KR20140115742A

KR20140115742A - 으름덩굴 추출물을 유효성분으로 포함하는 최종당화산물(AGEs) 생성 억제용 피부 외용제 조성물

Info

Publication number: KR20140115742A
Application number: KR1020130030741A
Authority: KR
Inventors: 이병만; 정은선; 박덕훈
Original assignee: 바이오스펙트럼 주식회사
Priority date: 2013-03-22
Filing date: 2013-03-22
Publication date: 2014-10-01

Abstract

본 발명은 으름덩굴 추출물(Akebia quinata extract)을 유효성분으로 포함하는 최종당화산물 생성 억제용 피부 외용제 조성물에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명의 조성물은 최종당화산물 생성을 억제하여 세포손상으로부터 섬유모세포를 보호하는 기전을 통해 피부주름개선 등의 효과를 가진다. 그리고 세포독성 및 피부 부작용이 없어 화장료 또는 의약품에 안전하게 적용할 수 있다.

Description

으름덩굴 추출물을 유효성분으로 포함하는 최종당화산물(AGEs) 생성 억제용 피부 외용제 조성물{Composition for blocking AGEs production comprising Akebia quinata extracts}

본 발명은 으름덩굴 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 외용제 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 상기 으름덩굴 추출물을 함유하는 최종당화산물 생성 억제제와 상기 최종당화산물 생성 억제제를 함유하여 피부주름개선 등의 효과가 있는 피부 외용제 조성물에 관한 것이다.

당화반응(glycation)은 당과 단백질의 비효소적인 반응으로, 환원당의 카르보닐기(carbonyl)와 단백질의 유리 아미노기인 리신(lysine) 또는 아르기닌(arginine)과 반응하여 초기 당화생성물인 시프염기(schiff base)를 형성하고 이렇게 형성된 화합물들이 계속적으로 재배열 교차결합 등의 일련 반응을 통하여 갈색의 화합물(Browning)인 비가역적 최종당화산물(Advanced glycation end products, AGEs)을 생성하는 반응이다.

구체적으로, 정상 상태에서는 당과 단백질은 비효소 반응인 메이라드(Millard) 반응을 일으켜, 시프염기(schiff base)를 형성한 후 재배열되어 아마도리(amadori)형의 초기당화산물(early glycosylation products)을 생성하는데, 여기까지의 반응은 가역적으로 일어나 그 농도가 조절이 된다. 그러나 고혈당 상태가 지속되면 가역적인 아마도리형의 초기당화산물이 분해되지 않고 재배열되어 수명이 긴 단백질과 교차결합하여 비가역적인 최종당화산물이 생성된다(Ulrich P et al., Recent Prog Horm Res 56; 1-21: 2001). 이렇게 생성된 최종당화산물은 세포외 기질단백질과의 교차결합하거나 신체 세포(내피세포, 평활근, 면역세포 등)의 최종당화산물 수용체 또는 핵산과 반응하여 당뇨 합병증을 유발하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 최종당화산물을 생성하는 당화반응을 억제하여 당뇨 합병증을 예방하는 약리활성 물질을 찾는 연구가 많이 이루어지고 있다.

또한, 당화반응은 고혈당을 가지는 당뇨환자에서 급격히 일어나지만, 정상혈당을 가진 정상인에게서도 노화가 진행됨에 따라 당화반응이 일어난다. 대표적으로 콜라겐과 교차결합(cross-linking)하며 생성된 최종당화산물이 피부에 축적되어 피부의 탄력감소 및 주름을 유도하는 것으로 알려져 있으며, 이들 최종당화산물의 반감기는 일반 세포의 평균 반감기보다 2배 정도 길어 섬유모세포 등 피부세포에도 손상을 유도하는 것으로 알려져 있다. 이외에도 최종당화산물이 생성되는 과정에서 지질대사에 이상이 일어나고 동시에 생성되는 유해한 산소 자유라디칼에 대한 방어시스템 기능이 저하되어 산화 스트레스가 유발된다고 보고된 바 있으며, 이는 알츠하이머, 심혈관질환, 백내장, 암, 말초신경질환 등 연령 관련 만성 질환의 원인이 된다(Verbeke, P et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 276: 1265-1270. 2000; Masamitsu Ichihashi et al., Anti-Aging Medicine 8 (3) : 23-29, 2011; Reddy VP et al., Neurotox Res 4;191-209: 2002; Fuentealba D et al., Photochem Photobiol. 85(1):185-94, 2009).

