CN110183522A - 一种具有抗抑郁功能的糖肽及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种具有抗抑郁功能的糖肽及其制备方法与应用。该具有抗抑郁功能的糖肽来源于灵芝，所述糖肽的N末端序列如序列表中序列1所示，所述糖肽具有序列表中1‑4所示的4个肽段。该糖肽能降低小鼠的悬尾固定时间，降低小鼠的游泳不动时间，增加抑郁小鼠的糖水偏好比，升高抑郁小鼠前额皮质中的5‑羟色胺水平，升高抑郁小鼠前额皮质中的去甲肾上腺素水平，升高抑郁小鼠前额皮质中的BDNF蛋白的表达量和降低抑郁小鼠肾上腺酮的含量。该糖肽能用于预防和/或治疗抑郁症。

Description

一种具有抗抑郁功能的糖肽及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及生物领域中一种具有抗抑郁功能的糖肽及其制备方法与应用。
背景技术
抑郁是一种最为常见的精神类疾病，被定义为情绪低落、缺乏主动性，自卑、有强烈的罪恶感和自杀趋势，它包括情绪、认知和身体上的各方面症状。全球疾病流行病学报告显示抑郁症影响了全球超过35亿人群，据估计男性的患病率为5.8％，女性的患病率为9.5％，并且全球超过10％的人群正在经历着情感焦虑以及长期慢性压力的折磨。
大量的研究数据显示抑郁症的形成机制是受多种因素导致的，现代临床治疗抑郁症主要应用单胺氧化酶抑制剂、去甲肾上腺素抑制剂和5-羟色胺抑制剂等，伴随着很多副作用，例如：睡眠障碍、疲惫、认知损伤、性功能障碍等，给患者带来很多的困扰。目前需要更为安全有效的新型抗抑郁药物来改善临床药物的不足。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何抗抑郁。
为了解决以上技术问题，本发明提供了一种糖肽。
本发明所提供的糖肽来源于灵芝，名称为糖肽PGL，所述糖肽的N末端序列如序列表中序列1所示，所述糖肽还含有序列表中序列1-4所示的4个肽段。
上述糖肽中，所述糖肽的分子量约为28kD。
上述糖肽中，所述糖肽含有甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、岩藻糖、葡糖醛酸和半乳糖醛酸，所述糖肽中甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、岩藻糖、葡糖醛酸和半乳糖醛酸的摩尔比为62.5：1.9：4：4514.5：300：3.8：20.7：10：2.4。
上述糖肽中，所述糖肽的制备方法包括从灵芝中提取分离纯化得到所述糖肽的步骤。
上述文中，所述灵芝可为灵芝孢子。
上述糖肽的制备方法中，所述糖肽是从粗提物中分离纯化得到的，所述粗提物的制备方法可包括：
1)收集用水从灵芝孢子粉中提取出来的水溶性物质，得到水提液；
2)除去所述水提液中的蛋白质，得到去除蛋白质的提取液，用乙醇沉淀所述去除蛋白质的提取液，收集沉淀，所述沉淀即为所述粗提物。
上述糖肽的制备方法中，所述从粗提物中分离纯化糖肽可包括：
P1、对所述粗提物进行阴离子交换柱层析，得到名称为D1组分的分离物；所述阴离子交换柱层析中所采用的阴离子交换基团是DEAE，所采用的洗脱程序为一步洗脱，所述一步洗脱用pH为6.8-7.5(如7.2)的Tris-HCl缓冲溶液进行洗脱，所述Tris-HCl缓冲溶液的溶质为50mM Tris和44.7mM HCl，溶剂为水；
P2、对所述D1组分进行分子筛层析，得到所述糖肽。
为了解决以上技术问题，本发明提供了一种具有抗抑郁功能的产品。
本发明所提供的具有抗抑郁功能的产品含有上述糖肽。
上述糖肽在制备具有抗抑郁功能的产品中的应用也属于本发明的保护范围。
上述应用中，所述具有抗抑郁功能的产品含有上述糖肽。
上文中，所述具有抗抑郁功能可体现为U1-U7的全部或部分：
U1、降低小鼠的悬尾固定时间，
U2、降低小鼠的游泳不动时间，
U3、增加抑郁小鼠的糖水偏好比，
U4、升高抑郁小鼠前额皮质中的5-羟色胺水平，
U5、升高抑郁小鼠前额皮质中的去甲肾上腺素水平，
U6、升高抑郁小鼠前额皮质中的BDNF蛋白的表达量，
U7、降低抑郁小鼠肾上腺酮的含量。
上文中，具有抗抑郁功能的产品可为用于预防和/或治疗抑郁症的产品。
上文中，所述产品可为药物、保健品或/食品。
上述具有抗抑郁功能的产品的活性成分可只为所述糖肽，也可含有其它成分，其它活性成分本领域技术人员可根据产品的抗抑郁效果确定。
