KR101389211B1

KR101389211B1 - 녹차 추출물, 울금 추출물, 후박추출물 및 독활 추출물의 나노캡슐을 포함하는 화장료 조성물 및 그 제조방법

Info

Publication number: KR101389211B1
Application number: KR1020110086902A
Authority: KR
Inventors: 이준구; 김동명; 김덕훈; 최지은
Original assignee: 인타글리오주식회사
Priority date: 2011-08-30
Filing date: 2011-08-30
Publication date: 2014-04-24
Also published as: KR20130023850A

Abstract

본 발명은 화장료 조성물 및 그 제조방법에 대한 것으로서, 보다 구체적으로, 본 발명은 녹차 추출물, 울금 추출물, 후박추출물 및 독활 추출물의 나노캡슐을 포함하는 화장료 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다.

Description

녹차 추출물, 울금 추출물, 후박추출물 및 독활 추출물의 나노캡슐을 포함하는 화장료 조성물 및 그 제조방법 {Cosmetic Composition Comprising Nano Capsule Containing Extract of Camellia Sinensis, Curcuma Longa, Magnolia Obovata and Aralia Continentalis and Manufacturing Method Thereof}

노화란 인간이 태어나서 사망할 때까지 지속적으로 일어나는 기능적, 구조적, 생화학적 과정으로 인체를 구성하고 있는 세포와 신체조직 전체에 일어나며, 대사속도의 저하, 질병증가, 적응력 저하 등을 나타내어 궁극적으로는 세포와 신체 전체의 사망에 이르게 되는 현상이다.

이 중 피부노화는 크게 두 가지로 나뉘어 연구되고 있는데 하나는 '내적 노화'로써 연령의 증가에 따른 노화현상이고 다른 하나는 '외적 노화'로써 외부환경 즉 자외선이나 공해 등으로 인한 노화현상을 말한다. 피부노화에 관하여서는 지금까지 여러 이론이 제시되고 있으나 그 중 피부 노화에 가장 과학적으로 접근된 이론은 산화에 의한 피부노화 이론이다. 사람의 피부는 각질층을 포함하는 표피와 진피, 그리고 결합조직으로 구성되어 있는데 그 중 각질층은 표피(epidermis)의 기저세포인 케라티노사이트(keratinocyte)의 분화 과정을 통해 형성되는 죽은 세포층으로 구성되어 있고 인체를 외부환경의 영향으로부터 보호해주는 역할을 담당하고 있다. 또한 피부의 내부에 존재하는 진피층은 콜라겐(collagen)과 엘라스틴(elastin)으로 구성되어 있어 피부의 탄력을 주어 피부가 처지지 않도록 지켜주는 역할을 담당하고 있다. 항산화이론은 콜라겐과 엘라스틴이 외부의 자외선 등의 인자들에 의해 생성된 자유 라디칼(free radical)에 의해 손상 받게 되고 이에 따라 피부의 탄력이 감소 되어 주름이 생성된다는 이론이다.

지금까지는 이와 같은 피부의 노화, 특히 주름을 방지하기 위해 천연항산화제인 비타민 E, 비타민 C, 카로테노이드(Carotenoid), 글루타티온(Glutathione) 및 식물 추출물 등을 사용하여 왔으나, 이 물질들은 그 효과가 낮거나 피부자극, 발적, 염증을 유발시켜 피부에 대한 부작용이 심각한 문제를 가지고 있다.

이에 본 발명자들은 주름개선 효과 및 항산화 효과가 우수한 화장료를 개발하고자 노력한 결과, 국내에 자생하는 생약재인 녹차, 울금, 후박 및 독활에서 알려지지 않은 항노화 및 주름개선 효능과 유효성을 최초로 검증하였다. 또한, 생약재들이 일반적으로 가지고 있는 피부자극성 및 화장품 제형에 영향을 미치는 색상과 냄새의 문제 해결하기 위하여 나노기술을 접목함으로써 안정적이고 자극이 없으며 유효성이 증대된 기능성 화장품을 개발하게 되었다.

이와 관련하여, 한국공개특허 제10-2010-0054026호 은 토후박 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 외용제 조성물에 관하여 기술하고 있고, 한국등록특허 제10-0902256호는 울금 추출물을 포함하는 혼합 울금 조성물의 간 보호 및 혈압저하 용도에 관하여 기술하고 있고, 한국등록특허 제10-0825432호는 독활 추출물의 항염증 및 항알러지 용도에 관하여 기술하고 있으나, 선행문헌의 어디에도 녹차, 울금, 후박 및 독활 추출물의 주름개선 및 항산화 효능, 나아가 이들을 나노 제형으로 제조한 화장료 조성물에 관하여는 개시된 바가 없다.

본 발명의 목적은 주름개선 및 항산화에 탁월한 효과가 있는 녹차, 울금, 후박 및 독활 추출물을 나노캡슐화함으로써 피부활성성분을 선택적으로 피부에 전달할 수 있는 전달시스템을 확립하고, 상기 나노캡슐화된 화장료 조성물 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기 과제를 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 녹차(Camellia sinensis) 추출물, 울금(Curcuma longa) 추출물, 후박(Magnolia obovata) 추출물 및 독활(Aralia continentalis) 추출물이 봉입된 나노 캡슐을 포함하는 주름 개선 및 항산화용 화장료 조성물에 관한 것이다.

바람직하게, 상기 녹차 추출물은 에피갈로카테킨 갈레이트(Epigallocatechin gallate, EGCG)를 포함한다.

