KR920006350B1 - 항생물질 생산력의 증진 방법 - Google Patents
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Abstract
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Description
제1도는 타일로신 생합성 경로.
제2도는 플라스미드 pHJL 280의 제한부위 및 기능 지도.
제3도는 플라스미드 pHJL 284의 제한부위 및 기능지도.
제4도는 플라스미드 pHJL 309의 제한부위 및 기능지도.
제5도는 플라스미드 pHJL 311의 제한부위 및 기능지도.
제6도는 플라스미드 pHJL 315의 제한부위 및 기능지도.
제7도는 타일로신 생합성 유전자의 염색체 구성.
본 발명은 항생물질-생산 유기체의 항생물질-생산력을 증진시키는 신규한 방법을 제공한다. 본 방법은 목적하는 항생물질의 생합성 경로에서 속도-제한적인 유전자 생성물의 발현물을 암호화하는 DNA 서열로 미생물 숙주를 형질전환시키는 단계를 포함한다. 본 발명은 또한 항생물질 생합성 유전자 생성물을 암호화하는 관련 DNA 서열, 재조합 DNA 발현 벡터, 및 형질전환된 미생물 숙주 세포를 제공한다.
본 발명은 스트렙토마이세테스(strepto-mycetes)와 같은 항생물질-생산 유기체에서 재조합 DNA 기술의 이르고도 상당히 상업적인 이용에 관한 것이다. 본 발명 이전에는 재조합 DNA 기술의 개발 및 이용이 이.콜라이(E.coli) 및 몇몇 경우에는 포유류 세포에서 특수한 폴리펩타이드를 발연시키는 것에 대부분 한정되어 있었다. 이 진보는 사람 인슐린 A 및 B쇄, 사람 프로인슐린, 사람 성장 호르몬, 사람 단백질C, 사람조직 플라스미노겐 활성자, 소의 성장 호르몬, 및 잠재적 가치가 있는 수 개의 기타 화합물과 같은 이종 유전자 생성물을 비교적 간단하게 발현시키도록 하고 있다. 각 경우에 있어서, 이종 유전자 발현은 다소 독립적이고, 상호 작용하지 않으며, 간섭하지 않거나 또는 적절한 생합성 경로를 변화시키지 않는다. 재조합 DNA 기술은 현재 항생물질 또는 항미생물 전구 물질의 증가된 수득량을 발현시키기 위한 특정 생합성 경로를 개선시키는데 응용할 수 있다.
스트렙토마이세테스 및 기타 항생물질-생산 유기체에 응용된 대부분의 재조합 DNA 기술은 클로닝 벡터의 개발에 한정되어 있다. 초기의 시도들은 루이저(Reusser)의 미합중국 특허 제 4,332,898호 및 마니스(Manis) 등의 미합중국 특허 제 4,273,875호, 제 4,332,900호, 제 4,338,400호 : 및 제 4,340,674호의 내용들이다. 스트렙토마이세테스의 형질전환은 이들 초기의 참조물에는 기술되거나 또는 교시되어 있지 않다. 항생물질-생산 유기체 용으로 커다란 잠재력을 보이는 개량된 벡터들은 예를들면 미합중국 특허 제 4,513,086호에 훼이어맨(Fayerman)등, 및 미합중국 특허 제 4,513,085호와 제 4,416,994호에 나까쯔가사(Nakatsukasa)등이 기술하고 있다. 이들 개량된 벡터들은 스트렙토마이세데스에서 선별적이고, 중요한 주요 스트렙토마이세스(streptomyces) 균주를 형질전환 시키는데 사용될 수 있으며, 더욱 복잡한 유전자 클로닝 실험을 수행하는데 필요한 도구를 구성하는 마커(marker)들을 함유한다. 그와 같은 하나의 실험이 최근 흡우드 등에 의해 보고되었다(Hopwood et al, 1985,in Nature 314 : 642). 비록 흡우드 등은 신규한 하이브리드 항생물질 색소의 생산을 보고하였으나, 그 내용은 특정 숙주 세포의 항생물질-생산력 또는 생합성 효율을 증가시키는 면에 촛점을 두고 있는 것이 아니라 대신에 하나의 스트렙트마이세스 균주로부터 다른 균주로 악티노로딘 색소 생합성 유전자의 전이를 기술하고 있다.
본 발명은 재조합 DNA 기술을 스트렙로마이세테스 및 기타 항생물질-생산 유기체에 상업적 적용이 가능토록 하기 때문에 특히 유용하다. 임상적으로 중요한 항생물질의 반 이상이 스트렙토마이세테스에 의해 생산되기 때문에 이들 유기체에 응용할 수 있는 방법을 개발하는 것이 특히 바람직하다. 본 발명은 그와같은 방법을 제공하며, 항생물질-생산력을 증진시킬 뿐만 아니라 항생물질-생산 유기체에서 새로운 항생물질 및 항생물질 전구체의 생산을 위한 유전자 클로닝을 가능하게 한다.
본 발명의 목적을 위해 하기 용어들은 정의된 바와같다 : 항생물질-천연적으로 또는 제한된 화학적 변형에 따라 다른 미생울 또는 진핵 세포의 성장을 억제하거나 저지, 또는 사멸시키는 미생물에 의해 생산되는 물질.
항생물질 생합성 유전자-효소적 활성을 암호화 하거나, 또는 효소적 활성의 발현을 조절하고 1차 대사산물을, 항생물질 활성을 소유할 수도 있는 항생물질 중간체, 및 이어서 항생물질로 전환시키기 위한 효소적 반응에 필요한 생성물을 암호화하는 DNA 절편.
항생물질 생합성 경로-1차 대사산물을 항생물질 중간체 및 이어서 항생물질로 전환시키는 공정에 필요한 항생물질 생합성 유전자 및 생화학적 반응의 전부.
항생물질 생산 미생물-항생물질을 생산하거나, 발현시킬 경우 항생물질을 생산할 유전자를 함유하는, 예를들면 이에 한정되는 것은 아니나 악티노플라네스(Actinoplanes), 악티노마두라(Actinomadura), 바실러스(Bacillus), 세팔로스포리엄(Cephalosporium), 마이크로모노스포라(Micromonospora), 페니실리엄(Penicillium) 및 스트랩트마이세스를 위시한 특정 유기체.
항생물질 내성 부여 유전자-항생물질에 대한 내성을 부여하는 활성을 암호화하는 DNA 절편.
ApR-암피실린 내성 표현형 또는 이를 부여하는 유전자.
숙주 세포-재조합 DNA 클로닝 벡터로 형질전환시킬 수 있는 유기체 및 생존 가능한 그의 원형질체.
NmR-네오 마이신 내성 표현형 또는 이를 부여하는 유전자.
항생물질 생합성 경로의 조작-항생물질 생합성 유전자의 발현 및 1차 대사산물올 항생물질로 전환시키는데 필요한 관련 생합성 반응.
재조합 DNA 클로닝 벡터-이에 한정되는 것은 아니나 플라스미드 및 페이지를 위시하여, 부가적인 DNA를 가할 수 있거나 이미 가한 DNA 분자를 함유하는 특정의 선별적이고도 자가 복제성 또는 염색체결합성인 제제.
rep-도면에 사용된 바와같이 스트렙토마이세스 플라스미드의 복제 기원.
제한 단편-하나 또는 다수의 제한효소 작용에 의해 생성된 특정의 선형 DNA.
감수성 숙주 세포-특정의 항생물질 존재하에서 그에 대한 내성을 부여하는 DNA 절편없이 생육할 수 없는 숙주 세포 및 그의 생존 가능한 원형질체.
형질전환체-형질전환을 한 수용 숙주 세포 및 그의 생존 가능한 원형질체.
형질전환-DNA를 그의 생존 가능한 원형질체를 위시한 수용 숙주 세포에 유입시켜 수용 세포의 유전형을 변화시킴.
tsr-티오스트립톤(thiostrepton) 내성 표현형 또는 이를 부여하는 유전자.
도면에 언급되어 있는 플라스미드 및 염색체 지도들은 척도를 대략적으로 도해하였다. 그러나 비록 연결되어 있기는 하나 타일로신(tylosin) 생합성 유전자는 DNA 의 큰 절편에 걸쳐 분산되어 있다. 그러므로 상세한 제한부위 지도 자료는 큰 타일로신 생합성 유전자-함유 DNA 단편의 작은 영역에 대해서만 존재한다. 지도는 특정 제한효소의 모든 절단부위를 필수적으로 전부 기록하진 않았다. 지도상에서 선 절편으로 표기된 독립적인 유전자의 위치는 지도를 삭제하여 결정하였으므로 특정 유전자의 정확한 위치를 대략 가리키고 있다.
본 발명은 생합성 경로의 속도-제한 효소의 발현물 또는 유전자 생성물을 암호화하는 항생물질 또는 항생물질-전구체 생합성 유전자를 함유하는 DNA 클로닝 벡터 또는 그의 일부로 형질전환된, 생합성 경로에 의해 항생물질 또는 항생물질 전구체를 생산하는 미생물을 세포 성장, 항생물질 또는 항생물질-전구체 생합성 유전자의 발현 및 항생물질 또는 항생물질-전구체의 생산에 적합한 조건하에, 단 배양 방법이 미생물의 항생물질-생산력을 증가시키도록 배양함을 특징으로 하여 항생물질-생산 미생물의 항생물질-또는 항생물질 전구체-생산력을 증진시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 관련 항생물질 생합성 유전자, 재조합 DNA 클로닝 벡터, 및 이 유전자와 벡터로 형질전환된 항생물질 또는 항생물질 전구체-생산 미생물을 제공한다.
또한 DNA 클로닝 벡터 또는 그의 일부가 항생물질 생합성 경로의 속도-제한 효소의 발현물 또는 유전자 생성물을 암호화하는 항생물질 생합성 유전자를 함유하여, 여기에서 상기 항생물질 생합성 유전자는 미생물의 항생물질-생산력을 증진시키는 발효 조건하에서 발현됨을 특징으로 하여, 상기 DNA 클로닝 벡터 또는 그의 일부로 형질전환시킨, 항생물질 생합성 경로를 통해 항생물질 또는 항생물질 전구체를 생산하는 미생물을 탄소, 질소 및 무기염의 동화성 공급원을 함유하는 배양 배지에서 호기성 발효 조건하에 배양시킴으로써, 항생물질, 항생물질 전구체 또는 약제학적으로 허용되는 그의 염을 제조하는 방법이 제공된다.
본 발명의 방법은 모든 항생물질-생산 유기체에 광범위하게 응용할 수 있다. 하기 도표는 본 발명을 응용할 수 있는 항생물질 생산 유기체를 수록한 것이나 전부를 수록한 것은 아니다.
[표 I]
아미노사이클리톨(aminocyclitol) 항생물질-생산유기체
[표 Ⅱ]
안사마이신(Ansamycin) 항생물질-생산유기체
[표 Ⅲ]
안트라사이클린(Anthracycline) 및 퀴논(Quinone)항생물질-생산유기체
[표 Ⅳ]
β-락탐 항생물질-생산 유기체
[표 Ⅴ]
마크롤라이드(Macrolide), 린코사마이드(Lincosamide) 및 스트렙토크라민(Streptogramin) 항생물질-생산유기체
[표 Ⅵ]
여러가지 항생물질-생산 스트렙토마이세스
[표 Ⅶ]
뉴클리오사이드 항생물질-생산 유기체
[표 Ⅷ]
[표 Ⅸ]
폴리에테르 항생물질-생산 유기체
본 발명은 1차 대사산물을 항생물질로 전환시키는 화학적 반응을 촉매하는 효소를 암호화하는 유전자로 항생물질-생산 미생물을 형질전환시킴에 의해 아주 잘 예시되고 있다. 그와 같은 효소의 하나인 마크로신 o-메틸 전이효소는 타일로신 생합성의 최종 단계를 촉매한다. 타일로신-생산 미생물을 tylF로 표기되는 마이크로신 o-메틸전이효소-암호화 유전자로 현질전환시켜 형질전환된 세포에서 tylF 유전자 생성물의 증산이 관찰되는 개선된 타일로신 생합성 경로를 산출한다.
