KR102431820B1 - 당유자 및 황칠 추출물을 포함하는 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 천연 추출물을 포함하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 당유자 및 황출 추출물을 유효성분으로 포함하는 주름 개선 및 미백 기능용 화장료 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 화장료 조성물은 다양한 세포실험 및 인체실험을 적용한 결과 모두에서 피부 주름생성 관련인자의 발현을 억제하고, 항산화 활성이 우수하였으며, 콜라겐 생성능력을 입증하였으며, 임상시험에서도 탁월한 개선효과와 안전성을 확인하여 다양한 피부 기능성 성분으로 활용될 수 있을 것이다.

Description

당유자 및 황칠 추출물을 포함하는 화장료 조성물 {Cosmetic composition comprising extract of Citrus grandis Osbeck and Dendropanax morbifera}

본 발명은 천연 추출물을 포함하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 당유자 및 황출 추출물을 유효성분으로 포함하는 주름 개선 및 미백 기능용 화장료 조성물에 관한 것이다.

피부는 인체의 일차 방어막으로서 체내의 기관을 온도 및 습도 변화와 자외선, 공해물질 등 외부환경의 자극으로부터 보호해 주는 기능을 가지고 있다. 그러나, 나이가 들어감에 따라 내적으로는 신진대사를 조절하는 각종 호르몬의 분비가 감소하며 면역 세포의 기능과 세포들의 활성이 저하되고, 외적으로는 오존층 파괴로 인하여 태양 광선에 자외선 함량이 증가하게 되고 환경오염이 더욱 심화됨에 따라 자유 라디칼 및 활성 유해 산소 등이 증가함으로써 생기는 과도한 물리적, 화학적 자극 및 스트레스 등은 피부의 정상기능을 저하시키고 멜라닌 침착에 의한 기미, 주근깨 등이 생성되며, 피부의 노화현상을 촉진하여 피부를 손상시키게 된다.

특히, 고령화 사회에 접어들면서 안티에이징에 대한 소비자의 관심과 자연성, 식물성, 천연성을 선호하는 니즈가 크게 강화되면서 실제 피부개선, 노화방지 등의 기능성 효과가 우수한 원료의 개발의 지속적으로 요구되고 있다. 비타민 C 및 유도체, 알부틴(arbutin), 코지산(kojic acid)등이 개발되어 이를 함유한 미백화장품이 시판되고 있으나 저농도로의 사용만 허가되고 있으며, 기능성 화장품의 주원료였던 많은 소재들의 안전성 문제에 따른 시장에서의 쇠퇴 이후 현재까지 안정성과 효과성을 만족하는 원료는 부족한 실정이다. 최근 기능성 기존 고시성분과 관련하여 물질의 불안전성, 알레르기 유발, 피부의 영구 탈색, 발암성 물질, 피부 효소에 의한 분해 등의 문제점이 부각되면서 기능성 비고시 성분에 대한 관심이 매우 높아지고 있다.

따라서, 피부미백 및 주름개선 기능이 강조된 화장품 소재 및 제품 개발이 활발히 이루어지고 있으며, 기능성화장품은 소재에 의해 차별화가 이루어지기 때문에 소재의 효능과 안전성을 모두 충족시킬 수 있는 차별화된 독특한 소재에 대한 연구개발이 절실한 상황이다. 국내 중심으로 전통의약을 근거로 한 천연물 연구가 활발히 진행되고 있으며, 이를 산업화, 제품화 및 세계화로 연계하려는 노력들이 진행되고 있는 실정임 피부주름방지나 피부개선을 위한 효능성분은 주로 천연물소재보다는 합성의약품 분야가 많은 연구가 진행되고 있어서 천연물이 가지는 낮은 독성, 다양한 화합물군, 천연색소 등의 장점을 이용한 피부노화방지 화장품 개발이 필요하다.

현재까지 여러 가지 기능성물질이 개발되어 사용되고 있으나, 실질적인 임상효과는 만족스럽지 못한 상황이며, 일부 천연소재가 개별적 기능성을 인증 받아 사용 중에 있으나 식약청고시 사용 기능성물질이 제한적이어서 시장 성장률과 매출확대에 비해 핵심물질 개발의 걸림돌로 작용하고 있으며 개발되는 천연소재의 경우 비교적 고가의 소재가 많다. 천연물은 합성원료보다 부작용이 적고 안전하며, 소재를 화장품에 적용 시 안전하면서 특정 기능성이 강화된 제품개발이 용이하다.

따라서, 안전성이 보장될 수 있는 천연물을 이용하여 미백 및 주름 개선과 같은 복합 기능을 가지는 새로운 소재 개발이 필요하며, 그 기능 성분을 극대화하고 수율을 증진 및 경제성을 가질 수 있는 공정개선과 기능성 성분들을 충분한 임상효과의 입증이 따라야 할 것이다.

본 발명자들은 주름 개선 및 미백 효과가 매우 우수하면서도, 안전성을 보장 될 수 있는 새로운 천연 추출물 소재의 화장료 또는 약학적 조성물 및 그 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 당유자 및 황칠 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 당유자 및 황칠 추출물을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 a) 당유자 및 황칠을 혼합하여 준비하는 단계; 및

b) 상기 a)단계에서 준비된 혼합물을 추출하는 단계;를 포함하는 화장료 조성물 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은 다양한 세포실험 및 인체실험을 적용한 결과 모두에서 피부 주름생성 관련인자의 발현을 억제하고, 항산화 활성이 우수하였으며, 콜라겐 생성능력을 입증하였으며, 특히 임상에서 통계적으로 유의미한 주름개선 효과등을 입증하였다. 특히 천연물에 함유된 기능 성분들이 효과적으로 추출될 수 있도록 공정의 최적화를 통한 수율 증가 및 기능강화 효과를 개선시킬 수 있었다. 결국, 천연 추출물을 이용하여 안전하면서도 탁월한 피부 개선효과를 가지는 피부 외용 기능성 성분으로 화장료, 약학 및 세정용등의 다양한 용도로 활용될 수 있을 것이다.

