CN104561048A - 杀真菌素链霉菌恩拉霉素抗性好且产量高的基因和菌株 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种杀真菌素链霉菌恩拉霉素抗性好且产量高的基因和菌株，序列如序列1所示，同时提供含有如权利要求所述的杀真菌素链霉菌恩拉霉素抗性好且产量高的基因的基因工程菌。本发明建立了杀真菌素链霉菌方便快捷的遗传操作方法,克服了物理化学诱变的育目性和工程浩大的筛选工作，利用定点突变的方法改变在链霉菌中存在的编码表达核糖体S12蛋白基因,提高恩拉霉素生产菌株的产量。本发明继续检测了突变后的菌株抗性能力对比，发现突变株比原始菌株对链霉素抗性提高至少10倍。

Description

杀真菌素链霉菌恩拉霉素抗性好且产量高的基因和菌株

技术领域

本发明属于工业微生物分子育种领域，建立在杀真菌素链霉菌中将rpsL基因定点改变，获得杀真菌素链霉菌恩拉霉素产量高的菌株。

背景技术

链霉菌在工业微生物中是一类极具商业价值的微生物。链霉菌是放线菌中重要的一个属，它产生大多数已知抗生素及其他生物活性物质，自然界约70％的抗生素是由链霉菌及其近缘放线菌产生的，它们分别在抗肿瘤、抗真菌、抗细菌及抗寄生虫等方面具有功效。例如：用于抗家畜寄生虫的阿维霉素和塞拉菌素、防止水稻紋枯萎的井冈霉素、用于医疗和兽药的红霉素泰乐霉素金霉素、用于动物生长促进剂的恩拉霉素黄霉素、用于植物保护的阿巴汀庆大霉素多氧霉素、用于抗肿瘤的链黑菌素柔毛霉素及用于免疫抑制剂的Fk506和雷帕霉素等。

链霉菌作为生物技术界瞩目的菌种资源，其育种和寻找新的链霉菌资源一直是活跃的领域。传统的菌株改良主要是使用物理化学随机诱导菌种突变以提高菌株的抗生素产量，或者用天然杂交或原生质体融合技术从突变筛选系的分支处组合预期基因以得到高产量或产新抗生素的菌株。虽然很多传统选育方法都取得了较大成功，但这些方法到目前还不能得到大家的满意。另外，这些方法存在很大的缺点，具有盲目性和筛选工作量大等劣势。随着分子生物学的不断发展，人们对链霉菌次级代谢产物合成基因及相关调控基因的研究，对链霉菌基因功能及相关调控基因认识不断深化，通过基因工程手段对菌株进行改造已经成为可能。

对链霉菌进行遗传操作，首先要建立方便快捷的操作方法，目前最常用的两种操作方法是原生质体转化和大肠杆菌-链霉菌间结合转移。原生质体转化方法由于步骤复杂，原生质体再生容易发生突变及再生困难等难题已经逐渐被结合转移法所取代。结合转移法受体链霉菌分为两种状态，包子热激发和菌丝体法。影响结合转移效率的因素主要是受体菌的状态和结合转移用的培养基。

通过基因工程手段对链霉菌进行改造，提高抗生素的产量，主要是通过对合成核糖体S12蛋白的基因rpsL进行定点突变，核糖体结构的改变带来了功能上的改变，调节链霉菌次级代谢产物代谢途径，这些结构的改变有的起正调节，有的起负调节作用，有的是多效性，有的是专一的。

而改变基因的方法可以通过基因置换来实现，其基本原理是基于染色体的同源重组，及作用基因置换的质粒上携带长度合适的基因片段，片段之间插入能在链霉菌中表达的抗性基因标记(如安普霉素)，同时载体部分也含有在链霉菌中表达的抗性标记(如卡那霉素和氯霉素)。基因置换是在抗生素的选择压力下，以单拷贝或低拷贝的形式进行的，因此质粒在受体菌中一般是不复制。质粒通常采用的形式有几种，如只在大肠杆菌中复制的单功能载体、温敏型质粒或复制及稳定功能有缺陷的质粒。当质粒转入受体菌时，可通过单抗或双抗筛选获得发生单交换的转化子，质粒这时通过与染色体上同源片段之间的重组而整合到染色体上。将上述转化子在松弛条件下生长一代或几代，可大大提高二次交换发生的频率，然后通过影印或者点种在两种不同抗生素平板上，挑取只对插入抗性标记敏感的转化子即可能为发生基因置换的菌株。