上述具有抗抑郁功能的产品可含有药学上可接受的载体。药学上可接受的载体可为稀释剂与吸收剂，如淀粉、糊精、硫酸钙、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、碳酸钙、白陶土、微晶纤维素、硅酸铝等；药学上可接受的载体可为湿润剂与粘合剂，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、紫胶、甲基纤维素、磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等；药学上可接受的载体可为崩解剂，例如干燥淀粉、海藻酸盐、琼脂粉、褐藻淀粉、碳酸氢钠与枸橼酸、碳酸钙、聚氧乙烯、山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等。
抗急性抑郁实验结果表明糖肽PGL能够显著降低小鼠的悬尾固定时间，一次性给予给药剂量为200mg/kg和400mg/kg的PGL的给药方式与一次性给予给药剂量为20mg/kg的盐酸氟西汀的给药方式在降低小鼠的悬尾固定时间方面没有显著差异。抗急性抑郁实验结果表明糖肽PGL能够显著降低小鼠的游泳不动时间，一次性给予给药剂量为200mg/kg和400mg/kg的PGL的给药方式在降低游泳不动时间方面显著优于一次性给予给药剂量为20mg/kg的盐酸氟西汀的给药方式。该抗慢性温和不可预知应激检验结果表明糖肽PGL能够显著增加抑郁小鼠的糖水偏好比和显著降低抑郁小鼠的游泳不动时间，连续4周每周一次给予给药剂量为100mg/kg、200mg/kg和400mg/kg的PGL的给药方式在增加抑郁小鼠的糖水偏好比方面与连续4周每周一次给予给药剂量为20mg/kg的盐酸氟西汀给药方式没有显著差异；连续4周每周一次给予给药剂量为100mg/kg和200mg/kg的PGL的给药方式在降低抑郁小鼠游泳不动时间方面与连续4周每周一次给予给药剂量为20mg/kg的盐酸氟西汀给药方式没有显著差异，连续4周每周一次给予给药剂量为400mg/kg的PGL的给药方式在降低抑郁小鼠游泳不动时间方面显著优于连续4周每周一次给予给药剂量为20mg/kg的盐酸氟西汀给药方式。
抗慢性温和不可预知应激检验结果表明糖肽PGL能够显著升高抑郁小鼠前额皮质中的5-羟色胺水平、去甲肾上腺素水平、BDNF蛋白的表达量，糖肽PGL能够显著降低抑郁小鼠肾上腺酮的含量，200mg/kg和400mg/kg的PGL的给药方式在提高5-羟色胺和去甲肾上腺素方面与给药剂量为20mg/kg的盐酸氟西汀给药方式之间没有显著差异，100mg/kg、200mg/kg和400mg/kg的PGL的给药方式在降低血清中肾上腺酮的含量方面和提高BDNF蛋白的表达量方面与给药剂量为20mg/kg的盐酸氟西汀给药方式之间没有显著差异。说明本发明的糖肽PGL能用于预防和/或治疗抑郁症。
附图说明
图1为实施例1的2.1中的灵芝粗提物的DEAE-Cellulose层析洗脱曲线。
图2为实施例1的2.1中的Superdex-75层析的洗脱曲线。
图3为实施例1的2.2中的灵芝粗提物的DEAE-Cellulose层析洗脱曲线。
图4为糖肽PGL的单糖组成的HPLC图谱。
图5为糖肽PGL的红外光谱分析图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的灵芝孢子粉为庆元大山合菌物科技有限公司的灵芝破壁孢子粉，经鉴定为赤芝(Ganoderma lucidum)的成熟孢子粉。盐酸氟西汀为美国Sigma-aldrich公司产品，货号为BP797。
XR－XZ301旷场实验分析系统，规格为40cm×40cm×30cm，被等分为面积相等的25个等边方格(8cm×8cm)；SuperFst强迫游泳实验分析系统，规格为25cm×12cm×25cm的玻璃容器；SuperTst高通量悬尾实验分析系统，规格为25cm×25cm×30cm(上海洛维生物科技有限公司)。
下述实施例中的细胞PC12(神经细胞)购自北京永泽浩嘉生物技术发展中心。
实施例1、灵芝糖肽(糖肽PGL)的制备
1.制备粗提物
将灵芝孢子粉加入去离子水，灵芝孢子粉和去离子水的质量比为1：40，90℃提取4h，重复提取三次，合并提取液，得到灵芝水提液。用Seveage法去除灵芝水提液中的蛋白质得到去除蛋白质的提取液，具体方法如下：将是灵芝水提液的1/3体积的Sevag试剂(由三氯甲烷和正丁醇按照4:1的体积比混合而成)加入灵芝水提液中，涡旋震荡5min，以4500g离心15min，吸取上清液，去除游离蛋白产生的凝胶状沉淀。向上清液中加入是上清液体积1/3的Sevag试剂涡旋震荡5min，以4500g离心15min，吸取上清液，如此重复多次直至获得无蛋白质层出现的上清液，该上清液即为去除蛋白质的提取液。
向该去除蛋白质的提取液中加入是该去除蛋白质的提取液4倍体积的无水乙醇使多糖析出，搅拌均匀后盖上锡箔纸，静置12小时待固液分离，6000g离心20分钟收集沉淀，该沉淀为灵芝粗提物。
2.从粗提物中分离纯化灵芝糖肽
将灵芝粗提物溶于超纯水中得到灵芝粗提物液，采用如下2.1和2.2的方法进行分离纯化。
