KR102525467B1 - 병아리꽃나무 추출물을 포함하는 항노화용 피부외용제 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 피부의 콜라겐 당화를 억제하여 피부 내 콜라겐 분해 저해를 통한 주름 개선과 피부의 투명도 개선에 도움을 줄 수 있는 병아리꽃나무의 잎, 꽃, 열매, 줄기 및 뿌리 추출물로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 항노화용 피부외용제 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 항산화 효과가 우수하고, 당화반응(glycation)에 의한 콜라겐 당화를 억제하여 피부의 주름 생성을 예방하거나 개선할 수 있으며, 최종당화산물(advanced glycation end products, AGEs)의 생성을 억제하여 피부 단백질 당화에 의한 피부 투명도가 저하되는 것을 개선할 수 있다. 따라서 본 발명의 조성물은 피부노화 방지, 주름 개선 및 피부 톤 개선 등을 위한 의약품, 화장품, 퍼스널 케어 제품 등으로 활용될 수 있다.

Description

병아리꽃나무 추출물을 포함하는 항노화용 피부외용제 조성물{Skin external application composition for anti-aging containing Rhodotypos scandens extract}

본 발명은 병아리꽃나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 항노화용 피부 외용제 조성물에 관한 것이다.

피부의 노화는 나이가 들어가면서 자연적으로 발생하는 변화이며 그 밖에도 자외선, 담배, 식이습관 및 환경오염 등 많은 외부적 인자에 의해서 발생한다. 피부의 노화에는 겉보기 나이의 저하, 살결의 저하, 주름증가, 칙칙함의 증가, 피부기능의 저하 등이 있다. 피부는 나이 듦에 따라 붉은색이 감소, 노란색이 증가, 명도가 낮아지는 색조로 변화하여 피부가 칙칙한 상태로 된다. 칙칙함의 요인에는 피부의 색소침착, 단백질의 당화나 산화에 의한 착색 등이 관여한다.

현재 단백질 당화 억제제로 아미노구아니딘이 친핵성 히드라진(hydrazine)으로 아마도리 산물과 결합하여 단백질과의 교차결합을 방지함으로써 최종당화산물의 생성을 억제하여 가장 유망한 당화 억제제 의약품으로 제 3상 임상실험까지 진행되었으나, 장기간 투여 시 카탈라아제의 저해와 관련된 부작용이 우려되고 있어 안전하고 효능이 우수한 새로운 단백질 당화 억제 소재를 탐색하고자 하는 노력이 계속되어 왔다. 또한 체내 생성된 활성산소는 생체 단백질을 변성시키며, 변성된 생체 단백질은 당과의 반응성이 높아져 당화반응이 유도된다. 이러한 메커니즘에 따라 활성산소로 유도된 산화스트레스 억제능이 우수하고 페놀성 화합물이 풍부한 추출물의 항당화 연구가 최근까지도 활발히 진행되고 있지만 아직 실질적 효능을 구현하기에는 부족한 수준이다.

상기 문제점을 해결하기 위한 본 발명의 목적은 피부노화 방지, 피부주름 방지, 피부주름 개선, 피부 톤 개선 및 피부모공 축소 효과를 상승시키고 인체에 안전하며 장기간 사용하여도 부작용이 없는 항노화용 피부외용제 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 양상은 병아리꽃나무 추출물을 유효성분으로 포함하고, 상기 병아리꽃나무 추출물은 상기 병아리꽃나무의 잎, 줄기, 뿌리, 꽃 및 열매로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 추출물인 항노화용 피부외용제 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 병아리꽃나무 추출물은 우수한 항산화 효과를 나타내며, 콜라겐 당화반응(collagen glycation)과 최종당화산물(advanced glycation end products, AGEs)의 생성을 억제시켜 피부노화 방지, 피부주름 방지, 피부주름 개선, 피부 톤 개선 및 피부모공 축소에 효과적이다.

또한, 피부 세포에 악영향을 미치지 않은 안전성을 가지면서 피부 세포 노화를 방지하므로 피부노화 방지, 피부주름방지 또는 개선, 피부 톤 개선 및 피부모공 축소 등을 위한 의약품, 화장품, 퍼스널 케어 제품 등으로 활용될 수 있다.

도 1은 피부 섬유아세포에 대한 병아리꽃나무의 잎, 줄기, 뿌리 추출물 각각의 농도 별 세포 생존율을 나타낸 그래프이다.
도 2는 병아리꽃나무의 줄기 추출물과 아미노구아니딘 염산염의 섬유아세포 내 카복시메칠라이신(carboxymethyl lysine, CML) 생성 억제 정도를 나타낸 그래프이다.

이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 다만, 본 발명의 설명을 위한 것으로, 본 발명의 범위는 청구범위에 기재된 사항을 기초로 한다.

본 발명은 병아리꽃나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 항노화용 피부외용제 조성물에 관한 것이다.

