JP2021535214A - インスリンアナログの精製のためのクロマトグラフィープロセス - Google Patents
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Abstract
Description
組換え型のインスリン、インスリンアナログおよび/またはインスリン誘導体は、様々な微生物発現系で製造されてきた。大腸菌、出芽酵母(s.cerevisiae)などの生物は、組換えヒトインスリンおよびその誘導体の商業的製造のために採用されてきた。タンパク質またはタンパク質前駆体は、酵母(yeast)発現系に由来する場合があり、高い発現レベルとグリコシル化タンパク質前駆体の増加との間には相関が観察されている。それゆえ、グリコシル化タンパク質から非グリコシル化タンパク質を分離する、より効率的なプロセスに対する必要性がますます明らかになっている。低い発現レベル、下流精製における困難性などのこれらの系の欠点により、タンパク質発現系としては、メチル栄養酵母であるピキア酵母(Pichia pastoris)の使用が好まれてきた。米国特許第6,800,606号においては、高発現、低製造コスト、高密度培養などのピキア酵母発現系の利点が言及されている。
バイオコン社による米国特許公開第20120178900号は、インスリン アスパルト(Aspart)、Atisoban、インスリン グラルギンおよびインスリン リスプロ(Lispro)の精製のためのRP−HPLCプロセスを開示している。このプロセスは、有機修飾剤と組み合わせたイオンペアリング剤を用いたRP−HPLCを採用することを含む。
本発明の目的は、モノグリコシル化、ジグリコシル化またはトリグリコシル化バリアントを実質的に含まない、少なくとも99.95%精製された非グリコシル化インスリン グラルギンおよび非グリコシル化インスリン リスプロを得るためのプロセスを提供することである。これは、2つの逆相HPLCステップの組み合わせを使用することによって達成され、ここで、第1のステップは、より低いpHで好ましいイオンペアリング剤としてオクタンスルホン酸(OSA)を用いて行われ、第2のステップは、好ましいイオンペアリング剤として過塩素酸ナトリウムまたは重硫酸テトラブチルアンモニウム(TBAB)を用いて高いpHで行われる。第1のステップおよび第2のステップは、逆の順序で行って、インスリン グラルギンまたはインスリン リスプロのグリコシル化バリアントの少なくとも99.95%除去が得られるようにしてもよい。
本発明は、インスリン リスプロおよびグラルギンの非グリコシル化バリアント、モノグリコシル化バリアントおよびポリグリコシル化バリアントを含む複合混合物から、前記グリコシル化バリアントの少なくとも99.95%除去を達成することによる、インスリン グラルギンおよびインスリン リスプロなどの非グリコシル化インスリンアナログの精製のためのプロセスに関する。
本概要は、請求の範囲に記載された主題の本質的な特徴を認定することを意図するものでなく、また、請求の範囲に記載された主題の範囲を決定または限定するために用いられることを意図するものでもない。
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、および本開示の側面をさらに例示するために含まれている。本開示は、本明細書に提示された特定の態様の詳細な説明と組み合わせて図面を参照することにより、よりよく理解され得る。
当業者は、本明細書において記載されている発明が、具体的に記載されているもの以外の変更および改変の対象となることが分かるであろう。本明細書において記載されている発明は、全てのかかる変更および改変を含むことが理解されるはずである。本発明はまた、本明細書中で言及されるまたは示される、全てのかかるステップ、特徴、組成物および方法を、個々にもしくはまとめて含み、ならびに前記ステップまたは特徴の任意の2つ以上の任意の全ての組み合わせを含む。
便宜上、本発明のさらなる説明の前に、本明細書において採用されている特定の用語、例をここにまとめる。これらの定義は、開示の残りの部分に照らして解釈されるべきであり、当業者により理解されるべきである。他に定義されていない限り、本明細書において用いられる全ての技術的および科学的用語は、当該技術分野における通常の知識を有する者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書全体にわたって用いられる用語は、特定の場合において他に限定されていない限り、以下のように定義される。
本開示は、例示のみを目的として意図されている本明細書において記載されている特定の態様によって、範囲が限定されるべきではない。
機能的に等価なプロセスおよび方法は、本明細書において記載されているように、明らかに本開示の範囲内にある。
用語「グリコシル化」は、特に、マンノース、ポリマンノース、リボース糖などの炭水化物骨格が、タンパク質のA鎖もしくはB鎖のアミノ酸に、またはA鎖およびB鎖の両方のアミノ酸に、付着しているタンパク質をいう。用語「グリコシル化タンパク質」には、モノグリコシル化タンパク質およびポリグリコシル化タンパク質が含まれる。
用語「非グリコシル化」は、特に、タンパク質の全ての鎖に糖骨格(グリカン)が付着していないタンパク質をいう。
用語「リスプロ」は、特に、ヒトインスリンとは化学的に異なる速効性ヒトインスリンアナログをいう。インスリン リスプロにおいては、B28位におけるアミノ酸プロリンがリジンに置換されており、およびB29位におけるリジンがプロリンに置換されている。
用語「下流精製」は、生合成医薬生成物の製造中に発生した関連不純物および廃棄物からの、該生成物の回収および精製をいう。
本発明は、多様なモノグリコシル化型およびポリグリコシル化型インスリンアナログの少なくとも99.95%除去による、非グリコシル化インスリンアナログの精製プロセスに関する。前記プロセスは、最終生成物中に存在する不純物の性質についてのよりよい理解に起因した、最適化された下流精製技術による生成物の選択的精製である。
本発明において、低pHで行われる精製ステップは、クロマトグラフィーの逆相モードにおいて、好ましいイオンペアリング剤としてオクタンスルホン酸、好ましくはオクタンスルホン酸(OSA)のナトリウム塩を用いる。OSAは、スルホン基(SO3−)に付着した、炭素8個の長い疎水性鎖を有するカチオン性イオンペアリング剤である。OSAは、酸性pHでタンパク質サンプルと相互作用し、結合化学を変化させて、グリコシル化タンパク質と非グリコシル化タンパク質との間の分割を増強させる。
本開示は、これより実施例を用いて例示されるが、これは、開示の実施を例示することを意図しており、本開示の範囲について、いかなる限定をも暗示するように制限的にみなすことを意図していない。
ある態様においては、インスリンアナログは、インスリン グラルギンである。別の態様においては、インスリンアナログは、インスリン リスプロである。
ある態様においては、グリコシル化インスリンアナログは、モノグリコシル化、ジグリコシル化、トリグリコシル化、ポリグリコシル化されていてもよく、およびそれらの混合物であってもよい。
低pHベースのRP−HPLCの後に高pHベースのRP−HPLCが続く、インスリン グラルギンの精製
低pHでの精製ステップ−1は、図1のフローチャートに示されている通りである。精製ステップ−1の詳細は以下の通りである。
定常相の詳細:
a.媒体:クロマシル(Kromasil) C8−100A−13pm
b.高さ:25.Oil.Ocm
c.線速度:全てのクロマトグラフィーステップについて、≦360cm/h
a.移動相A:pH3.7±0.1の、100mM酢酸ナトリウム+0.05%(w/v)オクタンスルホン酸(OSA)(pHは氷酢酸を用いて調整)
b.移動相B:100.0%アセトニトリル
c.精製サイクルの間の移動相AおよびBの温度:20〜30℃
a.先のステップで得られたロード濃縮物を、精製水および酢酸の混合物を用いて、≧1.0:10.0の比率で希釈した。
b.希釈後、サンプルを1.2pm、0.45pm、続いて0.22pmのフィルターでろ過した。
c.1.2pmのろ過に用いられたフィルターは、ポリプロピレン(PP)製であり、0.45/0.22pmのろ過に用いられたものは、ポリエーテルスルホン(PES)材質製であった。
d.ロード中の生成物濃度は、1.0〜2.0g/Lの範囲にあると予想された。
a.カラムは、90.0%(A):10.0%(B)の移動相を用い、≦360cm/hの線速度にて4〜5CV(カラム体積)で平衡化した。
b.カラムは、4〜12gグラルギン/Lクロマシルの容量で、≦360cm/hの線速度にてロードした。
c.ロード後、カラムは、85.0%(A):15.0%(B)の移動相を用い、≦360cm/hの線速度にて4〜5CV(カラム体積)で洗浄した。
d.生成物は、≦360cm/hの線速度にて、24〜31%Bの線形勾配を用い、25CVを超えてカラムから溶出させた。
f.溶出画分は、分析し、その純度レベルに基づいてプールし、調製した溶出プール(elution pool)を2〜8℃で保存した。
g.溶出後、残留タンパク質がある場合にはそれを除去するために、カラムを、≦360cm/hの線速度で、1M酢酸50.0%およびアセトニトリル50.0%を用いてアップフロー方向に2CV、続いて1M酢酸30.0%およびアセトニトリル70.0%を用いて1CVで再生した。
異なる相対的保持時間(RRT)における結果は、表1に示されるデータの通りであった。データによれば、グリコシル化タンパク質は、〜4.5倍、すなわちロード中の〜2.6%から溶出プール(EP)中の〜0.6%まで、減少した。
高pHでの精製ステップ−2は、図2のフローチャートに示されている通りである。精製ステップ−2の詳細は以下の通りである。
定常相の詳細:
a.媒体:クロマシル C8−100A−13pm
b.高さ:25.Oil.Ocm
c.線速度:全てのクロマトグラフィーステップについて、≦360cm/h
a.移動相A:pH8.5±0.1の、100mM Tris+50mM過塩素酸ナトリウム(pHは氷酢酸を用いて調整)
b.移動相B:100.0%アセトニトリル
c.精製サイクルの間の移動相AおよびBの温度:20〜30℃
a.精製ステップ−1で得られた溶出プール(EP)を、精製水を用いて1.0:2.0の比率で希釈した。
b.希釈されたサンプルのpHを、2.5M Trisを用いて8.5±0.1に調整した。
c.pH調整後、サンプルを、1.2μm、0.45pm、続いて0.22μmでろ過した。
d.1.2μmのろ過に用いられたフィルターは、ポリプロピレン(PP)製であり、0.45/0.22μmのろ過に用いられたものは、ポリエーテルスルホン(PES)材質製であった。
e.ロード中の生成物濃度は、1.0〜2.0g/Lの範囲にあると予想された。
a.カラムは、90.0%(A):10.0%(B)の移動相を用い、≦360cm/hの線速度にて4〜5CV(カラム体積)で平衡化した。
b.カラムは、4〜12gグラルギン/Lクロマシルの容量で、≦360cm/hの線速度にてロードした。
c.ロード後、カラムは、80.0%(A):20.0%(B)の移動相を用い、≦360cm/hの線速度にて4〜5CV(カラム体積)で洗浄した。
d.生成物は、≦360cm/hの線速度にて、25〜29%Bの線形勾配を用い、25CVを超えてカラムから溶出させた。
e.溶出の間、可変体積画分の収集は、280nmにおける吸光度(UV)の上昇に基づいて行った。収集は、UVがベースラインに低下するまで継続した。カラムからタンパク質を溶出させるのに必要な体積は2.0〜3.0CVであった。
g.溶出画分は、分析し、その純度レベルに基づいてプールし、調製した溶出プールを2〜8℃で保存した。
