CN113173987A - 一种合成利司那肽的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种合成利司那肽的方法，本发明首次采用Fmoc‑Asp‑OAll的侧链羧基与氨基树脂偶联反应，制备得到片段肽1‑28肽树脂，脱掉28位Asp的α羧基保护基All，与全保护片段肽29‑44偶联，得到利司那肽。本发明能够有效的提高粗肽的纯度，降低纯化的难度，提高终产品的收率，有利于合成规模的大规模工业化应用，降低生产成本。

Description

一种合成利司那肽的方法
技术领域
本发明属于多肽合成领域，特别是涉及一种合成利司那肽的方法。
背景技术
国际糖尿病联合会(IDF)最新发布的第9版糖尿病地图报告指出，“糖尿病是21世纪全球进展最快的紧急情况之一”，正在影响所有年龄段、各个地区的人群。2019年，全球20-79岁人群中约4.63亿人患有糖尿病，绝大多数为2型糖尿病，相当于每11个成人中就有1名患者。
利司那肽（Lixisenatide），又译为利西拉来，2016年7月27日美国FDA批准赛诺菲生产的Lixisenatide（商品名为ADLYXIN）上市，用于成人2型糖尿病的治疗。利司那肽一天仅需一次注射，原因在于利司那肽与GLP-1受体亲和度高，另外，可显著抑制胃排空，因此于餐时作用显著，降低三餐PPG，可作为餐时胰岛素的替代，具有广阔的使用前景。
GLP-1的受体广泛分布于胰腺、脑、心脏、肾、胃肠道等，GLP-1受体激动剂与GLP-1受体结合后通过cAMP/PKA信号通路作用于胰岛细胞，葡萄糖依赖性刺激胰岛素分泌，抑制胰高血糖素分泌；同时可作用于胃肠道延缓胃排空，延缓小肠对葡萄糖的吸收，有利于餐后血糖控制；另外还可抑制中枢神经系统的摄食中枢，有利于控制体重。利司那肽在Exendin-4的基础上去掉第38位的脯氨酸，并在39位的丝氨酸连接6个赖氨酸，修饰后的结构提高了药物对抗DPP-4降解的能力，半衰期可延长至3～4h。其氨基酸序列为：H-1His-Gly-Glu-Gly-5Thr–Phe-Thr-Ser-Asp-10Leu-Ser-Lys-Gln-Met-15Glu-Glu-Glu-Ala-Val-20Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-25Trp-Leu-Lys-28Asn-Gly-30Gly–Pro-Ser–Ser-Gly-35Ala–Pro-Pro-Ser-Lys-40Lys-Lys-Lys-Lys–Lys-NH2
利司那肽的合成，国内多采用固相Fmoc化学法合成，CN102558338B和CN102875663B公开了采用常规的逐步固相合成和纯化利司那肽的方法，由于利司那肽结构中含有44个氨基酸残基，导致采用逐步固相合成的利司那肽的粗肽纯度较低，纯化难度大，总收率低。CN103709243B通过将片段1-2与片段3-44肽树脂，或者将片段1-4与片段5-44肽树脂进行固相缩合；CN103819553A利用固相化学分别合成1-17，18-29和30-44三个肽中间体片段，然后利用液相化学缩合得到利西拉来。CN106928340A采用特定的保护的丝氨酸二肽作为原料偶联到肽序中，由于形成了类似脯氨酸的环状结构，能有效的防止肽键旋转，抑制肽链卷曲剂收缩，使活性官能团(伯胺)充分暴露，从而有利于氨基酸的偶联，减少缺损等副反应的发生；CN104844706B分别合成利西拉来1-2位氨基酸片段、3-4位氨基酸片段、29-30位氨基酸片段、32-33位氨基酸片段、34-35位氨基酸片段，而后采用片段和逐一合成两种方式来制备利司那肽；CN105713082B采用片段20-44肽树脂与片段15-19进行固相缩合，然后逐步偶联剩余氨基酸至固相合成结束；CN104211801A通过液相合成片段Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-OH参与固相合成利司那肽，此工艺既能有效控制杂质Di-Ser33-利西拉来和Di-Ala35-利西拉来的含量又不影响利西拉来的收率；以上采用的片段偶联法，与常规的逐步偶联相比，提高了粗肽纯度和纯化收率；但是仍存在，制备工艺较复杂，规模化放大受限等难题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种合成利司那肽的方法，主要解决现有合成方法存在的合成周期长，生产成本高，产品收率低，不利于后期工业化放大的技术问题。
为实现以上目的，本发明提供以下技术方案：一种合成利司那肽的方法，包括如下步骤：
(a)采用Siber amide resins为固相载体，用Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-OH与之偶联反应制备Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Siber amideresins，再按序列依次偶联保护氨基酸，得到H-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala–Pro-Pro-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)–Lys(Boc)-Siber amide resins，经裂解得到全保护片段肽29-44: H-Gly-30Gly-Pro-Ser(tBu)–Ser(tBu)-Gly-35Ala–Pro-Pro-Ser(tBu)-Lys(Boc)-40Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)–Lys(Boc)-NH2；