이와 같이 최종당화산물로 인한 당뇨, 피부주름, 세포손상 및 만성질환 등을 예방하기 위해 최종당화산물 생성 억제제로 카르노신(Carnosine), 벤포티아민(Benfotiamine), 피리독사민(pyridoxamine), 타우린(taurine), 아미노구아니딘(aminoguanidine), 아스피린(aspirin) 등이 있다. 그러나 아미노구아니딘은 임상 3상 실험에서 비타민 B 결핍과 관련된 독성으로 인해 개발이 중단되었고, 피리독사민의 경우 최근 임상 2상을 마치고 3상 준비 중에 있어 아직 상품화된 약품은 없는 실정이다.

한편, 최종당화산물 생성 억제와 관련된 기술로, 대한민국 등록특허 제1081910호에는 키위 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부톤 개선 및 피부노화방지 효과가 있는 화장료 조성물에 대하여 기재되어 있고, 대한민국 등록특허 제0997912호에는 개망초 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 당뇨합병증 치료, 예방용 조성물 및 건강기능식품에 대하여 기재되고 있으며, 대한민국 등록특허 제0973941호에는 소석적려 추출물을 이용한 당뇨합병증 치료 및 예방용 조성물 및 기능성 식품에 대하여 기재되고 있다.

그러나, 아직까지 본 발명에서와 같이 으름덩굴 추출물이 최종당화산물 생성을 억제하는 효능에 대한 결과는 개시되어 있지 않다.

이에, 본 발명자들은 으름덩굴 추출물을 이용하여 인체에 무해하고 안전성이 우수하면서도 최종당화산물 억제 효능을 갖는 피부 외용제 조성물을 개발하고자 노력한 결과, 최종당화산물 생성을 억제하고, 최종당화산물의 생성 억제에 의한 피부개선 효과에 매우 효과적임을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 하나의 목적은 으름덩굴 추출물(Akebia quinata extract)을 유효성분으로 포함하는 최종당화산물 생성 억제용 피부 외용제 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은, 상기 최종당화산물 생성 억제용 피부 외용제 조성물의 용도를 제공하는 것이다.

하나의 양태로서, 본 발명은 으름덩굴 추출물(Akebia quinata extract)을 유효성분으로 최종당화산물 생성 억제용 피부 외용제 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 으름덩굴(Akebiae quinata Decne)은 으름덩굴과에 속하는 낙엽성 덩굴식물로, 전국 각지에서 자생한다. 한 나무에서 암꽃과 수꽃이 다른 모양으로 따로따로 피어 관상용으로 사용된다. 또한, 어린잎과 열매는 식용, 뿌리, 가지는 약용으로 쓰인다. 구체적으로 새순과 어린 줄기는 나물로 먹었고, 꽃은 말려두었다가 향수를 대신하여 사용되었다. 줄기의 삶은 물은 노란색이나 황갈색의 염료로 사용되었으며, 특히 소염성 이뇨제, 소변통, 요도염, 인후통, 정신신경안정제에 효능이 있어 약용으로도 중요하게 사용되었다. 뿌리, 껍질은 배뇨장애에 효능이 있으며, 열매는 이뇨제, 중풍, 관절염에 효능이 있다.

본 발명에 있어서, 으름덩굴 추출물은 당업계에 공지된 추출방법 및 추출용매를 이용하여 수득할 수 있으며, 바람직하게는 물, 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올(메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등), 상기 저급 알코올과 물과의 혼합용매, 아세톤, 에틸 아세테이트, 클로로포름 또는 1,3-부틸렌글리콜을 추출 용매로 하여 수득할 수 있다.

또한, 상기 으름덩굴 추출물은 상기 추출용매에 의하여 추출하는 방법 외에 통상적인 정제 과정을 거쳐서도 수득할 수 있다. 예를 들어, 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외여과막을 이용한 분리, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 분획을 통하여도 으름덩굴 추출물을 수득할 수 있다.