따라서 본 발명은 또한 생합성 경로의 속도-제한 효소의 발현물 또는 유전자 생성물을 암호화하는 타일로신 또는 타일로신-전구체 생합성 유전자를 함유하는 DNA 클로닝 벡터 또는 그의 일부로 형질전환시킨, 생합성 경로에 의해 타일로신 또는 타일로신 전구체를 생산하는 미생물을, 세포 성장, 타일로신 또는 타일로신-전구체 생합성 유전자의 발현 및 타일로신 또는 타일로신 전구체의 생산에 적합한 조건하에서, 단 배양 방법이 미생물의 타일로신- 또는 타일로신 전구체-싱산력을 증진시키도록 배양시킴을 특징으로 하여 타일로신-생산 미생물의 타일로신 또는 타일로신 전구체-생산력을 증진시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 유기체의 항생물질-생산력을 증진시키기 위해 항생물질 생합성 유전자를 활용하고 있다. 관련 문헌에 소수의 항생물질 생합성 유전자가 클론화되고, 특성 확인되며, 기술되어 있다. 항생물질 생합성 유전자의 단리 방법이 개발되어 있으나, 특히 바람직한 한가지 방법이 볼쯔(Baltz)등이 1985년 6월 7일 출원한 미합중국 특허원 제742,349호(유럽 특허원 제86304239.6호에 해당)에 기술되어 있으며, 이는 본 원에 참조로서 인용되어 있다. 본 방법의 특별한 예시에 사용된 본 타일로신 항생물질 생합성 유전자는 우선 문헌[Fishman et al., 1985, J. Bacteriology 161 : 199-206]에 기술된 방법에 따라 구성된 λ도서관(library)으로부터 단리한다.
타일로신 생합성 경로의 도식적인 대표적 실례가 제1도에 있다 ; 제1도에서 화살표는 하나 또는 다수의 타일로신 생합성 유전자 생성물에 의해 촉매되는 단계를 나타낸다. 각 전환에 관계된 유전자(들)는 각 화살표 위에 지시되어 있다. 각 유전적 표기는 동일한 표현형에 기여하는 유전자의 부류를 나타낸다. 다수의 발현 벡터가 본 발명을 예시하기 위해 사용되었다. 이들 벡터는 하나 또는 다수의 타일로신 생합성 유전자를 함유하며, NRRL(Northern Regional Reserarch Laboratories, Peoria, Illinois 61604)로부터 수득할 수 있다. 표 X는 본 발명의 방법을 예시하기 위해 사용된 플라스미드 각각을 간단히 설명하고 있다.
[표 Ⅹ]
타일로신 생합성 유전자를 함유하는 플라스미드
변이 타일로신 생합성 유전자를 가지며 따라서 그들이 유도된 균주보다 타일로신을 덜 만드는 다수의 스트렙토마이세스 프라디아에(Streptomyces fradiae) 균주가 기술되어 있다. 표XI는 이들 변이 균주를 간단히 설명하고 있다.
[표 ⅩI]
타일로신 생합성에서 결핍성인 스트렙토마이세스 프라디아에
* ATCC는 메릴랜드 20852, 록빌 소재의 American Type Culture Collection이고,
NRRL은 일리노이즈 61604, 페오리아 소재의 Northern Regional Research Laboratory이다.
플라스미드 pHJL 280[Escherichia coli K12 HB101/pHJL 280, 기탁기관 ; KFCC(한국종균협회), 기탁번호 ; KFCC-10419, 기탁일 : 1987년 9월 1일]", pHJL 284[Escherichia coli K12 HB101/pHJL 284, 기탁기관 ; KFCC, 기탁번호 ; KFCC-10420, 기탁일 1987년 9월 1일] 및 pHJL 315[Escherichia coli K12 HB101/pHJL 315, 기탁기관 ; KFCC, 기탁번호 ; KFCC-10423, 기탁일: 1987년 9월 1일]를 스트렙토 마세스 프라디아에 GS 15[기탁기관 ; KFCC, 기탁번호 ; KFCC-10424, 기탁일 ; 1987년 9월 1일] 및 스트렙토마이세스 프라디아에 GS 28[기탁기관 ; KFCC, 기탁번호; KFCC-10426, 기탁일 ; 1987년 9월 1일]을 형질전환시키는데 사용하였다. GS 15 및 GS 28은 에스.프라디아에 C4(S. fradiae C4)를 나이트로소 구아니딘 돌연변이시켜 수득한다. 에스. 프라디아에 C4는 에스.프라디아에 T59235(ATCC 19609)를 돌연변이시켜 유도한다. G5 15 균주는 C4 균주에 비해 타일로신을 거의 만들지 못하고, GS 28 균주는 타일로신을 소량 만든다. GS 15 및 GS 28 균주의 감소되거나 전혀 존재하지 않는 타일로신-생산력은 마이크로신 o-메틸전이효소(MOMT)를 암호화하는 tylF 유전자에 대한 변이의 결과로 믿어진다. 타일로신 생합성 경로에서 마크로신을 타일로신으로 전환시키는데 필요한 MOMT 효소는 타일로신-생산 균주에서 자주 반응 속도-제한량으로 존재한다. 플라스미드 pHJL 280, pHJL 284 및 pHJL 315는 tylF 생합성 유전자의 카피수(copy number) 및 또한 타일로신 생합성에 이용되는 마크로신 o-메틸전이효소의 농도를 증진시키는 수단을 제공하여 이 반응 제한성을 제거한다. 따라서 에스.프라디아에 GS15/pHJL 280, 에스.프라디아에 GS15/pHJL 284, 에스.프라디아에 GS 15/pHJL 315, 에스. 프라디아에 GS 28/pHJL 284, 에스.프라디아에 GS 28/pHJL 280 및 에스.프라디아에 GS 28/pHJL 315를 72시간 동안 발효시키면 마크로신 o-메틸전이효소의 생산이 C4 균주에서 생산된 것보다는 약 2 배 내지 6배 증가되고 GS 28 균주에서 생산된 것보다는 약 120배 증가된다.
플라스미드 pHJL 280을 또한 사용하여 검출한계 이하로 타일로신을 생산하고 C4 균주의 돌연변이에 의해 유도된 (1) 스트렙토마이세스 프라디아에 GS 16[기탁기관; KFCC, 기탁번호 ; KFCC-10425, 기탁일 ; 1987년 9월 1일] ; (2) 에스.프라디아에 GS 48[기탁기관 ; KFCC, 기탁번호 ; KFCC-10427, 기탁일 ; 1987년 9월 1일] ; (3) 에스.프라디아에 GS 76[기탁기관 ; KFCC, 기탁번호 ; KFCC-10429, 기탁일 ; 1987년 9원 1일] 및 에스.프라디아에 GS 88을 형질전환시켰다. 비형질전환된 균주 GS 16, GS 48, GS 76 및 GS 88은 각각 (1) tylE, 디메틸마크로신 o-메틸전이효소 ; (2) 6-디옥시-D-알로오스의 첨가 또는 생합성에 필요한 tylD효소 ; (3) 타일락톤의 C-23 메틸 위치의 산화에 필요한 tylH 효소; 및 (4) tylJ 효소의 결함 효소 또는 속도-제한량을 생산한다. 비형질전환된 균주 GS 16, GS 48, GS 76 및 GS 88은 각각 목적하는 타일로신 항생물질 화합물 보다는 오히려 디메틸 마크로신, 디마이시노실 타일로신, 23-디옥시디아미노실 타일로신 및 디마이시노실 타일로신을 축적하는 경향이 있다.
플라스이드 pHJL 280은 비-결함 유전자를 제공할 뿐만 아니라 tylD, tylE, tyl H 및 tylJ 생합성 유전자의 카피수를 증가시키고 이들 유전자에 특이한 생성물의 세포내의 양을 증가시킴으로써 타일로신 생합성 경로의 효율을 증진시키는 방법을 제공한다. 그러므로 이용 가능한 tylE 유전자 생성물의 농도가 증가하면, 결과적으로 타일로신 생합성 경로에서 디메틸마크로신을 마크로신 내지 타일로신으로 전환시킬 수 있는 효소의 양을 증가시킨다. 마찬가지로 이용 가능한 tylD, tylH 및 tylJ 유전자 생성물의 농도가 또한 증가하면, 결과적으로 6-디옥시-D-알로오스 첨가 및 타일로신 전구체의 c-23 산화를 운용할 수 있는 효소의 증가된 양을 생산한다. 스트렙토마이세스 프라디아에 GS 16/pHJL 280, 에스.프라디아에 GS 48/pHJL 280, 에스.프라디아에 GS 76/pHJL 280 및 에스.프라디아에 GS 88/pHJL 280을 144-168시간 동안 발효시키면 타일로신의 수율이 비형질전환된, 타일로신 저생산성 변이 균주의 것보다 상당히 증가한다. 그와 같이 형질전환된 균주는 플라스미드 pHJL 280에 암호화된 특정 효소가 어버이 C4 균주보다 양이 많고, 따라서 본 발명을 또한 예시하고 있다. 플라스미드 pHJL 280은 tylD, tylE, tylF, tylH 또는 tylJ 유전자 생성을(또는 그들의 특정 배합)이 타일로신 합성에 대해 속도-제한량으로 존재하는 특정 미생물의 타일로신-생산력을 개선시키는데 사용할 수 있다.
플라스미드 pHJL 284를 또한 사용하여 마이카로스를 디-o-메틸락테노신에 첨가 또는 생합성하는데 필요한 효소를 반응-제한량으로 생산하는, C4 균주로부터 유도한 타일로신-저생산성 변이 균주인 스트렙토마이세스 프라디아에 GS 52를 형질전환시켰다. 스트렙토마이세스 프라디아에 GS 52의 타일로신 생합성 경로는 목적하는 타일로신 항생물질 화합물보다 오히려 데스마이코신(desmycosin)을 생산하는 경향이 있다. 플라스이드 pHJL 284는 비-결함 생합성 유전자를 제공하고 tylC 생합성 유전자의 카피수를 증가시킴으로써 이 회로의 합성 효율을 개선시키는 수단을 제공한다. 그러므로 형질전환된 균주에서 이용 가능한 tylC 유전자 생성물의 농도가 증가하면, 그 결과 목적하는 첨가 반응을 운용할 수 있는 효소의 생산이 향상된다. 따라서 스트렙토마이세스 프라디아에 GS 52/pHJL 284를 144-168시간 동안 발효시키면 타일로신 생산량이 형질전환된 변이 균주의 것보다 상당히 증가되며, tylC 효소량도 어버이 C4 균주에서의 것보다 높다. 플라스미드 pHJL 284는 또한 스트렙토마이세스 프라디아에 GS 88의 타일로신-생산력을 개선시키기 위한 본 방법에 사용되었고, 따라서, tylC, tylF 또는 tylJ 유전자 생성물(또는 그들의 특정 배합)이 타일로신 생합성에 대해 속도-제한량으로 존재하는 특정 유기체의 타일로신-생산력을 개선시키기 위한 본 방법에도 사용할 수 있다.