상기 병아리꽃나무 추출물은 상기 병아리꽃나무의 잎, 줄기, 뿌리, 꽃 및 열매로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 추출물이 바람직하며, 보다 바람직하게는 병아리꽃나무의 잎, 줄기 및 뿌리 추출물로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상이다.

본 발명에 있어서, 상기 ‘항노화’란 피부보호, 피부상태 개선, 피부미백, 피부노화 및 주름의 예방 또는 개선, 피부모공 축소, 피부보호, 피부의 염증 반응 완화, 면역질환 개선능, 피부 장벽기능 개선, 피부자극 완화, 피부세포 증식, 재생능, 항산화능, 콜라겐 합성 증진능 등을 모두 포함하는 개념이다.

또한, 상기 ‘유효성분으로 포함’의 의미는 피부외용제 조성물로써 항노화에 따른 피부 개선 효과를 나타낼 수 있는, 예컨대 피부외용제 조성물로써 주름개선 효능과 관련된 콜라겐 합성, 멜라닌 형성(melanogenesis) 저해에 따른 피부미백 효능, 피부보습, 모공수축 또는 유도형 산화질소 합성 효소(inducible nitric oxide synthase, iNOS) 억제 활성, 피지억제, 항균력 등을 나타낼 수 있는 정도의 유효량을 함유하는 것을 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 항노화용 피부외용제 조성물의 유효성분인 병아리꽃나무는 다음과 같은 특징을 가지고 있다.

상기 병아리꽃나무(Rhodotypos scandens)는 쌍떡잎식물 이판화군 장미목 장미과의 낙엽관목을 의미하며 대대추나무라고도 한다. 높이 2m 정도로 가지에 털이 없고, 잎은 마주나고 달걀 모양으로 가장자리에 겹톱니가 있으며 앞면은 짙은 녹색이고 주름이 지며, 뒷면은 연한 녹색으로 긴 털이 있다. 병아리꽃나무라는 이름은 순백의 하얀 꽃을 병아리에 비유하여 붙여졌다. 한국, 일본, 중국 등지에 분포하며 뿌리는 ‘계마’라고 하여 빈혈 치료에 사용한다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 병아리꽃나무 추출물은 피부 콜라겐 당화반응(collagen glycation)과 최종당화산물(advanced glycation end products, AGEs)의 생성을 억제시킬 수 있다.

피부 노화의 주원인 중 하나인 당화반응(non-enzymatic glycation)이란 단백질의 유리 아미노기인 리신(lysine)이나 아르기닌(arginine)과 환원당의 카보닐(carbonyl)기가 반응하여 초기 당화(glycation) 생성물인 시프 염기(schiff base)를 형성한다. 이 반응은 당류 농도에 의존적으로 진행되며, 수 시간 내 반응이 이루어진다. 생성된 시프 염기(schiff base)는 화학적 재배열(chemical rearrangement)을 통해 안정된 아마도리 산물(amadori product)을 생성하며, 수 일 내 반응이 이루어진다. 아마도리 산물이 체내 축적되어 일련의 산화, 탈수, 축합, 재전위, 분열, 고리화 등의 반응을 통해 단백질과 가교결합을 형성하는데 이 반응은 비가역적으로 이루어진다. 이러한 반응이 수 주에서 수 개월 정도 이루어지면 최종적으로 생성된 갈색 화합물의 당화산물인 최종당화산물(advanced glycation end products, AGEs)을 형성하는데 이 물질은 매우 안정하여 체내 축적될 경우 세포 내 외부에 이상을 초래한다.

또한, 피부 내 생성된 갈색화합물의 최종당화산물(AGEs)이 축적될 경우 피부의 황색증가 및 얼룩을 유발하고, 멜라닌 생성을 촉진시키는 등 겉보기 노화에 관여하기 때문에 피부 항노화 대책으로 당화스트레스의 억제(항당화)를 의식하는 것이 중요하다. 당화반응은 고혈당을 가지는 당뇨환자에서 정상인보다 급격히 일어나지만 정상 혈당의 경우에도 노화가 진행됨에 따라 체내에서 일어나며, 구체적인 당화 대책으로는 식후 고혈당을 억제하고 당화반응을 억제하며 생성한 AGEs를 분해 배설하는 것 등이 있다.

또한, 최종당화산물(AGEs)안에 가장 풍부하게 있는 카복시메칠라이신(carboxymethyl lysine, CML)은 당화 초기생성물의 산화적 분해반응에 의해 발생한다. I 형 콜라겐은 진피 안에서 가장 많은 단백질로 당화의 아주 좋은 표적이 된다. 당화스트레스로 인한 피부 콜라겐의 당화 발생시 콜라겐 단백질 변성 및 진피 내 CML 축적, 그리고 이미 생성된 최종당화산물(AGEs)과 가교결합 등의 반응이 지속됨에 따라 MMP-1(matrix metalloproteinase) 단백질 발현을 높게 유지시켜 콜라겐 분해를 촉진하여 피부의 유연성 및 탄력성이 감소되어 주름이 생성된다.

