CN102229905B - 不吸水链霉菌Str-8及利用其制备ε-聚赖氨酸及其盐的方法 - Google Patents
不吸水链霉菌Str-8及利用其制备ε-聚赖氨酸及其盐的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种不吸水链霉菌Str-8及利用其制备ε-聚赖氨酸及其盐的方法。该菌于2011年6月2日，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉市武汉大学，其保藏号为：CCTCC NO：M2011191。利用该菌可以发酵制备ε-聚赖氨酸及其盐。因此可以利用此菌株大量生产ε-聚赖氨酸及其盐，并为进一步选育ε-聚赖氨酸高产菌株提供了优良的新出发菌株。
Description
技术领域：
本发明属于发酵工程技术领域，具体涉及一种高产ε-聚赖氨酸(ε-poly-L-lysine，ε-PL)的微生物菌株-不吸水链霉菌(Streptomyces ahygroscopic)Str-8，以及用其发酵生产制备ε-聚赖氨酸及其盐的方法。
背景技术：
ε-聚赖氨酸是一种由微生物产生的氨基酸同型聚合物，由L-赖氨酸的ε-氨基和另一赖氨酸的α-羧基形成的ε-酰胺键连接而成。ε-聚赖氨酸具有抗革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌和病毒的活性，可以食用且对人体没有任何毒副作用，是一种性能优良的生物防腐剂，可广泛应用于化妆品、基因载体、药物包被、电子材料和环保材料等方面。
现有技术中发酵生产ε-PL的方法，已知有一种方法(日本专利：JP 3-42070)，在培养基中培养白色链霉菌346-D的突变株，即白色链霉菌lysinopolymerus亚种11011A-1(FERMBP-1109)，然后从培养基中分离和纯化ε-PL，并在1989年，日本Chisso公司利用此菌株实现了产业化生产。目前只有日本国内几家公司和科研院所拥有ε-PL的生产技术，整个ε-PL行业为极为少数的公司所垄断。此外，在我国尚未拥有自主知识产权的ε-PL生产菌株，ε-PL微生物发酵生产技术在国内还处于实验室阶段。因此，筛选新的ε-PL产生菌株，不断丰富ε-PL产生菌株，了解ε-PL产生菌的生物多样性，开发出高效的ε-PL制备方法仍然十分有意义。
发明内容：
本发明的目的是提供一种与现有ε-聚赖氨酸产生菌株不同的、能高产ε-聚赖氨酸的不吸水链霉菌(Streptomyces ahygroscopic)Str-8及利用该菌制备ε-聚赖氨酸及其盐的方法。本发明的不吸水链霉菌(Streptomyces ahygroscopic)Str-8于2011年6月2日，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉市武汉大学，其保藏号为：CCTCC NO：M2011191。
本发明的不吸水链霉菌(Streptomyces ahygroscopic)Str-8是从广东省的某处土壤中筛选分离得到的。
将从土壤中分离得到的Str-8菌株用细菌基因组DNA快速提取试剂盒(广州东盛生物科技有限公司)提取菌株总DNA，以总DNA为模板，采用16S rDNA的通用引物：
8F(5h-AGAGTTTGATCCTGG CTCAG-3h)
1492R(5h-GGTTACCTTGTTACGACTT-3h)
进行PCR扩增，PCR纯化产物委托深圳华大基因研究院测序，菌株16S rDNA序列如SEQID NO.1所示，全长为1431bp，GenBank中的序列号为HM246524。对菌株的16S rDNA序列进行BLAST比对发现，其与链霉菌属的多个种的16s rDNA序列相似性为99％。选取相似序列，进一步采取ClustalX对高同源序列进行多序列连配分析，利用MEGA3.1软件按照N-J法聚类构建系统发育树，系统发育树如图1所示，Str-8菌株与淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastatochromogenes)、白浅灰链霉菌(Streptomyces albogriseus)、不吸水链霉菌(Streptomyces ahygroscopicus)在同一个分支上，可见它们是同源的，所以初步确定Str-8菌株为以上链霉菌属中的一个种。
Str-8菌株的形态和生理生化性质如下：
1、形态特征：
