KR20100039077A

KR20100039077A - Ｎｄｒｇ2 유전자를 이용한 미백 활성 물질의 스크리닝 방법

Info

Publication number: KR20100039077A
Application number: KR1020080098292A
Authority: KR
Inventors: 임종석; 김애영; 강경아
Original assignee: 숙명여자대학교산학협력단
Priority date: 2008-10-07
Filing date: 2008-10-07
Publication date: 2010-04-15

Abstract

본 발명은 세포 내 NDRG2 유전자의 발현 변화를 측정하여 NDRG2 유전자의 발현을 증가시키거나 감소시키는 물질을 선별하는 방법에 관한 것이다.

본 발명을 통해서 NDRG2 유전자 발현에 의해서 흑색종 세포에서 MITF와 타이로시나제의 발현 및 활성이 억제됨을 확인하였으며, 그 결과로 멜라닌 양이 현저히 감소하는 것을 관찰함으로써, NDRG2 유전자가 미백 기능 조절의 특성을 가지고 있음을 확인하였다. 따라서 미백 후보물질 스크리닝 시스템 개발에 NDRG2 발현 변화를 지표로서 활용하는 신기술은 미백화장품 원료개발 및 색소질환 치료제 개발에 응용될 수 있으며, 이와 더불어 피부암의 진단 및 치료제 개발에 있어 NDRG2를 표적 유전자로 활용하는 것을 기대할 수 있다.

NDRG2, 멜라닌, 흑색종, 타이로시나제

Description

ＮＤＲＧ2 유전자를 이용한 미백 활성 물질의 스크리닝 방법{Screening system using NDRG2 as a novel regulator gene of pigmentation in developing agents for application of skin hyper-pigmentation treatment}

멜라닌은 진피-표피층에 존재하는 멜라노사이트와 수지상 세포에 의해 합성되는 색소성 생체고분자 물질로서 외관결정, 보호색, 평형감각 유지 및 유해물질 흡수 등의 다양한 기능을 가지고 있으며 멜라닌 형성에 관여하는 유전자 변이에 의해 광범위한 색소성 피부 질환이 발병하게 된다. 또한 자외선에 피부가 노출되면 멜라노사이트 자극 호르몬 (α-melanocyte stimulating hormone; α-MSH)과 부신피질 호르몬 (adrenocorticotropic hormone)이 분비되고 이를 통해 아데닐레이트 사이클라제 (adenylate cyclase) 활성화 및 세포내 cAMP가 상승되며, 이로 인하여 멜라닌 생성에 관여하는 효소인 타이로시나제 (tyrosinase)의 생성이 증가되어 색소 침착이 유발된다. 따라서 과색소 침착 질환인 기미 (melasma), 주근깨 (lentigines), 모반 (nevus)에 대한 약리학적 의미뿐만 아니라, 미백효과를 위한 화장품 개발 목적의 미용적 의미에서 멜라닌 생성을 조절하는 유전자를 발굴하고 작용 메커니즘을 이해하는 것이 필요하다. 멜라닌 생성에 주요한 유전자군으로 타이로시나제 유전자 패밀리(tyrosinase gene family)가 있으며 이들은 tyrosinase, tyrosinase-related protein 1 (TRP-1), 그리고 TRP-2로 구성되어 있다. 타이로시나제 (tyrosinase)는 타이로신 (tyrosine)이 DOPA로 하이드록시화 (hydroxylation)되는 과정 및 DOPA 산화에 의해 DOPA퀴논이 형성되는 과정에 관여하며, TRP-1은 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid (DHICA)를 인돌-퀴논으로 산화시키는 과정에 관여한다. 또한 TRP-2는 DOPAchrome tautomerase로 작용하여 DOPAchrome으로부터 DHICA를 재배열하는데 관여한다.