h.溶出後、残留タンパク質がある場合にはそれを除去するために、カラムを、精製水50.0%およびアセトニトリル50.0%を用い、≦360cm/hの線速度にてアップフロー方向に3CVで再生する。
結果は、表2に示されるデータの通りであった。データによれば、グリコシル化タンパク質は、ロード中の〜0.5%から溶出プール中の〜0.00%まで減少した。
実験1
ヒトインスリン グラルギンを40mg/mlの濃度で含有する酵素反応最終産物(enzyme reaction end)を、5%アセトニトリル、0.5M酢酸に調整し、精製水を用いて1.31mg/mlに希釈して、ロードサンプルとして用いた。予め充填された逆相クロマシル100−13−C8カラム(1*25cm)を使用し、インスリン グラルギンを精製した。カラムは、最初に、100mM酢酸ナトリウム+0.05%OSA緩衝液(pH3.7±0.1)90%およびアセトニトリル10%を用い、約5カラム体積で平衡化した。サンプルは、結合容量が〜8.0gヒトインスリン グラルギン/L樹脂のカラムにロードした。緩やかに結合したタンパク質は、100mM酢酸ナトリウム+0.05%OSA緩衝液(pH3.7±0.1)85%およびアセトニトリル15%を用いて、約4カラム体積で洗浄した。結合したタンパク質は、100mM酢酸ナトリウム+0.05%OSA緩衝液(pH3.7±0.1)を用いて25〜32%アセトニトリルの勾配で溶出した。0.25カラム体積の複数画分を280nmにおける吸光度の増加に基づいて収集した。強固に結合したタンパク質は、1M酢酸50%およびアセトニトリル50%を用いて2カラム体積で溶出し、続いて1M酢酸30%およびアセトニトリル70%を用いて1カラム体積で溶出した。全ユニットの操作は、360cm/hの線流速で行った。ロードサンプル、溶出画分および溶出プールは、YMC Co. Ltd製のC18カラムを用いた分析法によって分析した)。結果を表3において下記に示す。
ヒトインスリン グラルギンを40mg/mlの濃度で含有する酵素反応最終産物を、5%アセトニトリル、0.5M酢酸に調整し、精製水を用いて1.37mg/mlに希釈して、ロードサンプルとして用いた。予め充填された逆相クロマシル100−13−C8カラム(1*25cm)を使用し、インスリン グラルギンを精製した。カラムは、最初に、100mM酢酸ナトリウム+0.05%OSA緩衝液(pH3.7±0.1)90%およびアセトニトリル10%を用い、約5カラム体積で平衡化した。サンプルは、結合容量が〜8.0gヒトインスリン グラルギン/L樹脂のカラムにロードした。緩やかに結合したタンパク質は、100mM酢酸ナトリウム+0.05%OSA緩衝液(pH3.7±0.1)85%およびアセトニトリル15%を用いて、約4カラム体積で洗浄した。結合したタンパク質は、100mM酢酸ナトリウム+0.05%OSA緩衝液(pH3.7±0.1)を用いて25〜32%アセトニトリルの勾配で溶出した。0.25カラム体積の複数画分を280nmにおける吸光度の増加に基づいて収集した。強固に結合したタンパク質は、1M酢酸50%およびアセトニトリル50%を用いて2カラム体積で溶出し、続いて1M酢酸30%およびアセトニトリル70%を用いて1カラム体積で溶出した。全ユニットの操作は、360cm/hの線流速で行った。ロードサンプルならびに溶出画分および溶出プールは、YMC C18法によって分析した。結果を表4において下記に示す。
ヒトインスリン グラルギンを40mg/mlの濃度で含有する酵素反応最終産物を、5%アセトニトリル、0.5M酢酸に調整し、精製水を用いて1.42mg/mlに希釈して、ロードサンプルとして用いた。予め充填された逆相クロマシル100−13−C8カラム(1*25cm)を使用し、インスリン グラルギンを精製した。カラムは、最初に、100mM酢酸ナトリウム+0.05%OSA緩衝液(pH3.7±0.1)90%およびアセトニトリル10%を用い、約5カラム体積で平衡化した。サンプルは、結合容量が〜7.6gヒトインスリン グラルギン/L樹脂のカラムにロードした。緩やかに結合したタンパク質は、100mM酢酸ナトリウム+0.05%OSA緩衝液(pH3.7±0.1)85%およびアセトニトリル15%を用いて、約4カラム体積で洗浄した。結合したタンパク質は、100mM酢酸ナトリウム+0.05%OSA緩衝液(pH3.7±0.1)を用いて25〜32%アセトニトリルの勾配で溶出した。0.25カラム体積の複数画分を280nmにおける吸光度の増加に基づいて収集した。強固に結合したタンパク質は、1M酢酸50%およびアセトニトリル50%を用いて2カラム体積で溶出し、続いて1M酢酸30%およびアセトニトリル70%を用いて1カラム体積で溶出した。全ユニットの操作は、360cm/hの線流速で行った。ロードサンプル、溶出画分および溶出プールは、YMC Co. Ltd製のC18カラムを用いた分析法によって分析した。結果を表5において下記に示す。
ヒトインスリン グラルギンを18mg/mlの濃度で含有する酵素反応最終産物を、5%アセトニトリル、0.5M酢酸に調整し、精製水を用いて1.5mg/mlに希釈して、ロードサンプルとして用いた。予め充填された逆相クロマシル100−13−C8カラム(1*25cm)を使用し、インスリン グラルギンを精製した。カラムは、最初に、100mM酢酸ナトリウム+0.05%OSA緩衝液(pH3.7±0.1)90%およびアセトニトリル10%を用い、約5カラム体積で平衡化した。サンプルは、結合容量が〜10.0gヒトインスリン グラルギン/L樹脂のカラムにロードした。緩やかに結合したタンパク質は、100mM酢酸ナトリウム+0.05%OSA緩衝液(pH3.7±0.1)85%およびアセトニトリル15%を用いて、約4カラム体積で洗浄した。結合したタンパク質は、100mM酢酸ナトリウム+0.05%OSA緩衝液(pH3.7±0.1)を用いて25〜32%アセトニトリルの勾配で溶出した。0.25カラム体積の複数画分を280nmにおける吸光度の増加に基づいて収集した。強固に結合したタンパク質は、1M酢酸50%およびアセトニトリル50%を用いて2カラム体積で溶出し、続いて1M酢酸30%およびアセトニトリル70%を用いて1カラム体積で溶出した。全ユニットの操作は、360cm/hの線流速で行った。ロードサンプル、溶出画分および溶出プールは、YMC Co. Ltd製のC18カラムを用いた分析法によって分析した。結果を表6において下記に示す。
ヒトインスリン グラルギンを18mg/mlの濃度で含有する酵素反応最終産物を、5%アセトニトリル、0.5M酢酸に調整し、精製水を用いて1.6mg/mlに希釈して、ロードサンプルとして用いた。予め充填された逆相クロマシル100−13−C8カラム(2.1*25cm)を使用し、インスリン グラルギンを精製した。カラムは、最初に、100mM酢酸ナトリウム+0.05%OSA緩衝液(pH3.7±0.1)90%およびアセトニトリル10%を用い、約5カラム体積で平衡化した。サンプルは、結合容量が〜10gヒトインスリン グラルギン/L樹脂のカラムにロードした。緩やかに結合したタンパク質は、100mM酢酸ナトリウム+0.05%OSA緩衝液(pH3.7±0.1)85%およびアセトニトリル15%を用いて、約4カラム体積で洗浄した。結合したタンパク質は、100mM酢酸ナトリウム+0.05%OSA緩衝液(pH3.7±0.1)を用いて25〜32%アセトニトリルの勾配で溶出した。0.25カラム体積の複数画分を280nmにおける吸光度の増加に基づいて収集した。強固に結合したタンパク質は、1M酢酸50%およびアセトニトリル50%を用いて2カラム体積で溶出し、続いて1M酢酸30%およびアセトニトリル70%を用いて1カラム体積で溶出した。全ユニットの操作は、360cm/hの線流速で行った。ロードサンプル、溶出画分および溶出プールは、YMC Co. Ltd製のC18カラムを用いた分析法によって分析した。結果を表7において下記に示す。
ヒトインスリン グラルギンを32mg/mlの濃度で含有する酵素反応最終産物を、5%アセトニトリル、0.5M酢酸に調整し、精製水を用いて1.5mg/mlに希釈して、ロードサンプルとして用いた。予め充填された逆相クロマシル100−13−C8カラム(2.1*25cm)を使用し、インスリン グラルギンを精製した。カラムは、最初に、100mM酢酸ナトリウム+0.05%OSA緩衝液(pH3.7±0.1)90%およびアセトニトリル10%を用い、約5カラム体積で平衡化した。サンプルは、結合容量が〜10gヒトインスリン グラルギン/L樹脂のカラムにロードした。緩やかに結合したタンパク質は、100mM酢酸ナトリウム+0.05%OSA緩衝液(pH3.7±0.1)85%およびアセトニトリル15%を用いて、約4カラム体積で洗浄した。結合したタンパク質は、100mM酢酸ナトリウム+0.05%OSA緩衝液(pH3.7±0.1)を用いて25〜32%アセトニトリルの勾配で溶出した。0.25カラム体積の複数画分を280nmにおける吸光度の増加に基づいて収集した。強固に結合したタンパク質は、1M酢酸50%およびアセトニトリル50%を用いて2カラム体積で溶出し、続いて1M酢酸30%およびアセトニトリル70%を用いて1カラム体積で溶出した。全ユニットの操作は、360cm/hの線流速で行った。ロードサンプル、溶出画分および溶出プールは、YMC Co. Ltd製のC18カラムを用いた分析法によって分析した。結果を表8において下記に示す。
ヒトインスリン グラルギンを16mg/mlの濃度で含有する酵素反応最終産物を、5%アセトニトリル、0.5M酢酸に調整し、精製水を用いて1.5mg/mlに希釈して、ロードサンプルとして用いた。予め充填された逆相クロマシル100−13−C8カラム(2.1*25cm)を使用し、インスリン グラルギンを精製した。カラムは、最初に、100mM酢酸ナトリウム+0.05%OSA緩衝液(pH3.7±0.1)90%およびアセトニトリル10%を用い、約5カラム体積で平衡化した。サンプルは、結合容量が〜10gヒトインスリン グラルギン/L樹脂のカラムにロードした。緩やかに結合したタンパク質は、100mM酢酸ナトリウム+0.05%OSA緩衝液(pH3.7±0.1)85%およびアセトニトリル15%を用いて、約4カラム体積で洗浄した。結合したタンパク質は、100mM酢酸ナトリウム+0.05%OSA緩衝液(pH3.7±0.1)を用いて25〜32%アセトニトリルの勾配で溶出した。0.25カラム体積の複数画分を280nmにおける吸光度の増加に基づいて収集した。強固に結合したタンパク質は、1M酢酸50%およびアセトニトリル50%を用いて2カラム体積で溶出し、続いて1M酢酸30%およびアセトニトリル70%を用いて1カラム体積で溶出した。全ユニットの操作は、360cm/hの線流速で行った。ロードサンプル、溶出画分および溶出プールは、YMC Co. Ltd製のC18カラムを用いた分析法によって分析した。結果を表9において下記に示す。
ヒトインスリン グラルギンを36mg/mlの濃度で含有する酵素反応最終産物を、5%アセトニトリル、0.5M酢酸に調整し、精製水を用いて1.6mg/mlに希釈して、ロードサンプルとして用いた。クロマシル100−13−C8樹脂が充填されたNovosepステンレススチールカラム(5*25cm)を使用し、インスリン グラルギンを精製した。カラムは、最初に、100mM酢酸ナトリウム+0.05%OSA緩衝液(pH3.7±0.1)90%およびアセトニトリル10%を用い、約5カラム体積で平衡化した。サンプルは、結合容量が〜9gヒトインスリン グラルギン/L樹脂のカラムにロードした。緩やかに結合したタンパク質は、100mM酢酸ナトリウム+0.05%OSA緩衝液(pH3.7±0.1)85%およびアセトニトリル15%を用いて、約4カラム体積で洗浄した。結合したタンパク質は、100mM酢酸ナトリウム+0.05%OSA緩衝液(pH3.7±0.1)を用いて25〜32%アセトニトリルの勾配で溶出した。0.25カラム体積の複数画分を280nmにおける吸光度の増加に基づいて収集した。強固に結合したタンパク質は、1M酢酸50%およびアセトニトリル50%を用いて2カラム体積で溶出し、続いて1M酢酸30%およびアセトニトリル70%を用いて1カラム体積で溶出した。全ユニットの操作は、360cm/hの線流速で行った。ロードサンプル、溶出画分および溶出プールは、YMC Co. Ltd製のC18カラムを用いた分析法によって分析した。結果を表10において下記に示す。