Str-8菌株在高氏一号合成培养基中生长中度，营养菌丝体不分隔，不断裂，为杆状体，产生气生菌丝，孢子成链形成，符合链霉菌属(Streptomyces)特征，在蛋白质培养基中，气生菌丝体灰色，产生松敞螺旋，与链霉菌属的烬灰类群和金色类群相似。在电子显微镜(见图2)下孢子丝部分形成螺旋形，孢子大部分球形至椭圆形，孢子壁外有刺状物，大小均一，通过与链霉菌属相关已知种比较，发现菌株Str-8与不吸水链霉菌(Streptomyces ahygroscopicus)的形态相似。
2、培养特征
30℃培养7-20天，菌株在下列各种培养基上具有典型的特征，具体如表1所示。
表1：不吸水链霉菌(Streptomyces ahygroscopicus)Str-8的培养特征
3、生理生化性质
该菌培养温度：在25～37℃，最适温度为30℃，其他生理生化特征如表2所示。
表2：不吸水链霉菌(Streptomyces ahygroscopicus)Str-8的生理生化特征
注：-：阴性；+：阳性。
4、可以利用的碳源：
葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖、甘油、淀粉、甘露醇、肌醇。
5、可以利用的氮源：
有机氮源：牛肉膏、酵母膏、蛋白胨、尿素等，也可以采用无机氮源(NH4)2SO4、NH4Cl、NH4NO3等。
上述氮源可以单独使用也可以复合使用，复合使用效果更好。
Str-8菌株纯细胞壁水解液中主要含L-DAP(2，6-二氨基庚二酸)，全细胞壁水解液送到广州分析测试中心检测发现当中没有特征性糖，属于I型细胞壁类型，符合链霉菌属的特征。其主要的培养特征(表1)、生理生化特性(表2)与不吸水链霉菌基本相同。因此，结合上面分子生物学、形态学和生理生化特征的分析结果，确定菌株Str-8属于不吸水链霉菌(S.ahygroscopicus)，是一株新的不吸水链霉菌(S.ahygroscopicus)，将此菌命名为不吸水链霉菌(Streptomyces ahygroscopic)Str-8，于2011年6月2日，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉市武汉大学，其保藏号为：CCTCC NO：M2011191。
经实验发现，本发明的不吸水链霉菌Str-8能高效生产ε-聚赖氨酸，因此本发明还提供不吸水链霉菌Str-8在制备ε-聚赖氨酸及其盐中的应用。
本发明还提供了一种ε-聚赖氨酸及其盐的制备方法，它是以不吸水链霉菌Str-8作为发酵菌株进行发酵，从发酵液中制备分离得到ε-聚赖氨酸及其盐。
所使用的培养基只需含有不吸水链霉菌(Streptomyces ahygroscopic)Str-8能使用的碳源、氮源、无机盐等营养因子即可。
碳源并没有特定的限制，可以使用葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖、甘油、淀粉、甘露醇、肌醇等，其中葡萄糖较为合适。
氮源包括有机氮源如牛肉膏、酵母膏、蛋白胨、尿素等，也可以采用无机氮源(NH4)2SO4、NH4Cl、NH4NO3等。上述氮源可以单独使用，也可混合使用。
所述的以不吸水链霉菌Str-8作为发酵菌株进行发酵，其发酵培养基优选每升含有：酵母浸汁3.365g，葡萄糖10.149g，(NH4)2SO4 6.785g，K2HPO4 0.8g，KH2PO4 1.36g，MgSO4·7H2O0.5g，ZnSO4·7H2O 0.04g，FeSO4·7H2O 0.5g，余量为水。以此种发酵培养基进行发酵，ε-聚赖氨酸的产量高。
目前已报道的ε-聚赖氨酸产生菌主要为白色链霉菌，还有北里孢菌、灰橙链霉菌和淀粉酶产色链霉菌，而不吸水链霉菌则未见报道。本发明筛选到的不吸水链霉菌Str-8是一种新的不吸水链霉菌，不但能够产生ε-聚赖氨酸，而且还能高效的产生ε-聚赖氨酸，其初始产量可达0.846g/L，之前报道过的几株ε-聚赖氨酸产生菌其初始摇瓶产量一般为0.2～0.4g/L。因此可以利用此菌株大量生产ε-聚赖氨酸及其盐，并为进一步选育ε-聚赖氨酸高产菌株提供了优良的新出发菌株。
本发明的不吸水链霉菌(Streptomyces ahygroscopic)Str-8，于2011年6月2日，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉市武汉大学，其保藏号为：CCTCC NO：M2011191。
附图说明：