현재 미백제의 개발은 멜라노사이트에 의한 멜라닌 생성 억제, 멜라노사이트 자극물질 조절 및 멜라닌 배설 촉진 등으로 나뉘어 진행되고 있으며, 멜라닌 형성에 관여하는 주효소인 타이로시나제 활성억제 물질을 탐색하는 것이 주를 이루었다. 하지만 항산화 활성에 근거하여 타이로시나제 활성을 저해하는 기존의 미백 원료들은 효소 활성억제라는 긍정적 효과를 가짐에도 불구하고 피부에 적용하였을 때 피부 자극이나 피부 독성반응과 같은 부작용을 보였으며, 실제 화장품 제형에 적용하였을 때 불안정성을 보이거나 변색, 변취 등의 문제점이 대두되었다. 따라서 단순히 타이로시나제 활성을 억제하는 원료를 탐색하기보다는, 피부 세포간 상호 정보 전달 과정을 조절하여 타이로시나제 유전자의 프로모터 영역을 제어할 수 있는 상위 유전자 개념의 연구가 필요하다. 즉 타이로시나제 유전자 패 밀리인 tyrosinase, TRP-1, TRP-2 등의 발현을 제어하는 전사인자인 MITF (microphthalmia-associated transcription factor) 활성을 조절할 수 있는 상위 유전자를 발굴하고 이러한 유전자가 미백제 탐색 타겟으로 유용한지를 확인하는 연구가 필요하다. 덧붙여 백반증과 같은 저색소 질환을 치료하기 위한 치료제 탐색에도 이러한 연구는 도움을 줄 수 있을 것으로 기대된다. 특히 타이로시나제와 MITF가 피부암 발암과정에 관여하는 것으로 보고되고 있으므로, 이들을 조절하는 상위 유전자의 발굴 및 작용 메커니즘을 이해하는 것은 이를 이용한 기능성 화장품 신소재 개발, 색소성 피부질환 치료제 개발, 피부암 진단 및 치료제 개발에 유용한 정보를 제공할 것으로 기대된다.

NDRG2 유전자는 면역 세포인 수지상 세포의 분화과정에 관여하며 세포 성숙인자인 LPS (lipopolysaccharide)나 CD40 자극에 의해 발현이 조절되며, 세포의 성장과 세포사멸 유도를 통해 세포의 증식반응을 조절하는 것으로 본 연구진에 의해 보고되었다 (Choi et al., 2003; Park et al., 2007; Choi et al., 2008). 또한 알츠하이머 (AD; Alzheimer's disease) 환자의 뇌 병변부위에서 NDRG2가 강하게 발현되고 있어 알츠하이머의 발병에 본 유전자가 관여할 것으로 보고되었다. 최근 연구 결과, 뇌암, 간암 및 췌장암 등의 암 조직에서 NDRG2 유전자 발현이 정상 조직에 비해 현저히 감소되어 있어 본 유전자가 종양 억제 후보 유전자로 기능할 가능성이 보고되었으며 암 조직에서 NDRG2 promoter region의 methylation, mutation, genetic deletion이 관찰되었다 (Deng et al., 2003; Hue et al., 2004; Lusis et al., 2005, Lee et al., 2008).

이에 본 발명자들은, NDRG2 유전자의 발현과 멜라닌 생성과의 관계를 연구한 결과, NDRG2 유전자 발현을 통해 타이로시나제의 활성이 억제되어 멜라닌의 생성을 막고, 신규 미백 물질 발견에 본 유전자를 새로운 표적으로 활용할 수 있음을 발견함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명은,

NDRG2 유전자를 발현하는 세포에 후보물질을 처리하는 단계; 및

NDRG2 유전자의 발현 변화를 측정하여 상기 NDRG2 유전자의 발현을 증가시키는 물질을 선별하는 단계

를 포함하는 미백 활성 물질의 스크리닝 방법을 그 특징으로 한다.

또한 본 발명은,

NDRG2 유전자를 포함하는 형질전환용 벡터로 NDRG2 유전자를 발현하는 세포를 형질전환시켜 NDRG2 유전자가 과발현된 세포를 제조하는 단계;

상기 NDRG2 유전자가 과발현된 세포에 후보물질을 처리하는 단계; 및

NDRG2 유전자의 발현 변화를 측정하여 상기 NDRG2 유전자의 발현을 감소시키는 물질을 선별하는 단계

를 포함하는 멜라닌 형성을 증가시키는 물질의 스크리닝 방법을 그 특징으로 한다.

