JP6042904B2 - 乳頭状および網状の線維芽細胞の新規マーカーおよびその使用 - Google Patents
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-
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Description
a.少なくとも1つの試験化合物を乳頭状線維芽細胞の試料に接触させる工程;
b.上記乳頭状線維芽細胞中の、PDPN、CCRL1およびNTN1から選択される少なくとも1つの遺伝子の発現を測定する工程;ならびに
c.未処理の乳頭状線維芽細胞と比較して、aで処理した乳頭状線維芽細胞中で、上記遺伝子の少なくとも1つの発現の少なくとも1.5倍の活性化が測定される化合物を選別する工程を含む、方法に関する。
を与えるための候補化合物をスクリーニングするインビトロ法であって、
a.少なくとも1つの試験化合物を網状線維芽細胞の試料に接触させる工程;
b.上記網状線維芽細胞中の、MGP、PPP1R14AおよびTGM2から選択され
る少なくとも1つの遺伝子の発現を測定する工程;ならびに
c.未処理の網状線維芽細胞と比較して、aで処理した網状線維芽細胞中で、上記遺伝
子の少なくとも1つの発現の多くとも1.0倍の活性化が測定される化合物を選別する工
程を含む、方法に関する。
また、本出願が提供する発明として、以下に例示するものが挙げられる。
[1] 皮膚の老化を予防および/もしくは軽減させ、かつ/または皮膚に潤いを与えるための候補化合物をスクリーニングするインビトロ法であって、
a.少なくとも1つの試験化合物を乳頭状線維芽細胞の試料に接触させる工程;
b.前記乳頭状線維芽細胞中の、PDPN、CCRL1およびNTN1から選択される少なくとも1つの遺伝子の発現を測定する工程;ならびに
c.未処理の乳頭状線維芽細胞と比較して、aで処理した乳頭状線維芽細胞中で、前記遺伝子の少なくとも1つの発現の少なくとも1.5倍の活性化が測定される化合物を選別する工程を含む、方法。
[2] 皮膚の老化を予防および/もしくは軽減させ、かつ/または皮膚に潤いを与えるための候補化合物をスクリーニングするインビトロ法であって、
a.少なくとも1つの試験化合物を網状線維芽細胞の試料に接触させる工程;
b.前記網状線維芽細胞中の、TGM2、MGPおよびPPP1R14Aから選択される少なくとも1つの遺伝子の発現を測定する工程;ならびに
c.未処理の網状線維芽細胞と比較して、aで処理した網状線維芽細胞中で、前記遺伝子の少なくとも1つの発現の多くとも1.0倍の活性化が測定される化合物を選別する工程を含む、方法。
[3] 生物学的試料における乳頭状線維芽細胞および網状線維芽細胞の存在を検出するインビトロ法であって、前記線維芽細胞における、PDPN、MGP、CCRL1、PPP1R14A、NTN1およびTGM2からなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子の発現を測定する工程を含む、方法。
[4] 生物学的試料における乳頭状線維芽細胞の網状線維芽細胞への分化をモニターするインビトロ法であって、前記線維芽細胞における、PDPN、MGP、CCRL1、PPP1R14A、NTN1およびTGM2からなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子の発現を測定する工程を含む、方法。
[5] PDPN、MGP、CCRL1、PPP1R14A、NTN1およびTGM2から選択される少なくとも1つの遺伝子の発現が、対応遺伝子のmRNAを定量することによって測定される、[1]〜[4]のいずれか1項に記載の方法。
[6] PDPN、MGP、CCRL1、PPP1R14A、NTN1およびTGM2から選択される少なくとも1つの遺伝子の発現が、対応遺伝子によりコードされるタンパク質を定量することによって測定される、[1]〜[4]のいずれか1項に記載の方法。
[7] 試験化合物が植物抽出物から選択される、[1]〜[6]のいずれか1項に記載の方法。
a’乳頭状線維芽細胞の少なくとも2つの試料を調製する工程;
a.上記試料の1つを少なくとも1つの試験化合物と接触させる工程;その後
b.上記試料中の、PDPN、CCRL1およびNTN1から選択される少なくとも1つの遺伝子の発現を測定する工程;ならびに
