ITMI20120559A1 - Procedimento migliorato per la produzione di tiacumicina b - Google Patents
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Description
“PROCEDIMENTO MIGLIORATO PER LA PRODUZIONE DI TIACUMICINA Bâ€
Campo dell’invenzione
La presente invenzione si riferisce a un procedimento migliorato di produzione di Tiacumicina B e particolarmente ad un metodo di fermentazione che previene la degradazione di Tiacumicina B nel brodo di produzione.
Tecnica precedente
La Tiacumicina B, nota anche come Fidaxomicina, appartiene ad una famiglia di macrolattoni, prodotti da actinomiceti, con una storia complessa.
La Tiacumicina B, infatti, ha la stessa struttura della lipiarmycina che fu isolata e descritta da Lepetit nel 1976 in US 3,978,211 come nuovo antibiotico prodotto mediante coltivazione di Actinoplanes deccanensis A/10655 ATCC21983.
Il primo brevetto rivendicava il prodotto lipiarmycina ed un metodo di fermentazione per produrla utilizzando Actinoplanes deccanensis in un terreno nutritivo contenente fonti assimilabili di carbonio, azoto e sali inorganici.
Nel 1986, Abbott Laboratories, depositava un nuovo brevetto US 4,918,174 relativo allo stesso prodotto, che in questo caso era chiamato Tiacumicina B, ottenuto da Dactylosporangium aurantiacum subsp.
hamdenensis.
Il ceppo produttore fu depositato all’ARS Patent Collection del Northern Regional Research Center di Peoria, dove gli fu assegnato il numero di accesso NRRL 18085.
Il brevetto rivendicava le Tiacumicine ed un procedimento per produrre Tiacumicine tramite coltivazione di Dactylosporangium aurantiacum subsp. hamdenensis in un terreno nutritivo.
Più recentemente, Optimer Pharmaceutical ha depositato un nuovo brevetto US 7,507,564 che descrive un procedimento migliorato per la produzione di Tiacumicine allo scopo di ottenere una resa superiore a 50 mcg/ml.
Il procedimento descritto da Optimer à ̈ ancora basato sulla fermentazione di Dactylosporangium aurantiacum, ma in un terreno di fermentazione contenente una resina adsorbente in grado di adsorbire la Tiacumicina B.
La Tiacumicina B Ã ̈ un inibitore della RNA polimerasi.
Il grande interesse nei confronti della Tiacumicina B à ̈ dovuto alla sua attività biologica contro il batterio multiresistente (hospital superbug) Clostridium difficile.
Il C. difficile à ̈ un batterio sporigeno anaerobio Gram-positivo che può provocare gravi infezioni intestinali attraverso la produzione di tossine.
La Tiacumicina B à ̈ un antibiotico a spettro ristretto con una buona attività nei confronti dei clostridi e un’attività minima verso la restante microflora intestinale.
La specificità può essere importante per la riduzione del tasso di ricaduta (recidiva) che si osserva con gli antibiotici ad ampio spettro, poiché il mantenimento dell’equilibrio naturale dei batteri intestinali aiuta a fornire resistenza alla ricolonizzazione da parte dei patogeni.
Recentemente à ̈ stato dimostrato che la Tiacumicina B à ̈ efficace contro il Mycobacterium tuberculosis dotato di resistenza multidrug e presenta anche buona attività antitumorale.
Descrizione dell’invenzione
La presente invenzione si riferisce ad un procedimento migliorato per la produzione della Tiacumicina B e, particolarmente, ad un metodo per prevenire la degradazione della Tiacumicina B, che si verifica naturalmente durante la fermentazione, utilizzando un agente stabilizzante che protegge la Tiacumicina B dalla degradazione chimica.
Analizzando il brodo di fermentazione mediante HPLC, si osserva che la produzione di Tiacumicina B aumenta progressivamente durante il tempo di fermentazione.
Parallelamente, durante la fermentazione, si osserva la comparsa di alcuni prodotti di degrado.
Prolungando la fermentazione, i prodotti di degradado aumentano, mentre la concentrazione di Tiacumicina B diminuisce in modo proporzionale.
Come si osserva frequentemente per altri prodotti di fermentazione, l’ambiente di fermentazione non à ̈ favorevole ai composti chimicamente instabili.
La variazione del pH, l’accumulo di cataboliti e la presenza di attività enzimatiche sono tutte condizioni che concorrono alla degradazione dei composti instabili.
È stato osservato sorprendentemente che l’aggiunta di alcuni polisaccaridi quali la cellulosa o un suo derivato, nel corso della fermentazione, permette di evitare la degradazione del prodotto.
Analogamente le ciclodestrine producono un’analoga azione stabilizzante sul prodotto di fermentazione.
La presente invenzione si riferisce ad un procedimento per la produzione di Tiacumicina B comprendente la fermentazione di un microorganismo della specie Dactylosporangium aurantiacum o Actinoplanes deccanensis in un brodo di fermentazione contenente cellulosa o un suo derivato, oppure una ciclodestrina.