또한 바람직하게, 상기 울금 추출물은 커큐민(Curcumin), 디메톡시커큐민(Demethoxycurcumin) 및 비스메톡시커큐민(Bisdemethoxycurcumin)를 포함한다.

또한 바람직하게, 상기 후박 추출물은 호노키올(Honokiol) 및 4-메톡시호노키올(4-Methoxyhonokiol)을 포함한다.

또한 바람직하게, 상기 독활 추출물은 콘티넨탈산(Continentalic acid) 및 카우레노익산(Kaurenoic acid)을 포함한다.

또한, 상기 화장료 조성물은 유연화장수, 영양화장수, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 아이크림, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징워터, 팩, 스프레이 및 파우더로 이루어진 군에서 선택된 하나의 제형을 포함한다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 녹차 추출물, 울금 추출물, 후박 추출물 및 독활 추출물이 봉입된 나노 캡슐을 포함하는 주름 개선 및 항산화용 화장료 조성물의 제조방법에 관한 것이다.

바람직하게, 상기 제조방법은

(1) 녹차 추출물, 울금 추출물, 후박 추출물 및 독활 추출물을 제조하는 단계; 및

(2) 상기 녹차 추출물, 울금 추출물, 후박 추출물 및 독활 추출물을 나노캡슐화하는 단계를 포함한다.

또한 바람직하게, 상기 단계 (2)는

녹차 추출물, 울금 추출물, 후박 추출물 및 독활 추출물과 생분해성 고분자를 휘발성 유기용매에 용해시키는 단계;

상기 용액을 물에 분산 및 교반시켜 입자를 형성하는 단계; 및

상기 입자 용액 중 휘발성 유기용매를 증발시켜 제거하는 단계를 포함한다.

본 발명의 녹차, 울금, 후박 및 독활 추출물을 이용한 화장료 조성물은 주름 개선 및 항노화에 우수한 효과가 있으며, 종래의 식물 추출물 함유 기능성 화장품이 단순히 추출물을 이용했던 것과 달리 본 발명은 나노공법을 통해 활성성분을 피부 깊숙한 곳까지 그 효능을 빠르게 침투시킬 수 있다. 따라서, 본 발명은 기존의 한방 화장품에 비해 피부조직에 활성성분 공급이 더욱 우수하며, 장기 보관 시 활성성분이 그대로 유지될 수 있고, 안정적이고 자극이 없으며 유효성이 증대된 기능성 화장품을 제공할 수 있다.

도 1은 화합물들의 DHHP 소거능을 나타낸다. 그래프에서 VitC 1, 2, 3 은 각각 50, 200, 1000 uM을 나타내고, EGCG, RV(레스베라트롤), BDMC(비스디메톡시커큐민), DMC(디메톡시커큐민), CUR(커큐민), honokiol(호노키올) 및 4-MHK(4-메톡시호노키올) 1, 2, 3 은 각각 0.5, 5, 50 uM을 나타내고, CA(콘티넨탈산) 및 KA(카우레노익산) 1, 2, 3 은 각각 5, 50, 250 uM을 나타낸다. p<0.05*, p<0.01**, p<0.001***
도 2는 Transfectant HaCaT 세포의 NF-κBSEAP Reporter gene assay 결과를 나타낸다. BDC(비스메톡시커큐민), DMC(디메톡시커큐민), CA(콘티넨탈산), KA(카우레노익산), 4-MHK(4-메톡시호노키올)이고, ### 은 p<0.001 대 p<0.01** p<0.001*** 을 나타낸다.
도 3은 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR)을 통한 TNF-α활성 측정 결과를 나타낸다.
도 4는 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR)을 통한 MMP-1, MMP-2 활성 측정 결과를 나타낸다.
도 5는 웨스턴 블랏을 통한 인간 HaCaT 세포에서의 MMP-1 발현을 나타낸다.
도 6은 웨스턴 블랏을 통한 인간 HaCaT 세포에서의 MMP-1 발현을 나타낸다.
도 7은 웨스턴 블랏을 통한 신생아 포피 유래 섬유아세포에서의 MMP-1 발현을 나타낸다.
도 8은 웨스턴 블랏을 통한 신생아 포피 유래 섬유아세포에서의 MMP-1 발현을 나타낸다.
도 9는 ELISA 를 통한 신생아 포피 유래 섬유아세포에서의 MMP-1 발현을 나타낸다. BDMC(비스디메톡시커큐민), DMC(디메톡시커큐민), CUR(커큐민)에서 1, 2, 3은 각각 0.15, 1.5, 15 uM 을 나타내고, RV(레스베라트롤), 호노키올 및 4-MHK(4-메톡시호노키올)에서 1, 2, 3 은 각각 0.1, 1, 10 uM을 나타내고, CA(콘티넨탈산) 및 KA(카우레노익산) 에서 1, 2, 3은 각각 1, 10, 50 uM 을 나타낸다. # 는 p<0.05 대 p<0.05*, p<0.01**, p<0.001*** 을 나타낸다.

본 발명에서 용어, "녹차(Camellia sinensis)" 는 차나무과에 속하는 상록활엽관목을 말하며, 바람직하게, 상기 녹차 추출물은 에피갈로카테킨 갈레이트(Epigallocatechin gallate, EGCG)를 포함한다.