c.未処理の乳頭状線維芽細胞と比較して、aで処理した乳頭状線維芽細胞中で、上記遺伝子の少なくとも1つの発現の少なくとも1.5倍の活性化が測定される化合物を選別する工程を含む、方法に関する。
a’網状線維芽細胞の少なくとも2つの試料を調製する工程;
a.上記試料の1つを少なくとも1つの試験化合物と接触させる工程;その後
b.上記試料中の、MGP、PPP1R14AおよびTGM2から選択される少なくとも1つの遺伝子の発現を測定する工程;ならびに
c.未処理の網状線維芽細胞と比較して、aで処理した網状線維芽細胞中で、上記遺伝子の少なくとも1つの発現の多くとも1.0倍の活性化が測定される化合物を選別する工程を含む、方法に関する。
−特に、ポリジメチルシロキサン(ジメチコン)、ポリアルキルシクロシロキサン(シクロメチコン)およびポリアルキルフェニルシロキサン(フェニルジメチコン)などの直鎖状または環状の、揮発性または非揮発性シリコーン油;フッ素油、アルキル安息香酸およびポリイソブチレンなどの分岐炭化水素などの合成油;植物油、特にダイズ油またはホホバ油;ならびに液体ワセリンなどの鉱物油;から選択することができる油;
−オゾケライト、ポリエチレンワックス、蜜蝋またはカルナウバ蝋などのワックス;
−特に、触媒の存在下で、末端および/または側部に、少なくとも1つの反応基(特に水素またはビニル)を含有し、少なくとも1つのアルキル基(特にメチル)またはフェニルを有するポリシロキサンと、オルガノハイドロジェンポリシロキサンなどのオルガノシリコーンとの反応によって得られるシリコーンエラストマー;
−界面活性剤、好ましくは、非イオン性、アニオン性、カチオン性または両性である乳化界面活性剤、特に、グリセロールの脂肪酸エステル、ソルビタンの脂肪酸エステル、ポリエチレングリコールの脂肪酸エステルおよびスクロースの脂肪酸エステルなどのポリオールの脂肪酸エステル;ポリエチレングリコールの脂肪アルキルエーテル;アルキルポリグリコシド;ポリシロキサン変性ポリエーテル;ベタインおよびその誘導体;ポリクオタニウム;エトキシ化脂肪アルキル硫酸塩;スルホサクシネート;サルコシネート;リン酸アルキルおよびリン酸ジアルキルならびにそれらの塩;ならびに脂肪酸セッケン;
−直鎖脂肪アルコール、特にセチルアルコールおよびステアリルアルコールなどの共活性剤;
−増粘剤および/またはゲル化剤、特に、アクリロイルメチルプロパンスルホン酸(AMPS)および/またはアクリルアミドおよび/またはアクリル酸および/またはアクリル酸塩またはアクリル酸エステルの、架橋性または非架橋性の、親水性または両親媒性のホモポリマーおよびコポリマー;キサンタンガムまたはグアーガム;セルロース誘導体;ならびにシリコーンゴム(ジメチコノール);
−ジベンゾイルメタン誘導体(ブチルメトキシジベンゾイルメタンを含む)、ケイ皮酸誘導体(メトキシケイ皮酸エチルヘキシルを含む)、サリチレート、パラアミノ安息香酸、β,β’−ジフェニルアクリレート、ベンゾフェノン、ベンジリデンカンファー誘導体、フェニルベンズイミダゾール、トリアジン、フェニルベンゾトリアゾールおよびアントラニル誘導体などの有機スクリーニング剤;
−被覆顔料もしくは非被覆顔料またはナノ顔料の形態の鉱物酸化物ベース、特に二酸化チタンまたは酸化亜鉛ベースの無機スクリーニング剤;
−染料;
−保存剤;
−EDTA塩などの金属イオン封鎖剤;
−香料;
−ならびにそれらの混合物、
から選択される少なくとも1つの化合物などの種々のアジュバントを含んでもよいが、このリストに限定されるものではない。
乳頭状および網状の線維芽細胞での種々の発現パターン
材料および方法
単離および細胞培養
39歳から49歳までの5名の白人女性ドナーから線維芽細胞を単離した。すべてのドナーから網状線維芽細胞および乳頭状線維芽細胞の双方を単離し、その後、すべての分析をペアワイズ方式で行った。単離は、文献(12、13)に記載のように行った。すなわち、形成手術(乳房縮小または腹部補正)から得られた皮膚を十分洗浄し、2つの異なる深さで採皮(dermatomize)した。まず、表皮および真皮乳頭層を含む300μmの皮膚片を採取した。真皮網状層については、700μmの皮膚を採皮し、上層部分を廃棄した。残りの真皮(深層)は、線維芽細胞の単離に使用した。線維芽細胞は、37℃で2時間、コラゲナーゼ(Invitrogen社、ブレダ、オランダ)/ディスパーゼ(Roche Diagnostics社、アルメレ、オランダ)(3:1)で処理することにより単離した。