CN101302248B

CN101302248B - 高纯度替考拉宁的生产方法

Info

Publication number: CN101302248B
Application number: CN2007101071856A
Authority: CN
Inventors: 孙新强; 葛永红; 章槐东; 胡三明
Original assignee: Zhejiang Medicine Co Ltd Xinchang Pharmaceutical Factory
Current assignee: Zhejiang Medicine Co Ltd Xinchang Pharmaceutical Factory
Priority date: 2007-05-09
Filing date: 2007-05-09
Publication date: 2013-12-11
Anticipated expiration: 2027-05-09
Also published as: CN101302248A

Abstract

本发明提供了一种高纯度替考拉宁的生产方法，所述方法包括：阶段a，对替考拉宁粗品溶液进行凝胶层析、和大孔吸附分离以得到替考拉宁粗品溶液；阶段b，将所述替考拉宁粗品溶液进行活性炭脱色、超滤、纳滤及结晶以得到高纯度替考拉宁。所述方法最大限度地提高了替考拉宁的生产效率，从而实现高纯度替考拉宁的产业化。

Description

高纯度替考拉宁的生产方法

技术领域

本发明涉及利用变异株替考游动放线菌属(actinoplanesteichomyceticus var jianesis)提纯生产抗生物质替考拉宁的方法；更具体地说，利用替考游动放线菌的新型变异菌株-替考游动放线菌提纯生产抗生物质-替考拉宁的高效方法。

背景技术

所谓抗生物质是指，在1mg/ml以下的低浓度环境中，抑制其他生物体繁殖的低分子化合物。所以，通常抗生物质的范畴，不仅包括医药用抗生物质，而且还包括抗癌剂、农业用杀菌剂、除草剂及杀虫剂等；而且，根据抗菌活性、作用原理、生产菌株、合成方法、化学结构等，还可以细分上述抗生物质。

另一方面，到目前为止从天然物中分离出了大约10000多种抗生物质；而这些抗生物质的50％以上，是利用放线菌类进行提纯生产的；其中大部分放线菌属于链霉菌属。从1974年起，研究人员开始对链霉菌属之外的稀有放线菌开展了相关研究；通过多年的努力，从上述稀有放线菌分离出了多种有效抗生物质。

随着抗生物质的不断发现及抗生剂领域的显著发展，抗生剂的使用量也急剧增加；由于抗生剂的过度使用，导致了病菌的耐药性逐渐增强的不良现象。例如，医院对患者的治疗中大量使用了各种抗生剂，由此导致了耐抗生剂病原菌的出现和急速繁衍；作为从住院患者体内分离出的主要病原菌之一，葡萄球菌属(Staphylococcus aereous)是比较代表性的生产β-内酰胺酶的菌株，是一种对青霉素系抗生剂有耐药性的微生物。

为了有效地应付对抗生剂具备耐药性的病原菌，相关研究人员不断在寻找，对耐药性病原菌有活性的抗生物质以及针对较广范围内病原性微生物的选择性清除方法。与此同时，对人类、动物以及农作物没有任何毒性的新型抗生物质，也逐渐成为该领域的研究重点；其中最具代表性的是糖肽系列抗生剂。

据悉上述糖肽系列抗生剂对革兰氏阳性菌非常有效。另外，糖肽系列抗生剂的结构特点是，取代基带苯环的5个以上氨基酸直线状形成了缩氨酸，而且根据种类的不同，每个氨基酸苯环上连接有糖、氯基以及甲基等。

替考拉宁(teicoplanin)是比较代表性糖肽系列抗生剂，如今广泛应用于临床治疗；上述物质可分类为，根据极性差异划分的T-A2-1或T-A2-5的复合体以及上述T-A2的提纯过程中生成的T-A3。而替考拉宁的抗菌活性机理是，该物质可以阻碍，在革兰氏阳性菌株的细胞壁合成过程中，肽聚糖合成中间体的相互结合，从而起到了抑制上述细菌成长的作用。

具备上述特性的替考拉宁，由于其出众的药效及极小的副作用，其相关产品的进口量逐年大幅增加。但是，上述替考拉宁不仅化学合成比较难，而且至今为止生物合成过程也没有得到完全证实；目前，只能对发酵生产投入更多的研究力量。

为了实现上述替考拉宁的高效大量生产，对新型菌株及提纯方法的研究也逐渐加大力度；但是，现有的替考拉宁生成菌株只具备非常低的产率，无法适用于产业性大量生产工程中；而且，现有的提纯方法也存在效率低、得到的替考拉宁纯度差，很难实现产业化的缺点。

