CN102533813A - 友菌素的生物合成基因簇及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种友菌素的生物合成基因簇及其应用。包含21个基因，其中8个脱氧糖合成酶基因(amiB，amiC，amiD，amiE，amiH，amiK，amiN，amiU)和2个糖基转移酶基因(amiJ，amiG)编码的蛋白负责友菌素两个脱氧糖基的生物合成，3个基因(amiA，amiM，amiL)编码的蛋白负责对氨基苯甲酸的生物合成，1个基因(amiI)编码的蛋白负责胞嘧啶的生物合成，1个基因(amiF)编码的蛋白负责胞嘧啶脱氧核苷与对氨基苯甲酸辅酶A之间的缩合反应，3个基因(amiT，amiR，amiS)编码的蛋白负责末端氨基酸的生物合成，此外，还包括1个调控基因(amiP)，2个转运基因(amiO，amiQ)。本发明所提供的基因及其蛋白质也可以用来寻找和发现可用于医药、工业或农业的化合物或基因、蛋白。

Description

友菌素的生物合成基因簇及其应用

技术领域：

本发明属于微生物基因工程领域，具体涉及抗生素友菌素(amicetin)的生物合成基因簇的克隆、分析、功能研究及其应用。

背景技术：

友菌素是一类二糖核苷类抗生素，其结构式如图1所示，其能有效抑制革兰氏阳性和阴性细菌、结核杆菌，对鸡球虫病和肺结核病有一定的疗效，并有抗病毒功能(如1型疱疹病毒herpesvirus和脊髓灰质炎病毒poliovirus等)[Med.Res.Rev.(1984)4：471-512]。友菌素主要由Streptomyces和Aethrobater产生，其主要结构特点是以胞嘧啶为基本骨架，通过一位氮连接两个脱氧己糖amicetose和amosamine，通过四位氮耦合了一个分子的对氨基苯甲酸和一个分子的α-甲基丝氨酸。友菌素的主要抗菌作用机制是通过结合到宿主23S核糖体RNA的一个非常保守的“肽酰转移酶中心”区域，从而阻断宿主的蛋白质合成[Embo J.(1994)13：1682-1686]。采用同样机制的抗生素还包括氯霉素，大环内酯类抗生素和其他核苷类抗生素，如灭瘟素(blasticidin S)，谷氏菌素(gougerotin)，抗蠕霉素(anthelmycin)以及嘌呤霉素(puromycin)等[Med.Res.Rev.(1984)4：471-512；Russ.Chem.Rev.(2004)73：401-414]，其中友菌素对古细菌，细菌和真核生物的蛋白质合成都有抑制作用，被称为“通用”抗生素[EmboJ.(1994)13：1682-1686]。

核苷类抗生素由于独特的活性而得到了人们的关注，尤其近二十年来生物技术的发展为了解核苷类抗生素的生物合成机制提供了新的平台和机遇[中国抗生素杂志.(2009)34：129-141]，越来越多的核苷类抗生素的生物合成基因簇被克隆和鉴定，包括尼克霉素(nikkomycin)[Mol.Gen.Genet.(1999)262：102-114；Mol.Gen.Genet.(2001)264：662-673；Mol.Microbiol.(2005)55：1855-1866]，多氧霉素(polyoxin)[J.Biol.Chem.(2009)284：10627-10638]，嘌呤霉素(puromycin)[Embo J.(1992)11：785-792；J.Biol.Chem.(1996)271：1579-1590]，杀稻瘟菌素S(blasticidin S)[Chembiochem.(2003)4：821-828]，streptothricins[J.Bacteriol.(1997)179：6929-6936]，toyocamycin[Chem.Biol.(2008)15：790-798]，A-500359s[J.Antibiot.(2009)62：325-332]，caprazamycin[J.Biol.Chem.(2009)284：14987-14996]，lipisidomycin[Chembiochem.(2010)11(2)：191-196]及其类似物A-90289[Chembiochem.(2010)11(2)：184-190]，其中国内的科学家系统研究了尼克霉素和多氧霉素的生物合成，同时国内科学家也克隆和鉴定了米多霉素的两个生物合成酶[Chembiochem.(2008)9：1286-1294]。核苷类抗生素友菌素具有独特的二糖链，尤其是amosamine以独特的保留型糖苷键与amicetose相连，这种保留型的糖苷键在微生物天然产物中并不多见。因此，克隆和鉴定友菌素的生物合成基因簇，对于了解二糖链的形成机制，以及末端氨基酸(α-methylserine)的合成及其构效关系，都显得非常必要。

发明内容：

本发明的第一个目的是提供一种友菌素的生物合成基因簇。

本发明的友菌素的生物合成基因簇，其特征在于，该友菌素的生物合成基因簇的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，由其中的从7917位到34889位的碱基序列组成。

本发明的友菌素的生物合成基因簇，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1的第7917位到34889位的碱基序列所示，包含21个基因，其中8个脱氧糖合成酶基因(amiB，amiC，amiD，amiE，amiH，amiK，amiN，amiU)和2个糖基转移酶基因(amiJ，amiG)编码的蛋白负责友菌素两个脱氧糖基的生物合成，3个基因(amiA，amiM，amiL)编码的蛋白负责对氨基苯甲酸的生物合成，1个基因(amiI)编码的蛋白负责胞嘧啶的生物合成，1个基因(amiF)编码的蛋白负责胞嘧啶脱氧核苷与对氨基苯甲酸辅酶A之间的缩合反应，3个基因(amiT，amiR，amiS)编码的蛋白负责末端氨基酸的生物合成，此外，还包括1个调控基因(amiP)，2个转运基因(amiO，amiQ)，具体为：