본 발명에서 용어, "울금(Curcuma longa)"은 생강과의 한해살이 풀을 말하며, 강황 이라고도 불리운다. 바람직하게, 상기 울금 추출물은 커큐민(Curcumin), 디메톡시커큐민(Demethoxycurcumin) 및 비스메톡시커큐민(Bisdemethoxycurcumin)를 포함한다.

본 발명에서 용어, "후박(Magnolia obovata)" 은 목련과에 속하는 낙엽교목을 말하며, 바람직하게, 상기 후박 추출물은 호노키올(Honokiol) 및 4-메톡시호노키올(4-Methoxyhonokiol)을 포함한다.

본 발명에서 용어, "독활(Aralia continentalis)" 은 두릅나무과에 포함되는 다년생 초본으로, 땅두릅, 땃두릅, 강청, 강활이라고도 불리며, 어린 순은 식용으로 사용되며, 뿌리는 약용으로 사용되는 식물을 말한다. 바람직하게, 상기 독활 추출물은 콘티넨탈산(Continentalic acid) 및 카우레노익산(Kaurenoic acid)을 포함한다.

본 발명의 녹차, 울금, 후박 및 독활 추출물은, 건조된 각 식물체의 전초, 뿌리 또는 지상부 (잎, 줄기) 등을 세절하여 무게 (㎏)의 약 1배 내지 20배, 바람직하게는 약 3배 내지 10배의 물, C1 내지 C4의 저급 알콜 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는 에탄올로, 0 ℃ 내지 100 ℃, 바람직하게는 10 ℃ 내지 80 ℃ 추출온도에서 약 1시간 내지 24시간, 바람직하게는 약 2시간 내지 5시간 동안 냉침, 열수추출, 초음파 추출, 환류 냉각 추출방법 등을 이용하여 수득한 추출액을 여과, 감압농축 또는 건조하여 수득할 수 있다. 또한 추가로 통상의 분획 공정을 수행하여 수득할 수도 있다 (Harborne J.B., Phytochemical methods: A guide to modern techniques of plant analysis, 3rd Ed. pp6-7, 1998).

본 발명의 화장료 조성물에서 상기 녹차, 울금, 후박 및 독활 추출물은 조성물의 총 중량을 기준으로 각각 0.00001 내지 15.0 중량%, 보다 바람직하게는 0.0001 내지 10 중량%, 가장 바람직하게는 0.0001 내지 5 중량% 로 포함될 수 있다. 이들 유효성분 추출물의 중량이 0.00001 중량% 미만일 때는 그 효과가 나타나기 어렵고, 15.0 중량%를 초과하는 경우에는 함량의 증가에 따른 효과의 증가가 미약하고 제형상의 안정성이 확보되지 않는 문제점이 있다.

본 발명의 화장료 조성물은, 본 발명의 생약재 추출물들이 나노 소포체에 봉입되어 나노캡슐화됨을 특징으로 한다. 일반적으로 생약재 추출물 함유 화장품은 일반 화장품보다 피부활성능력이 우수하다고 알려져 있으나, 피부를 자극시키거나 발적, 염증을 유발시켜 피부에 대한 부작용이 존재할 수 있고, 화장품 제형에 영향을 미치는 색상과 냄새의 문제가 제기되어 왔다.

이에, 본 발명에서는 생약재 추출물 원료 자체의 피부 안정성과 피부 흡수력 문제를 해결하고 고품질의 화장품을 제공하기 위하여, 나노기술을 접목함으로써 기존 바이오 소재보다 안정적이고 자극이 없으며 유효성이 증대된 기능성 화장료 소재를 제공한다.

캡슐화기술(encapsulation technology)은 고체, 액체, 기체 상의 물질을 차폐하거나 특정 조건하에서 조절된 속도로 내용물을 방출할 수 있도록 어떤 물질이나 조직 내부에 포장하는 기술을 말하며, 나노 크기의 포장단위를 나노캡슐(nanocapsule)이라고 한다. 나노캡슐은 수 나노미터(nm) 내지 수백 나노미터로 정의할 수 있다. 바람직하게, 본 발명에서는 나노 범위에 속하는 50 내지 500 nm 크기의 나노 소구체 제조기술을 적용하여 기능성 화장품의 경피흡수 효능을 높였다.

본 발명의 화장료 조성물은 주름 개선 및 항산화용으로 사용될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, '항산화능' 은 자외선의 영향으로 반응성이 높은 활성 산소와 자유 라디칼(free radical)에 의한 피부 구성 성분의 산화를 억제하는 기능을 의미한다. 활성 산소와 자유 라디칼은 피부를 구성하는 성분들을 산화시켜 과산화물을 생성하고, 그 결과 피부가 구조적 및 기능적으로 손상되어 노화가 촉진되는데, 본 발명의 항산화 기능은 이로부터 피부를 보호하는 기능을 수행한다. 본 발명의 화장료 조성물은 상기 자유 라디칼을 불활성화시키는 기능을 수행할 수 있다.

따라서 본 발명자들은 구체적인 실시예에서는 항산화능과 관련하여, 녹차, 울금, 후박 및 독활 추출물에 포함된 유효 성분들이 DPPH(1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl)을 소거하는 효능을 평가하여 항산화능을 확인하였다 (도 1).

