CN110655557A - 一种纽莫康定b0丝氨酸类似物的分离纯化方法 - Google Patents
一种纽莫康定b0丝氨酸类似物的分离纯化方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110655557A CN110655557A CN201810689082.3A CN201810689082A CN110655557A CN 110655557 A CN110655557 A CN 110655557A CN 201810689082 A CN201810689082 A CN 201810689082A CN 110655557 A CN110655557 A CN 110655557A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- chromatographic
- aqueous solution
- pneumocandin
- solution
- purity
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108010016309 pneumocandin B(0) Proteins 0.000 title claims abstract description 86
- -1 pneumocandin B0 serine analogue Chemical class 0.000 title claims abstract description 39
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 26
- 238000000746 purification Methods 0.000 title claims abstract description 20
- 238000000926 separation method Methods 0.000 title claims description 22
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 claims abstract description 29
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims abstract description 25
- 239000000945 filler Substances 0.000 claims abstract description 22
- 238000012856 packing Methods 0.000 claims abstract description 22
- 238000010829 isocratic elution Methods 0.000 claims abstract description 20
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims abstract description 18
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 11
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 claims abstract description 11
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 claims abstract description 11
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims abstract description 9
- 125000003607 serino group Chemical class [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 claims abstract 5
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 87
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 72
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 72
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 60
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 51
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 39
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 31
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims description 24
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 22
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 17
- 239000012043 crude product Substances 0.000 claims description 12
- MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 1,2-Divinylbenzene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1C=C MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 8
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 6
- 238000002013 hydrophilic interaction chromatography Methods 0.000 claims description 6
- IDGUHHHQCWSQLU-UHFFFAOYSA-N ethanol;hydrate Chemical compound O.CCO IDGUHHHQCWSQLU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 claims description 4
- PBCJIPOGFJYBJE-UHFFFAOYSA-N acetonitrile;hydrate Chemical compound O.CC#N PBCJIPOGFJYBJE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 claims description 4
- 229920002125 Sokalan® Polymers 0.000 claims description 2
- 239000004584 polyacrylic acid Substances 0.000 claims description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 19
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 abstract description 7
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 abstract description 7
- 238000012986 modification Methods 0.000 abstract description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 abstract description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 abstract description 5
- 102000014413 Neuregulin Human genes 0.000 abstract 2
- 108050003475 Neuregulin Proteins 0.000 abstract 2
- DQXPFAADCTZLNL-FXDJFZINSA-N pneumocandin B0 Chemical compound C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N3CC[C@H](O)[C@H]3C(=O)N[C@H](O)[C@H](O)C[C@@H](C(N[C@H](C(=O)N3C[C@H](O)C[C@H]3C(=O)N2)[C@@H](C)O)=O)NC(=O)CCCCCCCC[C@@H](C)C[C@@H](C)CC)[C@H](O)CC(N)=O)=CC=C(O)C=C1 DQXPFAADCTZLNL-FXDJFZINSA-N 0.000 description 49
- 150000003355 serines Chemical class 0.000 description 43
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 28
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 23
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 20
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 15
