CN112543763A - 从固相裂解固相结合肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于从固相上裂解所述固相结合的多肽的方法，所述方法包括在约23℃至约29℃的范围内的温度下，使所述多肽结合的固相与基本上由三氟乙酸和1,2‑乙二硫醇组成的组合物接触。
Description
本发明涉及一种用于从固相上裂解固相结合的多肽的方法，所述方法包括在约23℃至约29℃的范围内的温度下，使所述多肽结合的固相与基本上由三氟乙酸和1,2-乙二硫醇组成的组合物接触。
本发明进一步涉及一种组合物，其基本上由三氟乙酸和1,2-乙二硫醇组成，其中所述组合物包含95％v/v-99％v/v的量的三氟乙酸和1％v/v-5％v/v的量的1,2-乙二硫醇。
本发明进一步涉及一种组合物的用途，其组合物基本上由三氟乙酸和1,2-乙二硫醇组成，其中所述组合物包含95％v/v-99％v/v的量的三氟乙酸和1％v/v-5％v/v的量的1,2-乙二硫醇，用于从固相上裂解与固相结合的肽。
固相肽合成的已建立方法教导了通过接头将待合成的氨基酸链的预定C末端氨基酸偶联至聚合物载体。用于偶联的氨基酸是具有N末端保护的氨基的氨基酸结构单元，所述保护基是临时连接的Fmoc基。成功偶联后，所述Fmoc保护基被裂解，并且下一个Fmoc保护的氨基酸结构单元与先前氨基酸结构单元的游离氨基官能团偶联。当合成所需的氨基酸链时，它会从固相上裂解。图1给出了所述方法的概述。
在WO 01/04156A1中所述的利西拉来(也称为AVE0010或ZP-10)的固相合成(通过引用包含在本文中)包括以相同的方式使各个Fmoc-保护的氨基酸结构单元偶联。
利西拉来具有序列desPro36毒蜥外泌肽-4(1-39)-Lys6-NH2。在WO 01/04156的SEQID NO:93中披露了这种物质(参见本申请的SEQ ID NO:1和图2)。毒蜥外泌肽是一组可以降低血糖浓度的肽。毒蜥外泌肽与GLP-1(7-36)的序列具有一定的相似性(53％,
等,J.Biol.Chem.268,19650-55)。毒蜥外泌肽-3和毒蜥外泌肽-4通过与毒蜥外泌肽受体的相互作用刺激豚鼠胰腺腺泡细胞中细胞cAMP产生的增加(Raufman,1996,Reg.Peptides 61:1-18)。与毒蜥外泌肽-4相反，毒蜥外泌肽-3可以增加胰腺腺泡细胞中淀粉酶的释放。毒蜥外泌肽充当GLP-1拮抗剂。
胰高血糖素样肽1(GLP-1)是一种内分泌激素，可在口服摄取葡萄糖或脂肪后增强胰岛素反应。GLP-1通常会降低胰高血糖素浓度，减慢胃排空，刺激(促)胰岛素的生物合成，增加对胰岛素的敏感性并刺激非胰岛素依赖的糖原的生物合成(Holst(1999),Curr.Med.Chem.6:1005,Nauck等(1997),Exp.Clin.Endocrinol.Diabetes 105:187，Lopez-Delgado等(1998),Endocrinology 139:2811)。人GLP-1具有37个氨基酸残基(Heinrich等,Endocrinol.115:2176(1984),Uttenthal等,J.Clin.Endocrinol.Metabol.(1985),61:472)。GLP-1的活性片段包括GLP-1(7-36)和GLP-1(7-37)。
结果表明，毒蜥外泌肽-3、毒蜥外泌肽-4和毒蜥外泌肽激动剂可用于治疗糖尿病和预防高血糖症，因为它们可减少胃排空和运动(US 5,424,286和WO 98/0535 A1)。
毒蜥外泌肽类似物的特征可能在于天然毒蜥外泌肽-4序列的氨基酸取代和/或C末端截短。此类毒蜥外泌肽类似物描述于WO 99/07404、WO 99/25727和WO 99/25728中。
在固相上，特别是在树脂上合成的肽的裂解是复杂的化学反应。一方面，必须从固相上裂解肽。另一方面，存在于氨基酸结构单元的侧链上的保护基可以被去除。现在存在于液相中的保护基和保护基片段被所谓的“清除剂”灭活，因为它们仍然可以与肽反应形成不希望的副产物。
用Fmoc保护的氨基酸结构单元生产的固相结合肽可以通过三氟乙酸(TFA)从固相上裂解下来。此外，TFA去除了酸不稳定的保护基，其可以存在于氨基酸结构单元的侧链上。
用于裂解固相结合肽的现有技术方法使用包含TFA和许多清除剂(例如3、4或5种清除剂)的组合物，以去除在从侧链上裂解保护基之后出现并可以共价修饰肽中的氨基酸残基的高反应性物质。King等(Int.J.Peptide Proteine Res:36,1990,255-266)披露了“试剂K”(82.5％TFA，5％苯酚，5％H2O，5％硫代苯甲醚，2.5％1,2-乙二硫醇)与含有2-4种不同清除剂的TFA组合物的比较。发现“试剂K”最有效地裂解和抑制10种不同肽中的不希望的副反应，每种肽含有20-50个氨基酸残基，并且是用基于Fmoc的固相合成方法生产的。在室温下进行测试。
如果从固相的裂解不完全，或者侧链的保护基没有完全去除，则可以重复裂解反应。这种另外的裂解在本文中称为“第二次裂解”或“随后的裂解”。
本发明的问题是在肽，特别是GLP-1激动剂的固相合成中肽产率的提高。如果氨基酸结构单元与固相结合氨基酸链的偶联完全，则氨基酸链从固相上裂解。使含有肽的固相与裂解试剂接触，其中从固相裂解肽，特别是GLP-1激动剂，并去除任选存在于氨基酸侧链上的保护基。
诸位发明人发现反应温度和裂解试剂的组分显著影响肽的产率。鉴于现有技术的裂解方法，本发明的裂解方法的特征在于
1.反应温度增加到室温以上，
2.减少裂解试剂或裂解组合物中组分的数量，或/和
3.任选地，省略“第二次裂解”。
诸位发明人发现，通过本发明的用于从固相裂解固相结合肽(特别是GLP-1激动剂)的方法，可以将肽(粗肽)的产率增加5％，从而降低了成本，增加了生产能力。此外，杂质特征曲线没有明显改变。
通过减少裂解混合物中的组分数量(考虑到比较用King's混合物中的五个组分)，提高了分析质量控制，降低了成本，并在生产过程中的操作变得容易。
省略第二次裂解步骤导致成本降低，并且在生产过程中的处理变得容易。减少了TFA的量，从而促进了TFA的去除。
本发明的第一方面是一种用于从固相上裂解固相结合的多肽的方法，所述方法包括在约23℃至约29℃的范围内的温度，使所述多肽结合的固相与基本上由三氟乙酸和1,2-乙二硫醇组成的组合物接触。
固相合成的方法是本领域技术人员已知的。在优选的方面，从待合成序列的C末端到N末端进行偶联循环。适用于通过氨基酸结构单元从C末端到N末端进行固相肽合成的反应条件是本领域技术人员已知的。本文描述了适用于固相合成的氨基酸结构单元。特别地，所述氨基酸结构单元的N末端氨基被如Fmoc之类的对碱不稳定的保护基保护。图1显示了用Fmoc保护的氨基酸结构单元合成。
在WO 01/04156A1中所述的利西拉来(也称为AVE0010或ZP-10)的固相合成(通过引用包含在本文中)包括以相同的方式使各个Fmoc-保护的氨基酸结构单元偶联。
可以使用适合于肽的固相合成的各种固相。特别地，可以使用包括树脂的固相。所述树脂可以是Rink树脂(Rink酰胺树脂)或
树脂。在优选的方面，所述固相树脂是Rink树脂或Rink酰胺树脂。
特别地，多肽通过接头与树脂，特别是Rink酰胺树脂结合。合适的接头是技术人员已知的。
在本发明中，术语“约”或“大约”是指±10％、±5％或±1％的范围。
在本发明中，“基本上由三氟乙酸和1,2-乙二硫醇组成”特别是指另外的化合物可以少量存在于组合物中。特别地，三氟乙酸和1,2-乙二硫醇以普通的纯度用于本发明的方法中。因此，基本上由三氟乙酸和1,2-乙二硫醇组成的本发明的组合物可包含通常存在于三氟乙酸和1,2-乙二硫醇中的杂质。在本发明的组合物中或在本发明的方法中，三氟乙酸和1,2-乙二硫醇的百分比总计为100％，包括可能存在于三氟乙酸或/和1,2-乙二硫醇中的杂质。
在本发明中，“少量”特别是指在本发明的组合物中或在本发明的方法中使用的反应混合物中可存在另外的化合物，如三氟乙酸或/和1,2-乙二硫醇的杂质，其处于高达1％v/v、高达0.5％v/v、高达0.2％v/v、高达0.1％v/v、高达0.05％v/v或高达0.02％v/v的量。如果存在可为固体的杂质，则百分比以w/v表示。
在本发明的方法中，所述裂解组合物包含特别是约95％v/v至约99％v/v的量的三氟乙酸。
优选地，所述裂解组合物包含约96％v/v至约98％v/v或约97％v/v至约99％v/v的量的三氟乙酸。
更特别地，所述组合物包含约97％v/v的量的三氟乙酸。
在本发明的方法中，所述裂解组合物包含特别是约1％v/v至约5％v/v的量的1,2-乙二硫醇，
优选地，所述裂解组合物包含约2％v/v至约4％v/v或约1％v/v至约3％v/v的量的1,2-乙二硫醇。
更特别地，所述组合物包含约3％v/v的量的1,2-乙二硫醇。
在本发明的方法中，优选的裂解组合物基本上由约96％v/v至约98％v/v的量的三氟乙酸和约4％v/v至约2％v/v的量的1,2-乙二硫醇组成。
在本发明的方法中，优选的裂解组合物基本上由约97％v/v至约99％v/v的量的三氟乙酸组成，并且其余部分为约3％v/v至约1％v/v的量的1,2-乙二硫醇。
在本发明的方法中，另一优选的裂解组合物基本上由约96.5至约97.5％v/v的量的三氟乙酸组成，并且其余部分为约3.5％v/v至约2.5％v/v的量的1,2-乙二硫醇。
在本发明的方法中，另一优选的组合物基本上由约97％v/v的量的三氟乙酸和约3％v/v的量的1,2-乙二硫醇组成。
在本文所述的本发明的方法中，另一优选的组合物基本上由三氟乙酸和1,2-乙二硫醇以8.25:0.25(v:v)的比例组成。
本发明的组合物可以是液体组合物。在本发明的方法中，所述组合物可以按固相上约5至12ml/g的量的肽，特别是固相上7至9ml/g的肽，或固相上约8.5ml/g的肽使用。“固相上的肽”或“树脂上的肽”的重量是指与本发明的组合物接触的肽的重量加上固相或树脂的重量。
更特别地，8.25ml TFA/g固相上的肽和约0.25ml 1,2-乙二硫醇/g固相上的肽可用于本发明的方法中。
在本发明中，出人意料地发现，在高于室温的温度下从树脂上裂解肽导致肽(特别是GLP-1激动剂)的产率增加。
在本发明的方法中，特别是在约25℃至约27℃或约26℃至约29℃的温度下，更特别地在约25.5℃至约26.5℃的温度下，最特别地在约26℃的温度下，使组合物与多肽结合的固相接触。
优选地，在约25℃至约27℃的温度下，使固相与基本上由约97％v/v的量的三氟乙酸和约3％v/v的量的1,2-乙二硫醇组成的组合物接触。
在本发明中还优选地在约26℃至约29℃的温度下，使固相与基本上由约97％v/v的量的三氟乙酸和约3％v/v的量的1,2-乙二硫醇组成的组合物接触。
更优选地，在约25.5℃至约26.5℃，优选地在约26℃的温度下，使固相与基本上由约97％v/v的量的三氟乙酸和约3％v/v的量的1,2-乙二硫醇组成的组合物接触。
在本发明的方法中，使组合物与多肽结合的固相接触1至8小时，更特别地4至8小时。优选使组合物与多肽结合的固相接触约4小时、约5小时、约6小时、约7或约8小时。
在本发明的方法中，最优选使组合物与多肽结合的固相接触3至5小时，特别是4小时。
更优选地，在约25.5℃至约26.5℃，使固相与基本上由约97％v/v的量的三氟乙酸和约3％v/v的量的1,2-乙二硫醇组成的组合物接触约4小时，优选地在约26℃的温度下接触约4小时。
在本发明的又一方面，不进行第二次或随后的裂解。在这方面，在多肽的固相合成中，根据本发明的方法的裂解在单个步骤中进行。
根据本发明的氨基酸结构单元是在肽合成的一个循环中使待合成的氨基酸链延长一个或多个氨基酸的化合物。在优选的方面，根据本发明的氨基酸结构单元使待合成的氨基酸链延长1、2、3或4个氨基酸。在特别优选的方面，根据本发明的氨基酸结构单元使待合成的氨基酸链延长一个或两个氨基酸。
根据本发明的氨基酸结构单元优选地包括一个氨基酸(单氨基酸结构单元)或包括2、3、4或更多个氨基酸的寡肽。在优选的方面，根据本发明的氨基酸结构单元包括一个氨基酸或肽，该肽包括两个氨基酸，如例如Pro-Pro或His-Gly。包括一个以上氨基酸的氨基酸结构单元的氨基酸优选通过肽键连接。包含两个氨基酸的特别优选的氨基酸结构单元是Fmoc-Pro-Pro-OH和Fmoc-His(Trt)-Gly-OH。
发现在利西拉来或毒蜥外泌肽-4的合成中，使用Fmoc-His(Trt)-Gly-OH代替氨基酸结构单元的位置1和2上的His和Gly可以预防不希望的DesGly(2)-利西拉来。此外，所获得的利西拉来没有显示出由消旋作用引起的D-His值的增加。
Fmoc-His(Trt)-Gly-OH可以例如由包括以下步骤的方法形成：
i)使Fmoc-His(Trt)-OH和H-Gly-OBzl甲苯磺酸酯反应，以及
ii)裂解步骤i)中获得的产物的苄基
以获得Fmoc-His(Trt)-Gly-OH。
示例性反应条件在实施例3中列出。
根据本发明的氨基酸结构单元可以包括适当的修饰，以便仅在所需的位置选择性地延长氨基酸链。所述氨基酸结构单元的修饰可以在氨基酸的N末端、C末端和/或侧链上进行。
为了保护所述氨基酸结构单元的N末端氨基官能团(即成功偶联后的氨基，即氨基链的N末端)，多肽合成(尤其多肽的固相合成)中常用的各种保护基都可以使用。本领域技术人员知道那些合适的临时保护基。在优选的方面，可以使用在碱性环境中不稳定的保护基。在优选的方面，所述氨基酸结构单元的N末端氨基被Fmoc保护基保护。
所述氨基酸结构单元的C末端羧基优选保持未保护。
根据本发明的氨基酸结构单元可以彼此独立地包括D-氨基酸和甘氨酸、L-氨基酸和甘氨酸和/或其组合。在优选的方面，根据本发明的氨基酸结构单元的氨基酸彼此独立地选自L-氨基酸和甘氨酸。在优选的方面，所述氨基酸可以选自α-氨基酸。在进一步的方面，所述氨基酸可以选自天然存在的氨基酸，如多肽中天然存在的氨基酸。在另一方面，根据本发明的氨基酸结构单元可以包括人工氨基酸，如Met(O)(蛋氨酸亚砜或蛋氨酸砜)、Trp(O2)(N-甲酰犬尿氨酸)和/或isoAsp(β-天冬氨酸或异天冬氨酸)。在又进一步的方面，所述氨基酸选自Ser、Thr、Trp、Lys、Ala、Asn、Asp、Val、Met、Phe、Ile、Pro、Arg、Glu、Gln、Leu(特别是各自呈D形或各自呈L形)以及Gly。在特别优选的方面，根据本发明的氨基酸结构单元包括选自Arg、Glu、Gln、Leu(特别是各自呈D形或各自呈L形)以及Gly的氨基酸。
