KR101503588B1 - 으아리 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부상태 개선용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 으아리 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부상태 개선용 화장료, 약제학적 및 식품 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 콜라겐 합성을 증대시키고 콜라겐을 분해시키는 효소인 콜라게나아제의 활성을 억제시켜 우수한 주름개선 및 피부재생 효능을 가진다. 또한, 활성산소에 의하여 손상된 세포의 재생을 촉진시켜 우수한 피부노화방지 효능을 가진다. 아울러, 본 발명의 조성물은 세포독성 및 피부 부작용이 없어 화장료, 약제학적 및 식품 조성물에 안전하게 적용할 수 있다.

Description

으아리 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부상태 개선용 조성물{Composition for Improving Skin Conditions Comprising Clematis mandshurica Ruprecht Extract}

본 발명은 으아리 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부상태 개선용 조성물에 관한 것이다.

환경오염, 자동차 배기가스 등으로 인해 호르몬 불균형 현상이 심화되고 있다. 이로 인해 탈모 발생률이 높아지고, 발생연령도 낮아지고 있으며, 피부면역시스템의 부조화가 초래되어 다양한 피부질환 등이 발생하고 있다. 따라서 미적인 차원뿐만 아니라 심각한 사회문제가 되고 있는 여러 가지 현상, 예를 들어, 내인성 노화와 자외선에 의한 주름발생, 면역불균형 및 탈모 등과 같은 현상을 효과적으로 해결할 수 있는 물질개발이 심도 깊게 연구되고 있다.

주름은 피부의 노화로 생기며, 노화된 피부라 함은 노화의 과정과 연관된 자연적 변화의 총체이다. 피부노화는 크게 두 가지로 구분되는데, 피부표면 전체에서 나이와 관련된 피부 기능, 구조 또는 모양의 변화를 나타내는 생리적 노화와 자외선에 의한 광노화로 구분된다.

피부에 노화가 진행되면 진피의 변화가 현저하게 나타나며, 70세 이후 나타나는 진피위축은 대표적인 노화현상이다. 진피의 변화는 섬유아세포(fibroblast)의 숫자와 이들의 합성 능력의 감소로 인하여 세포 외 기질 중 큰 분자량을 가진 물질들이 변화함으로써 발생된다. 그 구체적인 변화로는 콜라겐 다발의 분리, 점다당질 합성감소, 콜라겐과 탄력섬유(elastin) 수와 직경 감소, 콜라겐과 탄력섬유 분쇄 및 혈관의 팽창 등을 들 수 있다. 일반적으로 피부의 수분 함유량, 콜라겐 함유량 및 외부 환경에 대한 면역 작용 능력 등 여러 가지 복합적인 요인들 중 주름의 형성에 가장 큰 영향을 미치는 것은 콜라겐의 생성량과 콜라겐의 함량을 감소시키는 콜라겐 분해 효소인 콜라게네이즈의 발현량과 활성이다.

상기와 같은 주름을 예방하기 위해 활성 산소의 발생을 억제하여 세포의 노화를 예방하는 항산화제를 사용하거나, 하이드록시산(글리콜리산), 베타 하이드록시산(살리실산) 등의 화학 약품을 사용하여 피부를 벗김으로써 피부에 얇게 생성된 주름을 개선하는 박피술, 보툴리늄 독소를 주름이 형성되는 안면 근육에 일정량 주사하여 주름을 개선하는 보톡스 시술 및 주름 부위를 하이알루론산(hyalulonic acid) 등의 물질로 채워 주름을 완화시키는 필러 등의 방법들이 있다.

상기 방법들은 주름 개선 효과가 미약하거나, 과도하게 사용되는 경우 부작용이 발생하고 안정성 및 안전성에 문제가 있기 때문에, 천연물로부터 유래하여 부작용이 적어 안전하면서도 주름 개선 효과가 우수한 조성물의 개발이 필요하다.

천연물로부터 유래된 피부노화방지 및 피부주름개선 방법으로, 대한민국 등록특허 제0868784호에 망목주름담홍버섯 액체배양 추출물을 함유하는 주름 개선 화장료 조성물에 대하여 개시되어 있고, 대한민국 공개특허 제2007-0123712호에는 람부탄 및 리치 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 노화 방지용 및 피부 주름 개선용 화장료 조성물에 대하여 개시되어 있다. 또한, 대한민국 공개특허 제2011-0078678호는 이소플라본 비배당체를 포함하는 주름 개선용 화장료 조성물에 대하여 개시되어 있고, 대한민국 공개특허 제2008-0069816호는 보이차 추출물을 함유하는 피부 주름 및 탄력 개선용 조성물에 대하여 개시되고 있다.