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 14
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 14
- 206010017533 Fungal infection Diseases 0.000 description 13
- 208000031888 Mycoses Diseases 0.000 description 13
- 108010049047 Echinocandins Proteins 0.000 description 10
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 9
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 9
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 9
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 230000000843 anti-fungal effect Effects 0.000 description 7
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 7
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 7
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 6
- GBMDVOWEEQVZKZ-UHFFFAOYSA-N methanol;hydrate Chemical compound O.OC GBMDVOWEEQVZKZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 238000001728 nano-filtration Methods 0.000 description 6
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 5
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 5
- 238000005100 correlation spectroscopy Methods 0.000 description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 5
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 4
- KAESVJOAVNADME-UHFFFAOYSA-N Pyrrole Chemical compound C=1C=CNC=1 KAESVJOAVNADME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 4
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 4
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 3
- APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N Amphotericin-B Natural products O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1C=CC=CC=CC=CC=CC=CC=C[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N 0.000 description 3
- 241000144175 Lophium arboricola Species 0.000 description 3
- 241000144178 Zalerion Species 0.000 description 3
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 3
- APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N amphotericin B Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N 0.000 description 3
- 229960003942 amphotericin b Drugs 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 3
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 3
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 3
- 238000001644 13C nuclear magnetic resonance spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 2
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010020326 Caspofungin Proteins 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000233872 Pneumocystis carinii Species 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 241001052560 Thallis Species 0.000 description 2
- KAPLTEIQCKDUAT-UHFFFAOYSA-N ac1la431 Chemical compound N1C(=O)C2CC(O)CN2C(=O)C(C(C)O)NC(=O)C(NC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC)CC(O)C(O)NC(=O)C2C(O)C(C)CN2C(=O)C(C(O)CC(N)=O)NC(=O)C1C(O)C(O)C1=CC=C(O)C(OS(O)(=O)=O)=C1 KAPLTEIQCKDUAT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 239000003429 antifungal agent Substances 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 230000000857 drug effect Effects 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 108010062092 echinocandin B Proteins 0.000 description 2
- FAUOJMHVEYMQQG-HVYQDZECSA-N echinocandin B Chemical compound C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N3C[C@H](C)[C@H](O)[C@H]3C(=O)N[C@H](O)[C@H](O)C[C@@H](C(N[C@H](C(=O)N3C[C@H](O)C[C@H]3C(=O)N2)[C@@H](C)O)=O)NC(=O)CCCCCCC\C=C/C\C=C/CCCCC)[C@@H](C)O)=CC=C(O)C=C1 FAUOJMHVEYMQQG-HVYQDZECSA-N 0.000 description 2
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 2
- 238000003919 heteronuclear multiple bond coherence Methods 0.000 description 2
- 238000001052 heteronuclear multiple bond coherence spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000003929 heteronuclear multiple quantum coherence Methods 0.000 description 2