플라스미드 pHJL 309[Escherichia coli K12 HB101/pHJL 309, 기탁기관 ; KFCC, 기탁번호 ; KFCC-10421, 기탁일 ; 1987년 9월 1일]는 tylL 및 tylM 생합성 유전자를 함유하며, tylL 변이체인 스트렙토마이세스 프라디아에 GS 33 및 tylM 변이체인 Gs 62의 타일로신-생산력을 개선시키기 위한 본 방법에 사용된다. 플라스미드 pHJL 309는 또한 tylL 또는 tylM 유전자 생성물(또는 둘다)이 타일로신 생합성에 대해 속도-제한량으로 존재하는 특정 유기체의 타일로신-생산력을 개선시키기 위한 본 방법에 사용할 수 있다.
플라스미드 pHJL 311[Escherichia coli K12 HB101/pHJL 311, 기탁기관 ; KFCC, 기탁번호 ; KFCC-10422, 기탁일 ; 1987년 9월 1일]은 tylC, tylF, tylH, tylJ 및 tylK 생합성 유전자를 함유함으로 tylC변이체인 스트렙토 마이세스 프라디아에 GS 52 ; tylJ 변이체인 GS 88 ; tylF 변이체인 GS 15 및 GS 28 ; tylK 변이체인 GS 85의 타일로신-생산력을 개선시키기 위한 본 방법에 사용된다. 플라스미드 pHJL311은 tylC, tylF, tylH, tylJ 또는 tylK 유전자 생성물(또는 그들의 특정 배합)이 타일로신 생합성에 대해 속도-제한량으로 존재하는 특정 유기체의 타일로신-생산력을 개선시키기 위한 본 발명에 사용할 수 있다.
플라스미드 pHJL 315는 tylD, tyIE, tylF, tylH 및 tylJ 생합성 유전자를 함유함으로 tyID 변이체인 스트렙토마이세스 프라디아에 GS48 ; tylF 변이체인 GS88 ; tylE 변이체인 GS16 ; tylD 및 tylH 이중변이체인 GS76 ; 및 tylF 변이체인 GS15와 GS28의 타일로신-생산력을 개선시키기 위한 본 방법에 사용된다. 플라스미드 pHJL 315는 또한 tylD, tylE, tylF, tylH 및 tylJ 유전자 생성물(또는 그들의 특정 배합)이 타일로신 생합성에 대해 속도-제한량으로 존재하는 특정 유기체의 타일로신-생산력을 개선시키기 위한 본 방법에 사용할 수 있다.
이를 결과는 본 발명의 벡터들이 비형질 전환된 유기체에 비해 항생물질 생합성 경로에서 속도-제한적인 효소 또는 기타 유전자 생성물의 많은 양을 제공함으로써 항생물질-생산 유기체의 항생물질-생산력을 증진시킬 수 있을을 입증하고 있다. 그러나 항생물질-생산 숙주 세포에서의 플라스미드 유지가 때때로 항생물질 생산에 사용될 세포 에너지의 크나큰 낭비를 요구한다. 따라서 자가 복제 벡터로 형질전환된 특정 미생물은 비록 동일한 벡터가 다른 유기체의 항생물질-생산력을 증가시킬 수 있다 하더라도 사실상 항생물질-생산력에서 감소를 보여준다. 본 발명이 이론에 의해 어떤 식으로 묶이거나 제한되는 것을 원치 않으며, 이 분명한 예외는 아세테이트, 프로피오네이트, 말로닐-CoA, 메틸말로닐-CoA 및 글루코스와 같은 1차 대사산물로부터 특수한 효소의 작용에 의해 항생물질이 생산되는 사실로 설명될 수 있다. 이들 효소는 통상 유기체의 신속한 성장기중에는 존재하지 않으므로 생육 세포에서 필요한 화합물을 빼앗지 않는다. 성장이 영양 조건에 의해 제한되면 항생물질 생산 유전자가 활성화되어 특정의 1차 대사산물을 항생물질 생성물로 방향을 돌리는 효소의 합성을 유발시키는 것으로 믿어진다.
항생물질의 합성은 또한 항생물질의 생합성이 차단된 변이체가 생존성이고 항생물질-생산 어버이처렴 성장하기 때문에 항생물질-생산 유기체에서 없어도 되는 기능으로 믿어진다. 야생형 균주는 그 유기체에 선별적 장점을 제공하는데 확실히 적합한, 비교적 소량의 항생물질을 생산한다.
천연 단리물로부터 산업적 항생물질 생산 균주의 개발은 고도의 항생물질 생산성을 위한 많은 사이클의 변이 및 선별을 포함한다. 항생물질 합성은 1차 대사물 및 세포 에너지를 생육 및 유지 기능과는 무관하게 소모시키기 때문에, 고도의 항생물질 생산을 위한 선별은 유기체의 생존성을 희생시키면서 일어난다. 따라서 고도의 항생물질-생산성 균주의 생성은 세포를 생육-유지 기능 및 항생물질 생산 사이의 영양 및 에너지 공급원으로 아주 잘 균형시키는 단계를 포함한다. 이 세밀한 조절의 결과로서 고수율 생산 균주는 세포 생리학에 영향을 주는 인자들에 극도로 민감한 경향이 있다. 예를들면 자가 복제 벡터의 유입, 즉 현저한 다중 카피 플라스미드는 정상적으로는 많은 양으로 항생물질을 생산하는 유기체의 항생물질-생산력을 감소시키는 경향이 때때로 있다. 이 억제의 기작은 명백하지 않으나, 항생물질 전구체의 측정량이 이들 조건하에 축적되지 않는 것으로 보아 생합성의 초기 단계에서 발생하는 것 같다. 게다가 자가 복제 벡터는 DNA 또는 RNA 합성을 위한 전구체의 푸울(pool)을 소모하거나, 또는 높은 카피수에서 RNA 폴리머레이스, DNA 폴리머레이스, 폴리머레이스 활성자 또는 유전자 발현의 억제물과 같은 DNA 결합 단백질을 적정할 수 있다. 자가 복제 벡터의 또다른 빈번한 제한은 자연발생적 손실이다. 자연발생적 손실은 자주 발생하는 바와 같이 특히 벡터가 생육비를 감소시키는 경우 문제가 된다. 플라스미드 상에 내성 마커의 선택은 균일한 플라스미드-함유 개체의 성장을 확실하게 하나 또한 항생물질 발효의 미세한 생리학적 균형(이미 언급)을 파괴할 수 있다. 불안정한 플라스미드의 선택은 플라스미드를 상실해서 그결과 생육비가 감소된 세균을 사멸 또는 억제시켜 조작한다.
미생물의 항생물질-생산력상 간혹 관찰되는 자가 복제 벡터의 음성적 효과는 성장-유지 기능 및 항생물질 생산에 대한 불리하게 균형잡힌 고생산성 균주에서 가장 크다. 본 발명은 삽입된 플라스미드를 함유하는 형질전환된 세포의 식별을 용이하게 하도록 형질전환된 숙주 세포를 배양하는 방법을 제공하고, 또한 삽입의 검출을 용이하게하는 특성이 있는 벡터를 제공함으로써, 예전에는 인식치 못했던 고생산성 균주상에 미치는 자가 플라스미드 복제의 음성적 효과 문제를 극복하였다.
완성된 배양 방법의 선택은 고도로 선별되고 통상적으로 개량된 항생물질-생산 유기체의 항생물질-생산력을 개선함에 있어 중요하다. 항생물질-저생산력을 갖는 유기체 또는 균주는 융합 또는 자가 벡터 복제를 통해 형질전환으로 개선시킬 수 있다, 발효 기술 분야의 전문가들은 항생물질-생산력에서의 크나큰 개선이 항생물질-저생산성 균주에 본 발명을 응용할 경우 성취할 수 있음을 인지할 것이다.
플라스미드 DNA의 삽입은 특정한 항생물질-생산 균주 또는 그의 변이주를 표준 형질전환법에 따라 형질전환시키고, 형질전환체를 선별 또는 식별하며, 이어서 숙주 세포가 성장 및 복제하기 위해 플라스미드 DNA 서열의 존재를 필요로 하지 않는 조건하에 세포를 배양함으로써 용이하게 수행한다. 비선별적 조건하에서 수세대 이후 특정 세포는 더이상 유리 플라스미드 DNA를 함유하지 않는데, 이때 숙주 세포에 존재하는 플라스이드 DNA 서열을 선별 또는 식별함으로써 플라스미드 DNA가 세포의 염색체(제놈) DNA에 융합된 숙주 세포를 식별할 수 있다. 벡터 DNA를 융합시키기 위한 이 배양 기술은 형질전환된 숙주 세포에서 본래 불안정한 벡터와의 접합시 특히 유용하며, 따라서 벡터를 유지하기 위한 선택적 곤란없이 배양하여 플라스미드가 없는 분리체를 생성시킨다. 문헌[Bibb er al., 1980, Nature 384 : 526-531]은 벡터의 안정적 존속을 위해 필요한 DNA 서열이 기술되어 있으며, 이 안정성 서열이 결핍된 여러가지 벡터가 구성되어 있다.
예를들면 본 발명의 플라스미드를 구성하기 위해 사용된 클로닝 벡터 pH JL 210 및 pH JL 401은 이 안정 서열이 없다. 플라스미드 pHJL 210은 1984년 8월 10일 출원된 미합중국 특허원 제639,566호(유럽 공보제176199호에 해당)에 기술되어 있다. 플라스미드 pHJL 401은 1986년 3월 20일에 출원된 미합중국 특허원 제841,920호에 기술되어 있는데, 이 특허원은 1985년 8월 7일 출원된 제763,172호의 연속 출원이다(1986년8월 5일에 출원된 유럽 특허원 제86306011.7호에 해당). 언급한 "불안정성"은 플라스미드 유지를 위한 선택적 조건의 부재 상태에서 형질전환된 세포를 배양할 경우 이 세포에 의해 고빈도수로 상실되는 플라스미드를 지칭하는데, 예를들면 pHJL 210 및 pHJL 401과 같은 플라스미드는 선택적 조건을 형질전환된 숙주 세포에 적용했을때 매우 안정하다. 안정한 벡터로 형질전환시킨 숙주 세포를 선택적 조건의 부재하에 배양할경우, 벡터는 불안정 벡터에서 관찰된 고빈도로 상실되지 않으며, 비선택적 조건하에 생육한 후에도 자가 복제 플라스미드를 함유하는 다수의 세포에 의해 융합물의 식별이 곤란하게 된다. 융합물의 선별은 하기에 더욱 상세히 기술되고 있다. 일단 벡터 DNA가 숙주 세포의 염색체 DNA에 융합되면, 자가 복제 플라스미드에 의한 억제가 더이상 발생하지 않기 때문에 그 숙주 세포의 항생물질-생산력이 최대로 증가함을 관찰하게 된다.
클론화된 유전자를 함유하는 벡터를 생산 유기체의 제놈에 융합하는 것은 여러가지 방법으로 수행할 수 있다. 한가지 방법이 숙주 균주의 제놈에 융합할 수 있는 용원성 박테리오페이지 또는 기타 페이지의 사용이다. 다른 접근은 클론화된 유전자를 운반하는 플라스미드 벡터를 사용하고 클론화된 서열과 동종 염색체서열 사이의 단일 재조합 발생에 의해 재조합 플라스미드가 숙주 제놈에 삽입되었는지 선별하는 것이다. 벡터의 융합 빈도는 숙주 세포의 제놈 DNA에 동종성인 DNA를 벡터에 가함으로써 극적으로 증가시킬 수 있다. 사용된 "융합(intergration)"은 캠프벨 형(Campbell-type) 재조합으로 알려진 단일 재조합 결과 및 벡터와 염색체 사이에 유전정보의 교환을 초래하는 이중-교차 결과를 지칭한다. 이중-교차 재조합에서는 단지 벡터의 일부가 염색체 DNA에 융합된다.
