CN103038250A - 胰高血糖素类似物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于促进体重减轻或防止体重增长而不影响血糖控制的材料和方法。特别地，本发明提供了在这些方法中有效的新的胰高血糖素类似物肽。所述肽可以通过具有与人胰高血糖素相比提高的针对GLP-1受体的选择性来介导其作用。

Description

胰高血糖素类似物
技术领域
本发明涉及胰高血糖素类似物及其医疗应用，例如用于治疗摄食过量、肥胖症和超重、胆固醇升高，并且对血糖控制没有影响或者仅有很小的影响。
发明背景
前胰高血糖素原(preproglucagon)是158个氨基酸的前体多肽，其在组织中被差异性加工而形成多种结构上相关的胰高血糖素原(proglucagon)衍生肽，包括胰高血糖素(Glu)、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、胰高血糖素样肽-2(GLP-2)和胃泌酸调节素(oxyntomodulin，OXM)。这些分子参与多种生理功能，包括葡萄糖稳态、胰岛素分泌、胃排空和肠生长以及摄食调节。
胰高血糖素是29个氨基酸的肽，其对应于前胰高血糖素原的53至81位氨基酸，并具有如下序列：His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr(SEQ ID NO：1)。胃泌酸调节素(OXM)是37个氨基酸的肽，其包含胰高血糖素完整的29个氨基酸序列以及八肽羧基端延伸(前胰高血糖素原的82至89位氨基酸，其序列为Lys-Arg-Asn-Arg-Asn-Asn-Ile-Ala(SEQ ID NO：2)，并称为“间插肽1(intervening peptide 1)”或IP-1；因此，人胃泌酸调节素的完整序列为His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-Lys-Arg-Asn-Arg-Asn-Asn-Ile-Ala)(SEQ ID NO：3)。GLP-1的主要生物活性片段作为30个氨基酸的、对应于前胰高血糖素原之98至127位氨基酸的C末端酰胺化肽而产生。
胰高血糖素通过下述过程来帮助维持血液中的葡萄糖水平：结合至肝细胞上的胰高血糖素受体，通过糖原分解使肝释放以糖原形式储存的葡萄糖。随着这些储存的耗尽，胰高血糖素刺激肝通过糖异生合成额外的葡萄糖。这些葡萄糖释放到血流中，从而防止低血糖症的发生。
OXM响应于食物摄入而释放到血液中，并与膳食的卡路里含量成比例。已显示OXM在人中抑制食欲并抑制摄食(Cohen等，Journal ofEndocrinology and Metabolism，88，4696-4701，2003；WO 2003/022304)。除了与GLP-1类似的那些食欲抑制作用以外，OXM一定还通过另一种机制影响体重，这是因为与成对饲养的(pair-fed)大鼠相比，用胃泌酸调节素处理的大鼠示出更低的体重增长(Bloom，Endocrinology 2004，145，2687)。用OXM处理肥胖啮齿类动物还提高了它们的葡萄糖耐量(Parlevliet等，Am J Physiol Endocrinol Metab，294，E142-7，2008)并抑制了体重增长(WO 2003/022304)。
OXM活化胰高血糖素受体和GLP-1受体，其对胰高血糖素受体的效力比对GLP-1受体的效力高2倍，但比天然胰高血糖素和GLP-1对它们各自受体的效力低。人胰高血糖素也能够活化这两种受体，但相对于GLP-1受体来说对胰高血糖素受体有强偏好性。另一方面，GLP-1不能活化胰高血糖素受体。胃泌酸调节素的作用机制尚不完全清楚。特别是，不了解激素的一些肝外作用是通过GLP-1受体和胰高血糖素受体介导，还是通过一种或更多种尚未鉴定的受体介导。
已显示另一些肽结合并活化胰高血糖素受体和GLP-1受体这二者(Hjort等，Journal of Biological Chemistry，269，30121-30124，1994)以及抑制体重增长和降低摄食量(WO 2006/134340；WO 2007/100535；WO2008/10101；WO 2008/152403；WO 2009/155257和WO 2009/155258)。
肥胖症是日益增多的全球性健康问题，其与多种疾病相关，特别是心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)、2型糖尿病、阻塞性睡眠呼吸暂停、某些类型的癌症和骨关节炎。因此，已发现肥胖症降低预期寿命。根据世界卫生组织所做出的2005年预测，全世界有4亿成年人(年龄＞15岁)被划归为肥胖。在美国，目前认为肥胖症是仅次于吸烟的可预防性死亡的第二大原因。
肥胖症的增多导致糖尿病的增多，约90％的患2型糖尿病的人群可划归为肥胖。全世界有2亿4千6百万人患有糖尿病，预计到2025年将会有3亿8千万人患糖尿病。许多人还有其他心血管风险因素，包括高/异常LDL及甘油三酯和低HDL。
因此，有治疗肥胖症的强烈医疗需要。
发明概述
本发明提供了具有式R1-X-Z-R2的化合物或其可药用盐，
其中
R1是H、C1-4烷基、乙酰基、甲酰基、苯甲酰基或三氟乙酰基；
R2是OH或NH2；
X是具有式I的肽：
His-X2-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-X16-X17-Arg-Ala-X20-Asp-Phe-Ile-X24-Trp-Leu-X27-X28-X29(I)
其中
X2选自Ser和Aib；
X16选自Glu和Y；
X17选自Arg和Y；
X20选自Lys和Y；
X24选自Glu和Y；
X27选自Leu和Y；
X28选自Ser和Y或者不存在；
X29是Ala或者不存在；
其中，X16、X17、X20、X24、X27和X28中的至少一个是Y；
其中，残基Y各自独立地选自Lys、Cys和Orn；
其中，X的至少一个氨基酸残基Y的侧链与具有下式的亲脂取代基缀合：
(i)Z1，其中Z1是直接与X的侧链缀合的亲脂部分；或者
(ii)Z1Z2，其中Z1是亲脂部分，Z2是间隔物，并且Z1通过Z2与X的侧链缀合；
并且Z不存在或者是独立地选自Ala、Leu、Ser、Thr、Tyr、Cys、Glu、Lys、Arg、Dbu、Dpr和Orn的1至20个氨基酸单元的序列。
在一个实例中，X可具有序列：
HSQGTFTSDYSKYLDERRAKDFIEWLKSA
HSQGTFTSDYSKYLDERRAKDFIEWLLSA
HSQGTFTSDYSKYLDERRAKDFIEWLLKA
HSQGTFTSDYSKYLDKRRAKDFIEWLLSA
HSQGTFTSDYSKYLDEKRAKDFIEWLLSA或
H-Aib-QGTFTSDYSKYLDEKRAKDFIEWLLSA。
在一些实施方案中，亲脂取代基与第16、17、20、27或28位氨基酸残基相连接。
例如，本发明的化合物可具有序列：
H-HSQGTFTSDYSKYLDERRAKDFIEWL-K(十六烷酰基-异Glu)-SA-NH2
H-HSQGTFTSDYSKYLDERRA-K(十六烷酰基-异Glu)-DFIEWLLSA-NH2
H-HSQGTFTSDYSKYLDERRAKDFIEWLL-K(十六烷酰基-异Glu)-A-NH2
H-HSQGTFTSDYSKYLD-K(十六烷酰基-异Glu)-RRAKDFIEWLLSA-NH2
H-HSQGTFTSDYSKYLDE-K(十六烷酰基-异Glu)-RAKDFIEWLLSA-NH或H-H-Aib-QGTFTSDYSKYLDE-K(十六烷酰基-异Glu)-RAKDFIEWLLSA-NH2
本发明还提供了编码本发明化合物的核酸(其可以是DNA或RNA)、包含该核酸的表达载体以及包含该核酸或表达载体的宿主细胞。
在另一方面中，本发明提供了组合物，其包含与载体混合的如本文所限定的胰高血糖素类似物肽或者其盐或衍生物、编码该胰高血糖素类似物肽的核酸、包含该核酸的表达载体或者包含该核酸或表达载体的宿主细胞。在一些优选的实施方案中，所述组合物是可药用组合物，并且所述载体是可药用载体。胰高血糖素肽类似物可以是胰高血糖素类似物之可药用盐的形式。