采用rpsL基因的定点突变已经在天蓝色链霉菌和变铅青链霉菌得到应用，而且其次子代谢产量也巨大的提高。目前文献中，还没有利用该基因突变提高杀真菌素链霉菌恩拉霉素产量的报道。

本发明的工作是在恩拉霉素生产菌株杀真菌素链霉菌中进行的。利用核糖体工程对其进行改造没有相关的研究，通过引物PCR扩增杀真菌素链霉菌基因组DNA，获得rpsL基因并对其进行点突变。

发明内容

本发明的目的在于提供一种杀真菌素链霉菌恩拉霉素产量高的菌株，本发明的目的在于通过基因工程手段来提高杀真菌素链霉菌恩拉霉素产量,该方法是分子生物学方法的一种,通过点突变杀真菌素链霉菌染色体上的rpsL基因,达到提高恩拉霉素产量的目的。

本发明的目的是这样实现的：

一种杀真菌素链霉菌恩拉霉素抗性好且产量高的基因，序列如序列1所示。

一种含有如权利要求所述的杀真菌素链霉菌恩拉霉素抗性好且产量高的基因的基因工程菌。

而且，所述工程菌的宿主菌为含有pUZ8002质粒的大肠杆菌ET12567感受态细胞。

而且，所述载体为pKC1139。

本发明的优点和积极效果是：

本发明建立了杀真菌素链霉菌方便快捷的遗传操作方法,克服了物理化学诱变的育目性和工程浩大的筛选工作，利用定点突变的方法改变在链霉菌中存在的编码表达核糖体S12蛋白基因,提高恩拉霉素生产菌株的产量。

本发明继续检测了突变后的菌株抗性能力对比，发现突变株比原始菌株对链霉素抗性提高至少10倍。

附图说明

图1为利用定点突变rpsL基因提高杀真菌素链霉菌恩拉霉素产量的流程图；

图2为采用重叠PCR获得包含rpsL突变基因序列原理图；

图3为本发明实例中rpsL基因突变后恩拉霉素产量提高的效果图；

图4为本发明实例中用于杀真菌素链霉菌的中间载体pKC1139M1的物理构建图谱；

图5为本发明实例中野生杀真菌素链霉菌rpsL基因与突变后杀真菌素链霉菌rpsL基因序列比较。

具体实施方式

下面详细叙述本发明的实施例；需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

本申请了对比，在突变时设计了三套突变引物，同时产生三个突变序列，但是通过检测其产量和抗性结果，另外两种结果均较差，因此不再具体提供两外M2和M3的具体序列和引物序列。

M1序列涉及并用到的所有引物如下：

rpsLF1:gtgcctacgatccagcagct

rpsLR1:acttctccttcttggcgc

rpsLF2：gccgagttcggcttcttcg

rpsLR2：acaacctgcaggagcactcc

S12F1：ccgaattc tgaacggcaa ggcggtcgc

S12R1：gcaagctt gcaggtcaag tgaagtggta

MrpsLR1:accaccccgaacaagccgaa

MrpsLF1:ttcgg ctt gtt cggg gtggt

本发明属于工业微生物分子育种领域，具体涉及大肠杆菌-杀真菌素链霉菌结合转移系统的建立，高产恩拉霉素菌株的选育，中间载体的构建和利用抗性筛选得到杀真菌素链霉菌菌株提高恩拉霉素产量的方法，rpsL突变引起次级代谢产物的过量生产是因为其引起核糖体S12蛋白结构发生改变，导致一些次级代谢产物相关基因被激活或过量表达。其中天变铅青链霉菌的rpsL突变株L90K和R94G，显著地提高了放线菌紫红素的生产。天蓝色链霉菌的rpsl突变株K88E和P91S激活在天蓝色放线紫红素和十一烷基令菌红素。本发明建立在杀真菌素链霉菌中将rpsL基因定点改变，利用改造的菌株提高恩拉霉素的产量。