細胞は、その後70μmセルストレーナでろ過し、5%ウシ胎児血清(FCS、HyClone/Greiner社、ニュルティンゲン、ドイツ)および1%ペニシリン−ストレプトマイシン(Invitrogen社)を含むDMEM培地(Invitrogen社)で培養した。細胞は、37℃、5%CO2下で維持した。実験で使用した線維芽細胞は、6〜4回継代したものであった。成長曲線実験については、5000個の線維芽細胞を6ウェルプレートに播種した。3、6、7および10日後、Burker血球計算盤を用いて細胞を数えた。
RNAおよびタンパク質はそれぞれ、取扱説明書に従い、RNEasyキット(Qiagen社)および哺乳動物タンパク質抽出試薬(Mammalian Protein Extraction Reagent)(M−PER、Thermo Scientific社)を用いて、単層線維芽細胞培養物から単離した。以下の実験はすべて、1回の単離からのRNAおよびタンパク質を用いて行った。
遺伝子発現解析は、ServiceXS(Leiden社、オランダ)によって行った。プラットフォームはIllumina社のHumanHT−12 Expression BeadChipであった。データはIllumina社のBeadstudioソフトウェアで生成し、R(2.10.0)で分析した。分析については、データをインポートし、lumiパッケージ(ロバストスプラインノーマリゼーション(Robust Spline Normalization))(16)で正規化し、その後limmaパッケージで発現解析を行った(17)。すべてのアレイで発現を示さなかったプローブ(検出P値>0.05)は解析に含めなかった。多重検定補正については、FDR法を使用した(18)。
経路解析およびGOタームエンリッチメント解析(GO term enrichment analysis)はDAVIDツールを用いて行った(19)。網状線維芽細胞で上方制御された遺伝子を有するもの(調整済みp値<0.1、LogFC>0.7)と、乳頭状線維芽細胞で上方制御された遺伝子を有するもの(調整済みp値<0.1、LogFC<−0.7)の2つのリストをアップロードした。双方のリストには約80個の遺伝子があった。
cDNAは、取扱説明書に従い、iScript cDNA合成キット(BioRad社、ヴィーネンダール、オランダ)を用いて、1μgのRNAから生成した。PCR反応は、SYBR Green法(BioRad社)に基づき、2倍濃度のSybr Green Mastermix、1ngのcDNA鋳型ならびに500nMの順方向プライマーおよび逆方向プライマーを含んでいた。PCRはMylQシステム(BioRad社)で実施した。PCRサイクルは、95℃で3.5分維持してポリメラーゼを活性化し、95℃で20秒と60℃で40秒を35サイクル行い、その後溶解曲線を作成した。プライマーは、正常線維芽細胞のcDNAの希釈系列で先にチェックした。参照遺伝子はGeNorm法で分析した(20)。発現解析は、BioRadソフトウェア(iQ5)で行い、GeNorm解析で最も安定して発現される参照遺伝子を用いたΔΔCt法に基づいた。
7μgの各タンパク質試料をローディングバッファー(Loading Buffer)に添加し、5分間90℃に加熱し、10%SDS−PAGEゲルにロードした。電気泳動後、タンパク質がPVDF膜にブロットされた(Thermo Scientific社、エッテン・ルール、オランダ)。ブロッキングは、5%Protifar Plus(Nutricia社、オランダ)のPBS−T(0.1%Tween)溶液で行った。一次抗体は、4℃で一晩インキュベートした(表2に列記)。その後、膜は、安定化HRP結合抗マウスまたは抗ラビット(Thermo Scientific社/Pierce、希釈率1:1500)のいずれかの適当な二次抗体とともに培養した。バンドの検出のため、Supersignal West Femto ECLシステム(Thermo Scientific社/Pierce)を膜に適用した。バンドはG−box技術およびソフトウェアを用いて可視化した。
単層細胞培養におけるIHCについては、線維芽細胞は、ほぼコンフルエントになるまでスライドガラスで増殖させ、PBSで洗浄し、4%ホルムアルデヒドで固定した。一次抗体を表2に示す。染色は、蛍光染料(Cy3)を備えた二次抗体によって可視化した。DAPIは対比染色として使用した。