ヒトインスリン グラルギンを32mg/mlの濃度で含有する酵素反応最終産物を、5%アセトニトリル、0.5M酢酸に調整し、精製水を用いて1.7mg/mlに希釈して、ロードサンプルとして用いた。クロマシル100−13−C8樹脂が充填されたNovosepステンレススチールカラム(5*25cm)を使用し、インスリン グラルギンを精製した。カラムは、最初に、100mM酢酸ナトリウム+0.05%OSA緩衝液(pH3.7±0.1)90%およびアセトニトリル10%を用い、約5カラム体積で平衡化した。サンプルは、結合容量が〜9gヒトインスリン グラルギン/L樹脂のカラムにロードした。緩やかに結合したタンパク質は、100mM酢酸ナトリウム+0.05%OSA緩衝液(pH3.7±0.1)85%およびアセトニトリル15%を用いて、約4カラム体積で洗浄した。結合したタンパク質は、100mM酢酸ナトリウム+0.05%OSA緩衝液(pH3.7±0.1)を用いて25〜32%アセトニトリルの勾配で溶出した。0.25カラム体積の複数画分を280nmにおける吸光度の増加に基づいて収集した。強固に結合したタンパク質は、1M酢酸50%およびアセトニトリル50%を用いて2カラム体積で溶出し、続いて1M酢酸30%およびアセトニトリル70%を用いて1カラム体積で溶出した。全ユニットの操作は、360cm/hの線流速で行った。ロードサンプル、溶出画分および溶出プールは、YMC Co. Ltd製のC18カラムを用いた分析法によって分析した。結果を表11において下記に示す。
ヒトインスリン グラルギンを32mg/mlの濃度で含有する酵素反応最終産物を、5%アセトニトリル、0.5M酢酸に調整し、精製水を用いて1.7mg/mlに希釈して、ロードサンプルとして用いた。クロマシル100−13−C8樹脂が充填されたNovosepステンレススチールカラム(5*25cm)を使用し、インスリン グラルギンを精製した。カラムは、最初に、100mM酢酸ナトリウム+0.05%OSA緩衝液(pH3.7±0.1)90%およびアセトニトリル10%を用い、約5カラム体積で平衡化した。サンプルは、結合容量が〜11gヒトインスリン グラルギン/L樹脂のカラムにロードした。緩やかに結合したタンパク質は、100mM酢酸ナトリウム+0.05%OSA緩衝液(pH3.7±0.1)およびアセトニトリル15%を用いて、約4カラム体積で洗浄した。結合したタンパク質は、100mM酢酸ナトリウム+0.05%OSA緩衝液(pH3.7±0.1)85%を用いて25〜32%アセトニトリルの勾配で溶出した。0.25カラム体積の複数画分を280nmにおける吸光度の増加に基づいて収集した。強固に結合したタンパク質は、1M酢酸50%およびアセトニトリル50%を用いて2カラム体積で溶出し、続いて1M酢酸30%およびアセトニトリル70%を用いて1カラム体積で溶出した。全ユニットの操作は、360cm/hの線流速で行った。ロードサンプル、溶出画分および溶出プールは、YMC Co. Ltd製のC18カラムを用いた分析法によって分析した。結果を表12において下記に示す。
ヒトインスリン グラルギンについての第1の逆相精製ステップは、イオンペアリング剤オクタンスルホン酸(OSA)を併用した低pH緩衝液を用いて、グリコシル化バリアントを68〜90%減少させ、それによりロード中の〜60%から溶出プール(EP)中の>97%まで、純度を増加させる。
実験11
2.8mg/mlの濃度のヒトインスリン グラルギンおよび〜29%アセトニトリルを含有する逆相精製−1最終産物を、2M Trisを用いてpH8.5に調整し、精製水を用いて希釈してアセトニトリル10%を含む最終濃度1.3mg/mlのインスリン グラルギンを得て、ロードサンプルとして用いた。予め充填された逆相クロマシル100−13−C8カラム(1*25cm)を用いて、インスリン グラルギンを精製した。カラムは、最初に、100mM Tris+50mM過塩素酸ナトリウム緩衝液(pH8.5±0.1)90%およびアセトニトリル10%を用い、5カラム体積で平衡化した。サンプルは、結合容量が〜6.5gヒトインスリン グラルギン/L樹脂のカラムにロードした。緩やかに結合したタンパク質は、100mM Tris+50mM過塩素酸ナトリウム緩衝液(pH8.5±0.1)80%およびアセトニトリル20%を用いて、4カラム体積で洗浄した。結合したタンパク質は、100mM Tris+50mM過塩素酸ナトリウム緩衝液(pH8.5±0.1)を用いて25〜29%アセトニトリルの勾配で、25カラム体積を超えて溶出した。0.25カラム体積の複数画分を280nmにおける吸光度の増加に基づいて収集した。強固に結合したタンパク質は、精製水50%およびアセトニトリル50%を用いて4カラム体積で溶出した。全ユニットの操作は、360cm/hの線流速で行った。ロードサンプル、溶出画分および溶出プールは、YMC Co. Ltd製のC18カラムを用いた分析法によって分析した。結果を下記表14に示す。
2.8mg/mlの濃度のヒトインスリン グラルギンおよび〜29%アセトニトリルを含有する逆相精製−1最終産物を、2M Trisを用いてpH8.5に調整し、精製水を用いて希釈してアセトニトリル10%を含む最終濃度1.3mg/mlのインスリン グラルギンを得て、ロードサンプルとして用いた。予め充填された逆相クロマシル100−13−C8カラム(1*25cm)を用いて、インスリン グラルギンを精製した。カラムは、最初に、100mM Tris+50mM過塩素酸ナトリウム緩衝液(pH8.5±0.1)90%およびアセトニトリル10%を用い、5カラム体積で平衡化した。サンプルは、結合容量が〜6.6gヒトインスリン グラルギン/L樹脂のカラムにロードした。緩やかに結合したタンパク質は、100mM Tris+50mM過塩素酸ナトリウム緩衝液(pH8.5±0.1)80%およびアセトニトリル20%を用いて、4カラム体積で洗浄した。結合したタンパク質は、100mM Tris+50mM過塩素酸ナトリウム緩衝液(pH8.5±0.1)を用いて25〜29%アセトニトリルの勾配で、25カラム体積を超えて溶出した。0.25カラム体積の複数画分を280nmにおける吸光度の増加に基づいて収集した。強固に結合したタンパク質は、精製水50%およびアセトニトリル50%を用いて4カラム体積で溶出した。全ユニットの操作は、360cm/hの線流速で行った。ロードサンプル、溶出画分および溶出プールは、YMC Co. Ltd製のC18カラムを用いた分析法によって分析した。結果を下記表15に示す。
2.8mg/mlの濃度のヒトインスリン グラルギンおよび〜29%アセトニトリルを含有する逆相精製−1最終産物を、2M Trisを用いてpH8.5に調整し、精製水を用いて希釈してアセトニトリル10%を含む最終濃度1mg/mlのインスリン グラルギンを得て、ロードサンプルとして用いた。予め充填された逆相クロマシル100−13−C8カラム(1*25cm)を用いて、インスリン グラルギンを精製した。カラムは、最初に、100mM Tris+50mM過塩素酸ナトリウム緩衝液(pH8.5±0.1)90%およびアセトニトリル10%を用い、5カラム体積で平衡化した。サンプルは、結合容量が〜9gヒトインスリン グラルギン/L樹脂のカラムにロードした。緩やかに結合したタンパク質は、100mM Tris+50mM過塩素酸ナトリウム緩衝液(pH8.5±0.1)80%およびアセトニトリル20%を用いて、4カラム体積で洗浄した。結合したタンパク質は、100mM Tris+50mM過塩素酸ナトリウム緩衝液(pH8.5±0.1)を用いて25〜29%アセトニトリルの勾配で、25カラム体積を超えて溶出した。0.25カラム体積の複数画分を280nmにおける吸光度の増加に基づいて収集した。強固に結合したタンパク質は、精製水50%およびアセトニトリル50%を用いて4カラム体積で溶出した。全ユニットの操作は、360cm/hの線流速で行った。ロードサンプル、溶出画分および溶出プールは、YMC Co. Ltd製のC18カラムを用いた分析法によって分析した。結果を下記表16に示す。
2.9mg/mlの濃度のヒトインスリン グラルギンおよび〜29%アセトニトリルを含有する逆相精製−1最終産物を、2M Trisを用いてpH8.5に調整し、精製水を用いて希釈してアセトニトリル10%を含む最終濃度1mg/mlのインスリン グラルギンを得て、ロードサンプルとして用いた。予め充填された逆相クロマシル100−13−C8カラム(1*25cm)を用いて、インスリン グラルギンを精製した。カラムは、最初に、100mM Tris+50mM過塩素酸ナトリウム緩衝液(pH8.5±0.1)90%およびアセトニトリル10%を用い、5カラム体積で平衡化した。サンプルは、結合容量が〜9gヒトインスリン グラルギン/L樹脂のカラムにロードした。緩やかに結合したタンパク質は、100mM Tris+50mM過塩素酸ナトリウム緩衝液(pH8.5±0.1)80%およびアセトニトリル20%を用いて、4カラム体積で洗浄した。結合したタンパク質は、100mM Tris+50mM過塩素酸ナトリウム緩衝液(pH8.5±0.1)を用いて25〜29%アセトニトリルの勾配で、25カラム体積を超えて溶出した。0.25カラム体積の複数画分を280nmにおける吸光度の増加に基づいて収集した。強固に結合したタンパク質は、精製水50%およびアセトニトリル50%を用いて4カラム体積で溶出した。全ユニットの操作は、360cm/hの線流速で行った。ロードサンプル、溶出画分および溶出プールは、YMC Co. Ltd製のC18カラムを用いた分析法によって分析した。結果を下記表17に示す。
3.8mg/mlの濃度のヒトインスリン グラルギンおよび〜29%アセトニトリルを含有する逆相精製−1最終産物を、2M Trisを用いてpH8.5に調整し、精製水を用いて希釈してアセトニトリル10%を含む最終濃度0.5mg/mlのインスリン グラルギンを得て、ロードサンプルとして用いた。予め充填された逆相クロマシル100−13−C8カラム(1*25cm)を用いて、インスリン グラルギンを精製した。カラムは、最初に、100mM Tris+50mM過塩素酸ナトリウム緩衝液(pH8.5±0.1)90%およびアセトニトリル10%を用い、5カラム体積で平衡化した。サンプルは、結合容量が〜7gヒトインスリン グラルギン/L樹脂のカラムにロードした。緩やかに結合したタンパク質は、100mM Tris+50mM過塩素酸ナトリウム緩衝液(pH8.5±0.1)80%およびアセトニトリル20%を用いて、4カラム体積で洗浄した。結合したタンパク質は、100mM Tris+50mM過塩素酸ナトリウム緩衝液(pH8.5±0.1)を用いて25〜29%アセトニトリルの勾配で、25カラム体積を超えて溶出した。0.25カラム体積の複数画分を280nmにおける吸光度の増加に基づいて収集した。強固に結合したタンパク質は、精製水50%およびアセトニトリル50%を用いて4カラム体積で溶出した。全ユニットの操作は、360cm/hの線流速で行った。ロードサンプル、溶出画分および溶出プールは、YMC Co. Ltd製のC18カラムを用いた分析法によって分析した。結果を下記表18に示す。