本发明提供的提高杀真菌素链霉菌恩拉霉素产量的方法如图1所示,操作思路如下：

首先，通过引物rpsLF1和rpsLR1从杀真菌素链霉菌基因组DNA中PCR扩增rpsL基因；在rpsL基因内部设计引物rpsLF2和rpsLR2，采用反向PCR，获得rpsL两侧部分基因片段；设计引物S12F1和S12R1获得包含rpsL基因序列。

第二步，设计突变引物MrpsLF1/MrpsLR1、MrpsLF2/MrpsLR2和MrpsLF3/MrpsLR3分别与S12F1/S12R1组合进行重叠PCR，PCR产物测序，得到突变序列M1、M2和M3。构建M1、M2和M3基因重组载体，在本发明的实施例中构建了三个这样的重组载体，即pKC1139M1、pKC1139M2和pKC1139M3。

第三步，通过接合转移将第二步得到的重组载体转移到杀真菌素链霉菌中。

第四步，通过抗性筛选得到含有rpsL基因突变重组载体的杀真菌素链霉菌菌株。

第五步，通过PCR验证第四步得到的杀真菌素链霉菌菌株。

本发明的实施例得到了三株这样的杀真菌素链霉菌菌株，分别是P-1、P-2和P-3。

第六步，对第五步所得的杀真菌素链霉菌菌株进行发酵分析，得到恩拉霉素高产菌株。

在本实例中以下是应用到的一些培养基的组成(包含一些单项的制备方法)；

2XYT培养基：蛋白胨16g，酵母提取物10g，氯化钠5g，蒸馏水1000ml，121℃灭菌20min。

LB培养基配方：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，定容到1L，pH调节至7.0，121℃灭菌20min。

MS培养基(用于大肠杆菌与杀真菌素链霉菌的结合转移)配方：甘露醇20g，大豆粉20g，琼脂粉15g，自来水1000ml，121度，20min灭菌后备用。

MS培养基(用于大肠杆菌与杀真菌素链霉菌的结合转移)配方：甘露醇20g，大豆粉20g，琼脂粉15g，自来水1000ml，121度，20min灭菌后备用。

本发明利用定点突变杀真菌素链霉菌菌株中的rpsL基因来提高恩拉霉素产量，具体操作步骤如下：

一、在杀真菌素链霉菌的基因组DNA中PCR克隆rpsL基因，然后通过反向PCR、重叠PCR等分子克隆方法获得包含rpsL突变的基因片段

⑴在30ml 2XYT培养基中接种杀真菌素链霉菌，在28℃培养48h，收集菌丝体，抽提因组DNA；

⑵为了使含有突变位点的基因片段能与染色体高效交换，预想获得长度为1500bp左右的模板片段。经过生物信息分析发现rpsL基因非常保守且只有371bp大小，但两侧基因不保守，为了得到rpsL基因两侧基因，采用反向PCR获得：

首先，提取杀真菌素链霉菌基因组DNA，然后用BamH1酶切基因组DNA，酶切产物电泳跑胶，切胶回收1.5kb-3kb大小基因片段，回收片段进行环化自连；

其次，在保守区rpsL基因内部设计引物rpsLF2和rpsLR2进行反向PCR扩增，PCR反应条件：94℃预变形5min，94℃变性45s，62℃退火45s，72℃延伸1min30s，30循环，72℃延伸10min。PCR琼脂块凝胶电泳检测，得到1.5kb左右的带，切胶回收产物连接T载体测序。根据测序结果与rpsl部分保守区基因序列比对，确定该序列是rpsL两侧部分基因；