도 1은 실시예 2 추출물의 함염증활성을 보여주는 그래프이다.
도 2는 실시예 2 추출물의 세포 독성을 보여주는 그래프이다. .
도 3은 실시예 2 추출물의 (a)MITF, (b)tyrosinase, (c)TRP-1, (d)TRP-2단백질 발현 수준을 보여주는 그래프이다.
도 4(a)는 프로콜라겐 Ⅰ(Procollagen I)의 발현 수준을 보여주는 것이며, 도4(b)는 relative protein level (% of collagen/NT)를 보여주는 것이다.
도 5(a)는 단백질 발현, (b)는 MMP-2의 mRNA 발현, (c)는 MMP-3의 발현, (d)는 MMP-9의 발현을 보여주는 것이다.
도 6은 피부장벽 개선효과를 보여주는 것이다.
도 7은 미백개선효과를 보여주는 것이며, 도 7(a)는 L*의 수준변화이고, (b)는 ITA°의 수준변화를 보여주는 것이다.
도 8는 주름개선효과를 보여주는 것이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 명세서에서 "피부"라 함은, 동물의 체표를 덮는 조직을 의미하는 것으로서, 얼굴 또는 바디 등의 체표를 덮는 조직뿐만 아니라, 두피와 모발을 포함하는 최광의의 개념이다.

본 명세서에서 "추출물"이라 함은, 천연물로부터 그 안의 성분을 뽑아냄으로써 얻어진 물질이라면, 뽑아내는 방법이나 성분의 종류와 무관하게 모두 포함한다. 예컨대, 물이나 유기 용매를 이용하여 천연물로부터 용매에 용해되는 성분을 추출해 낸 것, 천연물의 특정 성분, 예컨대 오일과 같은 특정 성분만을 추출하여 얻어진 것 등을 모두 포함하는 광의의 개념이다.

본 발명은 당유자 및 황칠 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다. 일 측면으로, 상기 조성물은 주름 개선 및 미백용인 것이다.

일 측면으로, 상기 추출물은 물, 유기용매 및 물과 유기용매의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상으로 추출한 것이다.

일 측면으로, 상기 추출물은 조성물 총 중량에 대하여 0.001 내지 50 중량%로 함유되는 것이다.

일 측면으로, 상기 추출물은 당유자와 황칠이 건조중량으로 각각 1:1 내지 1:10의 조성으로 혼합되는 것이며, 바람직하게는 1:5로 혼합되는 것이다.

일 측면으로, 상기 조성물은 유연화장수, 영양화장수, 마사지크림, 영양크림, 모이스쳐 크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 크림, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디크림 및 팩으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 제형을 가지는 것이다.

당유자(Citrus grandis Osbeck)는 제주도 재래 감귤류로 제주도에서 왕귤 또는 뎅유지라고 불리는 제주 재래 감귤로서, 분류학상 운향과, 감귤아과에 속하는 과수이며 인체에 기능성을 가지는 많은 유효성분등을 함유하고 있으며 최근 유자 및 당유자를 이용한 기능성식품 개발 및 생리활성에 대한 연구가 보고되고 있다. 본 발명의 일측면에서, 당유자는 잎, 가지, 줄기, 꽃, 열매, 과피, 뿌리 또는 뿌리 껍질을 예로 들 수 있는 모든 부위를 포함한다.

황칠나무(Dendropanax morbifera Lev.)는 두릅나무과 나무로, 만병통치 나무라는 뜻의 학명 덴드로 파낙스(Dendropanax morbifera)를 가지고 있을 정도로 그 약리학적 효능이 매우 뛰어난 약용식물이다. 세계에서 오직 한국에서만 서식하며, 한국에서도 해남 완도 등의 남부지역과 제주도에서만 자생하며 겨울에도 낙엽이지지 않는 수종으로 매우 귀한 약용식물이다.