본 발명에서 사용되는 용어, '주름개선'은 피부의 주름 및 탄력과 관련된 능력을 유지 또는 강화시키는 것을 의미한다. 피부의 구조 중에서 진피층에 존재하는 콜라겐 및 엘라스틴이 피부 탄력을 주관하는데, 콜라겐의 생합성은 피부의 내, 외적 영향을 받게 된다. 구체적으로 피부 내적 요인으로는 자연 노화로 인하여 세포 활성이 감소되며, 콜라겐 섬유의 감소가 일어나고, 외적 요인으로는 자외선의 과량 조사 및 스트레스 등으로 인하여 생성된 활성 산소가 단백질의 티올기(thiol: -SH)와 반응하여 효소의 활성을 저해하거나, 콜라겐, 엘라스틴 등을 분해시키는 효소(Matrix Metalloproteinases-1: MMP-1)인 콜라게나아제의 발현을 증가시켜 피부의 주름을 증가시키는 한편 탄력을 감소시키는 결과를 야기한다.

특히, 생체 내에서 세포 외 기질의 합성과 분해는 적절하게 조화되나 노화가 진행되면서 그 합성이 감소하며 콜라겐을 분해하는 효소인 기질 금속 단백질 분해효소 (matrix metalloproteinase, MMP), 특히 MMP-1, MMP-2, MMP-13 등의 발현이 촉진되며 피부의 탄력이 저하되고 주름이 형성된다.

따라서 본 발명자들은 구체적인 실시예에서 주름 개선과 관련하여, 녹차, 울금, 후박 및 독활 추출물에 포함된 유효 성분들이 인간 케라티노사이트에서 MMP-1, MMP-2, MMP-13 의 발현을 억제하는 효능을 평가하였으며, 나아가 인간 케라티노사이트 내의 NF-κB의 활성화 (자외선 또는 TNF-α. IL-1)에 대한 억제 효능 및 인간신생아 포피 유래의 섬유아세포에서 MMP 활성 저해 효능을 평가하였다 (도 2 내지 도 9).

본 발명에서 사용되는 용어, '화장료 조성물'은 상기 추출물을 포함하는 조성물로서 그 제형은 어떠한 형태라도 가능하다. 이러한 제형의 예를 들면 상기 화장료 조성물을 이용하여 제조된 화장료는 크림류, 팩류, 로션류, 에센스류, 화장수류, 파운데이션류 및 메이크업 베이스류 등이고, 본 발명의 목적을 달성하기 위하여 이러한 제형 중 어떠한 형태로도 제조되어 상용화될 수 있으며, 상기 예들에 한정되지 않는다. 바람직하게, 상기 화장료 조성물은 유연화장수, 영양화장수, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 아이크림, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징워터, 팩, 스프레이 및 파우더로 이루어진 군에서 선택된 하나의 제형을 포함할 수 있다.

또한 본 발명에 따른 화장료 조성물은 화장료의 제형 또는 사용목적 등에 맞게 정제수, 보습제, 고급알코올, 고급지방산, 연화제(emollient), 킬레이트제, 점증제, 영영성분, pH조절제, 향료 등을 임의로 추가할 수 있다.

본 발명의 상기 생약체 추출물이 봉입된 나노캡슐을 포함하는 화장료 조성물의 제조방법은, 바람직하게,

(2) 상기 녹차 추출물, 울금 추출물, 후박 추출물 및 독활 추출물을 나노 소포체에 봉입하여 나노캡슐화하는 단계를 포함한다.

상기 녹차 추출물, 울금 추출물, 후박 추출물 및 독활 추출물을 제조하는 단계는, 건조된 각 식물체의 전초, 뿌리 또는 지상부 (잎, 줄기) 등을 세절하여 무게 (㎏)의 약 1배 내지 20배, 바람직하게는 약 3배 내지 10배의 물, C1 내지 C4의 저급 알콜 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는 에탄올로, 0 ℃ 내지 100 ℃, 바람직하게는 10 ℃ 내지 80 ℃ 추출온도에서 약 1시간 내지 24시간, 바람직하게는 약 2시간 내지 5시간 동안 냉침, 열수추출, 초음파 추출, 환류 냉각 추출방법 등을 이용하여 수득한 추출액을 여과, 감압농축 또는 건조하여 수득할 수 있다. 또한 추가로 통상의 분획 공정을 수행하여 수득할 수도 있다.

다음으로, 녹차 추출물, 울금 추출물, 후박 추출물 및 독활 추출물을 나노 소포체에 봉입하여 나노캡슐화하는 단계를 수행할 수 있다.

나노캡슐화의 구체적인 바람직한 양태로, 용매증발 방법(solvent evaporation method), 용매치환 방법(solvent displacement method) 또는 유화 용매 확산법(emulsification solvent diffusion), 초임계유체 추출 공정 등을 사용할 수 있다.

용매증발 방법은 물에 섞이지 않은 휘발성 유기용매에 캡슐화하는 물질과 유용성 물질을 용해하고, 이 용액을 응집방지제가 첨가된 수용액에 분산시켜 입자를 형성하게 한 후 휘발성 유기 용매를 증류시켜 입자를 제조하는 것이다. 이 때, 입자의 크기는 분산시킬 때의 교반 속도에 크게 좌우되며, 일반적인 교반기(agitator)를 사용할 경우에는 수 마이크론 단위의 입자가 형성되며, 고속 교반 유화기(homogenizer)를 사용할 경우에는 수백 나노미터의 입자가 형성될 수 있다. 일반적으로 수십 나노수준의 입자를 얻고자 할 경우에는 고압 유화기(high pressure homogenizer)를 사용하여 100나노미터 이하 크기의 입자를 얻을 수 있다. 상기 용매증발방법을 이용할 경우 유기용매는 휘발성이 높은 용매를 사용하며, 구체적인 예로 메틸렌 클로라이드(methylene chloride), 에틸 아세테이트(ethyl acetate) 등이 있다.