现有的替考拉宁生产方法中，作为替考拉宁生成菌株，一般性采用替考游动放线菌属(Actinoplanes teichomyceticus nov.sp.ATCC第31121号)；但是，上述菌株存在生产效率低以及不利于产业性大量生产工程的问题。

另外，大韩民国专利第100691号中记载有如下内容：将上述菌株的培养液或者处理流出物中生成的水溶液，与能够吸收上述抗生物质-替考拉宁的聚酰胺层析柱相接触，从水溶液中分离出上述树脂；然后，用水性溶出剂混合物洗涤已分离出的树脂，接着从上述溶出剂中分离/提纯出上述替考拉宁。其实，替考拉宁的最佳生长条件是pH7以上的弱碱性状态；但是，上述分离方法只能在酸性pH培养液环境中分离/提纯替考拉宁，而酸性环境会阻碍菌株的生长；因此上述分离/提纯方法不仅存在生产效率低的缺陷，而且还存在无法解决菌株的培养及替考拉宁的分离过程中产生的菌株自我毒性的问题点。所谓自我毒性现象是指，上述菌株生成的抗生物质-替考拉宁阻碍菌株的自我代谢，从而阻碍替考拉宁的生成；对抗生物质的生成来说，上述自我毒性现象就会降低其生成效率。

还有，现有文献[参照M.R.巴尔顿(M.R.Bardon)等的Journal ofAntibiotics，第31卷，第3号，第170-177页(1978年3月)]中记载有，从菌株-游动放线菌属的过滤发酵液中分离替考拉宁的方法；而上述分离方法中包括，在酸性pH环境内利用丁醇提取上述发酵液并实施洗涤及浓缩的工程；由于强酸性离子交换树脂的使用，存在替考拉宁的部分糖成分发生分解的问题点。如果采用强碱性离子交换树脂，容易发生差向异构化，就会损失生物学活性。再加上离子树脂的特性，使得从水溶液中的有色不纯物和副产物分离出替考拉宁的工程难上加难。

就是因为现有的技术存在上述问题点，我们切实需要开发出，能够适用产业化生产，且替考拉宁的生产效率较高的菌株及提纯方法。

发明内容

本发明是为了解决替考拉宁的生产方法上存在的上述问题而发明的，其目的是提供高纯度替考拉宁的生产方法，能在稳定的条件下实施整个生产过程，且经济实用，安全的高纯度替考拉宁生产方法。

为了达到上述目的，本发明提供了一种高纯度替考拉宁的生产方法，所述方法包括：

阶段a，对替考拉宁粗品溶液进行凝胶层析、大孔吸附分离以得到替考拉宁粗品溶液；

阶段b，将所述替考拉宁粗品溶液进行活性炭脱色、超滤、纳滤及结晶以得到高纯度替考拉宁。

根据本发明，在阶段a中所述凝胶层析采用葡聚糖凝胶或琼脂糖类凝胶进行层析。

根据本发明，在阶段a中所述大孔吸附分离采用孔径为20～300埃的多孔性吸附树脂进行分离。

根据本发明，在阶段b中所述超滤采用陶瓷、聚醚砜或者再生纤维素材质的分子量cut-off大小为3,000Da～300,000Da的超滤膜进行超滤。

其中，所述超滤膜分子量cut-off大小包括3,000Da～6,000Da。

根据本发明，在阶段b中所述纳滤采用纳滤膜为聚醚砜或者再生纤维素材质的分子量cut-off大小为100～1000Da的纳滤膜进行纳滤。

其中，所述纳滤膜分子量cut-off大小为700Da～800Da。

根据本发明，在阶段b中所述超滤和纳滤分别在温度0～55℃下进行。

根据本发明，在阶段b中所述超滤和纳滤分别在温度10～25℃下进行。

根据本发明，在阶段b中所述结晶采用酮进行结晶，其中，所述酮为C3-C6的酮，包括丙酮、丁酮或环己酮。

下面将进一步阐述本发明的生产方法。

阶段a：

上述替考拉宁的生产方法中，将变异株-actinoplanesteichomyceticus var jianesis作为生产替考拉宁的菌株。

上述替考拉宁的生产方法中，凝胶层析采用的凝胶为美国GE公司的capto streamline，sephadex，sepharose Big Beads，sepharose XL，sepharose fast flow，sepharose high performance，source，superdex prepgrade sephacryl hig hresolution，sepharose fast flow，sephadex g-25，sephadex LH-20。北京三博远志的葡聚糖凝胶G-10、G-15之一。

