KR20130086339A - 글루카곤 유사체 - Google Patents

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KR20130086339A
KR20130086339A KR1020137000529A KR20137000529A KR20130086339A KR 20130086339 A KR20130086339 A KR 20130086339A KR 1020137000529 A KR1020137000529 A KR 1020137000529A KR 20137000529 A KR20137000529 A KR 20137000529A KR 20130086339 A KR20130086339 A KR 20130086339A
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질랜드 파마 에이/에스
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Abstract

본 발명은 혈당 조절에 영향을 미치지 않고 체중 감소를 촉진하거나 체중 증가를 예방하기 위한 물질 및 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 이러한 방법에 효과적인 신규한 글루카곤 유사체 펩티드를 제공한다. 펩티드는 인간 글루카곤과 비교할 때 GLP-1 수용체에 대하여 증가된 선택성을 가짐으로써 그들의 효과를 매개할 수 있다.

Description

글루카곤 유사체{Glucagon analogues}
본 발명은 글루카곤 유사체, 및 혈당 조절에 영향이 없거나 단지 조금 영향을 미치면서, 예를 들어, 과식, 비만 및 과체중, 증가된 콜레스테롤의 치료에서의 이의 의학적 용도에 관한 것이다.
프리프로글루카곤(preproglucagon)은 조직내에서 차등적으로 프로세싱되어 글루카곤(Glu), 글루카곤-유사 펩티드-1(GLP-1), 글루카곤-유사 펩티드-2(GLP-2), 및 옥신토모둘린(OXM)을 포함하는 다수의 구조적으로 관련된 프로글루카곤-유래한 펩티드를 형성하는 158개 아미노산 전구체 폴리펩티드이다. 이들 분자는 글루코스 항상성(glucose hmeostasis), 인슐린 분비, 위 비우기 및 장 성장, 뿐만아니라 식품 섭취의 조절을 포함하는 매우 다양한 생리학적 기능에 관련되어 있다.
글루카곤은 프리-프로글루카곤의 53번 내지 81번 아미노산에 상응하는 29개 아미노산 펩티드이며, 서열 His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr(서열 번호: 1)을 갖는다. 옥신토모둘린(OXM)은 옥타펩티드 카복시말단 연장부[서열 Lys-Arg-Asn-Arg-Asn-Asn-Ile-Ala(서열번호 2)를 갖고 "개재 펩티드(intervening peptide) 1" 또는 IP-1로 명명되는, 프리-프로글루카곤의 82번 내지 89번 아미노산]를 가지며, 글루카곤의 완전한 29개 아미노산 서열을 포함하는 37개 아미노산 펩티드이며; 따라서, 인간 옥신토모둘린의 완전한 서열은 His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-Lys-Arg-Asn-Arg-Asn-Asn-Ile-Ala)(서열 번호: 3)이다. GLP-1의 주요 생물학적으로 활성인 단편은 30개 아미노산, 즉 프리-프로글루카곤의 98번 내지 127번 아미노산에 상응하는 C-말단에서 아미드화된 펩티드로서 생산된다.
글루카곤은 간세포 상의 글루카곤 수용체에 결합함으로써 글리코겐 분해를 통해- 글리코겐 형태로 저장된- 글루코스를 간이 방출하도록 함으로써, 혈중 글루코스 수준을 유지하는데 도움을 준다. 글리코겐 저장분이 고갈됨에 따라, 글루카곤은 간을 자극하여 글루코스신합성에 의해 추가의 글루코스를 합성하도록 한다. 상기 글루코스는 혈류내로 방출되어, 저혈당증의 진행을 예방한다.
OXM은 식품 섭취에 반응하여 및 식사 열량 함량에 비례하여 혈액내로 방출된다. OXM은 인간에서 식욕을 억제하고 식품 섭취를 억제하는 것으로 나타났다(Cohen et al, Journal of Endocrinology and Metabolism, 88, 4696-4701, 2003; WO 2003/022304). GLP-1의 효과와 유사한, 이들 식욕억제 효과 외에도, OXM은 또한, 옥신토모둘린으로 처리된 랫트가 쌍으로 사육한 랫트보다 체중 증가가 더 적게 나타나므로, 다른 메카니즘에 의해 체중에 영향을 미쳐야 한다(Bloom, Endocrinology 2004, 145, 2687). 비만 설치류를 OXM으로 처리하는 것은 또한 이들의 글루코스 내성(glucose tolerance)을 개선시키며(Parlevliet et al, Am J Physiol Endocrinol Metab, 294, E142-7, 2008) 또한 체중 증가를 억제한다(WO 2003/022304).