1)脱氧糖合成基因，即amiB，amiC，amiD，amiE，amiH，amiK，amiN，amiU共8个基因：

amiB位于基因簇核苷酸序列第9160-10278个碱基处，长度为1119个碱基对，编码氨基转移酶，372个氨基酸；

amiC位于基因簇核苷酸序列第10275-11651个碱基处，长度为1377个碱基对，编码NDP-己糖-2，3-脱水酶，458个氨基酸；

amiD位于基因簇核苷酸序列第11648-12616个碱基处，长度为969个碱基对，编码NDP-己糖-3-酮还原酶，322个氨基酸；

amiE位于基因簇核苷酸序列第12778-13551个碱基处，长度为774个碱基对，编码葡萄糖-1-磷酸腺苷转移酶，257个氨基酸；

amiH位于基因簇核苷酸序列第16530-17279个碱基处，长度为750个碱基对，编码甲基转移酶，249个氨基酸；

amiK位于基因簇核苷酸序列第19048-19995个碱基处，长度为948个碱基对，编码NDP-己糖-4-酮还原酶，315个氨基酸；

amiN位于基因簇核苷酸序列第23609-24928个碱基处，长度为1320个碱基对，编码CDP-4-酮-6-脱氧葡萄糖-3-脱水酶，439个氨基酸；

amiU位于基因簇核苷酸序列第33825-34889个碱基处，长度为1065个碱基对，编码dTDP-葡萄糖-4，6-脱水酶，354个氨基酸；

2)糖基转移酶基因，即amiJ，amiG共两个基因：

amiJ位于基因簇核苷酸序列第17821-19032个碱基处，长度为1212个碱基对，编码胞嘧啶葡萄糖酸合成酶/糖基转移酶，403个氨基酸；

amiG位于基因簇核苷酸序列第15035-16522个碱基处，长度为1488个碱基对，编码糖基转移酶，495个氨基酸；

3)对氨基苯甲酸合成基因，即amiA，amiM，amiL共三个基因：

amiA位于基因簇核苷酸序列第7917-8711个碱基处，长度为795个碱基对，编码4-氨基-4-脱氧分支酸裂解酶，264个氨基酸；

amiL位于基因簇核苷酸序列第20038-21534个碱基处，长度为1497个碱基对，编码苯辅酶A合成酶，498个氨基酸；

amiM位于基因簇核苷酸序列第21531-23564个碱基处，长度为2034个碱基对，编码对氨基苯甲酸合成酶，677个氨基酸；

4)胞嘧啶生物合成基因，即amiI共1个基因：

amiI位于基因簇核苷酸序列第17276-17824个碱基处，长度为549个碱基对，编码(脱氧)胞苷脱氧核糖转移酶，182个氨基酸；

5)酰基转移酶基因，即amiF共1个基因；

amiF位于基因簇核苷酸序列第13592-14998个碱基处，长度为1407个碱基对，编码酰基转移酶，468个氨基酸；

6)末端丝氨酸生物合成基因，即amiR，amiS，amiT共3个基因：

amiR位于基因簇核苷酸序列第28935-29834个碱基处，长度为900个碱基对，编码丙二酰辅酶A酰基载体蛋白转酰基酶，299个氨基酸；

amiS位于基因簇核苷酸序列第29925-31283个碱基处，长度为1359个碱基对，编码丝氨酸羟甲基转移酶，452个氨基酸；

amiT位于基因簇核苷酸序列第31329-33794个碱基处，长度为2466个碱基对，编码非核糖体肽合成酶，821个氨基酸；

7)调控基因，即amiP共1个基因：

amiP位于基因簇核苷酸序列第26996-27634个碱基处，长度为639个碱基对，编码TetR家族的转录调节子，212个氨基酸；

8)转运基因，即amiO，amiQ共2个基因：

amiO位于基因簇核苷酸序列第24970-26649个碱基处，长度为1680个碱基对，编码ABC家族转运蛋白，559个氨基酸；

amiQ位于基因簇核苷酸序列第27684-28877个碱基处，长度为1194个碱基对，编码主要易化超家族转运蛋白，397个氨基酸。

SEQ ID NO.1所示序列的互补序列可根据DNA碱基互补原则随时得到。SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列或部分核苷酸序列可以通过聚合酶链式反应(PCR)或用合适的限制性内切酶酶切相应的DNA或使用其他合适的技术得到。本发明提供了得到至少包含部分SEQ IDNO.1所示序列中DNA序列的重组DNA载体的途径。

本发明还提供了产生友菌素生物合成基因被中断或加倍的微生物体的途径，至少其中之一的基因包含有SEQ ID NO.1中的核苷酸序列。

本发明所提供的核苷酸序列或部分核苷酸序列，可利用聚合酶链式反应(PCR)的方法或包含本发明序列SEQ ID NO.1的DNA作为探针以Southern杂交等方法从其他生物体中得到与友菌素生物合成基因相似的基因。

包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的克隆DNA可用于从Streptomyces vinaceus-drappus NRRL 2363基因组文库中定位更多的文库质粒。这些文库质粒至少包含本发明中的部分序列，也包含有S.vinaceus-drappus NRRL 2363基因组中以前邻近区域未克隆的DNA。

包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列可以被修饰或突变。这些途径包括插入、置换或缺失，聚合酶链式反应，错误介导聚合酶链式反应，位点特异性突变，不同序列的重新连接，序列的不同部分或与其他来源的同源序列进行定向进化(DNA shuffling)，或通过紫外线或化学试剂诱变等。

包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的克隆基因可以通过合适的表达体系在外源宿主中表达以得到相应的酶或其他更高的生物活性或产量。这些外源宿主包括大肠杆菌、链霉菌、假单孢菌、芽孢杆菌、酵母、植物和动物等。

本发明所提供的氨基酸序列可以用来分离所需要的蛋白并可用于抗体的制备。

包含本发明所提供的氨基酸序列或至少部分序列的多肽可能在去除或替代某些氨基酸之后仍有生物活性甚至有新的生物学活性，或者提高了产量或优化了蛋白动力学特征或其他致力于得到的性质。