본 발명의 일측면에서, 당유자 추출물 또는 황칠 추출물은 각각 물, 유기 용매 및 물과 유기 용매의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상으로 추출한 추출물을 포함한다. 상기 유기 용매는 알코올, 아세톤, 에테르, 에틸아세테이트, 디에틸에테르, 에틸메틸케톤 및 클로로포름으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 알코올은 C1~C5의 저급 알코올을 포함하며, C1~C5의 저급 알코올은 메탄올, 에탄올, 이소프로필알코올, n-프로필알코올, n-부탄올 및 이소부탄올로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 물푸레나무 추출물을 제조하는 방법은 본 발명 기술 분야에 알려져 있는 통상의 방법을 선정하거나 그로부터 응용하여 적용할 수 있다. 일 측면에서 바람직하게는 50 내지 70% (v/v) 에탄올이며, 20℃ 내지 50℃에서 2일 내지 10일간, 구체적으로 25℃ 내지 35℃에서 3일 내지 5일간 추출될 수 있다. 용매의 사용량에는 특별한 제한이 있는 것은 아니나, 추출 효율, 조성물의 효능 또는 경제성 등을 고려할 때 용매의 양은 추출 대상 천연물의 건조 중량 대비 1 내지 1000배 정도 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은 상기한 물질 이외에 주 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서, 바람직하게는 주 효과에 상승 효과를 줄 수 있는 다른 성분들을 포함할 수 있다. 구체적으로, 본 발명에 따른 화장료 조성물의 피부 미백 효과를 상승시킬 수 있는 알부틴, 아스코르브산 유도체를 더 포함할 수 있다. 또한 본 발명에 따른 화장료 조성물은 보습제, 에몰리언트제, 계면 활성제, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, pH 조정제, 유기 및 무기 안료, 향료, 냉감제 또는 제한(制汗)제를 더 포함할 수 있다. 상기 성분의 배합량은 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 당업자가 용이하게 선정 가능하며, 그 배합량은 조성물 전체 중량을 기준으로 0.001 내지 50 중량%, 구체적으로 0.01 내지 30 중량%일 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물 내에 더 추가될 수 있는 담체, 부형제, 방부제, 향료, 염료, 수렴제 등이 추가될 수 있다. 상기 담체로서는 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선 차단제, 발색제, 향료 등이 예시될 수 있다.

상기 오일로서는 수소화 식물성유, 피마자유, 면실유, 올리브유, 야자인유, 호호바유, 아보카도유가 이용될 수 있으며, 왁스로는 밀랍, 경랍, 카르나우바, 칸델릴라, 몬탄, 세레신, 액체 파라핀, 라놀린이 이용될 수 있다.

지방산으로는 스테아르산, 리놀레산, 리놀렌산, 올레산이 이용될 수 있고, 지방산 알콜로는 세틸 알콜, 옥틸 도데칸올, 올레일 알콜, 판텐올, 라놀린 알콜, 스테아릴 알콜, 헥사데칸올이 이용될 수 있으며 지방산 에스테르로는 이소프로필 미리스테이트, 이소프로필 팔미테이트, 부틸 스테아레이트가 이용될 수 있다. 계면 활성제로는 당업계에 알려진 양이온 계면활성제, 음이온 계면활성제 및 비이온성 계면활성제가 사용가능하며 가능한 한 천연물 유래의 계면활성제가 바람직하다.

본 발명의 화장료 조성물은 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 프레스파우더, 루스파우더 및 아이섀도우에서 선택된 화장품에 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 또 다른 구체적인 양태에 있어 비누 조성물로서 파악될 수 있으며, 구체적으로 목욕비누, 물비누, 미용비누, 샴푸, 손세정제{핸드클리너}, 약용비누{비의료용}, 크림비누, 페이셜워시, 헤어린스, 화장비누 등이 될 수 있다.

본 발명의 조성물이 비누 조성물로서 파악될 경우에, 첨가제로서 피부 보습제, 유화제, 경수연화제 등을 포함하여 제조될 수 있다.

상기 비누 기재로서는 야자유, 팜유, 대두유, 파마자유 올리브유, 팜핵류 등의 식물유지 또는 우지, 돈지, 양지, 어유 등의 동물유지 등이 사용될 수 있고, 상기 피부 보습제로서는 글리세린, 에리트리톨, 폴리에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜, 펜틸렌글리콜, 헥실글리콜,이소프로필미리스테이트 , 실리콘 유도체, 알로에베라, 솔비톨 등이 사용될 수 있으며, 상기 유화제로서는 천연오일, 왁스 지방알콜, 탄화수소류, 천연식물 추출물 등이 사용될 수 있고, 상기 경수연화제로서는 테트라소듐 이디티에이 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 비누 조성물은 또한 첨가제로서 항균제, 분산제, 거품억제제, 용매, 물 때 방지제, 부식 방지제, 향료, 색소, 금속이온 봉쇄제, 산화방지제, 방부제 등을 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 비누 조성물에 있어서, 비누 기재나 첨가제는 당업계에 일반적으로 사용되고 있는 함량으로 포함될 수 있는데, 비누 기재는 일반적으로 비누 조성물의 전체 중량을 기준으로 하였을 때 99.999 중량 % 내지 50 중량 %로 참가 될 수 있으며, 첨가제는 1 중량 % 내지 20 중량 %로 첨가될 수 있다.

상기 화장료 조성물의 제형은 액상, 에멀젼상, 크림상, 페이스트상, 거품상, 젤상 및 고상 등을 포함할 수 있으며 제한되지 않는다. 한편, 상기 추출물을 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조한 후 이러한 분말을 사용할 수도 있음은 물론이다.

또한, 본 발명은 당유자 추출물 및 황칠 추출물을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.

일 측면으로, 상기 조성물은 피부 주름 개선 및 미백용인 것이다.

일 측면으로, 상기 조성물은 현탁액, 연고, 로션, 스프레이로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 제형을 가지는 것이다.

상기 약학 조성물은 피부 미백 및 주름개선 효과를 나타낼 수 있으며, 구체적으로 콜라겐 생성, 기미, 주근깨, 점, 피부 색소 침착을 개선 또는 치료할 수 있다.