예를를면 클론화된 타일로신 생합성 유전자(tyl)를 운반하는 플라스이드는 플라스미드 상의 tyl 유전자와 제놈에 동종인 tyl 유전자 사이의 단일 교차에 의해 스트렙토마이세스 프라디아에 제놈에 융합할 수 있다. 다른 방법은 클론된 tyl 유전자 외에 플라스미드 상에 비-tyl 에스. 프라디아에 DNA 서열을 넣고 비-tyl 서열에 상응하는 유전자좌에 융합되었는지 선별하는 것이다. 후자의 방법은 tyl 서열에 융합의 가능성 있는돌연변이원의 효과를 피할 수 있으나, 이중-교차 재조합이 요구되는 경우 벡터는 동종 DNA의 분리 서열이 인접하는 항생물질 생합성 유전자를 함유해야 한다. 그러나 타일로신 생산에 대한 재조합 플라스미드(자가 복제 또는 융합된)의 잠재적 역효과를 피하기 위해서, 배양 배지로부터 타일로신 전구체를 취하고 그들을 타일로신으로 전환시키는 스트렙토마이세스 프라디아에의 능력을 이용할 수 있다. 플라스미드 pHJL280으로 형질전환되고 융합물을 수득하기 위해 배양된 타일로신-생산 균주의 발효에서, 단지 세포의 소수(∼18%)만이 티오스트렙톤에 내성적이어서 플라스미드 pHJL 280 서열의 존재를 시사하고 있다. 그러나 이 소수의 개체는 두가지 속도-제한 효소, 즉 디메틸마크로신-o-메틸전이효소(DMOMT) 및 마크로신-o-메틸전이효소(MOMT)의 유전자 카피를 다수 함유하며, 결국 두 효소의 양을 증가시키고(약 9배), 정상적으로는 축적되는 디메틸마크로신 및 마크로신을 타일로신으로 전환시킬 수 있다(표 XIV 참조).
따라서 속도-제한 유전자의 카피 다수와 고도의 효소량을 함유하는 에스.프라디아에의 특수 균주를, 축적된 전구체를 타일로신으로 전환시키는 전환체로 작용하게 개발할 수 있다. 이들 전환체 균주는 수개의 상이한 방법으로 사용할 수 있다 : (1) 전환체 균주를 정상적 생산 균주와 함께 낮은 전환체 : 생산체 비율로 공동-접종시킬 수 있다 : (2) 전환체 균주를 중간체를 전환시키는 사이클의 후기에 생산 발효 배양물에 유입시킬 수 있다 : (3) 전환체 균주를 분리된 "반응조"에 유지하면서 여기에 생산 균주로부터의 발효 생산 브로뜨(broth)를 가할 수 있다 ; 또는 (4) 전환체 균주를 컬럼상에 고정하고 생산 균주로부터의 발효 브로뜨를 통과시킨다. 당 분야 숙련가들은 분리 생산 및 전환 개체들이 재조합 플라스미드가 때때로 항생물질-고생산성 균주의 항생물질 생산성에서 갖게 되는 역효과를 제거한다는 것을 인지할 것이다.
분리 개체는 또한 항생물질 선별 또는 플라스미드의 유지를 위한 기타 몇몇 선별 수단을 조심스럽게 조절 및 통제할 수 있는 소형 용기에서 전환 균주가 생육될 수 있기 때문에 벡터 안정성 문제를 제거한다. 기본적으로 전환 균주는 효소의 공급원이며, 이들 효소의 다량 생산은 이.콜라이중의 재조합 플라스미드로부터 단백질을 생산하는 것과 상당히 동일한 방법으로 접근할 수 있다.
물론 항생물질 생산은 형질전환 DNA가 비형질전환된 균주의 속도-제한 효소를 암호화하는 유전자를 함유할 경우 본 발명의 방법에 의해 증가된다. 항생물질의 생합성에서 속도-제한 단계를 측정하는 여러가지 방법이 당 분야에 공지되어 있으나[Seno and Baltz,1982, Antimicrobial Agents and chemotherapy 21 : 758-763], 항생물질 생합성 유전자의 전부를 항생물질-생산 균주에 유입시킬 수 있을 경우 속도-제한 단계를 식별할 필요가 없다. 속도-제한 효소가 공지되어 있지 않을 경우, 항생물질-생산 균주는 항생물질 생합성 유전자 전부로 형질전환시켜 어느 효소가 속도-제한적이든 관계없이 형질전환된 세포가 비형질전환된 숙주 세포보다 속도-제한 효소의 다량을 함유하도록 확실하게 한다. 그러나 대부분 항생물질 생합성 경로의 속도-제한 효소는 공지되어 있으며, 본 발명의 방법을 사용하여 속도-제한 항생물질 생합성효소를 암호화하는 벡터로 유기체를 형질전환시켜 유기체의 항생물질-생산력을 증진시킬 수 있다.
예를들면 용이하게 검출할 수 없는 타일로신을 생산하는 GS15 균주(이들 세포에 의해 생산되는 타일로신의 양이 타일로신의 양을 측정하기 위해 사용되는 측정법의 측정 한계 이하인) 및 매우 적은 양의 타일로신을 생산하는 GS28 균주는 tylF 변이체를 함유하므로, 이들 변이 균주에서의 타일로신 생합성 중 속도-제한 단계를 식별하는 것은 비교적 간단한 일이다. GS15 및 GS28 균주를 유도한, 스트렙토마이세스 프라디아에 C4로 표기되는 균주는 다량의 타일로신을 생산하며, tylF 유전자 생성물이 작용하여 타일로신으로 만드는 타일로신의 직접적 전구체인 마크로신을 비교적 다량 축적한다. C4 균주보다 타일로신을 더 생산하는 그밖의 에스. 프라디아에 균주는 C4 균주보다 마크로신을 더 축적한다. 이 관찰들은 tylF 유전자 생성물이 타일로신-고생산성 균주에서 타일로신의 생합성에 대한 속도-제한량으로 존재함을 시사한다. 이들 마크로신-축적 균주들을 tylF 유전자를 함유하는 벡터로 형질전환시키고, 이어서 융합된 벡터의 카피만을 함유하는 형질전환체를 단리함으로써 비형질전환된 세포보다 타일로신을 더 생산하는 형질전환체를 수득한다. 이들 형질전환체에서 관찰되는 타일로신 생산의 증가는 비형질전환된 세포에 축적하는 마크로신의 양과 관련이 있다. 상기 방법에 의해 생성된 형질전환체들이 아직도 tylF 유전자 생성물의 속도-제한량을 함유하는 경우 tylF 카피수의 추가적 증가는 타일로신 수율을 추가로 증가시키며, 그렇지 않으면 형질전환된 균주들이 본 발명의 방법에 의해 속도-제한적이 아니게 만들 수 없는 정도인 다른 항생물질 생합성 유전자의 속도-제한량을 현재도 갖고 있을 것이다.
본 발명은 항생물질 생합성 경로의 조작에 의해 항생물질의 생산을 증가시키기 위한 방법 및 재조합 DNA 클로닝 벡터를 제공한다. 대표적인 항생물질 생합성 회로는 스트렙토마이세스 프라디아에, 스트렙토마이세스 리모서스(Streptomyces rimosus) 및 스트렙토 마이세스 하이그로스코피커스(Streptomyces hygroscopicus) 균주에 의해 생산되는 복합체 마크롤라이드인 타릴로신의 생합성이다. 타일로신은 16-원측쇄 락톤(타일로놀라이드)으로 이루어져 있고 여기에 3개의 당(마이카로스, 마이카미노스 및 마이시노스)이 부착되어 있다. 락톤은 프로피오닐-S-조효소 A분자를 2개의 말로닐-S-조효소 A분자, 4개의 메틸말로닐-S-조효소 A분자 및 1개의 에틸말로닐-S-조효소 A분자와 축합시켜, 지방산 생합성에 포함된 것과 유사한 것으로 믿어지는 도식에 의해 2개의 아세테이트, 5개의 프로피오네이트 및 1개의 부티레이트로부터 유도한다. 락톤 형성, 당 생합성/부착 및 생성된 중간 화합물의 타일로신으로의 전환은 일련의 유전자-암호화된 효소에 의해 촉매한다. 그런 효소를 암호화하는 클로닝 유전자는 타일로신 생합성 경로의 조작 효율을 변경 및 개선시키는데 이는 본 발명을 설명하고 있다.
본 발명의 목적을 위해 사용할 수 있는 예시적인 타일로신 생합성 유전자는 예를들면 tylC., tylD. tylE, tylF, tylH, tylJ, tylK, tylL 및 tylM 유전자이다. 이 그룹중 tylF 유전자는 그에 의해 암호화된 마크로신 o-메틸전이효소가 대부분의 타일로신-생산 균주의 타일로신 생합성 경로에서 속도-제한적인 것으로 보이기 때문에 바람직하다. 마크로신은 tylF 유전자 생성물에 의해 촉매된 속도-제한 단계 때문에 스트렙토마이세스 프라디아에의 최적 발효 조건하에 허용되지 않는 정도까지 축적된다. tylF 효소는 별첨 도면의 제1도에 언급한 바와 같이 마크로신을 타일로신으로 전환시키는 단계를 촉매한다. tylF 유전자 생성물인 마크로신 o-메틸전이효소의 과잉-생산은 증가된 항생물질 수율 및 낮은 발효 비용에 의해 시사되는 바와 같이 타일로신 생합성 경로의 더욱 효율적인 조작을 초래한다.
당 분야 숙련가들은 본 발명이 플라스미드 pHJL 280, pHJL 284, pHJL 309, pHJL 311 또는 pHJL 315의 사용에 한정되지 않음을 인지할 것이다. 이들 벡터에 함유된 항생물질 생합성 유전자는 전체적으로 또는 부분적으로 절제하여 다른 재조합 DNA 클로닝 벡터에 연결할 수 있다. 예를들면 플라스미드 pHJL 280을 제한효소 Bgm HI 및 BglII로 분해하면 크기 ∼10.3kb, ∼6.54kb, ∼2.3kb, ∼1.7kb 및 ∼1.0kb인 5개의 Bam HI-Bam HI 단편 : 크기 ∼2.9kb 및 2.0kb인 2개의 Bam HI-Bgl II 단편 ; 크기 ∼0.2kb인 1개의 BglII-BglII 단편이 수득된다. 플라스미드 pHJL 280의 ∼2.9kb Bam HI-Bgl II 단편은 tylF 유전자를 함유한다. 플라스미드 pHJL 280을 제한효소 BglII 및 EcoRI으로 분해하면 4개의 단편이 생성된다 : ∼11.24kb EcoRI-EcoRI 단편 ; 11.5kb BglII-EcoRI 단편 ; ∼4.0kb EcoRI-BglII 단편 및 ∼0.2kb의 BglII-BglII 단편. 플라스미드 pHJL 280의 ∼4.0kb EcoRI-BglII 단편이 tylE 유전자를 함유한다.