在又一方面中，本发明提供了用于医疗方法中的组合物。
所述化合物尤其用于防止体重增长或促进体重减轻。“防止”是指当与不治疗相比时抑制或降低体重增长，但不必然意指体重增长的完全停止。所述肽可引起摄食量降低和/或能量消耗升高，使得对体重产生可观察到的作用。独立于其对体重的作用，本发明化合物可对循环胆固醇水平具有有益作用(能够降低循环LDL水平以及提高HDL/LDL比值)。因此，本发明化合物可用于直接或间接治疗由体重超重所引起的或者以其为特征的任何病症，例如治疗和/或预防肥胖症、病态肥胖症、肥胖症相关炎症、肥胖症相关的胆囊疾病、肥胖症引起的睡眠呼吸暂停。本发明化合物还可用于预防代谢综合征、高血压、致动脉粥样化性异常脂肪血症(atherogenicdyslipidemia)、动脉粥样硬化、动脉硬化、冠心病或中风。它们在这些病症中的作用可以是由它们对体重的作用所致或与之相关，或者可以独立于其对体重的作用。
在某些实施方案中，所述化合物可用于防止体重增长或促进体重减轻而对血糖控制没有影响或者仅有很小影响。本发明中发现，某些所述化合物在公认的动物模型中对体重减轻具有显著作用而对HbA1c水平没有影响或者仅有很小的影响。
如已描述的那样，本发明延伸至包含上述核酸序列(任选地与指导其表达的序列组合)的表达载体以及包含所述表达载体的宿主细胞。优选地，所述宿主细胞能够表达和分泌本发明化合物。在又一方面中，本发明提供了产生所述化合物的方法，该方法包括在适于所述化合物表达的条件下培养所述宿主细胞并纯化如此产生的化合物。
本发明还提供了用于医疗方法中的本发明核酸、本发明表达载体或能够表达和分泌本发明化合物的宿主细胞。应理解的是，所述核酸、表达载体和宿主细胞可用于治疗可使用本发明化合物本身治疗的本文所述的任任何病症。因此，除非上下文中另有要求，否则涉及包含本发明化合物的治疗组合物、本发明化合物的施用或其任何治疗应用的内容应解释为涵盖本发明核酸、表达载体或宿主细胞的等价应用。
附图说明
图1：在db/db小鼠中，s.c.施用Glu-GLP-1双激动剂(dual agonist)化合物6经6周的处理时间对HbA1c之改变的作用。数据显示为平均值+SEM，n＝11/组。＊p＜0.05，＊＊p＜0.01，＊＊＊p＜0.001，相对于相同时间点的载剂。
图2：在db/db小鼠中，s.c.施用Glu-GLP-1激动剂化合物6经6周的处理时间对体重增长的作用。数据以平均值+SEM给出，n＝11/组。＊＊p＜0.01，＊＊＊p＜0.001，相对于载剂。
图3：在高脂饲喂的C57BL/6J小鼠中，s.c.施用Glu-GLP-1激动剂化合物6对体重的作用。数据为平均值±SEM。
图4：在高脂饲喂的C57BL/6J小鼠中，s.c.施用Glu-GLP-1激动剂化合物6对OGTT期间葡萄糖曲线下面积(AUC)的作用。数据为平均值+SEM。＊p＜0.05。
图5：在用载剂(PBS)、10nmol/kg的毒蜥外泌肽(exendin)-4或10nmol/kg的化合物6每天两次地处理3周之前已经历了30周的30周高脂饮食的小鼠中，3周处理对脂质的作用。CHO：总胆固醇；HDL：高密度胆固醇；LDL：低密度胆固醇；TRIG：甘油三酯；HDL/LDL：HDL与LDL的比值。
图6：在高脂饲喂的C57BL/6J小鼠中，化合物6和化合物7对体重增长的作用。
发明详述
在本说明书通篇中，采用常规的单字母和三字母代码代表天然氨基酸，并采用公认的三字母代码代表其他氨基酸，如Aib(α-氨基异丁酸)、Orn(鸟氨酸)、Dbu(2，4二氨基丁酸)和Dpr(2，3-二氨基丙酸)。
术语“天然胰高血糖素”是指具有以下序列的天然人胰高血糖素：H-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-OH(SEQ ID NO：1)。
本发明提供了如上所述的化合物。为了避免疑义，在本文所提供的定义中，X的序列一般仅在所示允许变化的位置处与式I有差异。可认为序列X中的氨基酸以常规的N端到C端方向从1至29位连续编号。因此，应对X中的“位置”作相应的解释，如同应对天然人胰高血糖素和其他分子中的位置作相应解释一样。
本发明化合物可在肽序列X中携带一个或更多个分子内桥。每个这样的桥在X的两个氨基酸残基的侧链之间形成，所述两个氨基酸残基通常被X的线性序列中的三个氨基酸所分隔(即，在氨基酸A与氨基酸A+4之间)。
更特别地，所述桥可在残基对12与16、16与20、17与21、20与24或者24与28的侧链之间形成。两个侧链可通过离子相互作用或通过共价键彼此相连接。因此，这些残基对可包含带相反电荷的侧链，从而通过离子相互作用形成盐桥。例如，一个残基可以是Glu或Asp，而另一残基可以是Lys或Arg。Lys与Glu配对以及Lys与Asp配对分别还能够反应形成内酰胺环。同样地，Tyr与Glu或者Tyr与Asp能够形成内酯环。
不希望受到任何特定理论的约束，认为这种分子内桥稳定了分子的α螺旋结构并因而提高了针对GLP-1受体以及可能还针对胰高血糖素受体的效力和/或选择性。
不希望受任何特定理论的约束，天然胰高血糖素的第17和18位精氨酸残基似乎提供了针对胰高血糖素受体的显著选择性。
不希望受任何特定理论的约束，天然胰高血糖素的第27、28和29位残基似乎提供了肽针对胰高血糖素受体的显著选择性。在天然胰高血糖素序列这些位置中的1个、2个或所有这3个位置进行替换可提高针对GLP-1受体的效力和/或选择性，并且可能不会显著降低针对胰高血糖素受体的效力。具体的实例包括第27位的Leu、第28位的Ser和第29位的Ala。
对第27位天然的Met残基进行替换(例如用Leu或Lys，尤其是用Leu)还降低氧化的潜力，从而提高化合物的化学稳定性。
对第28位天然的Asn残基进行替换(例如通过Ser、Arg或Ala)还降低在酸性溶液中脱酰胺的潜力，从而提高化合物的化学稳定性。
还可通过引入可能形成两亲性螺旋结构的残基来提高针对GLP-1受体的效力和/或选择性，并且可能不会显著降低针对胰高血糖素受体的效力。这可通过在第16、20、24和28位中的一个或更多个位置引入带电荷残基来实现。因此，第16和20位残基可都带电荷，第16和24位残基可都带电荷，第20和24位残基可都带电荷，第16、20和24位残基可全部带电荷，或者第16、20、24和28位残基可全部带电荷。例如，第16位残基可以是Glu或Lys。第20位残基可以是Lys。第24位残基可以是Glu。第28位残基可以是Lys。
替换第20和24位天然的Gln残基一个或两个还降低在酸性溶液中脱酰胺的潜力，从而提高化合物的化学稳定性。
用带电氨基酸替换第16、17、20、27和28位天然氨基酸中的一个或更多个使得能够与亲脂取代基缀合。例如，第16、17、20、27或28位残基可以是Cys、Orn或Lys。更特别地，第16、17、20、27或28位残基中的一个或更多可以是Cys。此外，第16、17、20、27和28位残基中的一个或更多个可以是Lys。
如已公开的那样，本发明化合物可包含1-20个氨基酸的C末端肽序列Z，例如用以稳定胰高血糖素类似物肽的构象和/或二级结构，和/或用以使胰高血糖素类似物肽对酶水解更具抗性，例如，如WO99/46283中所述。
当存在时，Z代表1至20个氨基酸残基(例如，1-15个、更优选1-10个、特别地1-7个氨基酸残基(例如1、2、3、4、5、6或7个氨基酸残基，如6个氨基酸残基))的肽序列。肽序列Z中的每个氨基酸残基可独立地选自Ala、Leu、Ser、Thr、Tyr、Cys、Glu、Lys、Arg、Dbu(2，4二氨基丁酸)、Dpr(2，3-二氨基丙酸)和Orn(鸟氨酸)。优选地，所述氨基酸残基选自Ser、Thr、Tyr、Glu、Lys、Arg、Dbu、Dpr和Orn，更优选地仅选自Glu、Lys和Cys。上述氨基酸可具有D或L构型，但优选具有L构型。特别优选的序列Z是4、5、6或7个连续赖氨酸残基(即Lys3、Lys4、Lys5、Lys6或Lys7)、特别是5或6个连续赖氨酸残基的序列。Z的另一些示例性序列示于WO 01/04156中。或者，序列Z的C端残基可以是Cys残基。这可有助于化合物的修饰(例如PEG化，或者与白蛋白缀合)。在这样的实施方案中，序列Z的长度可例如仅是1个氨基酸(即Z＝Cys)或者可以是2、3、4、5、6或更多个氨基酸。这样，其他氨基酸作为肽X与末端Cys残基之间的间隔物。