그러나, 아직까지 본 발명에서와 같은 으아리 추출물을 이용하여 피부주름개선, 피부노화방지 및 피부재생을 위한 방법에 대하여서는 개시된 바가 없다.

이에, 본 발명자들은 천연물을 이용하여 인체에 무해하고 안전성이 우수하면서도 효과가 뛰어난 식물유래 피부상태 개선용 조성물을 개발하기 위하여 노력한 결과, 으아리 추출물을 유효성분으로 하는 조성물이 피부주름개선, 피부노화방지 및 피부재생에 매우 효과적임을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 하나의 목적은 으아리 추출물(Clematis mandshurica Ruprecht Extract)을 유효성분으로 포함하는 피부상태 개선용 화장료 조성물 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 으아리 추출물(Clematis mandshurica Ruprecht Extract)을 유효성분으로 포함하는 피부상태 개선용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 으아리 추출물(Clematis mandshurica Ruprecht Extract)을 유효성분으로 포함하는 피부상태 개선 및 예방용 식품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명은 하나의 양태로서, 으아리 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부상태 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 으아리(Clematis mandshurica Ruprecht)는 미나리아재비과에 속하는 낙엽 덩굴 식물로서, 전국 각지의 야산과 들에서 자생한다. 어린잎은 식용하고, 뿌리는 약재로 사용한다. 약효성분으로는 아네모닌(Anemonin), 아네모놀(Anemonol), 스테롤(Sterol), 당류(Glucose), 락톤(Lactone), 아미노산(Amino acid), 크레마틴(Clematin), 사포닌(Saponin) 등이 알려져 있으며, 으아리의 뿌리는 순환기계통에 작용하여 혈압을 내려 주며, 혈당강하, 사지신경통, 요통, 관절염, 사지마비와 보행 장애 등에 특효를 나타낸다. 최근의 임상실험에서는 급성황달형 전염성 간염에 치유효과가 확인되었고 관절염에도 소염작용이 뛰어난 것으로 알려져 있다. 이밖에 안질환으로 결막염, 눈다래끼 등에 쓰이고 편도선염이나 볼거리염의 소염, 해열작용도 나타낸다. 민간에서는 뿌리를 캐내어 술에 담가두었다가 공복에 마셔서 신경통을 치료하기도 하였다.

본 발명에 있어서, 으아리 추출물은 으아리의 전초를 포함한 잎, 뿌리, 줄기, 및 꽃으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 추출하여 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 으아리 추출물은 당업계에 공지된 추출방법 및 추출용매를 이용하여 수득할 수 있으며, 바람직하게는 물, 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올(메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등), 상기 저급 알코올과 물과의 혼합용매, 아세톤, 에틸 아세테이트, 클로로포름, 헥산 또는 1,3-부틸렌글리콜을 추출 용매로 하여 수득할 수 있다.

또한, 상기 으아리 추출물은 상기 추출용매에 의하여 추출하는 방법 외에 통상적인 정제 과정을 거쳐서도 수득할 수 있다. 예를 들어, 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외여과막을 이용한 분리, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 분획을 통하여도 수득할 수 있다.

본 발명에 있어서, 으아리 추출물은 추출, 분획 또는 정제의 각 단계에서 얻어지는 모든 추출액, 분획 및 정제물, 그들의 희석액, 농축액 또는 건조물을 모두 포함한다.

본 발명에 있어서, 피부상태 개선은 피부주름개선, 피부노화방지 및 피부재생으로 이루어진 것으로부터 선택된 하나 이상의 피부상태 개선을 유도하는 것을 말한다.

구체적으로, 으아리 추출물은 섬유아세포 보호, 콜라겐 합성 촉진 및 콜라겐분해효소 억제함으로써 우수한 피부주름개선, 피부노화방지 및 피부재생 효능을 나타낸다.

하나의 구체적 실시에서, 사람의 정상 섬유모세포를 이용하여 활성산소의 생성을 유도한 경우 으아리 추출물의 농도에 따른 세포 생존률을 살펴본 결과, 으아리 추출물의 농도가 높아질수록 세포의 생존률이 높아지는 것으로 나타나, 으아리 추출물은 피부노화방지 효과가 있는 것으로 확인되었다.