3.8mg/mlの濃度のヒトインスリン グラルギンおよび〜29%アセトニトリルを含有する逆相精製−1最終産物を、2M Trisを用いてpH8.5に調整し、精製水を用いて希釈してアセトニトリル10%を含む最終濃度1.2mg/mlのインスリン グラルギンを得て、ロードサンプルとして用いた。予め充填された逆相クロマシル100−13−C8カラム(1*25cm)を用いて、インスリン グラルギンを精製した。カラムは、最初に、100mM Tris+50mM過塩素酸ナトリウム緩衝液(pH8.5±0.1)90%およびアセトニトリル10%を用い、5カラム体積で平衡化した。サンプルは、結合容量が〜6gヒトインスリン グラルギン/L樹脂のカラムにロードした。緩やかに結合したタンパク質は、100mM Tris+50mM過塩素酸ナトリウム緩衝液(pH8.5±0.1)80%およびアセトニトリル20%を用いて、4カラム体積で洗浄した。結合したタンパク質は、100mM Tris+50mM過塩素酸ナトリウム緩衝液(pH8.5±0.1)を用いて25〜29%アセトニトリルの勾配で、25カラム体積を超えて溶出した。0.25カラム体積の複数画分を280nmにおける吸光度の増加に基づいて収集した。強固に結合したタンパク質は、精製水50%およびアセトニトリル50%を用いて4カラム体積で溶出した。全ユニットの操作は、360cm/hの線流速で行った。ロードサンプル、溶出画分および溶出プールは、YMC Co. Ltd製のC18カラムを用いた分析法によって分析した。結果を下記表19に示す。
3.4mg/mlの濃度のヒトインスリン グラルギンおよび〜29%アセトニトリルを含有する逆相精製−1最終産物を、2M Trisを用いてpH8.5に調整し、精製水を用いて希釈してアセトニトリル10%を含む最終濃度1.2mg/mlのインスリン グラルギンを得て、ロードサンプルとして用いた。予め充填された逆相クロマシル100−13−C8カラム(1*25cm)を用いて、インスリン グラルギンを精製した。カラムは、最初に、100mM Tris+50mM過塩素酸ナトリウム緩衝液(pH8.5±0.1)90%およびアセトニトリル10%を用い、5カラム体積で平衡化した。サンプルは、結合容量が〜4gヒトインスリン グラルギン/L樹脂のカラムにロードした。緩やかに結合したタンパク質は、100mM Tris+50mM過塩素酸ナトリウム緩衝液(pH8.5±0.1)80%およびアセトニトリル20%を用いて、4カラム体積で洗浄した。結合したタンパク質は、100mM Tris+50mM過塩素酸ナトリウム緩衝液(pH8.5±0.1)を用いて25〜29%アセトニトリルの勾配で、25カラム体積を超えて溶出した。0.25カラム体積の複数画分を280nmにおける吸光度の増加に基づいて収集した。強固に結合したタンパク質は、精製水50%およびアセトニトリル50%を用いて4カラム体積で溶出した。全ユニットの操作は、360cm/hの線流速で行った。ロードサンプル、溶出画分および溶出プールは、YMC Co. Ltd製のC18カラムを用いた分析法によって分析した。結果を下記表20に示す。
4.2mg/mlの濃度のヒトインスリン グラルギンおよび〜29%アセトニトリルを含有する逆相精製−1最終産物を、2M Trisを用いてpH8.5に調整し、精製水を用いて希釈してアセトニトリル10%を含む最終濃度1.5mg/mlのインスリン グラルギンを得て、ロードサンプルとして用いた。予め充填された逆相クロマシル100−13−C8カラム(2.1*25cm)を用いて、インスリン グラルギンを精製した。カラムは、最初に、100mM Tris+50mM過塩素酸ナトリウム緩衝液(pH8.5±0.1)90%およびアセトニトリル10%を用い、5カラム体積で平衡化した。サンプルは、結合容量が〜6gヒトインスリン グラルギン/L樹脂のカラムにロードした。緩やかに結合したタンパク質は、100mM Tris+50mM過塩素酸ナトリウム緩衝液(pH8.5±0.1)80%およびアセトニトリル20%を用いて、4カラム体積で洗浄した。結合したタンパク質は、100mM Tris+50mM過塩素酸ナトリウム緩衝液(pH8.5±0.1)を用いて25〜29%アセトニトリルの勾配で溶出した。0.25カラム体積の複数画分を280nmにおける吸光度の増加に基づいて収集した。強固に結合したタンパク質は、精製水50%およびアセトニトリル50%を用いて4カラム体積で溶出した。全ユニットの操作は、360cm/hの線流速で行った。ロードサンプル、溶出画分および溶出プールは、YMC Co. Ltd製のC18カラムを用いた分析法によって分析した。結果を下記表21に示す。
4.2mg/mlの濃度のヒトインスリン グラルギンおよび29%アセトニトリルを含有する逆相精製−1最終産物を、2M Trisを用いてpH8.5に調整し、精製水を用いて希釈してアセトニトリル10%を含む最終濃度1.5mg/mlのインスリン グラルギンを得て、ロードサンプルとして用いた。予め充填された逆相クロマシル100−13−C8カラム(2.1*25cm)を用いて、インスリン グラルギンを精製した。カラムは、最初に、100mM Tris+50mM過塩素酸ナトリウム緩衝液(pH8.5±0.1)90%およびアセトニトリル10%を用い、5カラム体積で平衡化した。サンプルは、結合容量が〜9gヒトインスリン グラルギン/L樹脂のカラムにロードした。緩やかに結合したタンパク質は、100mM Tris+50mM過塩素酸ナトリウム緩衝液(pH8.5±0.1)80%およびアセトニトリル20%を用いて、4カラム体積で洗浄した。結合したタンパク質は、100mM Tris+50mM過塩素酸ナトリウム緩衝液(pH8.5±0.1)を用いて25〜29%アセトニトリルの勾配で、25カラム体積を超えて溶出した。0.25カラム体積の複数画分を280nmにおける吸光度の増加に基づいて収集した。強固に結合したタンパク質は、精製水50%およびアセトニトリル50%を用いて4カラム体積で溶出した。全ユニットの操作は、360cm/hの線流速で行った。ロードサンプル、溶出画分および溶出プールは、YMC Co. Ltd製のC18カラムを用いた分析法によって分析した。結果を下記表22に示す。
4.5mg/mlの濃度のヒトインスリン グラルギンおよび29%アセトニトリルを含有する逆相精製−1最終産物を、2M Trisを用いてpH8.5に調整し、精製水を用いて希釈してアセトニトリル10%を含む最終濃度1.8mg/mlのインスリン グラルギンを得て、ロードサンプルとして用いた。予め充填された逆相クロマシル100−13−C8カラム(2.1*25cm)を用いて、インスリン グラルギンを精製した。カラムは、最初に、100mM Tris+50mM過塩素酸ナトリウム緩衝液(pH8.5±0.1)90%およびアセトニトリル10%を用い、5カラム体積で平衡化した。サンプルは、結合容量が〜8gヒトインスリン グラルギン/L樹脂のカラムにロードした。緩やかに結合したタンパク質は、100mM Tris+50mM過塩素酸ナトリウム緩衝液(pH8.5±0.1)80%およびアセトニトリル20%を用いて、4カラム体積で洗浄した。結合したタンパク質は、100mM Tris+50mM過塩素酸ナトリウム緩衝液(pH8.5±0.1)を用いて25〜29%アセトニトリルの勾配で、25カラム体積を超えて溶出した。0.25カラム体積の複数画分を280nmにおける吸光度の増加に基づいて収集した。強固に結合したタンパク質は、精製水50%およびアセトニトリル50%を用いて4カラム体積で溶出した。全ユニットの操作は、360cm/hの線流速で行った。ロードサンプル、溶出画分および溶出プールは、YMC Co. Ltd製のC18カラムを用いた分析法によって分析した。結果を下記表23に示す。
インスリン グラルギンについての第2の逆相精製ステップは、イオンペアリング剤過塩素酸ナトリウムを併用した高pH緩衝液を用いて、残りのグリコシル化バリアントを検出レベル未満まで減少させ、それによりロード中の>96%から溶出プール(EP)中の>99.5%まで、純度を増加させる。
低pHでの精製ステップ−1は、図1のフローチャートに示されている通りである。精製ステップ−1の詳細は以下の通りである。
定常相の詳細:
d.媒体:ダイソーパック(Daisopak) C18−200A−10pm
e.高さ:25.Oil.0cm
f.線速度:全てのクロマトグラフィーステップについて、≦360cm/h
d.移動相A:pH3.85±0.1の、400mMクエン酸三ナトリウム−クエン酸緩衝液+0.1%(w/v)オクタンスルホン酸(OSA)+50mM GuCl(塩化グアニジウム)
e.移動相B:100.0%アセトニトリル
f.精製サイクルの間の移動相AおよびBの温度:25〜30℃
e.先のステップで得られたロード濃縮物を、精製水および酢酸の混合物を用いて、≧1.0:10.0の比率で希釈した。
f.希釈後、サンプルを1.2pm、0.45pm、続いて0.22pmのフィルターでろ過した。
g.1.2pmのろ過に用いられたフィルターは、ポリプロピレン(PP)製であり、0.45/0.22pmのろ過に用いられたものは、ポリエーテルスルホン(PES)材質製であった。
h.ロード中の生成物濃度は、1.0〜2.0g/Lの範囲にあると予想された。
h.カラムは、90.0%(A):10.0%(B)の移動相を用い、≦360cm/hの線速度にて5〜10CV(カラム体積)で平衡化した。
i.カラムは、5〜7.5gリスプロ/L樹脂の容量で、≦360cm/hの線速度にてロードした。
j.ロード後、カラムは、78.0%(A):22.0%(B)の移動相を用い、≦360cm/hの線速度にて4〜5CV(カラム体積)で洗浄した。
k.生成物は、≦360cm/hの線速度にて、24〜28%Bの線形勾配を用い、20CVを超えてカラムから溶出させた。
m.溶出画分は、分析し、その純度レベルに基づいてプールし、調製した溶出プールを2〜8℃で保存した。
n.溶出後、残留タンパク質がある場合にはそれを除去するために、カラムを、≦360cm/hの線速度で、1M酢酸50.0%およびアセトニトリル50.0%を用いてアップフロー方向に2CV、続いて1M酢酸30.0%およびアセトニトリル70.0%を用いて1CVで再生した。
結果は、表27に示されるデータの通りであった。データによれば、グリコシル化タンパク質は、〜3倍、すなわちロード中の〜4%から溶出プール(EP)中の〜1.0%まで、減少した。
高pHでの精製ステップ−2は、図2のフローチャートに示されている通りである。精製ステップ−2の詳細は以下の通りである。
定常相の詳細:
a.媒体:フェノメネックス(Phenomenex) C8−100A−10pm
b.高さ:25.Oil.0cm
c.線速度:全てのクロマトグラフィーステップについて、≦360cm/h
a.移動相A:pH7.5±0.1の、100mM Tris+50mMイミダゾール+0.2%(w/v)重硫酸テトラブチルアンモニウム(TBAB)(pHは氷酢酸を用いて調整)
b.移動相B:100.0%アセトニトリル
c.精製サイクルの間の移動相AおよびBの温度:26〜30℃
a.精製ステップ−1で得られた溶出プール(EP)を、精製水を用いて1.0:2.0の比率で希釈した。
b.希釈されたサンプルのpHを、2.5M Trisを用いて7.5±0.1に調整した。
c.pH調整後、サンプルを、1.2pm、0.45pm、続いて0.22pmでろ過した。
d.1.2pmのろ過に用いられたフィルターは、ポリプロピレン(PP)製であり、0.45/0.22pmのろ過に用いられたものは、ポリエーテルスルホン(PES)材質製であった。
e.ロード中の生成物濃度は、1.0〜2.0g/Lの範囲にあると予想された。
a.カラムは、90.0%(A):10.0%(B)の移動相を用い、≦360cm/hの線速度にて5〜10CV(カラム体積)で平衡化した。