OXM은 GLP-1 수용체보다 글루카곤 수용체에 대해 2배 더 높은 효능으로 글루카곤 및 GLP-1 둘 모두를 활성화시키지만, 이들의 각각의 수용체 상에서 천연의 글루카곤 및 GLP-1보다는 효능이 덜하다. 인간 글루카곤은 또한, 비록 GLP-1 수용체보다 글루카곤 수용체에 대해 더 강력한 선호성을 지닌다고 해도, 이들 수용체 둘 모두를 활성화시킬 수 있다. 한편, GLP-1은 글루카곤 수용체를 활성화시킬 수 없다. 옥신토모둘린의 작용 메카니즘은 잘 이해되어 있지 않다. 특히, 호르몬의 간장밖의 효과의 일부가 글루카곤 수용체 및 GLP-1 수용체를 통해, 또는 하나 이상의 여전히 확인되지 않은 수용체를 통해 매개되는지는 알려져 있지 않다.
다른 펩티드는 GLP-1 수용체 및 글루카곤 둘 모두에 결합하여 이들을 활성화시키며(Hjort et al, Journal of Biological Chemistry, 269, 30121-30124,1994) 또한 체중 증가를 억제하고 식품 섭취를 감소시키는(WO 2006/134340, WO 2007/100535, WO 2008/10101, WO 2008/152403, WO 2009/155257 및 WO 2009/155258) 것으로 밝혀졌다.
비만은 세계적으로 증가하고 있는 건강 문제이며 각종 질환, 특히 심혈관병(CVD), 제2형 당뇨병, 폐쇄 수면 무호흡, 특정 유형의 암 및 골관절염과 관련되어 있다. 그 결과, 비만은 기대 수명을 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 세계 보건기구에 의한 2005년 계획안에 따르면, 전 세계적으로 4억명의 성인(연령 >15세)이 비만으로 분류되어 있다. 미국에서, 비만은 현재 흡연 다음으로 예방가능한 사망의 두 번째로 높은 원인인 것으로 여겨지고 있다.
비만의 증가는 당뇨병의 증가를 초래하며, 제2형 당뇨병을 가진 인간의 대략 90%가 비만으로 분류될 수 있다. 세계적으로 2억 4천 6백만명의 인간들이 당뇨병에 걸려있으며, 2025년까지 3억 8천만명이 당뇨병에 걸릴 것으로 추정된다. 많은 인간들이 고/이상(high/aberrant) LDL 및 트리글리세라이드 및 저 HDL을 포함하는 추가의 심혈관 위험 인자를 가지고 있다.
따라서, 비만을 치료하기 위한 강력한 의학적 요구가 존재한다.
본 발명은 다음 화학식을 갖는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다:
R1-X-Z-R2
상기 식에서,
R1은 H, C1 -4 알킬, 아세틸, 포르밀, 벤조일 또는 트리플루오로아세틸이고;
R2는 OH 또는 NH2이며;
X는 다음 화학식 I:
His-X2-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-X16-X17-Arg-Ala-X20-Asp-Phe-Ile-X24-Trp-Leu-X27-X28-X29 (I)를 갖는 펩티드이며,
여기에서,
X2는 Ser 및 Aib로부터 선택되고;
X16는 Glu 및 Y로부터 선택되고;
X17는 Arg 및 Y로부터 선택되고;
X20는 Lys 및 Y로부터 선택되고;
X24는 Glu 및 Y로부터 선택되고;
X27는 Leu 및 Y로부터 선택되고;
X28는 Ser 및 Y로부터 선택되거나 부재하며;
X29는 Ala이거나 부재하며;
여기서 X16, X17, X20, X24, X27 및 X28 중 적어도 하나가 Y이며;
여기서 각각의 잔기 Y는 독립적으로 Lys, Cys 및 Orn으로부터 선택되며;
여기서 X의 적어도 하나의 아미노산 잔기 Y의 측쇄가 다음 화학식을 갖는 친유성 치환기에 접합되며:
(i) Z1 [여기서 Z1은 X의 측쇄에 직접적으로 접합된 친유성 부분임]; 또는
(ii) Z1Z2 [여기서 Z1은 친유성 부분이며, Z2는 스페이서이고, Z1은 Z2를 통해 X의 측쇄에 접합됨]; 및
Z는 부재하거나 Ala, Leu, Ser, Thr, Tyr, Cys, Glu, Lys, Arg, Dbu, Dpr 및 Orn으로 구성된 그룹으로부터 독립적으로 선택된 1-20개 아미노산 단위의 서열이다.
