 ISAO-03을 스크리닝할 수 있었다.

[실시예 4]

ISAO-03의 농도를 1, 2, 4μM로 변화시키고 처리 시간을 24, 48, 72시간으로 변화시키는 것을 제외하고는 상기 실시예 3과 동일하게 실험을 수행하였다.

그 결과는 도 5에 나타나 있다. 도 5a 는 ISAO-03이 농도의존적으로 약 40% 가량 멜라닌의 양을 감소시키는 결과이고, 도 5b는 2개의 ISAO-03 농도(2,4μM)를 가지고 24시간부터 72시간까지의 시간의존적 결과를 볼 수 있었다. 이 두 결과는 상기 실시예 3(도 4의 a)의 스크리닝으로 실시하여 얻은 ISAO-03 이 효과적으로 멜라닌 생성을 억제하는 것을 의미하는 것이며, 또한 이 결과로 ISAO-03 이 농도 및 시간의존적으로 효과적으로 멜라닌 생성억제 효능이 있음을 알 수 있다.

[실시예 5] 기니아 피그(guinea pig)에서 ISAO-03의 멜라닌 생성억제효과.

몸무게가 500 g 내외인 갈색 기니아 피그의 등 부위 털을 제거하고 펜토바비탈(pentobarbital) (30 mg/kg)로 마취시킨 후 500 mJ의 자외선으로 태웠다. 태우는 부위는 지름 1 cm 정도의 동그라미가 되게 하였다. 같은 방법으로 같은 부위에 일주일에 한번씩 3번 자외선 조사를 하였다. 마지막 자외선 조사가 끝나면 그 다음날부터 아침 저녁으로 상기 생성된 인공 색소반에 각 해당 시료를 처리하였다.

구체적으로 비히클만 처리한 대조군, ISAO-03 0.1%, 0.5%를 처리한 실험군, 아무것도 처리하지 않은 비처리군 및 하이드로퀴논(Hydroquinone) 2%를 처리한 비교군으로 나뉘었다. 각 시료는 5 μl씩 3주간 도포하였다. 이와 같이 시료를 도포하고 3주 후에 상기 비히클만 처리한 대조군, ISAO-03을 처리한 실험군 및 하이드로퀴논을 처리한 비교군의 인공색소반의 색깔을 무처리군을 기준으로 육안으로 확인하고 상대적인 색깔 차이를 수치화 하였다. 6마리의 동물을 이용하여 동시에 실험하고 각각의 수치를 평균내어 도표화 하였다.

그 결과를 도 6 a 에 나타내었다. 도 6 a의 수치에서 0.5는 전문가만이 알 수 있는 미백효과, 1.0은 누구나 알 수 있는 미백효과, 3.0은 원래 피부색만큼 하얗게 된 미백효과, 2.0은 1과 3사이의 미백효과, 4.0은 원래 피부색보다 하얗게 된 미백효과를 나타내는 것이다.

도 6a 에서 나타난 바와 같이 ISAO-03 0.5%의 미백효과는 2.1로서 자외선에 의한 인공색소반의 색소참착을 3주만에 확실하게 개선하였으며, 0.1%를 도포한 경우에도 하이드로퀴논보다 미백효과가 우수하였다.

또한, 상기의 무처리군, 비히클만 처리한 인공 색소반(대조군), ISAO-03을 처리한 인공색소반, 및 하이드로퀴논을 처리한 인공 색소반의 색깔을 색차계(크로마미터, chromameter)로 명암판정 하였으며, 인공색소반의 명암을 색차계로 수치화한 값(L값)을 평균내었다.

그 결과는 도 6b 에 나타내었다. 도 6b 에서 수치(L값)이 클수록 밝은 색을 나타내는 것으로 ISAO-03 0.1%, 0.5%는 하이드로퀴논보다 높은 수치를 나타내어 우수한 미백효과를 나타냄을 확인하였다.