- 238000004896 high resolution mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- LCWIVMNAWXMBJV-BYPYZUCNSA-N (2s)-5-amino-2-(dihydroxyamino)pentanoic acid Chemical compound NCCC[C@H](N(O)O)C(O)=O LCWIVMNAWXMBJV-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- VQINCDSXSZLRHY-VKHMYHEASA-N (2s)-5-amino-2-(hydroxyamino)-5-oxopentanoic acid Chemical compound NC(=O)CC[C@H](NO)C(O)=O VQINCDSXSZLRHY-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- QFEZPPTUYVZRGI-UHFFFAOYSA-N 2,2-dimethyltetradecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCC(C)(C)C(O)=O QFEZPPTUYVZRGI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XILIYVSXLSWUAI-UHFFFAOYSA-N 2-(diethylamino)ethyl n'-phenylcarbamimidothioate;dihydrobromide Chemical compound Br.Br.CCN(CC)CCSC(N)=NC1=CC=CC=C1 XILIYVSXLSWUAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VHVPQPYKVGDNFY-DFMJLFEVSA-N 2-[(2r)-butan-2-yl]-4-[4-[4-[4-[[(2r,4s)-2-(2,4-dichlorophenyl)-2-(1,2,4-triazol-1-ylmethyl)-1,3-dioxolan-4-yl]methoxy]phenyl]piperazin-1-yl]phenyl]-1,2,4-triazol-3-one Chemical compound O=C1N([C@H](C)CC)N=CN1C1=CC=C(N2CCN(CC2)C=2C=CC(OC[C@@H]3O[C@](CN4N=CN=C4)(OC3)C=3C(=CC(Cl)=CC=3)Cl)=CC=2)C=C1 VHVPQPYKVGDNFY-DFMJLFEVSA-N 0.000 description 1
- CVOFKRWYWCSDMA-UHFFFAOYSA-N 2-chloro-n-(2,6-diethylphenyl)-n-(methoxymethyl)acetamide;2,6-dinitro-n,n-dipropyl-4-(trifluoromethyl)aniline Chemical compound CCC1=CC=CC(CC)=C1N(COC)C(=O)CCl.CCCN(CCC)C1=C([N+]([O-])=O)C=C(C(F)(F)F)C=C1[N+]([O-])=O CVOFKRWYWCSDMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010064760 Anidulafungin Proteins 0.000 description 1
- 208000036641 Aspergillus infections Diseases 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000222122 Candida albicans Species 0.000 description 1
- 206010007134 Candida infections Diseases 0.000 description 1
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 description 1
- 102000002004 Cytochrome P-450 Enzyme System Human genes 0.000 description 1
- 108010015742 Cytochrome P-450 Enzyme System Proteins 0.000 description 1
- 206010017543 Fungal skin infection Diseases 0.000 description 1
- 229920001503 Glucan Polymers 0.000 description 1
- 229940127488 Glucan Synthase Inhibitors Drugs 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N Hydroxyproline Chemical class O[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 239000007987 MES buffer Substances 0.000 description 1
- 108010021062 Micafungin Proteins 0.000 description 1
- QPHSFUGCBGILSS-QMMMGPOBSA-N N,N-dihydroxy-L-tyrosine Chemical class ON(O)[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 QPHSFUGCBGILSS-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 206010034133 Pathogen resistance Diseases 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 108010045495 WF 11899A Proteins 0.000 description 1
- 125000000218 acetic acid group Chemical group C(C)(=O)* 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000012378 ammonium molybdate tetrahydrate Substances 0.000 description 1
- 229960003348 anidulafungin Drugs 0.000 description 1
- JHVAMHSQVVQIOT-MFAJLEFUSA-N anidulafungin Chemical compound C1=CC(OCCCCC)=CC=C1C1=CC=C(C=2C=CC(=CC=2)C(=O)N[C@@H]2C(N[C@H](C(=O)N3C[C@H](O)C[C@H]3C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N3C[C@H](C)[C@H](O)[C@H]3C(=O)N[C@H](O)[C@H](O)C2)[C@@H](C)O)[C@H](O)[C@@H](O)C=2C=CC(O)=CC=2)[C@@H](C)O)=O)C=C1 JHVAMHSQVVQIOT-MFAJLEFUSA-N 0.000 description 1
- 125000000477 aza group Chemical group 0.000 description 1
- FIXLYHHVMHXSCP-UHFFFAOYSA-H azane;dihydroxy(dioxo)molybdenum;trioxomolybdenum;tetrahydrate Chemical compound N.N.N.N.N.N.O.O.O.O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O[Mo](O)(=O)=O.O[Mo](O)(=O)=O.O[Mo](O)(=O)=O FIXLYHHVMHXSCP-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 1
- LLSDKQJKOVVTOJ-UHFFFAOYSA-L calcium chloride dihydrate Chemical compound O.O.[Cl-].[Cl-].[Ca+2] LLSDKQJKOVVTOJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940052299 calcium chloride dihydrate Drugs 0.000 description 1
- 229940095731 candida albicans Drugs 0.000 description 1
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 1
- 229960003034 caspofungin Drugs 0.000 description 1
- JYIKNQVWKBUSNH-WVDDFWQHSA-N caspofungin Chemical compound C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N3CC[C@H](O)[C@H]3C(=O)N[C@H](NCCN)[C@H](O)C[C@@H](C(N[C@H](C(=O)N3C[C@H](O)C[C@H]3C(=O)N2)[C@@H](C)O)=O)NC(=O)CCCCCCCC[C@@H](C)C[C@@H](C)CC)[C@H](O)CCN)=CC=C(O)C=C1 JYIKNQVWKBUSNH-WVDDFWQHSA-N 0.000 description 1
- 229960000730 caspofungin acetate Drugs 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- MPTQRFCYZCXJFQ-UHFFFAOYSA-L copper(II) chloride dihydrate Chemical compound O.O.[Cl-].[Cl-].[Cu+2] MPTQRFCYZCXJFQ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000009295 crossflow filtration Methods 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- PXEDJBXQKAGXNJ-QTNFYWBSSA-L disodium L-glutamate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)[C@@H](N)CCC([O-])=O PXEDJBXQKAGXNJ-QTNFYWBSSA-L 0.000 description 1