特别地，所述氨基酸彼此独立地选择，例如独立于Ser、Thr、Trp、Lys、Ala、Asn、Asp、Val、Met、Phe、Ile、Pro、Arg、Glu、Gln、Leu(特别是各自呈D形或各自呈L形)以及Gly。
在一方面，根据本发明的氨基酸结构单元的至少一个侧链可以被另一保护基保护。所述另一保护基优选与N末端保护基正交。用于所述侧链的合适的保护基是本领域技术人员已知的。合适的保护基的例子是例如Trt、Boc、Bzl、Pdf、tBu和OtBu，可用于保护特定的侧链。本领域技术人员知道哪种侧链需要被哪种类型的保护基保护。在一方面，可以使用实施例1.4中提到的氨基酸结构单元。如果所述氨基酸结构单元包括多于一个的侧链，则这些侧链中的一个或多个可以被保护基保护，所述保护基独立地选自本领域技术人员已知的合适的保护基。
待合成的多肽可以是具有预定序列的每种可能的肽。在优选的方面，待合成的多肽是GLP-1激动剂。所述多肽可以是GLP-1激动剂，其中所述GLP-1激动剂选自GLP-1及其类似物和衍生物、毒蜥外泌肽-3及其类似物和衍生物、毒蜥外泌肽-4及其类似物和衍生物。在优选的方面，所述多肽选自毒蜥外泌肽-4和利西拉来。最优选的肽是利西拉来。在进一步优选的方面，所述多肽选自阿比鲁肽、杜拉鲁肽和索玛鲁肽。
在WO 01/04156、WO 98/30231、US 5,424,286、EP 99610043.4和WO 2004/005342中描述了毒蜥外泌肽-3、毒蜥外泌肽-3的类似物和衍生物、毒蜥外泌肽-4及毒蜥外泌肽-4的类似物和衍生物。这些文件通过引用并入本文。这些文献中所述的毒蜥外泌肽-3、毒蜥外泌肽-4及其类似物和衍生物可以通过根据本发明的方法合成，而另外的修饰可以在合成完成后进行。
利西拉来(SEQ ID NO:1，图2)、毒蜥外泌肽-4(SEQ ID NO:2，图2)和毒蜥外泌肽-3(SEQ ID NO:3，图2)具有高度的序列同一性。利西拉来和毒蜥外泌肽-4的序列在位置1-37处相同。毒蜥外泌肽-4的序列1-39与毒蜥外泌肽-3在39个位置中的37个位置相同(94％)(J.Biol.Chem.267,1992,7402-7405)。本文给出了关于利西拉来或毒蜥外泌肽-4序列的序列位置。从这些序列开始，本领域技术人员可以容易地确定其他序列中的相应位置。
毒蜥外泌肽-3和/或毒蜥外泌肽-4的类似物和衍生物特别包括修饰的氨基酸序列。在一方面，通过缺失一个或多个氨基酸(例如，毒蜥外泌肽-4中的desPro36、desPro37、desAsp28、desMet(O14)和毒蜥外泌肽-3中的各个位置)来修饰氨基酸序列。在一方面，可以替换一个或多个氨基酸(例如毒蜥外泌肽-4中的Met(O14)、Trp(O2)25、isoAsp28、Asp28、Pro38和毒蜥外泌肽-3中的各个位置)，其中可以引入天然存在或人工氨基酸，如例如Met(O)(甲硫氨酸亚砜或甲硫氨酸砜)、Trp(O2)(N-甲酰基犬尿氨酸)和/或isoAsp(β-天冬氨酸或异天冬氨酸)。通过在合成循环中使用各个氨基酸结构单元，可以容易地将人工氨基酸引入序列中。
在一方面，所述多肽的C末端和/或N末端可以被修饰，例如通过添加序列如-(Lys)-、-(Lys)2-、-(Lys)3-、-(Lys)4-、-(Lys)5-、-(Lys)6-和-Asn-(Glu)5-。在优选的方面，另外的氨基酸序列是例如-(Lys)4-、-(Lys)5-、-(Lys)6-和-Asn-(Glu)5-。C末端羧基优选为酸性胺基(-NH2)。任选地，在完成根据本发明的方法的合成循环之后，在单独的步骤中进行C末端和/或N末端的修饰。
在完成根据本发明的方法的合成循环之后，可以任选地在另外的步骤中形成合成的多肽的药学上可接受的盐。形成多肽的药学上可接受的盐的方法是本领域技术人员已知的。优选的药学上可接受的盐是例如乙酸盐。
进一步优选的GLP-1激动剂是毒蜥外泌肽-4的类似物，其选自：
H-desPro36-毒蜥外泌肽-4-Lys6-NH2、
H-des(Pro36,37)-毒蜥外泌肽-4-Lys4-NH2、
H-des(Pro36,37)-毒蜥外泌肽-4-Lys5-NH2及其药学上可接受的盐。
进一步优选的GLP-1激动剂是毒蜥外泌肽-4的类似物，其选自：
desPro36[Asp28]毒蜥外泌肽-4(1-39)、
desPro36[IsoAsp28]毒蜥外泌肽-4(1-39)、
desPro36[Met(O)14,Asp28]毒蜥外泌肽-4(1-39)、
desPro36[Met(O)14,IsoAsp28]毒蜥外泌肽-4(1-39)、
desPro36[Trp(O2)25,Asp28]毒蜥外泌肽-2(1-39)、
desPro36[Trp(O2)25,IsoAsp28]毒蜥外泌肽-2(1-39)、
desPro36[Met(O)14Trp(O2)25,Asp28]毒蜥外泌肽-4(1-39)、
desPro36[Met(O)14Trp(O2)25,IsoAsp28]毒蜥外泌肽-4(1-39)及其药学上可接受的盐。
进一步优选的GLP-1激动剂是选自如上所述的毒蜥外泌肽-4的类似物，其在C末端进一步用-Lys6-NH2肽修饰。
进一步优选的GLP-1激动剂是毒蜥外泌肽-4的类似物，其选自：
H-(Lys)6-desPro36[Asp28]毒蜥外泌肽-4(1-39)-Lys6-NH2、desAsp28Pro36,Pro37,Pro38毒蜥外泌肽-4(1-39)-NH2、
H-(Lys)6-desPro36,Pro37,Pro38[Asp28]毒蜥外泌肽-4(1-39)-NH2、
H-Asn-(Glu)5desPro36,Pro37,Pro38[Asp28]毒蜥外泌肽-4(1-39)-NH2、
desPro36,Pro37,Pro38[Asp28]毒蜥外泌肽-4(1-39)-(Lys)6-NH2、
H-(Lys)6-desPro36,Pro37,Pro38[Asp28]毒蜥外泌肽-4(1-39)-(Lys)6-NH2、
H-Asn-(Glu)5-desPro36,Pro37,Pro38[Asp28]毒蜥外泌肽-4(1-39)-(Lys)6-NH2、
H-(Lys)6-desPro36[Trp(O2)25,Asp28]毒蜥外泌肽-4(1-39)-Lys6-NH2、
H-desAsp28 Pro36,Pro37,Pro38[Trp(O2)25]毒蜥外泌肽-4(1-39)-NH2、
H-(Lys)6-desPro36,Pro37,Pro38[Trp(O2)25,Asp28]毒蜥外泌肽-4(1-39)-NH2、
H-Asn-(Glu)5-desPro36,Pro37,Pro38[Trp(O2)25,Asp28]毒蜥外泌肽-4(1-39)-NH2、
desPro36,Pro37,Pro38[Trp(O2)25,Asp28]毒蜥外泌肽-4(1-39)-(Lys)6-NH2、
H-(Lys)6-desPro36,Pro37,Pro38[Trp(O2)25,Asp28]毒蜥外泌肽-4(1-39)-(Lys)6-NH2、
H-Asn-(Glu)5-desPro36,Pro37,Pro38[Trp(O2)25,Asp28]毒蜥外泌肽-4(1-39)-(Lys)6-NH2、
H-(Lys)6-desPro36[Met(O)14,Asp28]毒蜥外泌肽-4(1-39)-Lys6-NH2、
desMet(O)14Asp28 Pro36,Pro37,Pro38毒蜥外泌肽-4(1-39)-NH2、
H-(Lys)6-desPro36,Pro37,Pro38[Met(O)14,Asp28]毒蜥外泌肽-4(1-39)-NH2、
H-Asn-(Glu)5-desPro36,Pro37,Pro38[Met(O)14,Asp28]毒蜥外泌肽-4(1-39)-NH2、
desPro36,Pro37,Pro38[Met(O)14,Asp28]毒蜥外泌肽-4(1-39)-(Lys)6-NH2、
H-(Lys)6-desPro36,Pro37,Pro38[Met(O)14,Asp28]毒蜥外泌肽-4(1-39)-Lys6-NH2、
H-Asn-(Glu)5-desPro36,Pro37,Pro38[Met(O)14,Asp28]毒蜥外泌肽-4(1-39)-(Lys)6-NH2、
H-(Lys)6-desPro36[Met(O)14,Trp(O2)25,Asp28]毒蜥外泌肽-4(1-39)-Lys6-NH2、
desAsp28Pro36,Pro37,Pro38[Met(O)14,Trp(O2)25]毒蜥外泌肽-4(1-39)-NH2、
H-(Lys)6-desPro36,Pro37,Pro38[Met(O)14,Trp(O2)25,Asp28]毒蜥外泌肽-4(1-39)-NH2、
H-Asn-(Glu)5-desPro36,Pro37,Pro38[Met(O)14,Asp28]毒蜥外泌肽-4(1-39)-NH2、
desPro36,Pro37,Pro38[Met(O)14,Trp(O2)25,Asp28]毒蜥外泌肽-4(1-39)-(Lys)6-NH2、
H-(Lys)6-desPro36,Pro37,Pro38[Met(O)14,Trp(O2)25,Asp28]毒蜥外泌肽-4(1-39)-(Lys)6-NH2、
H-Asn-(Glu)5-desPro36,Pro37,Pro38[Met(O)14,Trp(O2)25,Asp28]毒蜥外泌肽-4(1-39)-(Lys)6-NH2及其药学上可接受的盐。
在进一步的方面，优选的GLP-1激动剂选自GLP-1(特别是GLP-1(7-36)酰胺，SEQID NO:4)、Arg34、Lys26(Nε(γ-谷氨酰(Nα十六烷酰基)))GLP-1(7-37)(利拉鲁肽)、阿比鲁肽、杜拉鲁肽、索玛鲁肽及其药学上可接受的盐。特别地，优选的GLP-1激动剂选自阿比鲁肽、杜拉鲁肽、索玛鲁肽及其药学上可接受的盐。
进一步优选的GLP-1激动剂是利西拉来(SEQ ID NO:1)及其药学上可接受的盐。
本发明的优选方面涉及一种用于从固相上裂解固相结合的多肽的方法，所述方法包括在约23℃至约29℃的范围内的温度下，使所述多肽结合的固相与基本上由三氟乙酸和1,2-乙二硫醇组成的组合物接触，其中所述多肽是利西拉来。
本发明的另一优选方面涉及一种用于从固相上裂解固相结合的多肽的方法，所述方法包括在约23℃至约29℃的范围内的温度下，使所述多肽结合的固相与基本上由三氟乙酸和1,2-乙二硫醇组成的组合物接触，其中所述固相是Rink酰胺树脂，而所述多肽是利西拉来。
本发明的另一优选方面涉及一种用于从固相上裂解固相结合的多肽的方法，所述方法包括在约26℃至约29℃的温度下，使所述多肽结合的固相与基本上由三氟乙酸和1,2-乙二硫醇组成的组合物接触。
本发明的另一优选方面涉及一种用于从固相上裂解固相结合的多肽的方法，所述方法包括在约26℃至约29℃的范围内的温度下，使所述多肽结合的固相与基本上由三氟乙酸和1,2-乙二硫醇组成的组合物接触，其中所述多肽是利西拉来。
本发明的另一优选方面涉及一种用于从固相上裂解固相结合的多肽的方法，所述方法包括在约26℃至约29℃的范围内的温度下，使所述多肽结合的固相与基本上由三氟乙酸和1,2-乙二硫醇组成的组合物接触，其中所述固相是Rink酰胺树脂，而所述多肽是利西拉来。
本发明的另一优选方面涉及一种用于从固相上裂解固相结合的多肽的方法，所述方法包括在26℃的温度下，使所述多肽结合的固相与基本上由三氟乙酸和1,2-乙二硫醇组成的组合物接触。
本发明的另一优选方面涉及一种用于从固相上裂解固相结合的多肽的方法，所述方法包括在26℃的温度下，使所述多肽结合的固相与基本上由三氟乙酸和1,2-乙二硫醇组成的组合物接触，其中所述多肽是利西拉来。
本发明的另一优选方面涉及一种用于从固相上裂解固相结合的多肽的方法，所述方法包括在26℃的温度下，使所述多肽结合的固相与基本上由三氟乙酸和1,2-乙二硫醇组成的组合物接触，其中所述固相是Rink酰胺树脂，而所述多肽是利西拉来。
本发明的又一优选方面涉及一种用于从固相上裂解固相结合的多肽的方法，所述方法包括在约23℃至约29℃的范围内的温度下，使所述多肽结合的固相与基本上由97％的量的三氟乙酸和3％的量的1,2-乙二硫醇组成的组合物接触。
本发明的又一优选方面涉及一种用于从固相上裂解固相结合的多肽的方法，所述方法包括在约23℃至约29℃的范围内的温度下，使所述多肽结合的固相与基本上由97％的量的三氟乙酸和3％的量的1,2-乙二硫醇组成的组合物接触，其中所述多肽是利西拉来。
本发明的又一优选方面涉及一种用于从固相上裂解固相结合的多肽的方法，所述方法包括在约23℃至约29℃的范围内的温度下，使所述多肽结合的固相与基本上由97％的量的三氟乙酸和3％的量的1,2-乙二硫醇组成的组合物接触，其中所述固相是Rink酰胺树脂，而所述多肽是利西拉来。
本发明的又一优选方面涉及一种用于从固相上裂解固相结合的多肽的方法，所述方法包括在约26℃至约29℃的范围内的温度下，使所述多肽结合的固相与基本上由97％的量的三氟乙酸和3％的量的1,2-乙二硫醇组成的组合物接触。
本发明的又一优选方面涉及一种用于从固相上裂解固相结合的多肽的方法，所述方法包括在约26℃至约29℃的范围内的温度下，使所述多肽结合的固相与基本上由97％的量的三氟乙酸和3％的量的1,2-乙二硫醇组成的组合物接触，其中所述多肽是利西拉来。
本发明的又一优选方面涉及一种用于从固相上裂解固相结合的多肽的方法，所述方法包括在约26℃至约29℃的范围内的温度下，使所述多肽结合的固相与基本上由97％的量的三氟乙酸和3％的量的1,2-乙二硫醇组成的组合物接触，其中所述固相是Rink酰胺树脂，而所述多肽是利西拉来。