다른 하나의 구체적 실시에서, 사람의 정상 섬유모세포를 이용하여 으아리 추출물의 농도에 따른 콜라겐 합성 증가율을 살펴본 결과, 으아리 추출물의 농도가 높아질수록 콜라겐 합성 증가율이 높아지는 것으로 나타나, 으아리 추출물이 콜라겐을 합성시킴으로서 주름개선 및 피부재생 효과를 나타내는 것으로 확인되었다.

또 다른 하나의 구체적 실시에서, 인간의 피부에 으아리 추출물이 포함된 화장료를 사용하여 피부 탄력도를 관찰한 결과, 화장료에 포함된 으아리 추출물의 함량이 높아질수록 피부 탄력도가 증가되어 으아리 추출물이 주름개선 효과가 있는 것으로 확인되었다.

본 발명에 있어서, 화장료 조성물은 피부주름개선, 피부노화방지 및 피부재생 효능을 가진 유효성분으로서의 으아리 추출물 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있다. 예를 들어, 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 화장료로서 허용되는 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다.

상기 화장료 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 영양 크림, 수렴 화장수, 유연 화장수, 로션, 에센스, 샴푸, 영양젤 또는 마사지 크림의 제형으로 제조될 수 있다.

상기 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라가칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

상기 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

상기 화장료 조성물이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

상기 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미결정 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 한천 또는 트라가칸트 등이 이용될 수 있다.

상기 화장료 조성물의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

상기 으아리 추출물의 유효성분은 전체 조성물을 기준으로 하여 0.00001 내지 15중량%, 보다 바람직하게는 0.0001 내지 10중량%, 가장 바람직하게는 0.0001 내지 5중량%이다. 으아리 추출물의 중량이 0.0001중량% 미만일 경우 피부주름개선, 피부노화방지 및 피부재생 효능이 미약하고 15중량%를 초과하는 경우에는 함량의 증가에 따른 효과의 증가가 매우 미약하다는 문제점이 있다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명의 으아리 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부상태 개선용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 으아리 추출물의 추출용매, 추출방법 및 효능 등에 관한 내용은 상술한 바와 같다.

또한, 본 발명에 있어서 피부상태 개선은 상술한 바와 같다.

본 발명에 있어서, 약제학적 조성물은 피부주름개선, 피부노화방지 및 피부재생 효능을 가진 유효성분으로서의 으아리 추출물 이외에 약제학적 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있다. 예를 들어, 윤활제, 습윤제 ,감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 및 담체를 포함할 수 있다.

상기 약제학적 조성물로 적합한 담체는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 비경구, 경구 등의 다양한 경로로 투여될 수 있으며, 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

상기 약제학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서 약학적으로 유효한 양은 의학적 치료 또는 예방에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 예방하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 종류 및 이의 중증도, 약물의 활성, 환자의 연령, 체중, 건강 및 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 사용된 특정 추출물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 사용된 특정 추출물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 일반적으로, 성인 기준으로 0.001 내지 100mg/kg, 바람직하게는 10 내지 100mg/kg의 용량을, 일일 1회 내지 수회 투여할 수 있다. 또한 외용제인 경우에는 성인 기준으로 1.0 내지 3.0ml의 양으로 1일 1회 내지 5회 도포하여 1개월 이상 계속 하는 것이 좋다. 다만 상기 투여량에 의해 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

상기 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제와 함께 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 치료 목적에 따라 약제학 분야에서 통상적인 제제로 제형화될 수 있는데, 예를 들어, 정제, 캅셀제, 산제, 과립, 현탁제, 유제, 시럽제, 유탁제, 경고제, 연고제, 스프레이제, 오일제, 겔제, 주정제, 틴크제, 욕제, 리니먼트제, 로션제, 패취제, 패드제, 크림제 등으로 제형화될 수 있다. 또한, 환부에 직접 도포하는 국소투여를 목적으로 하는 피부 외용제로서 바람직하게 사용될 수 있는데, 이 경우 연고제, 로션제, 스프레이제, 젤 등의 형태가 바람직하다. 이들 피부 외용제는 또한 치료 부위에 직접 적용될 수 있는 지지 기재(support base) 또는 매트릭스 등에 포함될 수 있으며, 지지기재의 예는 거즈 또는 붕대를 포함한다.

상기 으아리 추출물의 유효성분은 전체 조성물을 기준으로 하여 0.00001 내지 15중량%, 보다 바람직하게는 0.0001 내지 10중량%, 가장 바람직하게는 0.0001 내지 5중량%이다. 으아리 추출물의 중량이 0.0001중량% 미만일 경우 피부주름개선, 피부노화방지 및 피부재생 효능이 미약하고 15중량%를 초과하는 경우에는 함량의 증가에 따른 효과의 증가가 매우 미약하다는 문제점이 있다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 으아리 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부상태 개선 및 예방용 식품 조성물에 관한 것이다.