플라스미드 pHJL 284를 제한효소 BamHI 및 EcoRI으로 분해하면 크기 ∼9.7kb, ∼2.3kb 및 ∼1.0kb인 3개의 BamHI-BamHI 단편 : 및 크기 ∼6.24kb, ∼4.3kh,∼2.3kb 및 ∼1.1kb인 4개의 EcoRI-BamHI 단편이 생성된다. 플라스미드 pHJL 284의 ∼2.3kb BamHI-EcoRI 단편이 tylF 유전자를 함유한다. 플라스미드 pHJL 284를 제한효소 EcoRI으로 분해하면 크기 ∼16.4kb 및 ∼10.54kb인 2개의 단편이 생성되며 ; ∼16.4kb 단편이 tyIF, tylC 및 tylJ 유전자를 함유한다. 플라스미드 pHJL 311의 ∼1.7kb EcoRI-BamHI 제한 단편이 tylK 유전자를 함유한다. 플라스미드 pHJL 309의 ∼18.5kb EcoRI 제한단편 뿐만 아니라 ∼8.3kb의 BamHI-KpnI 제한 단편이 tylL 및 tylM 유전자를 함유한다.
상술한 tyl 유전자-함유 단편중 어느 것을 다른 벡터속에 연결시켜 본 발명의 방법에 유용한 벡터로 만든다. 그와 같은 기타의 백터는 예를들면 미합중국 특허 제4,468,462호 ; 제4,513,086호 ; 제4,416,994호 ; 제4,503,155호 ; 및 제4,513,185호에 기술된 벡터들과 플라스미드 pIJ 101, pIJ 350, pIJ 702(ATCC 39155), SCP2*(NRRL 15041), pHJL 192, pHJL 197, pHJL 198, pHJL 210, pHJL 211, pHJL 400, pHJL 401, pHJL 302, pIJ 922, pIJ 903, pIJ 941, pIJ 940 및 pIJ 916등이다. 이들 벡터는 스트렙토마이세스 프라디아에 및 그밖에 타일로신-생산 균주에서 복제되며, 따라서 본 발명의 항생물질 생합성 유전자를 클로닝하는데 유용하다. 상기에 기술된 "불안정성" 벡터는 벡터의 융합이 요구될 경우에 바람직하다.
본 발명의 목적에 사용할 수 있는 예시적 스트렙토마이세트 균주는 예를들면, 에스ㆍ프라디아에, 에스ㆍ프라디아에 GS52, 에스ㆍ프라디아에 GS48, 에스ㆍ프라디아에 GS16, 에스ㆍ프라디아에 GS28, 에스ㆍ프라디아에 GS15, 에스ㆍ프라디아에 GS76, 에스ㆍ리모서스(S.rimosus) 및 에스ㆍ하이그로스코피커스(S.hygroscopicus)를 포함한다.
스트렙토마이세스 하이그로스코피커스 및 에스ㆍ리모서스가 숙지되어 있으며, 메릴랜드(Maryland)20852, 록빌(Rockville) 소재의 ATCC(American Type Culture Collection)에 기탁되어 있다. 에스ㆍ하이그로스코피커스의 많은 균주들이 부여번호 ATCC 27438, ATCC 21449, ATCC 15484, ATCC 19040 및 ATCC 15420하에 수득할 수 있으며, 에스ㆍ리모서스가 부여번호 ATCC 10970하에 수득할 수 있다. 스트렙트마이세스 분류 그룹중 에스ㆍ프라디아에 GS16, 에스ㆍ프라디아에 GS15 및 에스ㆍ프라디아에 GS28이 특히 플라스미드 pHJL 280으로 형질전환시킬 경우 바람직하다. 스트렙토 마이세스 프라디아에가 또한 아주 잘 공지된 미생물이며, 몇몇 균주는 각각 부여번호 NRRL 2702, NRRL 2703 및 ATCC 19609하에 일리노이즈 61640, 페오리아(Peoria) 소재의 NRRL(Northern Regional Reserach Laboratory) 및 ATCC로부터 별제한없이 수득할 수 있다.
본 발명에 기술된 재조합 플라스미드는 각각 하나 이상의 항생물질 생합성 유전자를 함유한다. 폴리시스트론(polycistron) 부분이 아니라면 각 항생물질 생합성 유전자는 정상적으로 다음을 함유한다 : (1) 유전자의 전사를 유도하는 프로모터, (2) mRNA로 전사될 경우 전사물의 전사를 유도하는 서열 ; (3) 단백질-암호화 서열, 및 (4) 전사 터미네이터(terminator).
이들 요소의 각각은 독립적으로 유용하며, 재조합 DNA 공학의 기술을 통해 아주 다양한 재조합 유전자를 제조하는데 사용할 수 있다. 한가지 실례로서 tylF 유전자의 단백질-암호화 서열을 비-스트렙토마이세스 프라디아에 유전자로부터의 프로모터, 해독-활성화 서열 및 전사-종결 서열에 연결시켜 숙주에서 작용하는 재조합 유전자를 형성할 수 있고, 이 숙주로부터 비-에스ㆍ프라디아에 서열이 단리되었다. 그와 같이 신규한 유전자를 사용하여 타일로신 경로에서는 발견되지 않는 신규한 유전자 생성물에 대한 기질로서 기여하는 항생물질 또는 항생물질 중간체를 생산하는 유기체에 유입시킬 경우 하이브리드 항생물질을 제조할 수 있을 것이다.
마찬가지로 tylF 유전자의 프로모터 및 기타의 조절요소를 비-타일로신 항생물질 생합성 유전자의 암호화 서열에 연결시켜 에스ㆍ프라디아에에서 작용하는 하이브리드 유전자를 제조할 수 있다. 따라서 본 명세서에 기술된 각 플라스미드상 각 항생물질 생합성 유전자의 개별적 요소는 본 발명의 중요한 성분을 구성하고 있다.
예를들면 tylF 뉴클리오타이드 서열상의 서열자료는 본 발명의 중요한 면을 구성하는 tylF 프로모터를 밝혀냈다. 이 서열(편의상 하나의 본쇄만 언급)이 하기에 나타나 있다 : tylF 유전자의 프로모터 및 해독-활성화 서열은 해독개시 부위로부터 위쪽으로 잔기 1과 207 사이의 서열에 존재하는 것으로 믿어진다. 이 서열의 끝에서 tylF 유전자의 암호화 영역이 시작한다.
추가의 태양으로서 tylF 유전자의 서열이 제공되어 있다. 특히 상술한 프로모터 및 해독-활성화 서열을 포함한 전체 tylF 유전자가 하기 서열을 갖는 것으로 밝혀졌다 :
상기 서열에서, A는 데옥시아데닐 잔기이고, G는 데옥시구아닐 잔기이며, C는 데옥시사이티딜 잔기이고, T는 타이미딜 잔기이다.
상술한 구조 유전자는 잔기 541에서 시작하여 잔기 1371까지 계속되고 잔기 1372에 위치한 정지 코돈으로 종결된다. tylF 구조 유전자의 아미노산 서열이 상응하는 뉴클리오타이드 서열 하부에 정리되어 있다. 유전적 코드의 축퇴성(degeneracy)으로 인해 당 분야의 숙련가들은 동일한 tylF 유전자 생성물을 암호화하는, 특별히 상술한 것과 동등한 서열을 수득할 수 있음을 알 수 있을 것이다. 그와 같이 동등한 서열을 수득하는 방법은 당분야 숙련가를에게 친숙해져 있다. 또한 제공된 특별한 서열이 어떤 식으로든 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
스트렙토 마이세스 프라디아에 균주는 몇몇 상이한 배지중 어느것을 사용하여 여러가지 방법으로 배양할수 있다. 배양배지에 바람직한 탄수화물 공급원은 예를들면 당밀, 글루코스, 덱스트란 및 글리세롤이고, 질소 공급원은 예를들면 콩가루, 아미노산 혼합물 및 펩톤이다. 영양 무기염을 또한 배지에 첨가할 수 있으며 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 인산염, 염산염, 황산염 및 유사 이온을 생성시킬 수 있는 통상적은 염을 포함한다. 기타 미생물의 성장 및 증식에 필요한 것으로서 필수 미량 원소를 또한 가한다. 그런 미량 원소는 통상 배지의 다른 성분 첨가시 부수적으로 일어나는 불순물로서 공급한다. 에스ㆍ프라디아에 균주는 약 5.5내지 8의 비교적 광범위한 pH 범위에서 약 25° 내지 37℃ 범위의 온도로 호기성 배양 조건하에 생육시킨다. 특히 타일로신은 본 발명에 의해 제공된 벡터를 함유하는 예를들면 에스ㆍ프라디아에의 타일로신-생산 균주를 배양하여 생산할 수 있다. 사용하는 배양배지는 이 미생물이 많은 에너지 공급원을 활용할 수 있기 때문에 다수의 배지중 어느 하나일 수 있다. 그러나 생산의 경제성, 항생물질의 최대수율 및 항생물질 단리의 용이성을 위해 특정 배양배지가 바람직하다. 타일로신 생산에 유용한 배지는 글루코스, 슈크로스, 프룩토스, 전분, 글리세린, 당밀, 텍스트린, 누런 실탕, 옥수수 침지액 등과 같은 동화성 탄소 공급원을 포함한다. 바람직한 탄소 공급원은 글로코스 및 전분이다. 추가로 사용할 수 있는 배지는 아마인 가로, 탱크 찌끼, 생선 가루, 목화씨 가루, 귀리가루, 밀가루, 고기추출물, 펩톤(고기 또는 콩) 카제인, 아미노산 혼합물등과 같은 동화성 질소 공급원을 포함한다. 바람직한 질소 공급원은 대두 가루, 카제인 또는 옥수수 침지액이다.
예를들면 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 마그네슘, 코발트, 황산염, 염산염, 인산염, 탄산염, 아세테이트밀 질산염 이온을 제공하는 광물염 및 주정 박즙과 효모 추출물 같은 성장 인자의 공급원을 배지에 가하여 이로운 결과를 얻을 수 있다.
기타 미생물의 성장 및 증식에 필요한 것으로서 필수 미량 원소가 이 발명에 사용된 미생물의 생육용 배양배지에 함유되어야 한다. 그런 미량 원소는 배지의 기타 성분 첨가시 부수적으로 수반되는 불순물로서 통상 공급된다.
배양배지의 초기 pH는 매우 다양하게 할 수 있다. 그러나 배지의 초기 pH가 약 pH 5.5 내지 약 pH 8.0 바람직하게는 약 pH 6.5 내지 약 pH 7.0이 양호한 것으로 밝혀졌다. 다른 미생물에서 관찰되는 바와 같이 배지의 pH는 미생물의 성장 기간을 통해 타일로신이 생산되는 동안 점차적으로 증가하고, 약 pH 7.2 내지 약 pH 8.0 또는 그 이상에 이르며, 최종 pH는 적어도 부분적으로는 배지의 초기 pH, 배지에 존재하는 완충액 및 미생물이 생육할 수 있는 시간에 따라 좌우된다.
수중 호기성 배양 조건이 타일로신 대량 생산시의 선택 조건이다. 비교적 소량 생산시에는 진탕 플라스크 및 병에서의 표면 배양을 사용할 수 있으나, 대량 생산시에는 멸균 탱크에서의 수중 호기성 배양이 바람직하다. 멸균 탱크의 배지는 포자형성된 현탁액으로 접종할 수 있다. 그러나 포자 형성된 현탁액을 접종에 사용할 경우 겪게되는 생장 지연으로 인해, 배양물의 영양형이 상술한 생장 지연을 방지하기 위해 바람직하며, 그럼으로써 발효 장치를 좀더 효율적으로 사용할 수 있다. 따라서 포자 형태의 유기체를 함유하는 비교적 소량의 배양배지를 접종하여 우선 유기체의 영향형 접종물을 생산하고, 왕성하고 활동적이며 영양형인 접종물을 수득했을때 영향형 접종물을 대형 탱크에 무균적으로 전이한다. 영양형 접종물을 생산하는 배지는 타일로신의 대규모 생산시 활용되는 배지와 동일 또는 상이할 수 있다.