따라서, 상기 병아리꽃나무 추출물은 피부 콜라겐 당화반응(collagen glycation)과 최종당화산물(advanced glycation end products, AGEs)의 생성을 억제시켜 피부노화 방지, 피부주름 방지, 피부주름 개선, 피부 톤 개선 및 피부모공 축소의 효과가 뛰어나다.

상기 병아리꽃나무 추출물은 상기 피부외용제 조성물 전체 중량에 대하여 0.0001 내지 30중량%로 포함될 수 있으며, 바람직하게는 0.001 내지 10중량%이고, 보다 바람직하게는 0.1 내지 5중량%이다.

상기 병아리꽃나무 추출물의 함량이 0.0001중량% 미만이면 유효한 효과를 나타낼 수 없으며, 30중량%를 초과하면 변색, 변취 등 제형 안정성에 문제가 발생될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 병아리꽃나무 추출물은 물, 유기용매 또는 이들의 혼합물을 사용하여 당업계에 잘 알려진 통상적인 추출 방법에 의하여 추출할 수 있으며, 유기용매를 사용하여 추출하는 것이 바람직하다.

상기 유기용매는 탄소수 1 내지 10의 무수 또는 함유 메탄올, 에탄올, 프로필 알코올, 부틸알코올, 글리세린, 프로필렌글리콜 및 부틸렌글리콜로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.

본 발명에서 있어서, 상기 병아리꽃나무의 줄기 추출물은 상기 병아리꽃나무 줄기를 추출 대상으로 하여 얻어지는 모든 형태의 추출물로서, 예를 들어 식물 줄기에 직/간접적으로 열을 가해 얻는 진액 형태의 추출물, 살아있는 식물 줄기의 윗부분을 잘라 흘러나오는 진액 형태의 추출물, 식물을 유기용매, 물 또는 이들의 혼합물로 추출하여 얻는 추출물, 식물 줄기를 연소시킬 때 기체를 냉각하여 얻는 추출물 등을 모두 포함하는 것이다.

상기 병아리꽃나무의 뿌리 및 잎 추출물은 유기용매, 물 또는 이들의 혼합물로 추출한 추출물을 의미한다.

본 발명에 있어서 상기 병아리꽃나무 열매 추출물은 유기 용매 또는 물을 사용하여 얻어지는 추출물과 병아리꽃나무 열매를 압착하여 얻어지는 진행 형태의 추출물, 용매 추출물을 감압하여 얻어지는 오일 추출물을 포함한다.

본 발명에 있어서 상기 병아리꽃나무 꽃 추출물은 유기 용매 또는 물을 사용하여 얻어진 추출물과, 병아리꽃나무 꽃을 압착하여 얻어지는 진액 추출물, 또는 용매 추출물을 감압하여 얻어진 오일 추출물을 포함한다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 병아리꽃나무 추출물은 병아리꽃나무의 잎, 줄기, 뿌리를 각각 분쇄한 후 유기용매, 예를 들어 50~100%의 탄소수 1 내지 10의 알코올, 에틸아세테이트, 헥산 및 디클로로메탄으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 추출용매로 추출된 추출물일 수 있으며, 또는 물 추출물일 수 있다.

상기 추출물의 제조방법은 냉침 추출법, 온침 추출법 또는 열 추출법 등이 사용될 수 있으며, 통상의 추출기기, 초음파 분쇄 추출기 또는 분획기를 이용할 수 있다.

상기 제조된 추출물은 여과하거나 농축 또는 건조하여 용매를 제거할 수 있다. 상기 여과는 여과지를 이용하거나, 감압 여과기를 이용할 수 있으며, 상기 농축은 감압 농축기, 일 예로 회전 증발기를 이용하여 감압 농축할 수 있고, 상기 건조는 일 예로 동결 건조법으로 수행할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 추출물은 농축 또는 희석하여 사용할 수 있고, 추출물의 증류액을 사용할 수도 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 피부외용제 조성물은 피부주름 방지용, 피부주름 개선용, 피부톤 개선용 또는 피부모공 축소용 조성물일 수 있다.

상기 피부주름 방지, 피부주름 개선은 주름과 관련된 능력을 유지 또는 강화시키는 것을 의미하는 것으로, 콜라겐 당화반응을 감소시켜 효과적으로 최종당화산물의 생성을 억제하여 피부주름 등과 같은 피부노화 현상을 방지할 수 있으며, 상기 피부 톤 개선은 피부에서의 혈액의 순환을 돕고 피부 콜라겐 당화반응을 억제하여 투명하고, 균일한 피부 톤을 만들어 주는 것이다.