本发明的又一优选方面涉及一种用于从固相上裂解固相结合的多肽的方法，所述方法包括在26℃的温度下，使所述多肽结合的固相与基本上由97％的量的三氟乙酸和3％的量的1,2-乙二硫醇组成的组合物接触。
本发明的又一优选方面涉及一种用于从固相上裂解固相结合的多肽的方法，所述方法包括在26℃的温度下，使所述多肽结合的固相与基本上由97％的量的三氟乙酸和3％的量的1,2-乙二硫醇组成的组合物接触，其中所述多肽是利西拉来。
本发明的又一优选方面涉及一种用于从固相上裂解所述固相结合的多肽的方法，所述方法包括在26℃的温度下，使所述多肽结合的固相与基本上由97％的量的三氟乙酸和3％的量的1,2-乙二硫醇组成的组合物接触，其中所述固相是Rink酰胺树脂，而所述多肽是利西拉来。
本发明的又一方面是一种用于固相合成包括预定氨基酸序列的多肽的方法，所述方法包括：
(a)将包括未保护的C末端羧基和保护的N末端氨基的氨基酸结构单元的C末端偶联至固相，如Rink酰胺树脂，
(b)使所述氨基酸结构单元的N末端氨基脱保护，
(c)将包括未保护的C末端羧基和保护的N末端氨基的氨基酸结构单元的C末端偶联至步骤(b)的未保护的N末端氨基，
(d)任选地，重复步骤(b)和(c)，以及
(e)如本文所述，通过本发明的方法从固相上裂解多肽。
本文描述了适用于本发明的固相合成方法的氨基酸结构单元。
在本发明的固相合成方法中，可以省略第二次或随后的裂解步骤。在多肽的固相合成中，优选地进行裂解步骤(e)一次。
技术人员知道用于在步骤(a)或/和(c)中偶联以及根据步骤(b)进行脱保护的合适条件
待合成的肽可以是如本文所述的肽。在固相合成方法中，如本文所述，所述多肽可以选自GLP-1、其类似物和衍生物，毒蜥外泌肽-3、其类似物和衍生物，以及毒蜥外泌肽-4、其类似物和衍生物。特别地，所述多肽选自毒蜥外泌肽-4和利西拉来。优选的多肽是利西拉来。所述多肽也可以选自阿比鲁肽、杜拉鲁肽和索玛鲁肽。
在一方面，所述待合成的多肽优选是利西拉来或毒蜥外泌肽-4，其中在偶联氨基酸结构单元Arg(20)、Glu(17)、Gln(13)、Leu(10)或/和Gly(4)之后，可在步骤(c)和(d)之间进行封端步骤。根据本发明，“封端”是未偶联氨基酸结构单元的游离的、未保护的N末端氨基的乙酰化，以终止这些分子中的链延长。此类被封端分子可在纯化过程中从产物中去除。在图1中描述了封端。
特别地，根据本发明的“封端”是指使步骤(c)中获得的产物与包含封端化合物的封端试剂或封端组合物接触，其中所述封端化合物结合至在步骤(c)中未与结构单元偶联的氨基酸链的未保护的N末端氨基上。
在一方面，所述封端组合物包含浓度为0.5％v/v-5％v/v的乙酸酐。在优选的方面，乙酸酐的浓度为1％v/v-3％v/v，更优选为2％v/v。
在一方面，所述封端组合物包含二异丙基乙胺，其中二异丙基乙胺的浓度可以为0.2％v/v-2％v/v，优选为0.5％v/v-2％v/v。二异丙基乙胺的优选浓度为1％v/v。
在一方面，所述封端组合物包含二异丙基乙胺和乙酸酐，其中二异丙基乙胺的浓度可以为0.2％v/v-2％v/v，优选为0.5％v/v-2％v/v，并且乙酸酐的浓度可以为0.5％v/v-5％v/v，优选为1％v/v-3％v/v。
优选地，所述封端组合物包含2％v/v的乙酸酐和1％v/v的二异丙基乙胺。
封端可以进行5至15分钟，特别是约10分钟。
优选的封端用包含2％v/v乙酸酐和1％v/v二异丙基乙胺的封端试剂或封端组合物进行约10分钟。
根据本发明的封端反应可在室温进行。根据本发明的室温涉及大约15℃-25℃的温度、大约20℃-23℃范围内的温度、大约19℃-21℃范围内的温度或大约20℃的温度。
在所述封端步骤中使用的溶剂优选为极性非水溶剂，如乙腈、二甲基亚砜(DMSO)、甲醇、二氯甲烷、N,N-二甲基乙酰胺(DMA)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、N-甲基吡咯烷酮或其混合物。在优选的方面，在所述封端步骤中使用的溶剂是DMF。
本发明的又一方面是一种组合物，其基本上由三氟乙酸和1,2-乙二硫醇组成，其中所述组合物包含95％v/v-99％v/v的量的三氟乙酸和1％v/v-5％v/v的量的1,2-乙二硫醇。
更特别地，本发明的组合物基本上由约97％v/v的量的三氟乙酸和约3％v/v的量的1,2-乙二硫醇组成。
另一优选的组合物基本上由三氟乙酸和1,2-乙二硫醇以8.25:0.25(v:v)的比例组成。
上面结合本发明的方法描述了组合物的其他特征。特别地，如本文所述，本发明的组合物可用于多肽的固相合成中，以如本文所述从固相裂解多肽。
缩写
Ac(N1-N2)：多肽从位置N1到N2的N末端乙酰化片段。
H(N1-N2)或(N1-N2)：从位置N1到N2的多肽片段包括游离的N末端氨基官能团。
Fmoc(N1-N2)：从位置N1至N2的多肽的片段包括保护的N末端氨基官能团，其中保护基为Fmoc。
(N-1)-杂质：与在肽合成过程中非预期肽的出现有关，该肽在某个位置缺少结构单元。如果预期的合成多肽的长度为N，则杂质的长度为N-1。通过封端防止(N-1)杂质的出现。
Fmoc 芴甲氧羰基
Boc 叔丁氧基羰基
Bzl 苄基
Pbf 2,2,5,7,8-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基
tBu 叔丁基
OtBu 邻叔丁基
Trt 三苯甲基
DIPE 二异丙醚
通过以下附图和实施例进一步表征本发明。
附图说明
图1：肽的固相合成。
图2：利西拉来(SEQ ID NO:1)、毒蜥外泌肽-4(SEQ ID NO:2)、毒蜥外泌肽-3(SEQID NO:3)和GLP-1(GLP-1(7-36)酰胺，SEQ ID NO:4)的序列。
图3：在利西拉来合成期间出现乙酰化错误序列。Fmoc-Arg(20)-OH的偶联和随后的封端/Fmoc裂解。应当注意，从合成中省略了位置21(Leu)。(1)Fmoc-(22-44)+Arg、(2)(22-44)+Arg、(3)Ac(22-44)+Arg、(4)Fmoc-(22-44)+Arg+Val。数据显示，在封端步骤中已经形成了乙酰化的片段，但是，错误的位置被乙酰化了[在Arg封端中已经出现了Ac(22-24)+Arg]。
图4：在利西拉来合成期间出现乙酰化错误序列。Fmoc-Gln(13)-OH的偶联和随后的封端/Fmoc裂解。(1)Ac(14-44)，(2)Fmoc(13-44)，(3)Ac(13-44)，(4)(13-44)，(5)(14-44)。数据显示，在封端步骤中已经形成了乙酰化的片段，但是，错误的位置被乙酰化了(Ac(13-44))。
图5：在利西拉来合成期间出现乙酰化错误序列。Fmoc-Lys(12)-OH的偶联和随后的封端/Fmoc裂解。(1)Ac(13-44)、(2)Fmoc(12-44)、(3)Ac(12-44)、(4)(12-44)。数据显示，在封端步骤中已经形成了乙酰化的片段，但是，错误的位置被乙酰化了(Ac(12-44))。
图6：使用HPLC色谱法比较使用根据本发明的封端方法(B)与用在DMF中的10％乙酸酐和5％v/v DIPEA封端20分钟(A)进行的利西拉来合成。(C)(A)和(B)的HPLC色谱图重叠。
图7：利西拉来(粗产物)的HPLC。红色：不希望的乙酰化副产物。
图8：Ac(36-44)的形成，取决于封端混合物和温度。
图9：Ac(23-44)的形成，取决于封端混合物和温度。
图10：Ac(21-44)的形成，取决于封端混合物和温度。
图11：Ac(19-44)的形成，取决于封端混合物和温度。
图12：Ac(18-44)的形成，取决于封端混合物和温度。
图13：Ac(15-44)的形成，取决于封端混合物和温度。
图14：Ac(12-44)的形成，取决于封端混合物和温度。
图15：Ac(8-44)的形成，取决于封端混合物和温度。
图16：Ac(6-44)的形成，取决于封端混合物和温度。
图17：在15℃，室温(RT)和30℃的利西拉来合成中9个不同位置处封端的情况下Ac(X-44)含量的比较。
图18：在15℃，室温(RT)和30℃的利西拉来合成中9个不同位置处封端的情况下Ac[(X-1)-44]含量的比较。
图19：在不同的封端条件下的利西拉来合成中9个不同位置处，在不同条件下封端或未封端的情况下Ac(X-44)含量的比较。
图20：在不同的封端条件下的利西拉来合成中9个不同位置处，在不同条件下或封端未封端的情况下Ac[(X-1)-44]含量的比较。
实施例1
利西拉来的合成
活性物质利西拉来是由44个氨基酸组成的多肽酰胺；乙酸盐起反离子的作用。
在一个字母的代码中，利西拉来的氨基酸序列如下：
H-G-E-G-T-F-T-S-D-L-S-K-Q-M-E-E-E-A-V-R-L-F-1-E-W-L-K-N-G-G-P-S-S-G-A-P-P-S-K-K-K-K-K-K-NH2
通过线性固相合成，从C末端Lys-44开始构建肽链。
合成方法是Fmoc固相肽合成，其中使用Rink酰胺树脂以获得肽酰胺。反应在室温下在DMF中进行。在反应之间，重复洗涤，主要用DMF进行，中间洗涤步骤之一是用异丙醇进行。
聚合载体上的利西拉来的合成可分为以下步骤：
·第一个Fmoc氨基酸(Fmoc-Lys(Boc)-OH)与Rink树脂的偶联
·未反应的氨基的封端
·裂解临时保护基Fmoc
·其他Fmoc-氨基酸或Fmoc-二肽的偶联
·未反应的氨基的封端
·最终Fmoc裂解
·将利西拉来从树脂上裂解并同时去除侧链保护基合成循环如图1所示。
1.1第一个Fmoc氨基酸(Fmoc-Lys(Boc)-OH)与Rink树脂的偶联
在开始合成之前，将Rink酰胺树脂在DMF中溶胀。溶胀进行2-15小时。随后，使用DMF中的25％哌啶将临时保护基Fmoc从Rink酰胺树脂上裂解。该裂解进行了两次；裂解时间分别为5分钟和20分钟。在所述Fmoc裂解之后，用DMF重复洗涤树脂，并用异丙醇洗涤一次。
为了负载所述树脂，第一个Fmoc-氨基酸Fmoc-Lys(Boc)-OH的偶联以过量2.4当量进行。将HOBt水合物、HBTU和DIPEA用作偶联试剂。偶联时间为60-120分钟。
为了用Fmoc-Lys(Boc)-OH完全负载Rink树脂，用偶联试剂HOBt水合物和DIC进行了进一步负载。偶联时间为6-18小时。搅拌混合物，同时进行步骤1.1。随后进行封端。
1.2未反应的氨基的封端
树脂不完全负载的结果是，在树脂上还发现了未反应的氨基。通过添加乙酸酐/DIPEA/DMF(10:5:85)的混合物使它们失活，因此无法进一步偶联。在搅拌的同时，将封端混合物在树脂上保留20分钟。剩余的游离氨基被酰化。随后，将树脂用DMF重复洗涤，并用异丙醇洗涤一次。
实施例4和5中描述了至少在利西拉来合成的5个位置处的根据本发明的封端方法。
1.3.裂解临时保护基Fmoc
使用在DMF中的25％哌啶裂解临时保护基Fmoc。该裂解进行了两次；裂解时间分别为5分钟和20分钟。在所述Fmoc裂解之后，用DMF重复洗涤树脂，并用异丙醇洗涤一次。
1.4其他Fmoc-氨基酸或Fmoc-二肽的偶联
将下一个Fmoc-氨基酸偶联到树脂上的脱保护的氨基上。偶联在DMF中以不同的当量进行。偶联时间为2小时至18小时。HOBt/DIC以及HBTU/DIPEA被用作偶联试剂。
以下衍生物被用作Fmoc-氨基酸：
·Fmoc-Lys(Boc)-OH
·Fmoc-Ser(tBu)-OH
·Fmoc-Pro-OH
·Fmoc-Ala-OH x H2O
·Fmoc-Gly-OH
·Fmoc-Asn(Trt)-OH
·Fmoc-Leu-OH
·Fmoc-Trp(Boc)-OH
·Fmoc-Glu(OtBu)-OH x H2O
·Fmoc-lle-OH
·Fmoc-Phe-OH
·Fmoc-Arg(Pbf)-OH
·Fmoc-Val-OH
·Fmoc-Met-OH
·Fmoc-Gln(Trt)-OH
·Fmoc-Asp(OtBu)-OH
·Fmoc-Thr(tBu)-OH
·Fmoc-His(Trt)-OH
可替代地，也可使用Fmoc-二肽(根据本发明的方法)：
·Fmoc-Pro-Pro-OH(CAS 129223-22-9)
·Fmoc-Ala-Pro-OH(CAS 186023-44-9)
·Fmoc-Ser(tBu)-Gly-OH(CAS 113247-80-6)
·Fmoc-Gly-Pro-OH(CAS 212651-48-4)
·Fmoc-Gly-Gly-OH(CAS 35665-38-4)
·Fmoc-Asn(Trt)-Gly-OH(来自Bachem B-3630)
·Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH(CAS 866044-63-5)
·Fmoc-His(Trt)-Gly-OH
如果根据Kaiser测试(E.Kaiser等,Anal.Biochem.34,1970,595)发现偶联不完全，则可以进一步偶联。为此，再次将Fmoc-氨基酸与HBTU/DIPEA/HOBt水合物一起偶联。
1.5未反应的氨基的封端
参见第1.2点的描述。
1.6最终Fmoc裂解
如第1.3点所述进行最终Fmoc裂解。最后将树脂再次用二异丙醚洗涤，并在减压下干燥。
1.7将利西拉来从树脂上裂解并同时去除侧链保护基
如实施例6所述进行利西拉来从Rink树脂上的裂解。
1.8创造性地利用二肽合成利西拉来
用HBTU/DIPEA/HOBt水合物进行第一个Fmoc-Lys(Boc)-OH与树脂的偶联。在第一个氨基酸Fmoc-Lys(Boc)-OH与Rink酰胺树脂的游离胺偶联后，以下过程步骤以无休止的重复循环进行(另请参见步骤1.3至1.6)：
·Fmoc裂解
·偶联
·必要时进一步偶联
·封端
·最终氨基酸单元偶联后，N末端Fmoc基被裂解。
将标准的Fmoc保护的氨基酸与DIC/HOBt偶联，其中过量的氨基酸和偶联试剂为2-4当量。
在Pro(36)和Pro(37)位置，二肽Fmoc-Pro-Pro-OH与HBTU/DIPEA偶联，而不是两个Fmoc-Pro-OH氨基酸衍生物。