肽序列Z与人OXM的IP-1部分的对应序列(其具有序列Lys-Arg-Asn-Arg-Asn-Asn-Ile-Ala)具有不高于25％的序列同一性。
给定肽或多肽序列相对于另一多肽序列(例如，IP-1)的“氨基酸序列同一性百分比(％)”计算为：当将两者彼此比对时(必要时可引入空位以进行最佳比对)，给定肽序列中与另一多肽对应序列中相应氨基酸残基一致的氨基酸残基的百分比。同一性％的值可通过使用WU-BLAST-2来确定(Altschul等，Methods in Enzymology，266：460-480(1996))。WU-BLAST-2采用若干检索参数，其中大部分设置为缺省值。可调整参数设置为如下值：重叠跨度(overlap span)＝1，重叠分数(overlap fraction)＝0.125，字阈值(word threshold)(T)＝11。氨基酸序列同一性％的值通过将由WU-BLAST-2确定的匹配的一致残基数除以参照序列的残基总数(忽略由WU-BLAST-2引入参照序列以使比对值最大化的空位)再乘以100而确定。
因此，当将Z与IP-1的8个氨基酸进行最佳比对时，其具有不超过2个与IP-1的对应氨基酸一致的氨基酸。
在一个特定实施方案中，本发明提供了其中不存在Z的化合物。
本发明化合物中的一个或更多个氨基酸侧链可与亲脂取代基缀合。所述亲脂取代基可共价键合至氨基酸侧链中的原子，或者作为替代地可通过间隔物缀合至氨基酸侧链。所述亲脂取代基可缀合至氨基酸的侧链，所述氨基酸是肽X的一部分和/或肽Z的一部分。
不希望受任何特定理论的约束，认为亲脂取代基结合血流中的白蛋白，从而保护本发明化合物免受酶降解，从而提高化合物的半衰期。所述间隔物(当存在时)用于在所述化合物与所述亲脂取代基之间提供间隔。
亲脂取代基可通过酯、磺酰酯、硫酯、酰胺或磺酰胺与氨基酸侧链或间隔物相连接。因此，应理解，亲脂取代基优选地包括形成酯、磺酰酯、硫酯、酰胺或磺酰胺之一部分的酰基、磺酰基、N原子、O原子或S原子。优选地，亲脂取代基中的酰基构成与氨基酸侧链或间隔物形成的酰胺或酯的一部分。
亲脂取代基可包含具有4至30个C原子的烃链。优选地，它具有至少8或12个C原子，优选地它具有24个或更少的C原子，或者20个或更少的C原子。所述烃链可以是直链的或支链的，并且可以是饱和的或不饱和的。应理解，烃链优选地被这样的部分所取代：所述部分形成与氨基酸侧链或间隔物的连接的一部分，例如酰基、磺酰基、N原子、O原子或S原子。最优选地，所述烃链被酰基取代，因此，所述烃链可以是烷酰基(例如棕榈酰基、己酰基、月桂酰基、肉豆蔻酰基或硬酯酰基)的一部分。
因此，所述亲脂取代基可具有下式：
A可以是例如酰基、磺酰基、NH、N-烷基、O原子或S原子，优选地为酰基。n是3至29的整数，优选地至少为7或至少为11，优选地为23或更小，更优选地为19或更小。
所述烃链可被进一步取代。例如，其可被至多3个选自NH2、OH和COOH的取代基进一步取代。如果烃链被进一步取代，优选地其仅被一个取代基进一步取代。作为替代或补充，所述烃链可包含环烷烃或杂环烷烃，例如如下所示：
Figure BDA00002623260600092
优选地，所述环烷烃或杂环烷烃是六元环。最优选地，其为哌啶。
或者，亲脂取代基可基于环戊烷并菲骨架，其可为部分或完全不饱和的或者饱和的。骨架中的每个碳原子可被Me或OH取代。例如，所述亲脂取代基可以是胆酰基(cholyl)、脱氧胆酰基或石胆酰基(lithocholyl)。
如上所述，亲脂取代基可通过间隔物缀合至氨基酸侧链。当存在时，间隔物连接至亲脂取代基和氨基酸侧链。间隔物可独立地通过酯、磺酰酯、硫酯、酰胺或磺酰胺与亲脂取代基和氨基酸侧链相连接。因此，其可包含独立地选自酰基、磺酰基、N原子、O原子或S原子的两个部分。所述间隔物可具有式：
其中B和D各自独立地选自酰基、磺酰基、NH、N-烷基、O原子和S原子，优选地选自酰基和NH。优选地，n是1至10、优选为1至5的整数。所述间隔物可进一步被选自以下的一个或更多个取代基取代：C0-6烷基、C0-6烷基胺、C0-6烷基羟基和C0-6烷基羧基。
或者，间隔物可具有两个或更多个上式的重复单元。对于每个重复单元，B、D和n各自独立地选择。相邻的重复单元可通过其各自的B和D部分彼此共价连接。例如，相邻重复单元的B和D部分可一起形成酯、磺酰酯、硫酯、酰胺或磺酰胺。间隔物各端的游离B和D单元连接至如上所述的氨基酸侧链和亲脂取代基。
优选地，所述间隔物具有5个或更少、4个或更少或者3个或更少的重复单元。最优选地，所述间隔物具有2个重复单元，或者为单个单元。
所述间隔物(或者间隔物的一个或更多个重复单元，如果其具有重复单元的话)可以是例如天然或非天然氨基酸。应理解，对于具有官能化侧链的氨基酸，B和/或D可以是氨基酸侧链中的一部分。所述间隔物可以是任何天然的或非天然的氨基酸。例如，间隔物(或者间隔物的一个或更多个重复单元，如果其具有重复单元的话)可以是Gly、Pro、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Cys、Phe、Tyr、Trp、His、Lys、Arg、Gln、Asn、α-Glu、γ-Glu、Asp、Ser Thr、Gaba、Aib、β-Ala、5-氨基戊酰基、6-氨基己酰基、7-氨基庚酰基、8-氨基辛酰基、9-氨基壬酰基或10-氨基癸酰基。
例如，所述间隔物可以是选自γ-Glu、Gaba、β-Ala和α-Gly的单个氨基酸。
亲脂取代基可缀合至本发明化合物的任何氨基酸侧链。优选地，所述氨基酸侧链包括羧基、羟基、巯基、酰胺基或胺基，用以与所述间隔物或亲脂取代基形成酯、磺酰酯、硫酯、酰胺或磺酰胺。例如，所述亲脂取代基可缀合至Asn、Asp、Glu、Gln、His、Lys、Arg、Ser、Thr、Tyr、Trp、Cys或Dbu、Dpr或Orn。优选地，所述亲脂取代基缀合至Lys。在本文提供的式中所显示的Lys的氨基酸可在添加亲脂取代基时被替换为例如Dbu、Dpr或Orn。
亲脂取代基和间隔物的实例示于下式中：
Figure BDA00002623260600111
在本文中，本发明化合物的Lys残基通过酰胺部分与γ-Glu(间隔物)共价连接。棕榈酰基通过酰胺部分与γ-Glu间隔物共价连接。
作为替选或补充，本发明化合物的一个或更多个氨基酸侧链可缀合至聚合物部分，例如，用以提高溶解度和/或体内(例如，血浆中)半衰期和/或生物利用度。还已知这样的修饰降低治疗性蛋白质和肽的清除率(例如，肾清除率)。
所述聚合物部分优选为水溶性的(两亲性的或亲水的)、无毒的并且药用惰性的。合适的聚合物部分包括聚乙二醇(PEG)、PEG的同聚物或共聚物、PEG的单甲基取代的聚合物(mPEG)和聚氧乙烯甘油(POG)。参见例如Int.J.Hematology 68：1(1998)；Bioconjugate Chem.6：150(1995)；以及Crit.Rev.Therap.Drug Carrier Sys.9：249(1992)。
另一些合适的聚合物部分包括聚氨基酸，例如聚赖氨酸、聚天冬氨酸和聚谷氨酸(参见例如Gombotz等，(1995)，Bioconjugate Chem.，第6卷：332-351；Hudecz等，(1992)，Bioconjugate Chem.，第3卷，49-57；Tsukada等.(1984)，J.Natl.Cancer Inst.，第73卷：721-729；以及Pratesi等，(1985)，Br.J.Cancer，第52卷：841-848)。
聚合物部分可以是直链的或支链的。其可具有500Da至40,000Da的分子量，例如500Da至10,000Da、1000Da至5000Da、10,000Da至20,000Da或20,000Da至40,000Da。