또한, 피부 모공이 넓어지는 원인은 피부에 탄력을 주고 지지대 역할을 하는 콜라겐과 엘라스틴의 힘이 떨어지게 되거나, 피부가 늘어져 모공이 커 보이는 것으로 피부 콜라겐 당화반응 억제 활성을 통해 피부 모공을 축소할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 상기 피부외용제 조성물은 특히 프로콜라겐(procollagen) 증가, 콜라겐(collagen) 생합성 증가능을 가지고 있고 피부노화 방지, 피부주름 개선/방지용으로 적용될 수 있으며, 이외에도 미백, 모공수축, 피지억제, 항균, iNOS 억제 활성을 통한 항염, 피부염증 예방, 완화, 경감, 치료용으로 적용될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 피부 외용제 조성물은 상기 병아리꽃나무 추출물 이외에 글리세린, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 폴리옥시에틸렌 경화피마자유, 에탄올, 트리에탄올아민 등을 포함할 수 있으며, 방부제, 항료, 착색료, 정제수 등을 필요에 따라 미량 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 피부 외용제 조성물은, 다양한 형태로 제조될 수 있는데, 예컨대, 화장수, 에센스, 젤, 에멀젼, 로션, 크림(수중유적형, 유중수적형, 다중상), 용액, 현탁액(무수 및 수계), 무수 생성물(오일 및 글리콜계), 젤, 마스크, 팩, 분말, 또는 젤라틴 등의 피막이 있는 캅셀(소프트 캅셀, 하드 캅셀), 연고, 패취, 파운데이션, 메이크업베이스, 자외선차단제, 입욕제, 비누, 액체 세정료, 분무제 제형 등의 형태로 제조될 수 있다.

본 발명에 있어서 피부는 얼굴뿐만 아니라, 두피, 전신도 포함되는 개념으로, 이러한 두피에 적용될 수 있는 피부 외용제 조성물로써, 샴푸, 린스, 트리트먼트, 발모제 등이 있고, 전신에 적용될 수 있는 바디클렌져 등의 용도로써 다양한 형태로 제조될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 병아리꽃나무 추출물을 포함하는 피부 외용제 조성물의 제조방법은 전술한 제조방법에 한정되는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기 제조방법을 일부 변형시킨 방법으로도 본 발명에 따른 병아리꽃나무 추출물을 함유 피부 외용제 조성물을 제조할 수 있다. 특히, 상기 피부 외용제 조성물은 본 발명에 특별히 개시된 제조방법 이외에도, 통상적으로 알려진 제조방법을 이용하여, 일반적인 유화 제형 및 가용화 제형의 형태로 제조될 수 있다. 화장료 조성물로 제조될 경우, 유화 제형의 화장품으로는 영양화장수, 크림, 에센스 등이 있으며, 가용화 제형의 화장품으로는 유연화장수가 있다. 또한, 피부과학적으로 허용 가능한 매질 또는 기제를 함유함으로써 피부과 학 분야에서 통상적으로 사용되는 국소적용 또는 전신 적용할 수 있는 보조제 형태로 제조될 수 있다.

또한, 적합한 화장품의 제형으로는, 예를 들면 용액, 겔, 고체 또는 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀), 비이온형의 소낭 분산제의 형태, 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실스틱의 형태로 제공될 수 있다. 또한, 포말(foam)의 형태 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 제조될 수 있다.

또한, 본 발명의 피부 외용제 조성물은 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 그리고 상기의 성분들은 피부과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 병아리꽃나무 추출물을 포함하는 피부외용제 조성물은 화장료 조성물 또는 약제학적 조성물일 수 있다.

상기 화장료 조성물에 있어서는, 화장품 제제에 있어서 수용가능한 담체를 포함할 수 있다. 여기서, 화장품 제제에 있어서 수용 가능한 담체란 화장품 제제에 포함될 수 있는 이미 공지되어 사용되고 있는 화합물 또는 조성물이거나 앞으로 개발될 화합물 또는 조성물로서 피부와의 접촉시 인체가 적응 가능한 이상의 독성, 불안정성 또는 자극성이 없는 것을 말한다.

상기 담체로서는 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선 산란제, 자외선흡수제, 발색제, 향료 등이 예시될 수 있다. 상기 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선산란제, 자외선흡수제, 발색제, 향료로 사용될 수 있는 화합물/조성물 등은 이미 당업계에 공지되어 있기 때문에 당업자라면 적절한 해당 물질/조성물을 선택하여 사용할 수 있다.

상기 약제학적 조성물은 피부질환 치료, 상처치유 및 피부재생용 조성물로써, 로션, 연고, 겔, 크림, 패취 또는 분무제와 같은 경피 투여형 제형일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

이하, 하기 구체예들을 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 이는 본 발명의 예시일 뿐 본 발명의 권리범위가 이에 한정되는 것은 아니다.

[ 제조예 ] 병아리꽃나무 잎, 줄기, 뿌리 추출물 제조

병아리꽃나무 잎, 줄기, 뿌리를 각각 20 g씩 수거하여 70% 에탄올 수용액 1 L를 넣고 실온에서 48시간 동안 냉침한 후 여과 및 감압 농축하여 잎, 줄기, 뿌리추출물 각각 3 g을 얻었다. 세포 실험을 진행하기 위해 각 추출물들을 DMSO (Dimethyl sulfoxide)에 녹여 시료를 제조하였다.

