HRP20040551A2

HRP20040551A2 - Insulin molecule having protracted time action

Info

Publication number: HRP20040551A2
Application number: HR20040551A
Authority: HR
Inventors: John Michael Beals; Michael Rosario Defelippis; Richard Dennis Dimarchi; Wayne David Kohn; Radmila Micanovic; Sharon Ruth Myers; Kongman Ng; Lianshan Zhang
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 2001-12-20
Filing date: 2004-06-16
Publication date: 2004-10-31
Also published as: US20050014679A1; CO5590884A2; IL161848A0; JP2005519041A; BR0215029A; WO2003053339A3; EP1545460A4; MXPA04006084A; HUP0700126A2; NO20042172L; EP1545460A2; CA2468100A1; WO2003053339A2; SK2432004A3; AU2002346490A1; PL374949A1; KR20040070237A; CZ2004710A3

Description

Ova prijava zahtijeva prioritet od US privremene prijave br. 60/344.310, podnesenu 20. prosinca 2001., i br. 60/414.604, podnesenu 27. rujna 2002., koje su u cijelosti pripojene prema referenci.

Područje izuma

Ovaj izum se odnosi na molekule inzulina koje su korisne kod liječenja hiperglikemije koja je katrakteristična za diabetes mellitus.

Pozadina izuma

Fiziološka potreba za inzulinom može se podijeliti u dvije faze: (a) faza apsorpcije nutrienata koja zahtjeva inzulin za rješavanje porasta glukoze u krvi, i (b) post-apsorpcijska faza, koja zahtjeva održivu dostavu inzulina za regulaciju glukoze u jetri za održavanje optimalne, održive količine glukoze u krvi, također poznata i kao "bazalna" sekrecija inzulina.

Učinkovita inzulinska terapija za ljude s dijabetesom uključuje, općenito, kombiniranu uporabu dvaju tipova egzogenih formulacija inzulina: inzulina brzog djelovanja za vrijeme jela koji se unosi preko bolus-a, i inzulina dužeg djelovanja, koji se injektira jednom ili dva puta dnevno, kako bi se kontrolirala razina glukoze u krvi između obroka.

Idealni egzogeni bazalni inzulin osiguravao bi produženo i kratko vrijeme djelovanja - to bi omogućilo kontrolu razine glukoze u krvi najmanje 12 sati, a po mogućnosti i 24 sata bez značajnijeg rizika hipoglikemije.

Komercijalna uporaba molekule inzulina dužeg djelovanja ne osigurava djelovanje inzulina tijekom 24 sata. Prema tome, ostaje potreba za molekulom inzulina koja omogućuje djelovanje inzulina tijekom 24 sata.

Bit izuma

Ovaj izum se odnosi na molekulu inzulina koja sadrži

(a) A-lanac prikazan formulom I,

[image]

gdje je slijed aminokiselina, prikazan formulom I, uključen dalje u slijed ID br. I, i

(a) B-lanac prikazan formulom II,

[image]

gdje je slijed aminokiselina, prikazan formulom II, uključen dalje u slijed ID br. II, i gdje je

Xaa na položaju A-1 je Arg, derivatizirani Arg, homoarginin, dezamino homoarginin, dezaminoarginin, Lys, derivatizirani Lys, dezaminolizin, alfa gvanidino homoarginin, alfa metil arginin, ili je odsutan;

Xaa na položaju A0 je Arg, derivatizirani Arg, homoarginin, dezamino homoarginin, dezaminoarginin, Lys, derivatizirani Lys, dezaminolizin, alfa gvanidino homoarginin ili alfa metil arginin;

Xaa na položaju A21 je genetski kodirana aminokiselina;

Xaa na položaju B-1 je Arg, derivatizirani Arg, homoarginin, dezamino homoarginin, dezaminoarginin, Lys, derivatizirani Lys, dezaminolizin, alfa gvanidino homoarginin, alfa metil arginin, ili je odsutan;

Xaa na položaju B0 je Arg, derivatizirani Arg, homoarginin, dezamino homoarginin, dezaminoarginin, Lys, derivatizirani Lys, dezaminolizin, alfa gvanidino homoarginin, alfa metil arginin, ili je odsutan;

Xaa na položaju B28 je Lys ili Pro;

Xaa na položaju B29 je Lys ili Pro;

Xaa na položaju B30 je Thr, Ala ili je odsutan;

jedan od Xaa na položaju B28 ili Xaa na položaju B29 je Lys;

Xaa na položaju B28 i Xaa na položaju B29 nisu oba Lys; a

ε-amino skupina na položaju B28 ili B29 je kovalentno vezana na α-karboksilnu grupu pozitivno nabijene aminokiseline u obliku Lys-Nε-aminokiselinskog derivata.

Ovaj izum sadrži, također, i postupak liječenja diabetes mellitus-a, postupak koja obuhvaća upravljanje molekulom inzulina prema ovom izumu u količini dostatnoj da regulira sadržaj glukoze u krvi.

Ovaj izum govori, također, i o mikrokristalima koji sadržavaju molekulu inzulina prema ovom izumu, o postupku stvaranja mikrokristala, i postupku liječenja dijabetesa davanjem mikrokristala.

Ovaj izum govori, također, i o suspenziji koja sadrži netopljivu fazu i fazu otopine. Netopljiva faza sadrži mikrokristale prema ovom izumu, a faza otopine sadrži vodu. Ovaj izum govori također i o pripremanju suspenzije.

Ovaj izum sadrži, također, i postupak liječenja diabetes mellitus-a, postupak upravljanja suspenzijom prema ovom izumu i to u količini dostatnoj da regulira sadržaj glukoze u krvi.

Ovaj izum govori, također, i o pripremanju suspenzija. Ovaj izum sadrži, također, i postupak liječenja diabetes mellitus-a, postupak koja obuhvaća upravljanje suspenzijom prema ovom izumu u količini dostatnoj da regulira sadržaj glukoze u krvi.

Ovaj izum govori, također, i o postupku pripremanja molekule inzulina koja sadrži: (a) alkiliranje svake slobodne aminokiseline prema šabloni inzulina sa zaštićenim aminokiselinama ili aminokielinskim derivatima kako bi se oblikovala alkilirana molekula inzulina; (b) čišćenje alkilirane molekule inzulina; (c) uklanjanje zaštitnih skupina sa svake zaštićene aminokiseline ili zaštićenog aminokiselinskog derivata kako bi se oblikovala nezaštićena alkilirana molekula inzulina; i (d) čišćenje nezaštićene alkilirane molekule inzulina. Jedan od preferirajućih oblika je da je zaštićena aminokiselina zaštićeni Arg, a aminokiselina je Arg. Drugi preferirajući oblik je da je zaštićena aminokiselina zaštićeni Lys, a aminokiselina je Lys.

Kratak opis slika

Slika 1 ocrtava Lys-Nε-Arg derivat dobiven stvaranjem kovalentne veze između ε-amino skupine od Lys i α-karboksilne skupine od Arg.

Detaljan opis izuma

U jednom od preferirajućih oblika, ovaj izum uključuje molekulu inzulina s preinakama na jednom ili više N-kraja A-lanca inzulina, C-kraja A-lanca inzulina, N-kraja B-lanca inzulina, i B-lanca lizina.

U drugom preferirajućem obliku, molekula inzulina prema ovom izumu uključuje preinake N-kraja A-lanca inzulina, modifikacije N-kraja B-lanca inzulina, modifikacije B-lanca lizina i slobodno po izboru modifikaciju C-kraja A-lanca. Na primjer, takva molekula inzulina je ona gdje je Arg kovalentno spojen na N-kraj A-lanca, Arg je kovalentno vezan na N-kraj B-lanca, B-lanac Lys je preinačen, a po slobodnom izboru C-kraj aminokiseline A-lanca nadomješten je drugom aminokiselinom, kao što je Gly.

U drugom preferirajućem obliku, molekula inzulina prema ovom izumu uključuje preinake N-kraja A-lanca inzulina, modifikacije B-lanca lizina i slobodno po izboru modifikaciju C-kraja A-lanca. Na primjer, takva molekula inzulina je ona gdje je Arg kovalentno spojen na N-kraj A-lanca, Arg je kovalentno vezan na N-kraj B-lanca, B-lanac Lys je preinačen, a po slobodnom izboru C-kraj aminokiseline A-lanca nadomješten je drugom aminokiselinom, kao što je Gly.

U drugom preferirajućem obliku, prema ovom izumu, molekula inzulina ima

(a) A-lanac prikazan formulom I,

[image]

gdje je slijed aminokiselina, prikazan formulom I, uključen dalje u slijed ID br. 1, i

(b) B-lanac prikazan formulom II,

[image]

gdje je slijed aminokiselina, prikazan formulom II, uključen dalje u slijed ID br. 2,

gdje je

Xaa na položaju A21 je genetski kodirana aminokiselina;

Xaa na položaju B28 je Lys ili Pro;

Xaa na položaju B29 je Lys ili Pro;

Xaa na položaju B30 je Thr, Ala ili je odsutan;

jedan od Xaa na položaju B28 ili Xaa na položaju B29 je Lys;

Xaa na položaju B28 i Xaa na položaju B29 nisu oba Lys; a

ε-amino skupina od Lys na položaju B28 ili B29 je kovalentno vezana na α-karboksilnu grupu pozitivno nabijene aminokiseline.

U jednom od preferirajućih oblika, Xaa na položaju A-1 je odsutan, Xaa na položaju A0 je Arg, derivatizirani Arg, homoarginin, dezaminoarginin, Lys, derivatizirani Lys, alfa gvanidino homoarginin ili alfa metil arginin, Xaa na položaju B-1 je odsutan, a Xaa na položaju B0 je Arg, derivatizirani Arg, dezaminoarginin, Lys, derivatizirani Lys, alfa gvanidino homoarginin, alfa metil arginin, ili je odsutan.

U drugom preferirajućem obliku, Xaa na položaju A-1 je odsutan, Xaa na položaju A0 je Arg, Xaa na položaju B-1 je odsutan, i Xaa na položaju B0 je odsutan.

U drugom preferirajućem obliku, Xaa na položaju A-1 je odsutan, Xaa na položaju A0 je Lys, derivatizirani Lys, Xaa na položaju B-1 je odsutan, i Xaa na položaju B0 je odsutan.

"Formula I" je

[image]

a slijed aminokiselina, prikazan formulom I, uključen je dalje u slijed ID br. 1. Aminokiseline na položaju A-1 do A21 u formuli I odgovaraju aminokiselinama na položaju 1-23 u slijedu ID br. 1. Aminokiseline na položaju A1 do A20 formule I i na položajima 3-22 slijeda ID br. 1 odgovaraju aminokiselinama na položaju 1-20 u A-lancu humanog inzulina (slijed ID br. 3).

"Formula II" je

[image]

a slijed aminokiselina, prikazan formulom II, uključen je dalje u slijed ID br. 2. Aminokiseline na položaju B-1 do B30 u formuli II odgovaraju aminokiselinama na položaju 1-32 u slijedu ID br. 2. Aminokiseline na položaju B1 do B27 formule I i na položajima 3-29 slijeda ID br. 2 odgovaraju aminokiselinama na položaju 1-27 u B-lancu humanog inzulina (slijed ID br. 4).

Polinukleotidi i aminokiselinski slijedovi dobro su poznati kod velikog broja različitih vrsta. Prije svega, pod nazivom "inzulin" misli se na humani inzulin. "Humani inzulin" ima dvadeset i jednu aminokiselinu u A-lancu, i to Gly - Ile - Val - Glu - Gln - Cys - Cys - Thr - Ser - Ile - Cys - Ser - Leu - Tyr - Gln - Leu - Glu - Asn - Tyr - Cys - Asn (slijed ID br. 3), i trideset aminokiselina u B-lancu i to Phe - Val - Asn - Gln - His - Leu - Cys - Gly - Ser - His - Leu - Val - Glu - Ala - Leu - Tyr - Leu - Val - Cys - Gly - Glu - Arg - Gly - Phe - Phe - Tyr - Thr - Pro - Lys - Thr (slijed ID br. 4).

A- i B-lanci humanog inzulina unakrsno su spojeni disulfidnim vezama. Jedna međulančana disulfidna veza je između Cys na položaju A7 formule I i Cys na položaju B7 formule II, a druga međulančana disulfidna veza je između Cys na položaju A20 formule I i Cys na položaju B19 formule II. Međulančane disulfidne veze su između cisteina na položajima A6 i A11 formule I.

Pojmovi "stanica domaćina" i "stanice domaćina" odnose se na pojedinačne stanice domaćina i na više od jedne stanice domaćina.

"Molekula inzulina" kao što se ovde upotrebljava, obuhvaća divlji tip inzulina, derivate inzulina i analoge inzulina.

"Pozitivno nabijena aminokiselina" je prirodna ili neprirodna aminokiselina koja kod pH 6 ima neto pozitivan naboj. U jednom od preferirajućih oblika pozitivno nabijena aminokiselina je Arg. U drugom preferirajućem obliku pozitivno nabijena aminokiselina je Lys.

"Derivat inzulina", kao što se ovdje spominje, podrazumjeva molekulu inzulina u kojoj je Lys derivatiziran u obliku kovalentne veze između ε-amino skupina (-Nε) od Lys i drugog dijela. U jednom od preferirajućih oblika, A-lanac od Lys je derivatiziran tako da tvori kovalentnu vezu između ε-amino skupina od Lys i drugog dijela. U drugom preferirajućem obliku, B-lanac od Lys je derivatiziran tako da tvori kovalentnu vezu između ε-amino skupina od Lys i drugog dijela. U nekom drugom od preferirajućih oblika, i A-lanac i B-lanac od Lys su derivatizirani tako da tvore kovalentnu vezu između ε-amino skupina od Lys i drugog dijela.

U drugom preferirajućem obliku, kovalentna veza je oblikovana acilacijom s pozitivno nabijenom aminokiselinom. U tom je slučaju kovalentna veza oblikovana između ε-amino skupine od Lys i ugljika u α-karboksilnoj grupi aminokiseline kada vodikov atom ε-amino skupine od Lys i hidroksilni dio α-karboksilne skupine aminokiseline izlaze i tvore molekulu vode.

U drugom preferirajućem obliku, kovalentna veza je oblikovana između ε-amino skupine od Lys i ugljika u α-karboksilnoj grupi od Arg uz stvaranje derivata "Lys-Nε-Arg". Derivat "Lys-Nε-Arg" je prikazan na Slici 1. U drugom preferirajućem obliku, derivat inzulina "Lys-Nε-Arg" je oblikovan od Lys na položaju B28 što je prikazano Formulom II. U drugom preferirajućem obliku, derivat inzulina "Lys-Nε-Arg" je oblikovan od Lys na položaju B29 što odgovara Lys na položaju 29 u slijedu ID br. 4.

U drugom opet preferirajućem obliku, kovalentna veza je oblikovana između ε-amino skupine od Lys i ugljika u α-karboksilnoj grupi od Lys uz stvaranje derivata "Lys-Nε-Lys". U drugom preferirajućem obliku, derivat inzulina "Lys-Nε-Lys" je oblikovan od Lys na položaju B28 što je prikazano Formulom II. U drugom preferirajućem obliku, derivat inzulina "Lys-Nε-Lys" je oblikovan od Lys na položaju B29, što je prikazano Formulom II, a koji odgovara Lys na položaju 29 u slijedu ID br. 4.

"Derivat proinzulina", kao što se ovdje spominje, podrazumjeva molekulu proinzulina u kojoj je Lys derivatiziran u obliku kovalentne veze između ε-amino skupina od Lys i drugog dijela. U jednom od preferirajućih oblika, kovalentna veza je oblikovana acilacijom s pozitivno nabijenom aminokiselinom. U tom je slučaju kovalentna veza oblikovana između ε-amino skupine od Lys i ugljika u α-karboksilnoj grupi pozitivno nabijene aminokiseline tvoreći "Lys-Nε-aminokiselinski" derivat. U jednom od preferirajućih oblika, kovalentna veza je oblikovana između ε-amino skupine od Lys i ugljika u α-karboksilnoj grupi od Arg uz stvaranje derivata "Lys-Nε-Arg". U drugom preferirajućem obliku, derivat inzulina "Lys-Nε-Arg" je oblikovan od Lys na položaju B28 što je prikazano Formulom II. U drugom preferirajućem obliku, derivat inzulina "Lys-Nε-Arg" je oblikovan od Lys na položaju B29 što odgovara Lys na položaju 29 u slijedu ID br. 4. U drugom opet preferirajućem obliku, kovalentna veza je oblikovana između ε-amino skupine od Lys i ugljika u α-karboksilnoj grupi od Lys uz stvaranje derivata "Lys-Nε-Lys". U drugom preferirajućem obliku, derivat inzulina "Lys-Nε-Lys" je oblikovan od Lys na položaju B28 što je prikazano Formulom II. U drugom preferirajućem obliku, derivat inzulina "Lys-Nε-Lys" je oblikovan od Lys na položaju B28. U drugom opet preferirajućem obliku, derivat inzulina "Lys-Nε-Lys" je oblikovan od Lys na položaju B29, što je prikazano Formulom II, a koji odgovara Lys na položaju 29 u slijedu ID br. 4.

"Analog inzulina", kao što se ovdje spominje, je različit od "derivata inzulina", kao što se ovdje spominje. "Derivat inzulina" je molekula inzulina u kojoj je Lys derivatiziran tako da se stvori kovalentna veza između ε-amino skupine Lys i druge polovice. Suprotno "derivatu inzulina", "analog inzulina" je molekula inzulina koja je modificirana tako da se razlikuje od divljeg tipa inzulina, ali Lys nije derivatiziran tako da bi se stvorila kovalentna veza između ε-amino skupine Lys i druge polovice. Prema tome, derivat inzulina može imati A- i/ili B-lance koji u biti imaju iste slijedove aminokiselina kao i A-lanac i B-lanac humanog inzulina, odnosno, koji se razlikuju od A-lanca i B-lanca humanog inzulina jer imaju jednu ili više aminokiselina manje u A- i/ili B-lancima i/ili jednu ili više zamijenjenih aminokiselina u A- i/ili B-lancima, i/ili jednu ili više aminokiselina kovalentno vezanih na N- i /ili C-kraj A- i /ili B-lanaca.

Prema tome, na primjer, A0ArgB29Lys-Nε-Arg-inzulin i A0Lys-Nε-Arg- inzulin i A0Lys- Nε-ArgB29Lys- Nε-Arg-inzulin su derivati inzulina jer je u svakoj od tih molekula Lys derivatiziran tako da tvori kovalentnu vezu između ε-amino skupine Lys i drugog dijela (Arg). Suprotno derivatu inzulina, A0Arg-inzulin je analog inzulina jer u A0Arg-inzulinu Lys nije derivatiziran tako da tvori kovalentnu vezu između ε-amino skupine Lys i drugog dijela.

"Analog proinzulina", kao što se ovdje spominje, je različit od "derivata proinzulina", kao što se ovdje spominje.

"Derivat proinzulina" je molekula proinzulina u kojoj je Lys derivatiziran tako da se stvori kovalentna veza između ε-amino skupine Lys i druge polovice. Suprotno "derivatu proinzulina", "analog proinzulina" je molekula proinzulina koja je modificirana tako da se razlikuje od divljeg tipa proinzulina, ali Lys nije derivatiziran tako da bi se stvorila kovalentna veza između ε-amino skupine Lys i drugog dijela.

Prema tome, derivat proinzulina može imati A-lanac, B-lanac i/ili C-peptid koji u biti imaju iste slijedove aminokiselina kao i A-lanac, B-lanac i C-peptid humanog proinzulina, odnosno, koji se razlikuju od A-lanca, B-lanca i C-peptida humanog proinzulina jer imaju jednu ili više aminokiselina manje u A-lancu, B-lancu ili C-peptidu, i/ili jednu ili više zamijenjenih aminokiselina u A-lancu, B-lancu ili C-peptidu, i/ili jednu ili više aminokiselina kovalentno vezanih na N- i /ili C-kraj A-lanca, B-lanca ili C-peptida. Na primjer, A0ArgB29Lys-Nε-Arg-proinzulin je derivat proinzulina, ali B28LysB29Pro-proinzulin je analog proinzulina.

Aminokiselina Xaa na položaju A-1 u Formuli I, može biti prisutna ili odsutna. Ukoliko je prisutna preferira se da to bude Arg, derivatizirani Arg, homoarginin, dezamino homoarginin, dezaminoarginin, Lys, derivatizirani Lys, dezaminolizin, alfa gvanidino homoarginin ili alfa metil arginin.

Aminokiselina Xaa na položaju A0 mora biti prisutna. U preferirajućem obliku, Xaa na položaju A0 je Arg, derivatizirani Arg, homoarginin, dezamino homoarginin, dezaminoarginin, Lys, derivatizirani Lys, dezaminolizin, alfa gvanidino homoarginin ili alfa metil arginin. U preferirajućem obliku, Xaa na položaju A0 je derivatizirani Lys s pozitivno nabijenom aminokiselinom. U drugom preferirajućem obliku, Xaa na položaju A0 je Lys- Nε-Arg. U drugom opet preferirajućem obliku, Xaa na položaju A0 je Lys- Nε-Lys.

Aminokiselina Xaa na položaju A21 je genetički kodirana aminokiselina izabrana od skupine koja se sastoji od alanina (Ala), arginina (Arg), asparagina (Asn), asparaginske kiseline (Asp), cisteina (Cys), glutaminske kiseline (Glu), glutamina (Gln), glicina (Gly), histidina (His), izoleucina (Ile), leucina (Leu), lizina (Lys), metionina (Met), fenilalanina (Phe), prolina (Pro), serina (Ser), treonina (Thr), triptofana (Trp), tirozina (Tyr) i valina (Val). U jednom od preferirajućih oblika, aminokiselina Xaa na položaju A21 je glicin. U drugom preferirajućem obliku, aminokiselina Xaa na položaju A21 je serin. U drugom pak preferirajućem obliku, aminokiselina Xaa na položaju 21 je treonin. U drugom opet preferirajućem obliku, amonokiselina Xaa na položaju A21 je alanin.