本发明化合物可包含两个或更多个这样的部分，在这种情况下，所有这样的部分的总分子量一般落在以上提供的范围内。
聚合物部分可偶联(通过共价连接)至氨基酸侧链的氨基、羧基或巯基。优选的实例为Cys残基的巯基和Lys残基的ε氨基。还可使用Asp和Glu残基的羧基。
本领域技术人员将知晓可用于实施偶联反应的合适技术。例如，可采用来自Nektar Therapeutics AL的市售试剂通过马来酰亚胺基连接将携带甲氧基的PEG部分偶联至Cys巯基。合适的化学方法的细节还参见WO 2008/101017以及所引用的参考文献。
在另一方面中，本发明化合物中的一个或更多个氨基酸侧链(例如肽X中)与聚合物部分缀合。
在又一方面中，本发明提供了组合物，其包含与载体混合的本文所述的本发明化合物或者其盐或衍生物。
术语“其衍生物”是指任一种所述化合物的衍生物。衍生物包括所述化合物的全部化学修饰、全部保守变体、全部前药和全部代谢物。
本发明还提供了本发明化合物在制备用于治疗下述病症的药物中的用途。
本发明还提供了组合物，其中所述组合物是可药用组合物，并且所述载体是可药用载体。
肽合成
本发明化合物可通过标准合成方法、重组表达系统或任何其他现有技术方法制备。因此，胰高血糖素类似物可以以多种方式合成，包括例如以下方法，其包括：
(a)通过固相法或液相法逐步或通过片段组装来合成肽，并分离和纯化最终的肽产物；或者
(b)在宿主细胞中表达编码肽的核酸构建体，并从宿主细胞培养物中回收表达产物；或者
(c)无细胞体外表达编码肽的核酸构建体，并回收表达产物；
或者方法(a)、(b)和(c)的任意组合以获得肽片段，随后连接所述片段以获得肽，并回收所述肽。
优选通过固相或液相肽合成来合成本发明的类似物。在这种情况下，参照WO 98/11125；Fields，GB等，2002，“Principles and practice ofsolid-phase peptide synthesis”于：Synthetic Peptides(第二版)，以及本文的实施例等。
就重组表达而言，通常将本发明的核酸片段插入适合的载体中以形成携带本发明核酸片段的克隆或表达载体；这些新的载体也是本发明的一部分。根据应用目的和类型，所述载体可以是质粒、噬菌体、黏粒、微型染色体或病毒的形式，此外，在某些细胞中仅瞬时表达的裸DNA也是重要载体。本发明优选的克隆和表达载体(质粒载体)能够自主复制，从而使得用于随后克隆之高水平表达或高水平复制目的的高拷贝数成为可能。
一般地，表达载体在5’→3’方向包含可操作连接的以下特征：用于驱动本发明核酸片段表达的启动子、任选地编码能够进行分泌(至细胞外相，或适当时进入周质(periplasma))的前导肽的核酸序列、编码本发明肽的核酸片段、以及任选地编码终止子的核酸序列。它们可包含其他特征，例如选择标记和复制起点。当操作生产株或细胞系中的表达载体时，优选所述载体能够整合到宿主细胞基因组中。本领域技术人员非常熟悉合适的载体并能根据他们的具体要求来设计载体。
使用本发明的载体转化宿主细胞以产生本发明化合物。这样的转化细胞(其也是本发明的一部分)可以是用于扩增本发明核酸片段和载体或者用于重组产生本发明肽的培养的细胞或细胞系。
本发明优选的转化细胞是微生物如细菌(例如，埃希氏菌属(Escherichia)(如大肠杆菌(E.coli))、芽孢杆菌属(Bacillus)(如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、沙门氏菌属(Salmonella)或分枝杆菌属(Mycobacterium)(优选非致病性的，如牛分枝杆菌(M.bovis)BCG))、酵母(如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris))和原生动物。或者，所述转化细胞可来自多细胞生物，即其可以是真菌细胞、昆虫细胞、藻细胞、植物细胞或动物细胞(如哺乳动物细胞)。为了克隆和/或优化表达，优选所述转化细胞能够复制本发明核酸片段。表达所述核酸片段的细胞可用于本发明的实施方案中；它们可用于小规模或大规模制备本发明的肽。
当利用转化细胞生产本发明的肽时，尽管远非必要地，但将表达产物分泌到培养基中是方便的。
效力
相关化合物与GLP-1受体或胰高血糖素(Glu)受体的结合可用作激动剂活性的指标，但一般优选使用生物测定，所述生物测定测量由化合物结合至相关受体所引起的细胞内信号传导。例如，胰高血糖素激动剂活化胰高血糖素受体会刺激细胞环AMP(cAMP)形成。类似地，GLP-1激动剂活化GLP-1受体会刺激细胞cAMP形成。因此，cAMP在表达这两种受体之一的合适细胞中的产生可用于监测相关受体活性。因此，使用合适的一对细胞类型(各自表达一种受体而不表达另一种受体)可用于确定对这两种类型受体的激动剂活性。
本领域技术人员会知晓合适的测定方式，并且下文中提供了实施例。GLP-1受体和/或胰高血糖素受体可具有实施例中所述的受体序列。例如，测定可使用具有初始登记号GI：4503947的人胰高血糖素受体(胰高血糖素-R)和/或具有初始登记号GI：166795283的人胰高血糖素样肽1受体(GLP-1R)。(当涉及前体蛋白质的序列时，显然应当理解为测定可使用不含信号序列的成熟蛋白质)。
可使用EC50值作为对给定受体激动剂效力的数值量度。EC50值是在特定测定中达到化合物最大活性一半时所需化合物浓度的测量值。因此，例如，在特定测定中，EC50[GLP-1]比胰高血糖素的EC50[GLP-1]低的化合物可被认为与胰高血糖素相比具有更高的GLP-1受体激动剂效力。
本说明书中所述的化合物通常是Glu-GLP-1双激动剂，如通过它们针对胰高血糖素受体和GLP-1受体这二者均能够刺激cAMP形成的观察结果所确定的那样。可在独立的测定中测量每种受体的刺激，而后彼此进行比较。
通过将给定化合物针对胰高血糖素受体的EC50值(EC50[胰高血糖素-R])与针对GLP-1受体的EC50值(EC50[GLP-1R])相比较，可得出该化合物的相对胰高血糖素选择性(％)如下：
相对胰高血糖素-R选择性[化合物]＝(1/EC50[胰高血糖素-R])×100/(1/EC50[胰高血糖素-R]+1/EC50[GLP-1R])
同样地，可得出相对GLP-1R选择性：
相对GLP-1R选择性[化合物]＝(1/EC50[GLP-1R])×100/(1/EC50[胰高血糖素-R]+1/EC50[GLP-1R])
利用化合物的相对选择性能将其对GLP-1或胰高血糖素受体的作用与其对另一受体的作用直接比较。例如，化合物的相对GLP-1选择性越高，则化合物对GLP-1受体比对胰高血糖素受体更有效。
使用下述测定，我们发现人胰高血糖素的相对GLP-1选择性为约5％。
与人胰高血糖素相比，本发明化合物具有更高的相对GLP-1R选择性，因为：对于特定水平的胰高血糖素-R激动剂活性来说，所述化合物将表现出与胰高血糖素相比更高水平的GLP-1R激动剂活性(即对GLP-1受体效力更高)。应理解，只要实现合适的相对GLP-1R选择性，则特定化合物对胰高血糖素受体和GLP-1受体的绝对效力与天然人胰高血糖素相比可以更高、更低或大致相等。
然而，本发明化合物与人胰高血糖素相比可具有更低的EC50[GLP-1R]。所述化合物与胰高血糖素相比可具有更低的EC50[GLP-1-R]，同时保持其EC50[胰高血糖素-R]与人胰高血糖素的相比高出小于10倍，与人胰高血糖素相比高出小于5倍，或与人胰高血糖素相比高出小于2倍。
本发明化合物的EC50[胰高血糖素-R]可以小于人胰高血糖素的EC50[胰高血糖素-R]的两倍。所述化合物的EC50[胰高血糖素-R]可以小于人胰高血糖素的EC50[胰高血糖素-R]的两倍，并且其EC50[GLP-1R]小于人胰高血糖素EC50[GLP-1R]的一半，小于人胰高血糖素的EC50[GLP-1R]的五分之一，或小于人胰高血糖素的EC50[GLP-1R]的十分之一。
化合物的相对GLP-1选择性可以是5％至95％。例如，所述化合物的相对选择性可以是5％至20％、10％至30％、20％至50％、30％至70％或50％至80％；或者是30％至50％、40％至60％、50％至70％或75％至95％。