包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的基因或基因簇可以在异源宿主中表达并通过DNA芯片技术了解它们在宿主代谢中的功能。

包含本发明所提供的核苷酸序列编码的蛋白可以催化合成脱氧糖amosamine、amicetose、褶皱菌素及正褶皱菌素，进一步催化合成抗生素友菌素。

因此本发明还提供友菌素的生物合成基因簇在制备友菌素及其类似物中的应用。

本发明还提供友菌素的生物合成基因簇在制备脱氧糖amosamine中的应用。

本发明还提供友菌素的生物合成基因簇在制备脱氧糖amicetose中的应用。

本发明还提供友菌素的生物合成基因簇在制备褶皱菌素及其类似物中的应用。

本发明还提供友菌素的生物合成基因簇在制备正褶皱菌素及其类似物中的应用。

包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的基因或基因簇可以通过遗传重组来构建重组载体以获得新型生物合成途径，也可以通过插入、置换、缺失或失活进而获得新型生物合成途径。

包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的克隆基因或DNA片段可以通过中断友菌素生物合成的一个或几个步骤而得到新的友菌素结构类似物或前体。包含DNA片段或基因可以用来提高友菌素或其衍生物的产量，本发明提供了在基因工程微生物中提高产量的途径。

本发明所提供的友菌素的糖基转移酶、甲基转移酶或其他酶提供了通过遗传修饰得到类似物的途径。

总之，本发明所提供的包含友菌素生物合成相关的所有基因和蛋白信息可以帮助人们理解友菌素家族天然产物的生物合成机制，为进一步遗传改造提供了材料和知识。本发明所提供的基因及其蛋白质也可以用来寻找和发现可用于医药、工业或农业的化合物或基因、蛋白。

用于本发明的酒红土褐链霉菌NRRL2363(Streptomyces vinaceusdrappus NRRL 2363)，保藏于美国农业研究菌种保藏中心(Agricultural Research Service Culture Collection，简写：NRRL)，其登录号为NRRL 2363。

附图说明：

图1是友菌素的化学结构；

图2(A)是友菌素生物合成基因簇的结构示意图和限制性内切酶谱。B代表限制性内切酶BamHI，E代表限制性内切酶EcoRI，X^*代表原始载体pOJ446中的限制性内切酶XbaI，S^*代表原始载体pOJ446中的限制性内切酶SspI。(B)pCSG3104的亚克隆。pCSG3201：11650bp BamHI/NdeI片段克隆至pET28a；pCSG3202：8479bp NotI片段克隆至pUCPU21；pCSG3203：8479bp BamHI/SpeI片段克隆至pET28a；pCSG3205：10903bp NotI片段克隆至pUCPU21；pCSG3206：9008bp XbaI/HindIII片段克隆至pUCPU21；pCSG3207：5953bp NotI片段克隆至pUCPU21。

图3是友菌素生物合成基因簇的异源表达和基因簇边界的确定。(A)友菌素生物合成基因簇在S.livdans TK64中异源表达代谢产物的高压液相分析，(I)包含载体pOJ446的TK64，(II)包含质粒pCSG3104(含完整的友菌素生物合成基因簇)的TK64，(III)友菌素标准品，(IV)化合物正褶皱菌素(9)和褶皱菌素(10)的标准品。(B)友菌素野生型生产菌酒红土褐链霉菌NRRL2363(V)，Δorf(-1)突变株AM1001(VI)和Δorf1突变株AM1011(VII)的代谢产物的高压液相分析；

图4是提出的友菌素两个脱氧糖amosamine和amicetose的生物合成途径；

图5是提出的友菌素的生物合成途径；

图6是友菌素生物合成基因突变株代谢产物的高压液相分析及所产化合物的结构式。(A)友菌素生物合成基因突变株代谢产物的高压液相分析，(I)ΔamiB突变株AM1002，(II)ΔamiF突变株AM1003，(III)ΔamiG突变株AM1004，(IV)ΔamiH突变株AM1005，(V)ΔamiI突变株AM1006，(VI)ΔamiL突变株AM1007，(VII)ΔamiP突变株AM1008，(VIII)ΔamiR突变株AM1009，(IX)ΔamiS突变株AM1010，(X)ΔamiT突变株AM1012，(XI)友菌素野生型生产菌酒红土褐链霉菌NRRL2363。(B)突变株所产化合物2-11的化学结构式；图7是对氨基苯甲酸(PABA)在突变株AM1006中生物转化为4-乙酰氨基-3-羟基-苯甲酸(3)。(A)对氨基苯甲酸生物转化的示意图。(B)生物转化菌株的高压液相分析，(I)突变株AM1006，(II)突变株AM1006添加1mM的对氨基苯甲酸，(III)突变株AM1006添加10mM的对氨基苯甲酸，(IV)对氨基苯甲酸标准品，(V)4-乙酰氨基-3-羟基-苯甲酸(3)标准品；

图8是糖基转移酶AmiG的异源表达和分离纯化的蛋白电泳分析。(A)糖基转移酶AmiG在大肠杆菌中的异源表达。1，E.coli BL21(DE3)/pET28a全细胞提取物；2，E.coli BL21(DE3)/pCSG3247全细胞提取物；3，E.coli BL21(DE3)/pCSG3247全细胞提取物的上清部分；M，蛋白标准分子量。(B)糖基转移酶AmiG的分离纯化。1，纯化后的AmiG(1μl)；1，纯化后的AmiG(5μl)；

图9是AmiG催化的代表性反应。(A)在TDP或UDP介导下AmiG催化的逆向反应，如AmiG可催化由化合物正褶皱菌素(9)变成化合物12，同时生成核苷糖。(B)AmiG催化的正向反应，如在TDP-葡萄糖(TDP-glucose)或UDP-葡萄糖(UDP-glucose)存在时，AmiG可催化化合物4的加糖反应形成化合物13。(C)AmiG催化的交换反应，如在AmiG的反应体系中同时加入化合物4和化合物10，AmiG可先进行逆向催化将化合物10转化为化合物12和TDP-amosamine，再将形成的TDP-amosamine经正向反应添加到化合物4上，最终形成化合物1；