Aminokiselina Xaa na položaju B-1 u Formuli II može biti prisutna ili odsutna. Ukoliko je prisutna, preferira se da to bude Arg, derivatizirani Arg, homoarginin, dezamino homoarginin, dezaminoarginin, Lys, derivatizirani Lys, dezaminolizin, alfa gvanidino homoarginin ili alfa metil arginin. Aminokiselina na položaju B0 može biti prisutna ili odsutna. Ukoliko je prisutna, preferira se da to bude Arg, derivatizirani Arg, homoarginin, dezamino homoarginin, dezaminoarginin, Lys, derivatizirani Lys, dezaminolizin, alfa gvanidino homoarginin ili alfa metil arginin. Ukoliko je aminokiselina Xaa na položaju B0 odsutna, odsutna je također i aminokiselina Xaa na položaju B-1.

Aminokiselina Xaa na položaju B28 je Lys ili Pro.

Aminokiselina Xaa na položaju B29 je Lys ili Pro.

Aminokiselina Xaa na položaju B30 je Thr, Ala ili je odsutna.

U jednom od preferirajućih oblika, Lys je ili Xaa na položaju B28 ili Xaa na položaju B29, odnosno, Lys ne mogu biti i Xaa na položaju B28 i Xaa na položaju B29, a ε-amino skupina od Lys na položaju B28 ili B29 je kovalentno vezana na ε-karboksilnu grupu pozitivno nabijene aminokiseline u obliku Lys-Nε-aminokiselinskog derivata. U drugom preferirajućem obliku ε-amino skupina od Lys na položaju B28 ili B29 je kovalentno vezana na ε-karboksilnu grupu Arg u obliku Lys-Nε-Arg derivata. U drugom opet preferirajućem obliku ε-amino skupina od Lys na položaju B28 ili B29 je kovalentno vezana na ε-karboksilnu grupu Lys u obliku Lys-Nε-Lys derivata.

U drugom preferirajućem obliku, amonokiselina u molekuli inzulina je prethodno je derivatizirana. U jednom od preferirajućih oblika, aminokiselinska derivatizacija je acilacija. Više se preferira da je Lys, na položaju B29 Formule II, aciliran s aminokiselinom.

U drugom preferirajućem obliku, aminokiselinska derivatizacija je karbamilacija. Preferira se da Lys bude derivatiziran u oblik homoarginina. Još se više preferira da homoarginin bude formiran od Lys na položaju B29 Formule II.

Pod "polipeptidnim lancem" misli se na dvije ili više aminokiselina međusobno povezanih peptidnim vezama.

U preferiranom obliku, A-lanac molekule inzulina prema ovom izumu unakrsno je spojen s B-lancem pomoću dvije disulfidne veze, a A-lanac sadrži i unutarlančane disulfidne, unakrsno spojene veze. Specifičnije, "ispravno spojeno" odnosi se na (1) disulfidnu vezu između Cys na položaju A6 u Formuli I i Cys na položaju A11, (2) disulfidnu vezu između Cys na položaju A7 u Formuli I i Cys na položaju B7 u Formuli II, i (3) disulfidnu vezu između Cys na položaju A20 u Formuli I i Cys na položaju B19 u Formuli II.

Jednostavna, kratka oznaka rabi se ovdje za označavanje molekula inzulina i proinzulina i dalje upućuje na A-lanac Formule I (slijed ID br. 1) i B-lanac Formule II (slijed ID br. 2). Ako aminokiselina Xaa na položaju A-1, B-1 ili B0 nije spomenuta u skraćenom imenu molekule inzulina, tada je Xaa na tom položaju odsutna. Ako aminokiselina Xaa na položaju A21 nije spomenuta u skraćenom imenu molekule inzulina, tada je aminokiselina Asn, koja je i aminokiselina na položaju A21 divljeg tipa A-lanca inzulina (slijed ID br. 3). Ako aminokiselina Xaa na položaju B28 nije spomenuta u skraćenom imenu molekule inzulina, tada je aminokiselina Pro, koja je i aminokiselina na položaju B28 divljeg tipa B-lanca inzulina (slijed ID br. 4). Ako aminokiselina Xaa na položaju B29 nije spomenuta u skraćenom imenu molekule inzulina, tada je aminokiselina Lys, koja je i aminokiselina na položaju B29 divljeg tipa B-lanca inzulina. Ako aminokiselina Xaa na položaju B30 nije spomenuta u skraćenom imenu molekule inzulina, tada je aminokiselina Thr, koja je i aminokiselina na položaju B30 divljeg tipa B-lanca inzulina. Oznaka "des(B30)" označava da Xaa na položaju B30 nije prisutna. Ako aminokiselina proinzulina nije spomenuta u kratkom imenu molekule proinzulina, aminokiselina na tom položaju odgovara položaju aminokiseline divljeg tipa molekule humanog proinzulina.

Primjer skraćene oznake je "A0ArgA21XaaB0ArgB29Lys-Nε-Arg -inzulin" koja označava da Xaa na položaju A-1 Formule I nije prisutna, da je Xaa na položaju A0 Arg, Xaa na položaju A21 je genetički kodirana aminokiselina, Xaa na položaju B-1 Formule II nije prisutna, Xaa na položaju B0 je Arg, Xaa na položaju B28 je Pro, Xaa na položaju B29 je Lys- Nε-Arg, a Xaa na položaju B30 je Thr.

U drugom primjeru skraćene oznake, oznaka "A0Lys-Nε-Arg A21GlyB29ArgB29Lys-Nε-Arg -inzulin" označava da Xaa na položaju A-1 Formule I nije prisutna, da je Xaa na položaju A0 Lys- Nε-Arg, Xaa na položaju A21 je Gly, Xaa na položaju B-1 Formule II nije prisutna, Xaa na položaju B0 nije prisutna, Xaa na položaju B28 je Pro, Xaa na položaju B29 je Lys- Nε-Arg, a Xaa na položaju B30 je Thr.

U drugom pak primjeru skraćene oznake, oznaka "A21Xaa -inzulin" označava da Xaa na položaju A-1 Formule I nije prisutna, da je Xaa na položaju A0 nije prisutna, Xaa na položaju A21 je genetički kodirana aminokiselina, Xaa na položaju B-1 Formule II nije prisutna, Xaa na položaju B0 je nije prisutna, Xaa na položaju B28 je Pro, Xaa na položaju B29 je Lys, a Xaa na položaju B30 je Thr. "A21Gly -inzulin" je isti kao i A21Xaa –inzulin, osim što je Xaa na položaju A21 Gly. "A21Ser -inzulin" je isti kao i A21Xaa –inzulin, osim što je Xaa na položaju A21 Ser.

U nekom drugom primjeru skraćene oznake, oznaka "B28LysB29Pro-inzulin" označava da Xaa na položaju A-1 Formule I nije prisutna, da Xaa na položaju A0 nije prisutna, Xaa na položaju A21 je je genetički kodirana aminokiselina, Xaa na položaju B-1 Formule II nije prisutna, Xaa na položaju B0 nije prisutna, Xaa na položaju B28 je Lys, Xaa na položaju B29 je Pro, a Xaa na položaju B30 je Thr.

U nekom drugom primjeru skraćene oznake, oznaka "A0Arg-inzulin" označava da Xaa na položaju A-1 Formule I nije prisutna, da je Xaa na položaju A0 Arg, Xaa na položaju A21 je Asn, Xaa na položaju B-1 Formule II nije prisutna, Xaa na položaju B0 nije prisutna, Xaa na položaju B28 je Pro, Xaa na položaju B29 je Lys, a Xaa na položaju B30 je Thr. Vidi U.S. 5.506.202, i U.S. 5.430.016.

"gHR" označava alfa-gvanidil homoarginin.

U preferirajućem obliku, molekula inzulina prema ovom izumu odabrana je od skupine koja sadrži:

A0ArgB29Lys-Nε-Arg-inzulin;

A0ArgA21XaaB29Lys-Nε-Arg-inzulin;

A0ArgA21GlyB29Lys-Nε-Arg-inzulin;

A0ArgA21SerB29Lys-Nε-Arg-inzulin;

A0ArgB29Lys-Nε-Lys-inzulin;

A0ArgA21XaaB29Lys-Nε-Lys-inzulin;

A0ArgA21GlyB29Lys-Nε-Lys-inzulin;

A0ArgA21SerB29Lys-Nε-Lys-inzulin;

A0LysB29Lys-Nε-Arg-inzulin;

A0LysA21XaaB29Lys-Nε-Arg-inzulin;

A0LysA21GlyB29Lys-Nε-Arg-inzulin;

A0LysA21SerB29Lys-Nε-Arg-inzulin;

A0LysB29Lys-Nε-Lys-inzulin;

A0LysA21XaaB29Lys-Nε-Lys-inzulin;

A0LysA21GlyB29Lys-Nε-Lys-inzulin;

A0LysA21SerB29Lys-Nε-Lys-inzulin;

A-1ArgA0LysA21XaaB29Lys-Nε-Arg-inzulin;

A-1ArgA0LysA21GlyB29Lys-Nε-Arg-inzulin;

A-1ArgA0LysA21SerB29Lys-Nε-Arg-inzulin;

A-1ArgA0LysA21XaaB29Lys-Nε-Lys-inzulin;

A-1ArgA0LysA21GlyB29Lys-Nε-Lys-inzulin;

A-1ArgA0LysA21SerB29Lys-Nε-Lys-inzulin;

A-1LysA0LysA21XaaB29Lys-Nε-Arg-inzulin;

A-1LysA0LysA21GlyB29Lys-Nε-Arg-inzulin;

A-1LysA0LysA21SerB29Lys-Nε-Arg-inzulin;

A-1LysA0LysA21XaaB29Lys-Nε-Lys-inzulin;

A-1LysA0LysA21GlyB29Lys-Nε-Lys-inzulin;

A-1LysA0LysA21SerB29Lys-Nε-Lys-inzulin;

A-1ArgA0ArgA21XaaB29Lys-Nε-Arg-inzulin;

A-1ArgA0ArgA21GlyB29Lys-Nε-Arg-inzulin;

A-1ArgA0ArgA21SerB29Lys-Nε-Arg-inzulin;

A-1ArgA0ArgA21XaaB29Lys-Nε-Lys-inzulin;

A-1ArgA0ArgA21GlyB29Lys-Nε-Lys-inzulin;

A-1ArgA0ArgA21SerB29Lys-Nε-Lys-inzulin;

A-1Lys-Nε-ArgA21XaaB29Lys-Nε-Arg-inzulin;

A-1Lys-Nε-ArgA21GlyB29Lys-Nε-Arg-inzulin;

A-1Lys-Nε-ArgA21SerB29Lys-Nε-Arg-inzulin;

A-1Lys-Nε-ArgA21XaaB29Lys-Nε-Lys-inzulin;

A-1Lys-Nε-ArgA21GlyB29Lys-Nε-Lys-inzulin;

A-1Lys-Nε-ArgA21SerB29Lys-Nε-Lys-inzulin;

A-1Lys-Nε-LysA21XaaB29Lys-Nε-Arg-inzulin;

A-1Lys-Nε-LysA21GlyB29Lys-Nε-Arg-inzulin;

A-1Lys-Nε-LysA21SerB29Lys-Nε-Arg-inzulin;

A-1Lys-Nε-LysA21XaaB29Lys-Nε-Lys-inzulin;

A-1Lys-Nε-LysA21GlyB29Lys-Nε-Lys-inzulin;

A-1Lys-Nε-LysA21SerB29Lys-Nε-Lys-inzulin;

A0ArgB0ArgB29Lys-Nε-Arg-inzulin;

A0ArgA21XaaB0ArgB29Lys-Nε-Arg-inzulin;

A0ArgA21GlyB0ArgB29Lys-Nε-Arg-inzulin;

A0ArgA21SerB0ArgB29Lys-Nε-Arg-inzulin;

A0ArgB0ArgB29Lys-Nε-Lys-inzulin;

A0ArgA21XaaB0ArgB29Lys-Nε-Lys-inzulin;

A0ArgA21GlyB0ArgB29Lys-Nε-Lys-inzulin;

A0ArgA21SerB0ArgB29Lys-Nε-Lys-inzulin;

A0LysB0LysB29Lys-Nε-Arg-inzulin;

A0LysA21XaaB0LysB29Lys-Nε-Arg-inzulin;

A0LysA21GlyB0LysB29Lys-Nε-Arg-inzulin;

A0LysA21SerB0LysB29Lys-Nε-Arg-inzulin;

A0LysB0LysB29Lys-Nε-Lys-inzulin;

A0LysA21XaaB0LysB29Lys-Nε-Lys-inzulin;

A0LysA21GlyB0LysB29Lys-Nε-Lys-inzulin;

A0LysA21SerB0LysB29Lys-Nε-Lys-inzulin;

A0ArgB0LysB29Lys-Nε-Arg-inzulin;

A0ArgA21XaaB0LysB29Lys-Nε-Arg-inzulin;

A0ArgA21GlyB0LysB29Lys-Nε-Arg-inzulin;

A0ArgA21SerB0LysB29Lys-Nε-Arg-inzulin;

A0LysB0ArgB29Lys-Nε-Arg-inzulin;

A0LysA21XaaB0ArgB29Lys-Nε-Arg-inzulin;

A0LysA21GlyB0ArgB29Lys-Nε-Arg-inzulin;

A0LysA21SerB0ArgB29Lys-Nε-Arg-inzulin;

A0LysB0ArgB29Lys-Nε-Lys-inzulin;

A0LysA21XaaB0ArgB29Lys-Nε-Lys-inzulin;

A0LysA21GlyB0ArgB29Lys-Nε-Lys-inzulin;

A0LysA21SerB0ArgB29Lys-Nε-Lys-inzulin;

A0ArgB0LysB29Lys-Nε-Lys-inzulin;

A0ArgA21XaaB0LysB29Lys-Nε-Lys-inzulin;

A0ArgA21GlyB0LysB29Lys-Nε-Lys-inzulin;

A0ArgA21SerB0LysB29Lys-Nε-Lys-inzulin;

A0gHRB0gHRB29Lys-Nε-Arg-inzulin;

A0gHRA21XaaB0gHRB29Lys-Nε-Arg-inzulin;

A0gHRA21GlyB0gHRB29Lys-Nε-Arg-inzulin;

A0gHRA21SerB0gHRB29Lys-Nε-Arg-inzulin;

A0gHRB0gHRB29Lys-Nε-Lys-inzulin;

A0gHRA21XaaB0gHRB29Lys-Nε-Lys-inzulin;

A0gHRA21GlyB0gHRB29Lys-Nε-Lys-inzulin;

A0gHRA21SerB0gHRB29Lys-Nε-Lys-inzulin;

A0ArgA21XaaB0ArgB28Lys-Nε-ArgB29Pro-inzulin;

A0ArgA21XaaB0LysB28Lys-Nε-ArgB29Pro-inzulin;

A0LysA21XaaB0ArgB28Lys-Nε-ArgB29Pro-inzulin;

A0LysA21XaaB0LysB28Lys-Nε-ArgB29Pro-inzulin;

A0ArgA21XaaB28Lys-Nε-ArgB29Pro-inzulin;

A0ArgA21GlyB28Lys-Nε-ArgB29Pro-inzulin;

A0ArgA21SerB28Lys-Nε-ArgB29Pro-inzulin;

A0ArgA21XaaB28Lys-Nε-LysB29Pro-inzulin;

A0ArgA21GlyB28Lys-Nε-LysB29Pro-inzulin;

A0ArgA21SerB28Lys-Nε-LysB29Pro-inzulin;

A0LysA21XaaB28Lys-Nε-ArgB29Pro-inzulin;

A0LysA21GlyB28Lys-Nε-ArgB29Pro-inzulin;

A0LysA21SerB28Lys-Nε-ArgB29Pro-inzulin;

A0LysA21XaaB28Lys-Nε-LysB29Pro-inzulin;

A0LysA21GlyB28Lys-Nε-LysB29Pro-inzulin;

A0LysA21SerB28Lys-Nε-LysB29Pro-inzulin;

A0ArgB29Lys-Nε-ArgB31Arg-inzulin;

A0ArgA21XaaB29Lys-Nε-ArgB31Arg-inzulin;

A0ArgA21GlyB29Lys-Nε-ArgB31Arg-inzulin;

A0ArgA21SerB29Lys-Nε-ArgB31Arg-inzulin;

A0ArgB29Lys-Nε-LysB31Arg-inzulin;

A0ArgA21XaaB29Lys-Nε-LysB31Arg-inzulin;

A0ArgA21GlyB29Lys-Nε-LysB31Arg-inzulin;

A0ArgA21SerB29Lys-Nε-LysB31Arg-inzulin;

A0LysB29Lys-Nε-ArgB31Lys-inzulin;

A0LysA21XaaB29Lys-Nε-ArgB31Lys-inzulin;

A0LysA21GlyB29Lys-Nε-ArgB31Lys-inzulin; i

A0LysA21SerB29Lys-Nε-ArgB31Lys-inzulin.

U drugom preferirajućem obliku, molekula inzulina prema ovom izumu, uključuje modifikaciju N-kraja A-lanca i N-kraja B-lanca. Na primjer, takva molekula inzulina je ona u kojoj je Arg kovalentno vezan na N-kraj A-lanca inzulina i gdje je Arg kovalentno vezan na B-lanac inzulina. U jednom od preferirajućih oblika, ovaj izum govori o molekuli inzulina koja ima:

(a) A-lanac prikazan Formulom I,

[image]

gdje se slijed aminokiselina Formule I nastavlja dalje u slijedu ID br. 1, i

(b) B-lanac prikazan Formulom II,

[image]

gdje se slijed aminokiselina Formule II nastavlja dalje u slijedu ID br. 2, i gdje je

Xaa na položaju A-1 Arg, derivatizirani Arg, homoarginin, dezamino homoarginin, dezaminoarginin, Lys, derivatizirani Lys, dezaminolizin, alfa gvanidino homoarginin, alfa metil arginin, ili je odsutan;

Xaa na položaju A21 je genetski kodirana aminokiselina;

Xaa na položaju B28 je Lys ili Pro;

Xaa na položaju B29 je Lys ili Pro;

Xaa na položaju B30 je Thr, Ala ili je odsutan;

jedan od Xaa na položaju B28 ili Xaa na položaju B29 je Lys;

Xaa na položaju B28 i Xaa na položaju B29 nisu oba Lys.

Mikrokristali sadržavaju također analog inzulina i cink. U preferirajućem mediju mikrokristali daržavaju analog inzulina, cink i protamin.

Posebna se pažnja posvećuje također i procesu pripremanja mikrokristala, uključujući kontaktne sastojke, molekulu inzulina i dvovalentni metalni kation u vodenoj otopini pri pH koji omogućuje dobivanje heksamera molekule inzulina. Pojam "kontaktirajuće" odnosi se, općenito, na položaj sastojaka u otopini. Manje se, pojam kontaktirajuće odnosi na zaokretanje, vrtnju, trešnju ili vibraciju sastojaka u otopini. Više se, pojam kontaktirajuće odnosi na miješanje sastojaka.

U drugom preferirajućem obliku, analog inzulina odabran je od skupine koja sadrži:

A0ArgB0Arg-inzulin;

A0ArgA21XaaB0Arg-inzulin;

A0ArgA21GlyB0Arg-inzulin;

A0ArgA21SerB0Arg-inzulin;

A0LysB0Lys-inzulin;

A0LysA21XaaB0Lys-inzulin;

A0LysA21GlyB0Lys-inzulin;

A0LysA21SerB0Lys-inzulin;

A0ArgB0Lys-inzulin;

A0ArgA21XaaB0Lys-inzulin;

A0ArgA21GlyB0Lys-inzulin;

A0ArgA21SerB0Lys-inzulin;

A0LysB0Arg-inzulin;

A0LysA21XaaB0Arg-inzulin;

A0LysA21GlyB0Arg-inzulin;

A0LysA21SerB0Arg-inzulin.

Pod pojmom "šablona inzulina" smatra se molekula inzulina koja je preinačena u oblik inzulinskog analoga ili ili derivata prema ovom izumu. Molekule inzulina koje se mogu rabiti kao šablone za kasnija kemijska preinačenja, ne uključuju, što nije ograničeno, ni jedan od inzulina koji se prirodno javljaju i preferirajući humani inzulin; analog humanog inzulina; B28Lys, B29Pro-inzulin; A0Arg-inzulin; A21Xaa-inzulin; A0ArgA21aXaa-inzulin, B0Arg-inzulin; B28Asp-inzulin; B3LysB29Glu-inzulin i molekula inzulina u kojoj su jedna ili više aminokiselina prethodno derivatizirane zaštitnom grupom, prije svega, tert-butiloksikarbonilom (Boc) kako bi se povečao broj reakcija specifičnih za slijedeći korak acilacije. Preferira se da šablona inzulina bude rekombinirani inzulin. Još se više preferira da je šablona inzulina rekombinirani humani inzulin ili njegov analog. Najviše preferirajuća šablona inzulina je rekombinirani humani inzulin.

A21Xaa-inzulin može se rabiti kao šablona inzulina ukoliko se u divljem tipu želi zamijeniti asparagin na položaju 21 Formule I (što odgovara položaju 23 u slijedu ID br. 2), s drugom aminokiselinom kako bi se oslabila ili spriječila deaminacija molekule inzulina i/ili se produžio učinak molekule inzulina. U jednom od preferirajučih oblika, A21Asn je zamijenjen s A21Gly kako bi se formirao A21Gly-inzulin. U drugom preferirajučem obliku, A21Asn je zamijenjen s A21Thr kako bi se formirao A21Thr-inzulin. U drugom pak preferirajučem obliku, A21Asn je zamijenjen s A21Ala kako bi se formirao A21Ala-inzulin. U drugom opet preferirajučem obliku, A21Asn je zamijenjen s A21Ser kako bi se formirao A21Ser-inzulin.

Pojam "rekombinirani protein" odnosi se na protein, izražen u eukariotskoj ili prokariotskoj stanici posebnim prijenosnikom, koji sadrži polinukleotidni slijed, a taj slijed kodira protein. Preferira se da rekombinantni protein bude rekombinantna molekula inzulina.

Pojam "rekombinantna molekula inzulina" odnosi se na molekulu inzulina izraženu u eukariotskoj ili prokariotskoj stanici posebnim prijenosnikom, koji sadrži polinukleotidni slijed, a taj slijed kodira A-lanac i B-lanac molekule inzulina, te neobavezno i C-peptid molekule proinzulina. U jednom od preferirajućih oblika, rekombinantni protein je rekombinantan inzulin ili derivat proinzulina. U drugom preferirajućem obliku, rekombinantni protein je rekombinanirani inzulin ili analog proinzulina

Pojam "rekombinirani humani inzulin" odnosi se na rekombinirani inzulin koji sadrži aminokiselinske slijedove divljeg tipa humanog A-lanca (slijed ID br. 3) i B-lanca (slijed ID br. 4).