본 발명에 있어서, 으름덩굴 추출물은 추출, 분획 또는 정제의 각 단계에서 얻어지는 모든 추출액, 분획 및 정제물, 그들의 희석액, 농축액 또는 건조물을 모두 포함한다.

본 발명에 있어서, 으름덩굴 추출물은 으름덩굴의 과피, 과육, 열매, 잎, 줄기, 가지 및 뿌리로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상, 바람직하게는 과피, 과육, 열매, 잎 및 뿌리로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상, 보다 바람직하게는 과피, 과육, 열매 및 잎으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 최종당화산물 생성 억제는 피부세포, 특히 피부섬유모세포의 당화반응을 억제시킬 수 있는 최종당화산물 생성 억제제를 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 최종당화산물 생성 억제에 의해 피부주름개선, 피부탄력개선, 노화방지 및 피부재생으로 이루어진 것으로부터 선택된 하나 이상의 피부상태 개선을 유도하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따르면, 상기 으름덩굴 추출물을 유효성분으로 포함하는 최종당화산물 억제용 피부 외용제 조성물은 피부의 최종당화산물 생성 억제하여 최종당화산물에 의해 손상된 세포를 보호함으로써 우수한 피부주름개선, 피부탄력개선, 노화방지 및 피부재생 효능을 나타낸다.

하나의 구체적 실시에서, 인간의 정상 섬유모세포(Human normal fibroblast)를 이용하여 으름덩굴 추출물의 농도에 따른 당화 및 산화스트레스에 대한 세포생존률을 살펴본 결과, 으름덩굴 추출물의 농도가 높아질수록 세포의 생존률이 높아지는 것으로 나타나, 으름덩굴 추출물이 최종당화산물 및 산화 스트레스로부터 세포 손상을 억제하는 효과가 있는 것으로 확인되었다.

다른 하나의 구체적 실시에서, 인간의 피부에 으름덩굴 추출물이 포함된 화장료를 사용하여 피부 탄력도를 관찰한 결과, 으름덩굴 추출물이 함유된 화장료의 피부 탄력도는 으름덩굴 추출물이 함유되지 않은 화장료에 비해 현저히 증가되어 으름덩굴 추출물이 주름 개선 효과가 있는 것으로 확인되었다.

본 발명에 있어서, 상기 으름덩굴 추출물은 전체 조성물의 총 중량 대비 0.00001 내지 15 중량%, 바람직하게는 0.0001 내지 10 중량%, 보다 바람직하게는 0.001 내지 5 중량%의 함량으로 포함한다. 으름덩굴 추출물의 중량이 0.0001 중량% 미만일 경우에는 최종당화산물억제 효과가 너무 미약하고, 15 중량%를 초과하는 경우 으름덩굴 추출물의 함량증가에 따른 효과의 증가가 미약한 문제점이 있다.

본 발명에 있어서, 상기 조성물은 으름덩굴 추출물을 유효성분으로 포함하는 최종당화산물 억제용 피부 외용제 화장료 조성물로서 이용 가능하다.

본 발명의 으름덩굴 추출물의 추출방법 및 효능 등에 관한 내용은 상술한 바와 같다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은 으름덩굴 추출물을 유효성분으로 포함하는 최종당화산물 억제용 조성물 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 추가적으로 포함할 수 있다. 예를 들어, 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함될 수 있다.

상기 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징제, 오일, 분말 파운데이션, 유액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 영양 크림, 수렴 화장수, 유연 화장수, 로션, 에센스, 영양젤 또는 마사지 크림의 제형으로 제조될 수 있다.

상기 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라가칸트검, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

상기 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진제를 포함할 수 있다.

상기 화장료 조성물의 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 가용화제 또는 유화제가 이용되고, 예컨대 용매로서 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸렌글리콜 , 가용화제 또는 유화제로서 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

상기 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미결정 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라가칸트검 등이 이용될 수 있다.