在Pro(31)位置，用HBTU/DIPEA/HOBt水合物进行偶联。
在His(1)和Gly(2)位置，偶联了二肽Fmoc-His(Trt)-Gly-OH，而不是氨基酸衍生物Fmoc-His(Boc)-OH和Fmoc-Gly-OH。
偶联后，在每种情况下用Ac2O/DIPEA进行封端，如实施例4和5中所述。
用在DMF中的25％哌啶进行Fmoc裂解，在每种情况下，先用5分钟的反应时间，然后用20-40分钟的反应时间连续进行。
偶联的完全性通过Kaiser测试进行检查。
在Fmoc基的最后偶联和最后裂解之后，首先用DMF，然后用异丙醇，最后用二异丙醚反复洗涤树脂，然后将其在35℃减压干燥。
用三氟乙酸与清除剂如1,2-乙二硫醇从树脂上裂解粗肽。
在两步HPLC过程中以C18 RP硅胶为固相纯化粗肽。在第一个纯化步骤中，使用了含有0.1％TFA的乙腈/水的缓冲液系统；在第二步中，使用含有AcOH的乙腈/水的缓冲液系统。浓缩合并的溶液后，通过冷冻干燥获得纯的肽。
使用3500g Rink酰胺树脂，其负载量为0.3mmol/g(即1.05mol批次)，得到9970g树脂上的肽。从中获得4636g粗肽。
纯化后，从中获得576g纯肽。MS:4855.5(单同位素摩尔质量)；观察值4855.6。氨基酸测序：发现正确的序列。测定：89.0％(照原样)。
1.9不使用二肽合成利西拉来
通过线性固相合成，从C末端Lys-44开始构建肽链。
将标准的Fmoc保护的氨基酸与DIC/HOBt偶联，其中过量的氨基酸和偶联试剂为2-4当量。
在Pro(37)、Pro(36)、Pro(31)位置，用HBTU/DIPEA/HOBt水合物进行偶联。
每次偶联后均用Ac2O/DIPEA封端。用在DMF中的25％哌啶进行Fmoc裂解，在每种情况下，先用5分钟的反应时间，然后用20分钟的反应时间连续进行。
偶联的完全性通过Kaiser测试进行检查。在Fmoc基的最后偶联和最后裂解之后，首先用DMF，然后用异丙醇，最后用二异丙醚反复洗涤树脂，然后将其在35℃减压干燥。
在三氟乙酸中用清除剂如1,2-乙二硫醇、硫代苯甲醚、苯酚和水进行树脂中粗肽的裂解。
在两步HPLC过程中以C18 RP硅胶为固相纯化粗肽。浓缩合并的溶液后，通过冷冻干燥获得纯的肽。表1比较了在使用二肽和不使用二肽的合成之间外消旋的D-His-利西拉来的含量和纯肽中一些杂质的含量。
表1使用和不使用二肽的利西拉来合成的比较。
数据显示，使用二肽Fmoc-His(Trt)-GIy-OH可以得到利西拉来，其不包含外消旋作用引起的D-His值升高。此外，当使用Fmoc-His(Trt)-GIy-OH时，不再发现desGly(2)-利西拉来。此外，在Pro(36)和Pro(37)链位置(例如desPro(36)-利西拉来或diPro(36)利西拉来)附近的N-1和N+1肽没有出现。
实施例2
毒蜥外泌肽-4的合成、纯化和表征(根据本发明)
活性物质毒蜥外泌肽-4是由39个氨基酸组成的多肽酰胺；乙酸盐起反离子的作用。
在一个字母的代码中，氨基酸序列如下：
H-G-E-G-T-F-T-S-D-L-S-K-Q-M-E-E-E-A-V-R-L-F-I-E-W-L-K-N-G-G-P-S-S-G-A-P-P-P-S-NH2
MW 4186.66g/mol；MW(单同位素)＝4184.03g/mol。
毒蜥外泌肽-4的合成是按照上述顺序，准确按照利西拉来的合成中所述进行的。在位置1和2，用Fmoc-His(Trt)-Gly-OH进行一个循环的偶联。在位置37和38，用Fmoc-Pro-Pro-OH进行一个循环的偶联。在其他位置，用Fmoc-氨基酸(单氨基酸单元)进行偶联。
使用26.666g Rink酰胺树脂，其负载量为0.42mmol/g(即11.2mmol批次)，得到74g树脂上的肽。由此，将65g树脂上的肽裂解，获得28g粗肽。为了纯化，由此，使用21.3g粗肽，获得4.01g纯肽。MS：4184.03(单同位素摩尔质量)：观察值4185.1[M+H]。纯度98.25FI％。
所述二肽的使用证实了从利西拉来获得的结果。使用二肽Fmoc-His(Trt)-GIy-OH可以得到毒蜥外泌肽-4，其不包含外消旋作用引起的D-His值升高。此外，当使用Fmoc-His(Trt)-GIy-OH时，不再发现desGly(2)-毒蜥外泌肽-4。此外，在链位置Pro(36)和Pro(37)(例如desPro(36)-毒蜥外泌肽-4或diPro(36)毒蜥外泌肽-4)附近的N-1和N+1肽没有出现。
实施例3
Fmoc-His(Trt)-Gly-OH的合成
3.1Fmoc-His(Trt)-Gly-OBzl
将40g Fmoc-His(Trt)-OH与32.7g H-Gly-OBzl甲苯磺酸酯和29.37g HBTU一起溶解在400ml乙酸乙酯中。此后，添加33.32ml的N-乙基吗啉。将反应在30℃搅拌4小时。此后，每次用256g的8％碳酸氢钠溶液萃取三次，然后用250ml水洗涤一次。将所得乙酸乙酯溶液的一半蒸发，并在下一步中进一步处理。
3.2Fmoc-His(Trt)-Gly-OH
将THF和甲醇添加至乙酸乙酯相，使得形成5:2:2(w/w/w)的THF/乙酸乙酯/MeOH混合物。随后，添加10g钯碳催化剂(5％)，并将该混合物在30℃和1.1bar的氢气压力下氢化2.5h。此后，滤出催化剂，并将所得溶液蒸发，直到开始形成沉淀为止。随后搅拌1小时，并将溶液在室温下静置4天。滤出产物，随后通过在2-丁酮中在80℃搅拌4小时来萃取。产率：32.9g的Fmoc-His(Trt)-Gly-OH(75％)。
实施例4
利西拉来合成过程中的乙酰化错误序列
4.1测定利西拉来合成过程中乙酰化错误序列的含量
在粗利西拉来产物的HPLC特征曲线中可以看到一些乙酰化错误序列。这些通常是由于被封端树脂上未反应的氨基引起的。通过封端实现的是，不会出现(N-1)杂质，其与所需产物仅略有不同，因此难以通过纯化去除。
通过Edman降解监测完全性和在选定位置的偶联动力学。从利西拉来的合成中取树脂样品，并从中裂解Fmoc基。然后对该树脂样品进行Edman降解，并以此方式可以确定偶联氨基酸与(N-1)氨基酸的比例，从中可以直接推断出偶联产率。Edman降解的结果(表2)显示出较高的偶联值。这些值是如此之高，以至于它们无法说明乙酰化错误序列的量(表2中的HPLC数据)。这意味着必须有形成这些副产物的替代方法。在以下各节中将说明这种情况。
表2：利西拉来合成过程中乙酰化片段的偶联产率和含量。将HPLC数据和Edman结果(Ac(6-44)、Ac(5-44)和Ac(4-44)的共洗脱)中乙酰化错误序列的百分比含量彼此比较。
4.2乙酰化错误序列的形成
为了研究在合成循环中形成乙酰化错误序列的点，在偶联循环中取树脂样品，并裂解肽和使用LC-MS研究。这些研究是在Fmoc-Arg(20)-OH偶联和Fmoc-Gln(13)-OH偶联的位置进行的。
在Fmoc-Arg(20)-OH与利西拉来部分序列H(22-24)的固相结合肽的偶联中，在1小时、2小时、4小时、8小时和24小时的偶联时间后以及封端、随后的Fmoc裂解和缬氨酸(19)的偶联后取样。如图3所示，错误序列Ac(22-44)+Arg在封端步骤中首次出现(3.1％)。因此，在封端过程中，Fmoc基的一小部分被裂解(丢失)并立即被酰化。为了解释名称Ac(22-24)+Arg，应当注意，从合成中省略了位置21(Leu)。
在利西拉来合成过程中对Fmoc-Gln(13)-OH的偶联进行了相同的实验(图4)。在这种情况下，在谷氨酰胺(13)偶联和封端后的Fmoc裂解过程中首次观察到错误序列Ac(13-44)(4.6％)。在Fmoc-Lys(12)-OH偶联后的其余合成过程中，可以看到在封端过程中还形成了Ac(12-44)(4.1％)(参见图5)。
实验表明，有必要寻找如下的封端条件，在这种条件下，可以防止不希望的第N个氨基酸(最后一个偶联)的乙酰化错误序列的形成，而不会将所用混合物的封端能力降低如此显著的程度以致于潜在(N-1)杂质不再被封端。
4.3封端条件的变化
研究了Fmoc-Arg(20)-OH、Fmoc-Leu(10)-OH、Fmoc-Gly(4)-OH和Fmoc-Thr(5)-OH的偶联。各种封端条件相互比较。
在利西拉来实验室合成中改变封端条件。特别注意不希望的Ac(N-44)和所需的Ac([N-1]-44)的含量。测试的条件如下：
·在DMF中的10％乙酸酐/5％DIPEA，进行20分钟
·在DMF中的10％乙酸酐/5％DIPEA，进行10分钟
·在DMF中的2％乙酸酐/1％DIPEA，进行20分钟
·在DMF中的2％乙酸酐/1％DIPEA，进行10分钟
研究是在位置Arg(20)、Leu(10)、Thr(5)和Gly(4)进行的。结果汇总在表3-6中。
还将数据与利西拉来的GMP合成结果进行比较(表3-6中的“GMP封端”)。所述封端条件对应于在DMF中的10％乙酸酐/5％DIPEA的条件。GMP批次中树脂与封端混合物的接触时间延长了7-8分钟，因此是27-28分钟。这是由于抽出封端混合物所需的时间较长。
4.3.1在位置Arg(20)偶联
将Fmoc-Arg(Pbf)-OH与Leu(21)偶联。在没有发生偶联的那些链上(产物H(21-44))，通过随后的封端形成产物Ac(21-44)。在封端过程中，当Fmoc基发生不希望的裂解(H(20-44)的形成)并发生乙酰化(Ac(2044)的形成)时，就会形成Ac(20-44)和H(20-44)两种产物。
从表3可以清楚地看出，不希望的产物H(20-44)和Ac(20-44)的形成程度既取决于封端时间，也取决于乙酸酐和DIPEA的量(参见Ac(20-44)％列)。可以在GMP封端中看到最高百分比值。发现在“在DMF中的2％乙酸酐/1％DIPEA，进行10分钟”的条件下，Ac(20-44)的含量最低。
各种封端混合物的封端能力(以及因此的原始预期用途)大致相同(参见Ac(21-44)列，即所有封端混合物均转换H(21-44))。混合物“在DMF中的2％乙酸酐/1％DIPEA，进行10分钟”也达到了避免(N-1)杂质的所需目的。
表3：在位置20的Fmoc-Arg(Pbf)-OH的偶联结果。该表显示了取决于封端条件的乙酰化和非乙酰化片段的含量。通过LC-MS获得结果。将数据与GMP合成(“GMP封端”)的结果进行比较。
4.3.2在位置Leu(10)、Gly(4)和Thr(5)偶联
在表4中给出Leu(10)的结果，并确认从位置Arg(20)获得的结果。在“2％乙酸酐，1％DIPEA，进行10分钟”的条件下，在产物H(11-44)的游离氨基封端期间形成的不希望的产物Ac(10-44)和H(10-44)的含量最低。不同封端混合物中的封端能力相当。
表4：在位置10的Fmoc-Leu-OH的偶联结果。该表显示了取决于封端条件的乙酰化和非乙酰化片段的含量。通过LC-MS获得结果。
对于Gly(4)的偶联，不希望的产物Ac(4-44)的含量也取决于封端混合物和反应时间。不同混合物中的封端能力相同(表5)。
表5：在位置4的Fmoc-Gly-OH的偶联结果。该表显示了取决于封端条件的乙酰化和非乙酰化片段的含量。通过LC-MS获得结果。
除了位置Arg(20)、Leu(10)和Gly(4)，还研究了位置Thr(5)。与前三个位置相反，在各种封端条件下，不希望的产物Ac(N-44)(位置5处Ac(5-44))的含量大致相同。但是，此处不同混合物的封端能力也相当(表6)。
表6：在位置5的Fmoc-Thr(tBu)-OH的偶联结果。该表显示了取决于封端条件的乙酰化和非乙酰化片段的含量。通过LC-MS获得结果。
4.3.3总结
在位置Arg(20)、Leu(10)和Gly(4)处，温和的封端混合物(在DMF中的2％乙酸酐/1％DIPEA，进行10分钟)足以保持通过酰化避免(N-1)杂质的所需效果。但是，在这三种情况下，Ac(20-44)、Ac(10-44)和Ac(4-44)的各自形成取决于封端时间以及封端混合物。这不适用于位置Thr(5)。
实施例5
利西拉来的合成
所述实施例涉及利西拉来的合成(参见SEQ ID NO:1)。在合成开始时，固相结合接头带有Fmoc保护基。在偶联循环中，各个氨基酸单元从C末端(第44位)开始朝N末端偶联，这由以下步骤组成：
·Fmoc裂解
·Fmoc保护的氨基酸单元的偶联以及
·封端。
在位置Arg(20)、Glu(17)、Gln(13)、Leu(10)和Gly(4)处，使用了根据本发明的封端方法(在DMF中的2％乙酸酐/1％DIPEA，进行10分钟)。对于这些位置，以下描述了偶联循环的说明。在其他位置，用在DMF中的10％乙酸酐/5％DIPEA进行封端20分钟。举例来说，描述了在位置Thr(5)处的该封端。根据本发明的封端方法包括较温和的条件。
批次大小为1050mmol Rink树脂。
5.1.在位置20的Fmoc-Arg(Pbf)-OH的偶联
5.1.1Fmoc裂解
将7l DMF添加到反应器中，随后添加在16.6l DMF中的7.9l哌啶的混合物。将该混合物搅拌5分钟，然后抽滤。重复该过程，并搅拌30分钟；然后再次进行抽滤。Fmoc裂解后，按以下顺序将树脂洗涤7次：DMF(31.1l)、DMF(31.1l)、异丙醇(31.1l)、DMF(31.1l)、DMF(8l)、DMF(31.1l)、DMF(31.1l)。每次在该反应器中填充各自的洗涤溶剂，然后搅拌3分钟，并再次进行抽滤。
5.1.2Fmoc-Arg(Pbf)-OH的偶联
将21l的DMF添加到反应器中。此后，称重2.125kg的FmocArg(Pbf)-OH，并添加5.3l的DMF。完全溶解后，将该溶液注入到反应器中，随后注入在2.2l DMF中的502g羟基苯并三唑水合物(HOBt水合物)的溶液。最后，将413g N,N-二异丙基碳二亚胺(DIC)添加到反应器中。偶联时间为6-18小时。偶联后，通过抽吸从树脂中滤出溶剂，并立即继续封端。
5.1.3封端(根据本发明)