Pojam "genetički kodirana aminokiselina" odnosi se na aminokiselinu koja je kodirana genetičkim kodonom koji predstavlja grupu od tri baze deoksiribonukleinske kiseline. Vidi Biochemistry, L. Stryer, Ed., Third Edition, W.H. Freeman and Co., New York, p 99-107 (1988). Genetički kodirane aminokiseline uključuju alanin (Ala), arginin (Arg), asparagin (Asn), asparaginsku kiselinu (Asp), cistein (Cys), glutaminsku kiselinu (Glu), glutamin (Gln), glicin (Gly), histidin (His), izoleucin (Ile), leucin (Leu), lizin (Lys), metionin (Met), fenilalanin (Phe), prolin (pro), serin (Ser), treonin (Thr), triptofan (Trp), tirozin (Tyr) i valin (Val).

Klinički normalna razina glukoze u plazmi je 70 - 110 mg/dl. Klinički normalna razina glukoze u plazmi nakon obroka je manja od 140 mg/dl. Pojam "dostatno za regulaciju glukoze u krvi" odnosi se na upravljanje molekulom inzulina što rezultira klinički normalnom razinom glukoze u plazmi.

Kao što je dobro poznato u struci, djelovanje inzulina može se kvantificirati uporabom tehnike "glukozna spona" gdje se količina egzogene glukoze, potrebne za održavanje unaprijed određene razine glukoze u plazmi, rabi kao mjerilo veličine i duljine djelovanja inzulina. Na primjer, vidi Burke et al., Diabetes Research, 4:163-167 (1987). Općenito je, kod istraživanja glukozne spone, glukoza unošena intravenozno. Ako molekula inzulina uzrokuje smanjenje razine glukoze u plazmi, povečava se unos glukoze kako bi se održala unaprijed određena razina glukoze u plazmi. Kada molekula inzulina smanjeno djeluje, unos glukoze je smanjen kako bi se održala unaprijed određena razina glukoze u plazmi.

Pojam "inzulinski efekt" podrazumijeva da, kod istraživanja glukozne spone, razina intravenozne glukoze u krvi bude povećana u skladu s održavanjem unaprijed određene razine glukoze u plazmi za vrijeme trajanja pokusa. U jednom od preferirajućih oblika, unaprijed određena razina glukoze je razina glukoze u plazmi prije obroka. U drugom preferirajućem obliku, unaprijed određena razina glukoze je razina glukoze u plazmi nakon obroka.

Molekula inzulina ima "dugotrajno djelovanje" ukoliko omogućuje djelovanje inzulina kod hipoglikemičara, npr. dijabetičara, bolesnika s dugotrajnim nedostatkom humanog inzulina. Preferira se da molekula inzulina djeluje od oko 8 sati do oko 24 sata nakon samostalnog upravljanja molekulom inzulina. Više se preferira da djelovanje inzulina traje od oko 10 sati do oko 24 sata. Još se više preferira da djelovanje traje u vremenu od oko 12 sati do oko 24 sata. Mnogo se više preferira djelovanje od oko 16 sati do oko 24 sata. Najviše se preferira djelovanje u trajanju od oko 20 sati do oko 24 sata.

Molekula inzulina ima "bazalni inzulinski efekt" ukoliko dovodi do sniženog djelovanja glukoze što traje oko 24 sata nakon samog djelovanja molekule inzulina.

"Izolirani protein", kao što se ovdje upotrebljava, odnosi se na protein koji je preseljen iz sredine u kojoj je stvoren. Prirodni protein je izoliran kada je preseljen iz stanične sredine u kojoj je nastao. Rekombinantni protein je izoliran kada je preseljen iz stanične sredine u kojoj je protein istisnut. Kemijski preinačen protein, prirodan li rekombiniran, izoliran je pri preseljenju iz reakcijske smjese u kojoj je protein kemijski preinačen. Preferira se da izolirani protein bude uklonjen od ostalih proteina, polipeptida ili peptida. Metode izolacije proteina uključuju centrifugiranje, kromatografiju, liofilizaciju ili elektroforezu. Takve su metode izolacije proteina vrlo dopro poznate i u struci se često rabe. Preferira se da molekula inzulina, preme ovom izumu, bude izolirana.

"Modifikacija" proteina uključuje adiciju aminokiseline, derivatizaciju aminokiseline, supstituciju jedne aminokiseline drugom ili deleciju aminokiseline. Modifikacija se može provesti metodologijom rekombinantne DNA. Na primjer, vidi U.S. patent 5.506.202, 5.430.016 i 5.656.782. Alternativno, modifikacija se može provesti i kemijskom modifikacijom šablone inzulina, kao što je dodavanje jednog ili više kemijskih dijelova na šablonu inzulina, ili pak preseljenje jednog ili više kemijskih dijelova od šablone inzulina. Kemijska modifikacija šablone inzulina na strani amino skupina uključuje karbamilaciju, amidaciju, gvanidinilaciju, sulfonilaciju, acilaciju jedne ili više α-amino skupina, acilaciju ε-amino skupine (npr. lizin α-amino skupina), N-alkilacija arginina, histidina ili lizina, alkilacija glutaminske ili asparaginske acido skupine i deamidaciju glutamina ili asparagina. Modifikacija krajnje amino skupine (npr. α-amino skupine) uklučuje, bez ograničenja, des-amino, N-kraći alkil, N-di-kraći alkil i n-acil modifikacije. Modifikacija krajnje karbonilne skupine uključuje, bez ograničenja, modifikaciju amida, kraćih alkilnih amida, dialkilnih amida i kraćih alkil estera. Osim toga, jedna ili više postranih ili krajnjih skupina mogu biti zaštićene zaštitnim skupinama poznatim u kemiji proteina.

Aminokiseline koje se rabe za tvorbu analoga inzulina ili derivata inzulina prema ovom izumu, mogu biti ili u D- ili u L-obliku i mogu biti ili prirodne ili sintetizirane aminokiseline.

"Derivatizirani Arg" se odnosi na arginin koji je preinačen sintetski, kemijskim postupkom. Preferirani derivati Arg dobiveni su acilacijom i/ili karbamilacijom. U preferiranom obliku, Arg je derivatiziran s pozitivno nabijenom aminokiselinom. U drugom preferirajućem obliku Arg je derivatiziran s Arg na epsilon (-Nε) amino grupi i tvori Arg-Nε-Arg. U drugom pak preferirajućem obliku Arg je derivatiziran s Lys na -Nε amino grupi i tvori Arg- Nε-Lys. U drugom opet preferirajućem obliku, derivatizirani Arg je dArginin (dArg ili dR), gdje je Arg obrnuto stereokemijski na alfa ugljiku.

"Derivatizirani Lys" se odnosi na lizin koji je preinačen sintetski, kemijskim postupkom. Preferirani derivati Lys dobiveni su acilacijom i/ili karbamilacijom. U preferiranom obliku, Arg je derivatiziran s pozitivno nabijenom aminokiselinom. U drugom preferirajućem obliku Lys je derivatiziran s Arg na epsilon (-Nε) amino grupi i tvori Lys-Nε-Arg. U drugom pak preferirajućem obliku Lys je derivatiziran s Lys na epsilon amino grupi i tvori Lys- Nε-Lys. U drugom opet preferirajućem obliku, derivatizirani Lys je homoarginin (homoArg ili hR). U drugom preferirajućem obliku, derivatizirani Lys je dLizin (dLys ili dL), gdje je Lys obrnuto stereokemijski na alfa ugljiku. U nekom drugom preferirajućem obliku derivatizirani Lys je alfa gvanidino homoarginin (gHR).

Humani inzulin sadrži tri slobodne amino skupine: N-krajnju α-amino grupu A-lanca, N-krajnju α-amino grupu B-lanca i ε-amino grupu B-lanca lizinske strane lanca. Općenito, α- i/ili ε-amino skupine proteina mogu biti acilirane s aktiviranim karboksilnim kiselinama. U tom kontekstu, acilacija se odnosi na oblik amidne veze između amina i karboksilne veze.

Acilacija N-kraja aminokiseline A-lanca inzulina s aminokiselinom rezultira dobivanjem peptidne veze. Isto tako, acilacija N-kraja aminokiseline B-lanca s aminokiselinom rezultira dobivanjem peptidne veze. Acilacija ε-amino skupine Lys s aminokiselinom formira derivat Lys-Nε-aminokiseline.

"Acilirani Arg" odnosi se na acilni dio koji je kovalentno vezan na Arg pomoću kovalentne veze formirane između acidne skupine komponente koja sadrži acil- i ε-amino skupine Arg.

"Acilirani Lys" odnosi se na acilni dio koji je kovalentno vezan na Lys pomoću kovalentne veze formirane između acidne skupine komponente koja sadrži acil- i Lys.

"Karbamilirani inzulin" odnosi se na karbamilirani dio koji je kovalentno vezan na inzulin preko kovalentne veze ostvarene između karbonilnog ugljika karbamilne skupine komponente, koja sadrži karbamil, i amino skupine inzulina.

"Karbamilirani Arg" odnosi se na karbamilirani dio koji je kovalentno vezan na Arg preko kovalentne veze ostvarene između karbonilnog ugljika karbamilne skupine komponente, koja sadrži karbamil, i alfa-amino skupine Arg.

"Karbamilirani Lys" odnosi se na karbamilirani dio koji je kovalentno vezan na Lys preko kovalentne veze ostvarene između karbonilnog ugljika karbamilne skupine komponente, koja sadrži karbamil, i lizina.

"Farmaceutski prihvatljivo" odnosi se ono što je klinički odgovarajuće za primjenu kod čovjeka. Farmaceutski prihvatljiva formulacija ne sadrži toksične elemente, nepoželjne sastojke ili slično, i ne ometa aktivnost aktivnih komponenata.

"Farmaceutski sastav" odnosi se na sastav koji je klinički prihvatljiv za primjenu kod čovjeka. Molekula inzulina, prema ovom izumu, može biti formulirana prema farmaceutskom sastavu gdje protein dolazi u interakciju s jednom ili više anorganskih baza, anorganskih i organskih kiselina i formira soli. Kiseline koje sudjeluju u formiranju soli, su anorganske kiseline kao što su hidrokloridna kiselina, hidrobromidna kiselina, hidrojodidna kiselina, sumporna kiselina, fosforna kiselina, i slične, i organske kiseline kao što su p-toluen sulfidna kiselina, metan sulfidna kiselina, oksalna kiselina, p-bromofenil sulfidna kiselina, ugljična kiselina, sukcinska kiselina, limunska kiselina, benzojeva kiselina, octena kiselina, triflorooctena kiselina, i slične. Primjeri takvih soli uključuju sulfate, pirosulfate, bisulfate, sulfite, bisulfite, fosfate, monohidrogenfosfate, dihidrogenfosfate, metafosfate, pirofosfate, kloride, bromide, jodode, acetate, propionate, dekanoate, kaprilate, akrilate, formate, izobutirate, kaproate, heptanoat, propionate, oksalate, malonate, sukcinate, suberate, sebakate, fumarate, maleate, butin-1,4-dionate, benzoate, klorbenzoate, metilbenzoate, dinitrobenzoate, hidroksibenzoate, metoksibenzoate, ftalate, sulfonate, ksilensulfonate, fenilacetate, fenilpropionate, fenilbutirate, citrate, laktate, gamahidroksibutirate, glikolate, tartarate, metan sulfonate, propan sulfonate, naftalen-1-sulfonate, naftalen-2-sulfonate, mandelate i slično.

Osnovne soli dobivaju se od anorganskih baza kao što su hidroksidi amonijaka, alkalnih ili zemnoalkalnih metala, karbonati, bikarbonati i slično. Takve baze, koje su korisne kod priprema soli prema ovom izumu, uključuju natrijev hidroksid, kalijev hidroksid, amonijev hidroksid, kalijev karbonat i slične.

"Mikrokristali" se odnose na krutine koje obuhvaćaju primarnu građu u kristalnom stanju i mikroskopsku veličinu, tipičnu za duže dimenzije unutar 1 do 100 mikrometara. "Mikrokristaličan" se odnosi na stanje mikrokristala.

"Amorfan talog" odnosi se na netopljiv materijal koji nije u kristalnom obliku. Osobe koje rade u struci mogu razlikovati kristale od amorfnih taloga.

"Suspenzije" se odnose na smjese tekuće faze i krute faze koja se sastoji od netopljivih ili djelomično topljivih čestica koje su veće od koloidalnih. Na primjer, suspenzije tvore smjese NPH mikrokristala i vodenog otapala.

"Suspenzijske formulacije" se odnose na farmaceutske sastave gdje je aktivna tvar prisutna u krutoj fazi, na primjer, mikrokristalična krutina, amorfni talog, ili oboje, koji su dispergirani u vodenom otapalu. Dispergirana krutina je ona koja se može potpuno jednolično dispergirati u vodenom otapalu uz nježno miješanje smjese pa prema tome osigurava prilično jednoličnu suspenziju čiji se dozirni volumen može ekstrahirati. Primjeri komercijalno dostupnih formulacija suspenzije inzulina uključuju, na primjer, NPH, PZI i Ultralente. Mali dio krute tvari u formulaciji mikrokristalinične suspenzije može biti amorfan. Poželjno je da dio amorfnog materijala bude manji od 10%, a još poželjnije da bude manje od 1% krute tvari u mikrokristaliničnoj suspenziji. Isto tako, mali dijelovi krutine u suspenziji amorfnog taloga mogu biti mikrokristalični.

"Protamin" se odnosi na smjesu jako bazičnih proteina dobivenih iz sperme riba. Prosječna molekularna težina proteina iz protamina je oko 4.200 (Hoffmann, J.A., et al., Protein Expression and Purification, 1:127-133 (1990)]. Protamin se također odnosi na preparate koji sadrže soli proteina, npr. protamin sulfat. Komercijalni pripravci se vrlo razlikuju po njihovom sastavu soli.

"Vodeno otapalo" se odnosi na tekuće otapalo koje sadrži vodu. Vodeno otapalo može sadržavati samo vodu, može sadržavati vodu plus jedno ili više pogodnih otapala, ili može sadržavatitvari topljive u otopini. Najčešće korištena otapala su kratkolančani organski alkoholi, kao što su metanol, etanol, propanol; kratkolančani ketoni, kao aceton; i polialkoholi, kao glicerol.

"Izotonično sredstvo" se odnosi na komponentu koja je fiziološki tolerantna i koja pruža pogodan tonus formulaciji u spriječavanju mrežnog kolanja vode kroz stanične membrane koje su u kontaktu s danom formulacijom. Glicerol, koji je također poznat i kao glicerin, i manitol često se rabe kao izotonična sredstva. Druga izotonična srdstva uključuju soli, npr. natrijev klorid, i monosaharide, npr. dekstrozu i laktozu. Poželjno je da izotonično sredstvo bude glicerol.

"Heksamer-stabilizirajuća komponenta" se odnosi na ne-proteinske komponente, male molekularne težine koje stabiliziraju molekulu inzulina, prema ovom izumu, u heksamernom asocijacijskom stanju. Fenolne komponente, prije svega fenolni konzervansi, su najbolje poznate stabilizirajuće komponente za molekule inzulina. Poželjno je da je heksamer-stabilizirajuća komponenta fenol, m-krezol, o-krezol, p-krezol, klorokrezol, metilparaben ili smjesa jedne ili više komponenata. Poželjnije je da heksamer-stabilizirajuća komponenta fenol ili m-krezol, ili njihova smjesa.

"Konzervansi" se odnose na komponente koje se dodaju farmaceutskom pripravku da djeluju kao antimikrobna sredstva. Konzervans koji se rabi u pripravcima prema ovom izumu, može biti fenolni konzervans, i može biti isti ili različit od heksamer-stabilizirajuće komponente. Od konzervansa, koji su poznati kao djelotvorni i prihvatljivi u parenteralnim pripravcima, poznati su benzalkonijev klorid, benzetonij, kloroheksidin, fenol, m-krezol, benzil alkohol, metilparaben, klorobutanol, o-krezol, klorokrezol, fenilživa nitrat, timerosal, benzojeva kiselina, butil paraben, etil praben, fenoksi etanol, fenil etilalkohol, propil paraben, benzilklorokrezol, klorokrezol, i njihove različite smjese.

"Fenolni konzervans" uključuje komponente kao što su fenol, m-krezol, o-krezol, p-krezol, klorokrezol, metilparaben, i njihove smjese. Poznao je da određeni fenolni konzervansi, kao što su fenol i m-krezol, vežu molekule koje su slične inzulinu i time potiću konformacijske promjene koje povećavaju ili fiziološku ili kemijsku stabilnost, ili oboje. Preferira se da je fenolni konzervans m.krezol ili fenol. "Pufer" ili "farmaceutski prihvatljiv pufer" odnosi se na komponentu koja je sigurna za uporabu kod pripravaka inzulina i koja djeluje tako da kontrolira pH pripravka kod onog pH koji je poželjan za pripravak. pH kristaliničnih pripravaka, prema ovom izumu, je od oko 6.0 do oko 8.0 pH pripravaka otopina, prema ovom izumu, je od oko 3.5 do oko 6.0.

Farmaceutski prihvatljivi puferi za kontroliranje pH kd umjereno kielog pH i umjereno lužnatogpH uključuju komponente kao što su laktat; tartarat, fosfat, i to posebno natrijev sulfat; acetat, posebno natrijev acetat; citrat i to natrijev citrat; arginin; TRIS; i histidin. "TRIS" se odnosi na 2-amino-2-hidroksimetil-1,3-propandiol i na njegove farmaceutski prihvatljve soli. Dva opća oblika TRIS-a su slobodne baze i klorovodik. TRIS je poznat i kao dio trimetilol aminometana, trometmina, i tris(hidroksimetil)aminometana. Ostali, famaceutski prihvatljivi puferi koji su pogodni za kontrolu pH kod željene vrijednosti, poznati su kemičarima koji rade u struci.

"Analog inzulina s brzim djelovanjem" osigurava hipoglikemičko djelovanje koje (a) počinje brže nakon subkutanog unosa nego kod humanog inzulina i/ili (b) pokazuje kraće djelovanje od humanog inzulina nakon subkutanog unosa. B28LysB29Pro-inzulin (takozvani "lispo" inzulin) je analog inzulina s brzim djelovanjem gdje su zamijenjeni Pro, na položaju 28 divljeg tipa B-lanca inzulina (slijed ID br. 4), i Lys na položaju 29 divljeg tipa B-lanca inzulina (slijed ID br. 4). Kao primjer vidi U.S. patent br. 5.504.188 i 5.700.662. Drugi analog inzulina s brzim djelovanjem je B28Asp-inzulin, gdje je divlji tip Pro na položaju 28 B-lanca zamijenjen s Asp. Vidi U.S. patent br. 6.221.633.

Ovdje se također govori o mikrokristalu koji sadrži molekulu inzulina prema ovom izumu. U jednom od preferirajućih oblika, mikrokristal ne sadrži protamin. S drugog aspekta ovog izuma, mikrokristal ne sadrži protamin i dvovalentni kation, npr. cink. Takav kristal je prikladan za pripremu mase kristala u otopini ili pak, u suhom obliku, za naredne pripravke.

U drugom preferirajućem obliku, mikrokristal sadrži protamin.

U nekom drugom pak preferirajućem obliku, mikrokristal sadrži i molekulu inzulina prema ovom izumu i humani inzulin. U jednom od preferirajućih oblika, mikrokristal se rabi za pripremu otopina. U drugom preferirajućem obliku, mikrokristal se rabi za pripremu suspenzija.

Također se preferira da suspenzija sadrži molekulu inzulina prema ovom izumu. Također se preferira sastav koji sadrži suspenziju. U jednom od oblika, suspenzija sadrži netopljivu fazu i otapalo, gdje netopljiva faza sadrži mikrokristal prema izumu, a faza otapala sadrži vodu. Po želji, faza otapala sadrži humani inzulin ili analog inzulina s brzim djelovanjem, kao što je B28LysB29Pro-inzulin, B28Asp-inzulin ili B3LysB29Glu.

Suspenzija se može rabiti za pripremu lijeka koji se rabi kod liječenja diabetes mellitus-a. Suspenzija se također može rabiti kod liječenja diabetes mellitus-a prema postupku koja uključuje davanje suspenzije osobi u dovoljnoj količini da regulira koncentraciju glukoze u krvi.

Molekula inzulina prema ovom izumu može sadržavati pogodan dvovalentni kation. "Dvovalentni metalni kation" se odnosi na ion ili ione koji mogu tvoriti kompleks s raznolikim proteinskim molekulama. Prijelazni metali, alkalni metali i zemnoalkalni metali, su primjeri metala koji su poznati po tome da tvore komplekse s inzulinom. Prijelazni metali se preferiraju. Dvovalentni metalni kation je jedan ili više kationa odabranih iz skupine koja sadrži cink, bakar, kobalt, mangan, kalcij, kadmij, nikal i željezo. Preferira se da dvovalenti kation bude cink. Cink se dobiva kao sol, kao što je cinkov sulfat, cinkov klorid, cinkov oksid, ili cinkov acetat. Kompleksi dvovalentnih metala s molekulom inzulina nisu topljivi u vodenoj otopini u uvjetima fiziološkog pH. Prema tome, ti kompleksi se mogu uzimati subkutano i pokazuju smanjeno otpuštanje u uvjetima in vitro, pa se prema tome prođužuje njihovo djelovanje.

Da bi se dobio kompleks između molekule inzulina prema ovom izumu i dvovalentnog metalnog kationa, protein je otopljen u pogodnom puferu i u prisustvu soli metala. Smjesa se inkubira na sobnoj temperaturi kako bi se kompleks istaložio. Pogodni su oni puferi koji održavaju smjesu na pH vrijednosti od 3.0 do 9.0 i ne omeću reakciju kompleksacije. Primjeri takvih pufera su fosfatni puferi, acetatni puferi, citratni puferi i Goode-ovi puferi, npr. HEPES, Tris i Tris acetat. Pogodne soli metala su one gdje je metal pogodan za kompleksaciju. Primjeri pogodnih cinkovih soli uključuju cinkov klorid, cinkov acetat, cinkov oksid i cinkov sulfat.