상기 으아리 추출물의 추출용매, 추출방법 및 효능 등에 관한 내용은 상술한 바와 같다.

또한, 본 발명에 있어서 피부상태 개선은 상술한 바와 같다.

본 발명에 있어서, 식품 조성물은 피부주름개선, 피부노화방지 및 피부재생 효능을 가진 유효성분으로서의 으아리 추출물 이외에 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물은 포도당 및 과당 당의 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스 및 올리고당 등의 디사카라이드, 덱스트린 및 사이클로덱스트린 등의 폴리사카라이드, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상기 향미제는 천연 향미제 (타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 으아리 추출물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

본 발명의 식품이 음료일 경우 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기의 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다.

상기 식품은 상술한 성분 외에 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 건강식품은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.

상기 으아리 추출물의 유효성분은 전체 조성물을 기준으로 하여 0.00001 내지 15중량%, 보다 바람직하게는 0.0001 내지 10중량%, 가장 바람직하게는 0.0001 내지 5중량%이다. 으아리 추출물의 중량이 0.0001중량% 미만일 경우 피부주름개선, 피부노화방지 및 피부재생 효능이 미약하고 15중량%를 초과하는 경우에는 함량의 증가에 따른 효과의 증가가 매우 미약하다는 문제점이 있다.

본 발명의 으아리 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료, 약제학적 및 식품 조성물은 피부주름개선, 피부노화방지 및 피부재생 효능을 가진다. 그리고 세포독성 및 피부 부작용이 없어 화장료, 약제학적 및 식품 조성물에 안전하게 적용될 수 있다.

도 1은 으아리 추출물의 농도에 따른 콜라겐(타입 I 콜라겐) 생합성 촉진 효과를 보여주는 그래프이다.
도 2는 으아리 추출물의 농도에 따른 콜라겐분해효소 억제 효과를 보여주는 그래프이다.
도 3은 사람의 정상 섬유모세포에 산화 스트레스를 유도한 경우 으아리 추출물의 농도에 따른 세포재생 효과를 관찰한 결과이다.
도 4는 사람의 정상 섬유모세포에 산화 스트레스를 유도한 경우 으아리 추출물의 농도에 따른 세포노화억제 효과를 보여주는 그래프이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 으아리 추출물 제조

으아리의 잎, 뿌리, 줄기 및 꽃을 채취하여 이물질 및 불순물이 완전히 제거되도록 깨끗이 세척한 다음, 각각 20 내지 35℃에서 음건한 다음, 분쇄하여 입자의 크기가 1mm 이하가 되도록 하였다. 그 다음 상기 분쇄된 으아리 분말 1kg을 70% 에탄올 10L에 침지하여 24시간 동안 초음파 추출하였다. 그 후 수득한 추출액을 여과지(Advantes, No.2)에 여과하고, 감압농축하여 으아리 추출물을 제조하였다.

실시예 2: 으아리 추출물의 콜라겐 합성 효과 측정

인간의 정상 섬유아세포(human normal fibroblast, 아주대 피부과)를 DMEM 배지가 들어 있는 24-웰 마이크로 플레이트에 웰당 약 2 × 10⁵ 개의 세포가 되도록 접종시키고, 5% 농도의 CO₂ 배양기에 37℃로 24시간 동안 배양하였다. 그 후, 각 웰의 배지를 제거하고 1, 10, 50 및 100 ppm 농도의 으아리 추출물을 처리한 다음 24시간 동안 다시 배양한 다음, 세포배지를 수집하여 샘플을 제조하였다.

상기에서 제조한 샘플의 콜라겐 합성량은 콜라겐 측정 키트(Procollagen Type I C-peptide EIA kit (MK101), 다카라, 교토, 일본)를 이용하여 프로콜라겐(procollagen) 타입I C-펩타이드(Type I C-peptide: PICP)의 양을 측정하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다.

실험 결과, 으아리 추출물이 콜라겐 합성을 증가시켰으며, 으아리 추출물의 농도가 증가할수록 인간의 정상 섬유아세포의 콜라겐 합성율이 상승하는 것으로 보아 농도 의존적인 경향이 있는 것으로 나타났다.