⑶对⑵得到的序列进行分析，以杀真菌素链霉菌基因组DNA为模板设计含有酶切位点引物S12F1和S12R1进行PCR。

PCR反应条件：94℃预变形5min，94℃变性45s，62℃退火45s，72℃延伸1min30s，30循环，72℃延伸10min。经跑胶验证与理论分析片段大小相符。

同时设计突变引物MrpsLF1/MrpsLR1、MrpsLF2/MrpsLR2和MrpsLF3/MrpsLR3，利用突变引物MrpsLF1/MrpsLR1、MrpsLF2/MrpsLR2、MrpsLF3/MrpsLR3分别和引物S12F1/S12R1进行重叠PCR，将PCR产物连接T载体，酶切验证正确，送华大测序。对测序结果分析，得到突变序列M1其序列见序列1。

二、杀真菌素链霉菌基因组DNA抽提方法：

⑴将平皿中培养5-7天的孢子(1cm²)接种于25mL 2XYT液体培养基中，200rpm摇床培养24h。

⑵取500μL培养液于1.5mL EP管中，离心并收集菌丝体。在装有菌丝体的EP管中加入SET缓冲液1mL，在蜗旋振荡器上震荡15s，使菌体充分悬浮。6000rpm离心5min，弃上清，并收集菌丝体。

⑶将约60mg湿菌丝体转移至新的EP管中，加入500μL SET缓冲液，振荡悬浮。

⑷加入15μL溶菌酶溶液(50mg/ml in water)，37℃消化30-60min。加入20ul proteinaseK(20mg/ml in water)和60ul 10％SDS，混匀后，50℃for2h(proteinase K终浓度约0.6mg/ml,SDS终浓度1％)。

⑸加入200ul 5M NaCl，颠倒混匀，再加入2ulRNase溶液(10mg/mL),消化20min。加入500ul酚-氯仿-异戊醇(25：24：1)，充分混匀，使裂解液中的蛋白充分变性。然后12000rpm离心10min。用切了头的移液枪头将上层水相转移至新的EP管中(注意不要把两相间变性的蛋白移入新EP管中)。重复该步骤进行第二次抽提，尽可能将蛋白去干净。

⑹再用500ul氯仿抽提一次，去除水相中的酚。在移出的水相中，加入等体积的预冷的异丙醇，混匀后可见棉絮状的DNA析出。

⑺12000rpm离心10min，去上清，加入600μL 75％的乙醇洗涤沉淀。

⑻10000rpm离心5min，去上清，并使乙醇充分挥发。

⑼再加入100ul RNase-水(20ug/mL)溶解基因组DNA。

大肠杆菌培养方法：在LB培养基中37℃振荡培养过夜。

三、构建包含突变基因的rpsl基因的重组载体pKC1139M1

⑴将突变序列M1、M2和M3分别与HindIII/EcoRI双酶切载体pKC1139后回收的6.4kb大片段进行酶连反应；

⑵将⑴得到的酶连产物转入感受态JM-109中，挑转化子，提质粒，酶切验证。得到质粒载体pKC1139M1、pKC1139M2和pKC1139M3。

1、大肠杆菌质粒提取方法：

⑴从平板中挑去单菌落接种到5mL含抗性的LB液体培养基中，37℃，180r/min过夜培养；

⑵取2mL培养物至2mL的离心管中，4000r/min离心5min，弃掉上清，沉淀用100μL溶液Ⅰ，充分悬浮细胞，转入1.5mL离心管中；收集菌体，加预冷的溶液I 100μL，(革兰氏阳性菌加入10μL Lysozyme 20mg/mL)，RNaseA(10mg/mL)5ul，充分悬浮菌体，37℃温浴30min；

⑶再沿管壁加入200ul现配的溶液Ⅱ，轻颠倒离心管3-5次，冰浴4min，然后迅速加入150ul溶液Ⅲ，冰浴20min；

⑷加入等体积的苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，混合均匀后，12000r/min离心10min，将上清移至新的EP管中，重复此步骤；加入等体积的氯仿，混合均匀后，12000r/min离心10min，将上清移至新的EP管；