본 발명의 일측면에 따른 약학 조성물은 경구, 비경구, 직장, 국소, 경피, 정맥 내, 근육 내, 복강 내, 피하 등으로 투여될 수 있다. 경구 투여를 위한 제형은 정제(錠劑), 환제(丸劑), 연질 및 경질 캅셀제, 과립제(顆粒劑), 산제, 세립제, 액제, 유탁제(乳濁濟) 또는 펠렛제일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 비경구 투여를 위한 제형은 용액제, 현탁제, 유액제, 겔, 주사제, 점적제, 좌제(坐劑), 패취 또는 분무제일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 제형은 당해 분야의 통상적인 방법에 따라 용이하게 제조될 수 있으며, 계면 활성제, 부형제, 수화제, 유화 촉진제, 현탁제, 삼투압 조절을 위한 염 또는 완충제, 착색제, 향신료, 안정화제, 방부제, 보존제 또는 기타 상용하는 보조제를 적당히 사용할 수 있다.

발명의 일측면에 따른 약학 조성물의 유효 성분은 투여 받을 대상의 연령, 성별, 체중, 병리 상태 및 그 심각도, 투여 경로 또는 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 적용량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 이의 1일 투여 용량은 예를 들어 0.1mg/kg/일 내지 100mg/kg/일, 보다 구체적으로는 5 mg/kg/일 내지 50 mg/kg/일이 될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, a) 당유자 및 황칠을 혼합하여 준비하는 단계; 및

b) 상기 a)단계에서 준비된 혼합물을 추출하는 단계;를 포함하는 화장료 조성물 제조방법에 관한 것이다.

일 측면으로, 상기 a)단계에서 당유자와 황칠이 건조중량으로 각각 1:1 내지 1:10의 조성으로 혼합되도록 하는 것이다.

일 측면으로, 상기 b)단계는 물, 유기용매 및 물과 유기용매의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상으로 용매로 추출한 것이며, 바람직하게는 상기 용매는 50 내지 70% (v/v) 에탄올인 것이다. 일 측면으로, 바람직하게는 20℃ 내지 50℃에서 2일 내지 10일간, 구체적으로 25℃ 내지 35℃에서 3일 내지 5일간 추출될 수 있다.

일 측면으로, 상기 b)단계에서 용매로 추출한 후 가압 및 감압 추출공정을 반복적으로 실시하여 추출하는 것이며, 바람직하게는 상기 가압은 상기 가압 추출공정 시 압력은 60 내지 100 MPa, 감압 추출공정 시 압력은 대기압인 것이다.

이하, 발명의 구체적인 실시예를 통해, 발명의 작용 및 효과를 보다 상세하게 설명하기로 한다. 다만, 이러한 실시예는 발명의 예시로 제시된 것에 불과하며, 이에 의해 발명의 권리범위가 정해지는 것은 아니다.

열수 추출물의 제조

당유자 과피 및 황칠나무를 건조중량으로 각각 150g, 750g (1 : 5)으로 혼합한 후 대하여 정제수를 중량비로 20배 가한 후 121^oC에서 15분 동안 추출한 후 원심분리하여 상등액을 수득하고, 상기 상등액을 여과하여 상기 당유자 과피 및 황칠의 혼합 추출물 1L을 제조하였다.

알콜 추출물의 제조

상기 실시예 1과 동일한 조성으로 믹서기로 분쇄 후 50% 에탄올 2L를 넣고 상온에서 3일간 추출하고 시료를 여과포 여과와 원심분리를 통해 분리하고 분리된 여액을 감압 농축기를 이용하여 농축하여 혼합 추출물 1L을 제조하였다.

상기 실시예 2의 공정에서 당유자 및 황칠의 혼합비율을 건조 중량비로 1:0으로 하는 것을 제외하고 동일한 공정으로 수행하여 추출물을 제조하였다.

상기 실시예 2의 공정에서 당유자 및 황칠의 혼합비율을 건조 중량비로 5:1으로 하는 것을 제외하고 동일한 공정으로 수행하여 추출물을 제조하였다.

상기 실시예 2의 공정에서 당유자 및 황칠의 혼합비율을 건조 중량비로 2:1으로 하는 것을 제외하고 동일한 공정으로 수행하여 추출물을 제조하였다.

상기 실시예 2의 공정에서 당유자 및 황칠의 혼합비율을 건조 중량비로 1:1으로 하는 것을 제외하고 동일한 공정으로 수행하여 추출물을 제조하였다.

상기 실시예 2의 공정에서 당유자 및 황칠의 혼합비율을 건조 중량비로 1:2으로 하는 것을 제외하고 동일한 공정으로 수행하여 추출물을 제조하였다.

상기 실시예 2의 공정에서 당유자 및 황칠의 혼합비율을 건조 중량비로 0:1으로 하는 것을 제외하고 동일한 공정으로 수행하여 추출물을 제조하였다.

상기 실시예 2의 공정에서 70% 에탄올을 사용하는 것을 제외하고 동일한 공정으로 수행하여 추출물을 제조하였다.

상기 실시예 2의 공정에서 100% 에탄올을 사용하는 것을 제외하고 동일한 공정으로 수행하여 추출물을 제조하였다.

[실험예1]

1. 항산화 및 티로시나제(Tyrosinase) 억제 활성

항산화 활성을 측정하기 위하여DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) 라디칼 소거 활성은 각 추출물의 DPPH에 대한 전자 공여능은 Bondet(1997)방법에 의해 측정하였다. 실시예 조성물 40 ㎕를 300 μM DPPH/EtOH 760 ㎕에 첨가한 후 30분간 37℃에서 방치한 후 UV/Visible spectrophotometer (Berkman, USA)을 이용하여 515 nm 에서 흡광도를 측정하였다.