本发明的化合物还可对其他B类GPCR受体具有作用，所述B类GPCR受体例如但不限于降血钙素基因相关肽1(CGRP1)、促肾上腺皮质激素释放因子1和2(CRF1和CRF2)、肠抑胃肽(gastric inhibitorypolypeptide，GIP)、胰高血糖素样肽1和2(GLP-1和GLP-2)、胰高血糖素(GCGR)、胰泌素(secretin)、促性腺激素释放激素(GnRH)、甲状旁腺激素1和2(PTH1和PTH2)、血管活性肠肽(VPAC1和VPAC2)。
治疗用途
本发明化合物可为肥胖症和代谢疾病等提供具有吸引力的治疗选择。
代谢综合征的特征为一个人中的一组代谢风险因素。它们包括腹部肥胖症(腹部内部器官周围脂肪组织过多)、致动脉粥样化性异常脂肪血症(血脂异常，包括高甘油三酯、低HDL胆固醇和/或高LDL胆固醇，其促使斑块在动脉壁中产生)、血压升高(高血压)、胰岛素抗性和葡萄糖不耐受、血栓前状态(例如血液中存在高纤维蛋白原或纤溶酶原活化物抑制剂-1)和促炎状态(例如血液中C反应蛋白升高)。
患有代谢综合征的个体患冠心病以及与动脉硬化的其他表现相关的其他疾病(例如，中风和外周血管疾病)的风险提高。该综合征的主要潜在风险因素似乎是腹部肥胖症。
不希望受任何特定理论的约束，认为本发明化合物作为GluGLP-1双激动剂起作用。双激动剂将胰高血糖素对脂肪代谢的作用与GLP-1对摄食的作用相结合。因此，它们可以协同方式加速消除过量的脂肪堆积并诱导可持续的体重减轻。
GluGLP-1双激动剂的协同作用还可导致心血管风险因素(例如高胆固醇和LDL)的降低，这可能完全独立于它们对体重的作用。
因此，本发明化合物可用作用于防止体重增长、促进体重减轻、减低过高的体重或治疗肥胖症(例如通过控制食欲、进食、摄食、卡路里摄入和/或能量消耗)的药剂，所述肥胖症包括病态肥胖症以及相关疾病和健康状况，包括但不限于肥胖症相关炎症、肥胖症相关胆囊疾病和肥胖症诱导的睡眠呼吸暂停。本发明化合物还可用于治疗代谢综合征、高血压、致动脉粥样化性异常脂肪血症、动脉粥样硬化、动脉硬化、冠心病和中风。这些都是可与肥胖症相关的病症。然而，本发明化合物对这些病症的作用可完全或部分地由对体重的作用而介导，或者可独立于对体重的作用。
特别地，本发明所述的化合物可用于防止体重增长或促进体重减轻而对葡萄糖耐量没有影响或者有很小的影响。已发现所述化合物在合适的血糖控制动物模型中对体重减轻具有显著的作用而对HbA1c水平没有影响或者有很小的影响。
因此，本发明提供了本发明化合物在有此需要的个体中治疗上述病症的用途。
本发明还提供了本发明化合物，其用于医疗方法中，特别地用于治疗上述病症的方法中。
在一个优选的方面中，所述化合物可用于防止体重增长或促进体重减轻。
在一个特定实施方案中，本发明包括化合物在有此需要的个体中防止体重增长或促进体重减轻的用途。
在一个特定实施方案中，本发明包括化合物在以下方法中的用途：在有此需要的个体中治疗由体重超重引起的或以其为特征的以下病症：例如治疗和/或防止肥胖症、病态肥胖症、手术前病态肥胖症、肥胖症相关炎症、肥胖症相关胆囊疾病、肥胖症诱导的睡眠呼吸暂停、高血压、致动脉粥样化性异常脂肪血症、动脉粥样硬化、动脉硬化、冠心病、外周动脉疾病、中风或微血管疾病。
在另一方面中，所述化合物可用于降低循环LDL水平和/或提高HDL/LDL比值的方法中。
在一个特定实施方案中，本发明包括化合物在以下方法中的用途：在有此需要的个体中降低循环LDL水平和/或提高HDL/LDL比值。
药物组合物
本发明的化合物或其盐可配制成制备用于储存或施用的药物组合物，所述药物组合物通常在可药用载体中包含治疗有效量的本发明化合物或其盐。
本发明化合物的治疗有效量将取决于施用途径、接受治疗的哺乳动物类型以及所考虑的具体哺乳动物的身体特征。确定该量的这些因素及其关系是医药领域技术人员所公知的。可调整该量和施用方法以达到最佳效力，并且可取决于医药领域技术人员公知的因素例如体重、饮食、同时用药(concurrent medication)及其他因素。人用最适剂量大小和给药方案可得到本发明所获得之结果的指导，并可在适当设计的临床试验中加以验证。
可通过常规方法确定有效剂量和治疗方案，首先在实验室动物中使用低剂量，而后提高剂量同时监测效果，并且还系统地改变给药方案。当确定针对给定对象的最佳剂量时，临床医师可考虑多种因素。这些因素是本领域技术人员所知晓的。
术语“可药用载体”包括任何标准药用载体。用于治疗用途的可药用载体是药学领域中公知的，并描述于例如Remington′s PharmaceuticalSciences，Mack Publishing Co.(A.R.Gennaro编，1985)中。例如，可使用弱酸性或生理pH下的无菌盐水和磷酸盐缓冲盐水。pH缓冲剂可以是磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、三/羟甲基)氨基甲烷(TRIS)、N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)、碳酸氢铵、二乙醇胺、组氨酸(其为优选的缓冲剂)、精氨酸、赖氨酸或乙酸盐，或者其混合物。该术语还涵盖在美国药典中所列出的用于动物(包括人)的任何试剂。
术语“可药用盐”是指任一所述化合物的盐。盐包括可药用盐例如酸加成盐和碱式盐。酸加成盐的实例包括盐酸盐、柠檬酸盐和乙酸盐。碱式盐的实例包括其中阳离子选自以下的盐：碱金属(例如钠和钾)、碱土金属(例如钙)和铵离子+N(R3)3(R4)(其中R3和R4独立地表示任选地取代的C1-6-烷基、任选地取代的C2-6-烯基、任选地取代的芳基或任选地取代的杂芳基)。可药用盐的另一些实例描述于“Remington’s PharmaceuticalSciences”，17版，Alfonso R.Gennaro(编)，Mark Publishing Company，Easton，PA，U.S.A.，1985以及更新的版本中，以及Encyclopaedia ofPharmaceutical Technology中。
“治疗”是用于获得有益或期望之临床结果的方法。为本发明目的，有益或期望之临床结果包括但不限于：无论是可检出或不可检出地缓和症状、减轻疾病程度、稳定疾病状态(即不恶化)、延后或减缓疾病进展、改善或缓和疾病状态以及(部分或全部地)缓解(remission)。“治疗”还可指与未接受治疗时的预期存活相比延长存活。“治疗”是以防止疾病发生或改变疾病之病理状况进展为目的而进行的干预。因此，“治疗”指治疗性处理以及预防性措施。需要治疗的那些包括已患有疾病和待预防疾病的那些。
药物组合物可是单位剂型的。在这样的形式中，组合物被分成包含合适量活性组分的单位剂量。所述单位剂型可以是经包装的制剂，所述包装包含独立量的制剂，例如，包装的片剂、胶囊以及小瓶或安瓿中的粉末。单位剂型还可以是胶囊剂、扁囊剂或片剂本身，或者其可以是合适数目的任何这些经包装的形式。其可以单剂量注射剂形式提供，例如以注射笔(pen)的形式。在某些实施方案中，经包装的形式包括带有使用说明的标签或者插页。可将组合物配制成适于任何合适的施用途径和方式。可药用载体或稀释剂包括适用于经口、经直肠、经鼻、局部(包括含服和舌下)、经阴道或肠胃外(包括皮下、肌内、静脉内、皮内和经皮)施用的制剂中使用的那些。可方便地将制剂以单位剂型提供，并可通过药学领域公知的任何方法来制备。
皮下或经皮施用模式可特别适于本文所述的化合物。
本发明的药物组合还可以与药物载体、药物递送系统和高级药物递送系统化合或连接(例如通过共价、疏水和静电相互作用)，以进一步增强化合物的稳定性、提高生物利用度、提高溶解度、降低不良作用、实现本领域技术人员公知的择时治疗(chronotherapy)以及提高患者顺应性或其任意组合。载体、药物递送系统和高级药物递送系统的实例包括但不限于：聚合物(例如纤维素及衍生物)、多糖(例如葡聚糖及衍生物、淀粉及衍生物)、聚乙烯醇、丙烯酸和甲基丙烯酸聚合物、聚乳酸和聚乙醇酸及其嵌段共聚物、聚乙二醇、载体蛋白质(例如白蛋白)、凝胶(例如热凝胶系统(如本领域技术人员公知的嵌段共聚系统))、胶束、脂质体、微球、纳米颗粒、液晶及其分散体、脂-水系统中相行为(phase behavior)领域技术人员公知的L2相及其分散体、聚合物胶束、复合乳剂、自乳化、自微乳化、环糊精及其衍生物和树状聚体(dendrimer)。