⑸加入0.6倍体积的异丙醇，混匀，-20℃放置20min以上，12000r/min离心10min，弃上清；

⑹沉淀用75％乙醇洗涤，弃去残液，待乙醇挥发后，用适量ddH2O(RnaseA)溶解沉淀，-20℃保存。

2、限制性内切酶的酶切反应方法：用限制性内切酶HindIII/EcoRI双酶切质粒pKC1139，酶切体系为50μL：

3、酶连反应方法：37℃处理4-7h，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳，切胶回收6.4kb大片段基因后分别连接目的序列M1、M2和M3，连接体系为20μL(目的基因浓度：载体浓度为3：1-9：1)。

连接体系：

16℃连接过夜。

4、大肠杆菌感受态制备(CaCl₂法)及转化方法：

⑴挑取新鲜的E.coliJM109/ET12567单菌落于5mL LB液体培养基的试管中，37℃振荡培养过夜；

⑵取1mL菌液转接到含有50mL LB液体培养基的三角瓶中，37℃振荡培养至OD600约0.4-0.6，将菌液转移到离心管中，冰上放置30min；

⑶4℃、4000r/min离心15min。弃上清，用冰冷的10ml悬浮细胞，冰上放置30min；

⑷4000r/min离心10min，用冰冷的溶液10ml悬浮细胞，每60ul体积分装EP管，70℃保存备用。

5、连接产物转化感受态细胞方法

⑴从-80℃冰箱取60ul取出感受态细胞，加入10ul连接产物，混匀，冰浴30min后；

⑵42℃水浴中热击90s，冰浴2min；

⑶加入800ul LB液体培养基，37℃，180r/min，复苏1h；

⑷4000r/min离心5min，去掉600ul上清，取适量余下的菌液涂布于含有抗性的LA平板上；

⑸37℃倒置培养12-16h。

四、将重组载体pKC1139M1、pKC1139M2和pKC1139M3通过结合转移的方法导入杀真菌素链霉菌中

现有技术中没有关于大肠杆菌与杀真菌素链霉菌的结合转移方法，通过摸索确定杀真菌素链霉菌结合转移方法如下：

⑴将重组载体质粒pKC1139M1、pKC1139M2和pKC1139M3分别转化含有pUZ8002质粒的大肠杆菌ET12567感受态细胞中，得到含有两个质粒的大肠杆菌ET12567菌株，表示为E1-Pkc1139M1、E2-Pkc1139M2和E3-Pkc1139M3；

⑵分别挑取大肠杆菌E1-Pkc1139M1、E2-Pkc1139M2和E3-Pkc1139M3单菌落于10ml含有抗生素安普拉霉素(50ug/ml)，氯霉素(25ug/ml)和卡那霉素(50ug/ml)的LB培养基中，37度过夜培养。

⑶取100ul⑵中大肠杆菌培养液于10ml新鲜含有抗生素安普拉霉素(50ug/ml)，氯霉素(25ug/ml)和卡那霉素(50ug/ml)的LB培养基，37℃培养至OD＝0.4。

⑷用10ml无抗LB培养基洗⑶得到的菌体以防止残留的抗生素对链霉菌孢子抑制，最后用1ml LB悬浮菌体。

⑸取10ul(孢子悬液浓度为10⁸个/ml)杀真菌素链霉菌孢子于500ul 2XYT培养基中，50℃水浴锅热激10min，冷却至室温。

⑹取500ul⑷大肠杆菌细胞悬浮液和500ul⑸中处理好的孢子，轻轻混匀。

⑺取100ul⑹中混合悬浮液涂布与添加10Mm氯化镁的Ms培养基中，30℃培养16-20h。

⑻在⑺中培养好的平板中覆盖1ml含有0.5mg奈丁酸(20ul的25mg/ml储存液)和1.25mg安普拉霉素(50mg/ml储存液)的灭菌水。用涂布器涂布均匀，30度继续培养，观察大结合转化子。