현재 미백제의 개발은 멜라노사이트에 의한 멜라닌 생성 억제, 멜라노사이트 자극물질 조절 및 멜라닌 배설 촉진 등으로 나뉘어 진행되고 있으며, 멜라닌 형성에 관여하는 주효소인 타이로시나제의 활성 억제 물질을 탐색하는 것이 주를 이루었다. 그러나 본 발명을 통해서 NDRG2 유전자 발현에 의해서 흑색종 세포에서MITF와 타이로시나제의 발현 및 활성이 억제됨을 확인하였으며, 그 결과로 멜라닌 양이 현저히 감소하는 것을 관찰함으로써, NDRG2 유전자가 미백 기능 조절의 특성을 가지고 있음을 확인하였다. 따라서 미백 후보물질 스크리닝 시스템 개발에 NDRG2 발현 변화를 지표로서 활용하는 신기술은 미백화장품 원료개발 및 색소질환 치료제 개발에 응용될 수 있으며, 이와 더불어 피부암의 진단 및 치료제 개발에 있어 NDRG2를 표적 유전자로 활용하는 것을 기대할 수 있다.

이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

멜라노사이트 또는 흑색종(melanoma) 세포에 미백 활성을 가질 것이라 예상되는 후보물질을 처리한다. 다음 상기 세포를 원심 분리하여 얻어진 상등액에 타이로시나제의 기질로서 L-DOPA를 넣어 생성된 도파크롬(DOPAchrome)을 측정함으로서 타이로시나제의 활성의 감소량을 측정하여 미백 효과를 확인할 수 있다.

본 발명에서는 NDRG2 유전자 (GenBank 등록번호 : NM_016250)의 멜라닌 생성 과정에의 역할을 발견하여, NDRG2 유전자의 프라이머를 이용하여 RT-PCR을 통해 NDRG2 유전자의 발현량을 측정함으로써 미백 물질의 효과를 확인한다.

흑색종(B16F10 melanoma) 세포는 NDRG2 유전자의 발현이 낮고 타이로시나제의 활성이 높다. 이에 NDRG2 유전자를 pCMV-Taq2B 벡터를 이용하여 클로닝하였고, 이후 흑색종 세포에 형질전환하여 NDRG2 유전자 과발현 세포주를 제조하였다. 상기 형질 전환된 NDRG2 유전자 과발현 흑색종 세포주의 타이로시나제 활성 및 멜라닌의 생성량이 일반 흑색종 세포에 비해 감소됨을 확인할 수 있었다.

이하, 본 발명을 다음 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명하겠으나, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 미백 활성 물질에 의한 NDRG2 유전자 발현 증가 조사

NDRG2 유전자 발현과 멜라닌 생성능의 상관관계를 조사하기 위해, 타이로시나제의 활성이 높은 것으로 알려진 B16F10 흑색종 세포에 기존 보고를 통해 미백 효과가 입증된 항산화 물질인 레스베라트롤 (25 μM), EGCG (Epigallocatechin gallate, 25 μM), 알부틴 (500 μM)을 각각 24 시간 동안 처리하였다.

타이로시나제의 활성을 측정하기 위해, 각각의 물질로 처리된 세포를 PBS로 두 번 세척한 후, 1% Triton X-100 용액으로 용해시킨 다음 14000g에서 20 분간 원 심 분리하여 상등액을 얻었다. 상기 상등액에 타이로시나제에 대한 기질로 1 mM L-DOPA를 넣어준 후 37℃에서 반응시켜 도파크롬 (DOPAchrome)을 생성한다. 생성된 도파크롬을 분광 광도계 (spectrophotometer, 475 nm)를 이용하여 측정한 결과, 타이로시나제의 활성이 30 ~ 50% 감소됨을 관찰하였다 (도 1a).

또한 마우스 NDRG2 프라이머 (forward: 5'-GGATCCATGGCAGAACTTCAGGAG-3'(서열번호 1), reverse: 5'-CTCGAGTCAACAGGAGACTTCCAT-3'(서열번호 2))를 이용하여 RT-PCR을 통해 NDRG2 발현을 조사하였다. 일반 흑색종 세포는 NDRG2 유전자의 발현이 미미한 반면, 상기 레스베라트롤, EGCG 및 알부틴을 각각 처리한 흑색종 세포의 경우, NDRG2 유전자의 발현이 현저히 증가됨을 확인할 수 있었다(도 1b). 이러한 결과를 통해 타이로시나제의 활성 억제 및 멜라닌의 생성 억제 기작에 NDRG2 유전자 발현이 관여하는 것으로 볼 수 있다.