2.1用pH为7.2的Tris-HCl缓冲溶液(溶质为50mM Tris和44.7mM HCl,溶剂为水)平衡DEAE-Cellulose层析柱(1×30cm)，上样，样品为灵芝粗提物液，进行四步洗脱，流速均为1.5ml/min，部分收集器收集洗脱液，用硫酸苯酚法测定每管收集的洗脱液的多糖浓度，以多糖含量为靶标确定洗脱曲线。第一步洗脱用上述pH为7.2的Tris-HCl缓冲溶液进行洗脱，收集第一步洗脱得到的洗脱峰，将该洗脱峰定义为D1(即洗脱体积为0-42mL的洗脱液)；第二步洗脱用pH为7.2的如下溶液进行洗脱：溶质是0.3M NaCl、溶剂是上述pH为7.2的Tris-HCl缓冲溶液，收集第二步洗脱得到的洗脱峰，将该洗脱峰定义为D2(即洗脱体积为132mL-168mL的洗脱液)；第三步洗脱用pH为7.2的如下溶液进行洗脱：溶质是1.0M NaCl、溶剂是上述pH为7.2的Tris-HCl缓冲溶液，第三步洗脱没有得到明显的多糖洗脱峰(图1)。
将洗脱峰D1和D2分别在蒸馏水中透析10-12小时后，加入4倍体积无水乙醇静置12小时后，离心收集沉淀，将该沉淀60℃烘干，研磨成粉末状，分别得到D1组分和D2组分。
按照如下方法检测D1组分和D2组分的神经保护作用：利用肾上腺酮诱导PC12(神经细胞)形成神经损伤模型，PC12细胞的培养液为在DMEM中加入牛血清、马血清、链霉素和青霉素，至牛血清的含量为5％，马血清的含量为5％，链霉素的含量为100mg/L和青霉素的含量为100mg/L，培养条件为37℃湿润环境、CO2的通气量为5％(v/v)。设实验组、模型组和对照组。实验组：将待测物质和肾上腺酮加入培养液中培养PC12细胞24h，待测物质的含量均为100μg/mL，肾上腺酮的含量为100μmol/L。待测物质为D1组分的实验组命名为实验组-D1，待测物质为D2组分的实验组命名为实验组-D2。模型组：将肾上腺酮加入培养液中培养PC12细胞24h，肾上腺酮的含量为100μmol/L。对照组：向培养液中加入等量的PBS，培养PC12细胞24h。每组实验设3次重复，通过下述MTT法检测细胞存活率，总DNA检测法以及胞外LDH检测法综合评价各待测物质保护神经细胞的作用。
MTT法检测细胞存活率：将培养液吸除，每孔加入200μL MTT稀释液(MTT浓度为0.5mg/mL)，置于37℃,相对湿度为95％，CO2浓度为5％的培养箱中孵育4h。孵育结束后，吸除每孔中的液体，每孔加入200μL DMSO溶液，混合均匀，在荧光全波长酶标仪测定每孔的OD562值。细胞存活率公式：细胞存活率(％)＝实验组的OD562值/对照组的OD562值×100％。
总DNA检测法：将培养液吸出，PBS溶液清洗细胞2次后用100μL超纯水冻融细胞三次使细胞裂解，加入100μL 10mM Tris-HCl(pH 7.4)溶液,其中含有2μg/mL bisbenzimideH33258，1mM EDTA和0.2M NaCl，37℃避光培养30min，利用荧光全波长酶标仪测定荧光值F465，其中360nm为激发波，465nm为发射波。总DNA数量比(％)＝实验组的F465值/对照组的F465值×100％。
胞外LDH检测法：采用LDH检测试剂盒(南京建成，货号A020-2-2)检测胞外LDH。
结果表明，肾上腺酮可以降低细胞总DNA的数量，破坏细胞膜结构，导致胞内LDH泄露到外围培养液中(模型组与对照组相比)。实验组-D1与模型组相比，神经细胞存活率极显著提高，细胞总DNA的数量显著增加，胞外LDH释放比例下降，D1组分具有保护神经细胞的作用，实验组-D2与模型组相比，神经细胞存活率、细胞总DNA的数量和胞外LDH释放比例没有显著差异(表1)。
D1组分经Superdex-75凝胶过滤层析(分子筛层析)，洗脱液为pH 8.5 0.2MNH4HCO3溶液，层析柱规格600mm(柱长)×16mm(内径)，上样体积为3ml，流速为1mL/min。部分收集器收集洗脱液，收集多糖集中的洗脱峰(洗脱体积为40mL-60mL的洗脱液)，将该洗脱峰定义为PGL洗脱峰(图2)。
将PGL洗脱峰在蒸馏水中透析10-12小时，在4℃进行截留分子量为5000道尔顿的超滤浓缩后，于-80℃条件下至完全冰冻，将冰冻样品冻干成粉备用，该干粉即为名称为PGL的糖肽(简称糖肽PGL)。
按照上述方法检测糖肽PGL的神经保护作用，区别仅在于实验组不同，其它操作完全相同。实验组：将糖肽PGL和肾上腺酮加入培养液中培养PC12细胞24h，糖肽PGL的含量为100μg/mL，肾上腺酮的含量为100μmol/L。将该实验组命名为实验组-PGL。结果如表1所示，实验组-PGL与模型组相比，神经细胞存活率极显著提高，细胞总DNA的数量显著增加，胞外LDH释放比例下降，说明糖肽PGL具有保护神经细胞的作用。