[ 시험예 1] 병아리꽃나무 추출물의 항산화력 측정

[ 시험예 1-1] 총 폴리페놀( polyphenol )함량 측정

폴리페놀은 몸에 있는 활성산소를 해가 없는 물질로 바꿔주는 항산화물질 중 하나이다. 본 발명의 병아리꽃나무 잎, 줄기, 뿌리 추출물의 총 폴리페놀 함량을 측정하기 위하여 폴린-데니스(Folin-Denis)법을 일부 변형하여 폴린-시약(Folin-reagent)이 추출물의 페놀성 화합물에 의해 환원되면 몰리브덴(molybdenum)의 청색으로 발색되는 원리를 이용하여 정량 하였다. 병아리꽃나무 잎, 줄기, 뿌리 추출물(1 mg/ml) 100 ㎕에 폴린-시오칼토 시약(folin-ciocalteu reagent) 200 ㎕을 가한 후 700 mM Na₂CO₃용액 800 ㎕를 혼합하고 실온에서 40분 방치한 후 microplate reader를 이용하여 750 nm에서 흡광도를 측정하였다. 갈릭 산(Gallic acid, sigma)를 표준물질로 사용하여 0~500 μg/ml 농도로 제조한 후 시료와 동일한 방법으로 분석하여 얻은 표준검량 선으로부터 병아리꽃나무 잎, 줄기, 뿌리추출물의 폴리페놀 함량을 분석하고, 그 결과를 갈릭 산 당량(GAE, gallic acid equivalents)으로 하기 표 1에 나타내었다.

시험물질		총 폴리페놀 함량 (㎛ GAE/mg 병아리꽃나무 추출물)
병아리꽃나무	잎	59.86
	줄기	89.64
	뿌리	131.54

표 1에서 나타나는 바와 같이, 병아리꽃나무 잎, 줄기, 뿌리 추출물의 폴리페놀 함량은 각 1 mg 당 59.86 μg, 89.64 μg, 131.54 μg을 함유하고 있어, 병아리꽃나무 뿌리추출물의 총 폴리페놀 함량이 매우 높음을 알 수 있다.

[ 시험예 1-2] DPPH 항산화 효과 측정

DPPH(1,1-diphenyl-2-picrydrazyl) 법에 의한 항산화 활성을 측정하였다. DPPH법은 DPPH라는 유리기를 사용하여 환원력에 의한 자유라디칼 소거활성을 측정하는 것이다.

96-웰 플레이트(well-plate)에 연속희석법(serial dilution)으로 각 시료 50 ㎕를 넣은 후, 0.2 mM DPPH(Sigma, St. Louis, USA) 용액 100 ㎕를 첨가하여 30분간 반응을 시켰다. 시료에 의해 DPPH가 환원되어 흡광도가 감소하는 정도를 대조군의 흡광도와 비교하여 파장 517 nm에서 자유라디칼 소거율을 측정하였고, 그 결과를 표 2에 나타내었다.

자유라디칼 소거활성(scavenging activity, %)은 다음의 수학식 1로 산출하였다.

<수학식 1>

자유라디칼 소거활성 (%) = (A - B) / A X 100

A : 시료를 처리하지 않은 대조군의 흡광도

B : 시료를 처리한 시험군의 흡광도

자유라디칼 소거활성이 50% 감소하는데 필요한 시료의 농도를 SC 50으로 나타냈다.

시험물질		DPPH radical SC 50(ppm)
병아리꽃나무	잎	464.6
	줄기	250
	뿌리	125
라스베라트롤		61.69

상기 표 2에서 볼 수 있는 바와 같이, 병아리꽃나무 추출물은 뿌리, 줄기, 잎 순으로 DPPH 라디칼 소거능이 우수하였으며, 특히 뿌리 추출물은 항산화 실험에서 대조군으로 사용된 대표적인 항산화 물질인 라스베라트롤의 약 50% 수준의 우수한 항산화 효과를 나타내었다.

[ 시험예 2] 단백질 당화 (protein glycation ) 반응 저해 효과 측정

우혈청 알부민(bovine serum albumin, BSA; Sigma, St. Louis, USA)을 반응 기질로 하여 당화 반응을 수행하고 형광 변화 정도를 측정함으로써 각 시료의 단백질 당화 반응 저해 효과를 측정하였다.

우선 글리옥살(glyoxal) 용액(100 mM) 0.4 ml과 PBS buffer (pH 7.4)에 희석한 500 ppm 농도의 각 시료 용액 0.4 ml을 첨가하여 37℃에서 2시간동안 반응시킨 후, 0.2 ml BSA 용액 (20 mg/ml)을 넣어 추가로 48시간동안 같은 온도에서 반응시켰다. 또한 0.02% 소디움 아자이드(sodium azide)를 넣어 반응기간 동안 미생물의 오염을 방지하였다. 각 시료에 의한 형광도의 간섭을 배제하기 위하여 BSA를 처리하지 않은 시료 처리군도 함께 제조하여 같은 기간 반응시켰다. 시료의 경우 당화반응이 일어나지 않은 각 시료의 형광도를 배제한 값을 사용하였다. 양성대조군으로는 아미노구아니딘 염산염(aminoguanidine-HCl)을 사용하였고, 반응 후 Victor X2 형광분광분석기(Perkin Elmer Inc.)를 이용하여 들뜸파장(Ex: Excitation wavelength) 355 nm, 방출파장(Em: Emission wavelength) 485 nm로 조정하여 형광도를 측정하였다.