- 238000000132 electrospray ionisation Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- RFHAOTPXVQNOHP-UHFFFAOYSA-N fluconazole Chemical compound C1=NC=NN1CC(C=1C(=CC(F)=CC=1)F)(O)CN1C=NC=N1 RFHAOTPXVQNOHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004884 fluconazole Drugs 0.000 description 1
- 230000004313 glare Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000000990 heteronuclear single quantum coherence spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 229960003444 immunosuppressant agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- SURQXAFEQWPFPV-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate heptahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.[Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O SURQXAFEQWPFPV-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229960004130 itraconazole Drugs 0.000 description 1
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 1
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L magnesium sulfate heptahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.[Mg+2].[O-]S([O-])(=O)=O WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940061634 magnesium sulfate heptahydrate Drugs 0.000 description 1
- ISPYRSDWRDQNSW-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate monohydrate Chemical compound O.[Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O ISPYRSDWRDQNSW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 1
- 125000001434 methanylylidene group Chemical group [H]C#[*] 0.000 description 1
- 125000001570 methylene group Chemical group [H]C([H])([*:1])[*:2] 0.000 description 1
- 229960002159 micafungin Drugs 0.000 description 1
- PIEUQSKUWLMALL-YABMTYFHSA-N micafungin Chemical compound C1=CC(OCCCCC)=CC=C1C1=CC(C=2C=CC(=CC=2)C(=O)N[C@@H]2C(N[C@H](C(=O)N3C[C@H](O)C[C@H]3C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N3C[C@H](C)[C@H](O)[C@H]3C(=O)N[C@H](O)[C@H](O)C2)[C@H](O)CC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](O)C=2C=C(OS(O)(=O)=O)C(O)=CC=2)[C@@H](C)O)=O)=NO1 PIEUQSKUWLMALL-YABMTYFHSA-N 0.000 description 1
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 description 1
- 235000013923 monosodium glutamate Nutrition 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 125000004043 oxo group Chemical group O=* 0.000 description 1
- 230000003071 parasitic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012466 permeate Substances 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 108010001062 polysaccharide-K Proteins 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- OVARTBFNCCXQKS-UHFFFAOYSA-N propan-2-one;hydrate Chemical compound O.CC(C)=O OVARTBFNCCXQKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 229930000044 secondary metabolite Natural products 0.000 description 1
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 1
- 229940073490 sodium glutamate Drugs 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 238000000547 structure data Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 229960004793 sucrose Drugs 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002627 tracheal intubation Methods 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- BCEHBSKCWLPMDN-MGPLVRAMSA-N voriconazole Chemical compound C1([C@H](C)[C@](O)(CN2N=CN=C2)C=2C(=CC(F)=CC=2)F)=NC=NC=C1F BCEHBSKCWLPMDN-MGPLVRAMSA-N 0.000 description 1
- 229960004740 voriconazole Drugs 0.000 description 1
- OGUJBRYAAJYXQP-IJFZAWIJSA-N vuw370o5qe Chemical compound CC(O)=O.CC(O)=O.C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N3CC[C@H](O)[C@H]3C(=O)N[C@H](NCCN)[C@H](O)C[C@@H](C(N[C@H](C(=O)N3C[C@H](O)C[C@H]3C(=O)N2)[C@@H](C)O)=O)NC(=O)CCCCCCCC[C@@H](C)C[C@@H](C)CC)[C@H](O)CCN)=CC=C(O)C=C1 OGUJBRYAAJYXQP-IJFZAWIJSA-N 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/50—Cyclic peptides containing at least one abnormal peptide link
- C07K7/54—Cyclic peptides containing at least one abnormal peptide link with at least one abnormal peptide link in the ring
- C07K7/56—Cyclic peptides containing at least one abnormal peptide link with at least one abnormal peptide link in the ring the cyclisation not occurring through 2,4-diamino-butanoic acid
Abstract
本发明涉及一种纽莫康定B0丝氨酸类似物的分离纯化方法，所述分离纯化方法包括以下步骤：a)用聚合物基质色谱填料进行第一次层析富集，等度洗脱，收集纯度＞30％部分；b)用亲水作用色谱填料进行第二次层析纯化，等度洗脱，收集纯度＞60％部分；c)用反相硅胶基质色谱填料进行第三次层析纯化，等度洗脱，收集纯度＞80％部分；d)第三次纯化后，纽莫康定B0丝氨酸类似物纯度＞80％的层析液，减压浓缩除去溶剂后冻干，得到纽莫康定B0丝氨酸类似物。通过本发明的制备方法得到的纯度＞80％的纽莫康定B0丝氨酸类似物进行了结构鉴定，为进一步进行生物活性的筛选或对其进行结构修饰后再进行生物活性筛选，奠定了基础。