일 예로, X는 다음의 서열을 가질 수 있다:
SQGTFTSDYSKYLDERRAKDFIEWLKSA
HSQGTFTSDYSKYLDERRAKDFIEWLLSA
HSQGTFTSDYSKYLDERRAKDFIEWLLKA
HSQGTFTSDYSKYLDKRRAKDFIEWLLSA
HSQGTFTSDYSKYLDEKRAKDFIEWLLSA 또는
H-Aib-QGTFTSDYSKYLDEKRAKDFIEWLLSA
일부 실시양태에서, 친유성 치환기는 16번, 17번, 20번, 27번 또는 28번 위치의 아미노산 잔기에 부착된다.
예를 들어, 본 발명의 화합물은 다음 서열을 가질 수 있다:
H-HSQGTFTSDYSKYLDERRAKDFIEWL-K(헥사데카노일-이소Glu)-SA -NH2
H-HSQGTFTSDYSKYLDERRA-K(헥사데카노일-이소Glu)-DFIEWLLSA -NH2
H-HSQGTFTSDYSKYLDERRAKDFIEWLL-K(헥사데카노일-이소Glu)-A -NH2
H-HSQGTFTSDYSKYLD-K(헥사데카노일-이소Glu)-RRAKDFIEWLLSA -NH2
H-HSQGTFTSDYSKYLDE-K(헥사데카노일-이소Glu)-RAKDFIEWLLSA -NH 또는
H-H-Aib-QGTFTSDYSKYLDE-K(헥사데카노일-이소Glu)-RAKDFIEWLLSA-NH2.
본 발명은 본 발명의 화합물을 인코딩하는 핵산(DNA 또는 RNA일 수 있음), 이러한 핵산을 포함하는 발현 벡터, 및 이러한 핵산 또는 발현 벡터를 함유하는 숙주 세포를 추가로 제공한다.
추가의 측면에서, 본 발명은 본 명세서에서 정의한 바와 같은 글루카곤 유사체 펩티드, 또는 이의 염 또는 유도체, 이러한 글루카곤 유사체 펩티드를 인코딩하는 핵산, 이러한 핵산을 포함하는 발현 벡터, 또는 이러한 핵산 또는 발현 벡터를 함유하는 숙주 세포를 담체와 혼합되게 포함하는 조성물을 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 본 조성물은 약학적으로 허용가능한 조성물이며, 담체는 약학적으로 허용가능한 담체이다. 글루카곤 펩티드 유사체는 글루카곤 유사체의 약학적으로 허용가능한 염의 형태일 수 있다.
더 추가적인 측면에서, 본 발명은 의학적 치료 방법에서 사용하기 위한 조성물을 제공한다.
상술된 화합물은 체중 증가를 예방하거나 체중 감소를 촉진하는데 사용된다. "예방"은 치료의 부재시와 비교하여 억제하거나 감소시킴을 의미하며, 필수적으로 반드시 체중 증가의 완전한 중지를 내포하는 것을 의미하지는 않는다. 펩티드는 식품 섭취에 있어서의 감소 및/또는 증가된 에너지 소비를 유발하여, 체중에 있어서 관측된 효과를 유도할 수 있다. 체중에 있어서 이들의 효과와는 독립적으로, 본 발명의 화합물은 순환하는 LDL 수준을 저하시키고 HDL/LDL 비를 증가시킬 수 있는, 순환하는 콜레스테롤 수준에 있어서 유리한 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 본 발명의 화합물은 비만, 병적 비만, 비만 관련 염증, 비만 관련 쓸개 질환, 비만 유도된 수면 무호흡의 치료 및/또는 예방과 같은, 과체중에 의해 야기되거나 특징지어지는 임의의 병태의 직접 또는 간접 치료법에 사용될 수 있다. 이들은 또한 대사 증후군, 고혈압, 동맥경화 유발 이상지혈증, 죽상동맥경화증, 동맥경화증, 관상 동맥 심장 질환, 또는 뇌졸증의 예방을 위해 사용될 수 있다. 이들 병태에서 그의 효과는 체중에 대한 그들의 효과의 결과이거나 체중에 대한 그의 효과와 관련되어 있을 수 있거나, 또는 그와 무관할 수 있다.