이 유기체는 약 25℃ 내지 약 37℃ 범위의 온도에서 가장 잘 성장한다. 최적 타일로신 생산은 약 26-30℃의 온도에서 이루어지는 것으로 나타났다.
수중 배양법에서 통상적인 바와 같이 멸균 공기를 배양배지를 통해 취입한다. 유기체의 효율적 성장과 타일로신 생산을 위해, 타일로신의 탱크생산시 사용하는 공기의 용적은 바람직하게는 매분마다 배양배지의 용적당 공기 0.1 용적 이상이다. 효과적 성장 및 타일로신의 최적 수율은 사용한 공기의 용적이 매분 배양배지의 용적당 공기 1용적 이상일 경우에 수득된다.
배양배지에서 타일로신 활성의 농도는 발효 기간중 배양배지의 샘플을, 타일로신의 존지하에 억제되는 것으로 공지된 미생물의 성장에 대한 그들의 억제 활성을 시험함으로써 용이하게 수행할 수 있다.
일반적으로 접종 후 타일로신의 최대 생산은 수중 호기성 배양 또는 진탕 플라스크 배양을 사용할 경우 약 2 내지 7일 이내에, 그리고 표면 배양을 사용할 경우 약 5 내지 10일 이내에 이루어진다.
경우에 따라 균사체 및 비용해된 고체를 여과 또는 원심분리와 같은 종래의 방법에 의해 발효 브로뜨로부터 제거한다. 경우에 따라 타일로신을 당 분야 숙련가들에게 익숙한 흡착 또는 추출 기술을 사용하여 여과된 또는 원심분리된 브로뜨로부터 회수한다.
여과된 브로뜨로부터 타일로신의 추출시 수-불혼화성, 극성, 유기 용매가 바람직하며, 예를들면 에틸 아세테이트 및 아밀 아세테이트와 같은 지방산의 에스테르, 클로로 에틸렌 다이클로라이드 및 트라이 클로로 에틸렌과 같은 염소화된 탄화수소, 부틸 및 아밀 알코올과 같은 수-불혼화성 알코올, 메틸이소부틸케톤 및 에틸아밀케톤과 같은 수-불혼화성 케톤 ; 및 다이에틸 에테르 및 메틸 프로필 에테르와 같은 기타가 있다.유사한 특성의 다른 용매를 사용할 수도 있다. 클로로포름 및 아밀 아세테이트가 현재 바람직한 추출 용매이다.
흡착 기술에 의한 타일로신의 회수시 여러가지 흡착제 및 이온교환수지가 사용될 수 있는데, 예를들면 탄소, 실리카겔, 알루미나, 및 "XE"64와 "IRC"50(Rohm ＆ Haas Company가 판매하는 약산성 양이온 교환수지), 카복시메틸 셀룰로오스 수지 및 "Dowex"50(The Dow chemical Company가 판매하는 강산성 양이온 교환수지)과 같은 산성 특성의 이온 교환수지이다. 타일로신은 클로로포름, 아세톤, 벤젠 또는 기타 적합한 용매중의 용액으로부터 상술한 또는 유사한 흡착제중 하나에 흡착시킬 수 있다. 흡착된 타일로신은 적합한 용매일 수 있다. 흡착된 타일로신은 이어서 타일로신이 흡착된 흡착제를 메탄올 또는 에탄올과 같은 저급 알코올, 또는 아세톤과 같은 저급 케톤을 약 50%까지 함유하는 저급 알코올로 세척하는 등의 적합한 용출 기술에 의해 흡착제로부터 용출시킬 수 있다.
바람직한 추출법에 의해 수득되는 유기 용매 추출물은 직접 증발 건조시켜 조타일로신을 수득할 수 있다. 또한 유기 용매 추출물을 사용하여 타일로신의 유기 용매 추출물을 진공중에서 농축하고, 탄소로 농축물을 탈색시키며, 비극성 용매, 예를들면 석유 에테르를 가하여 타일로신을 침전시킴으로써 정제된 타일로신을 제공할 수 있다. 수득한 침전물을 통상 무정형의 정제된 타일로신 고체이다. 무정형 침전물은 상술한 결정화 용매중 하나를 사용하여 결정화 할 수 있다. 또한 타일로신은 타일로신-함유 유기 추출물로부터 흡착 크로마토그래피에 의해, 흡착제로부터는 용출에 의해 흡착된 타일로신의 회수에 의해 회수한다.
배양배지로부터 목적하는 생성물의 기타 제조방법은 당 분야 숙련가들에 의해 인지될 것이다.
타일로신의 산부가염은 황산, 염산 및 질산과 같은 광산 및 타르타르산, 글루콘산, 옥살산 및 아세트산과 같은 유기산과 형성시킬 수 있다. 산부가염은 타일로신의 유리 염기를 이것이 용성인 용매, 예를들면 아세톤 또는 에테르에 용해시키고, 용액에 적절한 산의 등몰량을 가하여 제조한다. 형성된 염을 통상 용액에서 침전된다. 염이 침전되지 않을 경우 침전되도록 용액을 소량으로 증발시키거나, 염이 용해되지 않는 혼화성용매를 가하여 회수할 수 있다.
하기의 비-제한적인 실시예들이 또한 본 발명을 설명하기 위해 제공되었다. 시료의 공급원은 단순히 편리를 위해 제공되었으며 어떤 식으로든 본 발명을 제한하지는 않는다.
[실시예 1]
플라스미드 pHJL 280의 단리
A. 이. 콜라이 K12 HB 101/pHJL 280의 배양
이. 콜라이 K12 HB 101/pHJL 280의 동결 건조물을 부여번호 NRRL B-18043하에 NRRL로부터 수득한다. 동결건조된 세포를 암피실린 50㎍/ml을 함유하는 L-한천평판(L 한천은
당 박토트립톤 10g, 박토효모 추출물 5g, NaCl 10g, 글루코스 2g 및 한천 15g을 함유함)상에 도말하여 이.콜라이 K12 HB 101/pHJL 280의 단일-콜로니 단리물을 수득한다. 이 콜로니 하나를 사용하여 L 브로뜨(L 브로뜨는 한천이 없는 L 한천임) 100ml를 접종하고 37℃에서 밤새(약 16시간) 호기적으로 배양한다. 이튿날 아침 10,000xg에서 10분동안 원심 분리하여 세포를 수거한다. 이 방법으로 수득한 세포 1g을 사용하여 실질적으로 하술하는 방법에 따라 플라스미드 pHJL 280을 제조한다.
B. 플라스미드 단리
실시예 1A에서 수득한 세포 펠릿을 25% 슈크로스 및 50mM 트리스-HCl, pH=3.0으로 이루어진 용액 10ml에 재현탁한다. 50mM 트리스-HCl, pH=8.0중 라이소자임 10mg/ml용액약 1ml를 세포 현탁액에 가하고, 생성된 혼합물을 얼음상에서 5분 배양한다. 0.25M EDTA, pH=8.0 약 4ml를 세포 현탁액에 가하고 얼음상에서 5분더 계속 배양한다. 용해 용액[용해 용액은 0.4% 디옥시콜레이트 : 1% Brij 58(Sigma
Chemical Co., 사서함 14508, St. Louis, MO 63178 ; 0.05M 트리스-HCl, pH=8.0 및 0.0625M EDTA를 함유함] 약 16ml를 라이소자임-처리 세포에 가하고, 생성된 혼합물을 37℃에서 15분동안 배양한다.
세포 용해물을 48,000xg에서 25분동안 원심분리하여 청정하게 한다. 상등액을 분리관에 기울여 붓고, 여기에 3.0M NaOAc, pH=8.0 및 이소프로필 알코올 0.64 용적을 가한다. DNA 침전물을 20,000xg에서 10분동안 원심분리하여 수거하며 이어서 TE 완충액(10mM 트리스-HCl, pH=7.8, 및 1mM EDTA) 0.1용적에 재용해한다. DNA의 용액을 65℃에서 30분동안 용해하고 CsCl 및 이요오드화 프로피듐중 평형-밀도-구배 초원심분리에 의해 정제한다. 이 방법으로 수득한 플라스미드 pHJL 280 DNA를 약 1㎍/㎕의 농도로 TE 완충액에 용해한다. 플라스미드 pHJL 280의 제한부위 지도가 별첨 도면의 제2도에 있다.
[실시예 2]
플라스미드 pHJL 284, pHJL 309, pHJL 311 및 pHJL 315의 단리
플라스미드 pHJL 284, pHJL 309, pHJL 311 및 pHJL 315를 함유하는 이.콜라이 균주의 동결 건조물을 표 X에 수록된 부여 번호하에 NRRL로부터 수득할 수 있다. 목적하는 플라스미드를 각각 실질적으로 실시예 1의 교시에 따라 동결건조된 세포로부터 수득 및 정제한다. 플라스미드의 제한부위 지도가 별첨한 도면의 제2-6도에 있다.
[실시예 3]
스트렙토 마이세스 프라디아에 GS28/pHJL 280의 구성
스트렙토 마이세스 프라디아에 GS28의 배양물을 20ml의 트립티케이스-콩 브로뜨(TSB)에 접종하고 수욕 배양기에서 29℃ 및 260rpm으로 밤새(약 16시간)배양한다. 배양물을 균질용기(Thomas Scientific, Swedesboro, NJ) 및 T-계통 실험실 교반기를 사용하여 균질화하고, 이어서 초음파 세포 파쇄기(Sonifier Cell Disruptor : Heat Systems Ultrasonics, Inc.)를 사용하여 76와트에서 7초동안 단편화한다. 균질화 및 단편화된 배양물 4ml를 글라이신 0.3용적% 함유하는 TSB(BBL) 20ml에 접종하고, 배양물을 다시 29℃에서 밤새 배양한다. 이튿날 아침 배양물을 상술한 바와 같이 균질화하고 재배양한다. 이 세번째의 밤새 배양후 배양물을 균질화하고, 수거하며, 이어서 P 배지로 2회 세척한다. P 배지는 0.25g의 K2SO4및 2.03g MgCl2-6H2O에 103g의 슈크로스를 가하고, 이어서 탈이온수를 가하여 최종 용적을 700ml로 하여 제조한다. 혼합물을 멸균시키고, 용액 각 70ml에 0.05g KH2PO4/탈이온수 100ml : 2.78g CaCl4: 탈이온수 100ml ; 및 0.25M TES[2-([트리스-(하이드록시메틸)메틸]-아미노)에탄설폰산)], pH=7.2를 각각 10ml씩 가한다.