"Zaštićena aminokiselina" je aminokiselina koja ima sve funkcionalne skupine, ali je samo jedna reverzibilno derivatizirana, tako da je reaktivna samo jedna funkcionalna skupina. Na primjer, kod zaštićene, aktivirane karboksilne kiseline, alfa karboksilna skupina je reaktivna, ali sve ostale funkcionalne skupine aktivirane karboksilne kiseline nisu reaktivne. Zaštićena aminokiselina je "nezaštićena" kada je uklonjena zaštitna funkcionalnost. Preferira se da zaštićena aminokiselina bude zaštićeni arginin.

"Konzervativna supstitucija" je zamjena aminokiseline drugom aminokiselinom koja ima isti naboj i približno istu veličinu i oblik. Aminokiseline s alifatskim ili supstituiranim alifatskim aminokiselinama imaju približno istu veličinu kada se ukupni broj ugljikovih atoma i heteroatoma u njihovim lancima ne razlikuje za više od četiri. One imaju približno isti oblik kada se broj grananja u njihovim lancima ne razlikuje za više od jedan. Aminokiseline s fenilnim ili supstituiranim fenilnim skupinama u lancima, smatraju se da imaju istu veličinu i oblik. Ispod je navedeno pet skupina aminokiselina. Zamjena aminokiseline u inzulinu drugom aminokiselinom iz istih skupina rezultira konzervativnom supstitucijom:

Skupina I: glicin, alanin, valin, leucin, izoleucin, serin, treonin, cistein i neprirodne aminokiseline s C1-C4 alifatski ili C1-C4 hidroksil supstituiranoj alifatskoj strani lanaca (pravilno lančan ili monorazgranat).

Skupina II: glutaminka kiselina, asparaginska kiselina i neprirodne aminokiseline a karboksilnom kiselinom supstituiranom na C1-C4 alifatskoj strani lanaca (nerazgranata ili jednostrano razgranata točka).

Skupina III: lizin, ornitin, arginin, homoarginin, i neprirodne aminokiseline s aminom ili gvandinom supstituiranim na C1-C4 alifatskoj strani lanaca (nerazgranata ili jednostrano razgranata točka).

Skupina IV: glutamin, asparagin, i neprirodne aminokiseline s amidom supstituiranim na C1-C4 alifatskoj strani lanaca (nerazgranata ili jednostrano razgranata točka).

Skupina V: fenilalanin, fenilglicin, tirozin i triptofan.

Preferira se konzervativna supstitucija s prirodnim aminokiselinama.

"Visoko konzervativna supstitucija" je zamjena aminokiseline drugom aminokiselinom koja ima istu funkcionalnu grupu i koja je približno iste veličine i oblika. Aminokiseline s alifatskim ili supstituiranim alifatskim aminokiselinama imaju približno istu veličinu kada se ukupni broj ugljikovih atoma i heteroatoma u njihovim lancima ne razlikuje za više od dva. One imaju približno isti oblik kada imaju isti broj grananja u lancima. Primjeri visoko konzervativnih supstitucija uključuju zamjenu valina za leucin, treonina za serin, asparaginske kiseline za glutaminsku kiselinu i fenilglicina za fenilalanin. Primjeri supstitucija koje nisu visoko konzervativne uključuju zamjenu alanina za valin, alanina za serin i asparaginske kiseline za serin.

U molekuli inzulina prema ovom izumu, A-lanac može na C-kraju imati dodatne 1-3 aminokiseline koje odgovaraju položajima A22, A23 i A24 u formuli I. Preferira se da je amiokiselina na svim položajima, A22, A23 i A24, Xaa gdje je Xaa genetski kodirana aminokiselina.

B-lanac može imati dodatno 1-6 aminokiselina na C-kraju, koje odgovaraju položajima B31, B32, B33, B34, B35 i B36 u formuli II. U jednom od preferiranih oblika B-lanac sadrži Ala na položaju B31, Arg na položaju B32 i Arg na položaju B33. U drugom preferirajućem obliku, B-lanac sadrži Ala na položaju B31, Ala na položaju B33, Ala na položaju B34, Arg na položaju B35 i Arg na položaju B35.

"Efektivni učinak" molekule inzulina, mikrokristala, suspenzije, otopine amorfnog taloga ili pripravaka prema ovom izumu je kvantiteta koja rezultra željenim učinkom bez nepoželjih posljedica za osobu kojoj je potrebna terapija inzulinom. "Efektivni učinak" molekule inzulina prema ovom izumu nakon davanja osobi također ovisi i o tipu bolesti, karakteristikama osobe, kao što su opće zdravlje, starost, spol, tjelesna težina i podnošljivost lijekova. Ovisno o tim i drugim čimbenicima određuje se primjereno doziranje. Općenito, terapijski prikladna količina molekule inzulina prema ovom izumu za odrasle može se kretati od oko 0,01 mg po danu do oko 1000 mg po danu. Preferiraju se doze od oko 0,1 mg po danu do oko 100 mg po danu, a još se više preferiraju doze od oko 1,0 mg/dan do oko 10 mg/dan.

"Željeni terapijski učinak" uključuje jedno ili više od slijedećeg: 1) poboljšanje simptoma koji su u vezi s diabetes mellitus-om, 2) povečanu trajnost djelovanja, 3) bolju kvalitetu života. Na primjer, "efektivni učinak" molekule inzulina prema ovom izumu kod liječenja dijabetesa je kvaliteta kao rezultat izvrsne kontrole koncentracije glukoze u krvi, a time i spriječavanje dijabetskih komplikacija kao što su retinopatija, neuropatija ili bolest bubrega.

Doza, način i broj davanja lijeka po danu ovise o odlukama liječnika koje se temelje na razmatranjima čimbenika kao što su terapijski ciljevi, priroda i uzrok pacijentove bolesti, pacijentovo rodoslovlje i težina, hranidbene navike, metode uzimanja lijeka te drugi čimbenici poznati liječnicima. Dnevna doza može biti u području od oko 1 nmol/kg tjelesne težine do oko 6 nmol/kg tjelesne težine (6 nmol se smatra ekvivalentnim 1 jedinici aktivnosti inzulina). Najčešća doza u inzulinskoj terapiji je oko 2 i oko 3 nmol/kg.

Preferira se parenteralni unos lijeka. Najčešće je parenteralni unos otopine ili suspenzije pripravaka inzulina subkutani ili intramuskularni. Pripravci prema ovom izumu mogu se unijeti nazalnim, bukalnim, pulmonalnim, ili okularnim putem.

Molekula inzulina prema ovom izumu, i njeni pripravci, mogu se unijeti parenteralno. Parenteralni unos može uključivati, na primjer, sistemski unos kao što je to kod intramuskularnog, intravenoznog, subkutanog, ili intraperitonealnog injektiranja. Preferira se subkutani unos.

Molekula inzulina prema ovom izumu, i njeni pripravci, mogu se unijeti zajedno s jednom ili više farmaceutski prihvatljivih nosača ili otapala kao dio farmaceutskog pripravka za liječenje hiperglikemije.

Molekula inzulina prema ovom izumu, i njeni pripravci, mogu biti otopine. Alternativno, molekula inzulina prema ovom izumu, i njeni pripravci, mogu biti suspenzije molekule inzulina prema ovom izumu ili suspenzije proteinske komponente koja je u kompleksu s dvovalentnim metalnim kationom.

Pripravak sadrži molekulu inzulina i najmanje jedan sastojak iz skupine koja se sastoji od izotoničnog sredstva, dvovalentnog kationa, heksamer-stabilizirajuće komponente, konzervansa i pufera.

Pogodni farmaceutski nosači mogu sadržavati inertne sastojke koji ne dolaze u interakciju s molekulom inzulina prema ovom izumu. Standardne farmaceutske formulacijske tehnike mogu biti razvijene tako kao što je opisano u Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, P.A. Pogodni farmaceutski nosači za parenteralni unos uključuju, na primjer, sterilnu vodu, fiziološku otopinu, bakteriostatku otopinu (otopina sadrži oko 0,9% mg/ml benzilnog alkohola), fosfatni pufer, Hank-ovu otopinu, Ringer-ov laktat i slično. Neki primjeri pogodnih nosača uključuju glicerol, laktozu, dekstrozu, sukrozu, trehalozu, sorbitol i manitol.

"Subjekt" je sisavac, prije svega čovjek, ali može također biti i životinja, npr., životinje za druženje (npr. psi, mačke, i slično), životinje koje žive na farmi (npr, krave, ovce, svinje, konji, i slično) i laboratorijske životinje (npr. štakori, miševi, zamorci, i slično).

Šablona inzulina i inzulinskog analoga može se dobiti rekombinantnim metodologijama. Na primjer, mogu se upotrijebiti rekombinantni proinzulin ili proinzulinski analog. Alternativno, rekombinantni A- i B-lanci inzulina mogu biti u stanicama domaćina i tek tada se rekombinirati. Alternativno se može rabiti i prekursor inzulina. Svaka od ovih metodologija je dobro poznata osobama koje rade u struci. Na primjer, vidi U.S. patent br. 4.421.685, U.S. patent br. 4.569.791, U.S. patent br. 4.569.792, U.S. patent br. 4.581.165, U.S. patent br. 4.654.324, U.S. patent br. 5.304.473, U.S. patent br. 5.457.066, U.S. patent br. 5.559.094, i europski patent EP 741188 A1. Vidi također Chance et al., Diabetes Care 16 (Suppl 3): 133-142 (1993); Chance et al., ̋Peptides: Synthesis –Structure-Function ̋, in: Proceedings of the 7th American Peptide Symphosium, Rich, D.H. et al., eds., Pierce Chemical Company, Rockford, IL, pp. 721-738 (1981); i Frank et al., Munsh med Wsch 125 (Suppl. 1): S14-20 (1983).

U jednom od preferirajućih oblika, A0Lys-Nε-ArgA21GlyB29Lys-Nε-Arg-inzulin je porijeklom od selektivno aciliranih ε-amino skupina A0LysA21GlyB29Lys-inzulina. Selektivna acilacija ε-amino skupina može biti izvršena od ljudi koji rade u stuci. Na primjer, vidi U.S. patent br. 5.646.242. U drugom preferirajućem obliku, A0Lys-Nε-ArgA21GlyB29Lys-Nε-Arg-inzulin načinjen je selektivnom acilacijom ε-amino skupina A21GlyC64ArgC65Lys-humanog proinzulina i digestijom aciliranog derivata proinzulina proteazama kako bi se uklonile nepoželjne aminokiseline te očuvao kontakt između C65Lys-Nε-Arg i B29Lys-Nε-Arg te tako stvorio oblik A0Lys-Nε-ArgA21GlyB29Lys-Nε-Arg-inzulinskog derivata.

Rekombinantna molekula inzulina može se dobiti postupkom koji obuhvaća kulturu stanice domaćina koja sadrži DNA slijedove, koji kodiraju molekulu inzulina, ili prekursor i ima sposobnost ekspresije polipeptida u pogodnom hranjivom mediju i uvjetima koji omogućuju ekspresiju peptida, nakon čega se peptidi nadoknađuju od stanica domaćina i/ili medija kulture.

Medij koji se rabi za kulturu stanica može biti konvencionalni medij, pogodan za rast stanica domaćina, kao što su minimalni i kompleksniji mediji s određenim dodatcima. Mediji se mogu pribaviti od komercijalnih dobavljača ili se mogu pripremiti prema određenim recepturama (npr. u katalozima American Type Culture Collection). Peptidi koji su stvoreni od stanica, mogu se ponovno dobiti od medijske kulture konvencionalnim postupcima kao što su odvajanje stanica dmaćina iz medija centrifugiranjem ili filtriranjem, taloženjem proteinskih komponenata supernatanta ili od filtrata pomoću soli, npr. amonijevog sulfata, čišćenjem različitim kromatografskim postupcima, ionsko izmjenjivačkom kromatografijom, gel filtracijskom kromatografijom, afinitetnom kromatografijom, ili sličnom, ovisno o vrsti peptida koji se ispituje.

U skladu s ovim je postupak ekspresije molekule inzulina prema ovom izumu, a uključuje kultiviranje stanice domaćina koja sadrži molekulu inzulina u pogodnim uvjetima za širenje stanice domaćina i za ekspresiju molekule inzulina. U jednom od preferirajućih oblika, postupak obuhvaća daljnje čišćenje molekule inzulina od kulture medija. U drugom preferirajućem obliku, postupak obuhvaća daljnje čišćenje molekule inzulina i od stanice domaćina i od kulture medija.

U jednom preferirajućem obliku, stanica domaćina je eukariotska stanica. Preferira se da ta eukariotska stanica bude stanica gljiva, stanica kvasca, stanica sisavca, ili imortalizirana stanićna linija stanice sisavca. U drugom preferirajućem obliku, stanica domaćina je prokariotska stanica. Preferira se da je prokariotska stanica bakterijska stanica, prije svega stanica E. coli.

Sevenca nukleinske kiseline, koja kodira molekulu inzulina ili njenu preteću, može biti umetnuta unutar bilo kojeg vektora koji je podložan postupcima rekombinantne DNA, a izbor vektora često ovisi o stanici domaćina u koju se on uvodi. Prema tome, vektor može biti autonomno replicirajući vektor, npr., vektor koji postoji u ekstrakromosomalnoj tvorevini čija je replikacija neovisna o kromosomskoj replikaciji, npr. plazmid. Alternativno, vektor može biti jedan od onih koji se uvode u stanicu domaćina, integriraju se u genom domaćina, i repliciraju se zajedno s kromosomima u koje su ugrađeni.

Preferira se da vektor bude ekspresijski vektor, kao promotor, u kojem je DNA sekvenca koja kodira peptid, operabilno povezana s dodatnim segmentima koji zahtijevaju transkripciju DNA. Promotor može biti bilo koja DNA sekvenca koja pokazuje transkripcijsku aktivnost u stanici domaćina i može potjecati od gena koji kodiraju proteine homologne ili heterologne stanici domaćina.

Ukoliko je potrebno, sekvenca DNA, koja kodira peptid, može biti operabilno povezana s pogodnim terminatorom, poliadenilnim signalima, transkripcijskim sekvencama, i translacijskim sekvencama. Prema ovom izumu, rekombinantni vektor može dodatno sadržavati DNA sekvence koje omogućuju replikaciju vektora u stanici domaćina.

Vektor može također sadržavati odabrane markere, npr. gen čiji produkt kompletira nedostatak stanice domaćina ili pridonosi rezistentnosti na lijekove, npr. ampicilin, kanamicin, tetraciklin, kloramfenikol, neomicin, higromicin ili metotreksat.

Da bi se roditeljski peptidi usmjerili u sekrecijski put stanica domaćina, u rekombinatni vektor se može unijeti sekrecijska signalna sekvenca (poznata kao vodeća sekvenca, prepro sekvenca ili pre sekvenca). Sekrecijska signalna sekvenca je povezana s DNA sekvencama koje kodiraju peptide u ispravnom okviru čitanja. Sekrecijske signalne sekvence su uglavnom smještene na 5' DNA sekvencama koje kodiraju peptide.

Molekula inzulina prema ovom izumu može se pripremiti uporabom standardnih postupaka, tehnikama sinteze peptida u krutoj fazi. Sintetizatori peptida mogu se komercijalno nabaviti iz, na primjer, "Applied Biosystems" u Foster City, CA. Reagensi za sintezu u krutoj fazi mogu se komercijalno nabaviti iz, na primjer, "Midwest Biotech" (Fisher, IN).

Općenito, α-N-karbamil zaštićena aminokiselina i N-kraj aminokiseline na rastućem peptidnom lancu spojeni su na sobnoj temperaturi u inertnom otapalu, kao što je dimetilformamid, N-metilpirolidon ili metilen klorid uz pomoćna sredstva kao što su dicikloheksilkarbodiimid i 1-hidroksibenzotriazol te diizopropiletilamin. α-N-karbamil zaštitna skupina uklonjena je od rezultirajućeg peptida pomoću reagensa kao što je trifluoroctena kiselina (TFA) ili piperidin, a reakcija spajanja ponovljena je sa slijedećom N-zaštićenom aminokiselinom koja se želi dodati na peptidni lanac. Prikladne, amino zaštitne skupine dobro su poznate u struci i opisane u, na primjer, Green and Wuts, "Protecting Groups in Organic Synthesis", John Wiley and Sons, 1991. Primjeri uključuju t-butiloksikarbonil (tBoc) i fluorenilmetoksikarbonil (Fmoc).

Peptidi se mogu sintetizirati uporabom standardnih protokola sinteze u krutoj fazi uz pomoć t-butoksikarbonil- ili fluorenilmetoksikarbonil-alfa-aminokiselina. Nakon završene sinteze peptidi se izdvajaju iz krute faze uporabom standardnog vodikovog fluorida ili TFA postupkom. Sirovi peptidi se dalje pročišćuju reverzno-faznom kromatografijom na Vydac C18 kolonama uporabom linearnog vodeno-acetonitrilnog gradijenta u kojima sva otapala sadrže 0,1 % TFA. Da bi se uklonio acetonitril i voda, peptidi su liofilizirani iz otopine koja sadrži 0,1 % TFA, acetonitril i vodu. Čistoća se može verificirati analitički, reverzno faznom kromatografijom. Identitet peptida može se verificirati masenom spektrometrijom. Peptidi se mogu otopiti u vodenim puferima pri neutralnom pH.

Molekula inzulina prema ovom izumu može se dobiti kemijskom modifikacijom šablone rekombinantnog inzulina. U jednom od slučaja, šablona rekombinantnog inzulina je acilirana s jednom ili više zaštićenih aminokiselina uz aktiviranu karboksilnu kiselinu. Preferira se uporaba aktiviranog estera ili amida. Više se preferira aktivirani ester. Najviše se preferira uporaba N-hidroksisukcinimida (NHS) estera.

U postupku prema ovom izumu, molekula inzulina dobivena je kemijskom modifikacijom šablone rekombinantnog inzulina. U jednom od slučaja, šablona rekombinantnog inzulina je acilirana s jednom ili više zaštićenih aminokiselina uz aktiviranu karboksilnu kiselinu. Preferira se uporaba aktiviranog estera ili amida. Više se preferira aktivirani ester. Najviše se preferira uporaba N-hidroksisukcinimida (NHS) estera. Tehnike za acilaciju N-krajeva inzulinskog A-lanca i/ili B-lanca Lys su dobro poznate u struci.

Prema tome, u jednom od preferirajućih oblika, rekombinantni A21Xaa-inzulin je aciliran na položajima A1 i B29 pa tvori A0ArgA21XaaB29Lys-Nε-Arg-inzulin. U drugom preferirajućem obliku, A21Gly-inzulin je aciliran na položajima A1 i B29 pa tvori A0ArgA21GlyB29Lys- Nε-Arg-inzulin.

U drugom preferirajućem obliku, rekombinantni A0ArgA21Xaa-inzulin je aciliran na položaju B29 pa tvori A0ArgA21XaaB29Lys-Nε-Lys-inzulin. U drugom preferirajućem obliku, rekombinantni A0ArgA21Gly-inzulin je aciliran na položaju B29 pa tvori A0ArgA21GlyB29Lys-Nε-Lys-inzulin.

U drugom preferirajućem obliku, rekombinantni A0LysA21Xaa-inzulin je aciliran na položajima A0 i B29 pa tvori A0Lys- Nε-ArgA21XaaB29Lys-Nε-Arg-inzulin. Preferira se da A0LysA21Gly-inzulin bude aciliran na položajima A0 i B29 tako da tvori A0Lys- Nε-ArgA21GlyB29Lys- Nε-Arg-inzulin.

U drugom preferirajućem obliku korišten je analog proinzulina kako bi se dobila molekula inzulina prema ovom izumu. U divljem tipu humanog proinzulina, Lys je aminokiselina na položaju 64, a Arg je aminokiselina na položaju 65. Analog proinzulina koji ima Arg na položaju 64 i Lys na položaju 65, može se rabiti za dobivanje A0LysA21Xaa-inzulina koji je tada aciliran na položajima A0 i B29 pa tvori A0Lys-Nε-ArgA21XaaB29Lys- Nε-Arg-inzulin. Preferira se da A0LysA21Gly-inzulin bude aciliran na položajima A0 i B29 tako da tvori A0Lys- Nε-ArgA21GlyB29Lys- Nε-Arg-inzulin.

Reakcije acilacije proteina provode se u smjesama vode i organskih otapala, ali mogu se također provesti i u čistim organskim ili čistim vodenim stanjima, ovisno o topljivosti reaktanta. U slijedećim primjerima reakcije su provedene u smjesama koje sadrže između 40 do 60% organskih komponenata kao što su MeOH, DMF ili CH3CN. Aktivirani dijelovi sadrže aminokiseine, dipeptide ili kratke polipeptide u kojima su ε-amino skupine i funkcionalne skupine derivatizirane primjerenim zaštitnim skupinama, a koje se uklanjaju nakon što je završen korak derivatizacije proteina. Preferira se karboksilno aktivirajuća skupina N-hidroksisukcinimid (NHS) zbog svoje topljivosti u vodenim smjesama i svoje reaktivnosti što rezultira NHS-esterima s protein amino skupinama. Odnos NHS-estera prema šablonama inzulina može varirati između 2 i 20, ali poželjno je da bude između 3 i 5. Odnos se namješta na osnovi željene količine mono-, di-, i triaciliranih produkata, kao i na relativnoj reaktivnosti NHS-estera.

Reakcije se provode na sobnoj temperaturi (20-25 stupnjeva C) uz miješanje na magnetskoj miješalici. Reakcije se mogu provoditi od 1⁄2 h do 6 h.

Reakcijske smjese se prekinu nakon što se postigne određena razina acilacije (što se određuje LC-MS monitoringom) zakiseljavanjem s octenom kiselinom ili trifluorooctenom kiselinom. Daljnje se čišćenje može provesti (1) direktnim čišćenjem reakcijskih smjesa reverzno-faznim HPLC postupkom, iza čega slijedi uklanjanje zaštitne skupine i ponovno čišćenje izoliranih, nezaštićenih produkata reverzno-faznim HPLC postupkom, ili (2) razrjeđivanjem reakcijske smjese sa vodom tako da organski dio bude ispod 25% i liofilizacijom, iza čega slijedi uklanjanje zaštitne skupine, čišćenje kationsko izmjenjivačkom kromatografijom te konačno čišćenje reverzno-faznim HPLC postupkom ili gel filtracijom.