(b)采用氨基树脂为固相载体，用Fmoc-Asp-All与之偶联反应制备Fmoc-Asp(氨基树脂)-OAll，再按序列依次偶联保护氨基酸，得到片段肽1-28肽树脂Boc–1His(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Gly-5Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-10Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Met-15Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Val-20Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(OtBu)-25Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-28Asp(氨基树脂)-OAll；
(c)用脱All试剂处理片段肽1-28肽树脂，得到Boc–1His(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Gly-5Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-10Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Met-15Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Val-20Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(OtBu)-25Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-28Asp(氨基树脂)-OH，然后在偶联剂存在下与全保护片段肽29-44反应，得到利司那肽肽树脂：
Boc–1His(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Gly-5Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-10Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Met-15Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Val-20Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(OtBu)-25Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-28Asp(氨基树脂)-Gly-30Gly-Pro-Ser(tBu)–Ser(tBu)-Gly-35Ala–Pro-Pro-Ser(tBu)-Lys(Boc)-40Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)–Lys(Boc)-NH2；
(b)利司那肽肽树脂经裂解、纯化、冻干得利司那肽精肽：H-1His-Gly-Glu-Gly-5Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-10Leu-Ser-Lys(Boc)-Gln-Met-15Glu-Glu-Glu-Ala-Val-20Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-25Trp(Boc)-Leu-Lys-28Asn-Gly-30Gly–Pro-Ser–Ser-Gly-35Ala–Pro-Pro-Ser-Lys-40Lys-Lys-Lys-Lys–Lys-NH2。
优选的，步骤（a）中所述固相载体Siber amide resins的替代度为0.2-1.0mmol/g。裂解用的试剂为三氟乙醇、三氟异丙醇与DCM的混合溶剂，体积比优选为1/4。
优选的，步骤（a）中Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-OH合成的具体操作步骤为：取碱A溶解在溶剂B中，配成碱性溶液；在低温浴下将H-Lys(Boc)-OH 溶解于配置好的碱性溶液中，且溶解后溶液仍显碱性；低温下向反应液中加入Fmoc-Lys(Boc)-OSu/溶剂C溶液，滴加完毕后，升温继续搅拌反应，经浓缩、调酸、析晶、重结晶，得到单体Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-OH。