세포 펠릿을 1mg/ml 라이소자임(Calbiochem, La Jolla, CA92037)을 함유하는 P배지 15ml중에 재현탁하고, 이어서 실온에서 약 1시간반동안 배양하여 원형질체를 형성한다. 원형질체를 원심분리하여 조심스럽게 수거하고, P배지로 2회 세척하며, P배지 2ml중에 재현탁하고, 사용할때까지 얼음상에서 항온처리한다. 플라스미드 pHJL 280 DNA 약 1㎍을 1mg/ml 헤파린 설페이트(Sigma)의 약 50㎕에 가하고 얼음상에서약 10분동안 배양한다. 약 5-100 나노그램의 더 적은 플라스미드 DNA를 사용하여 스트렙토 마이세스 프라디아에 숙주로부터 제조할 경우 에스ㆍ프라디아에를 형질전환시킨다. 스트렙토 마이세스 플라스미드 DNA의 단리 방법이 문헌[Hopwood et al., 1985, Genetic Manipulation of Streptomyces : A Laboratory Manual(John Innes Foundation, Norwich, England)]에 기술되어 있다. DNA/헤파린 용액을 우선 원형질체 약 200㎕에 가하고, P배지중 55% PEG 1000(Sigma)로 이루어진 용액 약 0.9ml를 DNA/원형질체 혼합물에 가하며, 생성된 혼합물을 실온에서 부드럽게 혼합한다.
혼합물을 연성-R2-한천 중첩중 4ml를 사용하여 R2 평판상에 여러가지 분취량으로 평판화한다. R2 평판은 R2 배지 30ml를 함유하며 37℃에서 약 4일동안 건조한다. R2 배지는 물 700ml에 103g 슈크로스, 0.25g K2SO4, 2ml의 미량원소 용액, 10.12g MgCl2-6H2O, 10.0g의 글루코스, 2.0g의 L-아스파라긴, 0.1g의 카사미노산 및 22g의 한천을 가하고, 생성된 용액을 멸균시키며, 최종적으로 하기 용액을 각각 100ml씩 가한다 : 0,05g KH2PO4/탈이온수 100ml ; 2.22g CaCl2/탈이온수 100ml ; 및 0.25M TES, pH=7.2. 최종용액의 pH를 7.2로 조정한다. 미량원소 용액은 리터당 40mg ZnCl2, 200mg FeCl3-6H2O, 10mg CuCl2-2H2O, 10mg MnCl2-4H2O, 10mg Na2B4O7-10H2O 및 10mg(NH4)6Mo7O244H2O를 함유한다. 연성-R2-한천 중첩층은 51.5g의 슈크로스, 5.06g의 MgCl2-6H2O, 1.11g CaCl2, 50ml의 0.25M TES, pH 72, 및 2.05g의 한천을 충분히 탈이온화시킨 물에 가하여 최종 용적 500ml로 함으로써 제조한다. 혼합물을 증기 가온하여 한천을 용융시키고, 4ml 분취량으로 나눈 다음 사용하기 전에 가압멸균한다. 형질전환된 원형질체를 평판화한 후, 평판을 29℃에서 24시간동안 배양하고, 이어서 50mg/ml 티오스트렙톤(E.R.Squibb, Princeton, NJ 08540) 25μl를 함유하는 연성-R2-한천 4ml를 원형질체 위에 덮는다. 평판을 29℃에서 재생이 완료될때까지, 통상 약 7-14일동안 계속 배양하여 목적하는 에스ㆍ프라디아에 GS28/pHJL 280 형질전환체를 선별한다.
스트렙토 마이세스 프라디아에 GS28/pHJL 280 균주를 배양하여 비형질전환된 에스ㆍ프라디아에 GS28균주에서 생산된 것 이상의 양으로 마이크로신 O-메틸전이효소 및 타일로신을 생산한다. 마이크로신 O-메틸전이효소 활성은 실질적으로 문헌[Yeh et al.,1984, Journal of Chromatography 288 : 157-165]의 교시에 따라 검정하고 측정한다. 비형질전환된 GS28/pHJL 280 및 어버이 GS28에서의 마이크로신 O-메틸전이효소 활성과 비교해서, 형진전환된 균주에서는 60 내지 100배의 효소증가 및 14 내지 18배의 타일로신 생산증가를 나타냈다. 타일로신 생산은 실질적으로 문헌[Baltz and Seno, 1981,Antimicrobial Agents and Chemotherapy 20 : 214-225 ; 및 Kennedy, J.H., 1983, Journal of Chromatography 281 : 288-292]의 교시 내용에 따라 검정 및 측정한다.
[실시예 4]
스트렙토 마이세스 프라디아에 GS15/pHJL 280의 구성
목적하는 균주는 스트렙토 마이세스 프라디아에 GS28 대신에 에스ㆍ프라디아에 GS15를 사용하는 것을 제외하고는 실질적으로 실시예 3의 교시 내용에 따라 구성한다. 목적하는 균주를 72시간동안 배양하여 용이하게 검출할 수 없는 타일로신을 생산하는 비형질 전환된 에스ㆍ프라디아에 GS15 균주에서 생산된것 이상의 양으로 마크로신 O-메틸전이효소 및 타일로신을 생산한다.
[실시예 5]
스트렙토 마이세스 프라디아에 GS15/pHJL 284의 구성
목적하는 균주는 플라스미드 pHJL280 대신에 플라스미드 pHJL 284를 사용하는 것을 제외하고는 실질적으로 실시예 4의 교시 내용에 따라 구성한다. 목적하는 균주를 배양하여 비형질전환된 에스ㆍ프라디아에 GS15 균주에서 생상된것 이상의 양으로 마크로신 O-메틸전이 효소를 생산한다.
[실시예 6]
스트렙토 마이세스 프라디아에 GS16/pHJL 280의 구성
목적하는 균주는 스트렙토 마이세스 프라디아에 GS28 대신에 에스ㆍ프라디아에 GS16을 사용하는 것을 제외하고는 실질적으로 실시예 3의 교시 내용에 따라 구성한다. 목적하는 균주를 배양하여 비형질전환된 균주에서 생산된 것 이상의 양으로 tylE 유전자 생성물, 마이크로신 O-메탈전이효소 및 타일로신을 생산한다. 디메틸마이크로신 O-메틸전이효소 활성 및 타일로신 생산력 각각은 기질로서 마이크로신을 디메틸마이크로신으로 대치하는 것을 제외하고는 실질적으로 상기-참조한 방법에 따라 검정 및 측정한다.
[실시예 7]
스트렙토 마이세스 프라디아에 GS76/pHJL 280의 구성
목적하는 균주는 스트렙토 마이세스 프라디아에 GS28 대신에 에스ㆍ프라디아에 GS76을 사용하는 것을 제외하고는 실질적으로 실시예 3의 교시 내용에 따라 구성한다. 목적하는 균주를 배양하여 비형질전환된 균주에서 생산된 것 이상의 양으로 tylD 및 tylH 유전자 생성물 및 타일로신을 생산한다.
[실시예 8]
스트렙토 마이세스 프라디아에 GS48/pHJL 280의 구성
목적하는 균주는 스트렙토 마이세스 프라디아에 GS28 대신에 에스ㆍ프라디아에 GS48을 사용하는 것을 제외하고는 실질적으로 실시예 3의 교시 내용에 따라 구성한다. 목적하는 균주를 배양하여 비형질전환된 균주에서 생산된 것 이상의 양으로 tylD 유전자 생성물 및 타일로신을 생산한다.
[실시예 9]
스트렙토 마이세스 프라디아에 GS52/pHJL 284의 구성
목적하는 균주는 스트렙토 마이세스 프라디아에 GS28 및 플라스미드 pHJL 280 대신에 에스ㆍ프라디아에 GS52 및 플라스미드 pHJL284를 사용하는 것을 제외하고는 실질적으로 실시예3의 교시 내용에 따라 구성한다. 목적하는 균주를 배양하여 비형질전환된 균주에서 생산된 것 이상의 양으로 ±ylc유전자 생성물 및 타일로신을 생산한다.
[실시예 10]
속도-제한 효소의 특이 활성 및 본 발명의 방법을 사용한 증가된 타일로신 생산성.
하기 도표는 본 발명의 방법의 효능을 설명하고 있다. 도표에 수록된 모든 형질전환체는 실질적으로 실시예3의 방법에 따라 수득한다. 도표 XII 및 XIII에 시사된 결과는 숙주가 플라스미드를 함유할 경우 20㎍/ml 티오스트렙톤을 또한 함유하는 발효 배지(Baltz and Seno, 1981, Antimicrobial Agents and Chemotherapy 20 : 214-225)에서 배양된 균주로부터 수득하였다. 도표 XII 및 XIII에 수록된 형질전환된 숙주는 타일로신-저생산성이거나, 또는 용이하게 검출할 수 없는 양의 타일로신을 생산하고, 자가 복제 벡터로서 플라스미드 유지를 위한 선택적 조건(티오스트렙톤)의 존재하에 배양됨을 주목하라.
[표 ⅩII]
tylF 유전자 생성물, 마크로신 o-메틸전이효소(MOMT)의 특이활성
1. 발효일수
2. GS15 및 GS28을 유도한 균주
3. C4로부터 유도한 균주
4. tyl 유전자를 삽입하여 플라스미드 pHJL280 및 pHJL284를 수득한 클로닝 벡터
[표 ⅩIII]
tylE 유전자 생성물, 디메틸마크로신 o-메틸전이효소(DMOMT)의 특이활성
표 XⅣ결과는 형질전환 후 배양하여 융합물을 수득한 타일로신-고생산성 균주의 형질전환체, 즉 플라스미드 DNA의 전부 또는 일부를 숙주 세포의 제놈에 유입시킨 형질전환체로부터 수득하였다. 2가지 방법이 융합물을 수득하기 위해 사용되었다. 첫번째 방법에서는, 형질전환체를 선별성(티오스트렙톤 함유)및 비선별성 평판상에 처리하고 29℃에서 약 16시간 동안 배양하여 단일 콜로니를 수득한다. 선별 평판상에서 티오스트랩톤-내성인 비선별 평판상의 단일 콜로니를 선별없이 비교적 안정한 단일 콜론니가 발전될때까지 동일한 방법으로 수회 처리한다. 융합물을 수득하기 위한 두번째 방법에서는, 형질전환체를 연가제를 사용하여, 평판의 표면으로부터 포자를 전이시킴으로써 수회 비선별적으로 처리한다. 수회 처리후 콜로니를 비선별성 액체 배지(TSB)에서 생육하고, 균질화하며, 초음파로 단편화하고, 희석하며, 선별성 및 비선별성 배지상에 평판화하여 비교적 안정한 융합물을 식별한다. 융합물을 수득하기 위한 기타의 방법은 당 분야 전문가에게 명백하여, 본 발명의 방법은 융합물을 수득하는 특정 방법에 제한되지 않는다.
비교적 안정한 융합물을 사용하여 티오스트렙톤이 없는(비선별적 조건) 영양배지(복합 영양 배지는 리터당 옥수수 침지액 10g, 효소 추출물 5g, 대두가루 5g, 탄산칼슘 3g 및 조대두유 4.5g을 함유하며 pH는 NaOH로 7.8에 조정함. TSB가 또한 적절한 영양 배지임)를 접종하고, 영양 배양물을 사용하여 또한 티오스트렙톤이 없는 발효 배지를 접종한다(10%접종물). 발효는 260rpm으로 29℃에서 7일 동안 실시한다. 발효 브로뜨의 총 마크롤라이드 함량은 메탄올 : CHCl3로 추출하고, 290nm에서의 흡광도를 판독하며, 표준곡선과 비교하여 측정한다. 타일로신 인자는 실리카-겔-TLC플레이트상에 발효 브로뜨를 스포트(spot)하고 플레이트를 95 : 5의 에틸아세티이트 : 다이에틸아민 용매 시스템으로 전개시켜 확인한다. 총 A290인 각각의 마크롤라이드 성분 농도는 HPLC로 측정한 각 성분의 백분률에 비례한다.