图1是根据不吸水链霉菌(Streptomyces ahygroscopic)Str-8的16S rDNA全序列构建的系统发育树；
图2是不吸水链霉菌(Streptomyces ahygroscopic)Str-8在固体培养基上的孢子丝的扫描电镜图；
图3是水解产物的薄层层析图；
图4是发酵纯化产物的质谱图。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：
斜面培养基(g/L)：可溶性淀粉20，KNO3 1，NaCl 0.5，K2HPO4 0.5，MgSO4 0.5，FeSO40.01，琼脂20，溶剂为水；pH 7.1～7.5；121℃灭菌20min。
摇瓶培养基(g/L)：葡萄糖50，酵母浸出粉5，(NH4)2SO4 10，K2HPO4 0.8，KH2PO4 1.36，MgSO4·7H2O 0.5，ZnSO4·7H2O 0.04，FeSO4·7H2O 0.5，溶剂为水；pH 6.8，121℃灭菌20min。每250mL容积的三角瓶中装液50mL。
将不吸水链霉菌Str-8接种到斜面培养基上，28～30℃培养72h，然后接一环此菌的孢子到装有50ml摇瓶培养基的250ml三角瓶中，30℃培养72h，摇瓶转速为190r/min，而获得发酵液。将发酵液8000r/min离心10min，上清液用NaOH调pH至8.5，再12000r/min离心10min，上清液用阳离子(H+)交换树脂(D152)吸附后，分别用0.2mol/L醋酸和0.1mol/L盐酸进行冲洗和洗脱，洗脱液用NaOH中和至pH 6.5，12000r/min离心10min，上清液转入透析袋3000中透析1～2d，再用乙醇沉淀，得到发酵纯化产物。
1、产物成分鉴定：将发酵纯化产物的水解液、ε-聚赖氨酸标准品(购自浙江银象生物工程有限公司)的水解液和赖氨酸标准品(购自广州化学试剂厂)进行薄层层析，具体方法如下：
将发酵纯化产物、ε-聚赖氨酸标准品、赖氨酸标准品加入螺旋管中，加入6mol/L HCL，120℃水解24h，用薄层层析分析其组成成分。
薄层层析板：硅胶板
展开剂∶正丁醇∶冰醋酸∶吡啶∶水＝4∶1∶1∶2(体积比)
显色剂：质量分数为0.2％的茚三酮乙醇溶液
结果如图3所示，其中A：赖氨酸标准品；B：不吸水链霉菌Str-8的发酵纯化产物；C：ε-聚赖氨酸标准品水解产物，由图中可以看出不吸水链霉菌Str-8的发酵纯化产物、ε-PL的水解产物和赖氨酸标准品在薄板上仅形成一个斑点且Rf值相等。由此得出结论：不吸水链霉菌Str-8发酵纯化产物为赖氨酸的均聚物。
2、样品的分子量测定：采用MALDI-TOF-MS测定不吸水链霉菌Str-8的发酵纯化产物-ε-聚赖氨酸相对分子质量的分布(参考文献：Maeda S，Kunimoto KK，Sasaki C，et al.Characterization of microbial poly(ε-L-lysine)by FT-IR，Raman and solid state 13C NMR spectroscopies[J].Journal of Molecular Structure，2003，655(1)：149-155.)，结果如图4所示，不吸水链霉菌Str-8产生的ε-聚赖氨酸相对分子量质量分布为3600～4551D，且主要集中在4112D。根据赖氨酸的分子量，可知其对应聚合度为25～30，主要为28，与文献报道(参考文献：Nishikawa M，Ogawa K.Distribution of microbes producing antimicrobial epsilon-poly-L-lysine polymers in soil microflora determined by a novel method[J]Appl Environ Microbiol，2002，68(7)：3575-3581.)的相符。
由此可见，本发明的不吸水链霉菌Str-8能够产生的ε-聚赖氨酸，所产生的ε-聚赖氨酸具有以下理化性质：
(1)溶于水、盐酸，微溶于乙醇，不溶于乙醚、乙酸乙酯等有机溶剂；
(2)对茚三酮反应成阳性，用6mol/L HCl水解后对茚三酮呈阳性。
(3)6mol/L HCl水解后，用薄层层析检测，发现水解液中生成单一的氨基酸——赖氨酸，本产品为赖氨酸的高分子聚合物。
(4)采用MALDI-TOF-MS测定ε-PL相对分子质量为3600D～4551D，且主要集中在4112D。