五、筛选含有rpsl基因突变的杀真菌素链霉菌

⑴将转化子接种在含有安普拉霉素抗性的MS培养基中，28℃培养5天；

⑵挑取菌体转移到无抗MS培养基中，40℃培养5天，传代两次；

⑶采用影印法分别将对应菌落克隆到含有终浓度为50ug/ml安普拉霉素抗性MS平板和含有链霉素终浓度为5ug/ml抗性的MS平板上，28℃培养5天，这些在链霉素抗性板上生长而在安普拉霉素抗性板上不长的菌体可能是rpsl基因发生突变的杀真菌素链霉菌。

六、杀真菌素链霉菌的PCR验证

抽提杀真菌素链霉菌P-1、P-2和P-3的基因组，用rpsLF1和rpsLF1进行PCR扩增，对扩增序列进行测序，验证rpsL所选位点改变。

七、用HPLC测定123产生的恩拉霉素与出发菌的比较

首先取2ml发酵液，加入18ml预先配制好的甲醇浸提液(甲醇：2M盐酸：水＝20：1：21)，使用超声波震荡30分钟后，离心，取上清液，经过0.45um的滤膜过滤后，注射到HPLC系统中。

—色谱柱：C18反向色谱柱，4.6╳150mm，Φ＝5um

—流速：1.0ml/min

—检测波长：267nm

—流动相：乙腈：50mM的NaH2PO4＝3:7,pH4.5，使用磷酸调节pH值。

根据HPLC分析得到各组分面积，计算p-1、p-2和p-3的分面积，p-1、p-2和p-3的恩拉霉素产量与出发菌株相比，提高了20％。

八、突变菌株与原始菌株对链霉素抗性的变化

具体实验流程：

⑴最小抑菌浓度测定

制备含有1ug/ml、1.5ug/ml、2ug/ml、2.5ug/ml、3ug/ml、3.5ug/ml链霉素抗性浓度梯度的MS培养基，将原始杀真菌素链霉菌P孢子涂在上面，28度培养7天。

结果：当培养基中链霉素浓度小于且包含2.5ug/ml的生长，链霉素浓度大于3ug/ml的不长。因此得出野生型杀真菌素链霉菌的链霉素最小抑制浓度约为2.5ug/ml。

⑵突变菌株对链霉素浓度变化测试

制备含有2ug/ml、5ug/ml、10ug/ml、15ug/ml、20ug/ml、25ug/ml、30ug/ml链霉素抗性浓度梯度的MS培养基，将杀真菌素链霉菌P、P-1、P-2、P-3孢子分别涂在上面，28度培养7天。

结果：2ug/ml都生长；5ug/ml抗性板P不生长，而P-1生长；30ug/ml抗性板p-1仍然生长，突变株比原始菌株对链霉素抗性提高至少10倍。

九、说明：

本发明综合实验七和实验八的结果，综合抗性能力和产量，并通过实验对比，基因M1的综合表现优异，针对其突变的结果(图5)，我们不难看出，其个别基因的改变对产量和抗性具有偶然性，即使单个碱基的差异会使菌株的最终表现差别巨大，因此申请人经过认真细致的对比分析，认为基因M1具有较好的工业应用前景，因此保护序列M1。

Claims (4)

1.一种杀真菌素链霉菌恩拉霉素抗性好且产量高的基因，其特征在于：序列如序列1所示。

2.一种含有如权利要求所述的杀真菌素链霉菌恩拉霉素抗性好且产量高的基因的基因工程菌。

3.根据权利要求2所述的含有杀真菌素链霉菌恩拉霉素抗性好且产量高的基因的基因工程菌，其特征在于：所述工程菌的宿主菌为含有pUZ8002质粒的大肠杆菌ET12567感受态细胞。

4.根据权利要求2所述的含有杀真菌素链霉菌恩拉霉素抗性好且产量高的基因的基因工程菌，其特征在于：所述载体为pKC1139。