Zaštitne skupine uključuju one skupine koje će se ukloniti u uvjetima koji su odgovarajući za proteine i peptide (npr. koji ne razaraju proteine/peptide). Na primjer, tert-butiloksikarbonil (Boc) ili trifluorooctena (tfa) skupina mogu se rabiti za zaštitu amino skupina. Zaštitne skupine se mogu ukloniti, na primjer, trifluorooctenom kiselinom (TFA) i vodenom otopinom amonijevog hidroksida (NH4OH). Zaštita gvanidino dijelova su Boc, Pmc (2,2,5,7,8-pentametilkroman-6-sulfonil), ili Pbf (2,2,4,6,7-pentametilbenzofuran-5-sulfonil) skupine. Pmc i Pbf skupine se također uklanjaju s TFA, ali zahtijevaju i prisustvo "pometača" kao što je opisano u daljnjim primjerima.

S obzirom da amino skupine moraju biti u neutralnom (deprotoniranom) obliku kako bi moglo doći do reakcije acilacije, pH pri kojem se provodi reakcija utjeće na omjer reakcije. Općenito, u vodenim smjesama, omjer reakcije pojedinačne amino skupine je u inverznom odnosu s njenom pKa, osim kod vrlo visokog pH. U slučaju inzulina, tri amina imaju karakteristične vrijednosti pKa i različito je djelovanje okoline na reaktivnost, pa se moraju uzeti u obzir neke specifičnosti (vidi Lindsey et al., in Biochem. J. 121:737-745 (1971)). U principu, ε-amino skupina B29:lizin strane lanca dominira reakcijom acilacije kod pH iznad 10 (vidi Baker et al. U.S. Patent 5.646.242). U slijedećim primjerima, reakcije se provode kod pH vrijednosti koje se kreću od oko 6 do 11, ovisno o željenom produktu.

U slijedećim primjerima identiteti konačnih produkata potvrđeni su kombinacijom tehnika koja uključuje LC-MS (verifikacija molekulske težine), sekvenciranje N-krajeva proteina, i LC-MS analizu digestije S. Aureus V8 proteazom, koja daje karakteristične inzulinske fragmente jer taj enzim cijepa peptidne veze na karboksilnoj strani Glu (vidi Nikagawa, S.H. & Tager, H.S. in J. Biol. Chem. 266:11502-11509 (1991)).

PRIMJER 1

Acilacija B28LysB29Pro-inzulina sa Boc-Arg(Boc)2-NHS esterom u voda/CH3CN kod stvaranja A0ArgB0ArgB28Lys-Nε-ArgB29Pro-inzulina

B28LysB29Pro-inzulin-Zn kristali (320 mg; 0.055 mmol) su rastopljeni u 30 mL 1:1 CH3CN:PBS-pufera. Dodana je 5M otopina KOH (50 μL) kako bi se rastopili kristali kod pH 10. pH je tada namješten na približno 7.5 s 5M fosfornom kiselinom. Boc-Arg(Boc)2-NHS ester je pripremljen od po 1 mmol Boc-Arg(Boc)2-OH, NHS, i dicikloheksilkarbo-diimida (DCC) miješanih zajedno u diklormetanu tijekom 30 min. Smjesa je tada filtrirana i koncentrirana do suhog na rotacionom evaporatoru. Boc-Arg(Boc)2-NHS ester je tada otopljen u 4 mL MeOH. 2 mL otopine Boc-Arg(Boc)2-NHS estera dodano je otopini inzulina, a otopina je tada miješanana sobnoj temperaturi tijekom 2 sata. pH je namješten na približno 6.4. Dodavanjem 40 μL otopine 5M KOH pH ponovno raste na 7.1. Preostali Boc-Arg(Boc)2-NHS ester je dodan smjesi inzulina i reakcija je nastavljena dodatna 2.5 h. Smjesa je zatim zakiseljena s 100 μL trifluorooctene kiseline (TFA), razrijeđena s 30 mL vode i liofilizirana preko noći. Oko 900 mg liofiliziranog materijala otopljeno je u 20 mL TFA i ostavljeno 1 sat na sobnoj temperaturi. Smjesa je tada uparena skoro do suhog na rotacionom evaporatoru te ponovno otopljena u 20 mL 1:9 CH3CN:voda. Uzorak je analiziran analitički reverzno-faznim HPLC postupkom na Zorbax Eclipse XDB-C8 4.6 mm i.d. × 15 cm koloni s linearnim AB gradijentom od 10 do 100% B preko 15 min gdje je A = 0,05% TFA u 60:40 CH3CN:voda uz protok 1 mL/min. Pod tim uvjetima, LC-MS postupkom je potvrđeno da uzorak daje veliki pik MW tri-aciliranog izulina, s malim kolićinama tetra-aciliranog i di-aciliranog inzulina koji se eluiraju nešto prije i nešto poslije glavnog pika. Prosječno se oko 70% materijala pojavljuju kao tri-acilirane vrste.

Polovica sirovog, aciliranog materijala je pročišćena kationsko izmjenjivačkom kromatografijom na staklenoj 2 cm i.d. × 30 cm koloni sa SP-sefaroznim materijalom. A linearni AB gradijent od 0 do 40% B proveden je tijekom 100 min s protokom od 3 mL/min. Komponente otapala bile su A: 70 mM natrijevog acetata u H2O:CH3CN 70:30, pH 4.0 i B: 70 mM natrijevog acetata, 1 M natrijevog klorida u H2O:CH3CN 70:30, pH 4.0. Frakcije koje sadrže tri-acilirani inzulin su međusobno spojene, a otopina je koncentrirana od otprilike 96 mL na 75 mL, ponovno razrjeđena do 100 mL s H2O te stavljena na prethodno pripremljenu Vydac C18 2,0 cm i.d. × 25 cm kolonu uz 20 mL/min. Uzorak je eluiran uz protok od 10 mL/min uz dvo-linearni AB gradijent od 0 do 15% B preko 15 min iza kojeg slijedi 15 do 65% B preko 100 min, gdje je A = 0,05% TFA/H2O, a B = 0,05% TFA/CH3CN. Sastavljeni pročišćeni materijal je liofiliziran tako da daje 52 mg, što odgovara općem rezultatu od približno 34%.

PRIMJER 2

Acilacija A0Arg-inzulina sa Boc-Arg(Boc)2-NHS esterom u voda/CH3CN kod stvaranja A0ArgB29Lys-Nε-Arg- inzulina

Boc-Arg(Boc)2-NHS ester (0,5 mmol) je pripremljen i otopljen u 5 mL MeOH. 104 mg A0Arg-inzulina (0,017 mmol) je otopljeno u 10 mL 1:1 PBS pufer/CH3CN i namješteno na pH 11 sa 5M KOH otopinom. 0,52 mL Boc-Arg(Boc)2-NHS estera (0,052 mmol) dodano je u otopinu inzulina. pH je snižen na približno 9, a zatim odmah vraćen natrag na 11 sa 5M KOH otopinom.

Reakcija se odvijala tijekom 30 min na sobnoj temperaturi, nakon čega je slijedilo zakiseljavanje sa 200 μL octene kiseline. Glavni je pik prikazan analitičkim HPLC postupkom (kao što je prikazano iznad u Primjeru 1) sa ispravnim MW za mono-acilirani proizvod kao što je određeno LC-MS postupkom. Uzorak je direktno pročišćen reverzno-faznim HPLC postupkom na Vydac C18 koloni, kao što je iznad opisano, uz dvo-linearni AB gradijent od 0 do 18% B preko 15 min iza kojeg slijedi 18 do 100% B preko 160 min. Sastavljeni pročišćeni materijal je liofiliziran tako da daje oko 61 mg. Liofilizirani uzorak je otopljen u 10 mL TFA i ostavljen da stoji oko 30 min, a tada je koncentriran do gotovo suhog te ponovno otopljen u 20 mL 10:90 CH3CN:H2O. Uzorak je tada podvrgnut konačnom reverzno-faznom čišćenju kao što je to opisano iznad u Primjeru 1. Konačna liofilizirana masa bila je 31 mg, što odgovara općem rezultatu od približno 30%.

PRIMJER 3

Acilacija rekombinantnog humanog inzulina sa Boc-Arg(Pbf)Arg(Pbf)-NHS esterom u voda/DMF kod stvaranja A-1ArgA0Arg- inzulina

Boc-Arg(Pbf)Arg(Pbf)-NHS ester je pripremljen od po 0,2 mmol Boc-Arg(Pbf)Arg(Pbf)-OH, NHS, i dicikloheksilkarbodiimida (DCC) miješanih u diklormetanu 60 min. Uzorak je zatim filtriran, uparen do suhog i ponovno otopljen u 4 mL DMF. Rekombinantni humani inzulin-Zn kristali (320 mg; 0,055mmol) su otopljeni u 20 mL 1:1 DMF:PBS puferu. Dodano je 50 μL 5M KOH kako bi se otopili kristali kod pH 10. Zatim je pH namješten na 8,2 sa 5M fosfornom kiselinom te je dodano 3 mL otopine Boc-Arg(Pbf)Arg(Pbf)-NHS estera (0,15 mmol). Nakon miješanja kroz približno 1 h, analitička HPLC postupak (provedena kao i u Primjeru 1) pokazala je dva pika koja odgovaraju monoaciliranim produktima koji su potvrđeni i LC-MS postupkom. Dva su pika prisutna u omjeru 70:30. Subsekventna LC-MS analiza S. aureus V8 proteaze pokazuje da više prisutan pik odgovara acilaciji A-lanca N krajeva, a manji pik sadrži smjesu vrsta koje su acilirane na N-krjevima B-lanca ili amin strani lanca od B29:Lys. Čišćenje na Vydac C18 koloni, kao u Primjeru 1, daje 49 mg zaštićenog A-lanca aciliranog produkta. Taj materijal postaje nezaštićen sa smjesom od 10 mL 94:2:2:2 TFA:anisol:MeOH:triizopropilsilan (TIPS) kroz 1 h na sobnoj temperaturi.

Smjesa je tada koncentrirana do približno suhog, te ponovno otapana u 6 mL 20:80 CH3CN:H2O, što je dva puta ekstrahirano s po 10 mL dietil etera. Konačni reverzno-fazni HPLC postupak čišćenja (kao u Primjeru 1) odgovara od približno 10% A-1ArgA0Arg-inzulina.

PRIMJER 4

Acilacija rekombinantnog humanog inzulina sa Boc-Arg(Pbf)Arg(Pbf)-NHS esterom u voda/DMF kod stvaranja B-1ArgB0Arg- inzulina

S obzirom na monoacilirane produkte na N kraju B-lanca ili amin strani lanca B29Lys (vidi primjer 3 iznad), rekombinantni humani inzulin je prvo zaštićen s tert-butiloksikarbonil (Boc) skupinama na N kraju A-lanca i amin strani lanca B29Lys. Rekombinantni humani inzulin (320 mg) je otopljen u 20 mL 1:1 CH3CN:PBS puferu, a pH je namješen na 10,6. Dodan je di-tert-butil dikarbonat (2,5 ekvivalenata) ((Boc)2O) (55 mg u 270 μL CH3CN). Nakon 30 min, pH je snižen na približno 8,7. Zatim je pH namješen natrag na približno 11 s 5M KOH, a reakcija se zatim odvijala daljnja 2,5 h. LC-MS analiza je na tom stupnju pokazala prisustvo tri glavna produkta s masama mono-, di- i tri-Boc derivata.

Površine pikova utvrđenih HPLC postupkom potvrdile su mono-, di-, i tri-Boc derivata u približnom odnosu 15:60:25. Čišćenje je provedeno na prethodno pripremljenoj C18 koloni kao u Primjeru 1 s tro-faznim linearnim AB gradijentom s: (1) 0 do 20 % B u vremenu 0 do 20 min; (2) 20 do 25 % B u vremenu 20 do 30 min; i (3) 25 do 75 % B u vremenu 30 do 230 min. Dobivena količina di-Boc derivatiziranog produkta (Boc2-inzulina) nakon liofilizacije je 82 mg. LC-MS analiza S. aureus V8 proteaze konkluzivno je dokazala da produkt sadrži Boc skupine na N kraju A-lanca i B29:Lys strani lanca.

82 mg Boc2-inzulina (0,014 mmol) je otopljeno u 10 mL 1:1 DMF:PBS pufera, a pH je namješen na približno 8.

Boc-Arg(Pbf)Arg(Pbf)-NHS ester je pripravljen kao iznad u Primjeru 3 i otopljen kod koncentracije 0,05 mmol/mL u DMF. 1,4 mL otopine NHS estera (0,07 mmol) je dodano Boc2-inzulinu i ostavljeno da reagira kroz 1 h. Zatim je dodano 0,6 mL otopine Boc-Arg(Pbf)Arg(Pbf)-NHS estera (0,03 mmol) i reakcija je nastavljena kroz slijedeći sat. Produkt je analiziran analitičkim HPLC postupkom kao u Primjeru 1 uz linearni AB gradijent od 25 do 100% B kroz 25 min, gdje je A = 0,05% TFA/H2O i B = 0,05% TFA/CH3CN uz protok 1 mL/min. Nađen je pik s određenim MW Boc-Arg(Pbf)Arg(Pbf)-Boc2-inzulina.

Čišćenje je provedeno na prethodno pripremljenoj Vydac C18 koloni kao u Primjeru 1 s tro-faznim linearnim AB gradijentom s: (1) 0 do 25 % B u vremenu 0 do 20 min; (2) 25 do 40 % B u vremenu 20 do 40 min; i (3) 40 do 100 % B u vremenu 40 do 100 min. Dobivena količina potpuno zaštićenog produkta nakon liofilizacije je 36 mg. Materijal je tretiran 1 h na sobnoj temperaturi s 10 mL 94:2:2:2 TFA:anisol:MeOH:TIPS da bi se dobio potpuno nezaštićeni produkt. Smjesa je koncentrirana do približno suhog te ponovno otopljena u 10 mL 10:90 CH3CN:H2O, koji je dva puta ekstrahiran s 15 mL dietil etera. Konačnim čišćenjem reverzno-faznim HPLC postupkom (kao u Primjeru 1) dobiveno je 24 mg B-1ArgB0Arg-inzulina, što odgovara općem rezultatu od približno 8%.

PRIMJER 5

Acilacija A0Arg-inzulina sa Boc-Arg(Pbf)Arg(Pbf)-NHS esterom u voda/CH3CN kod stvaranja A0ArgB0Arg- inzulina

Boc-Arg(Pbf)Arg(Pbf)-NHS ester (0,5 mmol) je pripremljen kao u Primjeru 3 i otopljen u 4 mL MeOH. A0Arg-inzulin (320 mg, 0,054 mmol) je otopljen u 40 mL 1:1 CH3CN:PBS puferu kod pH 10. Zatim je pH snižen na 7. Otopina se počela zamućivati s obzirom da su proteini bili blizu svoje pI od 6,3. Dodano je pola otopine Boc-Arg(Pbf)Arg(Pbf)-NHS estera (0,25 mmol; 4,7 ekviv.) i otopina je držana u ultrazvučnoj kupelji 15 min, a tada miješana 75 min. HPLC postupkom utvrđena su dva pika, što je potvrđeno i LC-MS postupkom za monoacilirane produkte, prisutne u omjeru od 85:15. Uzorak je zakiseljen sa 100 μL TFA, a zatim razrijeđen s 20 mL H2O. Reverzno-fazno čišćenej je provedeno kao u Primjeru 2, a nakon liofilizacije je dobiveno 55 mg mono-aciliranog produkta. Peptidi su postali nezaštićeni uz TFA koktel, opisan u Primjeru 3, za 2 h, upareni do približno suhog, ponovno otopljeni u 20 mL 10:90 CH3CN:H2O i ekstrahirani s 20 mL heksana. Konačnim čišćenjem reverzno-faznim HPLC postupkom, kao u Primjeru 1, dobiveno je 38 mg produkta (odgovara općem rezultatu od 12%). Kasnije je potvrđeno da je to željeni A0ArgB-1ArgB0Arg- inzulin.

PRIMJER 6

Acilacija rekombinantnog humanog inzulina sa Boc-Arg(Pbf)Arg(Pbf)-NHS esterom u voda/CH3CN kod stvaranja A0ArgB0ArgB29Lys-Nε-Arg-inzulina

Rekombinantni humani inzulin-cink kristali (307 mg; 0,053 mmol) su otopljeni u 30 mL 1:1 CH3CN:PBS puferu. Dodana je otopina 5M KOH (50 μL) kako bi se rastopili kristali kod pH 10. pH je tada snižen na približno 7,5 s 5M fosfornom kiselinom. Boc-Arg(Pbf)Arg(Pbf)-NHS ester (1 mmol) je pripremljen kao u Primjeru 1 i otopljen u 4 mL MeOH. 2 mL otopine Boc-Arg(Boc)2-NHS estera (0,5 mmol) dodano je u otopinu inzulina a dobivena smjesa je miješana na sobnoj temperaturi tijekom 2 h. Zatim je pH snižen na približno 6,6. Dodatkom 50 μL 5M otopine KOH pH je ponovno namješten na 7,2.

Preostali Boc-Arg(Pbf)Arg(Pbf)-NHS ester je dodan u smjesu inzulina i reakcija je nastavljena daljnja 3 h. Smjesa je zatim zakiseljena s 100 μL TFA, razrijeđena s 30 mL vode te liofilizirana preko noći. Liofilizirani materijal od oko 1,07 g, uz prisustvo acilirajućeg reagensa i soli PBS pufera, otopljen je u 20 mL TFA i ostavljen na sobnoj temperaturi kroz 1,5 h kako bi se dobio nezaštićeni produkt. Smjesa je zatim uparena do gotovo suhog na rotacionom evaporatoru te ponovno otopljena u 20 mL 1:9 CH3CN:H2O.

Uzorak je analiziran analitički reverzno-faznim HPLC postupkom kao u Primjeru 1 i dobiven je sličan kromatografski profil s glavnim pikom tri-aciliranog produkta, te manjim količinama tetra-aciliranih i di-aciliranih inzulina koji se, u pravilu, eluiraju nešto prije i nešto poslije glavnog pika. Prosječno se oko 70% materijala pojavljuju kao tri-acilirane vrste (kao što je također uočeno u Primjeru 1).

"Sirov" acilirani materijal je pročišćen kationsko izmjenjivačkom kromatografijom kao u Primjeru 1. Sastavljeni pročišćeni tri-acilirani inzulin je koncentriran od približno 96 mL do 75 mL, natrag razrijeđen do 100 mL s H2O, stavljen na prethodno pripremljenu Vydac C18 kolonu te pročišćen kao u Primjeru 1. Sastavljeni pročišćeni materijal je liofiliziran tako da daje 96 mg (opći rezultat bio je približno 31%).

PRIMJER 7

Acilacija A21Gly-inzulina sa Boc-Arg(Boc)2-NHS esterom u H2O/CH3CN kod stvaranja A0ArgB0ArgB29Lys-Nε-ArgA21Gly-inzulina

Liofilizirani A21Gly-inzulin (65 mg; 0,011 mmol) je otopljen u 8 mL 1:1 CH3CN:PBS-puferu. pH je namješten na 7,5 sa 5M otopinom KOH. Boc-Arg(Boc)2-NHS ester (0,4 mmol) je pripremljen kao u Primjeru 1 i otopljen u 2 mL MeOH. Otopina Boc-Arg(Boc)2-NHS estera (1 mL, 0,2 mmol; 17 ekvivalenata) je dodano u otopinu A21:G-inzulina, a dobivena smjesa je miješana na sobnoj temperaturi kroz 3 h. pH je zatim snižen na približno 6,4. Dodatkom 20 μL 5M otopine KOH pH je natrag povećan na 7,5. Ostatak 0,2 mmol Boc-Arg(Boc)2-NHS estera je dodano u smjesu inzulina i reakcija je nastavljena dodatna 3 h. Smjesa je tada zakiseljena s 50 μL TFA, razrijeđena s 10 mL vode i liofilizirana preko noći. Liofilizirani materijal je, uz prisustvo acilirajućeg reagensa i soli PBS pufera, otopljen u 20 mL TFA i ostavljen na sobnoj temperaturi kroz 1 h kako bi se dobio nezaštićeni produkt. Smjesa je zatim uparena do gotovo suhog na rotacionom evaporatoru te ponovno otopljena u 20 mL 1:9 CH3CN:H2O, a zatim ekstrahirana s 20 mL heksana. Uzorak je analiziran analitički reverzno-faznim HPLC postupkom kao u Primjeru 1 i dobiven je sličan kromatografski profil s glavnim pikom tri-aciliranog produkta, te manjim količinama tetra-aciliranih i di-aciliranih inzulina koji se, u pravilu, eluiraju nešto prije i nešto poslije glavnog pika. U ovim kromatografskim uvjetima prosječno se oko 60-70% materijala pojavljuju kao željeni tri-acilirane oblici.

"Sirovi" acilirani materijal je pročišćen kationsko izmjenjivačkom kromatografijom kao u Primjeru 1. Sastavljeni pročišćeni tri-acilirani inzulin je koncentriran od približno 96 mL do 75 mL, natrag razrijeđen do 100 mL s H2O, stavljen na prethodno polu-pripremljenu Vydac C18 kolonu (10 mm i.d. × 250 mm). Uzorak je eluiran uz protok od 4 mL/min uz dvo-fazni linearni AB gradijent od 0 do 25% B kroz 15 min, iza čega slijedi 25 do 75% B kroz 100 min, gdje je A = 0,05% TFA/H2O, a B = 0,05% TFA/CH3CN. Pročišćeni materijal je liofiliziran tako da daje 21 mg (opći rezultat bio je približno 32%).