상기 화장료 조성물의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징제인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

상기 으름덩굴 추출물은 전체 조성물의 총 중량 대비 0.00001 내지 15 중량%, 바람직하게는 0.0001 내지 10 중량%, 보다 바람직하게는 0.001 내지 5 중량%의 함량으로 포함한다. 으름덩굴 추출물의 중량이 0.0001 중량% 미만일 경우에는 최종당화산물억제 효과가 너무 미약하고, 15 중량%를 초과하는 경우 으름덩굴 추출물의 함량증가에 따른 효과의 증가가 미약한 문제점이 있다.

본 발명에 있어서, 상기 조성물은 으름덩굴 추출물을 유효성분으로 포함하는 최종당화산물 억제용 피부 외용제 의약품 조성물로서 이용 가능하다.

본 발명에 따른 의약품 조성물은 으름덩굴 추출물을 유효성분으로 포함하는 최종당화산물 억제용 조성물 이외에 의약품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 추가적으로 포함할 수 있다. 예를 들어, 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 및 담체를 포함할 수 있다.

상기 의약품 조성물로 적합한 담체는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 적합한 의약품으로 허용되는 담체 및 제제는, 예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

상기 의약품 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 경구 또는 비경구 투여에 의해 적용될 수 있으며, 바람직하게는 비경구 투여, 보다 바람직하게는 도포에 의한 국소 투여(topical application) 방식으로 적용될 수 있다.

상기 의약품 조성물은 의학적으로 유효한 양을 투여한다. 본 발명에서 의약적으로 유효한 양은 의학적 치료 또는 예방에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 예방하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 종류 및 이의 중증도, 약물의 활성, 환자의 연령, 체중, 건강 및 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 사용된 특정 추출물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 사용된 특정 추출물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 일반적으로, 성인 기준으로 0.001 내지 100mg/kg, 바람직하게는 10 내지 100mg/kg의 용량을, 일일 1회 내지 수회 투여할 수 있다. 또한 외용제인 경우에는 성인 기준으로 1.0 내지 3.0ml의 양으로 1일 1회 내지 5회 도포하여 1개월 이상 계속 하는 것이 좋다. 다만 상기 투여량에 의해 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

상기 의약품 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 의약적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제와 함께 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 치료 목적에 따라 약제학 분야에서 통상적인 제제로 제형화될 수 있는데, 예를 들어, 정제, 캅셀제, 산제, 과립, 현탁제, 유제, 시럽제, 유탁제, 경고제, 연고제, 스프레이제, 오일제, 겔제, 주정제, 틴크제, 욕제, 리니먼트제, 로션제, 패취제, 패드제, 크림제 등으로 제형화될 수 있다. 또한, 환부에 직접 도포하는 국소투여를 목적으로 하는 피부 외용제로서 바람직하게 사용될 수 있는데, 이 경우 연고제, 로션제, 스프레이제, 젤 등의 형태가 바람직하다. 이들 피부 외용제는 또한 치료 부위에 직접 적용될 수 있는 지지 기재(support base) 또는 매트릭스 등에 포함될 수 있으며, 지지기재의 예는 거즈 또는 붕대를 포함한다.

본 발명의 으름덩굴 추출물을 유효성분으로 포함하는 최종당화산물 생성 억제용 피부 외용제 조성물은 최종당화산물의 생성을 억제하고, 상기 최종당화산물의 생성 억제를 통해 피부주름개선, 피부탄력개선, 피부노화방지, 피부재생 등의 효능을 가진다. 그리고 세포독성 및 피부 부작용이 없어 화장료 또는 의약품에 안전하게 적용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 으름덩굴 추출물의 농도에 따른 최종당화산물 억제 효과를 측정한 결과이다.
도 2는 본 발명의 으름덩굴 추출물의 농도에 따른 당화스트레스로부터 섬유모세포 보호 효과를 측정한 결과이다.
도 3은 본 발명의 으름덩굴 추출물의 농도에 따른 산화 스트레스로부터 섬유모세포 보호 효과를 측정한 결과이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다.

실시예 1: 으름덩굴 추출물 제조

으름덩굴의 열매 및 가지를 채취하여 이물질 및 불순물이 완전히 제거되도록 깨끗이 세척한 다음, 각각 20 내지 35℃에서 음건한 다음, 분쇄하여 입자의 크기가 1mm 이하가 되도록 하였다. 그 다음 상기 분쇄된 으름덩굴 열매 및 가지 분말 500g을 95% 메탄올 5L에 침지하여 24시간 동안 초음파 추출하였다. 그 후 수득한 추출액을 여과지(Advantes, No.2)에 여과하고, 감압농축하여 으름덩굴 추출물을 제조하였다.