联合治疗
如上所述，应当理解，在下文中提到的本发明化合物还延伸到其可药用盐或溶剂化物以及包含多于一种本发明的不同化合物的组合物。
本发明化合物可作为联合治疗的一部分与治疗肥胖症、高血压异常脂肪血症或糖尿病的药剂一起施用。
在这种情况下，可同时或分别给予两种活性药剂，所述两种活性药剂作为同一药物制剂的一部分或者作为分别的制剂。
因此，化合物或其盐还可以与抗肥胖剂联合使用，所述抗肥胖症药剂包括但不限于胰高血糖素样肽受体1激动剂、肽YY或其类似物、大麻素受体1拮抗剂、脂肪酶抑制剂、黑皮质素受体4激动剂或黑色素浓集激素(melanin concentrating hormone)受体1拮抗剂。
本发明化合物或其盐可以与抗高血压剂联合使用，所述抗高血压剂包括但不限于血管紧张素转化酶抑制剂、血管紧张素II受体阻断剂、利尿剂、β-阻断剂或钙通道阻断剂。
本发明化合物或其盐可与异常脂肪血症药剂联合使用，所述异常脂肪血症剂(dyslipidaemia agent)包括但不限于他汀类(statin)、贝特类(fibrate)、烟酸类(niacin)和/或胆固醇吸收抑制剂。
此外，本发明化合物或其盐可与抗糖尿病剂联合使用，所述抗糖尿病剂包括但不限于二甲双胍、磺酰脲类、格列奈类(glinide)、DPP-IV抑制剂、格列酮类(glitazone)、不同的GLP-1激动剂或胰岛素。在一个优选的实施方案中，所述化合物或其盐与胰岛素、DPP-IV抑制剂、磺酰脲类或二甲双胍(特别是磺酰脲类或二甲双胍)联合使用以实现充分的血糖控制。在一个甚至更优选的实施方案中，所述化合物或其盐与胰岛素或胰岛素类似物联合使用以实现充分的血糖控制。胰岛素类似物的实例包括但不限于Lantus、Novorapid、Humalog、Novomix和Actraphane HM。
方法
胰高血糖素类似物的一般合成
应用微波辅助合成仪、采用NMP中的标准Fmoc策略、利用聚苯乙烯树脂(TentaGel S Ram)进行固相肽合成(solid phase peptide synthesis，SPPS)。用HATU作为偶联剂，DIPEA作为基质。用哌啶(20％，在NMP中)进行去保护。适当时，使用假脯氨酸：Fmoc-Phe-Thr(.Psi.Me，Mepro)-OH和Fmoc-Asp-Ser(.Psi.，Me，Me pro)-OH(购自NovaBiochem)。
所使用的缩写如下：
ivDde：1-(4，4-二甲基-2，6-二氧代亚环己基)3-甲基-丁基
Dde：1-(4，4-二甲基-2，6-二氧代亚环己基)-乙基
DCM：二氯甲烷
DMF：N，N-二甲基甲酰胺
DIPEA：二异丙基乙胺
EtOH：乙醇
Et2O：乙醚
HATU：N-[(二甲基氨基)-1H-1，2，3-三唑[4，5-b]吡啶-1-基亚甲基]-N-甲基甲铵六氟磷酸酯/盐N-氧化物(N-[(dimethylamino)-1H-1，2，3-triazol[4，5-b]pyridine-1-ylmethylene]-N-methylmethanaminium hexafluorophosphate N-oxide)
MeCN：乙腈
NMP：N-甲基吡咯烷酮
TFA：三氟乙酸
TIS：三异丙基硅烷
切割：
通过在室温下用95/2.5/2.5％(v/v)TFA/TIS/水处理2小时，将粗制肽从树脂上切割下来。对于在序列中有甲硫氨酸的肽来说，使用95/5％(v/v)TFA/EDT混合物。在减压条件下除去大部分TFA，沉淀粗制肽并用乙醚洗涤，并使其在环境温度下干燥至恒重。
酰化胰高血糖素类似物的一般合成
按照上述针对胰高血糖素类似物的一般合成的描述合成肽骨架，只是肽骨架在赖氨酸残基的侧链上被酰化而肽仍与树脂相连并且在侧链基团上(待酰化赖氨酸上的ε-胺除外)得到完全保护。使用Fmoc-Lys(ivDde)-OH或Fmoc-Lys(Dde)-OH掺入待酰化的赖氨酸。用NMP中的Boc2O以Boc基团保护肽的N端。当肽仍与树脂相连时，用NMP中的5％水合肼选择性切割ivDde保护基。未经保护的赖氨酸侧链而后首先与间隔物氨基酸(如Fmoc-Glu-OtBu)偶联，其用哌啶去保护并采用上述标准肽偶联方法用脂肪酸酰化。或者，可一开始以Boc-His(Boc)-OH掺入N末端的组氨酸。如上所述进行从树脂切割以及纯化。
表达人胰高血糖素受体和GLP-1受体的细胞系的产生
分别从cDNA克隆BC104854(MGC：132514/IMAGE：8143857)或BC112126(MGC：138331/IMAGE：8327594)中克隆编码人胰高血糖素受体(胰高血糖素-R)(初始登记号P47871)或人胰高血糖素样肽1受体(GLP-1R)(初始登记号P43220)的cDNA。使用编码用于亚克隆之末端限制性位点的引物，通过PCR扩增编码胰高血糖素-R或GLP-1-R的DNA。5’端引物还编码近似的Kozak共有序列以确保有效翻译。通过DNA测序验证编码胰高血糖素-R和GLP-1-R之DNA的保真性。将编码胰高血糖素-R或GLP-1-R的PCR产物亚克隆到含有新霉素(G418)抗性标记物的哺乳动物表达载体中。通过标准的磷酸钙转染法将编码胰高血糖素-R或GLP-1-R的哺乳动物表达载体转染到HEK293细胞中。转染48小时后，将细胞接种用于有限稀释克隆，并在培养基中用1mg/ml G418进行选择。3周后，挑取表达胰高血糖素-R和GLP-1-R之细胞的12个存活集落，扩增并在如下所述的胰高血糖素-R和GLP-1-R效力测定中进行测试。选择一个表达胰高血糖素-R的克隆和一个表达GLP-1-R的克隆进行化合物分析(compound profiling)。
胰高血糖素受体和GLP-1受体效力测定
将表达人胰高血糖素-R或人GLP-1-R的HEK293细胞以40,000个细胞/孔接种在包被有0.01％聚-L-赖氨酸的96孔微滴定板上，并在100μl生长培养基中培养1天。在分析当天，去除生长培养基，用200μl Tyrode缓冲液洗涤细胞1次。在37℃下于含有浓度升高的受试肽、100μM IBMX和6mM葡萄糖的100μl Tyrode缓冲液中孵育细胞15分钟。通过添加25μl 0.5M HCl终止反应，并在冰上孵育60分钟。根据制造商的说明书使用来自Perkin-Elmer的
Figure BDA00002623260600221
cAMP试剂盒评估cAMP含量。通过计算机辅助的曲线拟合评估EC50和与参照化合物(胰高血糖素和GLP-1)相比较的相对效力。
HbA1c确定
可以通过确定血红蛋白A1C(HbA1c)的水平来评估化合物对对象的葡萄糖水平的长期作用。HbA1c是血红蛋白的糖基化形式，其在细胞中的水平反映所述细胞在其生命周期中接触的平均葡萄糖水平。在小鼠中，HbA1c是之前4周平均血液葡萄糖水平的相关生物标志物，因为HbA1c的转化受限于红细胞的寿命(约47天)(Abbrecht和Littell，1972；J.Appl.Physiol.32，443-445)。
根据免疫抑制比浊法(Turbidimetric INhibition ImmunoAssay，TINIA)确定HbA1c，其中样品中的HbA1c与抗HbA1c抗体反应形成可溶性抗原-抗体复合物。添加聚半抗原与过量的抗HbA1c抗体反应形成不溶性抗体-聚半抗原复合物，其可通过比浊法来测量。溶血的样品中释放的血红蛋白被转化成为具有特征性吸收谱的衍生物，其可在预孵育期间通过双色法测量。最终的结果表示为总血红蛋白的HbA1c百分比(
Figure BDA00002623260600222
Application note A1C-2)。
胆固醇水平测定
该测定是酶比色法。在镁离子存在下，硫酸葡聚糖选择性地与LDL、VLDLA和乳糜微粒形成水溶性复合物，其对PEG修饰的酶有抗性。通过以PEG与氨基偶联的胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶酶法测定HDL胆固醇。胆固醇酯定量分解成游离胆固醇和脂肪酸。HDL胆固醇被酶促氧化为胆甾-4-烯-3-酮和H2O2，以比色法测量所形成的H2O2(