2.2用pH为9.4的10mM NH4HCO3-NH3H2O缓冲溶液(溶质为10mM NH4HCO3和2.08mMNH3·H2O，溶剂为水)平衡DEAE-Cellulose层析柱(1×30cm)，上样，样品为灵芝粗提物液，进行四步洗脱，流速均为1.5ml/min，部分收集器收集洗脱液，用硫酸苯酚法测定每管收集的洗脱液的多糖浓度，以多糖含量为靶标确定洗脱曲线。第一步洗脱用上述pH为9.4的10mMNH4HCO3-NH3H2O缓冲溶液进行洗脱，收集第一步洗脱得到的洗脱峰，将该洗脱峰定义为N1(即洗脱体积为0-150mL的洗脱液)；第二步洗脱用pH为9.4的如下溶液进行洗脱：溶质是0.3M NaCl、溶剂是上述pH为9.4的10mM
NH4HCO3-NH3H2O缓冲溶液，收集第二步洗脱得到的洗脱峰，将该洗脱峰定义为N2(即洗脱体积为342-450mL的洗脱液)；第三步洗脱用pH为9.4的如下溶液进行洗脱：溶质是1.0M NaCl、溶剂是上述pH为9.4的10mM NH4HCO3-NH3H2O缓冲溶液，收集第三步洗脱得到的洗脱峰，将该洗脱峰定义为N3(即洗脱体积为912-978mL的洗脱液)(图3)。
将该洗脱峰N1、N2和N3分别在蒸馏水中透析10-12小时后，加入4倍体积无水乙醇静置12小时后，离心收集沉淀，将该沉淀60℃烘干，研磨成粉末状，分别得到N1组分、N2组分和N3组分。
按照上述方法检测N1组分、N2组分和N3组分的神经保护作用，区别仅在于实验组不同，其它操作完全相同。实验组：将待测物质(N1组分、N2组分或N3组分)和肾上腺酮加入培养液中培养PC12细胞24h，待测物质的含量均为100μg/mL，肾上腺酮的含量为100μmol/L。待测物质为N1组分的实验组命名为实验组-N1，待测物质为N2组分的实验组命名为实验组-N2，待测物质为N3组分的实验组命名为实验组-N3。结果表明，N1组分、N2组分和N3组分均不具有保护作用。因此，未对N1组分、N2组分和N3组分进行进一步的分离纯化。
表1.各组对PC12细胞的保护作用
注：*表示与模型组相比具有显著差异(p＜0.05)，**表示与模型组相比具有极显著差异(p＜0.01)。
3、糖肽PGL的单糖及糖醛酸分析
由青岛科创质量检测有限公司对糖肽PGL进行单糖及糖醛酸分析。
3.1、主要仪器及材料
3.1.1、仪器：
HPLC液相色谱仪。
3.1.2试剂：
三氟乙酸，乙腈(色谱纯)，磷酸盐缓冲溶液(pH＝6.8)，单糖及糖醛酸标准品(鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、岩藻糖、半乳糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸)。
3.2、样品分析方法
3.2.1、完全酸水解：
称取冻干的糖肽PGL适量，加入2mol/L三氟乙酸溶液0.5mL，在120℃条件下水解120min。氮吹仪吹干。
标准品处理：首先配制10mg/ml标准品溶液，放置于-20℃。用时取出融化，在可以密封的玻璃管中加入上述标准品各5μL，混匀。然后加入2mol/L TFA溶液0.5mL，与样品同时在120℃条件下水解120min。空气泵吹干。
3.2.2、PMP衍生化：
向水解干燥后得到的样品中加入溶于无水甲醇的0.5mol/L的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)试剂和0.3mol/L的NaOH溶液各0.5ml，充分混匀后，水浴70℃反应30min。冷却至室温，加入0.3mol/L HCl 0.5ml，充分混匀。加入0.5ml氯仿，充分震荡萃取，离心(5000rpm，5min)去除氯仿层，共萃取三次。水层(不低于0.4ml)用0.22μm滤膜过滤后，待上机。
3.2.3、仪器条件：
色谱柱：SHISEIDO C18柱(4.6×250mm,5μm)，
流动相为0.1mol/L pH 6.8磷酸盐缓冲液(PB):乙腈为82:18(v/v)；
流速为每分钟1.0mL/min；
柱温为25℃；
进样量10μL
波长为245nm。
仪器：Agilent 1200高效液相色谱仪
结果表明糖肽PGL含有甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、岩藻糖、葡糖醛酸和半乳糖醛酸(图4和表2)，糖肽PGL中甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、岩藻糖、葡糖醛酸和半乳糖醛酸的摩尔比为62.5：1.9：4：4514.5：300：3.8：20.7：10：2.4。
表2.糖肽PGL的单糖及糖醛酸分析
名称 保留时间(分钟) 峰面积(mAU*s) 含量(ng/ul)
甘露糖 20.719 7100.07471 72.83719