将26.3l DMF填充到反应器中。同时，在2l的Schott瓶中将1.2l的DMF、0.53l的乙酸酐和0.26l的二异丙基乙胺(DIPEA)混合并添加到反应器中的树脂中。将反应器搅拌10分钟，然后进行抽滤。封端后，按以下顺序将树脂洗涤5次：DMF(24l)、异丙醇(31.1l)、DMF(8l)、DMF(31.5l)、DMF(31.5l)。每次在该反应器中填充各自的洗涤溶剂，然后搅拌3分钟，并再次进行抽滤。
5.2.在位置17的Fmoc-Glu(OtBu)-OH水合物的偶联
5.2.1Fmoc裂解
将7l DMF添加到反应器中，随后添加在16.6l DMF中的7.9l哌啶的混合物。将该混合物搅拌5分钟，然后抽滤。重复该过程，并搅拌30分钟；然后再次进行抽滤。Fmoc裂解后，按以下顺序将树脂洗涤7次：DMF(31.1l)、DMF(31.1l)、异丙醇(31.1l)、DMF(31.1l)、DMF(8l)、DMF(31.1l)、DMF(31.1l)。每次在该反应器中填充各自的洗涤溶剂，然后搅拌3分钟，并再次进行抽滤。
5.2.2Fmoc-Glu(OtBu)-OH水合物的偶联
将21l的DMF添加到反应器中。此后，称重1.453kg的FmocGlu(OtBu)-OH水合物，并添加5.3l的DMF。完全溶解后，将该溶液注入到反应器中，随后注入在2.2l DMF中的502g羟基苯并三唑水合物(HOBt水合物)的溶液。最后，将413g N,N-二异丙基碳二亚胺(DIC)添加到反应器中。偶联时间为6-18小时。偶联后，通过抽吸从树脂中滤出溶剂，并立即继续封端。
5.2.3封端(根据本发明)
将26.3l DMF填充到反应器中。同时，在2l的Schott瓶中将1.2l的DMF、0.53l的乙酸酐和0.26l的二异丙基乙胺(DIPEA)混合并添加到反应器中的树脂中。将反应器搅拌10分钟，然后进行抽滤。封端后，按以下顺序将树脂洗涤5次：DMF(24l)、异丙醇(31.1l)、DMF(8l)、DMF(31.5l)、DMF(31.5l)。每次在该反应器中填充各自的洗涤溶剂，然后搅拌3分钟，并再次进行抽滤。
5.3在位置13的Fmoc-Gln(Trt)-OH的偶联
5.3.1Fmoc裂解
将7l DMF添加到反应器中，随后添加在16.6l DMF中的7.9l哌啶的混合物。将该混合物搅拌5分钟，然后抽滤。重复该过程，并搅拌35分钟；然后再次进行抽滤。Fmoc裂解后，按以下顺序将树脂洗涤7次：DMF(31.1l)、DMF(31.1l)、异丙醇(31.1l)、DMF(31.1l)、DMF(8l)、DMF(31.1l)、DMF(31.1l)。每次在该反应器中填充各自的洗涤溶剂，然后搅拌3分钟，并再次进行抽滤。
5.3.2Fmoc-Gln(Trt)-OH的偶联
将21l的DMF添加到反应器中。此后，称重2.001kg的FmocGln(Trt)-OH，并添加5.3l的DMF。完全溶解后，将该溶液注入到反应器中，随后注入在2.2l DMF中的502g羟基苯并三唑水合物(HOBt水合物)的溶液。最后，将413g N,N-二异丙基碳二亚胺(DIC)添加到反应器中。偶联时间为6-18小时。偶联后，通过抽吸从树脂中滤出溶剂，并立即继续封端。
5.3.3封端(根据本发明)
将26.3l DMF填充到反应器中。同时，在2l的Schott瓶中将1.2l的DMF、0.53l的乙酸酐和0.26l的二异丙基乙胺(DIPEA)混合并添加到反应器中的树脂中。将反应器搅拌10分钟，然后进行抽滤。封端后，按以下顺序将树脂洗涤5次：DMF(24l)、异丙醇(31.1l)、DMF(8l)、DMF(31.5l)、DMF(31.5l)。每次在该反应器中填充各自的洗涤溶剂，然后搅拌3分钟，并再次进行抽滤。
5.4在位置10的Fmoc-Leu-OH的偶联
5.4.1Fmoc裂解
将7l DMF添加到反应器中，随后添加在16.6l DMF中的7.9l哌啶的混合物。将该混合物搅拌5分钟，然后抽滤。重复该过程，并搅拌35分钟；然后再次进行抽滤。Fmoc裂解后，按以下顺序将树脂洗涤7次：DMF(31.1l)、DMF(31.1l)、异丙醇(31.1l)、DMF(31.1l)、DMF(8l)、DMF(31.1l)、DMF(31.1l)。每次在该反应器中填充各自的洗涤溶剂，然后搅拌3分钟，并再次进行抽滤。
5.4.2Fmoc-Leu-OH的偶联
将21l的DMF添加到反应器中。此后，称重1.158kg的Fmoc-Leu-OH，并添加5.3l的DMF。完全溶解后，将该溶液注入到反应器中，随后注入在2.2l DMF中的502g羟基苯并三唑水合物(HOBt水合物)的溶液。最后，将413g N,N-二异丙基碳二亚胺(DIC)添加到反应器中。偶联时间为6-18小时。偶联后，通过抽吸从树脂中滤出溶剂，并立即继续封端。
5.4.3封端(根据本发明)
将26.3l DMF填充到反应器中。同时，在2l的Schott瓶中将1.2l的DMF、0.53l的乙酸酐和0.26l的二异丙基乙胺(DIPEA)混合并添加到反应器中的树脂中。将反应器搅拌10分钟，然后进行抽滤。封端后，按以下顺序将树脂洗涤5次：DMF(24l)、异丙醇(31.1l)、DMF(8l)、DMF(31.5l)、DMF(31.5l)。每次在该反应器中填充各自的洗涤溶剂，然后搅拌3分钟，并再次进行抽滤。
5.5在位置4的Fmoc-Gly-OH的偶联
5.5.1Fmoc裂解
将7l DMF添加到反应器中，随后添加在16.6l DMF中的7.9l哌啶的混合物。将该混合物搅拌5分钟，然后抽滤。重复该过程，并搅拌35分钟；然后再次进行抽滤。Fmoc裂解后，按以下顺序将树脂洗涤7次：DMF(31.1l)、DMF(31.1l)、异丙醇(31.1l)、DMF(31.1l)、DMF(8l)、DMF(31.1l)、DMF(31.1l)。每次在该反应器中填充各自的洗涤溶剂，然后搅拌3分钟，并再次进行抽滤。
5.5.2Fmoc-Gly-OH的偶联
将21l的DMF添加到反应器中。此后，称重1.217kg的Fmoc-Gly-OH，并添加5.3l的DMF。完全溶解后，将该溶液注入到反应器中，随后注入在2.2l DMF中的627g羟基苯并三唑水合物(HOBt水合物)的溶液。最后，将517g N,N-二异丙基碳二亚胺(DIC)添加到反应器中。偶联时间为6-18小时。偶联后，通过抽吸从树脂中滤出溶剂，并立即继续封端。
5.5.3封端(根据本发明)
将26.3l DMF填充到反应器中。同时，在2l的Schott瓶中将1.21的DMF、0.53l的乙酸酐和0.26l的二异丙基乙胺(DIPEA)混合并添加到反应器中的树脂中。将反应器搅拌10分钟，然后进行抽滤。封端后，按以下顺序将树脂洗涤5次：DMF(24l)、异丙醇(31.1l)、DMF(8l)、DMF(31.5l)、DMF(31.5l)。每次在该反应器中填充各自的洗涤溶剂，然后搅拌3分钟，并再次进行抽滤。
5.6在位置5的Fmoc-Thr(tBu)-OH的偶联
5.6.1Fmoc裂解
将7l DMF添加到反应器中，随后添加在16.6l DMF中的7.9l哌啶的混合物。将该混合物搅拌5分钟，然后抽滤。重复该过程，并搅拌35分钟；然后再次进行抽滤。Fmoc裂解后，按以下顺序将树脂洗涤7次：DMF(31.1l)、DMF(31.1l)、异丙醇(31.1l)、DMF(31.1l)、DMF(8l)、DMF(31.1l)、DMF(31.1l)。每次在该反应器中填充各自的洗涤溶剂，然后搅拌3分钟，并再次进行抽滤。
5.6.2Fmoc-Thr(tBu)-OH的偶联
将21l的DMF添加到反应器中。此后，称重1.628kg的FmocThr(tBu)-OH，并添加5.3l的DMF。完全溶解后，将该溶液注入到反应器中，随后注入在2.2l DMF中的627g羟基苯并三唑水合物(HOBt水合物)的溶液。最后，将517g N,N-二异丙基碳二亚胺(DIC)添加到反应器中。偶联时间为6-18小时。偶联后，通过抽吸从树脂中滤出溶剂，并立即继续封端。
5.6.3封端
将10.5l DMF填充到反应器中。同时，在混合容器中将15.8l的DMF、3.2l的乙酸酐和1.6l的二异丙基乙胺(DIPEA)混合，并添加到反应器中的树脂中。将反应器搅拌20分钟，然后进行抽滤。封端后，按以下顺序将树脂洗涤5次：DMF(24l)、异丙醇(31.1l)、DMT(8l)、DMF(31.5l)、DMF(31.5l)。每次在该反应器中填充各自的洗涤溶剂，然后搅拌3分钟，并再次进行抽滤。
5.7结果
图6显示了在位置Arg(20)、Glu(17)、Gln(13)、Leu(10)和Gly(4)处用根据本发明的封端方法以及在5.6.3中所述的其他偶联中的封端进行的利西拉来合成的粗产物的HPLC色谱图。指示出了具有杂质乙酰基(20-44)、乙酰基(17-44)、乙酰基(13-44)、乙酰基(10-44)和乙酰基(4-44)/乙酰基(6-44)的峰。
5.8比较
进行了所有偶联的封端步骤(如5.6.3中所述)，导致不希望的错误序列Ac(20-44)、Ac(17-44)、Ac(13-44)、Ac(10-44)和Ac(4-44)/Ac(6-44)的形成增加。来自该测试的粗利西拉来的HPLC色谱图如图6A所示。
图6B显示了在位置Arg(20)、Glu(17)、Gln(13)、Leu(10)和Gly(4)处用根据本发明的封端方法合成的粗利西拉来的HPLC色谱图。
图6C显示了图6A和6B的HPLC色谱图的叠加图。很明显，在批操作中使用根据本发明的封端方法合成利西拉来可明显减少错误序列Ac(20-44)、Ac(17-44)、Ac(13-44)、Ac(10-44)和Ac(4-44)/Ac(6-44)。
通过使用较温和的封端混合物(在DMF中的2％乙酸酐/1％DIPEA，进行10分钟)，可以降低利西拉来粗产物中Ac(20-44)、Ac(17-44)、Ac(13-44)、Ac(10-44)和Ac(4-44)的乙酰化错误序列的水平或从中消除它们。由于通过根据本发明的封端制备的利西拉来粗产物包括特别地大量减少的乙酰化副产物Ac(17-44)、Ac(13-44)和Ac(10-44)，因此利西拉来的纯化被简化。结果，在第一次利西拉来的制备性色谱运行之后，将级分合并，得到了满足规格标准的更多级分，因此不必丢弃。这导致产率提高。
实施例6
利西拉来合成中9个特定位置处的封端
如实施例5中所讨论的，在位置Arg(20)、Glu(17)、Gln(13)、Leu(10)或/和Gly(4)处使用“温和的”封端条件合成利西拉来可改善不希望的副产物的特征曲线。
该实施例描述了封端条件对乙酰化和非乙酰化副产物形成的影响。温度(15℃，室温[20℃-23℃]，30℃)、封端持续时间和封端组合物成分的变化：
·没有封端，
·温和的封端条件：用2％乙酸酐和1％DIPEA(二异丙基乙胺)封端10分钟
·“正常”封端条件：用10％乙酸酐和5％DIPEA封端20分钟
·用10％乙酸酐和5％DIPEA封端40分钟
本发明的封端条件是“温和的条件”。这些条件用于实施例5中。发现这些条件是有利的。
在该实施例中选择的9个位置处，在(N-1)位置封端时获得了乙酰化序列(图7)。另外，在封端步骤期间，可能发生在氨基酸结构单元上的Fmoc基的不希望的去除。未保护的氨基可以被封端试剂或封端组合物乙酰化。在这方面，改善的封端条件可以避免Fmoc基的不希望的裂解。
6.1二肽结构单元Pro-Pro,(36-44)偶联后在位置36/35封端
通过固相合成生产肽Fmoc-(36-44)-AVE0010。将树脂分为4部分干燥。在室温(20℃-23℃)下，每个部分均经过上述四个封端程序之一。干燥样品，并从树脂上裂解肽。重复该程序，其中在15℃或30℃进行封端。
总共获得了12个肽样品。用LCMS分析12个肽样品。由TIC(总离子流)确定分子量。确定了以下化合物的分子量：
表7
表8显示了在Fmoc-ProPro偶联和亚序列封端后获得的产物的含量(占总肽含量的％)。
结果描述于图8中。找不到化合物(36-44)、(38-44)和Ac(38-44)，或者发现的量很小。在大多数情况下，不希望的产物Ac(36-44)的数量会随着封端混合物的强度和封端持续时间而增加。该产物的量随温度增加。
6.2偶联结构Ile,(23-44)之后，在位置23封端
Fmoc(23-44)的合成如6.1节所述。在15℃/30℃和室温下进行了不同批次的实验。
表9显示了Fmoc-Ile偶联和亚序列封端后获得的产物的含量(占总肽含量的％)
结果描述于图9中。取决于RT和30℃的封端试剂，不希望的化合物Ac(23-44)的含量增加。在20℃“正常”封端会产生0.26％的Ac(23-44)。封端的延长(从20分钟改为40分钟)对Ac(23-44)含量有负面影响。
所需产物Ac(24-44)的形成与封端组合物无关。
6.3偶联结构单元Leu,(21-44)之后，在位置21封端
Fmoc(21-44)的合成如6.1节所述。在15℃/30℃和室温下进行了不同批次的实验。
表10显示了Fmoc-Leu偶联和亚序列封端后获得的产物的含量(占总肽含量的％)
结果描述于图10中。在15℃、RT和30℃，“40分钟，10％Ac2O，5％DIPEA”中不希望的化合物Ac(21-44)的含量最大。化合物Ac(21-44)的含量随温度增加。
所需化合物Ac(22-44)的形成与封端组合物无关。即使没有封端，也会形成这种化合物。
6.4偶联结构单元Val,(19-44)之后，在位置19封端
Fmoc(19-44)的合成如6.1节所述。在15℃/30℃和室温下进行了不同批次的实验。
表11显示了Fmoc-Val偶联和亚序列封端后获得的产物的含量(占总肽含量的％)
结果描述于图11中。在15℃、RT和30℃，化合物Ac(19-44)的含量在“40分钟，10％Ac2O，5％DIPEA”下最大。化合物Ac(19-44)的含量随温度增加。
所需化合物Ac(20-44)的形成随封端组合物的强度而增加。不希望的(20-44)的含量随着封端组合物强度的增加而降低。
6.5偶联结构单元Ala(18-44)之后，在位置18封端
Fmoc(18-44)的合成如6.1节所述。在15℃/30℃和室温进行了不同批次的实验。
表12显示了Fmoc-Ala偶联和亚序列封端后获得的产物的含量(占总肽含量的％)
