CN101134009B - 护肤组合物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种护肤组合物及其用途，其包含用于改善肤质、减少皱纹、防御紫外线以及抗老化有效量的由黄耆(Astragalus membranaceus)以水萃取或醇萃取所得的水不溶部分或黄耆皂苷(Astraglosides)化合物。

Description

护肤组合物及其用途
技术领域
本发明涉及一种护肤组合物及其用途。尤其涉及用于改善肤质、减少皱纹、防御紫外线以及抗老化的皮肤护理的组合物及其用途。
背景技术
本发明是关于护肤的组合物及其用途，特别是利用黄耆(Astragalusmembranaceus)的以水萃取或醇萃取所得水不溶部分、有机溶剂部分或活性成分用于护肤的组合物及及其用途。
黄耆来自于学名为Astragalus membranaceus的植物的根部黄茋，其它的别名有：黄茋(Milk Vetch root，指在美国生长的品种)及Huang-Qi。黄耆经常被传统中医师用于增强或调节身体的整体活力，促进消化及滋补强化脾脏功能。许多研究也证实黄耆含有具有疗效的活性成分，包括可刺激免疫系统的多醣。
一研究显示末期癌症患者即使的受试者在给予黄耆后，其免疫反应可增强两至三倍。另一篇研究显示，在以免疫抑制剂-环磷酰胺(cyclophosphamide)治疗的动物中，黄耆仍然具有补强(boost)免疫反应的效果。在中国，癌症病人于线服用黄耆抗癌药物或放射治疗之后，以补强免疫力，因为它有助于保护体内的细胞对抗重金属及化学毒素的伤害。
然而，尚未有研究指出黄耆萃取物或黄耆皂苷可用于护肤。
发明内容
本发明提供一种护肤组合物及其用途，其包含用于改善肤质、减少皱纹、防御紫外线以及抗老化有效量的由黄耆(Astragalus membranaceus)以水萃取或醇萃取所得的水不溶部分。根据本发明的具体实例，其中黄耆该水不溶部分，系通过包括下列步骤的方法而被制得：
以醇类或水的溶剂萃取黄耆，得到醇类或水萃取物；再以少量水洗涤该醇类或水萃取物，而得到该水不溶部分。
同时根据本发明，提一种用于皮肤护理的组合物及其用途，包含用于抗老化及防御紫外线有效量的式(I)的环木菠萝烷醇型(cycloartanol)化合物。
Figure G200710089586320070411D000021
式(I)
其中R1由下列组成的群中选出：氢(H)、羟基(OH)、O-乙酰基(O-acetyl)，O-木哌喃糖基(O-xylopyranosyl)、O-(2-乙酰木哌喃糖基)(O-(2-acetylxylopyranosyl))、O-(3-乙酰木哌喃糖基)(O-(3-acetylxylopyranosyl))、O-(2，3-二乙酰木哌喃糖基)(O-(2，3-diacetylxylopyranosyl))、O-(2，4-二乙酰木哌喃糖基)(O-(2，4-diacetylxylopyranosyl))、O-木哌喃糖-(1-2)-β-D-葡萄哌喃糖基(O-xylopyranosyl-(1-2)-β-D-glucopyranosyl)、及O-木哌喃糖-(1-2)-α-阿拉伯哌喃糖基(O-xylopyranosyl-(1-2)-α-arabinopyranosyl)；
R2由下列组成的群中选出：氢、羟基、O-乙酰基、O-葡萄哌喃糖基(O-glucopyranosyl)、及O-木哌喃糖基；
R3由下列组成的群中选出：氢、羟基及O-乙酰基；以及
R4由下列组成的群中选出：
Figure G200710089586320070411D000022
Figure G200710089586320070411D000031
本发明的其它特色和优点将在下文说明中提出，可由该说明显而易见，或可通过实施本发明而得知。本发明的特色和优点将通过所述的组件和组合而了解和达成。
应了解前述的发明内容和下列实施方式仅为例示和说明，并非为本发明的限制。
附图说明
参照附图，将更能了解前述的发明内容以及实施方式。
在图中：
图1为显示在以黄耆皂苷处理的人类HDF细胞中MMP-1表现量的抑制度的SDS-PAGE凝胶电泳图。
具体实施方式
本发明详细说明如下。在本发明中，参考文献的资料将详列于实施例中。为更佳了解本发明，本文中所使用的术语将另加以详细说明。
本文中所使用的术语「一」是指一或多于一，也就是至少一个的数量，在本文中为文法受词，除非在文中清楚指明为特殊用法，仅代表单数意涵。
本文中所使用的术语「有效量」是指可提供抗老化效果，防御紫外线或两者于需要的受试者的剂量。对于具通常知识者，「有效量」如同投予的剂量与频率，根据本发明所公开的内容，可凭借一般实验的知识与标准方法轻易确知。