용매치환 방법 또는 유화 용매 확산법은 물과 섞이는 휘발성 유기용매에 캡슐화하는 물질과 유용성 물질을 용해하고, 이 용액을 응집방지제가 첨가된 수용액에 분산시켜 입자를 형성하게 한 후 휘발성 유기 용매를 증류시켜 입자를 제조하는 것이다. 이 방법은 물과 섞이는 휘발성 유기용매를 사용하기 때문에 물과 유기용매의 공용매상에서의 캡슐화하는 물질과 유용성 물질의 용해도 차이에 의해 입자가 형성되므로, 응집방지를 위한 수용성 계면활성제 및 기타 계면활성제를 포함하는 것이 바람직하다. 또한, 캡슐화된 유용성 활성물질의 안정화를 위해서 소수성 계면활성제를 사용할 수 있다. 상기 용매치환 방법을 이용하여 입자제조시 제조된 입자의 크기에 영향을 미치는 인자는 유기용매와 물의 비율, 사용하는 유기용매에 사용되는 캡슐화제 및 난용성 활성 성분의 농도, 소수성 계면활성제의 양, 친수성 계면활성제의 양, 및 교반속도를 들 수 있으며, 일반적으로 이러한 구성성분 및 방법을 통해서 얻어지는 입자의 크기는 100~300㎚ 사이가 된다.

초임계유체 추출공정은 다른 추출공정에 비하여 입자 내에 독성용매나 계면활성제가 없는 관계로 의약품, 식품, 화장품 등에 널리 사용될 수 있으며, RESS(Rapid Expansion of Supercritical Solutions), GAS(Gas Anti-Solvent), SAS(Supercritical fluid Anti-Solvent), ASES(Aerosol Solvent Extraction System), SEDS(Solution Enhanced Dispersion by Supercritical Fluids), PGSS(Particles from Gas Saturated Solutions), RPSS(Reactive Precipitaion in Supercritical Solution) 방법을 사용할 수 있다.

바람직한 양태로서, 본 발명의 화장료 제조방법 중 녹차 추출물, 울금 추출물, 후박 추출물 및 독활 추출물을 나노 소포체에 봉입하여 나노캡슐화하는 단계는,

상기 입자 용액 중 휘발성 유기용매를 증발시켜 제거하는 단계를 포함할 수 있다.

상기에서 생분해성 고분자는 제조된 나노입자가 피부에 침투할 경우 체내 안전성을 고려하여 생체적합성과 생분해성이 우수하여야 하며, 예를 들면 천연고분자류로서 전분, 키토산, 알긴산, 레시틴, 글루코만난, 폴리사카라이드, 아카시아검, Irish moss, karaya gum, gum tragacanth, gum guaiac, xanthan gum, locust bean gum과 이의 유도체가 가능하며, 카세인, 젤라틴, 콜라겐, 알부민, 글로블린, 피브린 등의 단백질과 이의 유도체, 셀룰로오스, 덱스트린, 펙틴, 전분, 아가, 만난 등의 천연유래 카보하이드레이트류와 이의 유도체, 합성된 고분자로서 폴리비닐류 고분자와 이의 유도체(예: 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐메틸에테르, 폴리비닐에테르 등), 폴리카르복시산과 이의 유도체(예: 폴리아크린산, 폴리메타크릴산, 폴리메틸메타그릴레이트 등), 폴리에틸렌, 폴리프로필렌 등의 hydrocarbone류와 이의 이성질체, 폴리사카라이드와 이의 유도체( 폴리슈크로즈, 폴리글루코스, 폴리락토스 및 이의 염류) 등이 가능하며, 상기한 고분자들이 가교화된 형태의 고분자들이 가능하다. 천연유래 고분자는 생체적합성이 우수한 것으로 알려져 있으며, 상기한 고분자류는 생체적합성이 우수한 고분자로서 본 발명의 나노입자에 적용이 가능하다.

또한, 예를 들면, 지방산 고분자(예: 폴리락트산, 폴리글리콜산, 폴리시트린산, 폴리말린산 등)와 이의 유도체, 폴리-, 알파-, 시아노아크린산과 이의 유도체, 폴리-, 베타-, 히드록시부티르산, 폴리알킬렌 옥살레이트(예 : 폴리메틸렌옥살레이트, 폴리테트라메틸렌옥살레이트 등), 폴리오르소에스터류, 폴리오르소카보네이트류, 폴리카보네이트류(예 : 폴리에틸렌 카보네이트, 폴리에틸렌-프로필렌 카보네이트 등), 폴리아미노산(예 : 폴리감마벤질글루타민산, 폴리알라닌, 폴리감마메틸글루타민산 등) 등이 사용 가능하며, 생체적합성은 뛰어나지만 생분해성은 없는 폴리스티렌, 폴리아크린산과 이의 유도체, 폴리메타크린산과 이의 유도체, 아크린산-메타크린산의 공중합체, 폴리아미드(예 : 나이론), 폴리에틸렌테레프탈레이트, 폴리아미노산, 실리콘고분자류, 덱스트란스테아레이트, 에틸셀룰로오스, 아세틸세룰로오스, 니트로세룰로오스, 폴리우레탄, 무수 말레인산 공중합체, 에틸렌-비닐아세테이트 공중합체, 폴리비닐아세테이트, 폴리비닐알코올, 폴리아크릴아미드와 같은 단일고분자 중합체, 두가지 이상의 공중합체 및 상기 고분자의 혼합물이 이용가능하며, 그 유도체와 염류를 이용할 수도 있다.