PRIMJER 8

Acilacija inzulina sa Boc-Lys(Boc)-NHS esterom u voda/CH3CN kod stvaranja A0LysB0LysB29Lys-Nε-Lys-inzulina te gvanidilacija s N,N'-bis-Boc-1-gvanilpirazol(Boc2-gvanilpirazol) do A0gHRB0gHRB29Lys-Nε-gHR-inzulina

"gHR" se odnosi na alfa-gvanidinil homoarginin. Rekombinantni humani-Zn kristali (300 mg, 0,052 mmol) su otopljeni u 20 mL CH3CN:PBS puferu 1:1 kod pH 10, a zatim je pH namješten na približno 7. Dodano je 10 ekvivalenata Boc-Lys(Boc)-NHS estera (230 mg u 2 mL CH3CN), a otopina je miješana na sobnoj temperaturi kroz 2 h. Nakon toga, dodano je dodatnih 230 mg Boc-Lys(Boc)-NHS estera i reakcija je nastavljena daljnja 2,5 h. LC-MS analiza je pokazala veliku količinu tri-aciliranih vrsta i manje količine di-aciliranih vrsta. Smjesa je razrijeđena do 50 mL s H2O te liofilizirana. Nakon dodatka 20 ml TFA i reakcije kroz 1 h, LC-MS analizom je također utvrđeno oko 70% inzulina u tri-aciliranom obliku, zatim oko 10% tetra-aciliranih produkata koji se eluiraju nešto ranije te 20% di-aciliranih produkata koji se eluiraju nešto kasnije od glavnog produkta. Uzorak je uparen do približno suhog, ponovno otopljen u 30 mL 30:70 CH3CN:H2O, razdijeljen na dva jednaka dijela, te liofiliziran. Jedan od liofiliziranih dijelova (0,026 mmol) je otopljen u 10 mL MeOH:H2O 9:1, i dodano je 0,5 mL trietilamina. pH je bio 9,3. Dodan je Boc2-gvanilpirazol (160 mg, 0,52 mmol) i ostavljeno je da reakcija traje 1 h. Zatim je dodano dodatnih 160 mg Boc2-gvanilpirazola i reakcija je nastavljena kroz slijedeći sat. Nakon toga, LC-MS analizom je utvrđena prisutnost produkata s po jednom do četiri dodane Boc2-gvanilne skupine.

Dodano je dodatnih 800 mg Boc2-gvanilpirazola (2,6 mmol) i reakcija je nastavljena slijedeća 4 h. Ukupno je dodano 3,6 mmol Boc2-gvanilpirazola, manje od količine za koju se očekuje da će reagirati s amino skupinama prekomjerno dodanog lizina u početnom koraku acilacije (1 mmol), što daje 2,6 mmola pogodnog za reakciju s triLys-inzulinom (približno 15 ekviv, reagensa po amino grupi).

Na kraju reakcijskog razdoblja od 6h, uzorak je koncentriran na rotacionom evaporatoru do približno suhog, zatim ponovno otopljen u 10 mL CH3CN:H2O 60:40, i liofiliziran. Liofiliziran uzorak je tretiran s 20 mL TFA kroz 2 h kako bi se dobio nezaštićeni produkt, koncentriran do suhog, te ponovno otopljen u 20 mL 15:85 CH3CN:H2O. Nakon toga, LC-MS analiza je pokazala glavni pik (približno 60% materijala) s očekivanim heksa-gvanidiliranim produktom te manjim količinama penta-gvanidiliranog produkta.

Čišćenje kationsko izmjenjivačkom kromatografijom je provedeno kao u Primjeru 1 uz protok od 4 mL i 8 mL frakcija, te različiti linearni AB gradijent od 25 do 70% B kroz 100 min. Frakcije (88 mL ukupnog volumena) su koncentrirane na rotacionom rotavaporu do približno 65 mL, a zatim ponovo razrijeđene do 90 mL s H2O.Uzorak je zatim konačno pročišćen RP-HPLC postupkom kao u Primjeru 1 tako da daje 43 mg konačnog produkta (opći rezultat bio je približno 29%).

PRIMJER 9

Acilacija rekombinantnog humanog inzulina sa Boc-Lys(tfa)-NHS esterom u voda/CH3CN kod stvaranja A0LysB0LysB29Lys-Nε-Lys-inzulina

Rekombinantni humani inzulin-Zn kristali (200 mg, 0,034 mmol) su otopljeni u 10 mL 1:1 CH3CN:H2O kod pH 10, a zatim je pH namješten na približno 7 sa 6 M fosfornom kiselinom. Boc-Lys(tfa)-NHS ester (1 mmol) je pripremljen od Boc-Lys(tfa)-OH, NHS, i DCC kao u Primjeru 1 te otopljen u 10 mL MeOH. Otopini inzulina dodano je 1,7 mL otopine Boc-Lys(tfa)-NHS estera (0,17 mmol; 5 ekvivalenata). Smjesa je puštena da reagira kroz 75 min, a zatim je zakiseljena s 0,5 mL TFA i razrijeđena do 30 mL. Analitički postupci, HPLC i LC-MS, potvrdile su prisustvo triju monoaciliranih pikova, dvaju diaciliranih produkata i jednog triaciliranog produkta.

Čišćenje reverzno-faznim HPLC postupkom, kao u Primjeru 2, te liofilizacija odijeljenih vrsta dovelo je do slijedećih zaštićenih produkata: 33 mg A0LysB0LysB29Lys-Nε-Lys-inzulina; 36 mg A0LysB0Lys-inzulina; 23 mg B0LysB29Lys-Nε-Lys-inzulina; 12 mg A0Lys-inzulina; i 31 mg B0Lys-inzulina.

Protuzaštita je provedena u dva koraka. Prvo, uklanjanje Boc skupina od lizin alfa-amino skupina je provedeno tako da je svaki od 5 uzoraka tretiran s 5 mL TFA tijekom 30 min. Otopina je tada uparena do gotovo suhog, a ostatak TFA je uklonjen propuhivanjem dušika iznad uzorka. Zatim su TFA skupine uklonjene od lizin ε-amino skupina dodatkom 6 mL 15% NH4OH/H2O (v:v) te ostavljanjem uzorka na sobnoj temperaturi 3-4 h. Uzorci su tada razrijeđeni do 40 mL s H2O i zakiseljeni s octenom kiselinom (1,5 mL) do pH 4. Uzorci su podvrgnuti konačnom čišćenju kao u Primjeru 1 te je dobiveno: 14 mg A0LysB0LysB29Lys-Nε-Lys-inzulina; 17 mg A0LysB0Lys-inzulina; 8 mg B0LysB29Lys-Nε-Lys-inzulina; 5 mg A0Lys-inzulina; i 16 mg B0Lys-inzulina.

PRIMJER 10

Acilacija A21Gly-inzulina sa Boc-Arg(Pbf)-NHS esterom u voda/CH3CN kod stvaranja A0ArgA21GlyB29Lys-Nε-Arg-inzulina

A21Gly-inzulin (230 mg; 0,040 mmol) je otopljen u 24 mL 1:1 CH3CN:voda. Dodano je 200 mg NaH2PO4×H2O.

5 M otopina KOH (približno 50 μL) je dodana kako bi se pH namjestio na 10,5. Boc-Arg(Pbf)-NHS ester je pripremljen od po 0,4 mmol Boc-Arg(Pbf)-OH, N-hidroksisukcinimida (NHS), i dicikloheksilkarbodiimida (DCC) koji su zajedno izmiješani u diklormetanu (DCM) tijekom 30 minuta. Smjesa je zatim filtrirana i koncentrirana do suhog na rotacionom evaporatoru. Dobiveno je 0,4 mmola Boc-Arg(Pbf)-NHS estera koji je zatim otopljen u 4 mL MeOH. 1 mL otopine Boc-Arg(Pbf)-NHS estera (0,1 mmol; 2,5 ekvivalenata) dodano je otopini inzulina i sve je miješano 1 h na sobnoj temperaturi. Tada je pH snižen na približno 9,8. Sa 6 M H3PO4 pH je dalje snižen do 9,0. Otopini inzulina dodan je drugi 1 mL otopine Boc-Arg(Pbf)-NHS estera (0,1 mmol; 2,5 ekvivalenata) i smjesa je miješana na sobnoj temperaturi drugih sat vremena. Nakon toga, prikazano je reverzno-faznim HPLC postupkom (provedenom na Zorbax Eclipse XDB-C8 4,6 mm i.d. × 15 cm koloni s linearnim AB gradijentom od 10 do 100% B kroz 15 min, gdje je A = 0,05% TFA/H2O, a B = 0,05% TFA u 60:40 CH3CN:voda uz protok od 1 mL/min) da se smjesa sastoji od primarnih, monoaciliranih i diaciliranih produkata u približnom odnosu 57:43. Drugih 0,5 mL otopine Boc-Arg(Pbf)-NHS estera (0,05 mmol; 1,25 ekvivalenata) dodano je otopini inzulina i smjesa je miješana na sobnoj temperaturi 5 min. Nakon drugog dodavanja 0,5 mL otopine Boc-Arg(Pbf)-NHS estera, smjesa je miješana 10 min, a zatim zakiseljena s trifluorooctenom kiselinom (TFA) do pH 3. Otopina je razrijeđena s 20 mL 50:50 CH3CN:voda i filtrirana. Konačna smjesa sadržavala je uglavnom monoacilirane i diacilirane produkte u omjeru 30:70, što je određeno prema HPLC površinama pikova od UV detekcije na 220 nm.

"Sirovi" acilirani materijal je pročišćen reverzno-faznim HPLC postupkom na prethodno pripremljenoj Vydac C18 2,2 cm i.d. × 25 cm koloni. Uzorak je eluiran uz protok od 12 mL/min uz dvo-fazni linearni AB gradijent od: (a) 0 do 18% B kroz 15 min, iza čega slijedi (b) 18 do 68% B kroz 100 min, gdje je A = 0,05% TFA/H2O, a B = 0,05% TFA/CH3CN. Frakcije koje su sadržavale diacilirani inzulin, su udružene i liofilizirane pa je dobiveno 134 mg zaštićenog produkta. Materijal je tretiran 1,5 h na sobnoj temperaturi s 20 mL 91:3:3:3 TFA:anisol:MeOH:TIPS da bi se dobio potpuno nezaštićeni produkt, smjesa je koncentrirana do približno suhog na rotacionom evaporatoru te ponovno otopljena u 25 mL 10:90 CH3CN:H2O, koji je dva puta ekstrahiran s 20 mL dietil etera. Konačno čišćenje reverzno-faznim HPLC postupkom provedeno je na istoj Vydac C18 koloni kao što je opisano iznad, uz protok od 12 mL/min sa dvo-faznim linearnim AB gradijentom od: (a) 0 do 15% B kroz 15 min, iza čega slijedi (b) 15 do 55% B kroz 100 min, gdje je A = 0,05% TFA/H2O, a B = 0,05% TFA/CH3CN. Time je dobiveno 77 mg A0ArgA21GlyB29Lys-Nε-Arg-inzulina, što odgovara općem rezultatu od približno 33%.

PRIMJER 11

Acilacija A21Gly-inzulina sa (1) Boc-Arg(Pbf)-NHS esterom i (2) Boc-Lys(Boc-Arg(Pbf)))-NHS esterom u voda/CH3CN kod stvaranja A0Lys-Nε-ArgB29Lys-Nε-ArgA21Gly-inzulina

Boc-Lys(Boc-Arg(Pbf)))-OH je sintetiziran na C1-(2'-kloro)tritil polistirenskom polimeru. Polimer sadrži višak Boc-Lys(Fmoc)-OH u smjesi 90:10 dimetilformamida(DMF):diizopropiletilamina (DIEA). Fmoc skupina je uklonjena sa lizin ε-amino skupine pomoću 20%-tne otopine piperidina u DMF. Α-karboksilat od Fmoc-Arg(Pbf)-OH je tada spojen sa slobodnim skupinama pomoću aktivacije s O-benzotriazol-N,N,N',N-tetrametiluronijevim-heksafluoro-fosfatom (HBTU) i DIEA u omjeru aminokiselina:HBTU:DIEA 1:0,95:3 u DMF otopini. Fmoc skupina je uklonjena sa ε-amino skupine Arg pomoću 20%-tne otopine piperidina u DMF, iza čega slijedi spajanje slobodnih amina s di-tert-butil-dikarbonatom (Boc-anhidrid) i DIEA u omjeru 1:2 u DMF otopini. Komponenta je izdvojena od polimera pomoću dva tretmana s po 30 mL 1:2 heksafluoroizopropanola (HFIP):diklorometana (DCM) i to svakog po 40 min. Dobivena otopina je filtrirana i uparena na rotacionom evaporatoru. Boc-Arg(Pbf)-NHS ester i Boc-Lys(Boc-Arg(Pbf))-NHS ester su pripremljeni kao što je opisano u Primjeru 1, miješanjem jednakih dijelova NHS i DCC sa svakom pojedinom kiselinom u DCM.

5 M otopina KOH (približno 50 μL) je dodana kako bi se pH namjestio na 10,5. Boc-Arg(Pbf)-NHS ester (0,4 mmol) je otopljen u 4 mL MeOH. 1 mL otopine Boc-Arg(Pbf)-NHS estera (0,1 mmol; 2,5 ekvivalenata) dodano je otopini inzulina i sve je miješano 40 min na sobnoj temperaturi. Zatim je smjesa prikazana reverzno-faznim HPLC postupkom (provedenom na Zorbax Eclipse XDB-C8 4,6 mm i.d. × 15 cm koloni uz linearni AB gradijent od 10 do 100% B kroz 15 min, gdje je A = 0,05% TFA/H2O, a B = 0,05% TFA u 60:40 CH3CN:H2O, uz protok od 1 mL/min) kako bi se kompromitirao početni materijal i monoacilirani produkt u omjeru 40:60. Drugih 0,6 mL otopine Boc-Arg(Pbf)-NHS estera (0,06 mmol; 1,5 ekvivalenata) je dodano u otopinu inzulina i smjesa je miješana na sobnoj temperaturi daljnjih 15 min, gdje je inzulin primarno preveden u monoacilirane vrste. Na toj je točci pH snižen s 10,2 na 9,0 uz dodatak 6 M H3PO4. Boc-Lys(Boc-Arg(Pbf))-NHS ester (0,12 mmol) je otopljen u 2 mL MeOH i dodan otopini inzulina. Smjesa je miješana na sobnoj temperaturi 30 min, a zatim je razrjeđena s 20 mL 50:50 CH3CN:voda, zakiseljena s 300 μL TFA te filtrirana. Glavni pik koji je uočen reverno-faznim HPLC postupkom, odgovara produktu koji je derivatiziran s Boc-Arg(Pbf) i s Boc-Lys(Boc-Arg(Pbf)) što je i potvrđeno HPLC-maseno spektralnom analizom.

"Sirovi" acilirani materijal je pročišćen reverzno-faznim HPLC postupkom na prethodno pripremljenoj Vydac C18 2,2 cm i.d. × 25 cm koloni. Uzorak je eluiran uz protok od 13 mL/min uz dvo-fazni linearni AB gradijent od: (a) 0 do 30% B kroz 20 min, iza čega slijedi (b) 30 do 80% B kroz 100 min, gdje je A = 0,05% TFA/H2O, a B = 0,05% TFA/CH3CN. Frakcije koje su sadržavale diacilirani inzulin, su udružene i liofilizirane pa je dobiveno 105 mg zaštićenog produkta. Materijal je tretiran 2 h na sobnoj temperaturi s 20 mL 91:3:3:3 TFA:anisol:MeOH:triizopropilsilan (TIPS) da bi se dobio nezaštićeni produkt, zatim je smjesa koncentrirana do približno suhog te ponovno otopljena u 25 mL 10:90 CH3CN:H2O, koji je tri puta ekstrahiran s 20 mL dietil etera. Konačno čišćenje reverzno-faznim HPLC postupkom provedeno je na istoj Vydac C18 koloni kao što je opisano iznad, uz protok od 12 mL/min sa dvo-faznim linearnim AB gradijentom od: (a) 0 do 15% B kroz 15 min, iza čega slijedi (b) 15 do 55% B kroz 100 min, gdje je A = 0,05% TFA/H2O, a B = 0,05% TFA/CH3CN. Time je dobiveno 60 mg A0Lys-Nε-ArgB29Lys-Nε-ArgA21Gly-inzulina, što odgovara općem rezultatu od približno 25%.

PRIMJER 12

Priprema A0Lys-Nε-ArgA21GlyB29Lys-Nε-Arg-inzulina

Plazmid koji sadrži sekvence za kodiranje analoga humanog proinzulina, A21GlyC64ArgC65Lys-humanog proinzulina, izražen je u E. coli. Analog proinzulina je pročišćen i sklopljen, a zatim aciliran kako slijedi. Boc-Arg(Boc)2-NHS ester je pripremljen od po 0,4 mmol Boc-Arg(Boc)2-OH, N-hidroksisukciniimida (NHS), i dicikloheksilkarbodiimida (DCC) koji su zajedno izmiješani u 3 mL diklormetana (DCM) tijekom 40 minuta. Smjesa je zatim filtrirana i koncentrirana do suhog na rotacionom evaporatoru. Dobiveno je 0,4 mmola Boc-Arg(Boc)2-NHS estera koji je zatim otopljen u 4 mL MeOH.

Približno 108 mg A21GlyC64ArgC65Lys-humanog proinzulina u 180 mL 10 mM otopine HCl je razdijeljeno na dva jednaka dijela i liofilizirano. Jedan od proinzulinskih dijelova je ponovno otopljen u 12 mL 50/50 voda/CH3CN. Dodan je NaH2PO4 (80 mg) kako bi koncentracija PO4 bila približno 50 mM. pH je namješten na 8,2 s 5 M otopinom KOH. Dodan je jedan mL Boc-Arg(Boc)2-NHS estera (0,1 mmol; približno 20 ekvivalenata) i smjesa je miješana 2,5 h na sobnoj temperaturi, a nakon toga pH je snižen na 7,4. Zatim je pH vraćen natrag na 8,2 i dodan je drugi 1 mL otopine Boc-Arg(Boc)2-NHS estera. Otopina je miješana dodatna 3 h, zatim je razrijeđena vodom do 50 mL, zakiseljena s 200 μL trifluorooctene kiseline (TFA) i liofilizirana. Liofilizirana smjesa je ponovno otopljena u 20 mL 95:5 TFA:voda i ostavljena 1,5 h na sobnoj temperaturi. TFA smjesa je uparena do gotovo suhog na rotacionom evaporatoru, a zatim razrijeđena s 25 mL 10% CH3CN/voda i ekstrahirana dva puta s 20 mL dietil etera. Smjesa je analizirana reverzno-faznim HPLC postupkom na Zorbax Eclipse XDB-C8 4,6 mm i.d. × 15 cm koloni s linearnim AB gradijentom od 10 do 100% B kroz 15 min, gdje je A = 0,05% TFA/H2O, a B = 0,05% TFA u 60:40 CH3CN:voda uz protok od 0,9 mL/min i masenim spec. određivanjem te je utvrđeno da sadrži male količine "prekoaciliranog" produkta gdje su pripojena više od tri očekivana Arg ostatka (na N kraju amina i lizin strani lanca amina B29:Lys i C65:Lys). To je vjerojatno zbog Arg ostataka na stranu lanca fenolnih skupina Tyr, imidazolnih skupina His ili nekih drugih reaktivnih dijelova lanca. pH otopine proinzulina je povećan na 10,5 kroz 30 min, bazno-kataliziranom hidrolizom tih veza, kako bi se smanjila količina "prekoaciliranih" produkata. Nakon 30 min visokog pH, pH je snižen natrag na približno 3 pomoću TFA. Otopina je čuvana na -20°C.

Kemijska modifikacija i pH promjene ponavljaju se drugim dijelom A21GlyC64ArgC65Lys-humanog proinzulina. Konačne otopine A21GlyB29Lys-Nε-ArgC64ArgC65Lys-humanog derivata proinzulina se kombiniraju i liofiliziraju. Čistoća sirovog, nezaštićenog materijala je približno 65%, što je utvrđeno prema površini pika reverzno-faznim HPLC postupkom.

Acilirani derivat proinzulina je obrađen tripsinom i karboksipeptidazom B kako bi se uklonile vodeće sekvence i "C peptidi" od ostataka C31Arg do C64Arg te ostavili netaknuti C65Lys-Nε-Arg i B29Lys-Nε-Arg dijelovi kako bi tvorili derivati A0Lys-Nε-ArgA21GlyB29Lys-Nε-Arg-inzulina. Dobivanje Des-30 produkta inzulina blokirano je modifikacijom na B29Lys. Pročišćeni A0Lys-Nε-ArgA21GlyB29Lys-Nε-Arg-inzulin je korišten u in vitro i u in vivo pokusima, kao što slijedi.

PRIMJER 13

Receptor afiniteta in vitro

Afinitet molekula inzulina za humani inzulinski receptor (IR) bio je mjeren u testu uz uporabu radioaktivno označenog liganda, [125I] inzulin. Membranski receptor humanog inzulina je pripremljen kao P1 membranski receptor 293EBNA stanica. Test je razvijen i validiran na dva načina, filtracijom i SPA (scintillation proximity assay) postupkom sa komparabilnim rezultatima, ali je izvršen na SPA način uz uporabu PVT PEI tretiranih pšeničnih klica aglutinin-vezanih SPA zrna, Tip A (WGA PVT PEI SPA) zrna iz Amersham Pharmacia Biotech.

Radioaktivno označen ligand ([125I] rekombinirani humani inzulin) se priprema ili se nabavlja iz Amersham Pharmacia Biotech, kod specifične aktivnosti 2000 Ci/mmol. Pufer u SPA testu bio je 50 mM Tris-HCl, pH 7,8, 150 mM NaCl, 0,1% BSA. Test se provodi na mikropločama s po 96 mjesta (Costar, #3632) i automatiziran s radioligandima, membranama i SPA zrnima dodanim od Titertec/Plus (ICN Pharmaceuticals).

Reagensi su dodani slijedećim redom:

[image]

Ploče su pokrivene adhezivnim pokrovnicama i trešene 1 min na LabLine Instruments tresilici. Ploče su inkubirane na sobnoj temperaturi (22°C) 12 sati stavljanjem u Wallac Microbeta scintilacijski brojač i podešavanjem vremena na 12 sati. Brojanje je učinjeno za 1 min po jažici na ploči prema protokolu za [125I].

IC50 za svaku molekulu inzulina određen je prema 4-parametarskoj logističkoj nelinearnoj regresijskoj analizi. Rezultati su izraženi kao srednja vrijednost ± SEM. Relativni afinitet je određen usporedbom svake molekule inzulina s kontrolom rekombinantnog humanog inzulina unutar svakog eksperimenta te je izračunat relativni afinitet s obzirom na broj provedenih eksperimenata. Prema tome, usporedba prosječnog IC50 za molekulu inzulina s prosjekom IC50 za inzulin ne daje istu vrijednost.