ABTS(2,2-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diamonium salt) 라디칼 소거활성은 Roberty 등(1999)의 방법에 의해 측정하였다. ABTS 농도는 734 nm에서 1.500가 되도록 조제 하였고, 실시예 조성물과 실온에서 10분간 반응 후 대조구와의 흡광도 차이에 의하여 활성을 측정하였다.

타이로시네이즈(tyrosinase)는 멜라닌 생성 첫 단계를 일으키는 중요한 효소로, tyrosin (타이로신)이 3, 4-dihydroxy phenylalanine (DOPA, 도파)를 거쳐 DOPAquinone (도파퀴논)으로 전환되고, DOPAquinone 으로부터 자동 산화 반응과 효소 반응으로 DOPAchrome (도파크롬)을 거쳐 흑갈색의 공중합체인 멜라닌을 생성하게 된다. 멜라닌 생성의 주요 효소인 타이로시네이즈 (tyrosinase) 활성을 저해함으로써 멜라닌 생성을 억제시켜 미백효과를 유도할 수 있다.

Tyrosinase 저해활성 측정은 반응구는 1/15M sodium phosphate buffer (pH 6.8) 0.5mL에 10mM L-DOPA을 녹인 기질액 0.2mL 및 실시예 조성물 0.1mL의 혼합액에 mushroom tyrosinase (110U/mL) 0.2mL 첨가하여 25℃에서 2분간 반응시켜 반응액 중에 생성된 DOPA chrome을 475nm에서 측정함. Tyrosinase 저해활성은 시료용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타었다.

당유자 및 황칠의 혼합비율에 따른 효과를 확인하기 위하여 실시예 2 내지 8의 조성물에 대한 활성을 각각 측정한 결과는 하기 표1에 나타내었다.

혼합비율 (당유자:황칠)	DPPH scavenging activity(%)	ABTS radical scavenging activity (%)	Tyrosinase inhibition activity (%)
실시예 3(1:0)	28.9	21.2		18.4
실시예 4(5:1)	68.8	62.3		32.7
실시예 5(2:1)	74.4	71.8		35.5
실시예 6(1:1)	81.8	78.6		39.3
실시예 7(1:2)	89.0	85.4		42.8
실시예 2(1:5)	92.5	90.3		48.6
실시예 8(0:1)	85.2	79.6		36.5

상기 결과에서와 같이, 당유자 또는 황칠의 단독 보다는 혼합한 경우 높은 활성을 보였으며 특히 1:5의 비율로 혼합한 조성물에서 가장 높은 활성을 보여주었다.

용매의 추출방법에 따른 효과를 확인하기 위하여 실시예 1(열수 추출), 실시예 2(50% 에탄올), 실시예 9(70% 에탄올),. 실시예 10(100% 에탄올)의 조성물에 대한 활성을 각각 측정한 결과는 하기 표2에 나타내었다.

	DPPH*	ABTS*	Tyrosinase*
실시예 1 (열수 추출)	13.6	6.1	-
실시예 2 (50 % 에탄올)	20.4	7.9	-
실시예 9 (70% 에탄올)	20.2	8.2	194
실시예 10 (100% 에탄올)	15.3	4.3	175

상기에서와 같이 에탄올 추출방법이 다소 우수하게 나타났으며, 특히 50 내자 70% 에탄올 용매를 사용한 경우 활성이 다소 높게 나타난다는 것을 확인하였다.

2. 페놀성 화합물의 함량 변화

총 페놀 함량은 Folin-Denis 방법을 참고하여 측정하였으며, 실시예 조성물 50 ㎕와 증류수 950 ㎕, folin (folin-ciocalteu 시약) 500 ㎕를 혼합한 후, 20% sodium carbonate 2.5 ml를 넣어 40분간 실온에서 반응시키고 반응 후 상징액을 UV/Visible spectrophotometer를 이용하여 725 nm에서 흡광도를 측정하여 표준곡선에서 양을 환산하였으며 표준품은 tannic acid를 사용하였고, 정량 직선방정식을 사용하여 측정하였다.

용매의 추출방법에 따른 효과를 확인하기 위하여 실시예 1(열수 추출), 실시예 2(50% 에탄올), 실시예 9(70% 에탄올),. 실시예 10(100% 에탄올)의 조성물에 대한 활성을 각각 측정한 결과는 하기 표3에 나타내었다.

	총페놀성 화합물 함량 (mg/kg)	추출수율
실시예 1 (열수 추출)	56.5	21.5
실시예 2 (50 % 에탄올)	61.3	24.8
실시예 9 (70% 에탄올)	62.4	22.8
실시예 10 (100% 에탄올)	53.6	16.0

상기에서와 같이 실시예 2 및 9의 조성물에서 페놀성 화합물의 함량과 그 수율이 우수한 효과를 보이는 것을 확인할 수 있었다.

3. 함염증 활성

Raw 264.7 세포를 96-well plate에 1.0x10⁴ cells/well의 밀도로 분주하여, 24시간 배양한 후 실시예 2의 추출물을 농도 별로 시료를 처리하였다. 시료 처리 1시간 후 LPS를 처리하여 24시간 배양한 상등액을 NO 생성량 측정에 사용하였다. 세포 상등액에 Griess reagent(1% sulfanilamide, 0.1% N-1-naphthylenediamine dihydrochloride, and 2.5% phosphoric acid)를 처리하여 540 nm에서 흡광도를 측정함 Raw 264.7 세포에 LPS 처리에 의한 NO 생성량에 의한 항염증 효과를 확인한 결과 추출물의 농도의존적으로 NO 생성을 효과적으로 억제하여 항염증 활성을 나타내었다. 그 결과는 도1에 나타내었으며, 대조물질인 덱사메타슨의 동일농도 대비 추출물은 약 40%의 항염증 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

4. 세포 독성 평가

96 well plate에 풀어놓은 피부세포 (B16F16, HDF)를 이용하여 실시예 2의 추출물을 최종농도가 0.32, 1.6, 8, 40, 200㎍/㎖가 되도록 처리하고 시료 처리 24시간 후 CellTiter 96®AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (Promega)을 배지의 총량의 20%씩 처리함. UV/Visible spectrophotometer(Human cop)을 이용해서 490nm에서 흡광도를 측정하여 세포독성을 확인하였다.