上述替考拉宁的生产方法中，大孔吸附分离的树脂为上海华震的Hz816、Hz803、HZ841，天津四光的D101、D101-I DA201、JD-1，罗门哈斯的Amberlite ^TM XAD1180、Amberlite ^TM XAD761，日本三菱的DIAION^(R)HP21之一。

阶段b：

上述替考拉宁的生产方法中，脱色阶段中所采用的活性炭型号为活性炭型号针用活性炭767、737，糖用活性炭303之一。

上述替考拉宁的生产方法中，超滤阶段所采用的超滤膜为陶瓷、聚醚砜或者再生纤维素材质的分子量cut-off大小为3,000Da～300,000Da的超滤膜，本发明建议使用的超滤膜分子量cut-off大小为3,000Da～6,000Da，可以使用以下超滤膜中的任意一种：密理博公司(Millipore Co.)的Pellicon module Biomax、Ultracel超滤膜、Prostakmodule的PT、PL超滤膜、Spiral Wound Ultrafiltration module的PT、PL、Helicon超滤膜、德国赛多利斯股份公司(Sartorius AG)的SatroconUltrasart超滤膜、颇尔公司(Pall Co.)的OMEGA^TM、ALPHA^TM、REGEN^TM、SUPOR^TM超滤膜、陶氏化学公司(Dow Chemical Co.)的Filmtec^TM超滤膜、安法玛西亚公司(Amersham Pharmacia)的Kvick^TM超滤膜。始终维持10～25℃温度条件和0～4.0bar的流入压及0～3.5bar的流出压。

上述替考拉宁的生产方法中，上述米格列醇生产方法中，纳滤阶段所采用的纳滤膜为聚醚砜或者再生纤维素材质的分子量cut-off大小为100～1000Da，本项发明中建议使用的纳滤膜分子量cut-off大小为700Da～800Da，可以使用美国OSMONICS的纳滤膜，始终维持10～25℃温度条件和0～2.0Mpa的流入压及0～1.8Mpa的回流压。

上述替考拉宁的生产方法中，本发明采用向替考拉宁的浓缩液中加入C3-C6的酮，搅拌至有大量白色固体析出，回收固体，用红外灯干燥晶体，即得到高纯度替考拉宁成品。用HPLC法检测，替考拉宁A2峰面积为90.1％，纯度达93.1％以上。

正如前面所述，本项发明可以提供高效地提纯生产替考拉宁的方法，采用了陶瓷膜超滤、离子交换、结晶等新技术，最大限度地提高了替考拉宁的生产效率，从而实现高纯度替考拉宁的产业化。

具体实施方式

实施例1

将10g替考拉宁粗品溶解于200mlNa₂CO₃:NaHCO₃＝0.05M:0.01M的缓冲溶液中，过滤得200ml滤液，对该滤液进行HPLC分析，结果替考拉宁含量为7.05g，该滤液PH值为9.2，把上述滤液以0.2BV/hr的流速滴在填充了200ml Q sepharose凝胶的柱(ф3mm×30mm)上，再分别以4BV的Na₂CO3:NaHCO₃＝0.05M:0.1M缓冲溶液，4BV含0.1％三羟甲基氨基甲烷的上述缓冲液以2BV/hr的流速进行预洗，最后用含1％三羟甲基氨基甲烷的上述缓冲液以2BV/hr的流速洗脱。得替考拉宁洗脱液400ml，经高效液相分析，洗脱液中替考拉宁A2的峰面积为总面积的84.6％，得到高纯度粗提纯物6.02g，回收率为85.4％。

实施例2

将实施例1中凝胶层析得到的工艺液，调PH至7.0，通过大孔吸附树脂JD-1，用4BV PH＝3的盐酸溶液，流速为2BV/hr洗涤该树脂柱，再用4BV10％的乙醇溶液以2BV/hr的流速洗涤，然后用60％乙醇溶液以1BV/hr的流速洗脱，得到320ml洗脱液，从而溶出了替考拉宁，经HPLC分析，溶出液中的替考拉宁A2的峰面积为总峰面积的87.2％，回收了5.4g替考拉宁，回收率为89.7％