本发明提供了一种用于皮肤护理的组合物及其用途，其包含用于改善肤质、减少皱纹、防御紫外线以及抗老化有效量的由黄耆(Astragalusmembranaceus)以水萃取或醇萃取所得的水不溶部分。根据本发明的具体实例，其中黄耆该水不溶部分，是通过包括下列步骤的方法而被制得：
以醇类或水之溶剂萃取黄耆，得到醇类或水萃取物；再以少量水洗涤该醇类或水萃取物，而得到该水不溶部分。
根据本发明的具体实例，其中黄耆该水不溶部分包含式(I)的环木菠萝烷醇型(cycloartanol)化合物：
Figure G200710089586320070411D000041
式(I)
其中R1由下列组成的群中选出：氢、羟基、O-乙酰基、O-木哌喃糖基、O-(2-乙酰木哌喃糖基)、O-(3-乙酰木哌喃糖基)、O-(2，3-二乙酰木哌喃糖基)、O-(2，4-二乙酰木哌喃糖基)、O-木哌喃糖-(1-2)-β-D-葡萄哌喃糖基、及O-木哌喃糖-(1-2)-α-阿拉伯哌喃糖基；
R2由下列组成的群中选出：氢、羟基、O-乙酰基、O-葡萄哌喃糖基、及O-木哌喃糖基；
R3由下列组成的群中选出：氢、羟基及O-乙酰基；以及
Figure G200710089586320070411D000042
在其中的本发明额具体实例，其中黄耆该水不溶部分包含式(II)的黄耆皂苷化合物：
Figure G200710089586320070411D000043
式(II)
其中RA、、RB，RC及RD由下列组成的群中选出：乙酰基、氢、及葡萄哌喃糖基(Glc)。
在本发明的较佳具体实施例中，黄耆的水不溶部分包含式(II)的黄耆皂苷化合物，其中RA为乙酰基，RB为乙酰基，RC为氢及RD为葡萄哌喃糖基(Glc)；例如黄耆皂苷I。
根据本发明的另一较佳具体实施例，黄耆的水不溶部分包含式(II)的黄耆皂苷化合物，其中RA为乙酰基，RB为氢，RC为氢及RD为葡萄哌喃糖基(Glc)；例如黄耆皂苷II。
根据本发明的较佳具体实施例，黄耆的水不溶部分包含式(II)的黄耆皂苷化合物，其中RA为葡萄哌喃糖基(Glc)，RB为氢，RC为氢，RD为氢；例如黄耆皂苷III。
根据本发明的较佳具体实施例，黄耆的水不溶部分包含式(II)的黄耆皂苷化合物，其中RA为氢，RB为氢，RC为氢及RD为葡萄哌喃糖基(Glc)；例如黄耆皂苷IV。
根据本发明的一较佳具体实施例，黄耆的水不溶部分包含式(II)的黄耆皂苷，其中RA为葡萄哌喃糖基(Glc)，RB为氢，RC为氢，RD为葡萄哌喃糖基(Glc)；例如黄耆皂苷VI。
根据本发明的较佳具体实施例，黄耆的水不溶部分包含式(II)的黄耆皂苷化合物，其中RA为乙酰基，RB为氢，RC为乙酰基及RD为葡萄哌喃糖基(Glc)；例如异黄耆皂苷I。
根据本发明的较佳具体实施例，黄耆的水不溶部分包含式(II)的黄耆皂苷化合物，其中RA为氢，RB为乙酰基，RC为氢，RD为葡萄哌喃糖基(Glc)；例如异黄耆皂苷II。
在本发明的另一实例中，黄耆的水不溶部分包含式(I)的黄耆皂苷化合物，其中R1为羟基，R2为O-葡萄哌喃糖基，R3为羟基，R4为
Figure G200710089586320070411D000051
例如环黄耆皂(cycloastragenol)-6-O-β-D-葡萄哌喃糖苷(简称AA)，为黄耆皂苷IV经柚皮苷酶(Naringinase)水解的产物。
如同本发明中实验的结果，该水不溶部分的投与可增强胶原蛋白I及III在细胞中的表现与分泌，促进葡萄糖胺与脯胺酸的摄取(uptake)，调升透明质酸(HA)的表现量，降低基质金属蛋白酵素(MMPs)的表现量与蛋白分解活性。在本发明的具体实施例中，以约0.25至40μg/mL之剂量的该水不溶部分处理细胞，可以得到上述的良好效果。
另一方面，本发明提供一种护肤组合物及其用途，该护肤组合物包含抗老化与防御紫外线有效量的式(I)的黄耆皂苷化合物。取代基的定义如上所述。
在本发明的具体实施例中，该黄耆皂苷化合物包含式(II)的黄耆皂苷化合物，取代基及较佳具体实施例则如上所述。
在本发明的具体实施例中，该黄耆皂苷化合物包含结构如式(I)的环木菠萝烷醇型(cycloartanol)化合物，其中R1为羟基，R2为O-葡萄哌喃糖基，R3为羟基，以及R4为
Figure G200710089586320070411D000061
例如环黄耆皂-6-O-β-D-葡萄哌喃糖苷(cycloastragenol-6-O-β-D-glucopyranoside)。
相同地，如本发明所进行的实验结果，当投与0.01至10μM剂量的本发明黄耆皂苷化合物时，可增强胶原蛋白I及胶原蛋白III在细胞中的表现，促进葡萄糖胺与脯胺酸的摄取(uptake)，调升透明质酸的表现量，降低基质金属蛋白酵素的表现量与蛋白分解活性。对于受到紫外线辐射激发而增加的基质金属蛋白酵素表现量，也具有抑制的效果。此结果显示该化合物可保护胶原蛋白，避免基质金属蛋白酵素引发的分解作用。结构如式(I)及式(II)的黄耆皂苷化合物，与黄耆萃取物水不溶部分可作为预防及治疗皮肤老化与提供皮肤防御紫外线的药剂。