Figure BDA00002623260600231
Application note HDLC3)。
通过非离子去污剂和糖化合物与脂蛋白(VLDL和乳糜微粒)的相互作用，利用LDL选择性胶束增溶来直接测定LDL。糖化合物与去污剂的组合使得可以选择性地测定血浆中的LDL。测试原理与胆固醇和HDL的测试原理相同，但由于糖和去污剂，仅LDL胆固醇酯分解成游离胆固醇和脂肪酸。随后氧化游离胆固醇，以比色法测量所形成的H2O2(Application note LDL_C，
Figure BDA00002623260600232
)。
所测试的GPCR-B靶标
针对以下的受体：降血钙素基因相关肽1(CGRP1)、促肾上腺皮质激素释放因子1和2(CRF1和CRF2)、肠抑胃肽(GIP)、胰高血糖素样肽1和2(GLP-1和GLP-2)、胰高血糖素(GCGR)、胰泌素、促性腺激素释放激素(GnRH)、甲状旁腺激素1和2(PTH1和PTH2)、血管活性肠肽(VPAC1和VPAC2)。
针对其他B类受体的测定设计
通过测定样品化合物(胰高血糖素类似物)并以所分析的每个GPCR的Emax对照作为参照而获得激动剂活化百分数测定值。通过测定样品化合物并以所分析的每个GPCR的对照EC80孔作为参照而获得拮抗剂抑制百分数测定值。使用针对激动剂和拮抗剂测定应用的“双添加”测定方案来应用样品。方案设计如下：
化合物制备主储存液(master stock solution)
除非另有指明，否则将样品化合物在包含所有稀释剂的100％无水DMSO中稀释。如果在不同溶剂中提供样品化合物，则所有主储存稀释在指定的溶剂中进行。所有对照孔包含与样品化合物孔相同的溶剂终浓度。
用于测定的化合物板
将胰高血糖素类似物从主储存液转移到用于测定的子板中。将每个样品化合物以适当的浓度稀释到测定缓冲剂(具有20mM HEPES和2.5mM丙磺舒的1×HBSS)中，以获得指定的终浓度。
钙流量测定激动剂测定方式
将胰高血糖素类似物以100nM和1nM一式两份地置于板中。本文所述的浓度反映拮抗剂测定期间化合物的终浓度。如上所述使用参照激动剂作为测定对照。如上所述使用参照激动剂用于Emax。使用FLIPRTETRA在90秒内读取测定值。
拮抗剂测定方式
使用之前确定的EC80值，刺激全部预孵育的样品化合物和具有参照激动剂的EC80的参照拮抗剂(如果可用的话)孔。使用FLIPRTETRA读取180秒(其向各孔中另外添加参照激动剂)，然后采集荧光测量值以计算IC50值。
食蟹猴(Cynomolgus monkey)中的PK
在第1天和第8天分别用20nmol化合物6/kg i.v.和20nmol化合物6/kg s.c.作为单剂量对食蟹猴(雄性，N＝2)给药。在以下时间点抽取血浆样品：给药前，i.v.给药后5、10、30分钟、1、2、4、8、12、24和36小时，以及给药前，s.c.给药后10、30分钟、1、2、4、8、12、24、36和48小时。载剂由pH为7.4的25mM磷酸盐缓冲盐水(25mM磷酸钠、25mM NaCl)组成。分析血浆样品如下：使用蛋白质沉淀，然后进行固相提取和LC-MS/MS分析。使用WinNonLin 4.1版中的非房室分析计算药物代谢动力学参数。
在db/db小鼠中，皮下施用Glu-GLP-1激动剂化合物6六周对HbA1c的 作用
5至6周龄的db/db(BKS.Cg-m+/+Leprdb/J)雄性小鼠获自CharlesRiver Laboratories(德国)，并使它们适应自由获取正常的普通饲料(chow)和水的新环境。将所述动物按照相似的平均HbA1c分组，并用化合物6(1、2.5和5nmol/kg)或载剂每天两次s.c.处理6周。在整个研究中，每天记录体重，并利用所记录体重施用经体重修正之剂量的肽。在处理前以及随后在研究期间每周一次测量血液样品的HbA1c水平。最后一次获取血液样品之后立即处死所有动物。
在饮食诱导的肥胖小鼠(30天高脂饮食)中，用双Glu-GLP-1激动剂化 合物6处理三周对口服葡萄糖耐量和体重的作用。
使6周龄的雄性C57Bl/6J小鼠适应自由获取高脂饮食和水的新环境。将36周龄动物按照相似的平均禁食(6小时)血糖(从尾尖获取的血液样品评估的)随机分组。用化合物6或载剂以每天两次s.c处理小鼠三周。每天记录体重。肽处理之后，使动物经受6小时禁食之后进行口服葡萄糖耐量测试(OGTT)。在早晨用肽或载剂对动物给药。约4小时后，获取初始血液样品(禁食血液葡萄糖水平)。随后，给予口服剂量的葡萄糖，并将动物放回其饲养笼中(t＝0)。在t＝15分钟、t＝30分钟、t＝60分钟、t＝90分钟和t＝120分钟时测量BG。采血之后立即通过CO2麻醉随之颈椎脱臼而处死所有动物。
通过以下实施例对本发明进行进一步举例说明。
实施例1：对胰高血糖素受体和GLP-1受体的效力
Figure BDA00002623260600251
表1：如上所述测量的EC50值
实施例2：在猴中皮下和静脉内施用后的药物代谢动力学研究
将化合物6向猴给药以测试皮下施用(其为人中的预期途径)之后的药物代谢动力学和生物利用度。化合物6示出43％±8.1的生物利用度、8.2小时±2.0的t1/2和4至8小时的tmax。通过皮下途径进行的每日一次的可行剂量的施用之后，化合物6的药物代谢动力学特性可以预测人中针对胰高血糖素受体和GLP-1受体的EC50以上的持续暴露。
实施例3：在db/db小鼠中，皮下施用Glu-GLP-1激动剂化合物6六周对HbA1c的作用
以100μl载剂(每天一次)对动物s.c.注射3天时间，以使动物适应抓取和注射。将动物按照相似的平均HbA1c随机分组。然后用化合物6(1、2.5或5nmol/kg)或载剂s.c.处理小鼠每天两次。在处理之前以及六周处理中每周一次，从眶后静脉丛获取血液样品。
使用Cobas c111分析仪(Roche Diagnostics，Mannheim，Germany)针对HbA1c对血液样品进行分析。在取样的24小时内对用于HbA1c分析的样品进行分析。
在整个研究中，每天记录体重，并利用所记录体重施用经体重修正之剂量的肽。临给药前制备溶液。
如从db/db小鼠模型所预期的那样，观察到HbA1c随时间升高(图1)。在六周的处理期间，我们在载剂组中观察到HbA1c升高了27％。
所有剂量的化合物6未在任意时间点降低载剂处理的动物中观察到的HbA1c随时间的升高(图1)。
在6周的处理期间，我们在载剂组中观察到体重增长了22％。与载剂相比，化合物6(5nmol/kg)显著地降低了体重增长(p＜0.0001，图2)。
如由db/db小鼠中的HbA1c所评估的那样，研究了用双Glu-GLP-1激动剂化合物6处理六周对血糖控制的作用。
如所预期的那样，db/db小鼠模型示出HbA1c随时间升高。用化合物6处理六周未显著地降低在经载剂处理的db/db小鼠观察到的HbA1c随时间的升高。
用化合物6(5nmol/kg)处理六周未显著地降低在经载剂处理的db/db小鼠中观察到的体重随时间的增长。
实施例4：在饮食诱导的肥胖C57BL/6J小鼠(六个月高脂饮食)中，皮下施用Glu-GLP-1激动剂化合物6三周对口服葡萄糖耐量和体重的作用体重
化合物6将体重降低了38.7％(p＜0.05)(图3)。有趣的是，用化合物6处理三周的高脂饲喂动物所获得的体重稳定至与规律的普通饲料饮食的未经处理对照动物所获得的体重相同(图3)。
OGTT(口服葡萄糖耐量测试)
用化合物6处理3周对葡萄糖耐量没有显著影响(如AUC降低所衡量的那样)(图4)。
化合物6显著地将饮食诱导的肥胖小鼠(30周高脂饮食)的体重降低至如规律的普通饲料饮食的未经处理对照动物中所观察到的水平(图3)。化合物6的作用显著地降低了禁食血糖。化合物6未显著地升高口服葡萄糖耐量。
体重减轻和葡萄糖处理的这些差异可以反映Glu-GLP-1激动剂化合物6针对GLP-1受体的效力(表1)和/或暴露。所述差异还可以与GLP-1及GLP-1类似物及Glu-GLP-1激动剂之间在作用机制中的差异相关。已知毒蜥外泌肽-4和另一些GLP-1类似物通过葡萄糖依赖性胰岛素分泌的刺激、胃排空的抑制以及胰高血糖素分泌的抑制来调节血糖。除了如这些对GLP-1受体的作用以外，化合物6还结合并活化GluR(见表1)。