[실시예 6] 정상 인체 멜라노사이트에서의 효과

Rho GDI-α가 인체 멜라노사이트에서 어떠한 효과를 나타내는지 알아보기 위해 정상 인체 멜라노사이트의 멜라닌 합성 효과를 살펴보았다. 이를 평가하기 위해 멜라닌 합성 과정에서 마지막 단계에서 중요한 역할을 하는 타이로시나제 활성을 측정하였다. 이는 DOPA 염색을 이용하여 타이로시나제 활성을 인시추(in situ)상에서 알아보는 방법으로 수행되었다. 6공 배지에 정상 인체 멜라노사이트(MTCC, 대한민국), 1X10⁵ 개 깔아주고, Rho GDI-α의 siRNA(invirogen, USA)는 20nmol/ml을 Fugene 6 HD (Roche, USA)를 이용하여 처리하고, Rho GDI-α가 삽입된 pCMV-SPORT6 벡터(invitrogen,USA)는 0.5mg/ml을 IBMX 100μM와 함께 Fugene 6 HD (Roche, USA)를 이용하여 처리하였다. IBMX 100μM 은 양성 대조군으로 사용되었다. 3일째에 세포를 PBS로 씻어준 후에 PMSF와 1.0% Triton X-100이 들어간 0.05M 소디움 인산 버퍼 (pH6.8)를 사용하여 소니케이션을 하였다. 그리고 멜라노좀 멤브레인으로부터 타이로시나제를 분리하기 위해서 4℃에서 30분간 놓아두었다. 그리고 나서 40000g 에서 20분간 원심분리를 한 후에 상등액만 수거하여 단백질을 획득하였다. 단백질 10 ug 을 SDS 샘플 버퍼와 섞은 후 Tris-Glycine 젤을 이용하여 전기 영동을 한다. 전기 영동이 끝난 후 젤을 0.5M 소디움 인산 버퍼 (pH6.5)에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 그 후 0.2% L-DOPA가 포함된 0.1M 소디움 인산 버퍼 (pH6.8)에 젤을 넣어서 37℃ 에서 반응을 시켰다. 밴드가 나타나면 반응을 멈추었다. 이를 정량화 하여 그래프로 도 7에 나타내었다. 도 7에서 보여주듯이 Rho GDI-α의 감소시 타이로시나제 활성 촉진 효과를 나타내며, 증가시 티로시나제 활성 촉진 억제를 확인할 수 있었다.

본 발명은, 멜라닌 생성을 억제함으로써 미백 효과를 얻을 수 있고 검버섯이나 기미, 주근깨 등을 예방 또는 치료하는 데에 유용하게 활용될 수 있다. 또한, 멜라닌 생성을 촉진함으로써 백모나 백반증 등을 예방 또는 치료하는 데에 유용하게 활용될 수 있다.

도 1은 Rho GDI-α의 발현량 변화(증가:a, 감소:b)에 따른 멜라닌 합성에 관련된 유전자들의 mRNA의 변화를 나타내는 RT-PCR 결과이다.

도 2는 Rho GDI-α의 발현량에 따른 멜라닌합성 변화(c) 및 이에 관련된 유전자인 타이로시나제 단백질 발현량의 변화(a) 및 활성의 변화(b)를 나타내는 결과이다.

도 3은 MITF 프로모터가 포함된 melan-a 세포 시스템을 이용하여 GLuc 분석방법으로 측정한 Rho GDI-α 에 대한 MITF 활성(a) 및 세포로부터 정량된 멜라닌양(b)을 나타내는 그래프이다.

도 4는 멜라닌 생성을 억제하는 물질을 스크리닝하는 예로서, Rho GDI-α의 발현 억제로 인해 증가된 멜라닌 합성 증가 관련 유전자들의 발현량을 ISAO-03이 다시 감소시킨 결과(a)와 ISAO-03이 증가된 멜라닌 양을 다시 감소시킨 결과(b)이다.

도 5는 위의 스크리닝을 통해 얻은 멜라닌 합성 저해 물질인 ISAO-03이 농도별(도 5a), 시간별(도 5b)로 멜라닌 생성 세포에서 멜라닌 합성을 감소시키는 결과이다.