Description
技术领域
本发明属于生物制药领域，涉及一种纽莫康定B0丝氨酸类似物的分离纯化方法，具体地说涉及一种从含有丝氨酸类似物的纽莫康定 B0粗品分离纯化出纽莫康定B0丝氨酸类似物的方法。
背景技术
真菌对于健康人体而言是条件致病菌，正常情况下对人体无害；但当机体抵抗力降低时，就有可能造成局部或全身真菌感染。近年来由于临床上滥用细胞毒性药物、免疫抑制剂、广谱抗生素及激素类药物，不仅患者机体的免疫力受到抑制，而且体内的微生态平衡受到破坏，使得原本不致病的真菌变为优势菌，从而诱发真菌感染；再加上现代医疗中器官移植、介入治疗、插管技术等开放性治疗手段的开展，更增大了真菌感染的发病机率。
按照国际医学界的通行标准，真菌感染可分为浅表性真菌感染、皮下真菌感染和系统性真菌感染。其中前两种真菌感染最为常见，但并不致命，最为严重的是系统性真菌感染，即深部真菌感染，染病后如果不能得到及时有效的控制，往往会危及生命。自从第一个抗真菌药两性霉素B问世以来，人类与真菌感染疾病的斗争已经持续了半个多世纪，现在，人类在预防和治疗浅表性真菌感染方面已取得突破，但对于皮下真菌感染和系统性真菌感染，由于其治疗的难度、真菌的抗药性和现有药物的毒副作用等因素的存在，尚未取得显著进展。现代临床上治疗真菌感染使用的药物主要有两性霉素B和唑类抗真菌药物(如氟康唑、伊曲康唑和伏力康唑等)，但它们在安全性、药代动力学或抗菌谱等方面都存在一定的问题，因此临床上亟待高效、低毒的新型广谱抗真菌药物的出现。
棘白菌素(Echinocandins)，又称棘球白素，是一类新型抗真菌药，属于乙酰六环类，为葡聚糖合成酶抑制剂，可以非竞争性地抑制真菌细胞壁的β-1,3-D-葡聚糖的合成，从而破坏细胞壁的完整性并使其渗透压发生变化而发挥杀菌作用，而哺乳动物细胞无细胞壁，故对哺乳动物细胞无影响。棘白菌素类药物通过抑制真菌体内的葡聚糖合成酶以杀灭真菌，对细胞色素P450无作用，不良反应少，与两性霉素B 和唑类抗真菌药物无交叉耐药性，对人体的毒性低，主要作用于念珠菌属(Candidas)和曲霉菌属(Aspergillus)，也可以作用于寄生虫类病原体如卡氏肺囊虫(Pneumocystis carinii)等。
棘白菌素类化合物基本结构类似，都是在乙酰六环的结构上结合有不同的取代基，但不同取代基的化合物抗真菌活性有所不同，经过有针对性的筛选，研究人员发现有些化合物抗真菌活性较强，包括纽莫康定B0(Pneumocandin B0)，WF11899A和棘白菌素B(Echinocandin B)，它们均通过发酵的方法得到，以其作为中间体进行半合成，分别可以得到抗真菌药物卡泊芬净、米卡芬净和阿尼芬净。纽莫康定B0 (Pneumocandin B0)由Zalerion arboricola菌体发酵进行生物合成产生，默克公司以其作为中间体进行半合成，得到了抗真菌药物醋酸卡泊芬净，于2001年2月在美国上市，用于治疗白色念珠菌和烟曲霉菌的感染。
纽莫康定B0(Pneumocandin B0)由Zalerion arboricola菌体发酵进行生物合成产生，属于次级代谢产物。Zalerion arboricola菌体发酵时，除了产生纽莫康定B0，还会产生多种结构类似物。对发酵过程中的结构类似物进行分离，得到单一化合物后直接进行生物活性的筛选，或者对其进行结构修饰后再进行生物活性筛选，有可能得到药效更好、不良反应更少的新化合物。
目前国内对于从发酵液中分离、制备纽莫康定B0的报道较多，但对于分离、制备其它结构类似物的工艺几乎没有报道；国外的相关研究也是集中在纽莫康定B0的分离、制备，对其结构类似物的制备少见报道。
如上所示的结构式，为以下三篇论文中公开的纽莫康定B0及其主要结构类似物的结构式：
1、PNEUMOCANDINS from Zalerion arboricolaⅠ.DISCOVERY AND ISOLATION,(THE JOURNAL OF ANTIBIOTICS, DEC.1992,VOL.45NO.12,1853-1866)；
2、PNEUMOCANDINS from Zalerion arboricolaⅡ. MODIFICATION OF PRODUCTSPECTRUM BY MUTATION AND MEDIUM MANIPULATION,(THE JOURNAL OF ANTIBIOTICS,DEC.1992,VOL.45NO.12,1867-1874)；
3、PNEUMOCANDINS from Zalerion arboricolaⅢ.STRUCTURE ELUCIDATION,(THEJOURNAL OF ANTIBIOTICS, DEC.1992,VOL.45NO.12,1875-1885)。
这三篇论文中分别介绍了纽莫康定B0发酵液中几种结构类似物的发现、检测、结构鉴定，但并没有开展对单一化合物进行分离、制备方面的研究。
如上所示的结构式，为以下论文中公开的纽莫康定B0及主要结构类似物的结构式：Effects of amino acid and trace element supplementation on pneumocandinproduction by Glarea lozoyensis:impact on titer, analogue levels,and theidentification of new analogues of pneumocandin B0(Journal of IndustrialMicrobiology and Biotechnology,2001,26, 216-221)，论文中介绍了如上所示的结构式中所列几种结构类似的分离纯化及结构鉴定数据，也没有进行单个化合物的研究；文中报道丝氨酸类似物分离难度很大，其结构数据是用纽莫康定B0(其中含有纽莫康定B0的丝氨酸类似物)进行化学合成，根据合成后产物中杂质的结构鉴定数据进行反向推测，才得到纽莫康定B0丝氨酸类似物的结构的。
本申请的发明人在对Zalerion arboricola菌体发酵产生的纽莫康定 B0进行纯化时，找到了一种制备纯度＞80％的纽莫康定B0丝氨酸类似物的方法。制备得到该化合物后，对其进行了结构鉴定，确认该化合物为纽莫康定B0丝氨酸类似物。
发明内容
本发明公开一种如下所示的纽莫康定B0丝氨酸类似物结构式的制备方法：
而纽莫康定B0结构式如下，两者仅在红框处有一个甲基的差异：
本发明提供了一种纽莫康定B0丝氨酸类似物的分离纯化方法，具体地说，提供了一种从含有丝氨酸类似物的纽莫康定B0粗品分离纯化出纯度＞80％的纽莫康定B0丝氨酸类似物的方法，所述分离纯化方法包括以下步骤：
a)将含有丝氨酸类似物的纽莫康定B0粗品采用色谱填料进行第一次层析富集，其中，所述色谱填料为聚苯乙烯/二乙烯基苯UniPS、聚苯乙烯/二乙烯基苯UniPSA或聚丙烯酸UniPSN，流动相为甲醇水溶液、乙醇水溶液、乙腈水溶液或丙酮水溶液；层析后进行等度洗脱或梯度洗脱、分段收集，以得到含有纯度＞30％的纽莫康定B0丝氨酸类似物的第一次层析富集液；
b)将所述第一次层析富集液进行减压浓缩以除去溶剂，再用亲水作用色谱填料进行第二次层析纯化，所述亲水作用色谱填料为 Xamide、X3或HILIC，流动相为甲醇水溶液、乙醇水溶液、乙腈水溶液或丙酮水溶液；层析后进行等度洗脱或梯度洗脱、分段收集，以得到含有纯度＞60％的纽莫康定B0丝氨酸类似物的第二次层析富集液；
c)将所述第二次层析富集液进行减压浓缩以除去溶剂，再用反相硅胶基质色谱填料第三次层析纯化，所述反相硅胶基质色谱填料为 C8或C18，流动相为甲醇水溶液、乙醇水溶液、乙腈水溶液或丙酮水溶液；层析后进行等度洗脱或梯度洗脱、分段收集，以得到含有纯度＞80％的纽莫康定B0丝氨酸类似物的第三次层析富集液；
d)将所述第三次层析富集液进行减压浓缩以除去溶剂，再冻干，以得到纯度＞80％的纽莫康定B0丝氨酸类似物干粉。
在本发明所述的分离纯化方法的优选技术方案中，在步骤a)中，所述色谱填料的粒径为5μm、10μm或30μm，所述色谱填料的孔径为100A、300A或500A。
在本发明所述的分离纯化方法的优选技术方案中，在步骤a)中，所述甲醇水溶液中甲醇的比例为65-85％(体积比)，优选70-80％(体积比)，更优选73-78％(体积比)；所述乙醇水溶液中乙醇的比例为 70-90％(体积比)，优选75-85％(体积比)，更优选78-83％(体积比)；所述乙腈水溶液中乙腈的比例为30-50％(体积比)，优选35-45％(体积比)，更优选38-42％(体积比)；所述丙酮水溶液中丙酮的比例为 60-80％(体积比)，优选65-75％(体积比)，更优选68-73％(体积比)。
在本发明所述的分离纯化方法的优选技术方案中，在步骤b)中，所述色谱填料的粒径为5μm、10μm或30μm；所述色谱填料的孔径为60A、100A或120A。
在本发明所述的分离纯化方法的优选技术方案中，在步骤b)中，所述甲醇水溶液中甲醇的比例为60-80％(体积比)，优选65-75％(体积比)，更优选68-72％(体积比)；所述乙醇水溶液中乙醇的比例为 65-85％(体积比)，优选60-80％(体积比)，更优选63-78％(体积比)；所述乙腈水溶液中乙腈的比例为35-55％(体积比)，优选40-50％(体积比)，更优选42-47％(体积比)；所述丙酮水溶液中丙酮的比例为 70-90％(体积比)，优选75-85％(体积比)，更优选78-82％(体积比)。
在本发明所述的分离纯化方法的优选技术方案中，在步骤c)中，所述色谱填料的粒径为5μm、10μm或30μmμ；所述色谱填料的孔径为60A、100A或120A。
在本发明所述的分离纯化方法的优选技术方案中，在步骤c)中，所述甲醇水溶液中甲醇的比例为65-85％(体积比)，优选70-80％(体积比)，更优选72-77％(体积比)；所述乙醇水溶液中乙醇的比例为 70-90％(体积比)，优选75-85％(体积比)，更优选77-82％(体积比)；所述乙腈水溶液中乙腈的比例为40-60％(体积比)，优选45-55％(体积比)，更优选48-52％(体积比)；所述丙酮水溶液中丙酮的比例为 65-85％(体积比)，优选70-80％(体积比)，更优选73-78％(体积比)。