실시예 2: 으름덩굴 추출물의 최종당화산물 생성 억제 효과 측정

상기 실시예 1에서 제조한 으름덩굴의 열매 및 가지 추출물의 최종당화산물 생성 억제능력을 측정하기 위해 당화억제분석(glycation inhibitor assay)을 실시하였다. 구체적으로, 단백질원으로 소혈청알부민(Bovine serum albumin, BSA)를 택하였다. BSA의 농도가 1mg/ml이 되도록 0.1M 인산완충용액(phosphate buffer, pH 7.0)에 가하여 제조하였다. 당원으로는 글루코오스(glucose)를 사용하였으며, 글루코오스의 농도가 200mM이 되도록 0.1M 인산완충용액(phosphate buffer, pH 7.0)에 가하여 제조하였다. 그 다음 1.5ml 마이크로큐브에 BSA와 글루코오스를 가하였다. 그 후, 상기 BSA와 글루코오스 혼합액에 100 및 500ppm의 으름덩굴 추출물을 처리하고 완전히 밀봉한 다음 60℃ 항온항습배양기에서 2일간 배양하였다. 배양이 끝난 후, 100% (w/v) 트리아클로로아세트산(trichloroacetic acid, TCA)을 50㎕ 처리하여 4℃에서 30분 동안 방치시키고, 15,000rpm으로 원심분리를 하였다. 원심분리 후 상층액을 제거하고 침전물에 PBS(Phosphate buffered saline, pH10) 0.5ml을 넣어 용해시켰다. 상기 용해시킨 침전물을 형광전용 96-웰 마이크로플레이트에 옮기고 분광광계도(Spectrofluorometer, INFINITE M200, Tecan, Switzerland)를 이용하여 excitation 파장 370nm와 emission 파장 440nm에서 측정하였다. 대조군은 BSA와 글루코오스 혼합액을 배양한 것이며, 양성대조군은 아미노구아니딘을 사용하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다.

실험 결과, 으름덩굴 추출물은 최종당화산물의 생성을 억제하는 효과가 있으며, 으름덩굴 추출물의 최종당화산물 생성 억제 효능은 농도 의존적으로 증가함을 관찰하였다. 또한, 으름덩굴의 열매 추출물은 으름덩굴 가지 추출물에 비해 최종당화산물 생성 억제 효능이 더 우수함을 확인하였다.

실시예 3: 당화 스트레스로부터 섬유모세포 보호효과

인간의 정상 섬유아세포(Human normal fibroblast, 아주대 피부과)를 DMEM 배지가 들어 있는 24-웰 마이크로 플레이트에 약 3 x 10⁴ 개의 세포가 되도록 접종시키고, 5% 농도의 CO₂ 배양기에 37℃로 24시간 동안 배양하였다. 그 후, 각 웰의 배지를 glucose없는 5% serum DMEM배지로 교환하고 세포에 당화스트레스를 유도할 수 있는 고농도 글루코오스(glucose, 200mM)와 10 및 50ppm 농도의 으름덩굴 추출물을 처리한 후 72시간 동안 다시 배양한 후, 배양 마지막날 세포독성도 조사(MTT assay; ATCC^TM, 30-1010K)를 이용해 세포생존력을 측정하였다. 대조군은 글루코오스를 사용하였으며, 양성대조군은 아미노구아니딘을 사용하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.

실험 결과, 으름덩굴 추출물은 고농도 글루코오스에 의해 당화 스트레스가 유도된 섬유아세포의 세포사멸을 억제시키며, 으름덩굴 추출물의 농도가 증가할수록 세포사멸의 억제율이 증가하는 것으로 보아 농도 의존적인 경향이 있는 것으로 나타났다. 또한, 으름덩굴 열매 추출물은 으름덩굴 가지 추출물에 비해 우수한 세포사 억제 효과를 가지는 것으로 나타났다.