在本发明的另一具体实施例中，当将含有黄耆水不溶部分的化妆用乳霜涂抹于受试者的皮肤时，如以红斑及黑色素作为参数测量，看起来较为容光焕发及白皙。同时，脸部皮肤的pH值也下降至可防止微生物生长的程度。而且，受试者脸部有皱纹的区域也明显减少。
黄耆萃取物的水不溶部分可通过任何标准方法或所属技术领域的技术人员已知或常用的方法制备。例如，黄耆萃取物的水不溶部分可通过下述步骤得到：提供黄耆，尤其是粉末状，以醇萃取得到醇萃取物，然后以水萃取该醇萃取物，得到水不溶部分。在一较佳具体实施例中，醇萃取物是利用醇(如95％酒精或甲醇)萃取所得的醇部分。然而，应了解该醇萃取物并不限于以上所述方法所得的黄耆水不溶部分及醇萃取部分。
本发明也提供一种化妆用乳霜，其包含黄耆萃取物的水不溶部分，或依照本发明的黄耆皂苷化合物。该化妆用乳霜可添加用于制造基本乳霜的其它成份配制。例如，上述这些成分可包括但不限于水、异壬酸异壬酯、丁二醇、三异辛酸甘油酯(Triethylhexanoin)、山萮醇、PEG-100氢化蓖麻油、硬脂酸甘油酯SE、二甲硅油(dimethicone)、澳洲胡桃油、荷荷芭油、氢化卵磷脂、对羟苯甲酸甲酯、DL-α-乙酸生育酚酯、对羟基苯甲酸丁酯、苯氧基乙醇及香料。
应注意的是，本发明并不只限于化妆品方面的应用；其它药学上的应用，例如治疗病患与缺乏胶原蛋白I、胶原蛋白III、葡萄糖胺、脯胺酸或透明质酸，以及基质金属蛋白酵素表现或活化增强相关的疾病，也属于本发明应用的范围。
本发明更特定地通过下列实例加以解释。然而，应了解本发明不应以任何方式受限于上述这些实例。
实例1：黄耆萃取物的水不溶部分的制备
1.0公斤的黄耆根部粉末(来自Formosa Kingstone BioproductInternational Co.Ltd.)，在50℃下以95％酒精萃取两小时，共三次。将合并的萃取物在真空中浓缩，得到约127.8克的酒精萃取物。
该127.8克的酒精萃取物以蒸馏水清洗三次，获得33.9克水不溶部分及93.9克水可溶部分。将100.0克的酒精萃取物分溶于蒸馏水与正丁醇(该二溶剂比为1∶1)中，得到63.0克的(正)丁醇可溶部分。
实例2：黄耆萃取物的水不溶部分及黄耆皂苷在人类HaCaT细胞及HDF细胞中对于胶原蛋白表现的影响
HaCaT细胞培养
将经自发性转型的人类角质细胞株HaCaT细胞，于湿化培养箱中，于37℃及5％二氧化碳及95％空气的环境下，在添加有10％牛胎血清(FBS)、100IU/mL盘尼西林、100μg/mL链霉素、2mM丙酮酸钠和1％非必须氨基酸(NEAA)的Dulbecco氏修饰Eagle培养基(DMEM)中培养。该培养基每两天更换一次。待细胞长满后，于胰蛋白酶处理后进行继代培养。为了进行继代培养，在以0.1％胰蛋白酶(Trypsin)/乙二胺四乙酸(EDTA)溶液短暂处理后，收集细胞并以1∶10的稀释比例接种。
使用于研究中的细胞，代数介于12至45代之间。接种及培育细胞24小时后，以黄耆皂苷化合物处理24小时。对照培养物维持在添加有载剂(0.1％的DMSO)的培养基中。在此培养条件下，未观察到DMSO对于生长与分化的影响。
HDF细胞培养
初始人类皮肤纤维母细胞(HDF)购自Cascade Biologics(Portland，OR，USA)，并于添加有10％牛胎血清、100IU/mL盘尼西林、100μg/mL链霉素之106号培养基中培养。使用于研究中的细胞，代数介于4至10代之间。该培养基每两天更换一次。待细胞长满后，于胰蛋白酶处理后进行继代培养。为了进行继代培养，在以0.1％胰蛋白酶/EDTA溶液短暂处理后，收集细胞并以1∶10的稀释比例接种。在6孔培养盘中接种1x 105个细胞并培养24小时后，以黄耆皂苷化合物或粗萃取物，例如黄耆的丁醇可溶部分及水不溶部分处理指定的时间。
将对照培养物维持于添加有载剂(0.1％的DMSO)的培养基中。在此培养条件下，未观察到DMSO对于生长与分化的作用。
黄耆皂苷化合物的处理
细胞以0-10μM浓度的纯化合物处理，该纯化合物例如为黄耆皂苷I(AS1)、黄耆皂苷II(AS2)、黄耆皂苷III(AS3)、黄耆皂苷IV(AS4)、黄耆皂苷VI(AS6)、异黄耆皂苷I(isoAS1)、异黄耆皂苷II(isoAS2)，及环黄耆皂-6-O-β-D-葡萄哌喃糖苷(AA)。或者，细胞以浓度为0、1、10及40μg/mL的黄耆粗萃取物如丁醇可溶部分及水不溶部分处理。细胞以所指示的化合物或粗萃取物处理24小时后，收集细胞，分析检定全细胞萃取液中所表现的胶原蛋白I及III或分泌于培养基中的胶原蛋白I及III。
西方墨点法