그 결과는 도2에 나타내었으며, 당유자 및 황칠추출물은 미백 및 노화개선품의 첨가소재로 안전하다는 것을 확인하였다.

5. 멜라닌 생성 관련인자의 단백질 발현 수준 평가

실시예 2 추출물의 미백 활성을 평가하기 위해 멜라노마세포(B16F10)를 이용하여 a-MSH 처리에 따른 멜라닌생성 관련인자인 MITF, tyrosinase, TRP-1, TRP-2의 단백질 발현수준을 확인함으로써 미백활성을 평가하였다. 각 추출물의 농도 100㎍/㎖ 일 때, 그 결과는 도3에 나타내었으며 MITF, tyrosinase, TRP-1, TRP-2단백질 발현을 저해하는 것을 확인할 수 있었다. (a) MITF, (b) Tyrosinase, (c) TRP-1, (d) TRP-2

6. 콜라겐 생합성능 평가

실시예 2 추출물의 콜라겐의 생합성능을 평가하기 위하여 약 1.2x105의 농도로 접종한 후, 37℃, 5% CO2 환경에서 24시간 동안 배양하였다. 그 후, UVB를 144mJ/cm2 조건으로 조사한 후, 실시예 2에서 제조된 추출물을 포함한 배지로 교체하여 3일간 배양하였다. 이후 배양액을 회수(harvest)하여 4℃, 7500rpm 환경에서 5분간 원심분리(centrifuge)하여 ELISA 방법을 이용하여 타입 1 프로콜라겐(Procollagen Type I C Peptide EIA Kit, Takara, Shiga, Japan)의 단백질 발현량 변화를 확인하였다..

도 4(a)는 프로콜라겐 Ⅰ(Procollagen I)의 발현 수준을 보여주는 것이며, 도4(b)는 relative protein level (% of collagen/NT)를 보여주는 것이다. 결과적으로 추출물이 농도 의존적으로 콜라겐의 합성이 증가함을 보여주었다. 특히 100~200 ㎍/ml 농도구간에서 우수하게 나타나고 있어 소재의 주름개선에 큰 효과를 보인다는 것을 확인할 수 있었다.

7. 멜라닌 생성 관련인자의 단백질 발현 수준 평가

실시예 2 추출물의 주름개선 효과를 평가하기 위해 인간 피부 섬유아세포(HDF)에 피부 주름생성 관련인자의 발현을 확인하였다. 주름생성 관여인자인 MMP-1, MMP-3, MMP-9의 단백질과 mRNA의 발현을 비교하였으며, 그 결과 무처리에 비해 증가하는 것을 확인하였다. 추출물 처리에 의해 MMP-1, MMP-3, MMP-9의 단백질 및 mRNA 발현이 농도 의존적으로 낮아짐을 확인할 수 있었다. 도 5(a)는 단백질 발현, (b)는 MMP-2의 mRNA 발현, (c)는 MMP-3의 발현, (d)는 MMP-9의 발현을 보여주는 것이다.

8. 인체 적용 시험

임상적 효과를 확인하기 위하여 실시예 2의 추출물을 4 주 적용, 무작위 배정 및 단일 시험을 기반으로 진행 되었고, 피시험자 선정 기준에 적합하며 제외기준에 해당 되지 않는 시험대상자 20 명 이상을 대상으로 시험의 목적과 방법, 기대 효능과 피부 이상 반응을 설명 하였다. 참의 의사를 보이는 시험 대상자는 초기방문 하여 시험 참여 동의서를 서명 하였고, 시험자는 피시험자의기초접로를 수집하였다. 본시험에서는 제품 사용 전 및 제품 사용 4 주 후 시점에서 인체피부의 시험제품의 피부

미백, 피부 장벽 개선, 그리고 주름개선을 평가 및 피시험자에 의한 설문평가 및 시험 담당자의 관찰과 문진을 통한 피부 안전성을 평가하였다

o 피시험자 모집기준

(1) 건강한 여성

(2) 나이: 18 - 55 살 (시험 시작 날짜 기준)

(3) 피부톤이 어두운자

(4) 일반 화장품 사용에 알러지가 없는자

(5) 지난 3 달간 유사시험에 참가하지 않은자

o 피시험자 제외 기준

(1) 한주안 항히스타민제를 복용한자 또는 한달안에 면역억제제를 복용한자

(2) 2 달 안에 패 치부분에 항염증제 약물을 복용한자

(3) 당뇨병에 의한 인슐린 복용자

(4) 천식 또는 CRD 치료중인자

(5) 임신부 또는 수유중인 여성

(6) 알러지, 알레르기 성 피부염자, 피부병 또는 피부병의 내력이 있는자

(7) 지난달 피부과전문의에게 치료중이거나 하이드록시산, 화이트닝 그리고 노화방지 피시험자

(8) 시험적용 부위에 상처가 있거나 마크가 있는자

(9) 시험법에 동의 하지 않을듯한자

o 시험 장비

(1) Antera 3D (Miravex, Ireland)

(2) Colorimeter (Courage & Khazaka, Germany)

(3) Tewameter (Courage & Khazaka, Germany)

o 시험환경

온도: 21.0±1.0℃, 습도: 50±10%

o 시험절차

본 시험은 4 주 적용, 무작위 배정및 단일 시험을 기반으로 진행 되었고, 피시험자 선정 기준에 적합한 피시험자가 모집되며, 하기의 절차 및 방법에 따라 시시험 진행 된다.