최종당화산물 생성 저해율은 다음의 수학식 2로 산출하였다.

<수학식 2>

최종당화산물 생성 저해율(%) = 100-{(샘플처리군-블랭크 값)/(음성대조군-블랭크 값)}X100

시료		농도(ppm)	최종당화산물 생성 저해율(%)
무처리군		-	0
아미노구아니딘 염산염 (Aminoguanidine HCl) (양성대조군)		500	64.5
병아리꽃나무	잎	500	25.2
	줄기	500	18.2
	뿌리	500	16.3

상기 표 3에서 알 수 있는 바와 같이, 500 ppm의 병아리꽃나무 추출물은 잎, 줄기, 뿌리 순으로 최종당화산물 생성 저해율이 우수하였으며, 특히 잎 추출물은 같은 농도의 아미노구아니딘 염산염의 약 40% 수준의 우수한 당화반응 억제효과를 나타내었다.

[ 시험예 3] 병아리꽃나무 추출물의 피부 섬유아세포 생존율 측정

본 발명의 병아리꽃나무 추출물의 인간 정상 피부 섬유아세포(CCD-986sk)에 대한 세포독성을 측정하기 위해 세포를 1X10⁴ cells/well 농도로 96-well plate에 분주한 후 37℃, 5% CO₂ 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 배양배지를 제거 후 무혈청배지에 희석한 10~100 ppm 농도의 병아리꽃나무 추출물을 세포에 처리하여 24시간 동안 추가 배양하였다. 배양 후, 세포 생존율을 확인하기 위하여 배양배지를 제거 후 각 well 당 0.5 mg/ml 농도의 MTT용액 200 ㎕를 처리하여 3시간동안 반응시켰다. 생성된 포마잔(formazan)을 DMSO 100 ㎕로 용해시켜 micro-plate reader를 이용하여 540 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 정상 대조군으로는 추출물을 처리하지 않은 well의 세포 생존율을 100%으로 하여 병아리꽃나무 추출물 처리군의 세포 생존율을 수학식 3에 따라 계산하여 산출한 결과를 도 1에 나타내었다.

<수학식 3>

섬유아세포 생존율(%) = (A/B) X 100

A: 시료를 처리한 시험군의 흡광도

B: 시료를 처리하지 않은 대조군의 흡광도

도 1에 나타낸 바와 같이, 병아리꽃나무 잎, 줄기, 뿌리 추출물을 10~100 ppm 피부 섬유아세포에 처리하였을 때 모두 100 ppm까지 독성이 보이지 않았으며, 추출물을 처리시 정상 대조군보다 더 높은 세포 생존률을 보이는 것으로 확인되었다. 따라서, 본 발명의 따른 병아리꽃나무 잎, 줄기, 뿌리 추출물은 100 ppm 농도까지는 세포 독성이 없어 안전한 것으로 확인되었으며, 피부 섬유아세포의 증식 촉진제로서 우수한 활성을 나타냄을 확인하였다.

[ 시험예 4] 당화스트레스에 의한 콜라겐 당화 저해 효과 측정

시험예 3과 같은 방법으로 세포 분주를 하여 24시간 배양을 한 뒤, 배양배지를 제거 후 무혈청배지에 희석한 10, 25, 50 ppm 농도의 병아리꽃나무 잎, 줄기, 뿌리추출물을 세포에 처리하여 24시간 동안 추가 배양하였다. 24시간 후, 무혈청배지에 희석한 0.5 mM의 글리옥살(glyoxal)을 48시간 처리하여 세포에 당화스트레스를 유발하였다. 48시간 반응이 끝난 후, 각 웰의 상층액을 모아 Human pro-collagen 1 alpha 1 분석 키트 (R&D system, DY6220-05)를 이용하여 상층액의 프로콜라겐 함량(pg/ml)을 측정하였다. 병아리꽃나무 추출물을 처리시 콜라겐 당화 억제로 인한 콜라겐 회복률(%)을 구하기 위해 정상 대조군으로는 시료와 글리옥살을 처리하지 않은 well의 상층액 내 콜라겐 함량을 100%으로 하여 정상 대조군 대비 글리옥살만 처리군 (음성대조군)과 시료 및 글리옥살 처리군의 콜라겐 생성률(%)을 계산하여 결과를 표 4에 나타내었다.