상기 휘발성 유기용매로는 물에 섞이는 휘발성 유기용매로서 메탄올(Methanol), 에탄올(Ethanol), 아세톤(Acetone), THF(테트라하이드로퓨란), 아세토니트릴(Acetonitrile) 및 1,4-디옥산(Dioxane) 등을 예시할 수 있으며, 물에 섞이지 않는 휘발성 유기용매로서 할로겐화 알칸류(클로로메탄, 디클로로메탄, 클로로포름, 테트라클로로메탄, 디클로로에탄 등), 에틸아세테이트, 디에틸에테르, 시클로헥산, 벤젠, 톨루엔 등을 예시할 수 있다.

상기 단계 (2)에서는 유화제를 첨가할 수 있으며, 유화제로서 폴리옥시에틸렌 유형의 유화제, 포화 및 불포화 알킬설페이트, 지방산의 암모늄, 알칸설포네이트, 지방 알콜 포스포레이트, 지방산 부분 글리세라이드, 폴리글리세롤 에스테르, 지방산의 프로필렌 글리콜 에스테르 및 지방산의 락테이트 등을 예시할 수 있다.

또한, 나노입자를 제조하기 위하여 고압, 고전단력을 이용하여 유화물을 균일한 나노크기의 입자로 만들어주는 마이크로프루다이저(Microfluidics Corporation, USA) 등을 사용할 수 있으며, 압력은 500 bar 내지 1,500bar 사이, 유속은 20ml/min 내지 150ml/min 사이에서 조절할 수 있다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 실험재료의 준비

1-1. 화합물 및 실험기기

녹차(Camellia sinensis)에서 분리한 에피갈로카테킨 갈레이트(Epigallocatechin gallate, EGCG), 울금(Curcuma longa)에서 분리한 커큐민(Curcumin), 디메톡시커큐민(Demethoxycurcumin) 및 비스메톡시커큐민(Bisdemethoxycurcumin), 후박(Magnolia obovata)에서 분리한 호노키올(Honokiol) 및 4-메톡시호노키올(4-Methoxyhonokiol), 독활(Aralia continentalis)에서 분리한 콘티넨탈산(Continentalic acid) 및 카우레노익산(Kaurenoic acid)에 대하여 실험하였다.

시약 및 분석기기로서, D-PBS(Dulbecco's phosphate buffered saline), DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium), 페니실린-스트렙토마이신 혼합용액, 술파닐이미드(sulfanilamide), 나프틸에틸렌디아민 디하이드로클로라이드(naphtylethylenediamine dihydrochloride) 등은 Sigma (St Louis, MO)에서 구입하였고, FBS(fetal bovine serum)는 South Pacific(New Zealand)에서 구입하였고, Geneticin(antibiotic G-418)은 Gibco BRL(Grand Island, NY, U.S.A)에서 구입하여 사용하였다. 관련된 배양디쉬 등은 SPL(Korea)사의 동물세포 배양 적정제품을 구입하여 사용하였다.

실험기기로, BIO-LINK crosslinker(Vilber Lourmat) Ultra violet spectrophotometer (Jasco), Microplate reader (Molecular Device), Microfluorometer (Molecular Device), LAS-1000(Fuji) 을 사용하였다.

1-2. 세포배양

인간의 케라티노사이트 (HaCaT) 세포 및 인간의 신생아 포피 유래의 섬유아세포(fibroblas) 는 10% FBS와 1% 항생제 (penicillinstreptomycin)가 포함된 DMEM하에서 37℃, 5% CO₂가 유지되는 배양기에서 배양하였다. pNF-kB SEAP NPT로 감염시킨 Transfectant HaCaT 세포는 추가로 네오마이신 유도체인 geneticin을 500 μg/㎖ 함께 넣어주어 선별하였다.

실시예 2. DPPH 항산화 효능 측정

시료의 항산화 작용을 측정하기 위하여 DPPH(1,1-dimethyl-2-picrylhydrazyl radical) 소거 활성을 측정하였다. DPPH 용액은 1.5×10^-4 M의 농도로 메탄올에 녹여 사용하였으며 대조군으로는 L-ascorbic acid(비타민 C)를 사용하였다. 다양한 농도의 시료에 DPPH 용액을 처리한 후 30분간 실온에서 반응시킨 후 540 nm에서 흡광도를 측정하여 활성산소 소거율로 나타내었다 (도 1).

실시예 3. Transfectant HaCaT 세포의 NF -κB SEAP 리포터 유전자 어세이

HaCaT 세포를 24웰 플레이트 세포 농도 1X10⁵ cells/well로 조절하여 배양하고 시료 화합물들을 처리하였다. 이후 각 웰로부터 50 ㎕를 취하여 65℃에서 5분간 반응시켜 효소를 불활성화시킨 후 20℃에 보관하고 96 웰 플레이트에 각 샘플 25 ㎕씩을 3 반복구로 배치하고 어세이 버퍼 100 ㎕ (500 μM 4methylumbelliferyl phosphate, 1 mM MgCl2, 2M diethanol amine)를 넣어 37℃에서 60분간 반응시킨 후 360 nm excitation후 449 nm에서 방출되는 형광치를 측정하여, NF-κB의 활성화로 인해 분비되는 알카라인 포스파타아제(alkaline phosphatase)의 활성도를 측정하였다(도 2).