도 6은 위의 스크리닝을 통해 얻은 멜라닌 합성 저해 후보물질인 ISAO-03의 미백 효과에 대하여 동물 실험한 결과를 나타낸다. 기니아피그 동물 모델에서 미백을 육안으로 관찰하고 수치화한 그래프(도 6a)와 색채계의 L값으로 나타낸 그래프이다(도 6b).

도 7은 인체 멜라노사이트에서 Rho GDI-α의 멜라닌 합성 혹은 억제 효과를 확인하기 위하여 인시추 (insitu)로 타이로시네이즈 활성을 측정한 결과이다.

Claims (12)

1. Rho GDI-α 단백질, 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자, 또는 상기 유전자에 상보적인 서열을 갖는 유전자 또는 그 단편을 유효성분으로 함유하는 멜라닌 생성 조절용 조성물.
2. 제1항에 있어서,

   상기 멜라닌 생성 조절용 조성물은 멜라닌 생성을 억제하는 조성물이며,

   상기 유효성분은 Rho GDI-α 단백질 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자인 것을 특징으로 하는 멜라닌 생성 조절용 조성물.
3. 제2항에 있어서, 상기 멜라닌 생성 조절용 조성물은, MITF 및 티로시나아제 발현을 억제함으로써 멜라닌 생성을 억제하는 것을 특징으로 하는 멜라닌 생성 조절용 조성물.
4. 제2항에 있어서,

   상기 Rho GDI-α 단백질을 암호화하는 유전자는 벡터에 삽입되어 있는 형태인 것을 특징으로 하는 멜라닌 생성 조절용 조성물.
5. 제1항에 있어서,

   상기 멜라닌 생성 조절용 조성물은 멜라닌 생성을 촉진하는 조성물이며,

   상기 유효성분은 Rho GDI-α 단백질을 암호화하는 유전자 서열에 상보적인 서열을 갖는 유전자 또는 그 단편인 것을 특징으로 하는 멜라닌 생성 조절용 조성물.
6. 제5항에 있어서, 상기 멜라닌 생성 조절용 조성물은, MITF 및 티로시나아제 발현을 촉진함으로써 멜라닌 생성을 촉진하는 것을 특징으로 하는 멜라닌 생성 조절용 조성물.
7. 제5항에 있어서, 상기 유효성분은 Rho GDI-α의 mRNA에 결합하는 siRNA인 것을 특징으로 하는 멜라닌 생성 조절용 조성물.
8. 시험 물질에 대하여 멜라닌 생성 조절 여부를 스크리닝하는 방법으로서,

   상기 시험 물질이 Rho GDI-α의 발현, 활성 또는 기능을 조절하는지 여부를 확인하는 것을 포함하는 멜라닌 생성 조절제 스크리닝 방법.
9. 제8항에 있어서, 상기 Rho GDI-α의 발현을 조절하는지 여부는 RT-PCR 또는 ELISA 및 웨스턴블럿(immuno blot)을 이용하여 결정되는 것을 특징으로 하는 멜라닌 생성 조절제 스크리닝 방법.
10. 제8항에 있어서, 상기 확인 결과, 상기 시험 물질이 Rho GDI-α의 발현, 활성 또는 기능을 촉진하는 경우 멜라닌 생성 억제제로 판정하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 멜라닌 생성 조절제 스크리닝 방법.
11. 제8항에 있어서, 상기 확인 결과, 상기 시험 물질이 Rho GDI-α의 발현, 활성 또는 기능을 억제하는 경우 멜라닌 생성 촉진제로 판정하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 멜라닌 생성 조절제 스크리닝 방법.
12. 제8항에 있어서,

    상기 멜라닌 생성 조절제 스크리닝 방법은,

    Rho GDI-α의 프로모터 및 리포터 유전자를 포함하는 플라스미드를 세포에 트랜스펙션시키는 단계;

    상기 세포에 시험 물질을 처리하는 단계; 및

    상기 시험 물질이 상기 리포터 유전자의 발현을 촉진하는지 또는 억제하는지의 여부를 확인하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 멜라닌 생성 조절제 스크리닝 방법.

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