对于培养后的培养基及细胞溶析产物实施西方墨点分析。在进行处理之前24小时，将细胞以1x106细胞/培养皿之密度接种于6公分培养皿中，24小时后以指定浓度的指定黄耆皂苷化合物再处理48小时。将该条件培养基离心，浓缩两倍后收集之，用于分析分泌至培养基中的胶原蛋白与基质金属蛋白酵素。将细胞清洗及在4℃下，于0.2mL的溶析(lysis)缓冲液(含有1％NP-40、50mM Tris-HCl(pH7.4)、180mM氯化钠、1mM EDTA、1mM PMSF、1mM氟化钠、10mM钒酸钠)中进行溶析30分钟。以17,500g离心15分钟后，收集细胞溶析产物的上清液。利用二喹啉甲酸(Bicinchoninic acid；BCA)蛋白质检定套组，根据制造商的使用方法(Pierce，Rockford，IL，USA)测量样品中的蛋白质浓度。将取自浓缩条件培养基(100μg)或细胞溶析产物的上清液(50μg)的等量蛋白质样品与适当体积的4xSDS取样缓冲液混合，再以8％SDS-PAGE胶分离。将8％SDS-PAGE胶上分离的蛋白质带转印于聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。被转印的PVDF膜以新鲜配制之含有0.1％Tween-20及7％脱脂奶粉的Tris-缓冲食盐水(TBS)清洗两次，并在室温下封阻两小时。将PVDF膜再与对抗胶原蛋白I及III或管家蛋白α-微管蛋白(Santa Cruz Biotecnology，Santa Cruz，CA)的任一抗体于4℃共同培育18小时。使用结合有山葵过氧化酵素(horseradishperoxiase)的抗山羊抗体作为二级抗体。信号通过加强化学发光套组(Clontech，Palo Alto，CA，USA)显现，继而在X光底片上曝光。
以下结果为西方点墨法分析之量化数据。一般而言，如表1A所示，在以不同剂量(0.01，0.1及1μM)的黄耆皂苷化合物如AS1、AS2、isoAS1、isoAS2及AA处理的人类HaCaT细胞中胶原蛋白I会超量表现。在以40μg/mL的黄耆皂苷萃取物处理的人类HaCaT细胞中胶原蛋白I也会超量表现。
表1A
Figure G200710089586320070411D000101
在以不同剂量(0.01，0.1及1μM)的黄耆皂苷化合物如AS1、AS2、AS3处理的人类HaCaT细胞中胶原蛋白III会超量表现。同样地，如表1B所示，在以不同剂量(1，10及40μg/mL)的粗萃取物处理之人类HaCaT细胞中胶原蛋白III也会超量表现。另一方面，测量胶原蛋白III被分泌到培养基中的量，以测知黄耆皂苷对于细胞释放胶原蛋白III的影响。在表1B中，当人类HaCaT细胞以不同剂量(0.01，0.1及1μM)的黄耆皂苷化合物如AS4、AS6、isoAS1处理时，胶原蛋白III在细胞培养基中会超量表现。
表1B
Figure G200710089586320070411D000102
Figure G200710089586320070411D000111
人类HDF细胞中的胶原蛋白表现也同样被测定。根据表2A所列出的结果，发现在以黄耆皂苷化合物如AS2、AS4、AS6、isoAS1及AA处理的人类HDF细胞中胶原蛋白I会超量表现。在以不同剂量(1，10及40μg/mL)的黄耆粗萃取物，如黄耆的丁醇可溶部分与水不溶部分，处理的HDF细胞中胶原蛋白I也会超量表现。另外，也观察到在培养基中出现胶原蛋白I的量，此显示当细胞以黄耆皂苷化合物或粗萃取物处理时，增加量的胶原蛋白I分泌到培养基中。
表2A
Figure G200710089586320070411D000121
此外，如下表2B所示，当人类HDF细胞以不同剂量的粗萃取物处理时，于细胞中与培养基中皆观察到胶原蛋白III的表现。因此，西方墨点法分析的结果大致上显示胶原蛋白I及胶原蛋白III在人类HaCaT细胞及HDF细胞中皆超量表现，以及其被释放到培养基中的量皆增加。
表2B
Figure G200710089586320070411D000122
Figure G200710089586320070411D000131
实例3：在人类HaCaT细胞中黄耆皂苷对脯胺酸摄取的影响
脯胺酸摄取分析
脯胺酸摄取分析乃如文献(Biochim Biophys Acta.1104：283-292，1992)所述进行。简单的说，将HaCaT细胞以3x104细胞/培养孔的密度接种于24孔盘中，培养24小时。将细胞在不存在(溶剂对照组)或存在各种浓度的黄耆皂苷化合物或黄耆的粗萃取物下再处理48小时。处理后的细胞以PBS清洗一次后，在不含氨基酸的培养基(AAFM)中再培养30分钟。将处理后的细胞改用新鲜的AAFM培养，该AAFM含有50μg/mL抗坏血酸盐(ascorbate)及总浓度0.5mM且含1μCi[3H]的L-脯胺酸(AmericanRadiolabelled Chemicals Inc，ARC，St.Louis，MO，USA)。以指定的时间间隔用含有未标示的脯胺酸的AAFM清洗，并以200μL的2％SDS溶析细胞。将细胞溶析产物以15,000g离心15分钟。通过将10μL的细胞溶析产物转移至底部设有过滤器的UniFilter盘(Perkin-Elmer)中计数，即可测出细胞所摄取的脯胺酸。样本中的蛋白质浓度，可利用上述的BCA蛋白质检定套组测定。计算出累积在细胞内的脯胺酸及将其标准化成蛋白质浓度，摄取速率以每分钟每毫克细胞蛋白质的L-脯胺酸的纳摩尔数(nmol/min/mg)来表示。