(1) 처음 방문한 화장을 하지 않은 피시험자들은 시험소에서 시험 과정에 대해 설명을 듣고 시험 동의서를 작성한다.

(2) 시험 요건에 따라 25 명의 피시험자가 선별되며 피시험자들은 시험 참여를 위해 등록을 한다.

(3) 베이스라인 (기준선) 테스트 (W0) - 피험자들은 얼굴을 물로 씻고 테스트하기 전에 30 분 동안 시험 적정 온도 와 습도가 갖추어 져 있는 항온항습실 (21.0±1.0℃, 습도: 50±10%) 에서 대기한후 시험에 임한다.

(4) 제품사용전 (베이스라인, 기준선) 테스트가 완료된 후, 테스트 제품을 대상에게 배포하고 사용 지침 및 사용 일지를 제공한다. 피험자는 사용할 제품을 갖고 귀가 한다.

(5) 4 주 후 (W4), 피험자들은 시험소에 화장기 없는 얼굴로 방문후 베이스라인 과 동일하게 진행을 한다.

o 시험 방법

본 시험에서 모든 평가는 동일 부위 측정을 통해 진행 되었고 시험대상자는 방문 시마다 시험부위를 세정한 다음

항온항습실 (21.0±1.0℃, 습도: 50±10%)에서 30 분 이상 대기후 시험에 참여 하였다.

o 통계 분석

(1) 설명 통계

양적: 관측값의 수 (N), 평균(Mean), 표준편차 (SD), 표준에러, 중앙값, 최소 그리고 최대

(2) 유의성 (효능)

- 산출된 모든 데이터는 SPSS Package Program 을 이용하여 통계적 유의성을 검증 한다.

- 데이터 정규 분포 검사는 샤피로 윅테스트를 통해 검증한다.

- 모든 평가결과에 대한 전후 비교는 모수일 경우 paired t-test 를, 비모수일 경우는 Wilcoxon singed ranks test,

Post-Hoc test (Bonferroni correction)를 이용한다 (p<0.05).

- 변화율은 다음과 같이 산출 한다.

8-1, 피부 장벽 평가

TEWL 값은 Tewameter 에 의해 W0 (기준선) 및 W4 (시험 제품 4 주 사용 후)에 얼굴 볼부위를 측정하며 하기 공식이 적용된다.

A = surface [m2]m = water transported [g]

t = time [h]

D = diffusion constant [= 0.0877 g/m(h(mmHg))]

p = vapour pressure of the atmosphere [mm Hg]

x = distance from skin surface to point of measurement [m]

분석 결과, 제품 사용 전과 비교시 제품 사용 4 주 후 시점에서 피험자의 TEWL 수치가 16.74% 향상되었고, p 벨류가 0.046 로 유의하게 개선 되었으므로, 이 시험 제품은 피부 장벽 개선에 효능이 있음을 나타냈다.

Significance: "ns"said p>0.05,"＊"said 0.01=p<0.05; "＊* " said 0.001=p<0.01; "＊*＊"said p<0.001.

그래프는 도6에 나타내었으며, 4 주간의 테스트 제품 적용 후, TEWL 값은 기준치와 비교하여 현저하게 감소하였으며, 테스트 제품은 피부 장벽을 개선하는 효능이 있음을 확인하였다.

8-2. 미백 평가

미백 벨류 측정 (L* & ITA°)은 컬러리미터로 얼굴 볼부위를 W0 와 W4, 2 회 측정한다. ITA (Individual Typology Angle) 은 측정은 자동 계산되며 L*값이 사용된다.

.

분석 결과, 제품 사용 전과 비교 시 제품 사용 4주 후 시점에서 1.24% 향상하였고, 피시험자의 L* 와 ITA°의 p 벨류 값이 0.026 으로 유의 하게 증가 하였으므로 이 시험 제품은 미백 개선 효능이 있음을 나타냈다.

그 결과는 도 7에 그래프로 나타내었다. 도 7(a) L*, (b) ITA° 4 주 제품 사용후, 사용전 과 비교시 L* 과 ITA °벨류가 현저히 증가하면 이제품은 미백의 유효성이 있음을 확인하였다.

8-3. 눈가 주름개선효과

주름(깊이)은 Antera 3D 로 눈가를 W0 와 W4, 2 회 측정 한다.

주름 전후 사진과 착색 효과로 분석한다. 본 시험에서 제품 사용 전 및 제품 사용 4 주 후 눈가 부위를 Antera 3D 로 눈가 주름의 깊이를 측정 하여 사용전에 비해 현저히 주름깊이가 줄어 들었다면 이제품은 주름개선의 유효성이 있음을 나타낸다.

분석 결과, 제품 사용 전과 비교시 제품 사용 4 주 후 시점에서 피시험자의 눈가 주름의 깊이가 11.74% 개선, 그리고 p 벨류가 0.001 으로 유의 (현저)하게 감소 하였으므로, 이 시험제품은 주름감소에 효능이 있음을 나타냈다.