在本发明所述的分离纯化方法的优选技术方案中，在步骤d)中，减压浓缩时，温度控制在10-50℃，优选20-40℃，更优选25-35℃。
在本发明所述的分离纯化方法的优选技术方案中，在步骤d)中，减压浓缩时，压力控制在-0.09mPa～-0,1mPa。
本发明以含有丝氨酸类似物(纯度约0.5％)的纽莫康定B0粗品为原料，经过纯化、制备得到纯度＞80％的纽莫康定B0丝氨酸类似物，并进行了结构鉴定，为进一步进行生物活性的筛选，或者对其进行结构修饰后再进行生物活性筛选，奠定了基础。通过后续工作，有可能得到药效更好、不良反应更少的新化合物。
附图说明
图1表示本发明得到的纽莫康定B0丝氨酸类似物的MS图
图2表示本发明得到的纽莫康定B0丝氨酸类似物的H谱；
图3表示本发明得到的纽莫康定B0丝氨酸类似物的C谱；
图4表示本发明得到的纽莫康定B0丝氨酸类似物的DEPT13 谱；
图5表示本发明得到的纽莫康定B0丝氨酸类似物的HMQC 谱；
图6表示本发明得到的纽莫康定B0丝氨酸类似物的COSY谱；
图7表示本发明得到的纽莫康定B0丝氨酸类似物的HMBC 谱。
具体实施方式
含有丝氨酸类似物(纯度约0.5％)的纽莫康定B0粗品，制备工艺可参考本申请人于2012年3月14日提交的中国第201210066411.1 号专利。
下面通过实施例来进一步说明本发明，本发明的实施例仅仅是用于说明本发明而给出，而不是对本发明的限制。
实施例1：纽莫康定B0发酵液的制备
参考本申请人于2012年3月14日提交的中国第201210066411.1 号专利制备纽莫康定B0发酵液。具体制备方法如下所述。
菌株：Zalerion arboricola(HCCB30111，CGMCC No.5412)；
斜面培养基：PDA；
斜面培养条件：28℃，5天；
种子培养基(％)：葡萄糖2.5，KH2PO4 0.9，酵母粉0.5，药媒 1.0，85％乳酸0.2ml，微量元素0.1ml，pH 6.0；
种子培养条件：挖块接种，25℃，220rpm，3天；
发酵培养基(％)：蔗糖12.5，谷氨酸钠0.8，酵母粉0.8，脯氨酸1.5，KH2PO4 0.15，七水合硫酸镁0.04，微量元素1ml，MES缓冲盐1.5，pH 5.3；
发酵条件：转种量10％，25℃，220rpm，发酵培养7天；
微量元素组成(g/L)：七水硫酸亚铁1.0，一水硫酸锰0.2，二水氯化钙0.1，硼酸0.056，二水氯化铜0.025，四水钼酸铵0.019， 12N盐酸50ml。
经过HPLC检测，发酵液中纽莫康定B0丝氨酸类似物液相含量为0.5％。
实施例2：含有丝氨酸类似物的纽莫康定B0粗品的制备
参考本申请人于2012年3月14日提交的中国第201210066411.1 号专利制备含有丝氨酸类似物的纽莫康定B0粗品。具体制备方法如下所述。
水洗及过滤：采用陶瓷膜微滤设备，对由实施例1制得的纽莫康定B0发酵液30L进行错流过滤，得到浓缩的菌丝体悬浮液；在0.05μm 陶瓷膜中利用10％磷酸调节pH至3.0的水对菌丝体悬浮液进行水洗和过滤操作。
萃取及过滤：水洗后，过滤至含有菌丝体的料液约15L，用甲醇 -水溶液(甲醇体积比例为20％)陶瓷膜中直接进行萃取，温度控制在10～15℃，进行萃取和过滤操作。
萃取液纳滤：上一步萃取液，用200Dalton的纳滤膜浓缩至原体积1/5后，纳滤透过液作为萃取剂返回到陶瓷膜中，继续进行萃取。
上柱及解析：纳滤浓缩液直接用3L XAD-1180N大孔树脂进行吸附，吸附后的废液返回到陶瓷膜中再次进行萃取，树脂柱先用水洗，再用浓度为20％的甲醇预洗后，60％的甲醇解析。
解析液纳滤：解析液先纳滤浓缩至原体积1/10。
脱色：纳滤浓缩后的解析液，按照纽莫康定B0：活性炭＝1:0.5 (重量：重量)的比例，加入活性炭，温度保持在10-20℃进行脱色.
减压浓缩：脱色后的料液40℃减压浓缩，压力控制在-0.09mPa～-0,1mPa。
沉淀：减压浓缩除去甲醇后，剩余料液中加入与2倍体积的水进行沉淀。
干燥：沉淀后的固液混合物，滤纸过滤后得到的湿粉，放在真空烘箱中，温度控制30-40℃，压力控制在-0.09mPa～-0,1mPa，干燥后得到含有丝氨酸类似物的纽莫康定B0粗品，液相检测后其中的丝氨酸类似物含量约0.5％。
实施例3：纽莫康定B0丝氨酸类似物的分离、制备
a)纽莫康定B0丝氨酸类似物的第一次层析富集
含有丝氨酸类似物的纽莫康定B0粗品，用聚合物基质色谱填料，如纳微公司的UniPS，粒径为10μm，孔径为300A，进行第一次层析富集，流动相为甲醇水溶液，甲醇比例为75％(体积比)，等度洗脱，分段收集，得到了含有纯度＞30％的纽莫康定B0丝氨酸类似物的第一次层析富集液。
b)纽莫康定B0丝氨酸类似物的第二次层析纯化
将含有纯度＞30％的纽莫康定B0丝氨酸类似物的第一次层析富集液，进行减压浓缩除去溶剂，再用亲水作用色谱填料，如华谱公司的XAmide，粒径为10μm，孔径为100A，进行第二次层析纯化，层析流动相为丙酮水溶液，丙酮比例为80％(体积比)，等度洗脱，分段收集，得到了含有纯度＞60％的纽莫康定B0丝氨酸类似物的第二次层析富集液。
c)纽莫康定B0丝氨酸类似物的第三次层析纯化
将含有纯度＞60％的纽莫康定B0丝氨酸类似物的第二次层析富集液，进行减压浓缩除去溶剂，再用反相硅胶基质色谱填料，如纳微公司的C18，粒径为10μm，孔径为120A，进行第三次层析纯化，层析流动相为乙腈水溶液，乙腈比例为50％(体积比)，等度洗脱，分段收集，得到了含有纯度＞80％的纽莫康定B0丝氨酸类似物的第三次层析富集液。
d)将含有纯度＞80％的纽莫康定B0丝氨酸类似物的第三次层析富集液，进行减压浓缩，压力控制在-0.09mPa～-0.1mPa。，控制温度为30℃，除去溶剂后冻干，得到纽莫康定B0丝氨酸类似物干粉，液相检测纯度为89.1％，产品收率45.2％。
实施例4：纽莫康定B0丝氨酸类似物的分离、制备
a)纽莫康定B0丝氨酸类似物的第一次层析富集
含有丝氨酸类似物的纽莫康定B0粗品，用聚合物基质色谱填料，如纳微公司的UniPSA，粒径为30μm，孔径为100A，进行第一次层析富集，流动相为乙醇水溶液，乙醇比例为78％(体积比)，等度洗脱，分段收集，得到了含有纯度＞30％的纽莫康定B0丝氨酸类似物的第一次层析富集液。
b)纽莫康定B0丝氨酸类似物的第二次层析纯化
将含有纯度＞30％的纽莫康定B0丝氨酸类似物的第一次层析富集液，进行减压浓缩除去溶剂，再用亲水作用色谱填料，如华谱公司的X3，粒径为10μm，孔径为60A，进行第二次层析纯化，层析流动相为甲醇水溶液，甲醇比例为72％(体积比)，等度洗脱，分段收集，得到了含有纯度＞60％的纽莫康定B0丝氨酸类似物的第二次层析富集液。
c)纽莫康定B0丝氨酸类似物的第三次层析纯化
将含有纯度＞60％的纽莫康定B0丝氨酸类似物的第二次层析富集液，进行减压浓缩除去溶剂，再用反相硅胶基质色谱填料，如纳微公司的C8，粒径为30μm，孔径为120A，进行第三次层析纯化，层析流动相为乙醇水溶液，乙醇比例为77％(体积比)，等度洗脱，分段收集，得到了含有纯度＞80％的纽莫康定B0丝氨酸类似物的第三次层析富集液。
d)将含有纯度＞80％的纽莫康定B0丝氨酸类似物的第三次层析富集液，进行减压浓缩，压力控制在-0.09mPa～-0.1mPa。，控制温度为30℃，除去溶剂后冻干，得到纽莫康定B0丝氨酸类似物干粉，液相检测纯度为90.5％，产品收率43.7％。
实施例5：纽莫康定B0丝氨酸类似物的分离、制备
a)纽莫康定B0丝氨酸类似物的第一次层析富集
含有丝氨酸类似物的纽莫康定B0粗品，用聚合物基质色谱填料，如纳微公司的UniPSN，粒径为30μm，孔径为300A，进行第一次层析富集，流动相为乙腈水溶液，乙腈比例为38％(体积比)，等度洗脱，分段收集，得到了含有纯度＞30％的纽莫康定B0丝氨酸类似物的第一次层析富集液。
b)纽莫康定B0丝氨酸类似物的第二次层析纯化
将含有纯度＞30％的纽莫康定B0丝氨酸类似物的第一次层析富集液，进行减压浓缩除去溶剂，再用亲水作用色谱填料，如华谱公司的HILIC，粒径为30μm，孔径为120A，进行第二次层析纯化，层析流动相为乙腈水溶液，乙腈比例为42％(体积比)，等度洗脱，分段收集，得到了含有纯度＞60％的纽莫康定B0丝氨酸类似物的第二次层析富集液。
c)纽莫康定B0丝氨酸类似物的第三次层析纯化
将含有纯度＞60％的纽莫康定B0丝氨酸类似物的第二次层析富集液，进行减压浓缩除去溶剂，再用反相硅胶基质色谱填料，如纳微公司的C8，粒径为10μm，孔径为60A，进行第三次层析纯化，层析流动相为甲醇水溶液，甲醇比例为75％(体积比)，等度洗脱，分段收集，得到了含有纯度＞80％的纽莫康定B0丝氨酸类似物的第三次层析富集液。
d)将含有纯度＞80％的纽莫康定B0丝氨酸类似物的第三次层析富集液，进行减压浓缩，压力控制在-0.09mPa～-0.1mPa。，控制温度为35℃，除去溶剂后冻干，得到纽莫康定B0丝氨酸类似物干粉，液相检测纯度为85.6％，产品收率53.1％。
实施例6：纽莫康定B0丝氨酸类似物的分离、制备
a)纽莫康定B0丝氨酸类似物的第一次层析富集
含有丝氨酸类似物的纽莫康定B0粗品，用聚合物基质色谱填料，如纳微公司的UniPS，粒径为30μm，孔径为100A，进行第一次层析富集，流动相为甲醇水溶液，甲醇比例为73％(体积比)，等度洗脱，分段收集，得到了含有纯度＞30％的纽莫康定B0丝氨酸类似物的第一次层析富集液。
b)纽莫康定B0丝氨酸类似物的第二次层析纯化
将含有纯度＞30％的纽莫康定B0丝氨酸类似物的第一次层析富集液，进行减压浓缩除去溶剂，再用亲水作用色谱填料，如华谱公司的HILIC，粒径为10μm，孔径为100A，进行第二次层析纯化，层析流动相为丙酮水溶液，丙酮比例为82％(体积比)，等度洗脱，分段收集，得到了含有纯度＞60％的纽莫康定B0丝氨酸类似物的第二次层析富集液。
c)纽莫康定B0丝氨酸类似物的第三次层析纯化
将含有纯度＞60％的纽莫康定B0丝氨酸类似物的第二次层析富集液，进行减压浓缩除去溶剂，再用反相硅胶基质色谱填料，如纳微公司的C18，粒径为10μm，孔径为120A，进行第三次层析纯化，层析流动相为乙腈水溶液，乙腈比例为48％(体积比)，等度洗脱，分段收集，得到了含有纯度＞80％的纽莫康定B0丝氨酸类似物的第三次层析富集液。