表3
Figure G200710089586320070411D000132
Figure G200710089586320070411D000141
从表3显示的结果看来，发明人发现粗萃取物与对照组相比，在人类HaCaT细胞中使脯胺酸的摄取上升达到105.56％，119.2％及108.62％，此显示粗萃取物具有促进细胞摄取脯胺酸的效果。
实例4：在人类HaCaT细胞中黄耆皂苷对透明质酸(HA)表现的影响
透明质酸测量
透明质酸测量乃根据文献中的所述方法实施(BBRC，2004，316：348-355)。简单来说，将HaCaT或HDF细胞接种于24孔盘中，等待其长满。于即将进行实验前，将细胞以不含血清的培养液清洗两次，以完全去除细胞生长时所累积的透明质酸。接着细胞在0.5mL不含或含有不同化合物的无血清培养液中培养48小时。经过指定的时间后，取出培养基的等分试样，在15000g离心5分钟，以酵素键连的免疫吸附测定(ELISA)套组(Echelon Bioscience，Salt Lake，UT)分析上清液中的透明质酸含量。
所列结果以在HaCaT细胞中黄耆皂苷所引发的透明质酸表现的倍数来表示。所用黄耆皂苷的浓度(若无其它特别指示)，就黄耆皂苷纯化合物而言为0、1、10μM；就丁醇可溶部分而言为0、0.5、1、2.5、5、10、40μg/mL；就水不溶部分而言为0、1、10、40μg/mL。将细胞以指定的化合物处理24小时，然后收集细胞并利用HA-ELISA套组分析分泌在培养基中的透明质酸。
以1μM或10μM黄耆皂苷化合物AS1，AS2，AS4，AS6处理的细胞均显示细胞分泌的透明质酸有增加的现象，此可由培养基中透明质酸量增加证明。在人类HaCaT细胞中，不同剂量(1、10及40μg/mL)的粗萃取物也有促进细胞分泌透明质酸到培养基中的能力，如表4A所示。
表4A
透明质酸合成酶2(HAS2)转录之定量分析
以实时定量反转录聚合酶连锁反应(qRT-PCR)测定出HaCaT细胞中HAS2的相对表现量。利用TRIzol试剂(Invitrogen，Irvine，CA，USA)，从培养的人类细胞分离出总RNAs。取1μg RNA在37℃下，于20μL的转录混合液中进行反转录60分钟，其中该转录混合液含有0.5mM dNTP、0.1μg oligo-dT、10单位RNasin，1x PCR缓冲液(含pH值8.3的20mMTris-HCl；2.5mM氯化镁；50mM氯化钾)及100单位的莫洛尼鼠类白血病病毒转录酶(Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase；Invitrogen)。cDNA产物以苯酚萃取，酒精沉淀后，再悬浮于20μL TE(含pH值8.0的20mM Tris-HCl及1mM EDTA)。qRT-PCR以应用生物7300系统(Applied Biosystem 7300System)及预定制之Taqman基因表现检定套组(pre-developed Taqman Gene Expression Assays)(Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)进行。该反应混合液(总体积20μL)包含2μL经连续稀释的cDNA、10μL Taqman Universal PCR Master Mix(AppliedBiosystems)以及1μL人类HAS-2基因(检定编号Hs00193435_m1，AppliedBiosystems)，或GAPDH引子混合物(检定编号Hs99999905_m1，AppliedBiosystems)。扩增反应以下列条件进行：50℃反应2分钟，95℃反应10分钟，接着以95℃反应1分钟、65℃反应1分钟进行40个循环。对于每个选定的基因皆进行两次独立的实验，各实验复制3份，相对定量的结果可利用7300软件(Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)计算得出，每个样本中的HAS-2表现量标准化成相对于GAPDH的表现量。
如表4B所示，在人类HaCaT细胞中，不论该细胞以0.1μM的黄耆皂苷化合物如AS2、AS4、isoAS1或isoAS2处理，或以2.5μg/mL、5.0μg/mL的黄耆的丁醇可溶部分处理，或以40μg/mL的黄耆的水不溶部分处理，HAS-2皆会超量表现。因此，表4A及4B的结果显示黄耆皂苷化合物或粗萃取物具有促进人类HaCaT细胞表现透明质酸的功效。