실시예 4: 산화 스트레스로부터 섬유모세포 보호효과

인간의 정상 섬유아세포(Human normal fibroblast, 아주대 피부과)를 DMEM 배지가 들어 있는 24-웰 마이크로 플레이트에 약 3 x 10⁴ 개의 세포가 되도록 접종시키고, 5% 농도의 CO₂ 배양기에 37℃로 24시간 동안 배양하였다. 그 후, serum이 없는 DMEM배지로 교환하고 10 및 50ppmm 농도의 으름덩굴 추출물을 처리한 다음 4시간 후, 과산화수소(H₂O₂)를 0.5mM 농도로 처리하였다. 그 다음 72시간 동안 다시 배양하고, 배양 마지막날 세포독성도 조사(MTT assay; ATCC^TM, 30-1010K)를 이용해 세포생존력을 측정하였다. 대조군은 으름덩굴 추출물을 처리하지 않은 세포에 과산화수소(H₂O₂)를 처리한 것을 사용하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.

실험 결과, 으름덩굴 추출물은 과산화수소(H₂O₂)에 의해 유도된 섬유아세포 의 세포사멸을 억제시키며, 으름덩굴 추출물의 농도가 증가할수록 세포사멸의 억제율이 증가하는 것으로 보아 농도 의존적인 경향이 있는 것으로 나타났다. 또한, 으름덩굴 열매 추출물은 으름덩굴 가지 추출물에 비해 우수한 세포사멸 억제 효과를 가지는 것으로 나타났다.

실시예 5: 으름덩굴 추출물을 함유한 화장료의 주름개선 효과 측정

5-1. 으름덩굴 추출물을 함유한 크림의 제조

하기 표 1과 같은 성분 및 함량을 가진 으름덩굴 추출물(열매 및 가지)을 함유한 영양 크림을 제조하였다. 구체적으로, 수상인 정제수, 트리에탄올 아민 및 프로필렌글리콜을 70℃로 가열하고 용해시킨 후, 유상인 지방산, 유성성분, 유화제 및 방부제를 70℃로 가열하여 용해한 액을 첨가하여 유화시켰다. 유화가 완료된 후 상기 용액을 45℃로 냉각시키고 으름덩굴 추출물을 0.1중량% 첨가하고 분산시킨 다음 30℃로 냉각하였다.

성분	함량 (중량%)
으름덩굴 추출물(열매 또는 가지)	0.1
호호바 오일	5.0
유동 파라핀	7.0
세틸아릴 알코올	2.0
폴리글리세릴-3 메칠 글루코스 디스테아레이	2.0
글리세릴 스테아레이트	0.5
스쿠알란	3.0
프로필렌글리콜	4.0
글리세린	5.0
트리에탄올 아민	0.3
카르복시 비닐폴리머	0.3
토코페릴 아세테이트	0.2
방부제, 향	미량
정제수	잔량
합계	100

5-2. 으름덩굴 추출물을 함유한 영양크림의 주름개선 효과 측정

상기 5-1의 방법으로 제조한 으름덩굴 추출물(열매 및 가지)이 0.1중량% 함유된 영양크림을 26 내지 40세의 건강한 여성 15명을 대상으로 각각 피검자의 얼굴에 1일 2회씩 3개월 동안 사용하게 하였다. 대조군으로 으름덩굴 추출물 대신 정제수를 함유시켜 제조한 영양크림을 사용하였다.

주름개선 효과는 피부탄력 변화의 측정을 통해 평가하였으며, 피부탄력의 측정은 온도 24 내지 26℃, 습도 38 내지 40%로 일정하게 유지되는 조건에서 Cutometer SEM 474(Courage+Khazaka, Cologne, 독일)를 이용하여 측정함으로써 이루어졌으며, 판정기준은 피부탄력이 없는 경우를 0, 많은 경우를 5로 하여 상대적인 값을 비교하였다. 그 결과를 표 2에 나타내었다.

분류	제조예 1		대조군
분류	열매 추출물	가지 추출물
피부탄력도	2.75	2.69	2.40

상기 표 1에 나타낸 것과 같이, 본 발명의 으름덩굴 추출물을 함유한 영양크림을 사용한 경우 으름덩굴 추출물이 함유되지 않은 영양크림을 사용한 경우에 비하여 피부탄력도가 증가하였으며, 으름덩굴의 열매 추출물이 으름덩굴의 가지 추출물에 비해 효과가 더 좋음을 나타내었다.