실시예 4. 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR)을 통한 TNF -α, MMP -1, MMP -2 활성 측정

HaCaT 및 신생아 포피 유래의 섬유아세포의 세포현탁액을 각각 12 웰 플레이트에 세포 농도 2X10⁵ cells/well로 분주하고 24시간 배양하여 안정화시킨 후, 후보 화합물군을 농도별로 처리하여 12시간 동안 전처리(pre-treatment)하였다. 이후 각 웰의 배양액을 제거하고 HaCaT 세포주의 경우 D-PBS로 도포한 상태로 UV B 30mJ/cm²을 조사하고, 섬유아세포주의 경우 TNF-α를 10 ng/ml의 농도로 처리한 후 다시 전처리와 같은 조건으로 각 실험 화합물을 재처리하여 5시간 동안 추가 배양하였다. 이후 배양액을 제거하고 Easy-BLUE(IntronBioTech, Korea)를 이용하여 total RNAs를 추출하고, UV-spectrophotometery를 이용하여 260/280 nm값을 구하였다. 각 시료 당 5 μg를 취하고 역전사효소를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 이후 cDNA based PCR을 통해 연쇄적으로 합성하여 MMP-1, MMP-2, TNF-α 등의 PCR산물을 획득하였다. 각 시료의 PCR산물 동일량을 아가로스 젤에 전기영동하여 증폭된 해당 유전자를 분리시킨 후 에티디움 브로마이드(ethidium bromide)로 염색하여 UV illumonator-image analyzer로 촬영하고 분석하였다. Loading control로는 GAPDH를 이용하였다(도 3 및 도 4).

실시예 5. 웨스턴 블랏을 통한 MMP -1, MMP -13 발현의 확인

각 화합물의 MMP-1, MMP-13 유전자발현에 미치는 영향을 확인하고자 웨스턴 블랏을 수행하였다. HaCaT 세포 및 신생아 포피 유래의 섬유아세포의 세포현탁액을 각각 6 웰 플레이트에 세포 농도 3 X 10⁵ cells/well로 분주하고 24시간 배양하여 안정화시킨 후, 각 후보 화합물 군을 농도별로 처리하여 24 시간 동안 전처리(pre-treatment)하였다. 이후 각 웰의 배양액을 제거하고 HaCaT 세포주의 경우 D-PBS로 도포한 상태로 UV B 30 mJ/cm²을 조사하고, 섬유아세포주의 경우 TNF-α를 10 ng/ml의 농도로 처리한 후 다시 전처리와 같은 조건으로 각 실험 화합물을 재처리하여 24 시간 동안 추가 배양하였다. 전 실험 종료 후 용해 버퍼(20 mM Tris-Cl pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM Na2EDTA, 1 mM EGTA, 1% NP-40, 1 mM DTT, 1 mM Na3VO4, 1 mM PMSF 및 protein inhibition cocktail)를 처리하여 총 단백질을 분리하여 UV spectrophotometery 595 nm 값을 이용하여 전 시료의 단백질량을 정량하였다. 10% SDS-PAG에 20 μg의 총 단백질을 로딩하여 분획시킨 후에 일반적인 웨스턴 블랏 방법을 이용하여 blocking, gel-membrane transfer, 1차 항체, 2차 항체 반응을 유도하고 ECL-like reagent인 WEST-Save (AB Fronteer, Korea)를 이용하여 최종 LAS1000로 membrane 상에 발색되는 형광량을 기록하여 비교하였다(도 5 내지 도 8).

실시예 6. ELISA 를 통한 MMP -1 발현 확인

세포 배양액으로 분비된 MMP-1은 RayBioHuman MMP-1 ELISA Kit(Cat#:ELH-MMP1-001)를 이용하여 측정하였다. 섬유아세포에 TNF-α를 처리한 후 24시간 뒤 배지를 모은 뒤 희석하여 측정하였다. 항-인간 MMP-1이 코팅되어있는 플레이트 희석한 배지를 4℃에서 반응시킨 뒤 차례로 MMP-1 항체, HRP-Streptavidin을 반응시키고 TMBtetramethylbenzidine)를 통해 발색을 시켜 450 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다(도 9). 발현된 human MMP-1양은 실험에 사용된 각 처리군의 전체 세포로부터 추출한 total protein를 측정하여 보정하였다 (Bradford 법).

실험 결과

녹차(Camellia sinensis)에서 분리한 에피갈로카테킨 갈레이트(Epigallocatechin gallate, EGCG)는 강한 DHHP 소거능을 나타내었다.

울금(Curcuma longa)에서 분리한 커큐민(Curcumin), 디메톡시커큐민(Demethoxycurcumin) 및 비스메톡시커큐민(Bisdemethoxycurcumin)은 DHHP 소거능을 나타내었으며, 케라티노사이트에서 NF-κB 억제, TNF-α 전사억제 및 MMP-1 억제를 나타내었고, 섬유아세포에서 분비된 MMP-1에 대한 ELISA 에서도 유일하게 효과를 나타내었으며 낮은 농도에서 강한 효과를 나타내는 천연물이라 생각된다.