表4B
Figure G200710089586320070411D000161
Figure G200710089586320070411D000171
实例5：黄耆皂苷在人类HaCaT细胞中对葡萄糖胺摄取的影响
葡萄糖胺摄取分析
葡萄糖胺是透明质酸的主要组成单元，因此，测量细胞所摄取的葡萄糖胺可推测在人类细胞中透明质酸的合成。
在葡萄糖胺摄取测试中，将HaCaT细胞以3x104细胞/培养孔的密度接种于24孔盘中，培养24小时。将细胞在不存在(溶剂对照组)或存在各种浓度的黄耆皂苷下再培养48小时。处理后的细胞以PBS清洗两次后，于不含葡萄糖及氨基酸的培养基(GSFM)中培养。2小时后，将细胞改以含0.2μCi之[14C]-葡萄糖胺(American Radiolabelled Chemicals Inc，ARC，St.Louis，MO，USA)之新鲜GSFM培养。以指定的时间间隔，将细胞以含有未标示的葡萄糖胺的GSFM清洗两次，并以200μL的2％SDS溶析细胞。将细胞溶析产物以15000g离心15分钟。通过将10μL的细胞溶析产物转移至底部设有过滤器的UniFilter盘(Perkin-Elmer)中计数，即可测出细胞所摄取的葡萄糖胺。样本中的蛋白质浓度，可利用上述的BCA蛋白质检定套组测定。计算出累积在细胞内的葡萄糖胺并将其标准化成蛋白质浓度，摄取速率以每分钟每毫克细胞蛋白质的计数(cpm/min/μg)来表示。
如表5所示，当细胞以0.1μM的黄耆皂苷化合物如AS1、AS2、AS3、isoAS1及isoAS2处理时，葡萄糖胺的摄取速率增加，此显示黄耆皂苷对葡萄糖胺有促进功效。
表5
Figure G200710089586320070411D000181
实例6：在人类HaCaT-1与HDF-1细胞中黄耆皂苷对基质金属蛋白酵素(MMPs)表现的影响
基质金属蛋白酵素-1(MMP-1)是一种分解间质胶原蛋白及其它细胞外基质大分子的酵素。基质金属蛋白酵素-1为主要的胶原蛋白酶。因此，基质金属蛋白酵素-1的存在或其蛋白分解活性增加表示胶原蛋白量减少。反过来说，当基质金属蛋白酵素-1的活性或表现减少时，则表示细胞中的胶原蛋白量可能丰富。
紫外线照射
为得知黄耆皂苷在人类细胞中对MMPs的表现量的影响，首先将HDF或HaCaT细胞以不含或含有各种浓度的黄耆皂苷处理24小时。细胞以磷酸盐-缓冲食盐水(PBS)清洗后，用紫外光照射器(UVItec unlimited，Cambridge，England)，以10-100mJ/cm2的UV-B(波长312nm)分别照射HDF-1及HaCaT细胞。在收集细胞以进行检定前，将细胞以不含血清的培养基清洗并培养24小时。以西方墨点法分析黄耆皂苷对MMPs的表现量的影响，并以酶谱(zymography)分析MMPs的活性。以全反式维生素A酸(atRA)做为抑制UV-B所引起的MMPs的活化与表现的阳性对照组。
将人类HDF细胞以表中所示浓度的黄耆的水不溶部分处理24小时，再进行50mJ/cm2的UV-B照射。24小时后，收集细胞进行西方墨点法分析。如图1所示，在未接受UV照射的细胞中MMP-1的表现量为基础値(泳道1，对照组)，在HDF细胞中UV照射引发的MMP-1表现(泳道2)，全反式RA(atRA)阻断UV照射所引发的MMP-1表现(泳道3，阳性对照组)，而在以0.1、1、10、40μM黄耆之水不溶部分预处理的细胞中UV照射所引发的MMP-1表现受到抑制(泳道4至7)。结果证明黄耆之水不溶部分能有效地阻断UV照射所引起之MMP-1表现，此显示该化合物能保护胶原蛋白I而避免被MMP-1分解。所以黄耆的水不溶部分有作为预防及治疗皮肤因紫外线照射而老化的药剂的潜力。
酶谱分析法
在HaCaT及HDF细胞中MMPs的蛋白分解活性，基本上是根据参考文献所描述的方式测定(Circ Res，1999；85：906-911)。细胞于接种后24小时，再以各种浓度的黄耆皂苷处理48小时。将条件培养基(conditionedmedium)离心，浓缩两倍后保存，以供检定被分泌至培养基的胶原蛋白及MMPs。将细胞以溶析缓冲液(含有1％表面活性剂Triton，pH值7.4的50mM Tris-HCl，180mM氯化钠，1mM EDTA)溶析，样本中的蛋白质浓度，可利用上述的二喹啉甲酸(BCA)蛋白质检定套组测定。将浓缩条件培养基的样本及细胞溶析产物与非还原性电泳加载缓冲液混合，以及在非还原状态下进行电泳，其中电泳在与2mg/mL明胶(gelatin)或酪蛋白(Sigma，St.Louis，MO.USA)共聚的10％SDS-PAGE上进行。为了进行MMP-2前驱物与活化MMP-2的酶谱分析，总计使用20μg的培养基进行电泳。