进一步的，所述的碱A溶解在溶剂B中配成的碱性溶液可以是氨水、氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸钾等水溶液或与水互溶的有机溶剂的混合溶液；同时也可以是三乙胺、二乙胺、N，N-二异丙基乙胺等有机碱的有机溶液；所述的溶剂C可以是四氢呋喃、二氧六环、N，N-二甲基甲酰胺、丙酮中的一种或一种以上的混合液。
优选的，步骤（a）中29位和30位Gly采用二肽单体Fmoc-Gly-Gly-OH作为原料引入，34位Gly和35位Ala采用二肽单体Fmoc-Gly-Ala-OH作为原料引入，39位和40位Lys以及41位和42位Lys均采用Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-OH作为原料引入。
优选的，步骤（b）中1位His和2位Gly采用二肽单体Boc-His(Trt)-Gly-OH作为原料引入，3位Glu和4位Gly采用二肽单体Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH作为原料引入。
优选的，步骤（b）所述的氨基树脂是替代度为0.1-0.8mmol/g的Rink amideresins、Rink amide AM-resins和Rink amide-MBHA resins中的一种；优选的，偶联反应中所用的缩合剂为以下组合DIC/HOBT、DIC/HOAT、TBTU/HOBT/ DIPEA、HBTU/HOBT/DIPEA、HATU/HOAT/DIPEA的一种。
优选的，步骤（c）中脱All试剂为Pd(PPh3)4/CHCl3-AcOH-N-甲基吗啉(37:2:1)。
优选的，所述步骤（d）中，裂解试剂为加入体积比1-5%清除剂的TFA溶液，所述清除剂为苯甲醚、苯甲硫醚、乙二硫醇、巯基乙醇、苯酚、水和TIS中的一种或几种。
相对于现有技术，本发明的有益效果是：
本发明首次采用Fmoc-Asp-OAll的侧链羧基与氨基树脂偶联反应，制备得到片段肽1-28肽树脂，脱掉28位Asp的α羧基保护基All，与全保护片段肽29-44偶联，得到利司那肽；与现有技术中的合成方法相比，本发明能够有效的提高粗肽的纯度，降低纯化的难度，提高终产品的收率，有利于合成规模的放大，降低生产成本。
附图说明
图1是利司那肽峰谱图。
图2是利司那肽峰面积结果图。
具体实施方式
下面用具体实施例对本发明进行详细说明，但不限定本专利；根据本发明改变原料的投料比、或是反应溶剂或及缩合剂等，均在本发明的保护范围内。
说明书和权利要求书中所使用的缩写含义如下：
Fmoc：9-芴甲氧羰基；
tBu：叔丁基；
Pbf：2，2，4，6，7-五甲基苯并呋喃-5-磺酰基；
Trt：三苯甲基；
DCM：二氯甲烷；
DMF：N，N-二甲基甲酰胺；
DIPEA：N，N-二异丙基乙胺；
DIC：N，N-二异丙基碳二亚胺；
HBTU：苯并三氮唑-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸盐；
HATU：2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸酯；
TBTU：O-苯并三氮唑-N，N，N'，N'-四甲基脲四氟硼酸；
HOBT：1-羟基苯并三唑；
HOAT：1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑；
TFA：三氟乙酸；
TIS：三异丙基硅烷；
Boc：叔丁氧羰基；
Su：琥珀酰亚胺基；
DTT：二硫苏糖醇；
All：烯丙基。
实施例1：Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-OH的合成
准确称取H-Lys(Boc)-OH 5.92kg(1.0mol)于100L反应釜中，加入10%碳酸钠水溶液24L，搅拌下溶解；待溶清后，低温下滴加入Fmoc-Lys(Boc)-OSu 11.30kg(2mol)/24L四氢呋喃溶液，搅拌反应，TLC监测终点；经减压浓缩、调酸、乙酸乙酯萃取、干燥、析晶，得纯度99.0%的二肽单体Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-OH 11.16kg，收率80.1%。
实施例2：全保护片段肽29-44的制备
准确称取替代度为0.62mmol/g 的siber amide resins 484g(合成规模300mmol)置于10L合成釜中，加入5000ml DCM溶胀30min；抽滤掉DCM后，5000ml DMF洗涤2次，加入20%哌啶/DMF溶液5000ml脱保护2次，分别反应10min和10min；然后用5000ml DMF、DCM、DMF分别洗涤2次；依次和Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-Ala-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-Gly-OH偶联，得到肽树脂H-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala–Pro-Pro-Ser(tBu)–Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)–Lys(Boc)-Siberamide