实施例3

将实施例2中的乙醇洗脱液300ml，调PH至4.0，添加糖用活性炭，针用活性炭各3g之后，控制温度为20～30℃搅拌30min，然后过滤，清除活性炭得到澄清滤液。

实施例4-7

将实施例3中的澄清滤液经过截流分子量为6000Da的超滤膜去除大分子杂质，超滤时分别在0℃、10℃、25℃、55℃的温度条件和0～4.0bar的流入压及0～3.5bar的流出压。期间用纯化水顶洗三次，得到450ml澄清滤液1、2、3、4。

实施例8-11

将实施例4-7中的澄清滤液1～4分别调PH至8.0，再用截流分子量为800Da的纳滤膜浓缩至100ml，纳滤时分别在0℃、10℃、25℃、55℃的温度条件和0～2.0Mpa的流入压及0～1.8Mpa的流出压。浓缩过程中不断用纯化水顶洗，除去滤液中乙醇，一边搅拌浓缩液，一边加入丙酮至丙酮浓度为68％，有部分杂质沉降出来，过滤除去沉降物，得沉降液1(320ml)、2(326ml)、3(330ml)、4(325ml)，经HPLC分析，沉降液中的替考拉宁A2峰面积为90.7％、90.6％、90.2％、88.5％，纯度为92.8％、92.8％、92.4％、87.9％。

实施例12-15

将实施例8-11中沉降液1～4分别继续缓慢加丙酮至90％丙酮度，搅拌均匀沉淀出替考拉宁粉末，静止1小时后，利用布氏漏斗过滤，用丙酮顶洗后回收沉淀物，然后在红外灯下对回收的沉淀物进行6小时干燥，用注射用水1mg/ml溶解已回收的替考拉宁粉末1(3.6g)、2(3.6g)、3(3.5g)、4(3.2g)，经HPLC分析，纯度为93.1％、93.1％、928％、91.0％。

Claims

1.一种从替考拉宁粗品提纯高纯度替考拉宁的生产方法，其特征在于，

阶段a，对替考拉宁粗品进行Q sepharose离子交换层析、大孔吸附分离以得到替考拉宁粗品大孔树脂洗脱液；其中，在进行所述Qsepharose离子交换层析时，将替考拉宁粗品溶解于Na₂CO₃∶NaHCO₃＝0.05M∶0.01M的缓冲溶液中，过滤得滤液，该滤液PH值为9.2，把上述滤液以0.2BV/hr的流速滴在填充了Q sepharose凝胶的柱上，再分别以4BV的Na₂CO₃∶NaHCO₃＝0.05M∶0.1M缓冲溶液，4BV含0.1％三羟甲基氨基甲烷的上述缓冲溶液以2BV/hr的流速进行预洗，最后用含1％三羟甲基氨基甲烷的上述缓冲溶液以2BV/hr的流速洗脱，得到替考拉宁粗品Q sepharose离子交换层析洗脱液；在进行大孔吸附分离时，将上述替考拉宁粗品Q sepharose离子交换层析洗脱液调PH至7.0，通过大孔吸附树脂JD-1，用4BV PH＝3的盐酸溶液，流速为2BV/hr洗涤树脂柱，再用4BV10％的乙醇溶液以2BV/hr的流速洗涤，然后用60％乙醇溶液以1BV/hr的流速洗脱，得到所述替考拉宁粗品大孔树脂洗脱液；

阶段b，将所述替考拉宁粗品大孔树脂洗脱液进行活性炭脱色、超滤、纳滤及结晶以得到高纯度替考拉宁。

2.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，在阶段b中所述超滤采用陶瓷、聚醚砜或者再生纤维素材质的截留分子量大小为3,000Da～300,000Da的超滤膜进行超滤。

3.根据权利要求2所述的生产方法，其特征在于，所述超滤膜截留分子量大小为3,000Da～6,000Da。

4.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，在阶段b中所述纳滤采用聚醚砜或者再生纤维素材质的截留分子量大小为100～1000Da的纳滤膜进行纳滤。

5.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，所述纳滤膜截留分子量大小为700Da～800Da。

6.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，在阶段b中所述超滤和纳滤分别在温度0～55℃下进行。

7.根据权利要求1或6所述的生产方法，其特征在于，在阶段b中所述超滤和纳滤分别在温度10～25℃下进行。

8.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，在阶段b中所述结晶采用酮进行结晶，其中，所述酮为C3-C6的酮。

9.根据权利要求8所述的生产方法，其特征在于，所述C3-C6的酮为丙酮、丁酮或环己酮。