电泳完成后，通过将凝胶以25g/L的Triton X-100于室温浸泡2次，每次各10分钟，以使蛋白复性。继而将该凝胶在含0.2M氯化钠、0.02％Brij35及10mM氯化钙的50mM Tris-HCl(pH7.5)中，于37℃处理18小时。凝胶以考马斯亮蓝R-250(Coomassie Brilliant Blue R-250)染色及退染后，蛋白分解活性的区域在染色后的凝胶中以透明带显现。为获得更高的灵敏度，再将凝胶片以1％Triton X-100溶液进一步退染1至2小时，此步骤可增加信号/噪声比，而允许于92，125，甚至大于200kDa处显现微弱的明胶酶带。酶谱使用附有凝胶成像软件(Image Quant软件)之计算器化激光密度计(Molecular Dynamics，Sunnyvale，CA，USA)读取。
MMP-1转录之定量分析
以实时定量反转录聚合酶连锁反应(qRT-PCR)来测定HDF细胞中MMP-1的相对表现量。全RNA及cDNA的制备方法如前段叙述进行。qRT-PCR以应用生物7300系统(Applied Biosystem 7300System)及预定制之Taqman基因表现检定套组(pre-developed Taqman Gene ExpressionAssays)(Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)进行。除了使用人类MMP-1(检定IDHS00233958_m1，Applied Biosystems)与GAPDH(检定IDHs99999905_m1，Applied Biosystems)之混合引子外，该反应如前段所述进行。
表6A中的结果代表HaCaT细胞中MMP-2蛋白质的酶谱分析的量化数据，以及HDF细胞中MMP-1的qRT-PCR结果。所用浓度(若无其它指示)，就纯化合物而言，为0、0.01、0.1、1μM；就粗萃取物而言，为0、1、10、40μg/mL。将细胞以指示的化合物处理24小时，然后收取细胞以分析全细胞萃取液中的MMP-2前驱物及活化MMP-2。使用50μg的细胞萃取液样本进行电泳。
根据表6A的结果，当细胞以各种剂量(0.01、0.1、1mM)的黄耆皂苷化合物如AS1、AS2、AS3及AS6处理时，在条件培养基中MMP-2的蛋白分解活性会被降低或减弱，此表示在人类HaCaT细胞中胶原蛋白颇为丰富。
表6A
Figure G200710089586320070411D000211
如表6B所示，在以0.1μM黄耆皂苷化合物AS1、AS2、isoAS1、isoAS2及AA处理之HDF细胞中，MMP-1Mrna的表现量下降。另外，当细胞以各种剂量(1及10μg/mL)的粗萃取物处理时，MMP-1mRNA的表现量减少。因此，表6A及6B的结果均显示有效量的黄耆皂苷化合物或粗萃取物能减少MMP-1的表现且抑制此酵素所引起的胶原蛋白分解。
表6B
Figure G200710089586320070411D000212
Figure G200710089586320070411D000221
实例7：制备含黄耆的粗萃取物的化妆乳霜
该化妆乳霜可通过将配制基本乳霜的成分与就作为化妆乳霜的活性成分而言为有效量的黄耆皂干萃取物混合而制备。配制基本乳霜的成分包括但不限于各种量的水、异壬酸异壬酯、丁二醇、三异辛酸甘油酯、山萮醇、PEG-100氢化蓖麻油、硬脂酸甘油酯SE、二甲硅油、澳洲胡桃油、荷荷芭油、氢化卵磷脂、对羟苯甲酸甲酯、DL-α-乙酸生育酚酯、对羟基苯甲酸丁酯、苯氧基乙醇及香料，如表7所示。
表7
  成分   含黄耆萃取物之水不溶部分之化妆乳霜(100克)   基本乳霜(100克)
  水   加至100.00g(或％)   加至100.00g
  异壬酸异壬酯   7.00g   7.00g
  丁二醇   5.00g   5.00g
  三异辛酸甘油酯   3.00g   3.00g
  山萮醇   3.00g   3.00g
  PEG-100氢化蓖麻油   2.00g   2.00g
  硬脂酸甘油酯SE   1.00g   1.00g
  二甲硅油   1.00g   1.00g
  澳洲胡桃油   0.50g   0.50g
  荷荷芭油   0.50g   0.50g
  氢化卵磷脂   0.20g   0.20g
  对羟苯甲酸甲酯   0.15g   0.15g
  DL-α-乙酸生育酚酯   0.10g   0.10g
  对羟基苯甲酸丁酯   0.10g   0.10g
  苯氧基乙醇   0.10g   0.10g
  香料   0.07g   0.07g
  水不溶部分   0.02g
实例8：临床试验
受试者测试