乳頭状および網状の線維芽細胞の特徴的な形態学
培養された網状および乳頭状の線維芽細胞は、文献(例えば(1、12))に記載のような形態学的特性を示した。乳頭状線維芽細胞は紡錘状の形態を示し、網状線維芽細胞は、筋線維芽細胞マーカーα平滑筋アクチン(α−SMA)の発現が増加するにつれ、より平らになる外観を特徴とする。さらに、乳頭状線維芽細胞の方が早く増殖した(データは示さず)。
遺伝子発現解析により、網状および乳頭状の線維芽細胞において発現量の異なる116個のプローブが明らかとなった(調整済みp値<0.05)(データは示さず)。
qPCRによって確認された遺伝子のうち、6個の遺伝子をタンパク質レベルでのさらなる検証に選択した。これらの遺伝子は、CCRL1(C−Cケモカイン受容体型11)、MGP(マトリックスGlaタンパク質)、NTN1(ネトリン−1)、PDPN(ポドプラニン)、TGM2(トランスグルタミナーゼ2)およびPPP1R14A(ヒトプロテインフォスファターゼ1、調節(阻害剤)サブユニット14A)であった(図1を参照)。選択は、高LogFCおよび細胞表面での発現(細胞内で発現されるTGM2を除く)に基づいた。これらのうちの2個の遺伝子(TGM2およびPDPN)は、アレイ実験で使用したものと同じドナーの細胞溶解物でのウェスタンブロットによって検証可能であった(データは示さず)。ターゲットの1つであるCCRL1は、ウェスタンブロット実験から、タンパク質レベルで差はなかった。
乳頭状線維芽細胞は、老化するにつれ網状線維芽細胞に分化する。
(本質的に)老化した皮膚の最も顕著な特徴は小稜/真皮乳頭の消失である。この小稜の消失により、真皮乳頭層の一部もまた消失する。皮膚の老化に伴い、乳頭状の表現型から主に網状の表現型まで(相対的な)シフトが生じるという仮説があった。この仮説は、Mineら(Mine S、Fortunel NO, Pageon H, Asselineau D. Aging alters functionally human dermal papillary fibroblasts but not reticular fibroblasts: a new view of skin morphogenesis and aging. PLoS ONE 2008; 3: e4066.)によってすでに提案されたものであった。乳頭状から網状までの線維芽細胞の分化により、皮膚の老化に伴うこのシフトを説明できる可能性があった。したがって、乳頭状線維芽細胞が長期のインビトロ培養の後にマーカーの発現を変化させるかどうかを調べた。
乳頭状線維芽細胞を、数週間から数か月間培養し続けた(コンフルエンスに達すると二次培養した)。低継代の乳頭状線維芽細胞、高継代(長期培養)の乳頭状線維芽細胞および低継代の網状線維芽細胞の3種の集団における網状および乳頭状マーカーの発現を比較した。マーカーは、単層でのqPCRおよび免疫組織化学によって測定した。
qPCR解析により、低継代の乳頭状線維芽細胞と比較して、高継代の乳頭状線維芽細胞は、乳頭状マーカーの発現が減少し、網状マーカーの発現が増加したことが明らかとなった。このことは、乳頭状線維芽細胞が長期培養の後に網状線維芽細胞に分化することを示している。実際、乳頭状マーカーPDPNは、低継代の乳頭状線維芽細胞に存在するが、乳頭状線維芽細胞の長期培養(高継代)後、網状線維芽細胞には存在しない。網状マーカーTGM2および筋線維芽細胞マーカーa−SMA(α平滑筋アクチン)は、低継代の乳頭状線維芽細胞には存在しないか、または非常に低レベルで発現され、高継代の乳頭状および網状の線維芽細胞では増加する。
TGF−βは、乳頭状線維芽細胞の網状線維芽細胞への分化を誘導する。
TGF−β1は、線維芽細胞の筋線維芽細胞への分化を誘導することができる。筋線維芽細胞は、次には、大きな細胞体および高い収縮性など、網状線維芽細胞といくつかの特徴を共有している。筋線維芽細胞マーカーaSMA(α平滑筋アクチン)は、すべての筋線維芽細胞によって発現されるが、網状線維芽細胞ではごく一部しか発現されない(1〜5%)。a−SMAは乳頭状線維芽細胞にはほとんど存在しない。
乳頭状線維芽細胞の単層培養物は、2日間または4日間、2ng/mLまたは10ng/mLのTGF−β1で処理した。その後、網状および乳頭状マーカーの発現を、qPCRおよび培養物のIHC染色によって測定した。