图10是AmiG催化反应的高压液相分析。(A)AmiG催化的逆向反应，i)对照反应，100μM化合物9，1mM TDP，无AmiG；ii)100μM化合物9，1mM TDP，5μM AmiG；iii)100μM化合物9，1mM UDP，5μM AmiG；iv)100μM化合物10，1mM TDP，5μM AmiG；v)100μM化合物7，1mM TDP，5μM AmiG；vi)100μM化合物1，1mM TDP，5μMAmiG；vii)100μM化合物6，1mM TDP，5μM AmiG。(B)AmiG催化的正向反应和交换反应，viii)对照反应，100μM化合物4，1mM TDP-glucose，无AmiG；ix)100μM化合物4，1mM TDP-glucose，5μM AmiG；x)100μM化合物4，1mM UDP-glucose，无AmiG；xi)100μM化合物4，1mM UDP-glucose，5μM AmiG；xii)对照反应，50μM化合物4，100μM化合物10，无AmiG；xiii)50μM化合物4，100μM化合物10，5μM AmiG。

具体实施方式：

以下是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

1、友菌素生物合成基因簇克隆、序列分析及功能分析：

友菌素(图1)结构中含有一分子的对氨基苯甲酸(PABA，para-Amino Benzoic Acid)，通过比较一些次级代谢产物的PABA合成酶AurG(aureothin，Streptomyces thioluteus，CAE02603)，PabAB(Streptomyces sp.FR-008，AAQ82560)，PabAB(chloramphenicol，Streptomyces venezuelaeISP5230，AAB30312)的氨基酸序列，确定了保守区域，设计兼并性引物PABA-2F：5′-GGGVGT SCA GTT CCM MCC SGA GTC-3′和PABA-5R：5′-CAG GTC GAC GAT CAT SAG GTTCTC GGC-3′，成功从酒红土褐链霉菌(Streptomyces vinaceus-drappus)NRRL 2363基因组中扩增到一个1.1kb的DNA片段，经克隆到T载体并测序确认了该片段与上述PABA合成酶有一定的相似性，从而暗示克隆到的基因片段很有可能参与了友菌素中对氨基苯甲酸结构域的生物合成。以该DNA片段为筛选探针，从酒红土褐链霉菌NRRL 2363基因组文库约2000个克隆中，成功筛选到9个阳性柯斯质粒，其中阳性克隆pCSG3104在异源宿主变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)TK64中表达可使其产生友菌素及其中间体，表明pCSG3104包含了友菌素生物合成所必须的全部基因。对pCSG3104进行DNA测序分析表明其插入序列全长为37337bp，其序列如SEQ ID NO.1所示，GC含量为68.5％，生物信息学分析包含了26个开放阅读框(表1，图2)，其中21个开放阅读框(amiA-amiU)可能与友菌素的生物合成有关。根据基因编码蛋白的功能分析，两个转座基因amiO和amiQ可能与友菌素的转运输送相关；一个调控子基因amiP可能与友菌素生物合成的调控相关；八个基因(amiB-amiE，amiH，amiK，amiN和amiU)可能和友菌素中的两个脱氧糖的生物合成相关；两个糖基转移酶基因amiG和amiJ可能和两个脱氧糖的添加有关；核苷2-脱氧戊糖转移酶基因amiI可能参与胞嘧啶的合成；四个基因(amiM，amiA，amiL和amiF)可能参与对氨基苯甲酸的生物合成；三个基因(amiS，amiT和amiR)可能参与末端α-甲基丝氨酸的生物合成。

表1：友菌素生物合成基因簇的基因及其功能分析

a氨基酸数目；b括号中包含了同源蛋白的GenBank登录号，及与之对应的相似性/一致性。

2、友菌素的生物合成基因簇边界的确定：

根据基因编码蛋白的功能分析，友菌素的生物合成基因簇被确定为从基因amiA到amiU(图2)，涵盖染色体26.9kb的区域，包含21个开放读码框。由于cosmid pCSG3104在异源宿主变铅青链霉菌TK64中表达可使其产生友菌素及其中间体(图3A)，表明pCSG3104包含了友菌素生物合成所必须的全部基因。通过生物信息学分析，初步确定了友菌素的生物合成基因簇的边界：在友菌素生物合成相关DNA区域左侧末端，orf(-3)和orf(-1)分别编码推定转录衰减调控子和Mg²⁺或Mn²⁺依赖的蛋白磷酸酶，这些酶往往参与微生物的初级代谢过程而与次级代谢无关；事实上，orf(-1)的敲除突变株依然能生产友菌素，表明其的确不参与友菌素的生物合成(图3B)；而amiA和amiB分别编码了4-氨基-4-脱氧分支酸裂解酶和核苷糖氨基转移酶，我们推测它们都与友菌素的生物合成相关；在友菌素生物合成相关DNA区域右侧末端，amiT和amiU分别编码了非核糖体肽合成酶和TDP-葡萄糖4，6-脱水酶，推测它们都与友菌素的生物合成相关；而orf1编码一个GCN5-相关的N-乙酰转移酶，而orf1基因的敲除突变对友菌素的产生没有影响(图3B)。综合以上分析，我们确定友菌素的生物合成基因簇的左侧边界为amiA，右侧边界为amiU。