특정한 실시양태에서, 상술한 화합물은 혈당 조절에 영향이 없거나 단지 조금 영향을 미치는, 체중 증가를 예방하거나 체중 감소를 촉진하는데 사용될 수 있다. 상술된 화합물의 일부가 잘 확립된 동물 모델에서 HbA1c 수준에 대해 거의 효과가 없거나 단지 조금 효과를 가지며 체중 감소에 대해 현저한 효과를 가짐이 본 발명에서 밝혀냈다.
이미 기술한 바와 같이, 본 발명은 선택적으로 이의 발현을 지시하기 위한 서열과 조합된, 상기 기술한 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터 및 발현 벡터를 함유하는 숙주 세포로 연장된다. 바람직하게는 숙주 세포는 본 발명의 화합물을 발현하고 분비할 수 있다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 화합물을 생산하는 방법을 제공하며, 본 방법은 화합물을 발현하기에 적합한 조건 하에서 숙주 세포를 배양하고 이에 따라 생산된 화합물을 정제하는 것을 포함한다.
본 발명은 또한 의학적 치료 방법에 사용하기 위한, 본 발명의 핵산, 본 발명의 발현 벡터, 또는 본 발명의 화합물을 발현하고 분비할 수 있는 숙주 세포를 제공한다. 핵산, 발현 벡터 및 숙주 세포가 상기 화합물 자체로 치료될 수 있는 본원에 기술된 임의의 질환의 치료에 사용될 수 있는 것으로 이해될 것이다. 따라서, 본 발명의 화합물을 포함하는 치료학적 조성물, 본 발명의 화합물의 투여, 또는 이의 임의의 치료학적 용도에 대한 언급은, 문맥이 달리 요구하는 경우를 제외하고는, 본 발명의 핵산, 발현 벡터 또는 숙주 세포의 동등한 용도를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서 전반을 통하여, 천연적으로 존재하는 아미노산에 대한 통상의 1문자 및 3문자 코드가 사용될 뿐만 아니라 Aib(α-아미노이소부티르산), Orn(오르니틴), Dbu(2,4 디아미노부티르산) 및 Dpr(2,3-디아미노프로파노산)과 같은 다른 아미노산에 대한 일반적으로 허용되는 3문자 코드가 사용된다.
용어 "천연 글루카곤"은 서열 H-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-OH(서열번호 1)을 갖는 천연의 인간 글루카곤을 나타낸다.
본 발명은 상기에서 정의한 바와 같은 화합물을 제공한다. 의심할 여지를 없애기 위하여, 본원에 제공된 정의에서, X의 서열만이 변이를 허용하는 것으로 기술된 위치에서 화학식 I과 상이한 것으로 일반적으로 의도되고 있다. 서열 X 내의 아미노산은 통상의 N-말단에서 C-말단 방향으로 1번부터 29번까지 연속적으로 넘버링되는 것으로 고려될 수 있다. 따라서 X 내에서 "위치"에 대한 언급은 천연의 인간 글루카곤 및 다른 분자 내의 위치에 대한 언급에서와 같이 해석되어야 한다.
본 발명의 화합물은 펩티드 서열 X 내에서 하나 이상의 분자내 가교(intramolecular bridge)를 보유할 수 있다. 각각의 이러한 가교는 선형의 서열 X 내에서 3개의 아미노산에 의해 전형적으로 분리된(즉, 아미노산 A와 아미노산 A+4 사이에서) X의 2개 아미노산 잔기의 측쇄 사이에서 형성된다.
더욱 특히, 상기 가교는 12번 및 16번, 16번 및 20번, 17번 및 21번, 20번 및 24번, 또는 24번 및 28번 잔기 쌍의 측쇄 사이에 형성될 수 있다. 2개의 측쇄는 서로 이온적 상호작용을 통해 또는 공유 결합에 의해 연결될 수 있다. 따라서, 잔기의 이들 쌍은 이온적 상호작용에 의해 염 가교를 형성하기 위해 반대로 하전된 측쇄를 포함할 수 있다. 예를 들어, 잔기들 중의 하나는 Glu 또는 Asp일 수 있는 반면, 다른 것은 Lys 또는 Arg일 수 있다. Lys와 Glu 및 Lys와 Asp 쌍 각각은 반응하여 락탐 환을 형성할 수 있다. 마찬가지로, Tyr과 Glu 또는 Tyr과 Asp는 락톤 환을 형성할 수 있다.