실시예 3 : 으아리 추출물의 콜라겐 분해효소 억제 효과 측정

인간의 정상 섬유아세포(human normal fibroblast, 아주대 피부과)를 DMEM 배지가 들어 있는 24-웰 마이크로 플레이트에 웰당 약 2 × 10⁵ 개의 세포가 되도록 접종시키고, 5% 농도의 CO₂ 배양기에 37℃로 24시간 동안 배양하였다. 그 후, 각 웰에서 배지를 제거하고 1, 10, 50 및 100 ppm 농도의 으아리 추출물을 처리한 다음 24시간 동안 다시 배양하여, 세포배지를 수집하여 샘플을 제조하였다.

상기 제조한 샘플의 콜라겐 분해효소 억제효과 측정은 콜라겐 분해효소 측정 키트(MMP-1 ELISA kit (QIA55), Merck, Germany)를 이용하여 콜라겐 분해효소의 양을 측정하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.

실험 결과, 으아리 추출물은 인간 정상 섬유아세포의 콜라겐 분해효소의 생성량을 감소시켰으며, 으아리 추출물의 농도가 증가할수록 인간 정상 섬유아세포의 콜라겐 분해효소의 생성량이 감소하여 농도 의존적인 경향이 있는 것으로 나타났다.

실시예 4: 산화스트레스로부터 섬유아세포 보호효과 및 세포재생 효과

인간의 정상 섬유아세포(human normal fibroblast, 아주대 피부과)를 DMEM 배지가 들어 있는 24-웰 마이크로 플레이트에 웰당 약 2 × 10⁵ 개의 세포가 되도록 접종시키고, 5% 농도의 CO₂ 배양기에 37℃로 24시간 동안 배양하였다. 그 후, 무혈청 DMEM배지로 교환하고 1, 10, 50 및 100 ppm 농도의 으아리 추출물을 처리한 다음, 미토콘드리아 활성산소를 유도하는 것으로 알려진 로테논을 1μM을 함께 처리하여 6일 동안 배양하여 3일째 되는 날 세포독성도 조사(MTT assay; ATCC^TM, 30-1010K)를 이용해 세포생존력을 측정하였다. 또한, 배양 마지막날 세포를 SA-beta-Gal 염색하여 세포재생을 확인하였으며, 실험식 1을 이용하여 세포재생율을 계산하였다. 그 결과를 표 1, 도 3 및 도 4에 나타내었다.

[실험식 1]

세포재생율 측정 = {(시료처리군 - 로테논 처리군)/(로테논 처리군)} × 100

시험항목	실시예 1 (10 ppn)	실시예 1 (50 ppn)	실시예 1 (100 ppn)
세포재생율	10	22	32

상기 표 1에 나타낸 것과 같이, 으아리 추출물은 로테논에 의해 유도된 섬유아세포의 세포를 재생시키며, 으아리 추출물의 농도가 증가할수록 세포재생능이 증가하는 것으로 보아 농도 의존적인 경향이 있는 것으로 나타났다.

또한, 도 3 및 도 4에서 보는 바와 같이, 으아리 추출물은 로테논에 의해 유도된 섬유아세포의 세포사멸을 억제시키며, 으아리 추출물의 농도가 증가할수록 세포사멸의 억제율이 증가하는 것으로 보아 농도 의존적인 경향이 있는 것으로 나타났다.

실시예 5: 으아리 추출물을 포함하는 화장료의 주름개선 효과 측정

5-1. 으아리 추출물을 함유한 영양 크림의 제조

하기 표 2와 같은 성분 및 함량을 가진 으아리 추출물을 포함하는 영양 크림을 제조하였다. 구체적으로, 수상인 정제수, 트리에탄올 아민 및 프로필렌글리콜을 70℃로 가열하고 용해시킨 후, 유상인 지방산, 유성성분, 유화제 및 방부제를 70℃로 가열하여 용해한 액을 첨가하여 호모믹서(일본 Tokushu kika사)로 교반하여 유화시켰다. 유화가 완료된 후 상기 용액을 45℃로 냉각시키고 으아리 추출물을 전체 조성물 중량 대비 0.01, 0.05 및 1 중량%를 첨가하고 분산시킨 다음 30℃로 냉각하였다.