Afinitet svake molekule inzulina i rekombinantnog humanog inzulina za receptor faktora rasta inzulina (IGF1-R) mjeren je testom gdje se rabe [125I]IGF-1 radioaktivno označeni ligandi. Humani IGF-1 membranski receptor je pripremljen kao P1 membranski receptor 293EBNA stanica. Test je razvijen i validiran na dva načina, filtracijom i SPA (scintillation proximity assay) postupkom sa komparabilnim rezultatima, ali je izvršen na SPA način uz uporabu PVT PEI tretiranih pšeničnih klica aglutinin-vezanih SPA zrna, Tip A (WGA PVT PEI SPA) zrna iz Amersham Pharmacia Biotech.

Radioaktivno označen ligand [125I]IGF-1 rekombinirani humani inzulin) se priprema ili se nabavlja iz Amersham Pharmacia Biotech, kod specifične aktivnosti 2000 Ci/mmol. Pufer u SPA testu bio je 50 mM Tris-HCl, pH 7,8, 150 mM NaCl, 0,1% BSA. Test se provodi na mikropločama s po 96 mjesta (Costar, #3632) i automatiziran s radioligandima, membranama i SPA zrnima dodanim od Titertec/Plus (ICN Pharmaceuticals).

Reagensi su dodani slijedećim redom:

[image]

Ploče su pokrivene adhezivnim pokrovnicama i trešene 1 min na LabLine Instruments tresilici. Ploče su inkubirane na sobnoj temperaturi (22°C) 12 sati stavljanjem u Wallac Microbeta scintilacijski brojač i podešavanjem vremena na 12 sati. Brojanje je učinjeno za 1 min po jažici na ploči uz protokol za [125I].

IC50 za svaku molekulu inzulina određen je prema 4-parametaraskoj logističkoj nelinearnoj regresijskoj analizi. Rezultati su izraženi kao srednja vrijednost ± SEM. Relativni afinitet je određen usporedbom svake molekule inzulina s kontrolom rekombinantnog humanog inzulina unutar svakog eksperimenta te je izračunat relativni afinitet s obzirom na broj provedenih eksperimenata. Prema tome, usporedba prosječnog IC50 za molekulu inzulina s prosjekom IC50 za inzulin ne daje istu vrijednost.

Indeks selektivnosti je izračunat kao omjer IR relativnog afiniteta i IGF-1R relativnog afiniteta. Indeks selektivnosti > 1 upućuje da je veća relativna selektivnost za HIR. Indeks selektivnosti <1 upućuje da je veća relativna selektivnost za IGF-1R.

Tablica 1 ocrtava afinitet receptora inzulina (IR), afinitet receptora inzulin faktora rasta 1 (IGF1-R), i indeks selektivnosti receptora (IR/IGF1-R) za svaku molekulu inzulina i rekombinantni humani inzulin.

[image]

PRIMJER 14

Metabolički potencijal in vitro

Metabolički potencijal (unos glukoze) svake molekule inzulina i rekombinantnog humanog inzulina određeno je testom unosa glukoze pomoću diferenciranih 3T3-L1 adipocita miševa. Nediferencirane 3T3 stanice miševa su stavljene u gustoći 25.000 stanica/jažici u 100 μL medija rasta (DMEM glukoza, w/out L-glutamin, 10% telećeg seruma, 2 mM L-glutamin, 1% otopina antibiotik/antimikotik).

Diferencijacija je započeta 3 dana nakon toga, dodavanjem medija za diferencijaciju: DMEM, glukoza, w/out L-glutamin, 10% FBS, 2mM L-glutamin, 1% otopina antibiotik/antimikotik, 10 mM HEPES, 0,25 mM deksametazon, 0,5 mM 3-izobutil-1-metilksantin(IBMX), 5 mg/ml inzulin. Nakon 48 sati (3. dan), diferencijacijski medij je zamijenjen inzulinom, ali bez IBMX ili deksametazona, a 6. dan stanice su bile izložene diferencijacijskom mediju bez inzulina, IBMX ili deksametazona. Stanice su održavane u FBS mediju koji je mijenjan svaki drugi dan.

Test transporta glukoze proveden je uz uporabu Cytostar T 96 ploča s jažicama. 24 sata prije samog testa, stanice su bile u 100 μL medija koji je sadžavao 0,1% BSA. Na dan testa, medij je uklonjen i dodano je 50 μL testnog pufera: takozvani KRBH ili Krebs-Ringer pufer koji sadrži HEPES, pH 7,4 (118 mM NaCl, 4,8 mM KCl, 1,2 mM MgSO4 × 7 H2O, 1,3 mM CaCl2H2O, 1,2 mM KH2PO4, 15 mM HEPES). Razrijeđenja inzulina su pripremljena u istom puferu s 0,1% BSA, i dodano kao 2X. Slijepa proba je sadržavala KRBH, 0,1% BSA i 20 mM 2X 2-deoksi-D-glukoza, 0,2 μCi/jažici 2-deoksi-D-(U-14C) gukoze i 2 × 10-7 inzulina. Stanice su inkubirane na 37°C kroz 1 sat. Nakon tog razdoblja dodano je 10 μL citohalazina B do konačne koncentracije od 200 μL u KRBH i ploče su pročitane pomoću Microbeta čitača. Relativni afinitet je određen usporedbom svake molekule inzulina s kontrolom rekombinantnog humanog inzulina za svaki pokus i tada je određen prosječni relativni afinitet s obzirom na broj izvršenih pokusa. Prema tome, usporedbom prosječne EC50 vrijednosti za svaku molekulu inzulina i prosječne EC50 vrijednosti za inzulin ne dobije se ista vrijednost.

Tablica 2 ocrtava in vitro metabolički potencijal za svaku molekulu inzulina i za rekombinantni humani inzulin.

[image]

PRIMJER 15

Mitogenost in vitro

Mitogeni potencijal svake molekule inzulina određen je mjerenjem proliferacije humanih epitelnih stanica mliječnih žlijezda (HMEC) u kulturi. HMEC su dobivene od Clonetics Corporation (San Diego, CA) i smrznute. Stanice su održavane u kulturi prema uputama Bio Whittaker. Da bi se stanice održale u kulturi, medij za rast mijenjan je svaki drugi dan, a kulture su nadzirane svakodnevno.

Kao medij za rast rabe se dva proizvoda od Bio Whittaker:

1. Potpun medij MEGM (CC-3051) uključuje: (iznosi pokazuju konačne koncentracije , osim BPE)

10 ng/mL hEGF (humani rekombinantni epidermalni faktor rasta)

5 μg/mL inzulin

0,5 μg/mL hidrokortizon

50 μg/mL gentamicin, 50 ng/mL amfotericin-B

13 mg/nL BPE (Bovine pituitary Extract, goveđi sluzni ekstrakt); i

2. Osnovni medij (MEBM, CC-3151) sa svim dopunama koje su ispod navedene (SingleQuots, CC-3150)

13 mg/mL BPE (Bovine pituitary Extract (CC-4009)) 2 mL

10 μg/mL hEGF (CC-4017) 0,5 mL

5 μg/mL inzulin (CC-4031) 0,5 mL

0,5 mg/mL hidrokortizon (CC-4031) 0,5 mL

50 μg/mL gentamicin, 50 mg/mL amfotericin-B (CC-4081) 0,5 mL.

Za pokus rasta korišten je medij za rast bez 5 μg/mL inzulina i s 0,1% BSA. Test je proveden na Cytostart scintilacijskim mikropločama s 96 jažica (Amersham Pharmacia Biotech, RPNQ0162). Rekombinantni humani inzulin i IGF-1 korišteni su kao kontrole u svakom nizu testova, a rekombinantni humani inzulin je bio na svakoj pokusnoj ploči.

Testovi su provedeni u skladu sa slijedećim protokolom. Prvi dan, HMEC su stavljene u 100 μL medija i to 4000 stanica/jažici. Inzulin u mediju rasta je premješten u stupnjevitim dozama od rekombinantnog humanog inzulina ili neke druge molekule inzulina od 0 do 1000 nM konačne koncentracije. Nakon 4 sata inkubacije, dodano je 0,1 μCi 14C-timidin u 10 μL test medija, a svaka je jažica i ploča očitana nakon 48h i/ili 72h na Trilux-u.

Tipično, maksimalni odgovor rasta bio je 3-4 puta veći nego bazalni. Odgovor između 0 i 100 % jednak je 100 X (odgovor kod koncentracije X – odgovor kod koncentracije nula) podijeljen s (odgovor kod maksimalne koncentracije - odgovor kod koncentracije nula). Koncentracija odgovora određena je nelinearnom regresijom pomoću JMP software-a.

Relativni mitogeni potencijal određen je uspoređivanjem svake molekule inzulina s kontrolom inzulina unutar svakog pokusa, a zatim je izračunat prosječni relativni potencijal u odnosu na broj provedenih pokusa. Prema tome, usporedbom prosječne EC50 vrijednosti za svaku molekulu inzulina i prosječne EC50 vrijednosti za inzulin ne dobije se ista vrijednost.

Tablica 3 ocrtava mitogenost in vitro, mjerenu u vrijeme stanične proliferacije za svaku molekulu inzulina. Podaci u Tablici 3 pokazuju da je svaka molekula inzulina manje mitogena od rekombinantnog humanog inzulina.

[image]

PRIMJER 16

Topivost uz fosfatni pufer

In vitro test taloženja koji je dobar pokazatelj sklonosti produženja djelovanja u uvjetima in vivo, razvijen je kako slijedi. Vodena otopina je namještena na pH 4 i sadržavala je farmaceutsku dozu (100 međunarodnih jedinica) molekule inzulina te 30 μg/mL Zn2+, 2,7 mg/mL m-krezola i 17 mg/mL glicerola, a zatim je neutralizirana fosfatnim puferom (PBF) do 2 međunarodne jedinice i centrifugirana 5 min pri 14.000 rpm i RT. Supernatant je uklonjen, a približno jedna desetina supernatanta je injektirana u analitički sistem Symmetry Shield RP8 RP-HPLC (Waters, Inc.). Površina ispod eluiranog pika je integrirana i uspoređena s površinom pika referentnog standarda, i to rekombinantnog humanog inzulina u 0,1 N HCl. Omjer površina je multipliciran za 100 kako bi se dobio % topivosti u PBS.

U Tablici 4 je prikazana PBS topivost za rekombinantni humani inzulin i za svaku molekulu inzulina.

[image]

PRIMJER 17

Izoelektrična točka

Izoelektrično fokusiranje je elektroforetska tehnika koja odvaja proteine na osnovi njihovih izoelektričnih točaka (pI). pI je pH kod kojeg protein nema naboj i ne miče se u električnom polju. IEF gelovi kreiraju pH gradijent tako da se proteini razdvajaju na osnovi njihove jedinstvene pI točke. Određivanje proteinskih veza može se izvršiti pomoću osjetljivih boja kao Novex Colloidal Coomassie Staining Kit. Alternativno, određivanje se može izvršiti nanošenjem gela na polivinil difluoridnu (PVDF) membranu i uz stajanje u "Ponceau red". pI proteina je određena usporedbom s pI poznatog standarda. IEF standardi proteina su kombinacije proteina s dobro poznatim pI vrijednostima i koje daju jedinstvena obojenja. Drugi postupak određivanja pI je IEF kapilarnom elektroforezom (cIEF). pI je određivana uspoređivanjem s poznatim markerima.

Izoelektrična točka (pI) rekombinantnog humanog inzulina i svake molekule inzulina određena je izoelektričnim fokusiranjem gel elektroforeze uz uporabu Novex IEF gelova kod pH 3-10 što daje pI u omjeru od 3,5 - 8,5. Izoelektrične točke su prikazane u Tablici 5.

[image]

PRIMJER 18

In vivo istraživanje na psima

Pokusi su provedeni s mužjacima i ženkama lovačkih pasa (Marshall farms, North Rose, NY). Na dan pokusa pročišćeni su unutrašnji vaskularni otvori (Access Technologies, Norfolk Medical, Skokie, IL) i životinje su smještene u pokusne kaveze 3'×3'. Psi su pušteni najmanje 15 minuta da se aklimatiziraju na kavez prije nego što im je izvađen uzorak arterijske krvi kako bi se odredila koncentracija inzulina i glukoze (vrijeme = 30 minuta). U to je vrijeme početa i venozna infuzija (0,65 μg/kg/min) cikličkog somatostatima (BACHEM, Torrence, CA) te nastavljena slijedeća 24,5 sata. Trideset minuta nakon početka infuzije (vrijeme = 0) uzet je arterijski uzorak, a zatim je subkutano injektiran pripravak inzulina (2 nmol/kg) s dorzalne strane vrata. U određenim vremenskim razmacima uziman je uzorak arterijske krvi za određivanje koncentracije glukoze i inzulina.

Koncentracije plazma glukoze određivane su uz pomoć postupka glukoza oksidaze u Beckman-ovom analizatoru glukoze II (Beckman Insruments Inc., Brea, CA). Uzorci plazme su spremljeni na -80°C sve do vremena analize inzulina. Koncentracije inzulina su određene uz pomoć komercijalno dostupnih radioimunotestnih kitova koji su osjetljivi na humani inzulin i na molekule inzulina.

A0Lys-Nε-ArgA21GlyB29Lys-Nε-Arg-inzulin i NPH inzulin su bili izloženi određenom vremenu djelovanja. Vrijeme djelovanja izložene otopine A0Lys-Nε-ArgA21GlyB29Lys-Nε-Arg-inzulina usporedivo je s NPH inzulinom.

A0ArgA21GlyB29Lys-Nε-Arg-inzulin i A0Lys-Nε-ArgA21GlyB29Lys-Nε-Arg-inzulin su uspoređeni s izotoničnom otopinom natrijevog klorida i inzulinom glarginom (A21GlyB31ArgB32Arg-inzulin). U oba istraživanja, A0ArgA21GlyB29Lys-Nε-Arg-inzulin, A0Lys-Nε-ArgA21GlyB29Lys-Nε-Arg-inzulin i glargin bili su izloženi duljem vremenu djelovanja u odnosu na kontrolnu izotoničnu otopinu. U prvom istraživanju A0ArgA21GlyB29Lys-Nε-Arg-inzulin i A0Lys-Nε-ArgA21GlyB29Lys-Nε-Arg-inzulin su bili izloženi vremenu djelovanja usporedivim s glarginom. U drugom istraživanju, A0ArgA21GlyB29Lys-Nε-Arg-inzulin i A0Lys-Nε-ArgA21GlyB29Lys-Nε-Arg-inzulin su bili izloženi kraćem vremenu djelovanja od glargina.

PRIMJER 19

In vivo istraživanje na štakorima

Pokusi su provedeni kanilama (femoralnom arterijom i venom), na muškim Sprague Dawley miševima nakon posta preko cijele noći. Ujutro na dan samog pokusa, ispražnjen je sadržaj katetera, krajevi katetera su bili pričvršćeni na nastavke a životinje su premještene u 12''×12'' pokusne kaveze. Nakon 30 minutnog razdoblja aklimatizacije uzet je uzorak arterijske krvi te je iv unešeno sredstvo (izotonična otopina koja sadrži 0,3% štakorovog albumina) ili molekula inzulina (formulacija molekule inzulina razrijeđena u izotoničnoj otopini koja sadrži 0,3% štakorovog albumina; 0,1, 0,2, 0,4, 0,8, ili 1,2 nmol/kg; n=5/doza). Krv je vađena 10, 20, 30, 45 i 60 minuta nakon intravenoznog unosa.

Svi uzorci krvi su skupljani u tube koje su sadržavale dinatrijev EDTA i bile su smještene na ledu. Uzorci su centrifugirani; plazma je skupljana; a koncentracije plazma glukoze su određivane pomoću Monarch Clinical Chemistry Analyzer.

Površine ispod krivulja glukoze (0-30 minuta) izračunate su pomoću trapezoidalnog pravila. Dobivene vrijednosti za različite doze grafički su prikazane pomoću Graphpad Prism. Određena je doza koja odgovara površini glukoze ispod krivulje od 2,45 g min/dL te je korištena za direktnu usporedbu relativnih potencijala inzulina.

U jednom pokusu, procijenjeni potencijal za rekombinantni humani inzulin bio je 0,160 nmol/kg, a 0,158 nmol/kg za A0ArgB0ArgB29Lys-Nε-Arg-inzulin.

U drugom pokusu, procijenjeni potencijal za rekombinantni humani inzulin bio je 0,162 nmol/kg, a 0,200 nmol/kg za A0ArgA21GlyB0ArgB29Lys-Nε-Arg-inzulin.

U drugom pak pokusu, procijenjeni potencijal za rekombinantni humani inzulin bio je 0,207 nmol/kg, za A0ArgA21SerB0ArgB29Lys-Nε-Arg-inzulin 0,226 nmol/kg, a za A0ArgA21GlyB29Lys-Nε-Arg-inzulin 0,268 nmol/kg.

U drugom opet pokusu, procijenjeni potencijal za rekombinantni humani inzulin bio je 0,317 nmol/kg, a za A0Lys-Nε-ArgA21GlyB29Lys-Nε-Arg-inzulin 0,320 nmol/kg.

U drugom pak pokusu, procijenjeni potencijal za rekombinantni humani inzulin bio je 0,217 nmol/kg, za A0Lys-Nε-ArgA21GlyB29Lys-Nε-Arg-inzulin 0,275 nmol/kg, a za A0ArgA21GlyB29Lys-Nε-Arg-inzulin 0,258 nmol/kg.

PRIMJER 20

A0ArgB0Arg-inzulin-cink kristali i protamin-cink kristali

Osnovna otopina A pripremljena je otapanjem 16,1 g sintetskog glicerina, 0,73 g fenola i 1,6 mL m-krezola u odgovarajućih 350 mL sterilne vode. Nakon otapanja, sterilna voda je dodana do konačne tezine otopine od 503 g. Osnovna otopina protamin sulfata pripremljena je otapanjem 0,0366 g protamin sulfata u 10 mL sterilne vode. Osnovna otopina A0ArgB0Arg-inzulina je pripremljena otapanjem 0,0121 g A0ArgB0Arg-inzulina u 1,28 mL osnovne otopine A. Osnovna otopina cinkovog oksida je pripremljena razrijeđivanjem 1 mL 25 mg/mL otopine cinkovog oksida do konačnog volumena od 25 mL, kako bi se dobila konačna koncentracija cinkovog oksida od 1 mg/mL. Osnovna otopina natrijevog fosfata je pripremljena otapanjem 0,0577 g natrijevog fosfata u 15 mL sterilne vode. Otopina natrijevog klorida je pripremljena otapanjem 1,1607 g natrijeva klorida u 10 mL sterilne vode.

Za pokuse s A0ArgB0Arg-inzulin-cink kristalom pomiješani su, kod kiselog pH, A0ArgB0Arg-inzulin, cinkov oksid i osnovna otopina A. Natrijev klorid je također dodan nekim od uzoraka. Svi su uzorci udruženi do konačnog volumena od 0,1 mL. Dodano je 0,1 ml osnovne otopine natrijevog fosfata pa je dobiven talog. Konačni pH bio je namješten na između 7,4 i 9,3. A0ArgB0Arg-inzulin protamin-cink kristali pripremljeni su na isti način samo što je protamin sulfat također kombiniran s A0ArgB0Arg-inzulinom, cinkovim oksidom i osnovnom otopinom A.

Svaki je uzorak tada razdvojen na dvije polovice. Jedan je uzorak inkubiran na 30 ̊C, a drugi je ostavljen na sobnoj temperaturi. Uvjeti testa prikazani su u Tablici 6, a kristali su promatrani za svaki set testiranih uvjeta. Sve su koncentracije bile nominalne.

[image]

PRIMJER 21

A0ArgB0ArgB29Lys-Nε-Arg-inzulin-cink kristali i protamin-cink kristali

Osnovna otopina A i osnovne otopina cinkovog oksida, natrijevog fosfata, i natrijevog klorida pripremljene su kao u Primjeru 20.

Osnovna otopina protamin sulfata pripremljena je otapanjem 0,0332 g protamin sulfata u 10 mL osnovne otopine A. Osnovna otopina A0ArgB0ArgB29Lys-Nε-Arg-inzulina je pripremljena otapanjem 0,0112 g A0ArgB0Arg-inzulina u 1,25 mL osnovne otopine A.

Za pokuse s A0ArgB0ArgB29Lys-Nε-Arg-inzulin-cink kristalom pomiješani su, kod kiselog pH, A0ArgB0ArgB29Lys-Nε-Arg-inzulin, cinkov oksid i osnovna otopina A. Natrijev klorid je također dodan nekim od uzoraka. Svi su uzorci udruženi do konačnog volumena od 0,1 mL. Dodano je 0,1 ml osnovne otopine natrijevog fosfata pa je formiran talog. Konačni pH bio je namješten na između 7,4 i 9,3.

A0ArgB0ArgB29Lys-Nε-Arg-inzulin protamin-cink kristali pripremljeni su na isti način samo što je protamin sulfat također kombiniran s A0ArgB0ArgB29Lys-Nε-Arg-inzulinom, cinkovim oksidom i osnovnom otopinom A.

Svaki je uzorak tada razdvojen na dvije polovice. Jedan je uzorak inkubiran na 30 ̊C, a drugi je ostavljen na sobnoj temperaturi. Uvjeti testa prikazani su u Tablici 7, a kristali su promatrani za svaki set testiranih uvjeta. Sve su koncentracije bile nominalne.

Daljnji pokusi su izvedeni kako bi se optimalizirala koncentracija natrijevog klorida i pH. Osnovna otopina A je pripremljena otapanjem 12,8g sintetskog glicerina, 0,59 g fenola i 1,28 mL m-krezola u približno 300 mL sterilne vode. Nakon otapanja, sterilna voda je dodana do konačne tezine otopine od 403 g. Osnovna otopina protamin sulfata pripremljena je otapanjem 0,033 g protamin sulfata u 10 mL osnovne otopine A. Osnovna otopina A0ArgB0ArgB29Lys-Nε-Arg-inzulina je pripremljena otapanjem 0,0042 g A0ArgB0Arg-inzulina u 0,3 mL osnovne otopine A. Osnovna otopina cinkovog oksida je pripremljena otapanjem 0,0308 g cinkovog oksida u 1 mL 5 N hidrokloridne kiseline, a sterilna voda je dodana do konačnog volumena od 25 mL. Osnovna otopina natrijevog fosfata je pripremljena otapanjem 0,1893 g natrijevog fosfata sterilnoj vodi do konačnog volumena od 50 mL. Osnovna otopina natrijevog klorida je pripremljena otapanjem 1,173 g natrijeva klorida u 10 mL sterilne vode.