结果描述于图12中。在15℃和30℃，“40分钟，10％Ac2O，5％DIPEA”中不希望的化合物Ac(18-44)的含量最大。随着温度从15℃增加到30℃，化合物Ac(18-44)的含量增加。
随着封端组合物的强度，所需化合物Ac(19-44)的形成在15℃和30℃增加。
6.6偶联结构单元Glu(15-44)之后，在位置15封端
Fmoc(15-44)的合成如6.1节所述。在15℃/30℃和室温下进行了不同批次的实验。
表13显示了Fmoc-Glu偶联和亚序列封端后获得的产物的含量(占总肽含量的％)
结果描述于图13中。在15℃、RT和30℃，“40分钟，10％Ac2O，5％DIPEA”中不希望的化合物Ac(15-44)的含量最大。化合物Ac(15-44)的含量随温度增加。
所需化合物Ac(16-44)的形成与封端组合物无关。即使没有封端，也会形成这种化合物。
6.7偶联结构单元Lys(12-44)之后，在位置12封端
Fmoc(12-44)的合成如6.1节所述。在15℃/30℃和室温进行了不同批次的实验。
表14显示了Fmoc-Lys偶联和亚序列封端后获得的产物的含量(占总肽含量的％)
结果描述于图14中。在15℃、RT和30℃，“40分钟，10％Ac2O，5％DIPEA”中不希望的化合物Ac(12-44)的含量最大。化合物Ac(12-44)的含量随温度增加。
所需化合物Ac(13-44)的形成与封端组合物无关。即使没有封端，也会形成这种化合物。
6.8偶联结构单元Ser(8-44)之后，在位置8封端
Fmoc(8-44)的合成如6.1节所述。在15℃，室温和30℃进行了同一批次实验。
表15显示了在Fmoc-Ser偶联和亚序列封端后获得的产物的含量(占总肽含量的％)
结果描述于图15中。在15℃、RT和30℃，“40分钟，10％Ac2O，5％DIPEA”中不希望的化合物Ac(8-44)的含量最大。化合物Ac(8-44)的含量随温度增加。
6.9偶联结构单元Phe(6-44)之后，在位置6封端
Fmoc(86-44)的合成如6.1节所述。在15℃，室温和30℃进行了同一批次实验。
表16显示了在Fmoc-Phe偶联和亚序列封端后获得的产物的含量(占总肽含量的％)
结果描述于图16中。在15℃、RT和30℃，“40分钟，10％Ac2O，5％DIPEA”中不希望的化合物Ac(6-44)的含量最大。化合物Ac(6-44)的含量随温度增加。
所需化合物Ac(7-44)的形成与封端组合物无关。即使没有封端，也会形成这种化合物。
温度仅对所需化合物Ac(7-44)的形成产生轻微影响。不希望的(7-44)的含量随着封端组合物强度的增加而降低。
6.10总结
Ac(X-44)-化合物的不希望的形成很大程度上取决于封端持续时间、封端组合物和封端温度。随着封端持续时间的增加、封端温度的增加以及封端组合物中乙酸酐和DIPEA含量的增加，不希望的Ac(X-44)化合物的含量也会增加。
6.11根据温度在“正常”条件下封端。
图17和图18总结了如该实施例所述在“正常”条件“20分钟，10％Ac2O，5％DIPEA”下的利西拉来合成中9个位置处在不同温度下封端所获得的数据。
图17显示了Ac(X-44)的GMP封端的比较，其取决于反应温度。15℃和30℃给出的值是与“室温”值(灰色区域)的正负偏差。
在9个位置中，5个位置的不希望的产物Ac(X-44)的形成≤0.5％，3个位置的在0.5％和1％之间，且一个位置仅>1％。在30℃时观察到大量增加，而在15℃时，Ac(X-44)的形成略有减少。
这意味着可以在15℃和室温(其可以为20℃-23℃)之间在不同位置进行GMP封端“20分钟，10％Ac2O，5％DIPEA”。
图18显示了Ac[(X-1)-44]的GMP封端的比较，其取决于反应温度。15℃和30℃给出的值是与“室温”值(灰色区域)的正负偏差
关于在RT下所需Ac[(X-1)-44]化合物的形成，在15℃的偏差在+0.23％和-0.25％之间。在30℃时，偏差在+0.29％和-0.33％之间。因此，所需的封端产物Ac[(X-1)-44]的形成与温度的依赖性比不希望的Ac(X-44)的形成要小。
考虑到在室温下封端，在15℃和30℃观察到所需化合物Ac[(X-1)-44]含量的负偏差。这意味着应在室温下以“正常”条件进行封端。
6.12在室温下用不同的封端组合物封端。
图19和20总结了如该实施例所述在利西拉来合成中9个位置处在室温下用不同的封端组合物进行封端所获得的数据。
图19显示了取决于室温下的封端组合物的Ac(X-44)含量的比较。“无封端”、“温和”和“40分钟”条件给出的值是与“正常封端”值(灰色区域)的正负偏差。
在“20分钟，10％Ac2O，5％DIPEA”和“40分钟，10％Ac2O，5％DIPEA”下，不希望的产物Ac(X-44)的形成最大。在“正常”条件(40分钟，10％Ac2O，5％DIPEA)下Ac(X-44)的形成在0.2％和1.12％之间。在温和的封端条件下，观察到强烈降低。
图20显示了取决于室温下的封端组合物的Ac[(X-1)-44]含量的比较。“无封端”、“温和”和“40分钟”给出的值是与“正常封端”值(灰色区域)的正负偏差。
考虑到“正常”条件，在“无封端”、“温和”和“40分钟”的条件下所需产物Ac[(X-1)-44]的形成在-0.14％和+0.16％之内。
特别地，在本发明的“温和”条件(10分钟，2％Ac2O，1％DIPEA)下，在利西拉来的合成中可以实现足够的封端。
总之，如本文所述，温和的封端条件，特别是在溶剂中用2％Ac2O和1％DIPEA封端10分钟有利于利西拉来的固相合成。
如果在某些氨基酸位置偶联之后省略封端，则在纯化过程中可能难以去除包括不完整氨基酸序列且少量存在的不希望的副产物。
实施例7
从固相裂解利西拉来
该实施例涉及根据本发明的利西拉来从固相的裂解。提供了固相(Rink树脂)，肽利西拉来结合至该固相。通过氨基酸单元的逐步偶联在树脂上合成肽。
作为比较测试，进行了根据现有技术的裂解(King等,Int.J.Peptide ProteinRes.1990,36:255-266)。
根据本发明的裂解方法与现有技术的方法的区别在于以下变化：
·反应温度从20℃到26℃
·裂解混合物中组分的数量从5个组分减少到2个组分，同时增加了树脂与裂解混合物的比例。
表17：根据本发明的裂解方法与根据现有技术的裂解的比较。差异以粗体/下划线表示。
与根据现有技术的裂解相比，通过使用根据本发明的裂解，可以将粗利西拉来的产率增加大约5％(从20％至25％)，而杂质特征曲线仅略微改变。
该实施例的方法适用于按比例扩大到中试工厂和生产规模。
表18总结了比较过程中获得的结果(参见表17)。使用了利西拉来-树脂(1-44)的三个不同批次2E002、2B008和2B006。分别为每个批次计算均值和标准偏差。在使用同一批次的利西拉来-树脂(1-44)进行的测试中应比较不同的裂解条件。在不同批次中，固相合成可能会影响产率。如果没有另外说明，则将10g的利西拉来-树脂(1-44)用作起始材料。
表18：树脂中的利西拉来的含量，以及在标准条件下从树脂上裂解利西拉来之后的利西拉来的产率(比较过程，参见表17)。
7.1裂解产率取决于20℃和35℃之间的裂解温度
在标准条件下(比较过程，参见表17)从利西拉来-树脂(1-44)裂解4小时。
| 实验编号 | 利西拉来-树脂(1-44)批次 | 温度[℃] | 持续时间[h] | 产率[％] |
| 标准 | 2E002 | 20 | 4 | 10.3±1.5 |
| 70586-050 | 2E002 | 23 | 4 | 11.7 |
| 70586-044 | 2E002 | 26 | 4 | 14.8 |
| 70586-046 | 2E002 | 30 | 4 | 14.2 |
| 70586-049 | 2E002 | 35 | 4 | 12.4 |
表19：裂解产率取决于温度
结果：在标准条件下裂解后，利西拉来的产率随温度的增加而增加，直至达到最佳约26℃。出人意料的是，温度从23℃增加到26℃导致产率显著增加。
7.2裂解产率取决于裂解持续时间
在标准条件下(比较过程，参见表17)在20℃从利西拉来-树脂(1-44)裂解。
表20：裂解产率取决于裂解持续时间
结果：利西拉来的产率随着裂解持续时间的延长而增加。裂解约8小时后达到最大产率。
7.3 12小时裂解持续时间下裂解产率取决于温度
在标准条件下(比较过程，参见表17)从利西拉来-树脂(1-44)裂解4小时。
| 实验编号 | 利西拉来-树脂(1-44)批次 | 温度[℃] | 持续时间[h] | 产率[％] |
| 70586-040 | 2E002 | 17 | 12 | 10.7 |
| 70586-037 | 2E002 | 20 | 12 | 14.1 |
| 70586-039 | 2E002 | 23 | 12 | 13.0 |
| 70586-045 | 2E002 | 26 | 12 | 14.0 |
| 70586-047 | 2E002 | 30 | 12 | 12.1 |
表21：12小时裂解持续时间下裂解产率取决于温度
结果：如果增加反应温度，则在12小时裂解持续时间下产率增加。如实施例7.1中所述，在4小时裂解，26℃获得最大产率。测试70586-044(4小时，26℃，实施例7)和70586-045(12小时，26℃)得到相似的产率(14.8％与14.0％)。
7.4裂解产率取决于最高20℃的裂解温度
在标准条件下(比较过程，参见表17)从利西拉来-树脂(1-44)裂解4小时。
表22：裂解产率取决于最高20℃的裂解温度
结果：如预期的那样，在低于20℃的温度下裂解需要更长的裂解持续时间，才能达到在20℃4小时所获得的产率(标准条件，比较过程，表17)。
7.5改良的裂解混合物
标准过程使用的裂解混合物包含五种组分：苯酚、硫代苯甲醚、1,2-乙硫基硫醚、水和TFA。所述实施例的主题是简化的裂解混合物，省略了硫苯甲醚、苯酚和水中的一到三种。确定了从利西拉来-树脂(1-44)裂解利西拉来的产率。表17“比较过程”中描述了“无改良”混合物。
表23：改良的裂解混合物
结果：除了测试71002-010(省略硫代苯甲醚)外，省略一种或多种组分可增加产率。
简化的裂解混合物(裂解混合物)具有以下几个优点：
(a)简化分析和质量控制，
(b)降低成本，
(c)在生产过程中便于处理。
7.6裂解混合物中的TFA和1,2-乙二硫醇含量
从测试71002-042开始，研究了TFA:1,2-乙二硫醇比例对裂解产率的影响：
表24：裂解混合物中不同的TFA和1,2-乙二硫醇比例
结果：1,2-乙二硫醇含量的增加导致利西拉来产率的显著降低。发现TFA:1,2-乙二硫醇比例为8.25:0.25是具有最大产率的比例(批次2E002)。使用批次2B008的实验证实了该发现。
7.7裂解混合物的体积
研究了裂解混合物的体积(以及浓度)的影响
| 实验编号 | 利西拉来-树脂(1-44)批次 | 减少体积[％] | 产率[％] |
| 标准 | 2E002 | 0％ | 10.3±1.5 |
| 71002-026 | 2E002 | -10％ | 13.3 |
| 71002-040 | 2E002 | -15％ | 10.3 |
| 71002-025 | 2E002 | -25％ | 11.0 |
| 70609-069 | 2E002 | -30％ | 10.5 |
| 71002-031 | 2E002 | -50％ | 7.9 |
表25：裂解产率，取决于裂解混合物的体积。
结果：最多减少30％对裂解产率没有影响。较大的体积减少会导致产率下降。
7.8裂解前用共溶剂(甲苯或CH2Cl2)溶胀“树脂上的肽”
该实验的基本原理是发现自树脂上裂解利西拉来可能导致温度增加最高5℃-8℃，这可能导致形成不希望的副产物，并可能对稳定性产生负面影响，从而影响裂解产率。在有机溶剂中“树脂上的肽”的溶胀可以减少放热，因此可以增加产率。
表26：裂解产率，取决于共溶剂的存在。*TFA和甲苯/CH2Cl2的总体积保持恒定。
结果：用有机助溶剂溶胀不会增加裂解产率。
7.9在助溶剂存在下浓缩
由于在从滤液中蒸馏TFA的过程中，共溶剂的存在可能会导致利西拉来沉淀，因此可以防止在King's混合物裂解过程中利西拉来的降解，沸点高于TFA且利西拉来不溶的助溶剂的存在可能会增加自树脂裂解后的产率。
| 实验编号 | 利西拉来-树脂(1-44)批次 | 溶剂 | 产率[％] |
| 标准 | 2E002 | Ohne | 10.3±1.5 |
| 71002-004 | 2E002 | 甲苯酚 | 12.0 |
| 71002-014 | 2E002 | 正庚烷 | 11.1 |
表27：裂解产率，取决于在TFA蒸馏期间共溶剂的存在。
结果：从树脂上裂解利西拉来后，滤液蒸馏中存在甲苯酚，导致产率略有增加。
7.10本发明的最佳裂解程序
基于在该实施例中获得的上述结果，选择并测试了以下最佳裂解条件：
(a)反应温度为26℃，
(b)裂解混合物由TFA和1,2-乙二硫醇组成。所述混合物含有约97％的TFA和约3％的1,2-乙二硫醇。使用8.25ml/g“树脂上的肽的TFA”和0.25ml/g“树脂上的肽”的1,2-乙二硫醇的量。
在批次2E002和2B008中测试了与标准比较用混合物相比该混合物的裂解产率。
表28：本发明的最佳裂解程序
结果：在两个批次中，产率均增加了约5％，表明通过本发明的方法从固相裂解肽显著改善。
7.11第二次(随后的)裂解
裂解后，使用本发明的比较用混合物(King's混合物)或裂解混合物进行第二次(随后的)裂解(参见表17)。
进行第一次裂解，获得滤液。将TFA添加到TFA-湿树脂中。搅拌1小时后，将树脂过滤。合并滤液并浓缩。
研究了第二次随后的裂解对利西拉肽产率的影响。
表29：第二次(随后的)裂解对利西拉肽产率的影响。EDT：1.2-乙二硫醇。
结果：随后的裂解导致产率仅增加约0.7％。这种增加与起始材料(TFA)成本的显著增加以及从肽制品中去除TFA的额外付出有关。必须考虑的是，通过组合第一次和第二次裂解步骤的滤液，TFA的量显著增加。