성분	함량 (중량%)
으아리 추출물	0.01, 0.05 또는 1.00
호호바 오일	5.0
유동 파라핀	7.0
세틸아릴 알코올	2.0
폴리글리세릴-3 메칠 글루코스 디스테아레이	2.0
글리세릴 스테아레이트	0.5
스쿠알란	3.0
프로필렌글리콜	4.0
글리세린	5.0
트리에탄올 아민	0.3
카르복시 비닐폴리머	0.3
토코페릴 아세테이트	0.2
방부제, 향	미량
정제수	잔량
합계	100

5-2. 으아리 추출물을 포함하는 영양크림의 주름개선 효과 측정

상기 5-1의 방법으로 제조한 으아리 추출물이 0.01, 0.05 및 1 중량% 함유된 영양 크림을 24 내지 35세의 건강한 여성 30명을 대상으로 각각 피검자의 얼굴에 1일 2회씩, 3개월 동안 사용하게 하였다. 대조군으로는 으아리 추출물 대신 정제수를 함유시켜 제조한 영양 크림을 사용하였다.

주름개선 효과는 피부탄력 변화의 측정을 통해 평가하였으며, 피부탄력의 측정은 온도 24 내지 26℃, 습도 38 내지 40%로 일정하게 유지되는 조건에서 Cutometer SEM 474(Courage+Khazaka, Cologne, 독일)를 이용하여 측정함으로써 이루어졌으며, 판정기준은 피부탄력이 없는 경우를 0, 많은 경우를 5로 하여 상대적인 값을 비교하였다. 그 결과를 표 3에 나타내었다.

으아리 추출물 (중량%)	0.01	0.05	1	0
피부탄력도	2.44	2.62	2.95	2.37

상기 표 3에 나타낸 것과 같이, 으아리 추출물을 포함한 영양 크림을 사용한 경우 으아리 추출물이 포함되지 않은 영양 크림을 사용한 경우에 비하여 피부탄력도가 증가하였으며, 으아리 추출물의 함유 농도가 증가함에 따라 피부탄력도가 향상되어 농도 의존적인 경향을 나타내었다.

실시예 6 : 경구투여에 의한 주름예방 효과

으아리 추출물의 주름예방 효과를 측정하기 위하여 6 내지 7 주령의 암컷 무모생쥐(hairless mouse, Skh: HR-1)를 그룹당 8 마리씩 정상군, UV/대조군, UV/으아리 추출물군으로 나누어 실험기간 동안 사육하였다. 정상군과 UV 대조군은 0.5ml의 생리식염수를 경구 투여하였고, UV/으아리 추출물 투여군은 고형분 기준으로 체중 Kg당 100mg의 으아리 추출물을 0.5ml 식염수에 섞어 경구 투여하였다.

상기에서 제조한 샘플은 주 5일간 동일한 시간에 투여하였으며, 경구투여 후 2주부터 5주까지 UV 대조군, UV/으아리 추출물 투여군에 주 3회, 총 UV 조사량이 60 mJ/cm²이 되도록 하였다.

주름예방 효과를 측정하기 위하여 부검 전 무모생쥐(hairless mouse)의 등쪽에서 실리콘 폴리머를 이용하여 피부주형(replica)을 채취하였고, 마찬가지로 5주 후에 각 샘플 처리군으로부터 피부주형을 채취하여 항노화 효과, 즉 주름개선 효과를 비교하였다. 그 결과를 표 4에 나타내었다.

R-파라미터	정상군	UV/대조군	UV/으아리 추출물
R1 값	0.402±0.012	0.45±0.009	0.41±0.005
R2 값	0.321±0.0105	0.48±0.005	0.43±0.011
R3 값	0.212±0.0097	0.30±0.012	0.24±0.004
R4 값	0.098±0.0086	0.19±0.011	0.13±0.006
R5 값	0.231±0.013	0.35±0.009	0.29±0.007

R1 값: 피부의 주름도(Skin roughness), R2 값: 피부의 깊은 주름도(Maximum roughness), R3 값: 피부의 평균주름도(Average roughness), R4 값: 주름 평균깊이(Smoothness depth), R5 값: 피부의 평균 거칠기(Arithmetic average roughness)(International Journal of Cosmetic Science, 27(3):155-60(2005)).

상기 표 4에 기재된 것과 같이, 주름개선정도를 나타내는 R1, R2, R3, R4, R5값 모두 으아리 추출물을 투여한 무모생쥐(hairless mouse)에서 투여하지 않은 UV/대조군에 비해 크게 감소한 것을 관찰하였다.