b.カラムは、5〜8.5gリスプロ/L樹脂の容量で、≦360cm/hの線速度にてロードした。
c.ロード後、カラムは、80.0%(A):20.0%(B)の移動相を用い、≦360cm/hの線速度にて4〜5CV(カラム体積)で洗浄した。
d.生成物は、≦360cm/hの線速度にて、25〜29%Bの線形勾配を用い、13CVを超えてカラムから溶出させた。
f.溶出画分は、分析し、およびその純度レベルに基づいてプールし、調製した溶出プールを2〜8℃で保存した。
g.溶出後、残留タンパク質がある場合にはそれを除去するために、カラムを、≦360cm/hの線速度にて、アップフロー方向に3CVで、精製水50.0%およびアセトニトリル50.0%を用い、続いて1M酢酸30%およびアセトニトリル70.0%を用い、再生した。
結果は、表28に示されるデータの通りであった。データによれば、グリコシル化タンパク質は、ロード中の〜0.5%から溶出プール中のBLOQまで減少した。
より完全な理解は、以下の例を参照することにより得ることができるが、これらは、例示のみを目的として提供されるものであり、本開示の範囲を限定することを意図するものではない。
ヒトインスリン リスプロを12.7mg/mlの濃度で含有する酵素反応最終産物を、氷酢酸を用いてpHを<3.5に調整し、続いて10%アセトニトリルに調整し、精製水を用いて1.16mg/mlに希釈して、ロードサンプルとして用いた。予め充填された逆相ダイソーパック200−10−C18カラム(1*25cm)を用い、インスリン リスプロを精製した。カラムは、最初に、400mMクエン酸三ナトリウム−クエン酸緩衝液+0.1%(w/v)OSA+50mM GuCl緩衝液(pH3.85±0.1)90%およびアセトニトリル10%を用い、約10カラム体積で平衡化した。サンプルは、結合容量が〜5.6gヒトインスリン リスプロ/L樹脂のカラムにロードした。緩やかに結合したタンパク質は、400mMクエン酸三ナトリウム−クエン酸緩衝液+0.1%(w/v)OSA+50mM GuCl緩衝液(pH3.85±0.1)78%およびアセトニトリル22%を用いて、約4カラム体積で洗浄した。結合したタンパク質は、400mMクエン酸三ナトリウム−クエン酸緩衝液+0.1%(w/v)OSA+50mM GuCl緩衝液(pH3.85±0.1)を用いて24〜28%アセトニトリルの勾配で、20カラム体積を超えて220cm/hの流速で溶出した。0.25カラム体積の複数画分を280nmにおける吸光度の増加に基づいて収集した。強固に結合したタンパク質は、3M酢酸70%およびアセトニトリル30%を用いて4カラム体積で溶出した。溶出相以外の全ユニットの操作は、360cm/hの線流速で行った。ロードサンプル、溶出画分および溶出プールは、Waters. Ltd製のC18カラムを用いた分析法によって分析した)。結果を表29において下記に示す。
ヒトインスリン リスプロを12.7mg/mlの濃度で含有する酵素反応最終産物を、氷酢酸を用いてpHを<3.5に調整し、続いて10%アセトニトリルに調整し、精製水を用いて1.16mg/mlに希釈して、ロードサンプルとして用いた。予め充填された逆相ダイソーパック200−10−C18カラム(1*25cm)を用い、インスリン リスプロを精製した。カラムは、最初に、400mMクエン酸三ナトリウム−クエン酸緩衝液+0.1%(w/v)OSA+50mM GuCl緩衝液(pH3.85±0.1)90%およびアセトニトリル10%を用い、約10カラム体積で平衡化した。サンプルは、結合容量が〜7.4gヒトインスリン リスプロ/L樹脂のカラムにロードした。緩やかに結合したタンパク質は、400mMクエン酸三ナトリウム−クエン酸緩衝液+0.1%(w/v)OSA+50mM GuCl緩衝液(pH3.85±0.1)78%およびアセトニトリル22%を用いて、約4カラム体積で洗浄した。結合したタンパク質は、400mMクエン酸三ナトリウム−クエン酸緩衝液+0.1%(w/v)OSA+50mM GuCl緩衝液(pH3.85±0.1)を用いて24〜28%アセトニトリルの勾配で、20カラム体積を超えて220cm/hの流速で溶出した。0.25カラム体積の複数画分を280nmにおける吸光度の増加に基づいて収集した。強固に結合したタンパク質は、3M酢酸70%およびアセトニトリル30%を用いて4カラム体積で溶出した。溶出相以外の全ユニットの操作は、360cm/hの線流速で行った。ロードサンプル、溶出画分および溶出プールは、Waters. Ltd製のC18カラムを用いた分析法によって分析した)。結果を表30において下記に示す。
ヒトインスリン リスプロを10.8mg/mlの濃度で含有する酵素反応最終産物を、氷酢酸を用いてpHを<3.5に調整し、続いて10%アセトニトリルに調整し、精製水を用いて1.42mg/mlに希釈して、ロードサンプルとして用いた。予め充填された逆相ダイソーパック200−10−C18カラム(1*25cm)を用い、インスリン リスプロを精製した。カラムは、最初に、400mMクエン酸三ナトリウム−クエン酸緩衝液+0.1%(w/v)OSA+50mM GuCl緩衝液(pH3.85±0.1)90%およびアセトニトリル10%を用い、約10カラム体積で平衡化した。サンプルは、結合容量が〜6.7gヒトインスリン リスプロ/L樹脂のカラムにロードした。緩やかに結合したタンパク質は、400mMクエン酸三ナトリウム−クエン酸緩衝液+0.1%(w/v)OSA+50mM GuCl緩衝液(pH3.85±0.1)78%およびアセトニトリル22%を用いて、約4カラム体積で洗浄した。結合したタンパク質は、400mMクエン酸三ナトリウム−クエン酸緩衝液+0.1%(w/v)OSA+50mM GuCl緩衝液(pH3.85±0.1)を用いて24〜28%アセトニトリルの勾配で、20カラム体積を超えて220cm/hの流速で溶出した。0.25カラム体積の複数画分を280nmにおける吸光度の増加に基づいて収集した。強固に結合したタンパク質は、3M酢酸70%およびアセトニトリル30%を用いて4カラム体積で溶出した。溶出相以外の全ユニットの操作は、360cm/hの線流速で行った。ロードサンプル、溶出画分および溶出プールは、Waters. Ltd製のC18カラムを用いた分析法によって分析した)。結果を表31において下記に示す。
ヒトインスリン リスプロを10.8mg/mlの濃度で含有する酵素反応最終産物を、氷酢酸を用いてpHを<3.5に調整し、続いて10%アセトニトリルに調整し、精製水を用いて1.06mg/mlに希釈して、ロードサンプルとして用いた。予め充填された逆相ダイソーパック200−10−C18カラム(1*25cm)を用い、インスリン リスプロを精製した。カラムは、最初に、400mMクエン酸三ナトリウム−クエン酸緩衝液+0.1%(w/v)OSA+50mM GuCl緩衝液(pH3.85±0.1)90%およびアセトニトリル10%を用い、約8カラム体積で平衡化した。サンプルは、結合容量が〜6.7gヒトインスリン リスプロ/L樹脂のカラムにロードした。緩やかに結合したタンパク質は、400mMクエン酸三ナトリウム−クエン酸緩衝液+0.1%(w/v)OSA+50mM GuCl緩衝液(pH3.85±0.1)78%およびアセトニトリル22%を用いて、約4カラム体積で洗浄した。結合したタンパク質は、400mMクエン酸三ナトリウム−クエン酸緩衝液+0.1%(w/v)OSA+50mM GuCl緩衝液(pH3.85±0.1)を用いて24〜28%アセトニトリルの勾配で、20カラム体積を超えて220cm/hの流速で溶出した。0.25カラム体積の複数画分を280nmにおける吸光度の増加に基づいて収集した。強固に結合したタンパク質は、3M酢酸70%およびアセトニトリル30%を用いて4カラム体積で溶出した。溶出相以外の全ユニットの操作は、360cm/hの線流速で行った。ロードサンプル、溶出画分および溶出プールは、Waters. Ltd製のC18カラムを用いた分析法によって分析した)。結果を表32において下記に示す。
実験25
2.4mg/mlの濃度のヒトインスリン リスプロおよび26.4%アセトニトリルを含有する逆相精製−1最終産物を、2M Trisを用いてpH7.5に調整し、精製水を用いて希釈してアセトニトリル10%を含む最終濃度0.82mg/mlのインスリン リスプロを得て、ロードサンプルとして用いた。予め充填された逆相フェノメネックス100−10−C8カラム(1*25cm)を用いて、インスリン リスプロを精製した。カラムは、最初に、100mM Tris+200mMイミダゾール+0.2%(w/v)TBAB緩衝液(pH7.5±0.1)90%およびアセトニトリル10%を用い、10カラム体積で平衡化した。サンプルは、結合容量が〜8gヒトインスリン リスプロ/L樹脂のカラムにロードした。緩やかに結合したタンパク質は、100mM Tris+200mMイミダゾール+0.2%(w/v)TBAB緩衝液(pH7.5±0.1)80%およびアセトニトリル20%を用いて、4カラム体積で洗浄した。結合したタンパク質は、100mM Tris+200mMイミダゾール+0.2%(w/v)TBAB緩衝液(pH7.5±0.1)を用いて24〜29%アセトニトリルの勾配で、13カラム体積を超えて溶出した。0.25カラム体積の複数画分を280nmにおける吸光度の増加に基づいて収集した。強固に結合したタンパク質は、100mM Tris+200mMイミダゾール+0.2%(w/v)TBAB緩衝液(pH7.5±0.1)50%およびアセトニトリル50%を用いて2カラム体積で溶出し、続いて3M酢酸30%およびアセトニトリル70%を用いて2カラム体積で溶出した。全ユニットの操作は、360cm/hの線流速で行った。ロードサンプル、溶出画分および溶出プールは、Waters. Ltd製のC18カラムを用いた分析法によって分析した。結果を下記表34に示す。
1.3mg/mlの濃度のヒトインスリン リスプロおよび〜26.4%アセトニトリルを含有する逆相精製−1最終産物を、2M Trisを用いてpH7.5に調整し、精製水を用いて希釈してアセトニトリル10%を含む最終濃度0.5mg/mlのインスリン リスプロを得て、ロードサンプルとして用いた。予め充填された逆相フェノメネックス100−10−C8カラム(1*25cm)を用いて、インスリン リスプロを精製した。カラムは、最初に、100mM Tris+200mMイミダゾール+0.2%(w/v)TBAB緩衝液(pH7.5±0.1)90%およびアセトニトリル10%を用い、5カラム体積で平衡化した。サンプルは、結合容量が5.6gヒトインスリン リスプロ/L樹脂のカラムにロードした。緩やかに結合したタンパク質は、100mM Tris+200mMイミダゾール+0.2%(w/v)TBAB緩衝液(pH7.5±0.1)80%およびアセトニトリル20%を用いて、4カラム体積で洗浄した。結合したタンパク質は、100mM Tris+200mMイミダゾール+0.2%(w/v)TBAB緩衝液(pH7.5±0.1)を用いて24〜29%アセトニトリルの勾配で、13カラム体積を超えて溶出した。0.25カラム体積の複数画分を280nmにおける吸光度の増加に基づいて収集した。強固に結合したタンパク質は、100mM Tris+200mMイミダゾール+0.2%(w/v)TBAB緩衝液(pH7.5±0.1)50%およびアセトニトリル50%を用いて2カラム体積で溶出し、続いて3M酢酸30%およびアセトニトリル70%を用いて2カラム体積で溶出した。全ユニットの操作は、360cm/hの線流速で行った。ロードサンプル、溶出画分および溶出プールは、Waters. Ltd製のC18カラムを用いた分析法によって分析した。結果を下記表35に示す。
高pHでの精製ステップ−1は、図1のフローチャートに示されている通りである。精製ステップ−1の詳細は以下の通りである。