resins；然后用7000ml20%三氟乙醇/DCM(体积比)处理肽树脂60min，再分别用1000ml20%三氟乙醇/DCM(体积比)溶液洗涤两次，合并裂解液和洗涤液，旋蒸掉DCM，加入甲基叔丁基醚20L，析晶，沉降、过滤、洗涤，真空干燥得到672.6g全保护片段肽29-44： H-Gly-30Gly-Pro-Ser(tBu)–Ser(tBu)-Gly-35Ala–Pro-Pro-Ser(tBu)-Lys(Boc)-40Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)–Lys(Boc)-NH2，收率99.52%，纯度95.62%。
实施例3：利司那肽肽树脂的制备
准确称取替代度为0.32mmol/g 的Rink amide AM-resins62.5g(合成规模20mmol)置于2L合成柱中，加入600ml DCM溶胀30min；抽滤掉DCM后，600ml DMF洗涤2次，加入20%哌啶/DMF溶液600ml脱保护2次，分别反应10min和10min；然后用600ml DMF、DCM、DMF分别洗涤2次；依次和Fmoc-Asp-OAll、Fmoc-Lys(Boc) –OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)–OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH、Boc–1His(Trt)-Gly-OH偶联，得到片段肽1-28肽树脂Boc–1His(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Gly-5Thr(tBu)-Phe–Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-10Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Met-15Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Val-20Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(OtBu)-25Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-28Asp(氨基树脂)-OAll；在氩气保护下向合成柱中加入69.36g(60mmol)Pd(PPh3)4/700mlCHCl3-AcOH-N-甲基吗啉(37:2:1)，反应2h后，抽滤掉反应液，然后用700ml DMF、DCM、DMF分别洗涤2次；然后准确称取151.37g (60mmlo)实施例2得到全保护片段肽29-44/8.91g(66mmol)HOBT/8.32g(66mmol) DIC/600mlDMF加入反应釜中，室温下反应4h，抽滤掉反应液（加入甲基叔丁基醚回收全保护片段肽29-44），经700ml DMF、DCM、甲醇分别洗涤2次，真空干燥后得利司那肽肽树脂132.60g。
实施例4：利司那肽肽树脂的制备
准确称取替代度为0.32mmol/g 的Rink amide resins62.5g(合成规模20mmol)置于2L合成柱中，加入600ml DCM溶胀30min；抽滤掉DCM后， 600ml DMF洗涤2次，加入20%哌啶/DMF溶液600ml脱保护2次，分别反应10min和10min；然后用600ml DMF、DCM、DMF分别洗涤2次；依次和Fmoc-Asp-OAll、Fmoc-Lys(Boc) –OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)–OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH、Boc–1His(Trt)-Gly-OH偶联，得到片段肽1-28肽树脂Boc–1His(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Gly-5Thr(tBu)-Phe–Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-10Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Met-15Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Val-20Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(OtBu)-25Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-28Asp(氨基树脂)-OAll；在氩气保护下向合成柱中加入69.36g(60mmol)Pd(PPh3)4/700mlCHCl3-AcOH-N-甲基吗啉(37:2:1)，反应2h后，抽滤掉反应液，然后用700ml DMF、DCM、DMF分别洗涤2次；然后准确称取151.37g (60mmlo)实施例2得到全保护片段肽29-44/8.91g(66mmol)HOBT/8.32g(66mmol)DIC/600mlDMF加入反应釜中，室温下反应4h，抽滤掉反应液（加入甲基叔丁基醚回收全保护片段肽29-44），经700ml DMF、DCM、甲醇分别洗涤2次，真空干燥后得利司那肽肽树脂131.80g。