d)将含有纯度＞80％的纽莫康定B0丝氨酸类似物的第三次层析富集液，进行减压浓缩，压力控制在-0.09mPa～-0.1mPa。，控制温度为35℃，除去溶剂后冻干，得到纽莫康定B0丝氨酸类似物干粉，液相检测纯度为88.9％，产品收率44.8％。
实施例7：纽莫康定B0丝氨酸类似物的分离、制备
a)纽莫康定B0丝氨酸类似物的第一次层析富集
含有丝氨酸类似物的纽莫康定B0粗品，用聚合物基质色谱填料，如纳微公司的UniPSA，粒径为10μm，孔径为300A，进行第一次层析富集，流动相为乙腈水溶液，乙腈比例为42％(体积比)，等度洗脱，分段收集，得到了含有纯度＞30％的纽莫康定B0丝氨酸类似物的第一次层析富集液。
b)纽莫康定B0丝氨酸类似物的第二次层析纯化
将含有纯度＞30％的纽莫康定B0丝氨酸类似物的第一次层析富集液，进行减压浓缩除去溶剂，再用亲水作用色谱填料，如华谱公司的X3，粒径为10μm，孔径为120A，进行第二次层析纯化，层析流动相为乙醇水溶液，乙醇比例为78％(体积比)，等度洗脱，分段收集，得到了含有纯度＞60％的纽莫康定B0丝氨酸类似物的第二次层析富集液。
c)纽莫康定B0丝氨酸类似物的第三次层析纯化
将含有纯度＞60％的纽莫康定B0丝氨酸类似物的第二次层析富集液，进行减压浓缩除去溶剂，再用反相硅胶基质色谱填料，如纳微公司的C18，粒径为5μm，孔径为120A，进行第三次层析纯化，层析流动相为丙酮水溶液，丙酮比例为75％(体积比)，等度洗脱，分段收集，得到了含有纯度＞80％的纽莫康定B0丝氨酸类似物的第三次层析富集液。
d)将含有纯度＞80％的纽莫康定B0丝氨酸类似物的第三次层析富集液，进行减压浓缩，压力控制在-0.09mPa～-0.1mPa。，控制温度为30℃，除去溶剂后冻干，得到纽莫康定B0丝氨酸类似物干粉，液相检测纯度为87.5％，产品收率45.9％。
实施例8：纽莫康定B0丝氨酸类似物的分离、制备
a)纽莫康定B0丝氨酸类似物的第一次层析富集
含有丝氨酸类似物的纽莫康定B0粗品，用聚合物基质色谱填料，如纳微公司的UniPSN，粒径为10μm，孔径为100A，进行第一次层析富集，流动相为丙酮水溶液，丙酮比例为68％(体积比)，等度洗脱，分段收集，得到了含有纯度＞30％的纽莫康定B0丝氨酸类似物的第一次层析富集液。
b)纽莫康定B0丝氨酸类似物的第二次层析纯化
将含有纯度＞30％的纽莫康定B0丝氨酸类似物的第一次层析富集液，进行减压浓缩除去溶剂，再用亲水作用色谱填料，如华谱公司的XAmide，粒径为30μm，孔径为120A，进行第二次层析纯化，层析流动相为甲醇水溶液，甲醇比例为68％(体积比)，等度洗脱，分段收集，得到了含有纯度＞60％的纽莫康定B0丝氨酸类似物的第二次层析富集液。
c)纽莫康定B0丝氨酸类似物的第三次层析纯化
将含有纯度＞60％的纽莫康定B0丝氨酸类似物的第二次层析富集液，进行减压浓缩除去溶剂，再用反相硅胶基质色谱填料，如纳微公司的C8，粒径为10μm，孔径为120A，进行第三次层析纯化，层析流动相为甲醇水溶液，甲醇比例为77％(体积比)，等度洗脱，分段收集，得到了含有纯度＞80％的纽莫康定B0丝氨酸类似物的第三次层析富集液。
d)将含有纯度＞80％的纽莫康定B0丝氨酸类似物的第三次层析富集液，进行减压浓缩，压力控制在-0.09mPa～-0.1mPa。，控制温度为40℃，除去溶剂后冻干，得到纽莫康定B0丝氨酸类似物干粉，液相检测纯度为81.3％，产品收率54.8％。
实施例9：纽莫康定B0丝氨酸类似物的结构鉴定
1、高分辨质谱
仪器：Q-TOF micro
测试条件：ESI源
测试结果：见图1。
高分辨质谱结果如下所示：
| 实测值 | 理论值 | 偏差(mDa) | 精度(ppm) | 元素组成 |
| 1051.5602 | 1051.5612 | 10 | 9.5 | C<sub>49</sub>H<sub>80</sub>N<sub>8</sub>O<sub>17</sub> |
解析：质谱电喷雾电离源(ESI)正离子检测,测得化合物的 [M+H]+1051.5602峰。确定[M+H]+1051.5602峰的元素组成为 C49H80N8O17，证明元素组成为C49H79N8O17，与Pneumocandin B0的丝氨酸类似物元素组成一致。
2、核磁共振谱
仪器型号：Bruker 400MHz
测试条件：CD3OD
测试结果：H谱见图2；C谱见图3；DEPT13见图4；COSY谱见图5；HMBC谱见图6；HSQC谱见图7。
解析：如下所示的结构式为化合物残基的结构式。
可以把该化合物的结构按残基分为3-OHPro、OHGln、DiOHTyr、 4-OHPro、Ser、DiOHOrn和DMM七个部分(图1)。分析1H、13C、 DEPT和HMQC谱表明有3个甲基、16个亚甲基(其中2个连N原子，分别为3-OHPro中的C-5和4-OHPro中的C-5)、16个是次甲基(7个氧代，6个氮代，1个氧氮二元代)、1个二取代的苯环、8 个羰基碳。1H、13C-NMR和二维相关光谱表明该化合物是
一个pneumocandin B0类似物，具有2个羟基脯氨酸(3-OHPro 和4-OHPro)、1个二羟基酪氨酸类似物(DiOHTyr)、1个羟基谷氨酰胺(OHGln)、1个丝氨酸(Ser)、一个二羟基鸟氨酸(DiOHOrn) 和1个二甲基肉豆蔻酸。通过COSY和HMBC相关谱，连接得到了该化合物的平面结构。
COSY谱显示化合物有下列5个自旋偶合相关体系：3-OHPro: 2-CH→3-CH→4-CH2→5-CH2；OHGln:2-CH→3-CH→4-CH2； DiOHTyr:2-CH→3-CH→4-CH和2’/6’-CH→3’/5’-CH；4-OHPro: 2-CH→3-CH2→4-CH→5-CH2；Ser:2-CH→3-CH；DiOHOrn: 2-CH→3-CH2→4-CH→5-CH；DMM:
2-CH2→3-CH2→4-CH2→5-CH2→6-CH2→7-CH2→8-CH2→9-CH2→10-CH→11-CH2→12-CH→13-CH2→14-CH3。
1H-13C-NMR远程偶合相关谱表明：3-OHPro中2-H和5-H2与 OHGln中的1-C相关，表明OHGln通过酰胺键与3-OHPro相连； OHGln中2-H与DiOHTyr中的1-C相关，表明DiOHTyr通过酰胺键与OHGln相连；DiOHTyr中2-H与4-OHPro中的1-C相关，表明 4-OHPro通过酰胺键与DiOHTyr相连；4-OHPro中2-H和5-H2与Ser 中的1-C相关，表明Ser通过酰胺键与4-OHPro相连；Ser中2-H与 DiOHOrn中的1-C相关，表明DiOHOrn通过酰胺键与Ser相连； DiOHOrn中2-H与DMM中的1-C相关，表明DMM通过酰胺键与 DiOHOrn相连；
通过COSY和HMBC的二维相关，把各基团相连，得到该化合物完整结构，如下所示的结构式，与文献中报道的纽莫康定 B0丝氨酸类似物结构一致：
需要声明的是，上述发明内容及具体实施方式意在证明本发明所提供技术方案的实际应用，不应解释为对本发明保护范围的限定。本领域技术人员在本发明的精神和原理内，当可作各种修改、等同替换、或改进。
Claims (9)
1.一种纽莫康定B0丝氨酸类似物的分离纯化方法，所述分离纯化方法包括以下步骤：
a)将含有丝氨酸类似物的纽莫康定B0粗品采用色谱填料进行第一次层析富集，其中，所述色谱填料为聚苯乙烯/二乙烯基苯UniPS、聚苯乙烯/二乙烯基苯UniPSA或聚丙烯酸UniPSN，流动相为甲醇水溶液、乙醇水溶液、乙腈水溶液或丙酮水溶液；层析后进行等度洗脱或梯度洗脱、分段收集，以得到含有纯度＞30％的纽莫康定B0丝氨酸类似物的第一次层析富集液；
b)将所述第一次层析富集液进行减压浓缩以除去溶剂，再用亲水作用色谱填料进行第二次层析纯化，所述亲水作用色谱填料为Xamide、X3或HILIC，流动相为甲醇水溶液、乙醇水溶液、乙腈水溶液或丙酮水溶液；层析后进行等度洗脱或梯度洗脱、分段收集，以得到含有纯度＞60％的纽莫康定B0丝氨酸类似物的第二次层析富集液；
c)将所述第二次层析富集液进行减压浓缩以除去溶剂，再用反相硅胶基质色谱填料第三次层析纯化，所述反相硅胶基质色谱填料为C8或C18，流动相为甲醇水溶液、乙醇水溶液、乙腈水溶液或丙酮水溶液；层析后进行等度洗脱或梯度洗脱、分段收集，以得到含有纯度＞80％的纽莫康定B0丝氨酸类似物的第三次层析富集液；
d)将所述第三次层析富集液进行减压浓缩以除去溶剂，再冻干，以得到纯度＞80％的纽莫康定B0丝氨酸类似物干粉。
2.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，在步骤a)中，所述色谱填料的粒径为5μm、10μm或30μm，所述色谱填料的孔径为100A、300A或500A。
3.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，在步骤a)中，所述甲醇水溶液中甲醇的比例为65-85％(体积比)；所述乙醇水溶液中乙醇的比例为70-90％(体积比)；所述乙腈水溶液中乙腈的比例为30-50％(体积比)；所述丙酮水溶液中丙酮的比例为60-80％(体积比)。
4.根据权利要求1所述的分离纯化方法，在步骤b)中，所述色谱填料的粒径为5μm、10μm或30μm；所述色谱填料的孔径为60A、100A或120A。
5.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，在步骤b)中，所述甲醇水溶液中甲醇的比例为60-80％(体积比)；所述乙醇水溶液中乙醇的比例为65-85％(体积比)；所述乙腈水溶液中乙腈的比例为35-55％(体积比)；所述丙酮水溶液中丙酮的比例为70-90％(体积比)。
6.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，在步骤c)中，所述色谱填料的粒径为5μm、10μm或30μm；所述色谱填料的孔径为60A、100A或120A。
7.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，在步骤c)中，所述甲醇水溶液中甲醇的比例为65-85％(体积比)；所述乙醇水溶液中乙醇的比例为70-90％(体积比)；所述乙腈水溶液中乙腈的比例为40-60％(体积比)；所述丙酮水溶液中丙酮的比例为65-85％(体积比)。