그래프는 도 9에 나타내었으며, 제품 적용 결과 주름 개선효과가 유의점으로 보임을 확인할 수 있었다.

8-4. 피시험자 설문평가

제품의 효능 및 사용성에 관한 설문은 제품 사용 4 주 방문시 시험대상자들이 5 점 척도 (1 점: 전혀 그렇지 않다. 매우 좋지 않다 / 5 점: 매우 그렇다)로 자가 평가 하였다. 다음의 설문지로 조사하였다.

시험 제품의 효능에 대한 설문 평가 결과, 제품 사용 4 주 후 시점에서 모든 항목에 대해 피시험자의 만족도는 하기 왔 같다.

- 95.7% 가 제품 흡수율의 만족했다.

- 91.3% 가 제품의 신선도에 만족했다.

- 91.3% 가 제품의 순함에 만족했다.

- 87%가 제품의 주름 개선 유효성에 만족했다.

- 78.3%가 제품의 미백 효과에 만족했다.

- 82.6%가 제품의 수분장벽 강화 유효성에 만족했다.

- 91.3%가 제품의 수분개선 유효성에 만족했다.

- 82.6% 가 제품의 사용감에 전체적으로 만족했다.

- 82.6% 가 제품에 대한 구매의사를 밝혔다.

9. 피부 안전성 평가

안전성 평가를 위해 시험자는 각 평가 시점에서 피시험자의 시험부위를 관찰한 후 피시험자와 질의 응답을 통해 시험부위 상태를 확인하여 기록, 평가 하였다. 제품으로 인한 이상반응 발생시 이상반응 보고서를 작성하도록 하였으며, 이에 대한 시험제품과의 관련성은 시험책임자가 판단하였고 자극에 대한 적의 및 부작용의 평가기준은 하기와 같다.

a. 부작용의 평가

- 제품 사용시 피부의 붉은기, 가려움증, 화끈거림, 등등 현상이 기록 되는 경우.

- 피부부작용은 피부 임상 테스트의 피부 반응 분류 기준로 구분된다

0=무반응

A: 긍정, 테스트 제품의 사용시 이상이 나타나는것이 증명되는것

B: 미비한 긍정, 제품 사용 중단시 부작용이 사라지는것

C: 초미비한 긍정, 제품 사용으로의 반응인지 명확 하지 않음

D. 초미비한 부정: 증상도 다르고 반응 또한 규칙적이지 않음

E. 추1= 최소홍반

2= 보통

3= 강한 홍반

4= 불같은 홍반

b. 부작용의 3 가지 기준은 하기와 같다:

- 가벼운 증상 : 참여자의 일반적인 생활에 방해 받지 않는 정도 미세한 경우

- 보통 증상 :참여자가 부작용 에 반응하여 생활이 불편한정도, 제품 사용을 중단 하여야 함

- 극한 증상 : 일반적인 생활을 방해 하는 경우 -제품 사용을 중지 하고 응급처치를 받아야함

c. 부작용과 제품 판단기준의 관계가 평가, 정보 불충분, 또는 반응에 대한 관계 설명이 부족할경우

F. 평가 불가, 부작용에 대한 정의가 성립되지 않을때 데이타 기입을 못함

그 결과 모든 시험대상자에게서 피부 이상반응은 관찰되지 않았다.

이상에서 본 발명의 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만, 본 발명은 청구범위에 기재된 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능하다는 것은 당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게는 자명할 것이다.

Claims (16)

1. 당유자 및 황칠이 건조중량으로 각각 1:5의 조성으로 혼합되는 혼합물을 50 내지 70% 에탄올로 추출한 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물.
2. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 주름 개선 및 미백용인 것을 특징으로 하는 조성물.
3. 삭제
4. 제 1항에 있어서, 상기 추출물은 조성물 총 중량에 대하여 0.001 내지 50 중량%로 함유되는 것을 특징으로 하는 조성물.
5. 삭제
6. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 유연화장수, 영양화장수, 마사지크림, 영양크림, 모이스쳐 크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 크림, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디크림 및 팩으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 제형을 가지는 것을 특징으로 하는 조성물.
7. 당유자 및 황칠이 건조중량으로 각각 1:5의 조성으로 혼합되는 혼합물을 50 내지 70% 에탄올로 추출한 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증 약학 조성물.
8. 삭제
9. 제 7항에 있어서, 상기 조성물은 현탁액, 연고, 로션, 스프레이로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 제형을 가지는 것을 특징으로 하는 항염증 약학 조성물.
10. a) 당유자 및 황칠이 건조중량으로 각각 1:5의 조성으로 을 혼합하여 준비하는 단계; 및
    b) 상기 a)단계에서 준비된 혼합물을 50 내지 70% 에탄올로 추출한 추출하는 단계;를 포함하는 화장료 조성물 제조방법.
11. 삭제
12. 삭제
13. 삭제
14. 제 10항에 있어서, 상기 b)단계에서 추출온도는 25 내지 35℃인 것을 특징으로 하는 제조방법.
15. 제 10항에 있어서, 상기 b)단계에서 용매로 추출한 후 가압 및 감압 추출공정을 반복적으로 실시하여 추출하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
16. 제 15항에 있어서, 상기 가압은 상기 가압 추출공정 시 압력은 60 내지 100 MPa, 감압 추출공정 시 압력은 대기압인 것을 특징으로 하는 제조방법.

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