	시료	농도(ppm)	정상대조군 대비 콜라겐 생성률(%)	음성대조군 대비 콜라겐 생성 회복률(%)
	정상대조군	-	100	-
글리옥살 (glyoxal) 0.5mM	음성대조군	-	71.61	0
	병아리꽃나무 잎 추출물	10	78.82	10.08
		25	76.31	6.58
		50	60.78	-
	병아리꽃나무 줄기 추출물	10	79.33	10.78
		25	83.16	16.12
		50	95.56	33.44
	병아리꽃나무 뿌리 추출물	10	73.21	2.23
		25	74.88	4.57
		50	73.27	2.31

표 4에서 알 수 있는 바와 같이, 음성대조군에서 정상대조군 대비 71.61%의 콜라겐 생성률을 보여 세포에 당화스트레스를 유도시 콜라겐 생합성 저해 및 콜라겐 당화가 일어나는 것을 확인하였다. 한편 병아리꽃나무 잎, 줄기, 뿌리 추출물을 10, 25, 50 ppm 농도로 선처리 후 당화스트레스를 유도시 잎 추출물은 10 ppm에서 최고 10.08%의 콜라겐 생성 회복률을 보였으며, 줄기 추출물은 처리 농도의존적으로 회복률이 증가하여 50 ppm에서 최고 33.44%의 회복률을 보였다. 그리고 뿌리 추출물은 25 ppm에서 최고 4.57%의 회복률을 확인하였다.

따라서, 상기 표 4의 결과와 같이, 본 발명의 병아리꽃나무 추출물, 특히 병아리꽃나무의 줄기 추출물에서 우수한 피부 콜라겐 당화 억제 활성을 나타냄을 확인하였다.

또한, 표 4에는 명시하지 않았지만 0.5 mM의 글리옥살(glyoxal)을 48시간 처리시 정상대조군 대비 90% 이상의 세포 생존율을 확인하여 세포 사멸에 크게 영향을 미치지 않은 글리옥살 농도 내에서 세포에 당화스트레스를 유발하였다.

[ 시험예 5] 당화스트레스에 의한 섬유아세포 내 carboxymethyl lysine( CML ) 생성 저해효과 측정

콜라겐 당화 억제 효과가 우수하였던 본 발명의 병아리꽃나무 줄기 추출물의 피부 섬유아세포 내 최종당화산물인 CML의 생성 저해효과를 측정하기 위해 세포를 4x10⁵ cells/well 농도로 100 mm dish에 분주한 후 37℃, 5% CO₂ 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 배양배지를 제거 후 무혈청배지에 희석한 25, 50 ppm 농도의 병아리꽃나무 줄기 추출물과 10 ppm 농도의 아미노구아니딘 염산염을 세포에 처리하여 24시간 추가 배양하였다. 24시간 후, 무혈청배지에 희석한 0.5 mM의 글리옥살(glyoxal)을 72시간 처리하여 세포에 당화스트레스를 유발하였다. 72시간 반응이 끝난 세포는 PBS buffer로 2회 세척한 후 RIPA lysis buffer를 첨가하고 4℃에서 5분간 lysis 시킨 후 12,000 rpm에서 10분간 원심 분리하였다. 상층액을 취하여 동일하게 단백질 정량한 후 CML competitive ELISA kit (Cell biolabs, STA-816)를 이용하여 상층액의 CML 함량(μg/ml)을 측정하였다. 병아리꽃나무 줄기추출물 처리시 피부 섬유아세포 당화 억제로 인한 세포 내 CML 생성 억제 정도를 확인하기 위해 글리옥살만 처리한 음성 대조군의 CML 함량을 100%으로 하여, 음성 대조군 대비 정상 대조군(시료와 글리옥살 무첨가)과 병아리꽃나무 줄기 추출물 및 아미노구아니딘 염산염 처리군의 CML 생성률(%)을 계산하여 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 피부 섬유아세포에 0.5 mM의 글리옥살을 처리시 정상대조군 대비 4배가량 CML 생성률이 증가되었으며, 병아리꽃나무 줄기 추출물을 25, 50 ppm 처리하였을 때 음성 대조군 대비 CML 생성률이 각각 8.19%, 21.23%씩 억제되는 것을 확인하였다. 아미노구아니딘 염산염은 농도 별로 24시간 처리하였을 때 10 ppm까지 세포 독성을 보이지 않아 해당 농도를 세포에 처리하였으며, CML 생성률이 21.66% 억제되는 것을 확인하였다. 병아리꽃나무 줄기 추출물의 세포 독성이 나타나지 않은 농도 범위 한에서는 50 ppm에서 최고 21.23%으로 10 ppm의 아미노구아니딘 염산염과 비슷한 수준의 CML 생성 억제 정도를 보임으로써 훨씬 안전하면서 피부 세포 당화 억제 효과가 우수한 것을 확인하였다.