可得出结论，鉴于产率的小幅增长，省略第二次裂解导致成本降低，并且在生产过程中的处理变得容易。减少了TFA的量，从而促进了TFA的去除。
7.12分析
制备了两批，71001-016(比较用批次，根据标准方法用King's混合物裂解)和71001-013(根据本发明的利西拉来裂解)。
| 输出重量[g] | 相对外标的含量[％] | 纯度[F1.-％] | 产率[％] | |
| 71001-016(比较) | 3.41 | 23.0 | 35.6 | 14.2 |
| 71001-013(发明) | 5.20 | 20.5 | 35.9 | 19.7 |
表30：分析
结果：各批次显示几乎相同的纯度。根据本发明生产的批次中的含量略有降低。在本发明的批次中，所述输出重量增加，导致产率增加。
7.13总结
本发明的裂解方法具有以下优点：
(a)利西拉来产率增加了约5％，从而降低了成本并增加了生产能力。
(b)所述裂解混合物中仅存在两种组分(鉴于比较用King's混合物中的五种组分)，因此改善了分析质量控制并降低了成本，
(c)省略第二次裂解导致成本降低，并且在生产过程中的处理变得容易。减少了TFA的量，从而促进了TFA的去除。
以下方面也是本发明的主题：
1.一种用于从固相上裂解所述固相结合的多肽的方法，所述方法包括在约23℃至约29℃的范围内的温度下，使所述多肽结合的固相与基本上由三氟乙酸和1,2-乙二硫醇组成的组合物接触。
2.根据第1项所述的方法，其中所述固相包括Rink酰胺树脂。
3.根据第1项或第2项所述的方法，其中所述多肽通过接头与所述Rink酰胺树脂结合。
4.根据前述任一项所述的方法，其中所述组合物包含约95％v/v至约99％v/v的量的三氟乙酸。
5.根据前述任一项所述的方法，其中所述组合物包含约1％v/v至约5％v/v的量的1,2-乙二硫醇。
6.根据前述任一项所述的方法，其中所述组合物基本上由约97％v/v的量的三氟乙酸和约3％v/v的量的1,2-乙二硫醇组成。
7.根据前述任一项所述的方法，其中在约25℃至约27℃或约26℃至约29℃的温度下，使所述组合物与所述多肽结合的固相接触。
8.根据前述任一项所述的方法，其中在约26℃的温度下，使所述组合物与所述多肽结合的固相接触。
9.根据前述任一项所述的方法，其中使所述组合物与所述多肽结合的固相接触1至8小时。
10.根据第1项至第9项中任一项所述的方法，其中使所述组合物与所述多肽结合的固相接触4至8小时。
11.根据第1项至第9项中任一项所述的方法，其中使所述组合物与所述多肽结合的固相接触3至5小时。
12.根据前述任一项所述的方法，其中使所述组合物与所述多肽结合的固相接触约4小时。
13.根据前述任一项所述的方法，其中所述多肽选自GLP-1、其类似物和衍生物，毒蜥外泌肽-3、其类似物和衍生物，以及毒蜥外泌肽-4、其类似物和衍生物。
14.根据第13项所述的方法，其中所述多肽选自毒蜥外泌肽-4和利西拉来。
15.根据第13项所述的方法，其中所述多肽选自阿比鲁肽、杜拉鲁肽和索玛鲁肽。
16.根据第13项或第14项所述的方法，其中所述多肽是利西拉来。
17.一种用于包括预定氨基酸序列的多肽的固相合成的方法，所述方法包括：
(a)将包括未保护的C末端羧基和保护的N末端氨基的氨基酸结构单元的C末端偶联至固相，如Rink酰胺树脂，
(b)使所述氨基酸结构单元的N末端氨基脱保护，
(c)将包括未保护的C末端羧基和保护的N末端氨基的氨基酸结构单元的C末端偶联至步骤(b)的未保护的N末端氨基，
(d)任选地，重复步骤(b)和(c)，以及
(e)通过根据第1项至第16项中任一项所述的方法从所述固相裂解所述多肽。
18.根据第17项所述的方法，其中所述多肽选自GLP-1、其类似物和衍生物，毒蜥外泌肽-3、其类似物和衍生物，以及毒蜥外泌肽-4、其类似物和衍生物。
19.根据第17项或第18项所述的方法，其中所述多肽选自毒蜥外泌肽-4和利西拉来。
20.根据第17项或第18项所述的方法，其中所述多肽选自阿比鲁肽、杜拉鲁肽和索玛鲁肽。
21.根据第17项至第19项中任一项所述的方法，其中所述多肽是利西拉来。
22.一种组合物，其基本上由三氟乙酸和1,2-乙二硫醇组成，其中所述组合物包含95％v/v-99％v/v的量的三氟乙酸和1％v/v-5％v/v的量的1,2-乙二硫醇。
23.根据第22项所述的组合物，其基本上由约97％v/v的量的三氟乙酸和约3％v/v的量的1,2-乙二硫醇组成。
24.根据第22项或第23项所述的组合物在多肽的固相合成中的用途。
25.根据第24项所述的用途，其中所述组合物用于从所述固相裂解所述多肽。
26.根据第24项或第25项所述的用途，其中所述多肽选自GLP-1、其类似物和衍生物，毒蜥外泌肽-3、其类似物和衍生物，以及毒蜥外泌肽-4、其类似物和衍生物。
27.根据第24项至第26项中任一项所述的用途，其中所述多肽选自毒蜥外泌肽-4、利西拉来、阿比鲁肽、杜拉鲁肽和索玛鲁肽。
28.根据第24项至第27项中任一项所述的用途，其中所述多肽是利西拉来。
序列表
<110> 赛诺菲-安万特德国有限公司(Sanofi-Aventis Deutschland GmbH)
<120> 用于从固相裂解固相结合的肽的方法
<130> 65961PEP
<160> 4
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 44
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 利西那肽(lixisenatide)
<400> 1
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu
1 5 10 15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys
35 40
<210> 2
<211> 39
<212> PRT
<213> 吉拉毒蜥(Heloderma suspectum)
<220>
<223> 毒蜥外泌肽-4
<400> 2
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu
1 5 10 15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
35
<210> 3
<211> 39
<212> PRT
<213> 珠毒蜥(Heloderma horridum)
<220>
<223> 毒蜥外泌肽-3
<400> 3
His Ser Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu
1 5 10 15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
35
<210> 4
<211> 30
<212> PRT
<213> 人
<220>
<223> GLP-1(7-36)
<400> 4
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg
20 25 30
Claims (15)
1.一种用于从固相上裂解所述固相结合的多肽的方法，所述方法包括在约23℃至约29℃的范围内的温度下，使所述多肽结合的固相与基本上由三氟乙酸和1,2-乙二硫醇组成的组合物接触。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述固相包括Rink酰胺树脂。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述多肽通过接头与所述Rink酰胺树脂结合。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述组合物包含约95％v/v至约99％v/v的量的三氟乙酸和约1％v/v至约5％v/v的量的1,2-乙二硫醇。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述组合物基本上由约97％v/v的量的三氟乙酸和约3％v/v的量的1,2-乙二硫醇组成。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在约25℃至约27℃的温度下，优选在约26℃的温度下，使所述组合物与所述多肽结合的固相接触。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中使所述组合物与所述多肽结合的固相接触1至8小时，优选3至5小时。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多肽选自GLP-1、其类似物和衍生物，毒蜥外泌肽-3、其类似物和衍生物，以及毒蜥外泌肽-4、其类似物和衍生物。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述多肽选自毒蜥外泌肽-4、利西拉来、阿比鲁肽、杜拉鲁肽和索玛鲁肽。
10.一种用于包括预定氨基酸序列的多肽的固相合成的方法，所述方法包括：
(a)将包括未保护的C末端羧基和保护的N末端氨基的氨基酸结构单元的C末端偶联至固相，如Rink酰胺树脂，
(b)使所述氨基酸结构单元的N末端氨基脱保护，
(c)将包括未保护的C末端羧基和保护的N末端氨基的氨基酸结构单元的C末端偶联至步骤(b)的未保护的N末端氨基，
(d)任选地，重复步骤(b)和(c)，以及
(e)通过根据权利要求1至9中任一项所述的方法从所述固相裂解所述多肽。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述多肽选自GLP-1、其类似物和衍生物，毒蜥外泌肽-3、其类似物和衍生物，以及毒蜥外泌肽-4、其类似物和衍生物。
12.根据权利要求10或11所述的方法，其中所述多肽选自毒蜥外泌肽-4、利西拉来、阿比鲁肽、杜拉鲁肽和索玛鲁肽。
13.一种组合物，其基本上由三氟乙酸和1,2-乙二硫醇组成，其中所述组合物包含95％v/v-99％v/v的量的三氟乙酸和1％v/v-5％v/v的量的1,2-乙二硫醇。
14.根据权利要求13所述的组合物，其基本上由约97％v/v的量的三氟乙酸和约3％v/v的量的1,2-乙二硫醇组成。
15.根据权利要求13或14所述的组合物在多肽的固相合成中的用途，其中所述组合物特别用于从所述固相裂解所述多肽。
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| CN111116731A (zh) * | 2020-01-09 | 2020-05-08 | 山东大学 | 一种基于可溶性疏水标记载体的液相法制备索马鲁肽的方法 |
| CN116332810B (zh) * | 2023-03-29 | 2023-11-07 | 上海嘉莱多生物技术有限责任公司 | 一种Fmoc-His(Trt)-Abe-OH的制备方法 |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20010007037A1 (en) * | 1998-07-12 | 2001-07-05 | Eliezer Falb | Processes for coupling amino acids using bis-(trichloromethyl) carbonate |
| US6528486B1 (en) * | 1999-07-12 | 2003-03-04 | Zealand Pharma A/S | Peptide agonists of GLP-1 activity |
| US20060194719A1 (en) * | 2002-10-02 | 2006-08-31 | Zealand Pharma A/S | Stabilized exendin-4 compounds |
| US20080051558A1 (en) * | 2006-03-10 | 2008-02-28 | Yiming Zhou | Method of preparing bivalirudin |
| CN101357938A (zh) * | 2007-07-31 | 2009-02-04 | 周逸明 | 固相多肽合成Exenatide的制备方法 |
| CN103038250A (zh) * | 2010-06-23 | 2013-04-10 | 西兰制药公司 | 胰高血糖素类似物 |
| CN104844706A (zh) * | 2015-06-10 | 2015-08-19 | 成都圣诺生物科技股份有限公司 | 一种合成利西拉来的方法 |
Family Cites Families (46)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5424286A (en) | 1993-05-24 | 1995-06-13 | Eng; John | Exendin-3 and exendin-4 polypeptides, and pharmaceutical compositions comprising same |
| JP3107488B2 (ja) | 1993-09-29 | 2000-11-06 | 株式会社資生堂 | 架橋ヒアルロン酸を用いた徐放性製剤及び塞栓剤 |
| WO1998005351A1 (en) | 1996-08-08 | 1998-02-12 | Amylin Pharmaceuticals, Inc. | Methods for regulating gastrointestinal motility |
| EP1629849B2 (en) | 1997-01-07 | 2017-10-04 | Amylin Pharmaceuticals, LLC | Pharmaceutical compositions comprising exendins and agonists thereof |