核糖 25.872 209.03386 1.80385
鼠李糖 27.031 260.30304 4.25765
葡萄糖醛酸 33.180 1145.16589 12.56712
半乳糖醛酸 39.271 287.69675 3.09326
葡萄糖 42.415 479744 5259.60509
半乳糖 51.194 19089.3 350.34058
木糖 52.993 无 无
阿拉伯糖 56.018 397.91394 3.73129
岩藻糖 63.326 3286.61792 45.84056
4、糖肽PGL的红外光谱(IR)分析
分别取1-2mg的糖肽PGL，利用KBr压片法进行制片，采用傅里叶变换红外光谱仪Nicolet iS5进行检测分析。
红外分析结果显示糖肽PGL在3421.46cm-1处有一个强烈的吸收峰，这是羟基伸缩振动的特征吸收峰，1655.81cm-1和2921.39cm-1处的吸收峰是C＝O，C-H的明显特征峰，揭示PGL具有糖特征基团的结构，说明糖肽PGL具有多糖组分(图5)。
5、糖肽PGL的N-端部分氨基酸序列测定
采用自动化EDMAN降解法对糖肽PGL的N-端部分氨基酸序列进行测定，用HewlettPackard 1000A配有HPLC系统的蛋白序列测定仪测定N-端部分序列。结果显示糖肽PGL的N-端氨基酸序列为VREQEWWRRR(序列表中序列1)，说明糖肽PGL具有多肽结构。
6、糖肽PGL的内部氨基酸序列分析
将糖肽PGL的SDS-PAGE条带回收，送检到清华大学实验公共平台检测，结果显示糖肽PGL具有序列表中序列1-4所示的4个肽段，序列表中序列2、3和4分别为EAYPGDVFYLHSR、VGEVMAIGR和LLTAVLGRLSEDENQLWEIATSLILNR。分子特性分析说明糖肽PGL是既具有多糖结构又存在多肽结构的纯品。
7、糖肽PGL的分子量
糖肽PGL经SDS-PAGE和分子筛层析检测，其分子量约为28kD。
实施例2、糖肽PGL具有抗抑郁功能
1.抗急性抑郁功能评价
雄性C57BL/6小鼠(8周龄，体重22-28g)购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，动物经过1周的适应期后开始实验。小鼠被随机分为5组，每组10只动物，分别为空白对照组、100mg/kg PGL组,200mg/kg PGL组、400mg/kg PGL组和阳性对照组。100mg/kg PGL组的每只小鼠一次性灌胃给药实施例1的糖肽PGL，使糖肽PGL的给药剂量为100mg/kg体重；200mg/kg PGL组的每只小鼠一次性灌胃给药实施例1的糖肽PGL，使糖肽PGL的给药剂量为200mg/kg体重；400mg/kg PGL组的每只小鼠一次性灌胃给药实施例1的糖肽PGL，使糖肽PGL的给药剂量为400mg/kg体重；阳性对照组每只小鼠一次性灌胃给药盐酸氟西汀，使盐酸氟西汀的给药剂量为20mg/kg体重，空白对照组每只小鼠给予等体积的生理盐水。给药后1h开展强迫游泳实验、悬尾实验和旷场实验。
试验所有数据采用SPSS12.0(SPSS Inc.，USA)统计软件的独立样本t检验处理统计。
1.1强迫游泳实验
在SuperFst强迫游泳实验分析系统，规格为25cm×12cm×25cm的玻璃容器中进行强迫游泳实验：灌胃给药lh后，将每组10只小鼠单独放入强迫游泳仪的玻璃缸中，缸内水深15cm，水温(23±2)℃，从小鼠入水后计时6min，记录后4min内游泳累计不动时间(指小鼠在水中停止挣扎，或显示漂浮状态，仅有微小的肢体运动以保持头部浮在水面)，作为游泳不动时间。
1.2悬尾实验在SuperTst高通量悬尾实验分析系统，规格为25cm×25cm×30cm的盒子中进行悬尾实验：灌胃给药lh后，在安静无风的室内，分别将10只小鼠尾部距末端约2cm处，用医用胶布粘贴固定在悬尾仪上，使小鼠呈倒挂状态，两侧有黑色挡板隔开，遮挡小鼠视线，使其不受外界干扰悬挂6min，记录后4min内小鼠累计不动时间(指小鼠停止挣扎，身体呈垂直倒悬状态，静止不动的时间)，作为悬尾固定时间。
1.3旷场实验(open field test，OFT)
在XR－XZ301旷场实验分析系统，规格为40cm×40cm×30cm，被等分为面积相等的25个等边方格(8cm×8cm)中进行旷场实验：灌胃给药lh后，每组10只动物，在室温为25℃的安静实验室内将小鼠小心放在自发活动旷场箱底中心，观察5min内活动情况。观察指标为:①水平穿行方格数:3爪以上跨入邻格或者重心落入；②竖直站立次数:前肢离开水平地面1cm以上的次数。
结果如表3所示：