상기 시험 결과에 따르면, 본 발명에 따른 병아리꽃나무 추출물을 처리시 항산화 활성, 콜라겐 당화 억제, 그리고 최종당화산물 생성 억제하는 효과가 있음을 확인하였다. 특히 단백질 당화 억제제로 알려져 있는 아미노구아니딘 염산염보다 세포 독성은 적으면서, 세포내 당화 억제효과가 비슷한 것을 확인하여 본 발명에 따른 조성물은 피부 내 당화스트레스로 유도된 피부노화, 주름 및 피부 투명감 저하를 효과적으로 개선시킬 수 있다.

이하, 상기 시험예의 결과를 근거로 하여, 병아리꽃나무 줄기 추출물을 이용한 여러 제형예를 조성하여 제시한다. 그러나 이들 제형예는 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 제형이 이들 제형예에만 국한되지 않는 다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진자에게 있어서 자명한 것이다.

< 제형예 1> 유연 화장수(skin toner)

성분명	함량 (중량%)
병아리꽃나무 줄기 추출물	1.0
글리세린	5.0
1,3-부틸렌글리콜	3.0
에탄올	5.0
폴리옥시에틸렌노닐페닐에테르	0.5
향료	적량
방부제	적량
정제수	잔량

< 제형예 2> 수렴 화장수(astringent)

성분명	함량 (중량%)
병아리꽃나무 줄기 추출물	1.0
글리세린	3.0
구연산	0.1
에탄올	10.0
폴리옥시에틸렌올레일에테르	1.0
소르비톨	2.0
향료	적량
벙부제	적량
정제수	잔량

< 제형예 3> 로션(emulsion)

성분명	함량 (중량%)
병아리꽃나무 줄기 추출물	1.0
글리세린	5.0
1,3-부틸렌글리콜	8.0
스쿠알란	10.0
모노올레인산폴리옥시에틸렌소르비탄	2.0
트리에탄올아민	1.5
글리세릴스테아레이트	0.5
스테아릴글리시레티네이트	0.2
카르복시비닐폴리머	0.1
아르기닌	0.1
향료	적량
방부제	적량
정제수	잔량

< 제형예 4> 크림(cream)

성분명	함량 (중량%)
병아리꽃나무 줄기 추출물	1.0
글리세린	5.0
스테아린산	8.0
스쿠알란	5.0
자기유화형 모노스테아린산 글리세린	2.5
모노스테아린산 폴리옥시에틸렌 소르비탄	1.5
프로필렌 글리콜	4.0
스테아릴글리시레티네이트	0.2
바셀린	2.0
산화방지제	적량
향료	적량
방부제	적량
정제수	잔량

< 제형예 5> 연고제(ointment)

성분명	함량 (중량%)
병아리꽃나무 줄기 추출물	1.0
세토스테아릴알코올	2.0
자기유화형 모노스테아린산	2.0
스테아린산	1.0
밀랍	4.0
스쿠알란	7.0
모노스테아린산 글리세린	3.0
모노스테아린산 소르비탄	1.0
폴리솔베이트 80	3.0
글리세린	5.0
프로필렌글리콜	4.0
향료	적량
바셀린	잔량

Claims (9)

1. 병아리꽃나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 항노화용 피부외용제 조성물이고,
   상기 병아리꽃나무 추출물은 상기 병아리꽃나무의 잎, 줄기, 뿌리, 꽃 및 열매로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 추출물이고,
   상기 항노화용 피부외용제 조성물은 피부주름 방지용, 피부주름 개선용, 피부톤 개선용 또는 피부모공 축소용 조성물인 것을 특징으로 하는 항노화용 피부외용제 조성물.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 병아리꽃나무 추출물은 피부 콜라겐 당화반응(collagen glycation) 및 최종당화산물(advanced glycation end products, AGEs)의 생성을 억제시키는 것을 특징으로 하는 항노화용 피부외용제 조성물.
   
3. 제1항에 있어서,
   상기 병아리꽃나무 추출물은 상기 피부외용제 조성물 전체 중량에 대하여 0.0001 내지 30중량%로 포함되는 것을 특징으로 하는 항노화용 피부외용제 조성물.
   
4. 제1항에 있어서,
   상기 병아리꽃나무 추출물은 물, 유기용매 또는 이들의 혼합물로 추출되는 것을 특징으로 하는 항노화용 피부외용제 조성물.
   
5. 제4항에 있어서,
   상기 유기용매는 탄소수 1 내지 10의 무수 또는 함유 메탄올, 에탄올, 프로필알코올, 부틸알코올, 글리세린, 프로필렌글리콜 및 부틸렌글리콜로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 항노화용 피부외용제 조성물.
   
6. 삭제
7. 제1항에 있어서,
   상기 항노화용 피부외용제 조성물은 화장수, 에센스, 로션, 크림, 팩, 젤, 연고, 패취, 파운데이션, 메이크업베이스, 자외선차단제, 입욕제, 비누, 액체 세정료 및 분무제로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 제형인 것을 특징으로 하는 항노화용 피부 외용제 조성물.
   
8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 병아리꽃나무 추출물을 포함하는 화장료 조성물.
   
9. 삭제

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