二十五位年龄为35岁或35岁以上的健康自愿者(20位女性及5位男性)在经本人同意下纳入本临床试验。在整个试验期间，受试者被要求不得在脸上使用任何其它的化妆品。清洁受试者脸部后30分钟，评估受试者的皮肤物理性质(皮肤pH值，皮肤水分含量，通过表皮的水分流失，皮肤表面脂肪，肤色及明亮度，皮肤弹性与皮肤粗糙程度)，以提供基础测量值。接着，取适量(约花生大小)含有本发明萃取物的化妆乳霜均匀地涂抹于右脸，并取等量的基本乳霜涂抹于左脸以供对照，30分钟后，对受试者的脸部做相同之测试，以作为短期效力的数据。所有测试皆在约24℃至28℃的室温及50％至60％的相对湿度下进行。每项测试的每次测量皆在受试者脸部任一侧所选定的三个测试区(前额，眼角与上脸颊)取直径约2公分的测试点进行。
皮肤pH值
以具备安装有感测组件的探针的Skin-
Figure G200710089586320070411D000241
PH 905(Courage+Khazaka electronic)进行测量。探针头部的平面设计允许接触皮肤直接测量。
肤色及明亮度(红斑指数与黑色素指数)
测量是根据光线的吸收及反射。
Figure G200710089586320070411D000242
MX 18(Courage+Khazaka electronic)的探针发出三种具特殊光波长的光。接收器可测量由皮肤反射的光，发光器与接收器的位置能确保只有漫射及散射光被量测到。当发射光的量固定，就能计算出皮肤吸收光的量。黑色素通过选择对应于不同的色素吸光速率的特殊波长而测量。选择与血色素的光谱吸收峰对应的特殊波长进行红斑的测量，以避免其它有色物质(例如胆红素)的干扰。上述两个参数的结果以指数表示。
皮肤粗E糙度
皮肤的粗糙度以皮肤检视仪(Skin Visiometer SV)(Courage+KhazakaElectronic，
Figure G200710089586320070411D000243
Germany)测量，该皮肤检视仪是基于光传导经过含有染为蓝色的两成分硅酮(其之光吸收率为已知)的复制薄片。将复制薄片插入改装幻灯机，直接来自霓虹灯的光穿透复制薄层而被吸收，吸光量视硅酮材料的厚度而定。利用视讯传感器电荷偶合装置及分辨率为640x 480像素的黑白(b/w)CMOS-相机测量局部光传导量，并根据吸光的朗伯-比尔定律(Lamber’t and Beer’s Law)计算光的强度。
取自治疗三十天后15位年龄为38至58岁的受试者的皮肤平均测量值列于表8。
表8
  项目   pH值   红斑指数   黑色素指数   L值   表面   体积
  左侧   -8.00   -4.25   -22.95   0.68   -2.79   3.29
  右侧   -11.19   0.22   -27.17   -1.18   -4.77   -7.77
根据表8中的结果，受试者右侧皮肤的平均pH值下降11.19％。所以，当皮肤以本发明的含有黄耆的水不溶部分的化妆乳霜处理时，可预期皮肤将维持健康状态，且由于为微酸环境，微生物生长将减至最低。鉴于红斑指数为0.22，且受试者的右侧脸红斑比左侧更明显，显示右侧脸的血液循环较好。右脸所测得的黑色素指数显示黑色素减少27.17％。同时，以L值表示的皮肤明亮度与红斑指数及黑色素指数一起评估。L值下降1.18％，表示使用该化妆乳霜一个月后，皮肤看起来更明亮。由此可知，受试者的右脸比左脸整体看起来更白且容光焕发。
测量皱折的表面积，以测定受试者脸部皮肤的皱纹。如表8所示，于受试者的右脸使用该化妆乳霜一个月后，平均表面积减少4.77％，此显示皮肤皱纹减少。体积(相对于皮肤表面区域的皮肤体积)则下降7.77％。该结果显示皱纹的深度及数量均减少。
该化合物可用于需要护肤者，使用频率为每天数次或较少之频率，例如一天一次，一周一次，两周一次，或一个月一次。使用频率为所属技术领域的技术人员所显而易知者且视许多因素，例如(但不限于)受试者的年龄等而定。
所属技术领域的技术人员应了解，在不悖离其广泛的发明概念下，上述具体实施例可做改变。因此应了解，本发明并不受限于本文中所揭示的特定具体实施例，而意欲涵盖在权利要求所定义的本发明的精神和范畴内的修改。

Claims (2)

1.一种黄耆的水不溶部分用于制造护肤组合物的用途，其特征在于该护肤组合物用于促进透明质酸的表现、增加葡萄糖胺的吸收以及减少基质金属蛋白酵素-1(MMP-1)的表现且该黄耆的水不溶部分是通过包括下列步骤的方法而制得：
以醇类的溶剂萃取黄耆，得到醇类萃取物；再以水和丁醇1∶1混合的溶剂洗涤该醇类萃取物，而得到该水不溶部分。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于该黄耆的水不溶部分可局部用于需要的皮肤区域。
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