实施例5：利司那肽肽树脂的制备
准确称取替代度为0.30mmol/g 的Rink amide –MBHA- resins62.7g(合成规模20mmol)置于2L合成柱中，加入600ml DCM溶胀30min；抽滤掉DCM后， 600ml DMF洗涤2次，加入20%哌啶/DMF溶液600ml脱保护2次，分别反应10min和10min；然后用600ml DMF、DCM、DMF分别洗涤2次；依次和Fmoc-Asp-OAll、Fmoc-Lys(Boc) –OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)–OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH、Boc–1His(Trt)-Gly-OH偶联，得到片段肽1-28肽树脂Boc–1His(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Gly-5Thr(tBu)-Phe–Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-10Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Met-15Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Val-20Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(OtBu)-25Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-28Asp(氨基树脂)-OAll；在氩气保护下向合成柱中加入69.36g(60mmol)Pd(PPh3)4/700mlCHCl3-AcOH-N-甲基吗啉(37:2:1)，反应2h后，抽滤掉反应液，然后用700ml DMF、DCM、DMF分别洗涤2次；然后准确称取151.37g (60mmlo)实施例2得到全保护片段肽29-44/8.91g(66mmol)HOBT/8.32g(66mmol) DIC/600mlDMF加入反应釜中，室温下反应4h，抽滤掉反应液（加入甲基叔丁基醚回收全保护片段肽29-44），经700ml DMF、DCM、甲醇分别洗涤2次，真空干燥后得利司那肽肽树脂132.90g。
实施例6：利司那肽肽树脂的裂解
将实施例3得到的130g肽树脂，加入到冷冻的1300mL裂解液(体积配比为TFA/苯甲硫醚/TIS/H20=90/5/2.5/2.5)中，室温下搅拌反应4h；裂解反应结束，过滤树脂，130mlTFA洗涤树脂2次，合并滤液和洗液，倒入16L冷冻甲叔醚中，析出白色沉淀；静置30min后，过滤，甲叔醚洗涤6次，真空干燥得粗肽94.90g，粗肽收率99.62%，纯度72.68%。
实施例7：利司那肽肽树脂的裂解
将实施例4得到的130g肽树脂，加入到冷冻的1300mL裂解液(体积配比为TFA/苯甲硫醚/TIS/H20=90/5/2.5/2.5)中，室温下搅拌反应4h；裂解反应结束，过滤树脂，130mlTFA洗涤树脂2次，合并滤液和洗液，倒入16L冷冻甲叔醚中，析出白色沉淀；静置30min后，过滤，甲叔醚洗涤6次，真空干燥得粗肽94.20g，粗肽收率98.29%，纯度73.82%。
实施例8：利司那肽肽树脂的裂解
将实施例5得到的130g肽树脂，加入到冷冻的1300mL裂解液(体积配比为TFA/苯甲硫醚/TIS/H20=90/5/2.5/2.5)中，室温下搅拌反应4h；裂解反应结束，过滤树脂，130mlTFA洗涤树脂2次，合并滤液和洗液，倒入16L冷冻甲叔醚中，析出白色沉淀；静置30min后，过滤，甲叔醚洗涤6次，真空干燥得粗肽95.00g，粗肽收率99.95%，纯度74.60%。
实施例9：利司那肽的纯化
将实施例6所得粗肽溶液用0.45um滤膜过滤备用。
内径为150mm C18制备柱，流动相为0.1%TFA/水-0.1%TFA/乙腈体系，上样量为30g/次，流速500ml/min，梯度洗脱；峰前和峰后循环进样，得到中控分析纯度合格的精肽溶液，脱盐后冻干得精肽49.67g，收率52.14.0%，纯度99.86%，单杂均小于0.2%.
实施例10：利司那肽的纯化
将实施例7所得粗肽溶液用0.45um滤膜过滤备用。
内径为150mm C18制备柱，流动相为0.1%TFA/水-0.1%TFA/乙腈体系，上样量为30g/次，流速500ml/min，梯度洗脱；峰前和峰后循环进样，得到中控分析纯度合格的精肽溶液，脱盐后冻干得精肽48.92g，收率51.04%，纯度99.80%，单杂均小于0.2%.