整个友菌素的生物合成基因簇共21个基因，其中8个脱氧糖合成酶基因(amiB，amiC，amiD，amiE，amiH，amiK，amiN，amiU)和2个糖基转移酶基因(amiJ，amiG)编码的蛋白负责友菌素两个脱氧糖基的生物合成，3个基因(amiA，amiM，amiL)编码的蛋白负责对氨基苯甲酸的生物合成，1个基因(amiI)编码的蛋白负责胞嘧啶的生物合成，1个基因(amiF)编码的蛋白负责胞嘧啶脱氧核苷与对氨基苯甲酸辅酶A之间的缩合反应，3个基因(amiT，amiR，amiS)编码的蛋白负责末端氨基酸的生物合成，此外，还包括1个调控基因(amiP)，2个转运基因(amiO，amiQ)。

3、脱氧糖的生物合成

友菌素中两个脱氧糖的生物合成如图4所示：amiE编码一个1-磷酸葡萄糖核苷转移酶，负责NDP-葡萄糖的合成，将葡萄糖-1-磷酸转化为NDP-D-葡萄糖。amiU编码一个dTDP-葡萄糖4，6-脱水酶，负责将NDP-D-葡萄糖转化为NDP-4-酮-6-脱氧-D-葡萄糖。amiC和amiD分别编码了NDP-己糖-2，3-脱水酶和NDP-己糖-3-酮还原酶，负责NDP-4-酮-6-脱氧-D-葡萄糖的2位碳脱氧，将NDP-4-酮-6-脱氧-D-葡萄糖转化为NDP-4-酮-2，6-二脱氧-D-葡萄糖。amiN和amiK分别编码了NDP-己糖-3-脱水酶和NDP-己糖-4-还原酶，负责NDP-4-酮-2，6-二脱氧-D-葡萄糖的3位碳脱氧和4位碳还原，从而形成终产物NDP-amicetose。amiB编码一个NDP-葡萄糖氨基转移酶，负责amosamine的4位氨基的形成，然后由amiH编码的NDP-氨基己糖-N-甲基转移酶实现氮原子的双甲基化，最终形成NDP-amosamine。amiJ编码一个糖基转移酶，负责在胞嘧啶上添加amicetose，而另一个糖基转移酶amiG则紧接着在amicetose的4’-羟基上添加amosamine，形成cytosamine。

4、友菌素的生物合成

友菌素的生物合成如图5所示：amiI编码了一个可能的胞苷酸水解酶，催化CMP脱磷酸核糖形成友菌素的合成前体胞嘧啶(cytosine)，随后，由AmiJ蛋白催化胞嘧啶和NDP-amicetose之间的耦合。amiM编码一个分支酸合成酶，催化分支酸转化为4-氨基-4-脱氧分支酸(ADC)，随后ADC在ADC裂解酶AmiA的催化下，经过一个丙酮酸消除反应，生成对氨基苯甲酸。amiL的编码产物显示了同苯甲酸辅酶A合成酶的相似性，它可能催化对氨基苯甲酸和辅酶A之间硫酯键的形成。随后，amiF编码的GCN5相关的N-酰基转移酶AmiF可能参与了胞嘧啶脱氧糖苷与对氨基苯甲酸辅酶A之间的缩合反应。缩合反应完成之后，amiG编码的糖基转移酶也可能在缩合反应完成后负责添加amosamine，形成友菌素生物合成的一个重要中间体褶皱菌素(plicacetin)。amiS编码了一个甘氨酸/丝氨酸羟甲基转移酶，催化丙氨酸生成α-甲基丝氨酸，随后，AmiR和非核糖体肽合成酶AmiT共同催化了褶皱菌素与α-甲基丝氨酸之间的缩合反应，最终形成终产物友菌素。

5、友菌素生物合成基因簇的应用-对生物合成基因簇的遗传突变获得其结构类似物：

在克隆、分析了完整的友菌素生物合成基因簇，研究了各基因编码蛋白可能的功能的基础上，本发明对友菌素的生物合成机制进行了探讨，采用PCR-targetting技术针对11个生物合成基因，进行了灭活突变(灭活引物参见表2，检测引物参见表3)，获得了AM1001-AM1012等12个突变株。

表2：构建突变株所需的灭活引物名称和序列

表3：构建突变株所需的检测引物名称和序列

我们通过对突变株进行发酵和代谢产物的分离鉴定，阐明了部分生物合成基因的功能，为进一步通过对生物合成基因簇进行遗传修饰获得友菌素活性类似物提供了可能。同时本发明也从突变株中获得了一系列的新产物(如图6所示)：

(1)如图3B所示，敲除了orf(-1)-Mg or Mn-依赖的蛋白磷酸酶基因，获得的突变株AM1001仍然生产友菌素(1)，证明了Orf(-1)可能不参与友菌素的生物合成，是整个友菌素生物合成基因簇的左边边界。

(2)如图3B所示，敲除了orf1-GCN5相关的N-乙酰转移酶基因，获得的突变株AM1011仍然生产友菌素(1)，证明了Orf1可能不参与友菌素的生物合成，是整个友菌素生物合成基因簇的右边边界。

(3)敲除了amiB-核苷糖氨基转移酶基因，获得的突变株AM1002不再生产友菌素(1)，也不积累友菌素类似物，证明了AmiB参与友菌素的生物合成。

(4)敲除了amiF-N-乙酰转移酶基因，获得的突变株AM1003不再生产友菌素(1)，但积累友菌素类似物cytosamine(2)和4-乙酰氨基-3-羟基-苯甲酸(3)，初步证明了AmiF参与友菌素的生物合成中对氨基苯甲酸与胞嘧啶之间的酰胺键的形成。化合物3可能是由基因簇之外的一个乙酰转移酶和羟化酶催化形成。

(5)敲除了amiG-糖基转移酶基因，获得的突变株AM1004不再生产友菌素(1)，但积累新友菌素类似物4和5，证明了AmiG参与友菌素的生物合成中amosamine的糖基化。

(6)敲除了amiH-N-甲基转移酶基因，获得的突变株AM1005不再生产友菌素(1)，但积累新3个友菌素类似物6，7和8，证明了AmiH参与友菌素的生物合成中amosamine的N-甲基化。