qPCRでの測定によると、乳頭状線維芽細胞にTGF−β1を添加すると、単層細胞培養において網状線維芽細胞への分化を引き起こした。乳頭状マーカーの発現は減少し、網状マーカーの発現が増加した(データは示さず)。この結果をIHC染色によって検証し、乳頭状マーカーPDPNの消失および網状マーカーTGM2の獲得を再度確認した。形態変化(細胞サイズの増加)に見られるように、TGF−β1はまた筋線維芽細胞分化を(いくらか)誘導し、a−SMA発現を増加させた。しかし、「網状マーカー陽性」細胞(TGM2の場合)の増加が、a−SMA陽性細胞の増加より高かった。
乳頭状線維芽細胞は表皮の寿命を延ばす。
方法
表皮幹細胞の2つの機能的特徴である粘着および寿命をこれらの実験で使用した。ケラチノサイト幹細胞は迅速に粘着する能力を有すると考えられている。したがって、ケラチノサイトのみが非常に短期間(1分から10分の範囲)で付着することができる実験を行った。これによって、潜在的な幹細胞の集団が濃縮される。その後、これらの集団は乳頭状および網状の線維芽細胞によって順化された培地で培養した。
HSEは乳頭状または網状の線維芽細胞を用いて生成した。ケラチノサイトをリングに播種し、付着させ、その後リングを除去し、マトリックスへのケラチノサイトの移動を可能にした。HSEを回収する前に撮影し、ケラチノサイトが覆った面積を測定し、マトリックスの全面積に対するパーセンテージとして算出した。ケラチノサイトは、網状マトリックス上よりも乳頭状マトリックス上の方が広い領域に移動した。
乳頭状および網状の線維芽細胞に対する化合物の活性による化合物スクリーニング
材料および方法
細胞培養
上記(実施例1)のように、線維芽細胞を単離および培養した。
12000個の網状または乳頭状の線維芽細胞を12ウェル培養プレート(Costar社)に播種した。表面積の90%が覆われるまで線維芽細胞を5日間培養した。化合物を2つの異なる濃度(低濃度/高濃度)で24時間適用した。写真は適用の前後で撮影した。形態の差は認められなかった(データは示さず)。実施例1に記載のように、RNAを単離した。
qPCR解析は、実施例1に従い、3種の乳頭状マーカー(CCRL1、NTN1およびPDPN)および3種の網状マーカー(MGP、PPP1R14AおよびTGM2)を使用して行った。その発現を2つの参照遺伝子(SNDlおよびEI24)を使用して正規化した。ベルバスコシドの効果は、遺伝子の発現と賦形剤で処理した線維芽細胞の発現を比較することにより判定した。
1種の化合物(ベルバスコシド、試験濃度:高濃度=0.01%v/v、低濃度=0.0001%v/v)は、網状サインを乳頭状のサインに変えることができた。スクリーニングの結果を図2に示す。
Claims (5)
- 皮膚の老化を予防および/もしくは軽減させるための候補化合物をスクリーニングするインビトロ法であって、
a.少なくとも1つの試験化合物を乳頭状線維芽細胞の試料に接触させる工程;
b.前記乳頭状線維芽細胞中の、PDPN遺伝子の発現を測定する工程;ならびに
c.未処理の乳頭状線維芽細胞と比較して、aで処理した乳頭状線維芽細胞中で、前記PDPN遺伝子の発現の少なくとも1.5倍の活性化が測定される化合物を選別する工程を含む、方法。 - PDPNの発現が、PDPN遺伝子のmRNAを定量することによって測定される、請求項1に記載の方法。
- PDPNの発現が、PDPN遺伝子によりコードされるタンパク質を定量することによって測定される、請求項1に記載の方法。
- 皮膚の老化を予防および/もしくは軽減させるための候補化合物をスクリーニングするインビトロ法であって、
a.少なくとも1つの試験化合物を乳頭状線維芽細胞の試料に接触させる工程;
b.前記乳頭状線維芽細胞中の、PDPNタンパク質の発現を測定する工程;ならびに
c.未処理の乳頭状線維芽細胞と比較して、aで処理した乳頭状線維芽細胞中で、前記PDPNタンパク質の量の少なくとも1.5倍の活性化が測定される化合物を選別する工程を含む、方法。 - 試験化合物が植物抽出物から選択される、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
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