| DE69838791T3 (de) | 1997-08-08 | 2011-06-22 | Amylin Pharmaceuticals, Inc., Calif. | Neue exendinagonist verbindungen |
| WO1999025728A1 (en) | 1997-11-14 | 1999-05-27 | Amylin Pharmaceuticals, Inc. | Novel exendin agonist compounds |
| NZ504258A (en) | 1997-11-14 | 2002-12-20 | Amylin Pharmaceuticals Inc | Exendin 3 and 4 agonist compounds for the treatment of diabetes |
| GB9818730D0 (en) | 1998-08-27 | 1998-10-21 | Univ Portsmouth | Collections of compounds |
| EP1076066A1 (en) | 1999-07-12 | 2001-02-14 | Zealand Pharmaceuticals A/S | Peptides for lowering blood glucose levels |
| JP3854995B2 (ja) | 2000-01-21 | 2006-12-06 | 関西ティー・エル・オー株式会社 | 細胞透過性キャリアペプチド |
| US7431685B2 (en) | 2000-03-28 | 2008-10-07 | Laser- Und Medizin Technologie Gmbh | Method and device for investigating substance libraries |
| JP5685355B2 (ja) | 2002-07-04 | 2015-03-18 | ジーランド ファーマ アクティーゼルスカブ | Ｇｌｐ−１および糖尿病の処置方法 |
| US20050176079A1 (en) | 2004-02-09 | 2005-08-11 | Chu Yong L. | Polypeptide bioconjugates, methods of making the bioconjugates and assays employing the bioconjugates |
| JP2008503597A (ja) | 2004-06-14 | 2008-02-07 | ユーエスブイ・リミテッド | ペプチドの製造方法 |
| US20080019911A1 (en) | 2005-04-20 | 2008-01-24 | Aimin Xu | Method for decreasing blood glucose and improving glucose tolerance using angiopoietin-like protein 4 |
| RU2485135C2 (ru) | 2005-06-13 | 2013-06-20 | Импиэриэл Инноувейшнс Лимитид | Соединения оксинтомодулина (варианты), фармацевтическая композиция на их основе, способы лечения и профилактики ожирения и сопутствующих заболеваний (варианты) и лекарственное средство (варианты) |
| WO2007004675A1 (ja) | 2005-07-06 | 2007-01-11 | Seikagaku Corporation | 薬剤導入光架橋ヒアルロン酸誘導体ゲル |
| MX2010008024A (es) | 2008-02-01 | 2010-12-21 | Ascendis Pharma As | Profarmaco que comprende un enlazador que se puede separar por si mismo. |
| CN104945500B (zh) | 2008-06-17 | 2019-07-09 | 印第安纳大学研究及科技有限公司 | 基于gip的混合激动剂用于治疗代谢紊乱和肥胖症 |
| BRPI0823378A2 (pt) * | 2008-12-15 | 2019-09-24 | Zealand Pharma As | análogos de glucagon |
| IN2012DN00377A (zh) | 2009-06-16 | 2015-08-21 | Univ Indiana Res & Tech Corp | |
| WO2011012723A1 (en) | 2009-07-31 | 2011-02-03 | Ascendis Pharma As | Injectable sustained release compositions comprising a pramipexole prodrug |
| AU2011349331A1 (en) | 2010-12-22 | 2013-07-11 | Indiana University Research And Technology Corporation | Glucagon analogs exhibiting GIP receptor activity |
| RU2458066C1 (ru) | 2011-05-31 | 2012-08-10 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Санкт-Петербургский государственный университет | Способ получения пептида эксенатида |
| JP6276690B2 (ja) | 2011-08-04 | 2018-02-07 | ファリス バイオテック ゲーエムベーハー | ヒトリラキシン−２を調製する方法 |
| US20130289241A1 (en) * | 2012-04-26 | 2013-10-31 | Shanghai Ambiopharm, Inc. | Method for preparing exenatide |
| CN104583234A (zh) | 2012-06-14 | 2015-04-29 | 赛诺菲 | 毒蜥外泌肽-4肽类似物 |
| AR091477A1 (es) | 2012-06-21 | 2015-02-04 | Univ Indiana Res & Tech Corp | Analogos de glucagon que presentan actividad de receptor de gip |
| PL2864350T3 (pl) | 2012-06-21 | 2019-01-31 | Indiana University Research And Technology Corporation | Analogi glukagonu wykazujące aktywność wobec receptora GIP |
| AR092873A1 (es) | 2012-09-26 | 2015-05-06 | Cadila Healthcare Ltd | Peptidos como agonistas triples de los receptores de gip, glp-1 y glugagon |
| UA116217C2 (uk) | 2012-10-09 | 2018-02-26 | Санофі | Пептидна сполука як подвійний агоніст рецепторів glp1-1 та глюкагону |
| BR112015010276A2 (pt) | 2012-11-06 | 2019-10-15 | Hoffmann La Roche | peptídeos miméticos |
| SI2934567T1 (sl) | 2012-12-21 | 2018-10-30 | Sanofi | Derivati eksendina-4 kot dualni GLP1/GIP ali trigonalni agonisti GLP1/GIP/glukagon |
| WO2015067716A1 (en) | 2013-11-06 | 2015-05-14 | Zealand Pharma A/S | Glucagon-glp-1-gip triple agonist compounds |
| WO2015086732A1 (en) | 2013-12-13 | 2015-06-18 | Sanofi | Exendin-4 peptide analogues |
| EP3080149A1 (en) | 2013-12-13 | 2016-10-19 | Sanofi | Dual glp-1/glucagon receptor agonists |
| WO2015086731A1 (en) | 2013-12-13 | 2015-06-18 | Sanofi | Exendin-4 peptide analogues as dual glp-1/glucagon receptor agonists |
| CN103819553A (zh) | 2013-12-27 | 2014-05-28 | 苏贤斌 | 一种使用固相和液相组合技术制备利西拉来的方法 |
| TW201625669A (zh) | 2014-04-07 | 2016-07-16 | 賽諾菲公司 | 衍生自艾塞那肽－４（Ｅｘｅｎｄｉｎ－４）之肽類雙重ＧＬＰ－１／升糖素受體促效劑 |
| JP6817188B2 (ja) | 2015-03-17 | 2021-01-20 | 国立大学法人大阪大学 | 血液脳関門透過性ペプチド |
| WO2016198624A1 (en) | 2015-06-12 | 2016-12-15 | Sanofi | Exendin-4 derivatives as trigonal glp-1/glucagon/gip receptor agonists |
| JP6991196B2 (ja) | 2016-03-23 | 2022-02-03 | バッヘン・ホールディング・アクチエンゲゼルシャフト | グルカゴン様ペプチドを製造するための方法 |
| US20170313740A1 (en) * | 2016-04-28 | 2017-11-02 | C S Bio Co. | Methods of preparing peptides |
| TW201821434A (zh) | 2016-10-10 | 2018-06-16 | 法商賽諾菲公司 | 製備包含親脂性修飾的離胺酸側鏈的肽的方法 |
| TW201833132A (zh) | 2016-12-02 | 2018-09-16 | 法商賽諾菲公司 | 作為肽類ｇｌｐ１／升糖素／ｇｉｐ三重受體激動劑之新穎化合物 |
| AU2019250359A1 (en) | 2018-04-10 | 2020-11-26 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Method for cleavage of solid phase-bound peptides from the solid phase |
-
2019
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-
2020
- 2020-10-07 IL IL277838A patent/IL277838A/en unknown
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20010007037A1 (en) * | 1998-07-12 | 2001-07-05 | Eliezer Falb | Processes for coupling amino acids using bis-(trichloromethyl) carbonate |
| US6528486B1 (en) * | 1999-07-12 | 2003-03-04 | Zealand Pharma A/S | Peptide agonists of GLP-1 activity |
| US20060194719A1 (en) * | 2002-10-02 | 2006-08-31 | Zealand Pharma A/S | Stabilized exendin-4 compounds |
| US20080051558A1 (en) * | 2006-03-10 | 2008-02-28 | Yiming Zhou | Method of preparing bivalirudin |
| CN101357938A (zh) * | 2007-07-31 | 2009-02-04 | 周逸明 | 固相多肽合成Exenatide的制备方法 |
| CN103038250A (zh) * | 2010-06-23 | 2013-04-10 | 西兰制药公司 | 胰高血糖素类似物 |
| CN104844706A (zh) * | 2015-06-10 | 2015-08-19 | 成都圣诺生物科技股份有限公司 | 一种合成利西拉来的方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| SG11202010017SA (en) | 2020-11-27 |
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