(7)敲除了amiI-胞嘧啶脱氧核糖转移酶基因，获得的突变株AM1006不再生产友菌素(1)，也不积累友菌素类似物，初步证明了AmiI参与友菌素的生物合成中胞嘧啶的合成。

(8)敲除了amiL-苯甲酸辅酶A合成酶基因，获得的突变株AM1007不再生产友菌素(1)，但积累友菌素类似物cytosamine(2)和4-乙酰氨基-3-羟基-苯甲酸(3)，初步证明了AmiL参与友菌素的生物合成中对氨基苯甲酸辅酶A的形成。

(9)敲除了amiP-TetR家族转录调节因子基因，获得的突变株AM1008仍能生产友菌素(1)，同时积累友菌素类似物9和10，初步证明了AmiP参与友菌素的生物合成中末端氨基酸合成酶的调控作用。

(10)敲除了amiR-丙酰辅酶A载体蛋白酰基转移酶基因，获得的突变株AM1009不再生产友菌素(1)，但积累新友菌素类似物4和5，证明了AmiR参与友菌素的生物合成中末端氨基酸的组装。

(11)敲除了amiS-丝氨酸羟甲基转移酶基因，获得的突变株AM1010仍能生产友菌素(1)，但积累新友菌素类似物9，10和11，证明了AmiS参与友菌素的生物合成中丙氨酸的羟甲基化。

(12)敲除了amiT-非核糖体肽合成酶(NRPS)基因，获得的突变株AM1012不再生产友菌素(1)，但积累友菌素类似物10，证明了AmiT参与友菌素的生物合成中末端氨基酸的组装。

以下进一步提供实施例，这些实施例有助于理解本发明，仅用作说明而不限制本发明的应用范围。

实施例1

友菌素产生菌酒红土褐链霉菌NRRL 2363总DNA的提取：

将酒红土褐链霉菌NRRL 2363的新鲜菌丝体按照5％的接种量接种于50ml的YMS培养基(酵母抽提物4g，麦芽抽提物10g，可溶性淀粉4g，加水至1L，pH 7.2-7.4)中，28-30℃培养，振荡培养约36-40小时，4000rpm离心10分钟收集菌体。向收集的菌体中加入10ml裂解液(Tris-Cl 25mM，EDTA25mM，pH8.0，含溶菌酶4mg/ml，0.05mg/ml RNA酶)，涡旋均匀，37℃温浴0.5-1小时，加入终浓度0.5-1mg/ml蛋白酶，1％SDS，混匀，50℃水浴约2小时，待溶液澄清。置于冰上冷却，加入1/10体积的3M KAc，冰上冷却。加入等体积的中性饱和酚，轻柔混匀，4000rpm离心15分钟，然后用剪过的大口径枪头吸取上清到新的离心管中，用同样的方法用酚反复处理3次，然后用氯仿洗两次，4000rpm，4℃离心10分钟。用剪过的大口径枪头将水相吸出转移至新的离心管，加2倍体积的无水乙醇，混匀沉淀DNA，12000rpm，4℃离心20分钟。用70％乙醇洗涤两次，将液体倾出，在37℃下略微烘干，加5mL TE溶解，得到酒红土褐链霉菌NRRL 2363的总DNA。

实施例2

友菌素生产菌酒红土褐链霉菌NRRL 2363基因组文库的建立：

首先通过一系列的稀释实验来确定Sau3AI的用量，在此基础上大量通过Sau3AI部分酶切得到的DNA片段略大于40kb，脱磷。载体pOJ446先用Xba I从多克隆位点处切开然后用去磷酸化酶脱磷，然后再从多克隆位点处用BamH I切开，获得两个臂，与制备的基因组部分酶切的40kb的DNA片段连接过夜。从-80℃冰箱中取出包装混合物(Gigapack III XLpackaging kit，Stratagene公司)置于冰中，将包装混合物在指间迅速融化，在刚刚开始融化时加入4μl的连接产物，用枪混匀，22℃放置2小时，加入500μl SM缓冲液(5.8g NaCl，2.0gMgSO₄，50mL 1M pH 7.5 Tris-HCl，5mL 2％(w/v)明胶)，再加入50μl氯仿，轻轻混匀，离心机离心5秒，出现沉淀，得包装液，于4℃保存。将冻存于-80℃的菌株E.coli LE392涂布在LB培养基上复苏，取单克隆接种于LB培养基中(添加0.2％麦芽糖和10mM MgSO₄)，于37℃，200rpm振荡培养4-6个小时，其OD₆₀₀约为1时，500g，10分钟收集菌体，用以前体积一半的10mM MgSO₄稀释菌体至OD₆₀₀＝0.5，取25μl的上述菌体和25μl已经处理好的10倍稀释包装液轻轻混匀，于室温下放置30分钟，然后加入200μl LB液体，37℃摇1个小时，每隔15分钟轻轻晃动，收集菌体，涂布于含50μg/ml阿普拉霉素的LB平板上，将长出来的单个克隆子，用牙签点种于20块含50μg/ml阿普拉霉素的LB的96孔板上，长好后，加入终浓度为20％的甘油，混合均匀，置于-80℃保存。