[표 ⅩⅣ]
* C4 균주와의 비율
[실시예 11]
본 발명에 의해 제공된 플라스미드를 함유하는 스트렙토마이세스 프라디아에의 포자형성 배양물은 미생물을 하기 조성의 영양 한천 슬랜트(slant)상에 생육하여 생산할 수 있다 :
배지의 pH는 수산화나트륨을 가하여 pH 7.3으로 조정한다.
슬랜트를 목적하는 유기체의 포자로 접종하고 약 30℃에서 5일동안 배양한다. 슬랜트상 포자형성 배양물의 생육물을 물로 덮고, 슬랜트를 조심스럽게 부셔 포자를 회수함으로써 수성 포자 현탁액을 수득한다.
포자 현탁액 1ml를 사용하여 하기 조성을 갖는 멸균 영양 배지의 100ml부를 무균 조건하에 접종한다.
저장수를 가하여 총용적 1
로 함.
접종된 영양 배지를 약 30℃에서 48시간 동안 배양하는데, 이 시간중 배양물은 2-인치의 회전반경을 갖는 역진탕기 상에서 분당 114사이클의 비율로 진탕시킨다.
영양 접종물 5ml를 사용하여 500ml에를렌마이어 플라스크에 함유된 하기의 멸균된 생산 배지 100ml부를 무균적으로 접종한다 :
저장수를 가하여 총용적 1
함.
접종된 배양물을 약 26-28℃에서 100시간 동안 배양한다. 배양 기간 동안 배양물을 2-인치 회전 반경을 갖는 역진탕기 상에서 분당 114회전수로 진탕한다. 출발 배지의 pH는 약 pH 6.5이고, 배양 시기 말기에 배지의 pH는 통상 약 pH 7.5로 증가한다.
발효된 배양 브로뜨를 여과하여 균사체 및 기타 비용해된 교체를 제거한다. 여과한 브로뜨는 타일로신을 함유한다
[실시예 12]
타일로신의 또 다른 제조방법.
목적하는 형질전환 미생물의 포자형성 배양물은 하기 조성의 영양 한천 슬랜트상에 유기체를 생육시킴으로써 제조한다.
물을 가하여 총용적 1
로 함.
슬랜트를 유기체의 포자로 접종하고, 접종된 슬랜트는 약 30℃의 온도에서 9일 동안 배양한다. 배양후 슬랜트상의 포자형성 배양물을 물로 덮고, 슬랜트의 표면을 부드럽게 부셔 포자를 회수함으로써 수성 포자 현탁액을 수득한다.
하나의 한천 슬랜트로부터 수득한 접종물의 반을 무균 기술을 사용하여 2에틀렌마이어 플라스크에 함유된 하기 조성물의 멸균된 영양 배양 배지 500ml부에 접종한다 :
물을 가하여 총용적 1
로 함.
28℃에서 48시간 동안 2-인치 회전반경을 갖는 역진탕기 상에서 분당 110사이클로 진탕시키면서 배양한다.
플라스크로부터 영양 접종물 0.25갤론을 350갤론 철발효조에 함유된 상술한 멸균 옥수수 침지 효모I배지 250갤론에 접종물로서 무균적으로 가한다. 소포제 A(The Dow Corning Company가 시판하는 소포재) 0.025캘론을 배양 배지에 가하여 과한 기포 형성을 방비하고, 추가적인 양을 발효도중 필요에 따라 가한다. 접종된 배지를 28℃의 온도에서 24시간 발효시킨다. 발효도중 배지를 분당 27입방 피이트 비율의 멸균 공기로 통기시키고 분당 160회전수로 조작되는 2개의 16인치 날개로 교반시킨다.
1700갤론의 철발효조에 하기 조성을 갖는 배지 1200갤론을 가한다.
물을 가하여 총용적 1000
로 한다.
배지를 발효탱크에서 생육시킨 접종물 96갤론으로 접종한다. 28℃에서 4일동안 발효시키고 소포발생은 "Larex"No. 1 (Swift ＆ Company가 시판하는 소포제)을 필요한 만큼 가하여 조절한다. 발효배지는 분당 128입방 피이트의 비율로 멸균공기를 가하여 통기시키고, 분당 130회전수로 조작되는 2개의 24인치 날개로 교반시킨다.
"Silflo"(The Silfo Company가 시판하는 적층토 필터 보조물) 600파운드를 브로뜨에 가하고 혼합물을 여과한다. 여과물을 20% 수산화나트륨을 가하여 pH 8.5로 조정하고, 클로로포름 500갤론을 가하며, 혼합물을 30분 동안 교반하고, 유탁액 형태의 클로로포름층을 부어 낸다. 클로로포름 추출을 클로로포름 500갤론으로 2회 반복한다. 타일로신을 함유하는 클로로포름 유탁액을 합하여 De Laval분리기를 통해 통과시킴으로써 유탁액을 부수고, 클로로포름 용액을 진공중에서 25
용적으로 농축시킨다. 불순물은 피츠버그 코크앤드 케미칼 캄파니(Pittsburgh Coke and Chemical Co.)가 시판하는 것과 같은 활성탄소 10kg을 함유하는 직경 6인치의 컬럼을 통해 통과시킴으로써 용액으로부터 대충 제거한다. 탄소 컬럼을 클로로포름 16
로 세척하고, 타일로신을 함유하는 합한 클로로포름 용출액을 진공중에서 약 2
의 용적으로 농축한다. 클로로포름 농축물의 석유 에테르 20
에 교반하면서 서서히 가하고, 혼합물을 15분 동안 교반하여, 여과하여 백색의 무정형 침전물인 타일로신을 수거한다.
무정형 타일로신을 아세톤 355ml에 용해하고, 아세톤 혼합물을 여과하여 흐린 상태를 제거하며, 부드럽게 교반하면서 5℃에서 물 20
에 여과된 아세톤 혼합물을 서서히 가하여 결정화한다. 타일로신의 수성 아세톤 용액을 실온에서 부드럽게 교반하면서 방치함으로써 아세톤을 서서히 증발시키고 그에 따라 타일로신이 결정화된다. 타일로신 결정을 여과하여 수거하고 진공중에서 실온으로 건조한다. 타일로신은 약 127-132℃의 융점을 갖는다.
[실시예 13]
타일로신 타르타레이트의 제조방법.
결정성 타일로신 5g을 아세톤 100ml에 용해하고 아세톤 20ml중에 용해된 D-타르 타르산 1.5g을 교반하면서 가한다. 용액을 실온에 방치함에 따라 타일로신의 타르타르산이 용액으로부터 결정화된다. 타일로신의 타르타레이트 염의 결정은 여과하여 수거하고, 아세톤으로 세척하며, 공기-건조한다. 타일로신의 결정성 타르타레이트 염은 약 140-146℃에서 용융한다.
[실시예 14]
타일로신 글루코네이트의 제조방법.
글루코노-델타 락톤 1.03g을 물 10ml에 용해하고, 수성 용액을 85℃로 2시간 동안 가온하여 락톤을 글루콘산으로 가수분해시킨다. 온에탄올 15ml를 수용액에 가한다. 메탄올 10ml중에 용해된 타일로된 5g을 교반하면서 에탄올 혼합물에 가한다. 타일로신 메탄올 혼합물을 실온에서 밤새 방치한다. 진공중에서 실온으로 증발시켜 혼합물로부터 메탄올을 제거한다. 메탄올을 제거한 후 물 40ml를 수성 타일로신 혼합물에 가한다. 희석된 혼합물을 여과하고, 타일로신을 함유하는 여과물을 동결-건조하여 타일로신의 글루코네이트염을 함유하는 백색 고체를 생성시킨다. 타일로신 글루코네이트 염은 약 114-117℃에서 용융한다.
[실시예 15]
타일로신 염산염의 제조방법.
타일로신 890mg을 에테르 200ml에 용해 한다. 에테르 혼합물을 12N 염산 0.082ml를 가하여 산성으로 한다. 형성되는 타일로신 염산염의 침전물을 여과해 내고, 에테르로 세척하며, 진공중에서 건조한다. 타일로신의 염산염을 에탄올-에테르 혼합물로 재결정화한다. 타일로신의 염산염은 약 141-145℃의 융점을 갖는다.
Claims (7)
- 타일로신 또는 타일로신 전구체의 생합성 경로에서 속도-제한적인 효소 또는 유전자 생성물의 발현을 암호화하는 타일로신 또는 타일로신-전구체의 생합성 유전자를 함유하는 DNA클로닝 벡터 또는 그의 일부분으로, 생합성 경로를 통해 타일로신 또는 타일로신 전구체를 생성하는 스트렙토마이세스(Streptomyces)를 형질전환시킨후 : 세포성장, 및 타일로신 또는 타일로신-전구체 생합성 유전자의 발현 및 타일로신 또는 타일로신 전구체의 생성에 적합한 조건하에서 상기 미생물의 타일로신-생산력이 증진되도록 배양함을 특징으로 하여, 타일로신-생성 미생물의 타일로신 또는 타일로신 전구체-생산력을 증진시키는 방법.
- 제1항에 있어서, 미생물이 스트렙토마이세스 프라디아에(Streptomyces fradiae), 스트렙토마이세스 리모서스(Streptomyces rimosus), 또는 스트렙토마이세스 하이그로스코피커스(Streptomyces hygroscopicus)인 방법.
- 제2항에 있어서, 타일로신 생합성 유전자가 tylC, tylD, tylE, tylF, tylH, ty1J, tylK, tylL 또는 tylM인 방법.
- 제3항에 있어서, 생합성 유전자가 tylF인 방법.
- 제1항에 있어서, 클로닝 벡터가 플라스미드 pHJL 280, pHJL 284, pHJL 309, pHJL 311 또는 pHJL 315인 방법.
- 제1항에 있어서, 클로닝 벡터로 형질전환된 미생물이 스트렙토마이세스 프라디아에 GS 15/pHJL280, 스트렙토마이세스 프라디아에 GS 15/pHJL 284, 스트렙토마이세스 프라디아에 GS 15/pHJL 311, 스트렙토마이세스 프라디아에 GS 15/pHJL 315, 스트렙토마이세스 프라디아에 GS 28/pHJL 280, 스트렙토마이세스 프라디아에 GS 28/pHJL 284, 스트렙토마이세스 프라디아에 GS 28/pHJL 311, 스트렙토마이세스 프라디아에 GS 28/pHJL 315, 스트렙토마이세스 프라디아에 GS 16/pHJL 280, 스트렙토마이세스 프라디아에 GS 16/pHJL 315, 스트렙토마이세스 프라디아에 GS 48/pHJL 280, 스트렙토마이세스 프라디아에GS 48/pHJL 315, 스트렙토마이세스 프라디아에 GS 52/pHJL 284, 스트렙토마이세스 프라디아에 GS 52/PHJL 311, 스트렙토마이세스 프라디아에 GS 76/pHJL 280, 또는 스트렙토마이세스 프라디아에 GS 76/pHJL 315인 방법.
- 타일로신 또는 타일로신 전구체의 생합성 경로에서 속도-제한적인 효소 또는 유전자 생성물의 발현을 암호화하며, 미생물의 타일로신-생산력을 증진시키는 발효 조건하에서 발현되는 타일로신 생합성 유전자를 함유하는 DNA클로닝 벡터 또는 그의 일부분으로 형질전환된 미생물(이들은 생합성 경로를 통해 타일로신 또는 타일로신 전구체를 생성한다)을 호기성 발효 조건하에 탄소, 질소 및 무기염의 등화성 공급원을 함유하는 배양 배지중에서 배양시킴으로 특징으로 하여, 타일로신, 타일로신 전구체, 또는 악제학적으로 허용되는 이의 염을 제조하는 방법.
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