실시예 2: NDRG2 유전자 과발현 세포주 제조 및 멜라닌 생성 조사

NDRG2 유전자의 발현이 낮은 흑색종(B16F10 melanoma) 세포를 NDRG2 유전자 과발현 세포로 제조하기 위하여, pCMV-Taq2B vector에 NDRG2 유전자를 클로닝 한 후, WelFect-EXTM PLUS 형질전환 시약(WelGENE)을 이용하여 흑색종(B16F10 melanoma) 세포에 형질전환 하였다. 대조 세포주는 pCMV-Taq2B vector를 흑색종에 형질전환한 것이다. pCMV-Taq2B vector 혹은 pCMV-Taq2B-NDRG2 플라즈미드 5 μg을 형질전환 시약과 혼합한 후, 흑색종 세포에 처리하여 4시간동안 배양한다. 형질전환 시약을 제거한 후, 1 mg/ml neomycin (G418, Geneticin, Gibco/Invitrogen)으로 안정한 형질 전환 클론을 선별한 후 NDRG2 유전자 과발현 세포주를 RT-PCR과 웨스턴 블랏 분석을 통해 선택하였다 (도 2a).

NDRG2 과발현 세포주의 멜라닌 생성량 및 타이로시나제의 활성을 조사한 결과, NDRG2 발현에 의해 B16F10 흑색종 세포 펠렛에서 나타나는 흑색이 사라지는 것을 확인하였으며 (도 2b), 멜라닌 생성량 역시 50% 이상 감소됨을 확인하였다 (도 2c). 멜라닌 생성량은 1 X 10⁷개의 세포를 수획하여 얻은 세포 펠렛을 1N NaOH/10% DMSO 용액으로 용해하여 80℃에서 한 시간 반응시킨 후 475 nm에서 흡광도를 측정하여 상대적으로 파악할 수 있다.

실시예 3: NDRG2 유전자 과발현 세포주에서 타이로시나제의 활성 변화 조사

상기 NDRG2 유전자 과발현 세포주에서 멜라닌의 합성에 중요한 효소로 알려진 타이로시나제, TRP-1 및 TRP-2 의 활성 변화를 RT-PCR을 통해 조사하였다. 프라이머로서 마우스 타이로시나아제는 forward: 5'-GGCCAGCTTTCAGGCAGAGGT-3'(서열번호 3), reverse: 5'-TGGTGCTTCATGGGCAATC-3'(서열번호 4), TRP-1는 forward: 5'-GCTGCAGGAGCCTTCTTTCTC-3'(서열번호 5), reverse: 5'-AAGACGCTGCACTGCTGGTCT-3'(서열번호 6), TRP-2는 forward: 5'-GGATGACCGTGAGCAATGGCC-3'(서열번호 7), reverse: 5'-CGGTTGTGACCAATGGGTGCC-3'(서열번호 8)를 사용하였다. RT-PCR을 통해 나타난 NDRG2 유전자 과발현 세포주의 타이로시나제, TRP-1 및 TRP-2의 mRNA 발현은 일반 세포주에 비해 현저히 감소하였음을 확인하였다 (도 3a). 또한 L- DOPA 산화를 통한 타이로시나제의 활성 역시 NDRG2 발현에 의해서 억제됨을 확인하였다 (도 3b).

실시예 4: cAMP 신호전달체계의 활성화의 영향

cAMP의 경우, CREB (cAMP responsive element binding protein) 인산화를 통해 MITF 발현 및 활성을 증가시켜 타이로시나제 프로모터의 전사 활성을 유도하는 것으로 알려져 있다. cAMP 유도 물질로 잘 알려진 α-MSH(0.5, 1 μM, Melanocyte-stimulating hormone), 혹은 IBMX (50, 100 μM, 3-isobutyl-1-methylxanthine)를 24 시간 처리한 후, 멜라닌 생성 (도 4a) 및 타이로시나제의 활성 (도 4b)을 측정하였다. 측정 결과 일반 세포주는 cAMP 유도 물질에 의해 멜라닌 생성 및 타이로시나제 활성이 약 4 ~ 6배 정도 증가하였으나, NDRG2 유전자 과발현 세포주는 cAMP 유도 물질에 의한 활성의 증가 정도가 미약하였다.