根据次级代谢产物对氨基苯甲酸(PABA)合成酶的保守序列设计简并性引物PABA-2F：5′-GGG VGT SCA GTT CCM MCC SGA GTC-3′和PABA-5R：5′-CAG GTC GAC GAT CATSAG GTT CTC GGC-3′，从酒红土褐链霉菌(Streptomyces vinaceus-drappus)NRRL 2363基因组中扩增到一个1.1kb的DNA片段，经克隆到T载体并测序确认了该片段与上述PABA合成酶有一定的相似性，从而暗示克隆到的基因片段很有可能参与了友菌素中对氨基苯甲酸结构域的生物合成。以PABA-2F和PABA-5R为筛选引物，从酒红土褐链霉菌NRRL 2363基因组文库约2000个克隆中，利用PCR成功筛选到9个阳性柯斯质粒。将其中的阳性克隆pCSG3104通过原生质体转化到异源宿主变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)TK64中表达时，该重组异源宿主能够产生友菌素及其类似物(图3A，II)，表明pCSG3104包含了友菌素生物合成所必须的全部基因，测序，其序列如SEQ ID NO.1所示。作为对照，将空载体pOJ446通过原生质体转化到异源宿主变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)TK64中表达时，无友菌素及其类似物产生(图3A，I)。

实施例3

友菌素产生菌酒红土褐链霉菌NRRL 2363遗传转移系统的建立及基因中断突变菌株的获得：

amiB基因敲除突变株(AM1002)的获得

对pCSG3104进行酶切，获得系列亚克隆pCSG3201-3207(图2B)。利用PCR-targeting的方法获得体外敲除突变株。根据获得的友菌素的生物合成基因簇序列，参照文献报道的PCR-targeting系统，设计一对amiB基因的敲除引物，引物序列见于表2中的amiB基因敲除引物。然后参照PCR-targeting的方法构建体外敲除质粒然后转入到结合转移的供体菌中。具体步骤如下：(1)将cosmid质粒pCSG3202转入大肠杆菌E.coli BW25113/pIJ790中得到E.coliBW25113/pIJ790/pCSG3202，用10mmol/L的L-阿拉伯糖诱导λ/red重组系统表达，并将其制备成为电转感受态细胞待用。(2)用内切酶EcoR I和Hind III酶切质粒pIJ773，接着回收约1.4kb含有转移原点和阿泊拉霉素抗性基因的DNA片段，以此作为PCR模板，用引物AmiBDF和AmiBDR通过PCR扩增出1.4kb的PCR产物，50μl的PCR反应体系：高保真DNA聚合酶3U，10×Buffer 5μl，dNTPs 0.5mmol/L，DMSO 2.5μl，引物各0.5μmol/L，DNA模板约1ng，加水至50μl。PCR反应条件为：预变性94℃ 5min；扩增循环为94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸90s，30个循环；最后72℃延伸10min。将1.4kb的PCR产物回收纯化待用。(3)将PCR产物电转入(1)步骤中制备的感受态细胞使其发生重组，用LB筛选平板(含100μg/ml氨苄青霉素，50μg/ml卡那霉素，50μg/ml阿泊拉霉素)上于37℃过夜培养，从平板上挑出阳性单克隆，抽提质粒，命名为pAM1002，该质粒中的amiB基因的部分片段被转移原点和阿泊拉霉素抗性基因取代。(4)将构建好的该重组突变质粒电转到E.coliET12567/pUZ8002中，构建成E.coli ET12567/pUZ8002/pAM1002，作为接合转移的供体菌。

将含有E.coli ET12567/pUZ8002/pAM1002接种于含氨苄青霉素(50μg/mL)和阿泊拉霉素(25μg/mL)的3mL LB培养基中37℃培养过夜，转接500μL过夜培养菌于50ml含氨苄青霉素(50μg/mL)和阿泊拉霉素(25μg/mL)的SOB培养基中，37℃，200rpm，摇3-4h，使OD₆₀₀达到0.4左右，4℃，4000rpm离心5min，去培养基，用30mL不含抗生素的LB培养基洗细胞两次，抗生素的存在会抑制链霉菌的生长，洗两次后将细胞重悬于1ml LB培养基中。当洗大肠杆菌细胞时，收集酒红土褐链霉菌NRRL 2363孢子，并于500μl 2×YT中，50℃热击10min，冷至室温，取0.5ml大肠杆菌细胞悬液(供体菌)与0.5ml热击孢子混合，短暂离心，倒出大部分上清，用剩下的约100μl上清重悬沉淀，涂于含100mM MgCl₂的ISP2培养基(不含抗生素)中，30℃培养16-24h，用1ml含0.5g萘啶酮酸或TMP(20μl 25mg/ml储液，可选择性杀死细菌)和1.25mg阿泊拉霉素(25μl 50mg/ml储液)的水覆盖平板，继续于30℃培养，将生长出的单克隆挑入新的含萘啶酮酸(25ug/ml)或TMP和阿泊拉霉素(50ug/ml)的平板上生长，待菌落长大时，将其分别接种到含50μg/ml阿泊拉霉素的2.5ml YMS(或者ISP2)液体培养基中，于28℃，200rpm培养1-2天。抽取各个突变株的基因组DNA，用检测引物做诊断PCR来判断其是否为双交换突变株，检测引物序列见于表3中的amiB的检测引物序列，通过PCR检测获得阳性克隆，即获得amiB基因敲除突变株(AM1002)。

其他各个基因的灭活引物和检测引物参见表2和表3，参照上述方法，利用PCR-targeting技术获得各个基因敲除的突变菌株。

实施例4

友菌素产生菌酒红土褐链霉菌NRRL 2363及其突变株的生物发酵、产物分离纯化和鉴定：

友菌素野生型菌株及其突变株的发酵培养，均采用专用发酵培养基(按总质量分数100％计，葡萄糖2.5％，酵母提取物0.25％，大豆粉0.7％，硫酸铵0.5％，碳酸钙0.8％，氯化钠0.4％，磷酸二氢钾0.04％，余量为水)。首先将相应菌种接入上述种子培养基中，28℃，200rpm，培养2d制得种子培养液；随后，按照体积比1∶10的比例转接，28℃，200rpm，继续培养5～6d。