在饮食诱导的肥胖小鼠中，化合物6显著地降低体重。化合物6未提高在口服葡萄糖耐量测试过程中所测量的葡萄糖耐量。
实施例5：在30周高脂饮食饲喂的小鼠中，皮下施用Glu-GLP-1激动剂化合物6三周对脂质的作用。
对在用载剂(PBS)、10nmol/kg毒蜥外泌肽-4或10nmol/kg化合物6每天两次处理(s.c.)之前已经高脂饮食30周的小鼠处理3周对脂质的作用(图5)。针对LDL、HDL和甘油三酯(CHO：总胆固醇；HDL：高密度胆固醇；LDL：低密度胆固醇；TRIG：甘油三酯；HDL/LDL：HDL与LDL的比值)对该作用进行测量。
化合物6示出显著降低的总胆固醇、HDL、LDL(P＜0.001)和甘油三酯(P＜0.05)，而HDL/LDL比值显著升高(p＜0.001)(图5)。HLD/LDL比值被认为是心脏疾病的风险指标。该比值越高，心脏病发作或其他心血管问题的风险越低。
实施例6：化合物6对CGRP和另一些受体的反筛选(counterscreen)
测试了化合物6在1(1.25)nM、100(125)nM和10,000(12,500)nM下对降血钙素基因相关肽1(CGRP1)、促肾上腺皮质激素释放因子1和2(CRF1和CRF2)、肠抑胃肽(GIP)、胰高血糖素样肽1和2(GLP-1和GLP-2)、胰高血糖素(GCGR)、胰泌素、促性腺激素释放激素(GnRH)、甲状旁腺激素1和2(PTH1和PTH2)、血管活性肠肽(VPAC1和VPAC2)的激动剂活性和拮抗剂活性。
观察到了对以下受体的激动剂活性：
GLP-1受体：化合物6在12.5μM和125nM表现出激动剂活性胰高血糖素受体：化合物6在12.5μM和125nM表现出激动剂活性
观察到了对以下受体的拮抗剂活性：
GRF2受体：化合物6在10μM表现出拮抗剂活性
GIP受体：化合物6在10μM和100μM表现出拮抗剂活性
胰泌素受体：化合物6在10μM表现出拮抗剂活性。
实施例7：在高脂饲喂的C57BL/6J小鼠中，化合物6和7对体重增长的作用
使C57BL/6J小鼠适应自由获取高脂饮食和水的新环境4周。然后用化合物6和化合物7(两种剂量：0.5nmol/kg和5nmol/kg)或载剂每天两次s.c.处理小鼠10天。在整个研究过程中，每天记录体重，并利用所记录体重施用经体重修正之剂量的肽(图6)。通过颈椎脱臼处死小鼠。
在高脂饲喂的C57BL/6J小鼠中，化合物6和化合物7在两个剂量(0.5nmol/kg和5nmol/kg)显著地降低了体重增长。

Claims (19)

1.具有下式的化合物，或者其可药用盐：
R1-X-Z-R2
其中
R1是H、C1-4烷基、乙酰基、甲酰基、苯甲酰基或三氟乙酰基；
R2是OH或NH2；
X是具有式I的肽：
His-X2-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-X16-X17-Arg-Ala-X20-Asp-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-X27-X28-X29(I)
其中
X2选自Ser和Aib；
X16选自Glu和Y；
X17选自Arg和Y；
X20选自Lys和Y；
X27选自Leu和Y；
X28选自Ser和Y或者不存在；
X29是Ala或者不存在；
其中，X16、X17、X20、X27和X28中的至少一个是Y；
其中，残基Y各自独立地选自Lys、Cys和Orn；
其中，X的至少一个氨基酸残基Y的侧链与具有下式的亲脂取代基缀合：
(i)Z1，其中Z1是直接与所述Y的侧链缀合的亲脂部分；或者
(ii)Z1Z2，其中Z1是亲脂部分，Z2是间隔物，并且Z1通过Z2与所述Y的侧链缀合；
并且Z不存在或者是独立地选自Ala、Leu、Ser、Thr、Tyr、Cys、Glu、Lys、Arg、Dbu、Dpr和Orn的1至20个氨基酸单元的序列。
2.根据权利要求1所述的化合物，其具有序列：
HSQGTFTSDYSKYLDERRAKDFIEWLKSA
HSQGTFTSDYSKYLDERRAKDFIEWLLSA
HSQGTFTSDYSKYLDERRAKDFIEWLLKA
HSQGTFTSDYSKYLDKRRAKDFIEWLLSA
HSQGTFTSDYSKYLDEKRAKDFIEWLLSA或
H-Aib-QGTFTSDYSKYLDEKRAKDFIEWLLSA
3.根据权利要求1或2所述的化合物，其中所述亲脂取代基与第16、17、20、27或28位氨基酸残基相连接。
4.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其中R1是H。
5.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其中R2是NH2。
6.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其具有序列：
H-HSQGTFTSDYSKYLDERRAKDFIEWL-K(十六烷酰基-异Glu)-SA-NH2
H-HSQGTFTSDYSKYLDERRA-K(十六烷酰基-异Glu)DFIEWLLSA-NH2
H-HSQGTFTSDYSKYLDERRAKDFIEWLL-K(十六烷酰基-异Glu)-A-NH2
H-HSQGTFTSDYSKYLD-K(十六烷酰基-异Glu)-RRAKDFIEWLLSA-NH2
H-HSQGTFTSDYSKYLDE-K(十六烷酰基-异Glu)-RAKDFIEWLLSA-NH2或
H-H-Aib-QGTFTSDYSKYLDE-K(十六烷酰基-异Glu)-RAKD FIEWLLSA-NH2。
7.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其中所述化合物中的一个或更多个氨基酸侧链与聚合物部分缀合。
8.根据权利要求7所述的化合物，其中肽X中的一个或更多个氨基酸侧链与聚合物部分缀合。
9.组合物，其包含与载体混合的根据权利要求1至8中任一项所述的化合物或者其盐或衍生物。
10.根据权利要求9所述的组合物，其中所述组合物是可药用组合物，并且所述载体是可药用载体。
11.根据权利要求1至8中任一项所述的化合物，其用于医疗方法中。
12.根据权利要求1至8中任一项所述的化合物，其用于以下方法中：在有此需要的个体中防止体重增长或促进体重减轻。
13.根据权利要求1至8中任一项所述的化合物，其用于以下方法中：在有此需要的个体中降低循环LDL水平和/或提高HDL/LDL比值。
14.根据权利要求1至8中任一项所述的化合物在以下方法中的用途：治疗由体重超重所引起的或者以其为特征的病症。
15.根据权利要求1至8中任一项所述的化合物在以下方法中的用途：在有此需要的个体中治疗和/或预防肥胖症、病态肥胖症、手术前病态肥胖症、肥胖症相关炎症、肥胖症相关胆囊疾病、肥胖症诱导的睡眠呼吸暂停、高血压、致动脉粥样硬化性异常脂肪血症、动脉粥样硬化、动脉硬化、冠心病、外周动脉疾病、中风或微血管疾病。
16.根据权利要求11至15中任一项所述的化合物、用途或方法，其中所述化合物作为联合治疗的一部分与用于治疗肥胖症、异常脂肪血症或高血压的药剂一起施用。
17.根据权利要求16所述的化合物、用途或方法，其中所述用于治疗肥胖症的药剂是胰高血糖素样肽受体1激动剂、肽YY受体激动剂或其类似物、大麻素受体1拮抗剂、脂肪酶抑制剂、黑皮质素受体4激动剂或黑色素浓集激素受体1拮抗剂。
18.根据权利要求16所述的化合物、用途或方法，其中所述用于治疗高血压的药剂是血管紧张素转化酶抑制剂、血管紧张素II受体阻断剂、利尿剂、β-阻断剂或钙通道阻断剂。
19.根据权利要求16所述的化合物、用途或方法，其中所述用于治疗异常脂肪血症的药剂是他汀类、贝特类、烟酸类和/或胆固醇吸收抑制剂。
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