并通过改进的Itzhaki方法(参考文献：Itzhaki R F.Colorimetric method for estimatingpolylysine and polyarginine[J].Analytical Biochemistry，1972，50(2)：569-574.)，具体方法如下：
ε-聚赖氨酸标准曲线的测定：取0.2mL ε-聚赖氨酸浓度为0～0.4g/L的标准液与0.8mL 500μmol/L甲基橙溶液混合，于30℃振摇反应30min，12000r/min离心3min，将上清液用磷酸钾缓冲液稀释8倍，置分光光度计464nm处测定吸光值，以磷酸钾缓冲液与甲基橙反应为空白对照，得出标准曲线和曲线方程。
本实施例中的发酵液也按照上述方法处理，得到464nm处的吸光值，并通过标准曲线算出发酵液中ε-聚赖氨酸的含量。由此测得本实施例的发酵液中ε-聚赖氨酸含量为0.864g/l。
实施例2：
发酵培养基(g/L)：酵母浸汁3.365，葡萄糖10.149，(NH4)2SO4 6.785，K2HPO4 0.8，KH2PO41.36，MgSO4·7H2O 0.5，ZnSO4·7H2O 0.04，FeSO4·7H2O 0.5，溶剂为水。
按照实施例1的方法，将不吸水链霉菌Str-8接种到斜面培养基上，28～30℃培养72h，然后接一环此菌的孢子到装有50ml发酵培养基的250ml三角瓶中，30℃培养72h，摇瓶转速为190r/min，而获得发酵液。按照实施例1的改进的Itzhaki方法测定ε-聚赖氨酸含量为1.992g/L。
实施例3：
将葡萄糖1000g，酵母膏100g，(NH4)2SO4 200g，K2HPO4 16g，KH2PO4 27.2g，MgSO4·7H2O 10g，ZnSO4·7H2O 0.8g，FeSO4·7H2O 0.6g，用氨水调pH6.8，装入一个30L的发酵罐中，用水定容至20L，121℃蒸汽灭菌15min，作为发酵培养基。将不吸水链霉菌Str-8用种子培养基30℃培养24h，种子培养基与发酵培养基的配方相同。将种子液1000mL接入冷却后的发酵培养基中，30℃培养，通风比0.5∶1.5vvm，搅拌转速为350r/min，发酵过程控制pH4.0，到72h时，通过改进的Itzhaki方法测定发酵液中含有ε-聚赖氨酸4.05g/L。
实施例4：
将葡萄糖1000g，酵母膏100g，(NH4)2SO4 200g，K2HPO4 16g，KH2PO4 27.2g，MgSO4·7H2O 10g，ZnSO4·7H2O 0.8g，FeSO4·7H2O 0.6g，用氨水调pH6.8，装入一个30L发酵罐中，用水定容至20L，121℃蒸汽灭菌15min，作为发酵培养基。将不吸水链霉菌Str-8用种子培养基30℃培养24h，种子培养基与发酵培养基的配方相同。将种子液1000mL接入冷却后的发酵培养基中，30℃培养，通风比0.5∶1.5vvm，搅拌转速为350r/min，发酵过程控制pH4.0，并流加培养基(含1000g/L葡萄糖和100g/L硫酸铵)，维持葡萄糖浓度在10～20g/L，发酵时间为168h时，通过改进的Itzhaki方法测定发酵液中含有ε-聚赖氨酸20.1g/L。将发酵液离心去除菌体，上清液用NaOH调pH值至8.5，再离心取上清液，上清液用阳离子(H+)交换树脂(D152)吸附，用0.2mol/L醋酸溶液冲洗，再用0.1mol/L盐酸溶液洗脱，洗脱液经活性炭吸附脱色，再透析截留ε-聚赖氨酸，再用乙醇沉淀，得到ε-聚赖氨酸盐酸盐86.23g，SDS-PAGE测得分子量为4000D。
Claims (4)
1.一种不吸水链霉菌(Streptomyces ahygroscopic)Str-8，其保藏编号为：CCTCC NO：M2011191。
2.权利要求1所述的不吸水链霉菌Str-8在制备ε-聚赖氨酸及其盐中的应用。
3.一种ε-聚赖氨酸及其盐的制备方法，其特征在于，是以权利要求1所述的不吸水链霉菌Str-8作为发酵菌株进行发酵，从发酵液中制备分离得到ε-聚赖氨酸及其盐。
4.根据权利要求3所述的ε-聚赖氨酸及其盐的制备方法，其特征在于，所述的以不吸水链霉菌Str-8作为发酵菌株进行发酵，其发酵培养基为每升含有：酵母浸汁3.365g，葡萄糖10.149g，(NH4)2SO4 6.785g，K2HPO4 0.8g，KH2PO4 1.36g，MgSO4·7H2O 0.5g，ZnSO4·7H2O0.04g，FeSO4·7H2O 0.5g，余量为水。
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