定常相の詳細:
a.媒体:クロマシル C8−100A−13pm
b.高さ:25.Oil.Ocm
c.線速度:全てのクロマトグラフィーステップについて、≦360cm/h
a.移動相A:pH8.5±0.1の、100mM Tris+50mM過塩素酸ナトリウム(pHは氷酢酸を用いて調整)
b.移動相B:100.0%アセトニトリル
c.精製サイクルの間の移動相AおよびBの温度:20〜30℃
a.先のステップで得られたロード濃縮物を、0.5M Trisおよび0.7Mアルギニンの混合物を用いて、≧1.0:10.0の比率で希釈した。
b.希釈されたサンプルのpHを、酢酸を用いて8.5±0.1に調整した。
c.pH調整後、サンプルを、1.2pm、0.45pm、続いて0.22pmでろ過した。
d.1.2pmのろ過に用いられたフィルターは、ポリプロピレン(PP)製であり、0.45/0.22pmのろ過に用いられたものは、ポリエーテルスルホン(PES)材質製であった。
e.ロード中の生成物濃度は、1.0〜2.0g/Lの範囲にあると予想された。
a.カラムは、90.0%(A):10.0%(B)の移動相を用い、≦360cm/hの線速度にて5〜10CV(カラム体積)で平衡化した。
b.カラムは、9〜10gグラルギン/L樹脂の容量で、≦360cm/hの線速度にてロードした。
c.ロード後、カラムは、80.0%(A):20.0%(B)の移動相を用い、≦360cm/hの線速度にて4〜5CV(カラム体積)で洗浄した。
d.生成物は、≦360cm/hの線速度にて、25〜30%Bの線形勾配を用い、25CVを超えてカラムから溶出させた。
e.溶出の間、可変体積画分の収集は、280nmにおける吸光度(UV)の上昇に基づいて行った。収集は、UVがベースラインに低下するまで継続した。カラムからタンパク質を溶出させるのに必要な体積は2.0〜3.0CVであった。
g.溶出画分は、分析し、その純度レベルに基づいてプールし、調製した溶出プールを2〜8℃で保存した。
h.溶出後、残留タンパク質がある場合にはそれを除去するために、カラムを、精製水50.0%およびアセトニトリル50.0%を用い、≦360cm/hの線速度にてアップフロー方向に3CVで再生する。
結果は、表41に示されるデータの通りであった。データによれば、グリコシル化タンパク質は、〜9倍、すなわちロード中の〜4.0%から溶出プール中の〜0.25%まで、減少した。
低pHでの精製ステップ−2は、図2のフローチャートに示されている通りである。精製ステップ−2の詳細は以下の通りである。
定常相の詳細:
a.媒体:クロマシル C8−100A−13pm
b.高さ:25.Oil.0cm
c.線速度:全てのクロマトグラフィーステップについて、≦360cm/h
a.移動相A:pH3.7±0.1の、100mM酢酸ナトリウム+0.05%(w/v)オクタンスルホン酸(OSA)(pHは氷酢酸を用いて調整)
b.移動相B:100.0%アセトニトリル
c.精製サイクルの間の移動相AおよびBの温度:26〜30℃
a.先のステップで得られた溶出プールを、酢酸を用いてpHを3.7±0.1に調整し、精製水を用いて≧1.0:1.5の比率で希釈した。
b.希釈後、サンプルを1.2pm、0.45pm、続いて0.22pmのフィルターでろ過した。
c.1.2pmのろ過に用いられたフィルターは、ポリプロピレン(PP)製であり、0.45/0.22pmのろ過に用いられたものは、ポリエーテルスルホン(PES)材質製であった。
d.ロード中の生成物濃度は、1.0〜2.0g/Lの範囲にあると予想された。
a.カラムは、90.0%(A):10.0%(B)の移動相を用い、≦360cm/hの線速度にて10CV(カラム体積)で平衡化した。
b.カラムは、6〜7.5gグラルギン/L樹脂の容量で、≦360cm/hの線速度にてロードした。
c.ロード後、カラムは、85.0%(A):15.0%(B)の移動相を用い、≦360cm/hの線速度にて4〜5CV(カラム体積)で洗浄した。
d.生成物は、≦360cm/hの線速度にて、24〜31%Bの線形勾配を用い、25CVを超えてカラムから溶出させた。
f.溶出画分は、分析し、その純度レベルに基づいてプールし、調製した溶出プールを2〜8℃で保存した。
g.溶出後、残留タンパク質がある場合にはそれを除去するために、カラムを、≦360cm/hの線速度で、1M酢酸50.0%およびアセトニトリル50.0%を用いてアップフロー方向に2CV、続いて1M酢酸30.0%およびアセトニトリル70.0%を用いて1CVで再生した。
結果は、表42に示されるデータの通りであった。データによれば、グリコシル化タンパク質は、ロード中の〜0.3%から溶出プール中のBLOQレベルまで減少した。
実験27
10mg/mlの濃度のヒトインスリン グラルギンを含有する酵素反応最終産物を、pHを8.5に調整し、アセトニトリル10%に調整し、0.5M Tris+0.7Mアルギニンを用いて1.91mg/mlに希釈し、ロードサンプルとして用いた。予め充填された逆相クロマシル100−13−C8カラム(1*25cm)を用いて、インスリン グラルギンを精製した。カラムは、最初に、100mM Tris+50mM過塩素酸ナトリウム緩衝液(pH8.5±0.1)90%およびアセトニトリル10%を用い、10カラム体積で平衡化した。サンプルは、結合容量が〜9gヒトインスリン グラルギン/L樹脂のカラムにロードした。緩やかに結合したタンパク質は、100mM Tris+50mM過塩素酸ナトリウム緩衝液(pH8.5±0.1)80%およびアセトニトリル20%を用いて、4カラム体積で洗浄した。結合したタンパク質は、100mM Tris+50mM過塩素酸ナトリウム緩衝液(pH8.5±0.1)を用いて25〜30%アセトニトリルの勾配で溶出した。0.25カラム体積の複数画分を280nmにおける吸光度の増加に基づいて収集した。強固に結合したタンパク質は、精製水50%およびアセトニトリル50%を用いて4カラム体積で溶出した。全ユニットの操作は、360cm/hの線流速で行った。ロードサンプル、溶出画分および溶出プールは、YMC Co. Ltd製のC18カラムを用いた分析法によって分析した。結果を表43に示す。
10mg/mlの濃度のヒトインスリン グラルギンを含有する酵素反応最終産物を、pHを8.5に調整し、アセトニトリル10%に調整し、0.5M Tris+0.7Mアルギニン*を用いて1.91mg/mlに希釈し、ロードサンプルとして用いた。予め充填された逆相クロマシル100−13−C8カラム(1*25cm)を用いて、インスリン グラルギンを精製した。カラムは、最初に、100mM Tris+50mM過塩素酸ナトリウム緩衝液(pH8.5±0.1)90%およびアセトニトリル10%を用い、5カラム体積で平衡化した。サンプルは、結合容量が〜9.3gヒトインスリン グラルギン/L樹脂のカラムにロードした。緩やかに結合したタンパク質は、100mM Tris+50mM過塩素酸ナトリウム緩衝液(pH8.5±0.1)80%およびアセトニトリル20%を用いて、4カラム体積で洗浄した。結合したタンパク質は、100mM Tris+50mM過塩素酸ナトリウム緩衝液(pH8.5±0.1)を用いて25〜30%アセトニトリルの勾配で溶出した。0.25カラム体積の複数画分を280nmにおける吸光度の増加に基づいて収集した。強固に結合したタンパク質は、精製水50%およびアセトニトリル50%を用いて4カラム体積で溶出した。全ユニットの操作は、360cm/hの線流速で行った。ロードサンプル、溶出画分および溶出プールは、YMC Co. Ltd製のC18カラムを用いた分析法によって分析した。結果を表44に示す。
10mg/mlの濃度のヒトインスリン グラルギンを含有する酵素反応最終産物を、pHを8.5に調整し、アセトニトリル10%に調整し、0.5M Tris+0.7Mアルギニン*を用いて1.91mg/mlに希釈し、ロードサンプルとして用いた。予め充填された逆相クロマシル100−13−C8カラム(2.1*25cm)を用いて、インスリン グラルギンを精製した。カラムは、最初に、100mM Tris+50mM過塩素酸ナトリウム緩衝液(pH8.5±0.1)90%およびアセトニトリル10%を用い、5カラム体積で平衡化した。サンプルは、結合容量が〜9.75gヒトインスリン グラルギン/L樹脂のカラムにロードした。緩やかに結合したタンパク質は、100mM Tris+50mM過塩素酸ナトリウム緩衝液(pH8.5±0.1)80%およびアセトニトリル20%を用いて、4カラム体積で洗浄した。結合したタンパク質は、100mM Tris+50mM過塩素酸ナトリウム緩衝液(pH8.5±0.1)を用いて25〜30%アセトニトリルの勾配で溶出した。0.25カラム体積の複数画分を280nmにおける吸光度の増加に基づいて収集した。強固に結合したタンパク質は、精製水50%およびアセトニトリル50%を用いて4カラム体積で溶出した。全ユニットの操作は、360cm/hの線流速で行った。ロードサンプル、溶出画分および溶出プールは、YMC Co. Ltd製のC18カラムを用いた分析法によって分析した。結果を表45に示す。
残りのグリコシル化不純物は、低pHを採用する第2の逆相精製ステップを用いて取り除かれ、インスリン グラルギンの純度は>99.5%に増加する。
実験30
5.06mg/mlの濃度のヒトインスリン グラルギンおよび28.8%アセトニトリルを含有する逆相精製−1最終産物を、酢酸を用いてpH3.7に調整し、精製水を用いて希釈してアセトニトリル10%を含む最終濃度〜1.69mg/mlのインスリン グラルギンを得て、ロードサンプルとして用いた。予め充填された逆相クロマシル100−13−C8カラム(1*25cm)を使用し、インスリン グラルギンを精製した。カラムは、最初に、100mM酢酸ナトリウム+0.05%OSA緩衝液(pH3.7±0.1)90%およびアセトニトリル10%を用い、約10カラム体積で平衡化した。サンプルは、結合容量が〜6.9gヒトインスリン グラルギン/L樹脂のカラムにロードした。緩やかに結合したタンパク質は、100mM酢酸ナトリウム+0.05%OSA緩衝液(pH3.7±0.1)85%およびアセトニトリル15%を用いて、約4カラム体積で洗浄した。結合したタンパク質は、100mM酢酸ナトリウム+0.05%OSA緩衝液(pH3.7±0.1)を用いて24〜31%アセトニトリルの勾配で溶出した。0.25カラム体積の複数画分を280nmにおける吸光度の増加に基づいて収集した。強固に結合したタンパク質は、1M酢酸50%およびアセトニトリル50%を用いて2カラム体積で溶出し、続いて1M酢酸30%およびアセトニトリル70%を用いて1カラム体積で溶出した。全ユニットの操作は、360cm/hの線流速で行った。ロードサンプル、溶出画分および溶出プールは、YMC Co. Ltd製のC18カラムを用いた分析法によって分析した。結果を表47において下記に示す。
5.49mg/mlの濃度のヒトインスリン グラルギンおよび28.8%アセトニトリルを含有する逆相精製−1最終産物を、酢酸を用いてpH3.7に調整し、精製水を用いて希釈してアセトニトリル10%を含む最終濃度1.96mg/mlのインスリン グラルギンを得て、ロードサンプルとして用いた。予め充填された逆相クロマシル100−13−C8カラム(1*25cm)を使用し、インスリン グラルギンを精製した。カラムは、最初に、100mM酢酸ナトリウム+0.05%OSA緩衝液(pH3.7±0.1)90%およびアセトニトリル10%を用い、約10カラム体積で平衡化した。サンプルは、結合容量が〜7.0gヒトインスリン グラルギン/L樹脂のカラムにロードした。緩やかに結合したタンパク質は、100mM酢酸ナトリウム+0.05%OSA緩衝液(pH3.7±0.1)85%およびアセトニトリル15%を用いて、約4カラム体積で洗浄した。結合したタンパク質は、100mM酢酸ナトリウム+0.05%OSA緩衝液(pH3.7±0.1)を用いて24〜31%アセトニトリルの勾配で溶出した。0.25カラム体積の複数画分を280nmにおける吸光度の増加に基づいて収集した。強固に結合したタンパク質は、1M酢酸50%およびアセトニトリル50%を用いて2カラム体積で溶出し、続いて1M酢酸30%およびアセトニトリル70%を用いて1カラム体積で溶出した。全ユニットの操作は、360cm/hの線流速で行った。ロードサンプル、溶出画分および溶出プールは、YMC Co. Ltd製のC18カラムを用いた分析法によって分析した。結果を表48において下記に示す。