실시예 5: 타이로시나제의 활성을 조절하는 전사인자에 대한 영향

cAMP 활성이 증가되면, CREB 인산화와 MITF 발현 및 활성이 증가되고 그 결과, 타이로시나제가 활성화되어 멜라닌 생성이 증가된다. α-MSH (1 μM)와 IBMX (100 μM)을 6 시간 처리한 후 단백질을 수획하여 p-CREB/CREB 및 MITF 발현을 웨스턴 블랏으로 조사한 결과, 일반 세포주에서는 α-MSH 혹은 IBMX 처리에 의해 CREB 인산화 및 MITF 발현이 증가되었으나, NDRG2 유전자 과발현 세포주는 CREB 인산화 및 MITF 발현 증가가 억제되었다.

또한 pCRE-luc, pMITF 리포터 유전자 벡터를 일반 세포주와 NDRG2 유전자 과발현 세포주에 형질전환한 후, α-MSH (1 μM) 와 IBMX (100 μM)를 처리하면서 18 시간 동안 배양한 후 루시퍼라아제(luciferase) 활성을 측정한 결과, 일반 세포주에 비해 NDRG2 유전자 과발현 세포주는 cAMP 유도 물질에 의한 활성의 증가 정도가 현저히 억제되어 있음을 확인하였다 (도 5). 상기 실험 결과를 통해 NDRG2 유전자가 멜라닌 생성 과정에 중요한 역할을 담당하는 CREB 및 MITF의 상위에서 이들의 활성을 억제하고, 그 결과 타이로시나제의 활성 억제 및 멜라닌의 생성 저하를 유도하는 것으로 보여진다.

실시예 6: 멜라닌 생성에 관여하는 TCF/β-catenin 신호 전달 체계에 대한 영향

TCF/β-catenin 신호 전달 체계는 MITF 활성에 관여하는 것으로 알려져 있다. TCF/β-catenin 신호 활성 물질인 LiCl (GSK3β inhibitor, 20 mM)를 12 시간 처리한 후 GSK3β 인산화 정도를 웨스턴 블랏을 통해 확인한 결과, NDRG2 유전자 과발현 세포주에서는 LiCl에 의한 GSK3β의 인산화를 관찰할 수 없었다 (도 6a).

LiCl 처리 후 GSK3β 인산화에 의해 핵으로 이동한 β-catenin과 TCF의 결합을 TOPflash 루시퍼라아제 분석을 통해 조사한 결과, 일반 세포주에 비해 NDRG2 유전자 과발현 세포주에서는 TOPflash 루시퍼라아제 활성이 현저히 억제됨을 관찰하였다 (도 6b).

실시예 7: siRNA를 이용한 NDRG2 발현억제와 멜라닌 합성 회복 조사

상기 NDRG2 유전자의 멜라닌 생성 억제 기능을 확인하기 위해 NDRG2 유전자 과발현 세포주에 NDRG2-siRNA를 주입하여 NDRG2 발현을 소실시킨 후 타이로시나제 및 MITF 발현, 멜라닌 합성을 조사하였다.

Santa Cruz Biotechnology에서 구입한 NDRG2-siRNA (sc-40758) 및 control siRNA (sc-36869)를 Lipofectamin 2000를 이용하여 NDRG2 유전자 과발현 세포주에 형질전환시켜 배양한 결과, NDRG2 발현 소실에 의해 타이로시나제 및 MITF 발현이 다시 증가되고 멜라닌 생성이 회복됨을 관찰하였다 (도 7).

실시예 8: cAMP 유도물질에 의한 NDRG2 발현 감소 조사

NDRG2 과발현 세포주에 cAMP 유도 물질인 α-MSH (1 μM) 와 IBMX (100 μM)를 처리한 결과 NDRG2 발현에 의해 억제되었던 타이로시나제와 MITF 발현이 현저하게 회복됨을 확인하였다 (도 8). 이러한 결과와 나란히 NDRG2 과발현 세포주 내 NDRG2 발현은 cAMP 유도 물질 처리에 의해 감소됨을 관찰하였다.

도 1a은 기존에 알려진 미백 효과물질들의 타이로시나제 활성을 억제하는 효과를 나타낸 그래프이다.

도 1b는 기존에 알려진 미백 효과물질들의 처리에 의한 NDRG2 유전자 발현 을 비교한 결과이다.