임의의 특정한 이론으로 구속받고 싶지는 않지만, 이러한 분자내 가교는 분자의 알파 나선 구조를 안정화시켜 GLP-1 수용체 및 가능하게는 또한 글루카곤 수용체에서 효능 및/또는 선택성을 증가시키는 것으로 여겨진다.
임의의 특정한 이론에 구속받고 싶지는 않지만, 천연 글루카곤의 17번 및 18번 위치에서의 아르기닌 잔기는 글루카곤 수용체에 대하여 현저한 선택성을 제공하는 것으로 여겨진다.
임의의 특정한 이론에 구속받고 싶지는 않지만, 천연 글루카곤의 27번, 28번 및 29번째 위치에서의 잔기는 글루카곤 수용체에 대해 펩티드의 현저한 선택성을 제공하는 것으로 여겨진다. 천연의 글루카곤 서열과 관련하여 이들 위치 중 1개, 2개 또는 3개 모두에서의 치환은, 잠재적으로 글루카곤 수용체에서 효능의 현저한 감소 없이, GLP-1 수용체에 대한 효능 및/또는 선택성을 증가시킬 수 있다. 특정 예는 27번 위치에서 Leu, 28번 위치에서 Ser 및 29번 위치에서 Ala를 포함한다.
27번 위치에서 천연적으로 존재하는 Met 잔기의 치환(예컨대, Leu 또는 Lys, 특히 Leu를 이용)은 또한 산화에 대한 잠재성을 감소시키므로, 이에따라 화합물의 화학적 안정성을 증가시킨다.
28번 위치에서 천연적으로 존재하는 Asn 잔기의 치환(예컨대, Ser, Arg 또는 Ala에 의한)은 또한 산성 용액에서의 탈아미드화 잠재성을 감소시킴으로써, 화합물의 화학적 안정성을 증가시킨다.
GLP-1 수용체에서 효능 및/또는 선택성은 또한 잠재적으로 글루카곤 수용체에서 효능의 현저한 손실 없이, 양친매성 나선 구조를 형성하는 경향이 있는 잔기를 도입함으로써 증가시킬 수 있다. 이는 16번, 20번, 24번, 및 28번 위치 중 하나 이상에서 하전된 잔기를 도입함으로써 달성할 수 있다. 따라서, 16번 및 20번 위치의 잔기는 둘 모두 하전될 수 있고, 16번 및 24번 위치의 잔기는 둘 모두 하전될 수 있고, 20번 및 24번 위치의 잔기는 둘 모두 하전될 수 있으며, 16번, 20번 및 24번 위치에서 잔기가 모두 하전될 수 있거나, 16번, 20번, 24번 및 28번 위치에서 잔기는 모두 하전될 수 있다. 예를 들어, 16번 위치에서 잔기는 Glu 또는 Lys일 수 있다. 20번 위치에서 잔기는 Lys일 수 있다. 24번 위치에서 잔기는 Glu일 수 있다. 28번 위치에서 잔기는 Lys일 수 있다.
20번 및 24번 위치에서 천연적으로 존재하는 Gln 잔기 중 하나 또는 둘 모두의 치환은 또한 산성 용액 속에서 탈아미드화 잠재성을 감소시키므로, 이에따라 화합물의 화학적 안정성을 증가시킨다.
하전된 아미노산을 이용한 16번, 17번, 20번, 27번 및 28번 위치에서 천연적으로 존재하는 아미노산의 하나 이상의 치환은 친유성 치환기에의 접합을 가능케한다. 예를 들어, 16번, 17번, 20번, 27번 또는 28번 위치에서 잔기는 Cys, Orn 또는 Lys일 수 있다. 더욱 특히, 16번, 17번, 20번, 27번 및 28번 위치에서 잔기의 하나 이상은 Cys일 수 있다. 또한, 16번, 17번, 20번, 27번 및 28번 위치에서 잔기의 하나 이상은 Lys일 수 있다.
이미 개시된 바와 같이, 본 발명의 화합물은 1 내지 20개 아미노산의 C-말단 펩티드 서열 Z를 포함하여, 예를 들어, 글루카곤 유사체 펩티드의 형태 및/또는 2차 구조를 안정화시키고/시키거나 예컨대, WO99/46283호에 기술된 바와 같이, 효소적 가수분해에 보다 내성인 글루카곤 유사체 펩티드를 만들 수 있다.