与空白对照组相比，200mg/kg PGL组、400mg/kg PGL组和阳性对照组能够极显著降低小鼠的悬尾固定时间(P<0.01)，其中200mg/kg PGL组可平均降低悬尾固定时间50.8％((101.7-50.0)/101.7*100％＝50.8％)，400mg/kg PGL组可平均降低悬尾固定时间49.4％((101.7-51.5)/101.7*100％＝49.4％)，阳性对照组可平均降低悬尾固定时间49.8％((101.7-51.1)/101.7*100％＝49.8％)，200mg/kg PGL组、400mg/kg PGL组和阳性对照组在降低小鼠的悬尾固定时间方面没有显著差异。说明糖肽PGL能够显著降低小鼠的悬尾固定时间，PGL给药剂量为200mg/kg和400mg/kg的给药方式与盐酸氟西汀给药剂量为20mg/kg的给药方式在降低小鼠的悬尾固定时间方面没有显著差异。
与空白对照组相比，200mg/kg PGL组可以降低游泳不动时间的55.8％((72.7-32.1)/72.7*100％＝55.8％，达到显著性差异的程度(P<0.05)；400mg/kg PGL组可以降低游泳不动时间的68.1％((72.7-23.2)/72.7*100％＝68.1％)，达到极其显著性差异的程度(P<0.01)；阳性对照组与空白对照组没有显著差异。200mg/kg PGL组和400mg/kg PGL组在降低游泳不动时间方面显著优于阳性对照组。说明糖肽PGL能够显著降低小鼠的游泳不动时间，PGL给药剂量为200mg/kg和400mg/kg的给药方式在降低游泳不动时间方面显著优于盐酸氟西汀给药剂量为20mg/kg的给药方式。
PGL对旷场实验中水平方向移动和垂直方向直立的影响不明显。
上述抗急性抑郁实验结果表明糖肽PGL能够显著降低小鼠的悬尾固定时间，一次性给予给药剂量为200mg/kg和400mg/kg的PGL的给药方式与一次性给予给药剂量为20mg/kg的盐酸氟西汀的给药方式在降低小鼠的悬尾固定时间方面没有显著差异。抗急性抑郁实验结果表明糖肽PGL能够显著降低小鼠的游泳不动时间，一次性给予给药剂量为200mg/kg和400mg/kg的PGL的给药方式在降低游泳不动时间方面显著优于一次性给予给药剂量为20mg/kg的盐酸氟西汀的给药方式。
表3.小鼠对应激抑郁行为的影响
注：同列数据没有相同小写字母者差异显著(P<0.05)，没有相同大写字母者差异极显著(P<0.01)。
2.抗慢性温和不可预知应激(CUMS)抑郁功能评价
雄性C57BL/6小鼠(8周龄，体重22-28kg)购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，动物经过1周的适应期后开始实验。小鼠被随机分为6组，每组10只动物，分别为空白对照组、模型组、100mg/kg PGL组、200mg/kg PGL组、400mg/kg PGL组和阳性对照组。按照如下方法建立起温和不可预知应激(CUMS)小鼠模型：除了空白对照组小鼠外，其他实验组小鼠每天均要持续并随机给予如下慢性压力刺激:18h食物剥夺，16h禁水，污笼，间隔照明(间隔时间为2h)，斜笼45度，减少空间，昼夜照明，4h噪音刺激。每种刺激单独给予，以上刺激每天随机安排1种，同种刺激在整个实验周期中可出现多次，但不能连续出现，使动物不能预知刺激的发生，14d 1个循环，共造模28d，其后持续刺激28d并给药，共8周。
在慢性压力刺激的第29天，对空白对照组、模型组、100mg/kg PGL组、200mg/kgPGL组、400mg/kg PGL组和阳性对照组小鼠进行灌胃给药，每周给药1次，持续4周。每次给药方式均为：100mg/kg PGL组的每只小鼠每次灌胃给药实施例1的糖肽PGL，使糖肽PGL的给药剂量为100mg/kg体重；200mg/kg PGL组的每只小鼠每次灌胃给药实施例1的糖肽PGL，使糖肽PGL的给药剂量为200mg/kg体重；400mg/kg PGL组的每只小鼠每次灌胃给药实施例1的糖肽PGL，使糖肽PGL的给药剂量为400mg/kg体重；阳性对照组每只小鼠每次灌胃给药盐酸氟西汀，使盐酸氟西汀的给药剂量为20mg/kg体重，空白对照组和模型组的每只小鼠给予等体积的生理盐水。
在给药结束1h后进行糖水偏好实验，计算糖水偏好比(糖水偏好比＝糖水消耗量/(糖水消耗量+普通水消耗量)×100％)。糖水偏好实验结束后按照1.1的方法开展强迫游泳实验。
其中，糖水偏好实验(sucrose preference test，SPT)方法如下：实验开始前，在安静的房间内先训练小鼠适应含糖饮水:每笼同时放置2个水瓶，第1个24h，2瓶均装有1％的蔗糖水；第2个24h，一瓶装有1％蔗糖水，另一瓶装有蒸馏水。禁食禁水10h后，进行小鼠的蔗糖饮水实验。同时给予每组小鼠事先定量好的1瓶1％蔗糖水，1瓶蒸馏水。1h后，取走2瓶水称重，记录每组的蔗糖水消耗量、蒸馏水消耗量以及总液体消耗量。于实验的第28和56天各测量1次。蔗糖水偏好度(％)＝(蔗糖水消耗量/总液体消耗量)×100％。