실시예 6 : 으름덩굴 추출물의 인체 피부에 대한 안전성 확인 실험

6-1. 으름덩굴 추출물을 포함한 피부 외용제의 제조

으름덩굴 추출물이 인체피부에 안전한지 확인하기 위하여, 하기 표 3의 성분 및 함량으로 으름덩굴 추출물 1중량%를 함유한 피부 외용제를 제조한 다음 피부 안전성 검증 실험을 수행하였다. 먼저, 스쿠알렌을 베이스로 정제수, 글리세린, 부틸렌글리콜을 혼합하여 약 70℃의 온도에서 용해한 다음(수상파트), 상기 세 성분과 트리메탄올아민을 제외한 나머지 성분을 약 70℃의 온도에서 용해하였다(유상파트). 그 후, 상기 오일파트를 수상파트에 첨가시켜 호모믹서(일본 Tokushu Kika사)로 교반하여 1차 유화한 다음, 트리메탄올아민을 최종 첨가하였다.

성분	함량 (%)
성분	시험군 1	시험군 2	대조군
정제수	71	71	71
글리세린	8.0	8.0	8.0
부틸렌글리콜	4.0	4.0	4.0
으름덩굴 열매추출물	0.1	0	0
으름덩굴 가지추출물	0	0.1	0
카프릴릭 카프리 트리글리세라이드	8.0	8.0	8.0
스쿠알란	5.0	5.0	5.0
세테아릴 글루쿠사이드	1.5	1.5	1.5
소르비탄 스테아레이트	0.4	0.4	0.4
세테아릴 알코올	1.0	1.0	1.0
트리메탄올아민	0.1	0.1	0.1
총중량	100	100	100

6-2. 피부누적 자극 실험

상기 6-1의 방법으로 제조한 피부 외용제를 건강한 30명의 성인을 대상으로 윗팔뚝 부위에 격일로 총 9회의 24시간 누적 첩포를 시행하여 으름덩굴 추출물이 피부에 자극을 주는지의 여부를 측정하였다. 대조군으로는 스쿠알란 베이스로 으름덩굴 추출물이 함유되지 않은 피부 외용제를 사용하였다.

첩포는 핀 챔버(Finn chamber, Epitest Ltd, 핀란드)를 이용하였으며, 챔버에 상기 각 피부외용제를 15㎕씩 적하한 후 첩포를 실시하였다. 매회 피부에 나타난 반응의 정도를 하기 실험식 1을 이용하여 점수화 하였으며, 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.

[실험식 1]

평균반응도 = [[반응지수 × 반응도 / 총피검자수 × 최고점수 (4점)] ×100] / 검사회수

이 때, 반응도에서 ± 는 1점, +는 2점 및 ++는 4점의 점수를 부여하며, 평균반응도가 3 미만일 때 안전한 조성물로 판정된다.

시험물질	반응이 나타난 피검자수(명)									평균 반응도
	1주			2주			3주
	1차	2차	3차	4차	5차	6차	7차	8차	9차
	±/+/++	±/+/++	±/+/++	±/+/++	±/+/++	±/+/++	±/+/++	±/+/++	±/+/++
대조군	0/0/0	0/0/0	0/0/0	0/0/0	0/0/0	0/0/0	0/0/0	0/0/0	0/0/0	0.00
시험군 1	0/0/0	0/0/0	0/0/0	0/0/0	0/0/0	0/0/0	0/0/0	0/0/0	0/0/0	0.00
시험군 2	0/0/0	0/0/0	0/0/0	0/0/0	0/0/0	0/0/0	0/0/0	0/0/0	0/0/0	0.00

상기 표 4에 나타낸 것과 같이, 대조군, 시험군 1 및 2 모두 ± , + 및 ++에 해당하는 사람의 수가 각각 0명, 0명 및 0명으로 피부에 반응이 나타나지 않았다. 상기 기재된 실험실 1에 따라 계산한 결과 평균 반응도는 각각 0.00, 0.00, 0.00으로 모두 3 이하의 반응도를 나타나 안전한 조성물로 판단되었다.