후박(Magnolia obovata)에서 분리한 호노키올(Honokiol) 및 4-메톡시호노키올(4-Methoxyhonokiol), 그리고 독활(Aralia continentalis)에서 분리한 콘티넨탈산(Continentalic acid) 및 카우레노익산(Kaurenoic acid)은 DHHP 소거능을 나타내었으며, 케라티노이드에서 약한 NF-κB 활성억제 및 TNF-α 전사억제를 나타내고 웨스턴 블랏을 통해 MMP-1의 발현을 감소시키는 것을 확인하였다. (표 1)

기원	화합물명	HaCaT 케라티노사이트			섬유아세포
기원	화합물명	NF-κB	TNF-α	MMP-1	MMP-1 ELISA
울금	커큐민		+	++	++
	디메톡시커큐민	++	++	++	+
	비스메톡시커큐민	++	++	++	+
후박	호노키올	+	-	+	-
후박	4-메톡시호노키올	+	-	++	-
독활	콘티넨탈산	+	-	+	-
독활	카우레노익산	+	-	++	-

실시예 7. 나노 제형의 제작

생분해성 고분자로서 폴리락트산, 폴리글리콜산, IPM (isopropyl myristate) 등의 지방산 고분자를 사용하여 용매 확산법에 의하여 100-200nm 크기의 나노 담체를 제조하고, 유화제(폴리옥시에틸렌 유형의 유화제, 포화 및 불포화 알킬설페이트, 지방산의 암모늄, 알칸설포네이트, 지방 알콜 포스포레이트, 지방산 부분 글리세라이드, 폴리글리세롤 에스테르, 지방산의 프로필렌 글리콜 에스테르, 지방산의 락테이트)를 혼합한 후 고속 교반 유화기(homogenizer)에서 교반하여, 내부에 녹차, 울금, 후박 및 녹활 추출물을 포함된 용매 크림 등 화장품 제형으로 제조하였다.

실시예 8. 나노 제형의 주름개선 관련 효능 평가

건강한 여성 20명을 대상으로 대조군 제품(생리식염수 1cc)과 실시예 7에서 제조한 나노 제형(1cc)을 피험자에게 하루에 2회(아침, 자기 전) 눈 주위에 도포하도록 한 후, 4주 후 및 8주 후에 피부 보습 정도, 탄력감, 주름개선효과, 피부 자극 정도 및 사용감을 관능 평가하도록 하였고, 느껴지는 정도가 우수할 경우에 5점, 전혀 효과가 느껴지지 않을 경우에는 0 점으로 하여 각각 6 단계로 평가하도록 하였다(단, 피부 자극 정도 및 사용감은 자극이 없거나 사용감이 우수한 경우를 0 점, 자극이 심하거나 사용감이 나쁠 경우를 5 점으로 나타내었다.). 그 결과를 표 2에 나타내었다.

	실시예7의 나노 제형		대조군
	4주 후	8주 후	4주 후	8주 후
피부보습정도	3.6	4.2	1.2	1.1
탄력감	2.8	3.1	0.8	0.8
주름개선정도	3.0	4.2	0.9	1.2
피부자극정도	0.0	0.0	0.0	0.0
사용감	0.0	0.0	0.0	0.0

이상에서 본 발명의 바람직한 실시 예에 대하여 설명하였으나, 본 발명은 상술한 특정의 실시 예에 한정되지 아니한다. 즉, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자라면 첨부된 특허청구범위의 사상 및 범주를 일탈함이 없이 본 발명에 대한 다수의 변경 및 수정이 가능하며, 그러한 모든 적절한 변경 및 수정의 균등물들도 본 발명의 범위에 속하는 것으로 간주되어야 할 것이다.

Claims

녹차(Camellia sinensis) 추출물, 울금(Curcuma longa) 추출물, 후박(Magnolia obovata) 추출물, 콘티넨탈산(Continentalic acid) 및 카우레노익산(Kaurenoic acid)이 포함된 나노 캡슐을 포함하는 주름 개선용 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 녹차 추출물은 에피갈로카테킨 갈레이트(Epigallocatechin gallate, EGCG)를 포함하는 것인 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 울금 추출물은 커큐민(Curcumin), 디메톡시커큐민(Demethoxycurcumin) 및 비스메톡시커큐민(Bisdemethoxycurcumin)를 포함하는 것인 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 후박 추출물은 호노키올(Honokiol) 및 4-메톡시호노키올(4-Methoxyhonokiol)을 포함하는 것인 화장료 조성물.
삭제
제1항에 있어서, 상기 나노캡슐은 직경이 50 내지 500 nm 인 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 유연화장수, 영양화장수, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 아이크림, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징워터, 팩, 스프레이 및 파우더로 이루어진 군에서 선택된 하나의 제형을 갖는 것인 화장료 조성물.
(1) 녹차 추출물, 울금 추출물, 후박 추출물, 콘티넨탈산 및 카우레노익산을 제조하는 단계; 및
(2) 상기 녹차 추출물, 울금 추출물, 후박 추출물, 콘티넨탈산 및 카우레노익산을 나노캡슐화하는 단계를 포함하는,
제1항의 화장료 조성물의 제조방법.
제8항에 있어서, 상기 단계 (2)는
녹차 추출물, 울금 추출물, 후박 추출물, 콘티넨탈산 및 카우레노익산과 생분해성 고분자를 휘발성 유기용매에 용해시키는 단계;
상기 용액을 물에 분산 및 교반시켜 입자를 형성하는 단계; 및
상기 입자 용액 중 휘발성 유기용매를 증발시켜 제거하는 단계를 포함하는 것인, 화장료 조성물의 제조방법.