Di particolare utilità risultano la cellulosa microgranulare e la cellulosa microcristallina. Tra i derivati della cellulosa che possono essere impiegati vi sono la l’etil-cellulosa, la fenil-cellulosa e la butil-cellulosa.
Particolarmente preferite sono l’alfa, beta e gamma ciclodestrina, in particolare la beta ciclodestrina.
Il microorganismo preferibilmente utilizzato à ̈ Dactylosporangium aurantiacum subsp. hamdenensis.
La cellulosa à ̈ il biopolimero più abbondante presente in natura. È un polisaccaride che consiste di una catena lineare costituita da unità di D-glucosio legate ß (1→4) in quantità da parecchie centinaia fino a oltre decine di migliaia.
La cellulosa à ̈ il componente strutturale della parete cellulare primaria delle piante verdi, di molte forme di alghe e degli oomiceti.
Il prodotto per uso industriale à ̈ ottenuto principalmente dalla polpa di legno e dal cotone.
La cellulosa à ̈ insapore, inodore, insolubile in acqua e nella maggior parte dei solventi organici, à ̈ chirale e biodegradabile. Può essere degradata chimicamente nelle sue unità glucosio per trattamento con acidi concentrati e temperatura elevata.
Fra i derivati della cellulosa, la cellulosa microcristallina ha numerose applicazioni in campo farmaceutico dove viene utilizzata come eccipiente, in forma di “pellets†, nella formulazione di compresse e capsule.
Analizzando tramite HPLC il brodo di fermentazione dopo l’addizione di cellulosa nel terreno, à ̈ stato osservato sorprendentemente, che in presenza di questo substrato, mentre la produzione di Tiacumicina B aumenta nel tempo, non avviene invece la comparsa di prodotti di degradazione.
L’assenza, o per lo meno l’accumulo minimo, di prodotti di degradazione permette di ottenere una maggiore concentrazione di Tiacumicina B nel brodo.
Inoltre, dato che il brodo contiene come prodotto prevalentemente la Tiacumicina B, il recupero e la purificazione della Tiacumicina B dal brodo di fermentazione diventa più efficiente.
Appare evidente che la presenza di un prodotto prevalentemente puro nel brodo semplifichi il processo di recupero e permetta di evitare stadi di purificazione lunghi e dispendiosi.
La concentrazione della cellulosa o di un suo derivato o della ciclodestrina nel brodo di cultura varia tra 0,5g/L e 50g/L.
Preferibilmente la cellulosa o un suo derivato o la ciclodestrina ha una concentrazione nel brodo di cultura di 20 g/L.
La cellulosa à ̈ un substrato inerte, infatti, il microorganismo produttore, Dactylosporangium aurantiacum, può crescere in presenza di cellulosa senza metabolizzarla.
La cellulosa à ̈ un substrato naturale ed a basso costo che può essere aggiunto facilmente durante la fermentazione all’inizio della produzione e non interferisce con la crescita del microrganismo o la produzione dell’antibiotico.
La cellulosa o un suo derivato o la ciclodestrina può essere aggiunto quando inizia la produzione di Tiacumicina B in un'unica volta o gradualmente durante la fermentazione. In genere l’aggiunta di cellulosa o del suo derivato o della ciclodestrina può essere effettuata con un’aggiunta singola, a 72h di fermentazione, o con aggiunte graduali nel tempo, da 72h in poi.
La cellulosa viene aggiunta preferibilmente come sospensione acquosa sterile. Le ciclodestrine sono degli oligosaccaridi ciclici con una struttura cava a tronco di cono. Sulla base della larghezza dell’anello vengono classificate in alfa, beta e gamma.
Sono prodotti naturali derivati dall’amido che vengono utilizzati in campo farmaceutico in quanto non presentano tossicità se somministrate per via orale.
Il loro impiego principale farmaceutico à ̈ quello nella preparazione di compresse e capsule.
Le ciclodestrine formano complessi stabili in acqua con molecole liofile che ospitano all’interno della cavità . La porzione idrofila esterna assicura la solubilità in acqua.
Esempio 1
Dactylosporangium aurantiacum subsp. hamdenensis AB718C-41 NRRL18085 fu mantenuto a -180°C (WCB). La coltura stock fu usata per inoculare una beuta (seed flask) contenente 40 ml di terreno vegetativo VBF-1 (Tabella 1) che fu incubata su un agitatore rotante per 72h a 30°C e 250 rpm.
INGREDIENTE 1 L
Estratto lievito 7,5 g
Destrosio 1 g
Amido solubile 24 g
Peptone di soia 7,5 g
Estratto carne 3 g
CaCO34 g
pH corretto a 7.3
Sterilizzazione 121C° x 30 min
Tabella 1. terreno vegetativo VBF-1
Al termine dell’incubazione, la coltura vegetativa fu trasferita
asetticamente (0,8% di inoculo) in una beuta contenente 30 ml di terreno
produttivo VPF-1 (tabella 2) che fu incubata su agitatore rotante a 30°C e
250 rpm.
A 72h di fermentazione una sospensione sterile di cellulosa (Solka Floc
BW100) fu aggiunta asetticamente al brodo di fermentazione per raggiungere
una concentrazione di 20 g/L nel terreno. L’incubazione fu quindi prolungata
fino a 144h.