제조예 1 : 화장료 제제

1-1. 유연 화장수의 제조

하기의 표 5와 같이 으름덩굴 추출물을 유효성분으로 포함하는 유연 화장수를 통상의 방법에 따라 제조하였다.

성분	함량(중량%)
으름덩굴 추출물	0.1
글리세린	3.0
부틸렌 글리콜	2.0
프로필렌 글리콜	2.0
카복시비닐폴리머	0.1
에탄올	10.0
트리에탄올아민	0.1
방부제, 미량색소, 미량향료 및 미량정제수	잔량
총계	100.0

1-2. 영양 화장수의 제조

하기의 표 6과 같이 으름덩굴 추출물을 유효성분으로 포함하는 영양 화장수를 통상의 방법에 따라 제조하였다.

성분	함량(중량%)
으름덩굴 추출물	0.1
밀납	4.0
폴리소르베이트 60	1.5
소르비탄세스퀴올레이트	0.5
유동파라핀	5.0
스쿠알란	5.0
카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드	5.0
글리세린	3.0
부틸렌 글리콜	3.0
프로필렌 글리콜	3.0
카복시비닐폴리머	0.1
트리에탄올아민	0.2
방부제, 미량색소, 미량향료 및 미량정제수	잔량
총계	100.0

1-3. 영양 크림의 제조

하기의 표 7과 같이 으름덩굴 추출물을 유효 성분으로 포함하는 영양 크림을 통상의 방법에 따라 제조하였다.

성분	함량(중량%)
으름덩굴 추출물	0.1
밀납	10.0
폴리소르베이트 60	1.5
소르비탄세스퀴올레이트	0.5
유동파라핀	10.0
스쿠알란	5.0
카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드	5.0
글리세린	5.0
부틸렌 글리콜	3.0
프로필렌 글리콜	3.0
트리에탄올아민	0.2
방부제, 미량색소, 미량향료 및 미량정제수	잔량
총계	100.0

1-4. 맛사지 크림의 제조

하기의 표 8과 같이 으름덩굴 추출물을 유효 성분으로 포함하는 맛사지 크림을 통상의 방법에 따라 제조하였다.

성분	함량(중량%)
으름덩굴 추출물	0.1
밀납	10.0
폴리소르베이트 60	1.5
소르비탄세스퀴올레이트	0.8
유동파라핀	40.0
스쿠알란	5.0
카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드	4.0
글리세린	5.0
부틸렌 글리콜	3.0
프로필렌 글리콜	3.0
트리에탄올아민	0.2
방부제, 미량색소, 미량향료 및 미량정제수	잔량
총계	100.0

1-5. 팩의 제조

하기의 표 9와 같이 으름덩굴 추출물을 유효 성분으로 포함하는 팩을 통상의 방법에 따라 제조하였다.

성분	함량(중량%)
으름덩굴 추출물	0.1
폴리비닐알콜	13.0
소듐카복시메틸셀룰로스	0.2
알란토인	0.1
에탄올	5.0
노닐페닐에테르	0.3
방부제, 미량색소, 미량향료 및 미량정제수	잔량
총계	100.0

Claims

으름덩굴 추출물(Akebia quinata extract)을 유효성분으로 포함하는 최종당화산물(AGEs) 억제용 피부 외용제 조성물.
제1항에 있어서, 상기 으름덩굴 추출물은 으름덩굴의 과피, 과육, 열매, 잎, 줄기, 가지 및 뿌리로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
제1항에 있어서, 상기 최종당화산물 생성 억제는 피부의 섬유모세포에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
제1항에 있어서, 상기 최종당화산물 생성 억제는 피부주름개선, 피부탄력개선, 노화방지 및 피부 재생으로 이루어진 것으로부터 선택된 하나 이상의 피부상태 개선을 유도하는 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 화장료 또는 의약품의 용도로 사용하는 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
제5항에 있어서, 상기 화장료는 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징제, 오일, 분말 파운데이션, 유액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 형태인 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 으름덩굴 추출물은 조성물의 총 중량을 기준으로 0.0001 내지 15중량% 포함되는 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.