〜4.3mg/mlの濃度のヒトインスリン グラルギンおよび28.6%アセトニトリルを含有する逆相精製−1最終産物を、酢酸を用いてpH3.7に調整し、精製水を用いて希釈してアセトニトリル10%を含む最終濃度〜1.5mg/mlのインスリン グラルギンを得て、ロードサンプルとして用いた。予め充填された逆相クロマシル100−13−C8カラム(1*25cm)を使用し、インスリン グラルギンを精製した。カラムは、最初に、100mM酢酸ナトリウム+0.05%OSA緩衝液(pH3.7±0.1)90%およびアセトニトリル10%を用い、約5カラム体積で平衡化した。サンプルは、結合容量が〜7.5gヒトインスリン グラルギン/L樹脂のカラムにロードした。緩やかに結合したタンパク質は、100mM酢酸ナトリウム+0.05%OSA緩衝液(pH3.7±0.1)85%およびアセトニトリル15%を用いて、約4カラム体積で洗浄した。結合したタンパク質は、100mM酢酸ナトリウム+0.05%OSA緩衝液(pH3.7±0.1)を用いて24〜31%アセトニトリルの勾配で溶出した。0.25カラム体積の複数画分を280nmにおける吸光度の増加に基づいて収集した。強固に結合したタンパク質は、1M酢酸50%およびアセトニトリル50%を用いて2カラム体積で溶出し、続いて1M酢酸30%およびアセトニトリル70%を用いて1カラム体積で溶出した。全ユニットの操作は、360cm/hの線流速で行った。ロードサンプル、溶出画分および溶出プールは、YMC Co. Ltd製のC18カラムを用いた分析法によって分析した。結果を表49において下記に示す。
高pHでの精製ステップ−1は、図1のフローチャートに示されている通りである。精製ステップ−1の詳細は以下の通りである。
定常相の詳細:
a.媒体:ダイソーパック C18−200A−10pm
b.高さ:25.Oil.0cm
c.線速度:全てのクロマトグラフィーステップについて、≦360cm/h
a.移動相A:pH7.5±0.1の、100mM Tris+200mMイミダゾール+0.2%(w/v)重硫酸テトラブチルアンモニウム(TBAB)(pHは氷酢酸を用いて調整)
b.移動相B:100.0%アセトニトリル
c.精製サイクルの間の移動相AおよびBの温度:20〜30℃
a.先のステップで得られたロード濃縮物を、pHを7.5±0.1に調整し、精製水を用いて≧1.0:10.0の比率で希釈した。
b.サンプルを、1.2pm、0.45pm、続いて0.22pmでろ過した。
c.1.2pmのろ過に用いられたフィルターは、ポリプロピレン(PP)製であり、0.45/0.22pmのろ過に用いられたものは、ポリエーテルスルホン(PES)材質製であった。
d.ロード中の生成物濃度は、1.0〜2.0g/Lの範囲にあると予想された。
a.カラムは、90.0%(A):10.0%(B)の移動相を用い、≦360cm/hの線速度にて5〜10CV(カラム体積)で平衡化した。
b.カラムは、9〜10gリスプロ/L樹脂の容量で、≦360cm/hの線速度にてロードした。
c.ロード後、カラムは、80.0%(A):15.0%(B)の移動相を用い、≦360cm/hの線速度にて4〜5CV(カラム体積)で洗浄した。
d.生成物は、≦360cm/hの線速度にて、24〜29%Bの線形勾配を用い、13CVを超えてカラムから溶出させた。
f.溶出画分は、分析し、およびその純度レベルに基づいてプールし、調製した溶出プールを2〜8℃で保存した。
g.溶出後、残留タンパク質がある場合にはそれを除去するために、カラムを、≦360cm/hの線速度にて、アップフロー方向に2CVで、移動相A50.0%およびアセトニトリル50.0%を用い、続いて3M酢酸30%およびアセトニトリル70.0%を用い、再生した。
結果は、表53に示されるデータの通りであった。データによれば、グリコシル化タンパク質は、〜3倍、すなわちロード中の〜4.0%から溶出プール中の〜1.0%まで、減少した。
低pHでの精製ステップ−2は、図2のフローチャートに示されている通りである。精製ステップ−2の詳細は以下の通りである。
定常相の詳細:
a.媒体:ダイソーパック C18−200A−10pm
b.高さ:25.Oil.0cm
c.線速度:全てのクロマトグラフィーステップについて、≦360cm/h
a.移動相A:pH3.85±0.1の、400mMクエン酸三ナトリウム−クエン酸緩衝液+0.1%(w/v)オクタンスルホン酸(OSA)+50mM GuCl
b.移動相B:100.0%アセトニトリル
c.精製サイクルの間の移動相AおよびBの温度:26〜30℃
a.先のステップで得られた溶出プールを、氷酢酸を用いてpHを4.0±0.1に調整し、精製水を用いて、≧1.0:1.5の比率で希釈した。
b.希釈後、サンプルを1.2pm、0.45pm、続いて0.22pmのフィルターでろ過した。
c.1.2pmのろ過に用いられたフィルターは、ポリプロピレン(PP)製であり、0.45/0.22pmのろ過に用いられたものは、ポリエーテルスルホン(PES)材質製であった。
d.ロード中の生成物濃度は、0.8〜1.0g/Lの範囲にあると予想された。
a.カラムは、90.0%(A):10.0%(B)の移動相を用い、≦360cm/hの線速度にて5〜10CV(カラム体積)で平衡化した。
b.カラムは、7〜8gリスプロ/L樹脂の容量で、≦360cm/hの線速度にてロードした。
c.ロード後、カラムは、78.0%(A):22.0%(B)の移動相を用い、≦360cm/hの線速度にて4〜5CV(カラム体積)で洗浄した。
d.生成物は、≦220cm/hの線速度にて、24〜28%Bの線形勾配を用い、20CVを超えてカラムから溶出させた。
f.溶出画分は、分析し、その純度レベルに基づいてプールし、調製した溶出プールを2〜8℃で保存した。
g.溶出後、残留タンパク質がある場合にはそれを除去するために、カラムを、≦360cm/hの線速度で、アップフロー方向に1M酢酸70.0%およびアセトニトリル30.0%を用いて4CVで再生した。
結果は、表54に示されるデータの通りであった。データによれば、グリコシル化タンパク質は、ロード中の〜0.3%から溶出プール中のBLOQレベルまで減少した。
実験33
ヒトインスリン リスプロを13mg/mlの濃度で含有する酵素反応最終産物を、pHを7.5に調整し、および10%アセトニトリルに調整し、続いて精製水を用いて1.45mg/mlに希釈して、ロードサンプルとして用いた。予め充填された逆相ダイソーパック200−10−C18カラム(2*25cm)を用い、インスリン リスプロを精製した。カラムは、最初に、100mM Tris+200mMイミダゾール+0.2%(w/v)TBAB緩衝液(pH7.5±0.1)90%およびアセトニトリル10%を用い、10カラム体積で平衡化した。サンプルは、結合容量が〜7.3gヒトインスリン リスプロ/L樹脂のカラムにロードした。緩やかに結合したタンパク質は、100mM Tris+200mMイミダゾール+0.2%(w/v)TBAB緩衝液(pH7.5±0.1)75%およびアセトニトリル15%を用いて、4カラム体積で洗浄した。結合したタンパク質は、100mM Tris+200mMイミダゾール+0.2%(w/v)TBAB緩衝液(pH7.5±0.1)を用いて24〜29%アセトニトリルの勾配で、13カラム体積を超えて溶出した。0.25カラム体積の複数画分を280nmにおける吸光度の増加に基づいて収集した。強固に結合したタンパク質は、100mM Tris+200mMイミダゾール+0.2%(w/v)TBAB緩衝液(pH7.5±0.1)50%およびアセトニトリル50%を用いて2カラム体積で、続いて3M酢酸30%およびアセトニトリル70%を用いて2カラム容積で、溶出した。全ユニットの操作は、360cm/hの線流速で行った。ロードサンプル、溶出画分および溶出プールは、Waters. Ltd製のC18カラムを用いた分析法によって分析した。結果を表55に示す。
ヒトインスリン リスプロを13mg/mlの濃度で含有する酵素反応最終産物を、pHを7.5に調整し、および10%アセトニトリルに調整し、続いて精製水を用いて1.45mg/mlに希釈して、ロードサンプルとして用いた。予め充填された逆相ダイソーパック200−10−C18カラム(2*25cm)を用い、インスリン リスプロを精製した。カラムは、最初に、100mM Tris+200mMイミダゾール+0.2%(w/v)TBAB緩衝液(pH7.5±0.1)90%およびアセトニトリル10%を用い、5カラム体積で平衡化した。サンプルは、結合容量が〜7.3gヒトインスリン リスプロ/L樹脂のカラムにロードした。緩やかに結合したタンパク質は、100mM Tris+200mMイミダゾール+0.2%(w/v)TBAB緩衝液(pH7.5±0.1)75%およびアセトニトリル15%を用いて、4カラム体積で洗浄した。結合したタンパク質は、100mM Tris+200mMイミダゾール+0.2%(w/v)TBAB緩衝液(pH7.5±0.1)を用いて24〜29%アセトニトリルの勾配で、13カラム体積を超えて溶出した。0.25カラム体積の複数画分を280nmにおける吸光度の増加に基づいて収集した。強固に結合したタンパク質は、100mM Tris+200mMイミダゾール+0.2%(w/v)TBAB緩衝液(pH7.5±0.1)50%およびアセトニトリル50%を用いて2カラム体積で、続いて3M酢酸30%およびアセトニトリル70%を用いて2カラム容積で、溶出した。全ユニットの操作は、360cm/hの線流速で行った。ロードサンプル、溶出画分および溶出プールは、Waters. Ltd製のC18カラムを用いた分析法によって分析した。結果を表56に示す。
ヒトインスリン リスプロを13mg/mlの濃度で含有する酵素反応最終産物を、pHを7.5に調整し、および10%アセトニトリルに調整し、続いて精製水を用いて1.45mg/mlに希釈して、ロードサンプルとして用いた。予め充填された逆相ダイソーパック200−10−C18カラム(2*25cm)を用い、インスリン リスプロを精製した。カラムは、最初に、100mM Tris+200mMイミダゾール+0.2%(w/v)TBAB緩衝液(pH7.5±0.1)90%およびアセトニトリル10%を用い、5カラム体積で平衡化した。サンプルは、結合容量が〜7.3gヒトインスリン リスプロ/L樹脂のカラムにロードした。緩やかに結合したタンパク質は、100mM Tris+200mMイミダゾール+0.2%(w/v)TBAB緩衝液(pH7.5±0.1)75%およびアセトニトリル15%を用いて、4カラム体積で洗浄した。結合したタンパク質は、100mM Tris+200mMイミダゾール+0.2%(w/v)TBAB緩衝液(pH7.5±0.1)を用いて24〜29%アセトニトリルの勾配で、13カラム体積を超えて溶出した。0.25カラム体積の複数画分を280nmにおける吸光度の増加に基づいて収集した。強固に結合したタンパク質は、100mM Tris+200mMイミダゾール+0.2%(w/v)TBAB緩衝液(pH7.5±0.1)50%およびアセトニトリル50%を用いて2カラム体積で、続いて3M酢酸30%およびアセトニトリル70%を用いて2カラム容積で、溶出した。全ユニットの操作は、360cm/hの線流速で行った。ロードサンプル、溶出画分および溶出プールは、Waters. Ltd製のC18カラムを用いた分析法によって分析した。結果を表57に示す。