실시예 7 : 으아리 추출물의 인체 피부에 대한 안전성 확인 실험

7-1. 으아리 추출물을 포함한 피부외용제의 제조

으아리 추출물이 인체 피부에도 안전한지 확인하기 위하여, 하기 표 5의 성분 및 함량으로 으아리 추출물을 함유한 피부외용제를 제조한 다음 피부 안전성 검정 실험을 수행하였다. 먼저, 정제수, 글리세린, 부틸렌글리콜을 혼합하여 약 70 ℃의 온도에서 용해한 다음(수상파트), 상기 세 성분과 트리메탄올아민을 제외한 나머지 성분을 약 70 ℃의 온도에서 용해하였다(유상파트). 그 후, 상기 오일파트를 수상파트에 첨가시켜 호모믹서(일본 Tokushu Kika사)로 교반하여 1차 유화한 다음, 트리메탄올아민을 최종 첨가하였다. 다음으로, 상기 혼합액에 생성된 기포를 제거한 후, 실온으로 냉각시켜 피부외용제를 제조하였다.

성분	함량 (%)
	시험군 1	시험군 2	시험군 3	대조군
정제수	71	71	71	71
글리세린	8.0	8.0	8.0	8.0
부틸렌글리콜	4.0	4.0	4.0	4.0
으아리 추출물	0.1	0.5	1.0	0
카프릴릭 카프리 트리글리세라이드	8.0	8.0	8.0	8.0
스쿠알란	5.0	5.0	5.0	5.0
세테아릴 글루쿠사이드	1.5	1.5	1.5	1.5
소르비탄 스테아레이트	0.4	0.4	0.4	0.4
세테아릴 알코올	1.0	1.0	1.0	1.0
트리메탄올아민	0.1	0.1	0.1	0.1
총중량	100	100	100	100

7-2. 피부누적 자극 실험

상기 7-1의 방법으로 제조한 피부외용제를 건강한 30명의 성인을 대상으로 윗팔뚝 부위에 격일로 총 9회, 24시간 누적 첩포를 시행하여 으아리 추출물이 피부에 자극을 주는지의 여부를 측정하였다. 대조군으로는 스쿠알란 베이스로 으아리 추출물이 함유되지 않은 피부외용제를 사용하였다.

첩포는 핀 챔버(Finn chamber, Epitest Ltd, 핀란드)를 이용하여 수행하였으며, 챔버에 상기 각 피부외용제를 15㎕씩 적하한 후 첩포를 실시하였다. 매회 피부에 나타난 반응의 정도를 하기 실험식 2를 이용하여 점수화 하였으며, 그 결과를 하기 표 6에 나타내었다.

[실험식 2]

평균반응도 = [[{(반응지수 × 반응도)/ (총 피검자수 × 최고점수(4점))}] × 100] / 검사회수(9회)

이때, 반응도에서 ±는 1점, +는 2점 및 ++는 4점의 점수를 부여하며, 평균반응도가 3 미만일 때 안전한 조성물로 판정된다.

시험물질	반응이 나타난 피검자수(명)									평균 반응도
	1주			2주			3주
	1차	2차	3차	4차	5차	6차	7차	8차	9차
	±/+/++	±/+/++	±/+/++	±/+/++	±/+/++	±/+/++	±/+/++	±/+/++	±/+/++
대조군	1/0/0	0/0/0	0/0/0	0/0/0	0/0/0	0/0/0	0/0/0	0/0/0	0/0/0	0.09
시험군 1	0/0/0	0/0/0	0/0/0	0/0/0	0/0/0	0/0/0	0/0/0	0/0/0	0/0/0	0.00
시험군 2	0/0/0	0/0/0	0/0/0	0/0/0	0/0/0	0/0/0	0/0/0	0/0/0	0/0/0	0.00
시험군 3	0/0/0	0/0/0	0/0/0	0/0/0	0/0/0	0/0/0	0/0/0	0/0/0	0/0/0	0.00

상기 표 6에 나타낸 것과 같이, 대조군의 경우 ± , + 및 ++에 해당하는 사람의 수가 1차 첩포에서 각각 1명, 0명, 0명 이였고, 2차 첩포 이후부터는 피부에 반응이 일어나지 않았다. 시험군 1, 2 및 3 모두 ± , + 및 ++에 해당하는 사람의 수가 1차 첩포에서 각각 0명, 0명 및 1명이였고, 2차 첩포 이후부터는 피부에 반응이 일어나지 않았다. 상기 기재된 식에 따라 계산한 결과 대조군의 평균 반응도는 0.09이며, 시험군 1, 2 및 3의 평균 반응도는 각각 0.00, 0.00, 0.00으로 모두 3 이하로 나타나 안전한 조성물로 판단되었다.

제제예 1 : 화장료의 제제

1-1. 유연 화장수의 제조

하기의 표 7과 같이 으아리 추출물을 유효 성분으로 포함하는 유연 화장수를 통상의 방법에 따라 제조하였다.