表4.各组小鼠的糖水偏好比和游泳不动时间
组别 糖水偏好比 游泳不动时间(s)
空白对照组 77.5±9.6<sup>aA</sup> 91.9±34.6<sup>abAB</sup>
模型组 57.6±13.9<sup>bB</sup> 115.2±30.8<sup>aA</sup>
100mg/kg PGL组 72.5±8.3<sup>aA</sup> 60.5±35.1<sup>bB</sup>
200mg/kg PGL组 76.8±15.5<sup>aA</sup> 52.8±33.3<sup>bB</sup>
400mg/kg PGL组 79.1±11.3<sup>aA</sup> 47.9±34.0<sup>bC</sup>
阳性对照组 77.18±12.5<sup>aA</sup> 60.0±43.6<sup>bB</sup>
注：同列数据标注没有相同小写字母者差异显著(P<0.05)，没有相同大写字母者差异极显著(P<0.01)。
结果如表4所示，8周的温和不可预知应激刺激显著的降低糖水偏好比，但是没有显著的增加固定时间(模型组与空白对照组相比较)。与模型组相比较，100mg/kg PGL组、200mg/kg PGL组、400mg/kg PGL组和阳性对照组小鼠可以极显著地增加糖水偏好比(P<0.01)，降低游泳不动时间(P<0.01)。100mg/kg PGL组、200mg/kg PGL组、400mg/kg PGL组和阳性对照组小鼠的糖水偏好比没有显著差异。100mg/kg PGL组、200mg/kg PGL组和阳性对照组小鼠的游泳不动时间没有显著差异。400mg/kg PGL组的游泳不动时间极显著高于阳性对照组小鼠。该抗慢性温和不可预知应激检验结果表明糖肽PGL能够显著增加抑郁小鼠的糖水偏好比和显著降低抑郁小鼠的游泳不动时间，连续4周每周一次给予给药剂量为100mg/kg、200mg/kg和400mg/kg的PGL的给药方式在增加抑郁小鼠的糖水偏好比方面与连续4周每周一次给予给药剂量为20mg/kg的盐酸氟西汀给药方式没有显著差异。连续4周每周一次给予给药剂量为100mg/kg和200mg/kg的PGL的给药方式在降低抑郁小鼠游泳不动时间方面与连续4周每周一次给予给药剂量为20mg/kg的盐酸氟西汀给药方式没有显著差异，连续4周每周一次给予给药剂量为400mg/kg的PGL的给药方式在降低抑郁小鼠游泳不动时间方面显著优于连续4周每周一次给予给药剂量为20mg/kg的盐酸氟西汀给药方式。
3、抗抑郁作用机制研究
步骤2的强迫游泳实验结束后，处死小鼠解剖摘取前额皮质区域，利用HPLC技术分析前额皮质中单胺神经介质水平，利用RT-PCR和Western blot技术分析前额皮质中脑源性神经营养因子(BDNF)mRNA的表达量，收集动物血样，根据试剂盒(美国Enzo Life Sciences公司，货号：ADI-900-097，)的说明测定血液中肾上腺酮的水平。其中BDNF引物序列为正向：5'-TTATTTCATACTTCGGTTGC-3'，反向：5'-TGTCAGCCAGTGATGTCG-3'，anti-BDNF购自SantaCruz公司，货号为SC-546，anti-synapsin(5297)、anti-PSD95(2507)和anti-TrkB(4603P)均购自Cell Signaling Technology公司，anti-pTrkB购自Bioworld Technology公司，货号为BS94070，anti-β-actin购自Sigma-Aldrich，货号为A3854。
前额皮质中单胺神经介质水平如表5所示，8周的温和不可预知应激刺激可以显著的降低组织中5-羟色胺(P<0.05)和去甲肾上腺素(P<0.01)的水平(模型组与空白对照组相比较)。长期给予PGL(200和400mg/kg)可以升高5-羟色胺(P<0.05，P<0.05)和去甲肾上腺素(P<0.01，P<0.01)，但是PGL不能影响多巴胺的水平。200mg/kg PGL组和400mg/kg PGL组在提高5-羟色胺和去甲肾上腺素方面与阳性对照组之间没有显著差异。
表5.PGL对慢性温和不可预知应激抑郁小鼠前额皮质中单胺神经介质水平的影响
注：同列数据标注没有相同小写字母者差异显著(P<0.05)，没有相同大写字母者差异极显著(P<0.01)。
结果显示8周的温和不可预知应激刺激显著提升了血清中肾上腺酮的浓度(P<0.01)(模型组与空白对照组相比较)。长期给予PGL或氟西汀，与模型组相比较，使血清中肾上腺酮显著降低，其中阳性对照组的效果为显著性(P<0.05)，100mg/kg PGL组、200mg/kgPGL组和400mg/kg PGL组的效果为极其显著性(P<0.01)。100mg/kg PGL组、200mg/kg PGL组、400mg/kg PGL组和阳性对照组之间在降低血清中肾上腺酮的含量方面没有显著差异。