实施例11：利司那肽的纯化
将实施例8所得粗肽溶液用0.45um滤膜过滤备用。
内径为150mm C18制备柱，流动相为0.1%TFA/水-0.1%TFA/乙腈体系，上样量为30g/次，流速500ml/min，梯度洗脱；峰前和峰后循环进样，得到中控分析纯度合格的精肽溶液，脱盐后冻干得精肽48.62g，收率51.15%，纯度99.74%，单杂均小于0.2%。利司那肽精肽的纯度谱图见图1和图2，图1是利司那肽峰谱图，图2是利司那肽峰面积结果图。

Claims (9)

1.一种合成利司那肽的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(a)采用Siber amide resins为固相载体，用Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-OH与之偶联反应制备Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Siber amideresins，再按序列依次偶联保护氨基酸，得到H-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala–Pro-Pro-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)–Lys(Boc)-Siber amide resins，经裂解得到全保护片段肽29-44:H-Gly-30Gly-Pro-Ser(tBu)–Ser(tBu)-Gly-35Ala–Pro-Pro-Ser(tBu)-Lys(Boc)-40Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)–Lys(Boc)-NH2；
(b)采用氨基树脂为固相载体，用Fmoc-Asp-OAll与之偶联反应制备Fmoc-Asp(氨基树脂)-OAll，再按序列依次偶联保护氨基酸，得到片段肽1-28肽树脂：
Boc–1His(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Gly-5Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-10Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Met-15Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Val-20Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(OtBu)-25Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-28Asp(氨基树脂)-OAll；
(c)用脱All试剂处理片段肽1-28肽树脂，得到Boc–1His(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Gly-5Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-10Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Met-15Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Val-20Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(OtBu)-25Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-28Asp(氨基树脂)-OH，然后在偶联剂存在下与全保护片段肽29-44反应，得到利司那肽肽树脂：
Boc–1His(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Gly-5Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-10Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Met-15Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Val-20Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(OtBu)-25Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-28Asp(氨基树脂)-Gly-30Gly-Pro-Ser(tBu)–Ser(tBu)-Gly-35Ala–Pro-Pro-Ser(tBu)-Lys(Boc)-40Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)–Lys(Boc)-NH2；
(d)利司那肽肽树脂经裂解、纯化、冻干得利司那肽精肽：H-1His-Gly-Glu-Gly-5Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-10Leu-Ser-Lys(Boc)-Gln-Met-15Glu-Glu-Glu-Ala-Val-20Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-25Trp(Boc)-Leu-Lys-28Asn-Gly-30Gly–Pro-Ser–Ser-Gly-35Ala–Pro-Pro-Ser-Lys-40Lys-Lys-Lys-Lys–Lys-NH2。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（a）中所述固相载体Siber amideresins的替代度为0.2-1.0mmol/g；所述裂解用的试剂为三氟乙醇、三氟异丙醇与DCM的混合溶剂。
3.根据权利要求1所述的合成利司那肽的方法，其特征在于，步骤（a）中Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-OH合成的具体操作步骤为：取碱A溶解在溶剂B中，配成碱性溶液；在低温浴下将H-Lys(Boc)-OH 溶解于配置好的碱性溶液中，且溶解后溶液仍显碱性；低温下向反应液中加入Fmoc-Lys(Boc)-OSu/溶剂C溶液，滴加完毕后，升温继续搅拌反应，经浓缩、调酸、析晶、重结晶，得到单体Fmoc-Lys(Boc) -Lys(Boc)-OH。
4.根据权利要求3所述的合成利司那肽的方法，其特征在于，碱A和溶剂B配成的碱性溶液是氨水、氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸钾等水溶液或与水互溶的有机溶剂的混合溶液，或者是三乙胺、二乙胺、N，N-二异丙基乙胺有机碱的有机溶液。
5.根据权利要求1所述的合成利司那肽的方法，其特征在于，步骤（a）中29位和30位Gly采用二肽单体Fmoc-Gly-Gly-OH作为原料引入，34位Gly和35位Ala采用二肽单体Fmoc-Gly-Ala-OH作为原料引入，39位和40位Lys以及41位和42位Lys均采用Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-OH作为原料引入。
6.根据权利要求1所述的合成利司那肽的方法，其特征在于，步骤（b）中1位His和2位Gly采用二肽单体Boc-His(Trt)-Gly-OH作为原料引入，3位Glu和4位Gly采用二肽单体Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-OH作为原料引入。
7.根据权利要求1所述的合成利司那肽的方法，其特征在于，步骤（c）中脱All试剂为Pd(PPh3)4/CHCl3-AcOH-N-甲基吗啉(37:2:1)。
8.根据权利要求1所述的合成利司那肽的方法，其特征在于，步骤（b）所述的氨基树脂是替代度为0.1-0.8mmol/g的Rink amide resins、Rink amide AM-resins和Rink amide-MBHA resins中的一种；偶联反应中所用的缩合剂为以下组合DIC/HOBT、DIC/HOAT、TBTU/HOBT/ DIPEA、HBTU/HOBT/DIPEA、HATU/HOAT/DIPEA的一种。
9.根据权利要求1所述的合成利司那肽的方法，其特征在于，所述步骤（d）中，裂解试剂为加入体积比1-5%清除剂的TFA溶液，所述清除剂为苯甲醚、苯甲硫醚、乙二硫醇、巯基乙醇、苯酚、水和TIS中的一种或几种。
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