INGREDIENTE 1 L
Destrosio 20 g
Farina di soia 10 g
Estratto lievito 3 g
Olio di soia 1 g
K2HPO4*7H2O 0,05 g
MgSO4*7H2O 0,05 g
KCl 0,03
CaCO33 g
Senza correzione del pH
Sterilizzazione 121C° x 30 min
Esempio 2
Dactylosporangium aurantiacum subsp. hamdenensis AB718C-41
NRRL18085 fu mantenuto a -180°C (WCB). La coltura stock fu usata per
inoculare una beuta (2L capacità ) contenente 450 ml di terreno vegetativo
VBF-1 (Tabella 1) che fu incubata su agitatore rotante per 72h a 30°C e
150 rpm.
Al termine dell’incubazione, 1,4% di inoculo vegetativo fu trasferito
asetticamente in un fermentatore, 20 L di capacità , contenente 18 L di terreno
produttivo VPF-2 (Tabella 3) che fu incubato a 30°C, 0.75vvm, 0.5 bar.
Durante la fermentazione, fu alimentata una soluzione di glucosio
(35%) per mantenere la concentrazione di glucosio nel brodo a 3 g/L.
A 72h di fermentazione, una sospensione sterile di cellulosa (Solka
Floc BW100) (concentrazione finale 20 g/L) fu aggiunta asetticamente al
brodo di fermentazione. L’incubazione fu quindi prolungata fino a 230h.
INGREDIENTE 1 L
Destrosio 10 g
Farina di soia 10 g
Caseina 3 g
Olio di soia 1 g
K2HPO4*7H2O 0,5 g
MgSO4*7H2O 0,5 g
KCl 0,3
CaCO33 g
Senza correzione del pH
Sterilizzazione 121C° x 30 min
Tabella 3. Terreno Produttivo VPF-2
Esempio 3
Dactylosporangium aurantiacum subsp. hamdenensis AB718C-41 NRRL18085 fu mantenuto a -180°C (WCB). La coltura stock fu usata per inoculare una beuta (2L capacità ) contenente 450 ml di terreno vegetativo VBF-1 (Tabella1) che fu incubata su agitatore rotante per 72h a 30°C e 150rpm.
Al termine dell’incubazione, 1,4% di inoculo vegetativo fu trasferito asetticamente in un fermentatore, di 20L di capacità , contenente 18L di terreno produttivo VPF-2 (tabella 3) che fu incubata a 30°C, 0.75vvm, 0.5 bar.
Durante la fermentazione, fu alimentata una soluzione di glucosio (35%) per mantenere la concentrazione di glucosio nel brodo a 3 g/L.
A partire da 72h di fermentazione, una sospensione sterile di cellulosa (Solka Floc BW100) fu aggiunta asetticamente ogni 24h al brodo di fermentazione per raggiungere, dopo 4 aggiunte, una concentrazione finale nel terreno di 20 g/L. L’incubazione fu quindi prolungata fino a 230h.
Claims (10)
- RIVENDICAZIONI 1. Un procedimento per la produzione di Tiacumicina B comprendente la fermentazione di un microorganismo della specie Dactylosporangium aurantiacum in un brodo di fermentazione contenente cellulosa o un suo derivato o una ciclodestrina.
- 2. Il procedimento secondo la rivendicazione 1 in cui il microorganismo à ̈ Dactylosporangium aurantiacum subsp. Hamdenensis.
- 3. Il procedimento secondo la rivendicazione 1 o 2 contenente cellulosa.
- 4. Il procedimento secondo la rivendicazione 1 o 2 in cui il derivato della cellulosa à ̈ cellulosa microgranulare o microcristallina.
- 5. Il procedimento secondo la rivendicazione 1 o 2 contenente un derivato della cellulosa scelto nel gruppo costituito da etil-cellulosa, butil-cellulosa, fenil-cellulosa.
- 6. Il procedimento secondo la rivendicazione 1 o 2 contenente una ciclodestrina scelta nel gruppo costituito da ciclodestrina alfa, beta o gamma.
- 7. Il procedimento secondo la rivendicazione 6 in cui la ciclodestrina à ̈ la beta-ciclodestrina.
- 8. Il procedimento secondo le rivendicazioni 1-7 in cui la cellulosa o un suo derivato o la iclodestrina ha una concentrazione nel brodo di fermentazione tra 0,5g/L e 50g/L.
- 9. Il procedimento secondo le rivendicazioni 1-8 in cui la cellulosa o il suo derivato o la ciclodestrina ha una concentrazione nel brodo di cultura di 20 g/L.
- 10. Il procedimento secondo le rivendicazioni 1-9 in cui la cellulosa o un suo derivato o la ciclodestrina viene aggiunta all’inizio della produzione della Tiacumicina B in un'unica volta o gradualmente durante la fermentazione.
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| IT000559A ITMI20120559A1 (it) | 2012-04-05 | 2012-04-05 | Procedimento migliorato per la produzione di tiacumicina b |
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