残りのグリコシル化不純物は、低pHを採用する第2の逆相精製ステップを用いて取り除かれ、インスリン リスプロの純度は>95%に増加する。
実験36
Gmg/mlの濃度のヒトインスリン グラルギンおよび28.3%アセトニトリルを含有する逆相精製−1最終産物を、酢酸を用いてpH4.0に調整し、精製水を用いて希釈してアセトニトリル10%を含む最終濃度1.06mg/mlのインスリン リスプロを得て、ロードサンプルとして用いた。予め充填された逆相ダイソーパック200−10−C8カラム(1*25cm)を用いて、インスリン リスプロを精製した。カラムは、最初に、400mMクエン酸三ナトリウム−クエン酸緩衝液+0.1%(w/v)OSA+50mM GuCl(pH3.85±0.1)90%およびアセトニトリル10%を用い、約10カラム体積で平衡化した。サンプルは、結合容量が〜7.5gヒトインスリン リスプロ/L樹脂のカラムにロードした。緩やかに結合したタンパク質は、400mMクエン酸三ナトリウム−クエン酸緩衝液+0.1%(w/v)OSA+50mM GuCl(pH3.85±0.1)78%およびアセトニトリル22%を用いて、約4カラム体積で洗浄した。結合したタンパク質は、400mMクエン酸三ナトリウム−クエン酸緩衝液+0.1%(w/v)OSA+50mM GuCl(pH3.85±0.1)を用いて24〜28%アセトニトリルの勾配で、20カラム体積を超えて220cm/hの線流速で溶出した。0.25カラム体積の複数画分を280nmにおける吸光度の増加に基づいて収集した。強固に結合したタンパク質は、1M酢酸30%およびアセトニトリル70%を用いて4カラム体積で溶出した。溶出以外の全ユニットの操作は、360cm/hの線流速で行った。ロードサンプル、溶出画分および溶出プールは、Waters. Ltd製のC18カラムを用いた分析法によって分析した。結果を表59において下記に示す。
〜3mg/mlの濃度のヒトインスリン リスプロおよび28.8%アセトニトリルを含有する逆相精製−1最終産物を、酢酸を用いてpH4.0に調整し、精製水を用いて希釈してアセトニトリル10%を含む最終濃度1.06mg/mlのインスリン リスプロを得て、ロードサンプルとして用いた。予め充填された逆相ダイソーパック200−10−C8カラム(1*25cm)を用いて、インスリン リスプロを精製した。カラムは、最初に、400mMクエン酸三ナトリウム−クエン酸緩衝液+0.1%(w/v)OSA+50mM GuCl(pH3.85±0.1)90%およびアセトニトリル10%を用い、約10カラム体積で平衡化した。サンプルは、結合容量が〜7.2gヒトインスリン リスプロ/L樹脂のカラムにロードした。緩やかに結合したタンパク質は、400mMクエン酸三ナトリウム−クエン酸緩衝液+0.1%(w/v)OSA+50mM GuCl(pH3.85±0.1)78%およびアセトニトリル22%を用いて、約4カラム体積で洗浄した。結合したタンパク質は、400mMクエン酸三ナトリウム−クエン酸緩衝液+0.1%(w/v)OSA+50mM GuCl(pH3.85±0.1)を用いて24〜28%アセトニトリルの勾配で、20カラム体積を超えて220cm/hの線流速で溶出した。0.25カラム体積の複数画分を280nmにおける吸光度の増加に基づいて収集した。強固に結合したタンパク質は、1M酢酸30%およびアセトニトリル70%を用いて4カラム体積で溶出した。溶出以外の全ユニットの操作は、360cm/hの線流速で行った。ロードサンプル、溶出画分および溶出プールは、Waters. Ltd製のC18カラムを用いた分析法によって分析した。結果を表60において下記に示す。
〜2.3mg/mlの濃度のヒトインスリン リスプロおよび28.6%アセトニトリルを含有する逆相精製−1最終産物を、酢酸を用いてpH4.0に調整し、精製水を用いて希釈してアセトニトリル10%を含む最終濃度〜0.83mg/mlのインスリン リスプロを得て、ロードサンプルとして用いた。予め充填された逆相ダイソーパック200−10−C8カラム(1*25cm)を用いて、インスリン リスプロを精製した。カラムは、最初に、400mMクエン酸三ナトリウム−クエン酸緩衝液+0.1%(w/v)OSA+50mM GuCl(pH3.85±0.1)90%およびアセトニトリル10%を用い、約5カラム体積で平衡化した。サンプルは、結合容量が〜8.0gヒトインスリン リスプロ/L樹脂のカラムにロードした。緩やかに結合したタンパク質は、400mMクエン酸三ナトリウム−クエン酸緩衝液+0.1%(w/v)OSA+50mM GuCl(pH3.85±0.1)78%およびアセトニトリル22%を用いて、約4カラム体積で洗浄した。結合したタンパク質は、400mMクエン酸三ナトリウム−クエン酸緩衝液+0.1%(w/v)OSA+50mM GuCl(pH3.85±0.1)を用いて24〜28%アセトニトリルの勾配で、20カラム体積を超えて220cm/hの線流速で溶出した。0.25カラム体積の複数画分を280nmにおける吸光度の増加に基づいて収集した。強固に結合したタンパク質は、1M酢酸30%およびアセトニトリル70%を用いて4カラム体積で溶出した。溶出以外の全ユニットの操作は、360cm/hの線流速で行った。ロードサンプル、溶出画分および溶出プールは、Waters. Ltd製のC18カラムを用いた分析法によって分析した。結果を表61において下記に示す。
例において詳細に示した通り、本発明は、一方のステップでイオンペアリング剤、好ましくはOSAを、他方のステップでのアルカリpHベースの溶離液と併せて採用することによる、グリコシル化アナログからの非グリコシル化インスリンアナログの分離のための2ステップ精製プロセスに関し、グリコシル化型インスリンアナログの約99.95%除去を達成する。
Claims (12)
- 非グリコシル化インスリンアナログおよびグリコシル化インスリンアナログの両方を含む複合混合物からの、非グリコシル化インスリンアナログの精製のためのプロセスであって、前記精製プロセスは:
a)酸性pHにおいて、アセトニトリルなどの有機修飾剤と組み合わせたイオンペアリング剤の存在下、前記複合混合物を用いてRP−HPLCを行い、部分的に精製された非グリコシル化インスリンアナログを含む第1の混合物を生じるステップ;および
b)アルカリ性pHにおいて、アセトニトリルなどの有機修飾剤と組み合わせたイオンペアリング剤の存在下、第1の混合物についてRP−HPLCを行い、少なくとも99.95%精製された非グリコシル化インスリンアナログを得るステップ、
または;
a)アルカリ性pHにおいて、アセトニトリルなどの有機修飾剤と組み合わせたイオンペアリング剤の存在下、第1の混合物についてRP−HPLCを行い、部分的に精製された非グリコシル化インスリンアナログを含む第1の混合物を生じるステップ;および
b)酸性pHにおいて、アセトニトリルなどの有機修飾剤と組み合わせたイオンペアリング剤の存在下、前記第1の混合物を用いてRP−HPLCを行い、少なくとも99.95%精製された非グリコシル化インスリンアナログを得るステップ、
を含む、前記プロセス。 - インスリンアナログが、インスリン グラルギンおよびインスリン リスプロからなる群から選択される、請求項1に記載のプロセス。
- 請求項1に記載のプロセスであって、低pHベースのRP−HPLCにより得られる部分的に精製された非グリコシル化インスリンアナログを含む第1の混合物が、以下のステップ:
a)RP−HPLCカラムをシリカベースの樹脂、好ましくはC8で充填するステップ;
b)4〜12g/Lの容量のカラムにロードするステップ;
c)有機修飾剤、好ましくはアセトニトリルと組み合わせた、イオンペアリング剤、好ましくはオクタンスルホン酸(OSA)を用いて、3.5〜3.9の範囲の酸性pHで、カラムを洗浄するステップ;および
d)部分的に精製された非グリコシル化インスリンアナログの第1の混合物を溶出させるために、24%〜31%の線形勾配を行うステップ、
を含む、前記プロセス。 - 請求項1に記載のプロセスであって、低pHベースのRP−HPLCステップに続く高pHベースのRP−HPLCにより得られる、少なくとも99.95%精製された非グリコシル化インスリンアナログが、以下のステップ:
a)RP−HPLCカラムをシリカベースの樹脂、好ましくはC8で充填するステップ;
b)第1の混合物を、4〜12g/Lの容量のカラムにロードするステップ;
c)アセトニトリルと組み合わせた、イオンペアリング剤を用いて、8.3〜8.7の範囲のアルカリ性pHで、カラムを洗浄するステップ;および
d)少なくとも99.95%精製された非グリコシル化インスリンアナログを溶出させるために、25%〜29%の線形勾配を行うステップ、
を含む、前記プロセス。 - 請求項1に記載のプロセスであって、部分的に精製された非グリコシル化インスリンアナログを含む第1の混合物が、以下のステップ:
a)RP−HPLCカラムをシリカベースの樹脂、好ましくはC8で充填するステップ;
b)第1の混合物を、4〜12g/Lの容量のカラムにロードするステップ;
c)アセトニトリルを組み合わせた、イオンペアリング剤を用いて、7.3〜8.7の範囲のアルカリ性pHで、カラムを洗浄するステップ;および
d)部分的に精製された非グリコシル化インスリンアナログの第1の混合物を溶出させるために、25%〜29%の線形勾配を行うステップ、
を含む高pHベースのRP−HPLCにより得られる、前記プロセス。 - 請求項1に記載のプロセスであって、高pHベースのRP−HPLCステップに続く低pHベースのRP−HPLCにより得られる、少なくとも99.95%精製されたインスリンアナログが、以下のステップ:
a)RP−HPLCカラムをシリカベースの樹脂、好ましくはC8で充填するステップ;
b)4〜12g/Lの容量のカラムにロードするステップ;
c)有機修飾剤、好ましくはアセトニトリルと組み合わせた、イオンペアリング剤、好ましくはオクタンスルホン酸(OSA)を用いて、3.5〜3.9の範囲の酸性pHで、カラムを洗浄するステップ;および
d)少なくとも99.95%精製された非グリコシル化インスリンアナログを溶出させるために、24%〜31%の線形勾配を行うステップ、
を含む、前記プロセス。 - イオンペアリング剤が、オクタンスルホン酸(OSA)のナトリウム塩、過塩素酸ナトリウム、および重硫酸テトラブチルアンモニウム(TBAB)からなる群から選択される、請求項1に記載のプロセス。
- インスリンアナログがインスリン グラルギンである場合には、イオンペアリング剤が過塩素酸ナトリウムであり、およびインスリンアナログがインスリン リスプロである場合には、イオンペアリング剤がTBABである、請求項4または5に記載のプロセス。
- インスリンアナログが、インスリン グラルギンのグリコシル化バリアントを0.05%未満含むインスリン グラルギンである、請求項1に記載のプロセス。
- インスリンアナログが、インスリン リスプロのグリコシル化バリアントを0.05%未満含むインスリン リスプロである、請求項1に記載のプロセス。
- インスリン グラルギンのグリコシル化バリアントが少なくとも99.95%含まれていない、非グリコシル化インスリン グラルギン。
- インスリン リスプロのグリコシル化バリアントが少なくとも99.95%含まれていない、非グリコシル化インスリン リスプロ。
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