结果显示8周的温和不可预知应激刺激显著抑制了BDNF mRNA和蛋白的表达(P<0.01)。长期给予各剂量的PGL或盐酸氟西汀，与模型组相比较，都可以显著提高BDNF蛋白的表达量(P<0.05,P<0.05,P<0.05,P<0.01)，说明PGL通过BDNF参与的通路发挥抗抑郁功效。100mg/kg PGL组、200mg/kg PGL组、400mg/kg PGL组和阳性对照组之间在提高BDNF蛋白的表达量方面没有显著差异(表6)。
表6.PGL对慢性温和不可预知应激抑郁小鼠血清中肾上腺酮水平的影响和前额皮质中BDNF表达的影响
注：同列数据标注没有相同小写字母者差异显著(P<0.05)，没有相同大写字母者差异极显著(P<0.01)。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
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<211> 10
<212> PRT
<213> 赤芝（Ganoderma lucidum）
<400> 1
Val Arg Glu Gln Glu Trp Trp Arg Arg Arg
1 5 10
<210> 2
<211> 13
<212> PRT
<213> 赤芝（Ganoderma lucidum）
<400> 2
Glu Ala Tyr Pro Gly Asp Val Phe Tyr Leu His Ser Arg
1 5 10
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 赤芝（Ganoderma lucidum）
<400> 3
Val Gly Glu Val Met Ala Ile Gly Arg
1 5
<210> 4
<211> 27
<212> PRT
<213> 赤芝（Ganoderma lucidum）
<400> 4
Leu Leu Thr Ala Val Leu Gly Arg Leu Ser Glu Asp Glu Asn Gln Leu
1 5 10 15
Trp Glu Ile Ala Thr Ser Leu Ile Leu Asn Arg
20 25

Claims (10)

1.一种糖肽，其特征在于：所述糖肽来源于灵芝，所述糖肽的N末端序列如序列表中序列1所示，所述糖肽具有序列表中序列1-4所示的4个肽段。
2.根据权利要求1所述的糖肽，其特征在于：所述糖肽含有甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、岩藻糖、葡糖醛酸和半乳糖醛酸，所述糖肽中甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、岩藻糖、葡糖醛酸和半乳糖醛酸的摩尔比为62.5：1.9：4：4514.5：300：3.8：20.7：10：2.4。
3.根据权利要求1或2所述的糖肽，其特征在于：所述糖肽按照权利要求4-7中任一所述的方法制备。
4.权利要求1-3中任一所述的糖肽的制备方法，包括从灵芝中提取分离纯化得到所述糖肽的步骤。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述灵芝为灵芝孢子。
6.根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于：所述糖肽是从粗提物中分离纯化得到的，所述粗提物的制备方法包括：
1)收集用水从灵芝孢子粉中提取出来的水溶性物质，得到水提液；
2)除去所述水提液中的蛋白质，得到去除蛋白质的提取液，用乙醇沉淀所述去除蛋白质的提取液，收集沉淀，所述沉淀即为所述粗提物。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述从粗提物中分离纯化糖肽包括：
P1、对所述粗提物进行阴离子交换柱层析，得到名称为D1组分的分离物；所述阴离子交换柱层析中所采用的阴离子交换基团是DEAE，所采用的洗脱程序为一步洗脱，所述一步洗脱用pH为6.8-7.5的Tris-HCl缓冲溶液进行洗脱，所述Tris-HCl缓冲溶液的溶质为50mMTris和44.7mM HCl，溶剂为水；
P2、对所述D1组分进行分子筛层析，得到所述糖肽。
8.具有抗抑郁功能的产品，其特征在于：所述产品含有权利要求1-3中任一所述的糖肽。
9.权利要求1-3中任一所述的糖肽在制备具有抗抑郁功能的产品中的应用。
10.权利要求4-6中任一所述的方法在制备具有抗抑郁功能的产品中的应用。
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