A0ArgB0ArgB29Lys-Nε-Arg-inzulin, protamin sulfat, cinkov oksid, natrijev klorid i osnovna otopina A su pomiješani do konačnog volumena od 0,1 mL. Dodano je 0,1 ml osnovne otopine natrijevog fosfata pa je dobiven talog. Konačni pH bio je namješten na između 7,4 i 9,3.

Svaki je uzorak tada razdvojen na dvije polovice. Jedan je uzorak inkubiran na 30 ̊C, a drugi je ostavljen na sobnoj temperaturi. Uvjeti testa prikazani su u Tablici 8, a kristali su promatrani za svaki set testiranih uvjeta. Sve su koncentracije bile nominalne.

[image]

PRIMJER 22

A0Lys-Nε- ArgA21GlyB29Lys-Nε-Arg-inzulin-cink kristali

Za slijedeće pokuse, osnovna otopina A i osnovne otopine natrijevog klorida, natrijevog fosfata, cinkovog oksida i natrijevog citrata pripremljene su prema slijedećem.

Osnovna otopina A pripremljena je otapanjem 128,2 g sintetskog glicerina, 5,9 g fenola, 12,5 g m-krezola i 30,3 g natrijevog fosfata u približno 3500 mL mili-Q vode. Nakon otapanja, mili-Q voda je dodana do konačne tezine otopine od 4000 g.

Osnovna otopina natrijevog klorida je pripremljena otapanjem 1,1614 g natrijeva klorida u 10 mL sterilne vode.

Osnovna otopina natrijevog fosfata je pripremljena otapanjem 0,7538 g natrijevog fosfata u 10 mL sterilne vode.

0,5 mL otopine fosfata je je razrijeđeno u 9,5 mL sterilne vode.

Osnovna otopina cinkovog oksida je pripremljena otapanjem 0,4 mL 25 mg/mL otopine cinkovog oksida u 9,6 mL sterilne vode kako bi se dobila konačna koncentracija cinkovog oksida od 1 mg/mL.

Osnovna otopina natrijevog citrata je pripremljena otapanjem 2,9597 g natrijevog citrata u 10 mL sterilne vode.

U jednom je pokusu, osnovna otopina A0Lys-Nε- ArgA21GlyB29Lys-Nε-Arg-inzulina pripremljena otapanjem 0,00335 g A0Lys-Nε- ArgA0GlyB29Lys-Nε-Arg-inzulina u 0,65 mL osnovne otopine A. Otopina je bila zamućena, a pH je bio približno 7,1. zatim je pH namješten na približno 3,7 kako bi se otopina razbistrila.

Kristalizacija je potaknuta udruživanjem A0Lys-Nε-ArgA21GlyB29Lys-Nε-Arg-inzulina s cinkovim oksidom, uz dodatak osnovne otopine A i osnovne otopine natrijevog klorida. pH otopine je držan ispod 4. Dodana je otopina natrijevog fosfata pa je stvoren talog. Konačni pH je namješten na između 6,5 i 9,5. Svaki je uzorak tada razdijeljen na tri dijela. Jedan je uzorak inkubiran na 5°C, jedan na 30°C, a jedan je ostavljen na sobnoj temperaturi. Uvjeti testiranja i opažanja prikazani su u tablici 9. Sve su koncentracije nominalne.

[image] [image]

U drugom je pokusu, osnovna otopina A0Lys-Nε- ArgA21GlyB29Lys-Nε-Arg-inzulina pripremljena otapanjem 0,0032 g A0Lys-Nε- ArgA21GlyB29Lys-Nε-Arg-inzulina u 0,65 mL osnovne otopine A. Otopina je bila zamućena, a pH je bio približno 7,1. Zatim je pH namješten na približno 3,7 kako bi se otopina razbistrila.

Kristalizacija je potaknuta udruživanjem A0Lys-Nε-ArgA21GlyB29Lys-Nε-Arg-inzulina s cinkovim oksidom, uz dodatak osnovne otopine A, osnovne otopine natrijevog klorida, i/ili natrijevog citrata. pH otopine je držan ispod 4. Dodana je otopina natrijevog fosfata pa je stvoren talog. Konačni pH je namješten na između 6,5 i 9,5. Svaki je uzorak tada razdijeljen na tri dijela. Jedan je uzorak inkubiran na 5°C, jedan na 30°C, a jedan je ostavljen na sobnoj temperaturi. Uvjeti testiranja i opažanja prikazani su u tablici 10. Sve su koncentracije nominalne.

[image] [image]

U drugom je pokusu, osnovna otopina natrijevog acetata pripremljena otapanjem 0,8203 g natrijevog acetata u 10 mL sterilne vode. Osnovna otopina A0Lys-Nε- ArgA21GlyB29Lys-Nε-Arg-inzulina pripremljena otapanjem 0,003 g A0Lys-Nε- ArgA21GlyB29Lys-Nε-Arg-inzulina u 0,63 mL osnovne otopine A. Otopina je bila zamućena, a pH je bio približno 7,1. zatim je pH namješten na približno 3,7 kako bi se otopina razbistrila.

Kristalizacija je potaknuta udruživanjem A0Lys-Nε-ArgA21GlyB29Lys-Nε-Arg-inzulina s cinkovim oksidom, uz dodatak osnovne otopine A, osnovne otopine natrijevog klorida, i/ili osnovne otopine natrijevog acetata. pH otopine je držan ispod 4. Dodana je otopina natrijevog fosfata pa je stvoren talog. Konačni pH je namješten na između 6,5 i 9,5. Svaki je uzorak tada razdijeljen na tri dijela. Jedan je uzorak inkubiran na 5°C, jedan na 30°C, a jedan je ostavljen na sobnoj temperaturi. Uvjeti testiranja i opažanja prikazani su u tablici 11. Sve su koncentracije nominalne.

[image] [image]

U drugom je pokusu, osnovna otopina cinkovog oksida pripremljena razrjeđivanjem 1,0 mL 10 mg/mL cinkovog oksida u 1,0 mL sterilne vode. Konačna koncentracija cinkovog oksida bila je 5 mg/mL.

Osnovna otopina A0Lys-Nε-ArgA21GlyB29Lys-Nε-Arg-inzulina pripremljena je otapanjem 0,00221 g A0Lys-Nε- ArgA21GlyB29Lys-Nε-Arg-inzulina u 0,43 mL sterilne vode. Otopina je bila gotovo bistra, a pH je bio približno 3,7. Zatim je pH namješten na približno 3,0 kako bi se otopina potpuno razbistrila.

Kristalizacija je potaknuta udruživanjem A0Lys-Nε-ArgA21GlyB29Lys-Nε-Arg-inzulina s cinkovim oksidom, uz dodatak osnovne otopine A, osnovne otopine natrijevog klorida, i natrijevog citrata ili natrijevog acetata. pH otopine je držan ispod 3. Dodana je otopina natrijevog fosfata pa je stvoren talog. Konačni pH je namješten na između 6,5 i 8,5. Svi su uzorci ostavljeni na sobnoj temperaturi. Uvjeti testiranja i opažanja prikazani su u tablici 12. Sve su koncentracije nominalne.

[image]

PRIMJER 23

A0Lys-Nε- ArgA21GlyB29Lys-Nε-Arg-inzulin protamin-cink kristali

Osnovna otopina A pripremljena je otapanjem 16,1 g sintetskog glicerina, 0,73 g fenola i 1,6 mL m-krezola u odgovarajućih 350 mL sterilne vode. Nakon otapanja, sterilna voda je dodana do konačne tezine otopine od 503 g. Osnovna otopina protamin sulfata pripremljena je otapanjem 0,0366 g protamin sulfata u 10 mL sterilne vode.

Osnovna otopina A0Lys-Nε-ArgA21GlyB29Lys-Nε-Arg-inzulina je pripremljena otapanjem 0,0121 g A0Lys-Nε- ArgA21GlyB29Lys-Nε-Arg-inzulina u 1,28 mL osnovne otopine A. Osnovna otopina cinkovog oksida je pripremljena razrijeđivanjem 1 mL 25 mg/mL otopine cinkovog oksida do konačnog volumena od 25 mL, kako bi se dobila konačna koncentracija cinkovog oksida od 1 mg/mL. Osnovna otopina natrijevog fosfata je pripremljena otapanjem 0,0577 g natrijevog fosfata u 15 mL sterilne vode. Otopina natrijevog klorida je pripremljena otapanjem 1,1607 g natrijeva klorida u 10 mL sterilne vode.

A0ArgB0ArgB29Lys-Nε-Arg-inzulin, cinkov oksid, protamin sulfat, natrijev klorid i osnovna otopina A su međusobno su udruženi do konačnog volumena od 0,1 mL. Dodano je 0,1 ml osnovne otopine natrijevog fosfata pa je dobiven talog. Konačni pH bio je namješten na između 7,4 i 9,3.

Svaki je uzorak tada razdvojen na dvije polovice. Jedan je uzorak inkubiran na 30 ̊C, a drugi je ostavljen na sobnoj temperaturi. Uvjeti testa prikazani su u Tablici 13, a ujedno su prmatrani i kristali.

[image]

Izum je djelomično prikazan i opisan referencama i preferirajućim ivjetima, ali ljudi koji rade u struci, razumiju da su moguće različite promjene oblika i detalja bez odstupanja od duha i vidokruga izuma kao što je to definirano u dodanim zahtjevima.

Svi patenti, patentne aplikacije, članci, knjige, i druge publikacije koje su ovdje citirane, uključene su kao reference u njihovoj potpunosti.

Claims

1. Molekula inzulina naznačena time, da posjeduje: (a) A-lanac prikazan formulom I, [image] gdje je slijed aminokiselina, prikazan formulom I, uključen dalje u slijed ID br. 1, i (b) B-lanac prikazan formulom II, [image] gdje je slijed aminokiselina, prikazan formulom II, uključen dalje u slijed ID br. 2, gdje je Xaa na položaju A-1 Arg, derivatizirani Arg, homoarginin, dezamino homoarginin, dezaminoarginin, Lys, derivatizirani Lys, dezaminolizin, alfa gvanidino homoarginin, alfa metil arginin, ili je odsutan; Xaa na položaju A0 je Arg, derivatizirani Arg, homoarginin, dezamino homoarginin, dezaminoarginin, Lys, derivatizirani Lys, dezaminolizin, alfa gvanidino homoarginin ili alfa metil arginin; Xaa na položaju A21 je genetski kodirana aminokiselina; Xaa na položaju B-1 je Arg, derivatizirani Arg, homoarginin, dezamino homoarginin, dezaminoarginin, Lys, derivatizirani Lys, dezaminolizin, alfa gvanidino homoarginin, alfa metil arginin, ili je odsutan; Xaa na položaju B0 je Arg, derivatizirani Arg, homoarginin, dezamino homoarginin, dezaminoarginin, Lys, derivatizirani Lys, dezaminolizin, alfa gvanidino homoarginin, alfa metil arginin, ili je odsutan; Xaa na položaju B28 je Lys ili Pro; Xaa na položaju B29 je Lys ili Pro; Xaa na položaju B30 je Thr, Ala ili je odsutan; jedan od Xaa na položaju B28 ili Xaa na položaju B29 je Lys; Xaa na položaju B28 i Xaa na položaju B29 nisu oba Lys; a ε-amino skupina od Lys na položaju B28 ili B29 je kovalentno vezana na α-karboksilnu grupu pozitivno nabijene aminokiseline te tvori derivat Lys-Nε-aninokiseline.

2. Molekula inzulina prema zahtjevu 1, naznačena time, da je ε-amino skupina od Lys na položaju B28 ili B29 kovalentno vezana na α-karboksilnu grupu Arg te tvori Lys-Nε-Arg.

3. Molekula inzulina prema zahtjevu 1, naznačena time, da je ε-amino skupina od Lys na položaju B28 ili B29 kovalentno vezana na α-karboksilnu grupu Lys te tvori Lys-Nε-Lys.

4. Molekula inzulina prema zahtjevu 1, naznačena time, da su Xaa na položaju A-1 i Xaa na položaju B-1 odsutni.

5. Molekula inzulina prema zahtjevu 1, naznačena time, da su Xaa na položaju B-1 i Xaa na položaju B0 odsutni.

6. Molekula inzulina prema zahtjevu 1, naznačena time, da su Xaa na položaju A-1, Xaa na položaju B-1 i Xaa na položaju B0 odsutni.

7. Molekula inzulina prema zahtjevu 4, naznačena time, da Xaa na položaju A-1 je Arg, derivatizirani Arg, homoarginin, dezamino homoarginin, dezaminoarginin, Lys, derivatizirani Lys, dezaminolizin, alfa gvanidino homoarginin ili alfa metil arginin; i Xaa na položaju B0 je Arg, derivatizirani Arg, homoarginin, dezamino homoarginin, dezaminoarginin, Lys, derivatizirani Lys, dezaminolizin, alfa gvanidino homoarginin, alfa metil arginin, ili je odsutan.

8. Molekula inzulina prema zahtjevu 7, naznačena time, da Xaa na položaju A0 je Arg; a Xaa na položaju B0 je odsutna.

9. Molekula inzulina prema zahtjevu 4, naznačena time, da Xaa na položaju A0 je Arg; i Xaa na položaju B0 je Arg.

10. Uporaba molekule inzulina u skladu sa bilo kojim od zahtjeva 1-9, naznačena time, da je pripravak namijenjen liječenju bolesti diabetes mellitus.

11. Sastav, naznačena time, da je molekula inzulina u skladu sa bilo kojim od zahtjeva 1-9.

12. Sastav prema zahtjevu 11, naznačen time, da je sastav farmaceutski sastav.

13. Sastav prema zahtjevu 12, naznačen time, da dalje sadrži jednu ili više farmaceutski prihvatljivih supstanca.

14. Sastav u skladu s bilo kojim od zahtjeva 11 - 13, naznačen time, da dalje sadrži dvovalentni metani kation.

15. Sastav prema zahtjevu 14, naznačen time, da je dvovalentni metani kation cink.

16. Sastav u skladu s bilo kojim od zahtjeva 11 - 14, naznačen time, da dalje sadrži humani inzulin.

17. Sastav u skladu s bilo kojim od zahtjeva 11 - 14, naznačen time, da dalje sadrži brzo-djelujući analog inzulina.

18. Uporaba sastava u skladu s bilo kojim od zahtjeva 11 - 17, naznačen time, da se rabi za pripremu lijekova za liječenje bolesti diabetes mellitus.

19. Mikrokristal, naznačen time, da sadrži molekulu inzulina u skladu s bilo kojim od zahtjeva 1 - 9 i dvovalentni metalni kation, gdje mikrokristal ne sarži protamin.

20. Mikrokristal prema zahtjevu 19, naznačen time, da je dvovalentni metalni kation cink.

21. Mikrokristal, naznačen time, da sadrži molekulu inzulina u skladu s bilo kojim od zahtjeva 4, 6, 7, 8, ili 9, dvovalentni metalni kation i protamin.

22. Mikrokristal prema zahtjevu 19, naznačen time, da je dvovalentni metalni kation cink.

23. Priprema mikrokristala prema zahtjevu 19, naznačena time, da uključuje molekulu inzulina, dvovalentni metalni kation u vodenom otapalu i pH koji omogućuje stvaranje heksamera molekule inzulina.

24. Proces prema zahtjevu 23, naznačen time, da je dvovalentni metalni kation cink.

25. Proces prema zahtjevu 23, naznačen time, da dalje sadrži sastojke sa heksamer-stabilizirajućom komponentom, prisutnoj u koncentraciji koja olakšava dobivanje heksamera.

26. Uporaba mikrokristala prema zahtjevu 19, naznačena time, da se rabi za pripremu lijekova za liječenje bolesti diabetes mellitus.

27. Postupak pripreme molekule inzulina, naznačena time, da postupak obuhvaća: a) acilaciju svake slobodne amino skupine šablone inzulina sa zaštićenim aminokiselinama ili zaštićenim b) derivatima aminokiselina kako bi se formirala acilirana molekula inzulina; c) čišćenje acilirane molekule inzulina; d) uklanjanje zaštitnih skupina sa svake zaštićene aminokiseline ili derivata zaštićene aminokiseline kako bi se formirala nezaštićena acilirana molekula inzulina; i e) čišćenje nezaštićene, acilirane molekule inzulina.

28. Postupak prema zahtjevu 27, naznačena time, da je zaštićena aminokiselina aktivirana karboksilna kiselina.

29. Postupak prema zahtjevu 28, naznačena time, da aktivirana karboksilna kiselina N-hidroksisukcinimid.

30. Postupak prema zahtjevu 29, naznačena time, da je šablona inzulina rekombinantni humani inzulin ili njegov analog.

31. Postupak prema zahtjevu 27, naznačena time, da je šablona inzulina A21Xaa-inzulin.

32. Postupak liječenja hiperglikemije, naznačena time, da postupak obuhvaća upravljanje molekulom inzulina prema bilo kojem od zahtjeva 1-9 u količinama koje su dostatne za regulaciju koncentracije glukoze u krvi.

33. Postupak liječenja hiperglikemije, naznačena time, da postupak obuhvaća upravljanje sastavom prema bilo kojem od zahtjeva 11-17 u količinama koje su dostatne za regulaciju koncentracije glukoze u krvi.

34. Postupak prema zahtjevu 32 ili 33, naznačena time, da se pacijent liječi od diabetes mellitus.

35. Postupak liječenja diabetes mellitus-a, naznačena time, da postupak obuhvaća upravljanje mikrokristalima prema zahtjevu 19 u količinama koje su dostatne za regulaciju koncentracije glukoze u krvi.

36. Molekula inzulina naznačena time, da posjeduje: (a) A-lanac prikazan formulom I, [image] gdje je slijed aminokiselina, prikazan formulom I, uključen dalje u slijed ID br. 1, i (b) B-lanac prikazan formulom II, [image] gdje je slijed aminokiselina, prikazan formulom II, uključen dalje u slijed ID br. 2, gdje je Xaa na položaju A-1 Arg, derivatizirani Arg, homoarginin, dezamino homoarginin, dezaminoarginin, Lys, derivatizirani Lys, dezaminolizin, alfa gvanidino homoarginin, alfa metil arginin, ili je odsutan; Xaa na položaju A0 je Arg, derivatizirani Arg, homoarginin, dezamino homoarginin, dezaminoarginin, Lys, derivatizirani Lys, dezaminolizin, alfa gvanidino homoarginin, alfa metil arginin; Xaa na položaju A21 je genetski kodirana aminokiselina; Xaa na položaju B-1 je Arg, derivatizirani Arg, homoarginin, dezamino homoarginin, dezaminoarginin, Lys, derivatizirani Lys, dezaminolizin, alfa gvanidino homoarginin, alfa metil arginin, ili je odsutan; Xaa na položaju B0 je Arg, derivatizirani Arg, homoarginin, dezamino homoarginin, dezaminoarginin, Lys, derivatizirani Lys, dezaminolizin, alfa gvanidino homoarginin, alfa metil arginin; Xaa na položaju B28 je Lys ili Pro; Xaa na položaju B29 je Lys ili Pro; Xaa na položaju B30 je Thr, Ala ili je odsutan; jedan od Xaa na položaju B28 ili Xaa na položaju B29 je Lys; Xaa na položaju B28 i Xaa na položaju B29 nisu oba Lys.

37. Molekula inzulina prema zahtjevu 36, naznačena time, da Xaa na položaju A-1 je odsutna; i Xaa na položaju B-1 je odsutna.

38. Molekula inzulina prema zahtjevu 37, naznačena time, da Xaa na položaju A0 je Arg ili Lys; i Xaa na položaju B0 je Arg ili Lys.

39. Molekula inzulina prema zahtjevu 38, naznačena time, da Xaa na položaju A0 je Arg; i Xaa na položaju B0 je Arg.

40. Mikrokristal, naznačen time, da sadrži molekulu inzulina prema zahtjevu 36 i dvovalentni metalni kation.

41. Mikrokristal prema zahtjevu 40, naznačen time, da je dvovalentni metalni kation cink.

42. Mikrokristal prema zahtjevu 40 ili 41, naznačen time, da sadrži protamin.

43. Sastav, naznačen time, da sadrži molekulu inzulina prema zahtjevu 36.

44. Sastav prema zahtjevu 43, naznačen time, da sadrži dvovalentni metalni kation.

45. Sastav prema zahtjevu 44, naznačen time, da je dvovalentni metalni kation cink.

46. Sastav prema zahtjevu 44, naznačen time, da je sastav farmaceutski prihvatljiv.

47. Sastav prema zahtjevu 46, naznačen time, da sadrži farmaceutski prihvatljive prenosnike.

48. Uporaba molekule inzulina prema bilo kojem od zahtjeva 36-39, naznačena time, da se rabi za pripremu lijekova za liječenje bolesti diabetes mellitus.

49. Uporaba sastava prema bilo kojem od zahtjeva 43-47, naznačena time, da se rabi za pripremu lijekova za liječenje bolesti diabetes mellitus.

50. Postupak liječenja hiperglikemije, naznačena time, da postupak obuhvaća upravljanje molekulom inzulina prema bilo kojem od zahtjeva 36-39 u količinama koje su dostatne za regulaciju koncentracije glukoze u krvi.

51. Postupak liječenja hiperglikemije, naznačena time, da postupak obuhvaća upravljanje sastavom prema bilo kojem od zahtjeva 43-47 u količinama koje su dostatne za regulaciju koncentracije glukoze u krvi.

52. Postupak prema zahtjevu 50 ili 51, naznačena time, da se pacijent liječi od diabetes mellitus.

53. Postupak liječenja diabetes mellitus-a, naznačena time, da postupak obuhvaća upravljanje mikrokristalima prema zahtjevu 40-42 u količinama koje su dostatne za regulaciju koncentracije glukoze u krvi.