도 2a 대조 세포주와 NDRG2 유전자 과발현 흑색종 세포주의 RT-PCR 및 웨스턴블랏 분석 사진이다. 상기 사진에서 wild는 모세포주인 B16F10 흑색종 세포주이며, mock은 pCMV-Taq2B vector를 흑색종 세포주에 형질 전환시켜 만든 대조 세포주이다.

도 2b는 대조 세포주와 NDRG2 유전자 과발현 흑색종 세포주의 세포 펠렛을 비교한 결과이다.

도 2c는 대조 세포주와 NDRG2 유전자 과발현 흑색종 세포주에서의 멜라닌의 생성량을 상대적으로 나타낸 그래프이다.

도 3a는 NDRG2 유전자 발현에 의한 타이로시나제 유전자 패밀리의 발현을 비교한 결과이다.

도 3b는 NDRG2 유전자 발현에 의하여 타이로시나제의 활성 감소를 나타내는 그래프이다.

도 4a는 cAMP 유도 물질에 의한 멜라닌 합성량의 변화를 나타낸 그래프이다.

도 4b는 cAMP 유도 물질에 의한 타이로시나제 활성 변화를 나타낸 그래프이다.

도 5는 전사 인자 CRE와 MITF의 프로모터 결합하는 활성을 나타내는 루시퍼라아제 활성을 측정한 그래프이다.

도 6a는 LiCl 처리에 따른 GSK 인산화 정도를 웨스턴 블랏팅으로 비교 확인한 결과이다.

도 6b는 TCF/β-catenin 결합을 TOPflash 루시퍼라아제 분석을 통해 비교한 결과이다.

도 7은 NDRG2 특이적 siRNA를 처리하여 NDRG2 유전자 소실을 유도하여 멜라닌 합성량과 타이로시나제 및 MITF의 발현을 비교한 결과이다.

도 8은 NDRG2 과발현 세포주에서 cAMP 유도 물질에 의해 MITF 발현이 증가하는 동시에 NDRG2 발현이 감소됨을 확인한 결과이다.

<110> Sookmyung Women's University Industry Academic Cooperation Foundation <120> Screening system using NDRG2 as a novel regulator gene of pigmentation in developing agents for application of skin hyper-pigmentation treatment <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDRG2 primer(forward) <400> 1 ggatccatgg cagaacttca ggag 24 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NDRG2 primer(reverse) <400> 2 ctcgagtcaa caggagactt ccat 24 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tyrosinase primer(forward) <400> 3 ggccagcttt caggcagagg t 21 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tyrosinase primer(reverse) <400> 4 tggtgcttca tgggcaatc 19 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TRP-1 primer(forward) <400> 5 gctgcaggag ccttctttct c 21 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TRP-1 primer(reverse) <400> 6 aagacgctgc actgctggtc t 21 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TRP-2 primer(forward) <400> 7 ggatgaccgt gagcaatggc c 21 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TRP-2 primer(reverse) <400> 8 cggttgtgac caatgggtgc c 21

Claims

NDRG2 유전자를 발현하는 세포에 후보물질을 처리하는 단계; 및

NDRG2 유전자의 발현 변화를 측정하여 상기 NDRG2 유전자의 발현을 증가시키는 물질을 선별하는 단계

를 포함하는 것을 특징으로 하는 미백 활성 물질의 스크리닝 방법.
NDRG2 유전자를 포함하는 형질전환용 벡터로 NDRG2 유전자를 발현하는 세포를 형질전환시켜 NDRG2 유전자가 과발현된 세포를 제조하는 단계;

상기 NDRG2 유전자가 과발현된 세포에 후보물질을 처리하는 단계; 및

NDRG2 유전자의 발현 변화를 측정하여 상기 NDRG2 유전자의 발현을 감소시키는 물질을 선별하는 단계

를 포함하는 것을 특징으로 하는 멜라닌 형성을 증가시키는 물질의 스크리닝 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, NDRG2 유전자의 발현 변화는 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머를 이용한 RT-PCR을 수행하여 측정하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 NDRG2 유전자를 발현하는 세포는 흑색종 세포 또는 멜라노사이트인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, NDRG2 유전자의 발현이 타이로시나제의 활성을 억제하는 스크리닝 방법.