8.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，在步骤d)中，减压浓缩时，温度控制在10-50℃，优选20-40℃，更优选25-35℃。
9.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，在步骤d)中，减压浓缩时，压力控制在-0.09mPa～-0.1mPa。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810689082.3A CN110655557A (zh) | 2018-06-28 | 2018-06-28 | 一种纽莫康定b0丝氨酸类似物的分离纯化方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810689082.3A CN110655557A (zh) | 2018-06-28 | 2018-06-28 | 一种纽莫康定b0丝氨酸类似物的分离纯化方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN110655557A true CN110655557A (zh) | 2020-01-07 |
Family
ID=69027410
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201810689082.3A Pending CN110655557A (zh) | 2018-06-28 | 2018-06-28 | 一种纽莫康定b0丝氨酸类似物的分离纯化方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN110655557A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112321682A (zh) * | 2020-11-24 | 2021-02-05 | 苏州纳微科技股份有限公司 | 一种纽莫康定b0的纯化方法 |
| CN112430256A (zh) * | 2020-11-23 | 2021-03-02 | 苏州纳微科技股份有限公司 | 一种阿尼芬净母核的分离纯化方法 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20130018171A1 (en) * | 2010-03-29 | 2013-01-17 | Dsm Sinochem Pharmaceuticals Netherlands B.V. | Purification of caspofungin intermediates |
| CN103304640A (zh) * | 2012-03-14 | 2013-09-18 | 浙江医药股份有限公司新昌制药厂 | 一种从发酵液中提取棘白菌素类化合物的方法 |
| CN104507309A (zh) * | 2012-03-19 | 2015-04-08 | 奇达拉治疗公司 | 用于棘白菌素类化合物的给药方案 |
| US20160213742A1 (en) * | 2013-09-04 | 2016-07-28 | Cidara Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for the treatment of fungal infections |
| CN105820213A (zh) * | 2016-04-15 | 2016-08-03 | 中国医药集团总公司四川抗菌素工业研究所 | 高效分离纯化纽莫康定的方法 |
-
2018
- 2018-06-28 CN CN201810689082.3A patent/CN110655557A/zh active Pending
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20130018171A1 (en) * | 2010-03-29 | 2013-01-17 | Dsm Sinochem Pharmaceuticals Netherlands B.V. | Purification of caspofungin intermediates |
| CN103304640A (zh) * | 2012-03-14 | 2013-09-18 | 浙江医药股份有限公司新昌制药厂 | 一种从发酵液中提取棘白菌素类化合物的方法 |
| CN104507309A (zh) * | 2012-03-19 | 2015-04-08 | 奇达拉治疗公司 | 用于棘白菌素类化合物的给药方案 |
| US20160213742A1 (en) * | 2013-09-04 | 2016-07-28 | Cidara Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for the treatment of fungal infections |
| CN105820213A (zh) * | 2016-04-15 | 2016-08-03 | 中国医药集团总公司四川抗菌素工业研究所 | 高效分离纯化纽莫康定的方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| LA PETERSEN ET AL.: ""Effects of amino acid and trace element supplementation on pneumocandin production by Glareal lozyensis：impact on titer，analogue levels，and the identification of new analogues of pneumocandin B0"", 《JOURNAL OF INDUSTRIAL MICROBIOLOGY & BIOTECHNOLOGY》 * |
| 孙新强 等: ""一种纽莫康定Bo丝氨酸类似物的分离和结构鉴定"", 《中国抗生素杂志》 * |
| 杨渊 等: ""亲水作用色谱法测定纽莫康定B0及其杂质的研究"", 《中国抗生素杂志》 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112430256A (zh) * | 2020-11-23 | 2021-03-02 | 苏州纳微科技股份有限公司 | 一种阿尼芬净母核的分离纯化方法 |
| CN112321682A (zh) * | 2020-11-24 | 2021-02-05 | 苏州纳微科技股份有限公司 | 一种纽莫康定b0的纯化方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR101479389B1 (ko) | 아자시클로헥사펩타이드 또는 그 염의 정제방법 | |
| JPH02288837A (ja) | ニユーモシステイス・カリニの抑制方法 | |
| CN102718843B (zh) | 一种替考拉宁单组份的制备方法 | |
| EP2623611A1 (en) | Method for purifying cyclic lipopeptide or salt thereof | |
| CN103304640B (zh) | 一种从发酵液中提取棘白菌素类化合物的方法 | |
| CN101195647A (zh) | 羟基红花黄色素a及其制备方法和应用 | |
| CN108640968B (zh) | 一种混源萜类化合物及其在制备抗炎药物中的用途 | |
| CN110655557A (zh) | 一种纽莫康定b0丝氨酸类似物的分离纯化方法 | |
| CN108250270A (zh) | 一种从发酵液中富集提取达托霉素的方法 | |
| CN101209952B (zh) | 倍半萜类化合物及其组合物和从植物中提取的方法与其应用 | |
| CN112830949B (zh) | 海洋曲霉菌产生的抗真菌化合物及其制备方法 | |
| CN107141335B (zh) | 一种环肽化合物及其制备方法和应用 | |
| RU2694354C1 (ru) | Способ сорбционно-хроматографического выделения и очистки такролимуса | |
| CN107573362A (zh) | 一种从发酵液中分离提纯西罗莫司的方法 | |
| CN111187339B (zh) | 一种从发酵液中提取fr901379的方法 | |
| CN107778357A (zh) | 一种纽莫康定b0的提取、纯化方法 | |
| JPS6158593A (ja) | 新規サフラマイシンａ誘導体およびその製造法 | |
| CN106957216B (zh) | 一种抗真菌化合物制备方法和抗真菌用途 | |
| US20080096856A1 (en) | Antibiotic Compound | |
| CN114989190B (zh) | 一类大环内酯类化合物kongjuemycins及其制备方法和应用 | |
| CN105646627B (zh) | 一种从蛹虫草培养液中提取纯化虫草素的方法 | |
| CN108516923B (zh) | 一系列烯萜类化合物及其制备方法和应用 | |
| JPH05279384A (ja) | 新規抗真菌抗生物質 | |
| CN111378013B (zh) | 一种高纯度环肽化合物的制备方法 | |
| RU2725187C1 (ru) | Способ выделения и очистки нафтохиноновых противогрибковых антибиотиков астолидов А и В |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20200107 |