성분	함량(중량%)
으아리 추출물	0.01
글리세린	3.0
부틸렌 글리콜	2.0
프로필렌 글리콜	2.0
카복시비닐폴리머	0.1
에탄올	10.0
트리에탄올아민	0.1
방부제, 미량색소, 미량향료 및 미량정제수	잔량
총계	100.0

1-2. 영양 화장수의 제조

하기의 표 8과 같이 으아리 추출물을 유효 성분으로 포함하는 영양 화장수를 통상의 방법에 따라 제조하였다.

성분	함량(중량%)
으아리 추출물	0.01
밀납	4.0
폴리소르베이트 60	1.5
소르비탄세스퀴올레이트	0.5
유동파라핀	5.0
스쿠알란	5.0
카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드	5.0
글리세린	3.0
부틸렌 글리콜	3.0
프로필렌 글리콜	3.0
카복시비닐폴리머	0.1
트리에탄올아민	0.2
방부제, 미량색소, 미량향료 및 미량정제수	잔량
총계	100.0

1-3. 영양 크림의 제조

하기의 표 9와 같이 으아리 추출물을 유효 성분으로 포함하는 영양 크림을 통상의 방법에 따라 제조하였다.

성분	함량(중량%)
으아리 추출물	0.01
밀납	10.0
폴리소르베이트 60	1.5
소르비탄세스퀴올레이트	0.5
유동파라핀	10.0
스쿠알란	5.0
카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드	5.0
글리세린	5.0
부틸렌 글리콜	3.0
프로필렌 글리콜	3.0
트리에탄올아민	0.2
방부제, 미량색소, 미량향료 및 미량정제수	잔량
총계	100.0

1-4. 맛사지 크림의 제조

하기의 표 10과 같이 으아리 추출물을 유효 성분으로 포함하는 맛사지 크림을 통상의 방법에 따라 제조하였다.

성분	함량(중량%)
으아리 추출물	0.01
밀납	10.0
폴리소르베이트 60	1.5
소르비탄세스퀴올레이트	0.8
유동파라핀	40.0
스쿠알란	5.0
카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드	4.0
글리세린	5.0
부틸렌 글리콜	3.0
프로필렌 글리콜	3.0
트리에탄올아민	0.2
방부제, 미량색소, 미량향료 및 미량정제수	잔량
총계	100.0

1-5. 팩의 제조

하기의 표 11과 같이 으아리 추출물을 유효 성분으로 포함하는 팩을 통상의 방법에 따라 제조하였다.

성분	함량(중량%)
으아리 추출물	0.01
폴리비닐알콜	13.0
소듐카복시메틸셀룰로스	0.2
알란토인	0.1
에탄올	5.0
노닐페닐에테르	0.3
방부제, 미량색소, 미량향료 및 미량정제수	잔량
총계	100.0

제조예 2: 약학적 제제의 제조

2-1. 산제의 제조

으아리 추출물을 유효 성분으로 포함하는 산제를 제조하기 위하여, 하기 표 12의 성분을 혼합한 다음 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

성분	함량(g)
으아리 추출물	2
유당	1

2-2. 정제의 제조

으아리 추출물을 유효 성분으로 포함하는 정제를 제조하기 위하여, 하기 표 13의 성분을 혼합한 다음 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

성분	함량(mg)
으아리 추출물	100
옥수수전분	100
유당	100
스테아린산 마그네슘	2

2-3. 캡슐제의 제조

으아리 추출물을 유효 성분으로 포함하는 캡슐제를 제조하기 위하여, 하기 표 14의 성분을 혼합한 다음 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

성분	함량(mg)
으아리 추출물	100
옥수수전분	100
유당	100
스테아린산 마그네슘	2

Claims (6)

1. 으아리 추출물(Clematis mandshurica Ruprecht extract)을 유효성분으로 포함하는 피부재생용 화장료 조성물.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 으아리 추출물은 으아리의 전초를 포함한 잎, 뿌리, 줄기 및 꽃으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상으로 추출된 것을 특징으로 하는 피부재생용 화장료 조성물.
   
3. 삭제
4. 제1항에 있어서, 상기 으아리 추출물은 조성물의 총 중량을 기준으로 0.0001 내지 15중량%의 함량으로 포함되는 것을 특징으로 하는 피부재생용 화장료 조성물.
   
5. 으아리 추출물(Clematis mandshurica Ruprecht extract)을 유효성분으로 포함하는 피부재생용 약제학적 조성물.
6. 삭제

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