发酵完成后，将发酵液离心，分为上清和菌体两部分，上清直接用正丁醇萃取3-4次，菌体先用甲醇浸提，再用正丁醇萃取，两部分萃取完后合并获得粗浸膏。随后通过正向硅胶柱色谱，凝胶柱色谱，反相中压柱色谱等分离方法将粗浸膏进行分离纯化，分离过程中主要采用HPLC检测，HPLC法使用Varian高效液相色谱仪，色谱柱Phenomenex，150×4.6mm，ODS5u，菲罗门科学仪器有限公司生产。柱温：室温；洗脱剂：A相，乙腈∶水∶三氟乙酸(体积比10∶89.2∶0.8)；B相，乙腈∶水(体积比90∶10)；流速：1.0mL·min^-1；检测波长：210nm，254nm，操作程序：0-15min，从100％A/0％B到60％A/40％B线性洗脱；15-18min，从60％A/40％B到20％A/80％B线性洗脱；18-19min，从20％A/80％B到100％A/0％B线性洗脱；19-25min，用100％A/0％B进行恒梯度洗脱。各单体化合物通过一维¹H，¹³C和二维HSQC、¹H-¹H Cosy以及HMBC核磁共振谱确定其结构。

实施例5

友菌素生物合成基因簇的应用-对生物合成基因的遗传修饰获得结构类似物：

通过实施例3和4中所描述的方法，对友菌素的生物合成基因簇中的一系列基因进行了敲除获得了一系列的化合物，并进行了结构鉴定，结果如下：(1)敲除orf(-1)获得突变株AM1001，仍然生产友菌素(1)；(2)敲除orf1获得突变株AM1011，仍然生产友菌素(1)；(3)敲除amiB获得突变株AM1002，不再生产友菌素(1)，也不积累友菌素类似物；(4)敲除amiF获得突变株AM1003，生产友菌素类似物2和3；(5)敲除amiG获得突变株AM1004，生产新友菌素类似物4和5；(6)敲除amiH获得突变株AM1005，产生3个新友菌素类似物6，7和8；(7)敲除amiI获得突变株AM1006，不再生产友菌素(1)，也不积累友菌素类似物；(8)敲除amiL获得突变株AM1007，不产生友菌素1，但积累友菌素类似物化合物2和3；(9)敲除amiP获得突变株AM1008，仍能生产友菌素(1)，同时积累友菌素类似物9和10；(10)敲除amiR获得突变株AM1009，产生友菌素类似物4和5；(11)敲除amiS获得突变株AM1010，仍能生产友菌素(1)，同时积累友菌素类似物9，10和11；(12)敲除amiT获得突变株AM1012，不再生产友菌素(1)，但积累友菌素类似物10。(图6)

实施例6

突变株AM1006在制备4-乙酰氨基-3-羟基-苯甲酸(3)中的应用：

将对氨基苯甲酸(PABA)加入到突变株AM1006的培养液中，PABA能够被突变株AM1006转化为4-乙酰氨基-3-羟基-苯甲酸(3)。当PABA添加浓度为1mM时，大部分PABA转化为3，当PABA添加浓度为10mM时，部分PABA转化为3。(图7)

实施例7

糖基转移酶AmiG的生化反应及其在获得友菌素结构类似物中的应用：

应用PCR方法从酒红土褐链霉菌NRRL 2363的基因组DNA中扩增获取了amiG基因，采用高保真酶Pyrobest和引物对为5’-CGCCGCATATGAACATTCTTTTCGTA-3’(NdeI)，5’-GCATCGGATCCTTCGGCATTG-3’(EcoRI)，经NdeI和EcoRI酶切后，连入表达载体pET28a，形成表达质粒pCSG3247。含有pCSG3247质粒的大肠杆菌BL21(DE3)在LB培养基中于37℃培养至OD₆₀₀为0.7左右，然后加入终浓度为0.1mM的异丙基-beta-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)，继续在20-25℃培养4-5小时诱导蛋白表达。所获取的细胞重悬于缓冲液(300mMNaCl，50mM磷酸盐缓冲液，10mM咪唑，pH 7.4)中，利用超声波破碎法释放内容物。重组AmiG的分离纯化利用快速蛋白质液相色谱层析法完成，纯化后的蛋白，其电泳图如图8所示。具体而言，细胞破碎后的上清液加入到1ml规格的HisTrap柱中，然后用10-500mM的咪唑溶液洗脱。纯化后的蛋白通过PD-10柱脱盐，于-80℃保存在含有1mM二硫苏糖醇(DTT)的50mM磷酸钠盐缓冲液中。

100μL的AmiG的反应液一般包括100μM化合物1(或者4，6，7，9，10)，5μM AmiG和1mM TDP(或者UDP，UDP-葡萄糖，TDP-葡萄糖)，缓冲液为50mM MOPS缓冲液(pH 6.5)，在30℃培养12小时。反应液用3倍体积的乙酸乙酯萃取抽干后，残留物溶解于甲醇并利用高压液相分析。结果表明，如图9和10所示，AmiG可以在TDP(或UDP)存在的情况下，经过逆反应催化化合物1，6，7，9和10的脱糖反应，分别形成4和12。同时，化合物4和TDP-葡萄糖(或UDP-葡萄糖)经AmiG催化可形成新化合物13。另外，化合物4和10同时存在的情况下，AmiG可先经逆反应催化10形成12和TDP-amosamine，该核苷糖又可由AmiG添加到化合物4上形成1。

Claims (6)

1.一种友菌素的生物合成基因簇，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1的第7917位到34889位的碱基序列所示。

2.权利要求1所述的友菌素的生物合成基因簇在制备友菌素及其类似物中的应用。

3.权利要求1所述的友菌素的生物合成基因簇在制备脱氧糖amosamine中的应用。

4.权利要求1所述的友菌素的生物合成基因簇在制备脱氧糖amicetose中的应用。

5.权利要求1所述的友菌素的生物合成基因簇在制备褶皱菌素及其类似物中的应用。

6.权利要求1所述的友菌素的生物合成基因簇在制备正褶皱菌素及其类似物中的应用。

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