존재하는 경우, Z는 1 내지 20개 아미노산 잔기, 예를 들어, 1 내지 15개 범위, 보다 바람직하게는 1 내지 10개 범위, 특히 1 내지 7개 범위의 아미노산 잔기, 예컨대, 6개 아미노산 잔기와 같은, 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개 아미노산 잔기의 팹티드 서열을 나타낸다. 펩티드 서열 Z내 아미노산 잔기 각각은 Ala, Leu, Ser, Thr, Tyr, Cys, Glu, Lys, Arg, Dbu(2,4 디아미노부티르산), Dpr(2,3-디아미노프로파노산) 및 Orn(오르니틴) 중에서 독립적으로 선택될 수 있다. 바람직하게는, 아미노산 잔기는 Ser, Thr, Tyr, Cys, Glu, Lys, Arg, Dbu, Dpr 및 Orn 중에서 선택되며, 더욱 바람직하게는 Glu, Lys, 및 Cys 중에서 전적으로 선택될 수 있다. 상기-언급한 아미노산은 D- 또는 L-형태일 수 있으나, 바람직하게는 L-형태를 가진다. 특히 바람직한 서열 Z는 4, 5, 6 또는 7개의 연속적인 라이신 잔기(즉, Lys3, Lys4, Lys5, Lys6 또는 Lys7), 및 특히 5개 또는 6개의 연속적인 라이신 잔기의 서열이다. Z의 다른 예시적인 서열은 WO 01/04156호에 나타낸다. 대안적으로, 서열 Z의 C-말단 잔기는 Cys 잔기일 수 있다. 이는 화합물의 변형(예컨대, PEG화, 또는 알부민에 접합)을 보조할 수 있다. 이러한 실시양태에서, 서열 Z는 예를 들어, 길이가 단지 1개 아미노산(즉, Z = Cys)이거나 길이가 2, 3, 4, 5, 6 또는 그 이상의 아미노산일 수 있다. 그러므로 다른 아미노산은 펩티드 X와 말단 Cys 잔기 사이에 스페이서로서 제공된다.
펩티드 서열 Z는 인간 OXM의 IP-1 부위의 상응하는 서열(이는 서열 Lys-Arg-Asn-Arg-Asn-Asn-Ile-Ala를 갖음)과 25% 이하의 서열 동일성을 가진다.
다른 폴리펩티드 서열(예컨대, IP-1)과 관련하여 제공된 펩티드 또는 폴리펩티드 서열의 "아미노산 서열 동일성 퍼센트(%)"는, 2개가 서로 정렬되어 있고, 필요한 경우 최적의 정렬을 위한 갭이 도입되어 있는 경우, 그 다른 폴리펩티드의 상응하는 서열내 상응하게 위치된 아미노산 잔기와 동일한 제공된 펩티드 서열내 아미노산 부분의 퍼센트로 계산된다. 동일성 값%는 WU-BLAST-2[Altschul et al., Methods in Enzymology, 266:460-480 (1996)]에 의해 측정될 수 있다. WU-BLAST-2는 몇가지 조사 파라미터를 사용하며, 이들 중 대부분은 디폴트 값(default value)으로 설정된다. 조절가능한 파라미터는 다음 값으로 설정된다: 오버랩 스팬(overlap span) = 1, 오버랩 부분(overlap fraction) = 0.125, 단어 한계점(word threshold)(T) = 11. 아미노산 서열 동일성 값 %는 WU-BLAST-2로 측정한 것으로서 일치하는 동일한 잔기의 수를 참조 서열의 부분의 총 수(정렬 점수를 최대화하기 위해 WU-BLAST-2에 의해 참조 서열내로 도입된 갭은 무시함)로 나눈 후 100을 곱하여 측정한다.
따라서, Z가 IP-1의 8개 아미노산과 최적으로 정렬될 경우, 이는 IP-1의 상응하는 아미노산과 동일한 2개 이하의 아미노산을 갖는다.
구체적 실시양태에서, 본 발명은 Z가 부재하는 화합물을 제공한다.
본 발명의 화합물 내에 하나 이상의 아미노산 측쇄는 친유성 치환기에 접합될 수 있다. 친유성 치환기는 아미노산 측쇄 내 원자에 공유적으로 결합하거나, 또는 대안적으로 스페이서에 의해 아미노산 측쇄에 접합될 수 있다. 친유성 치환기는 펩티드 X의 일부, 및/또는 펩티드 Z의 일부인 아미노산의 측쇄에 접합될 수 있다.
임의의 특정 이론으로 구속받고 싶지는 않지만, 친유성 치환기는 혈류 중 알부민과 결합함으로써, 본 발명의 화합물을 효소적 분해로부터 차폐하여 이에 따라 화합물의 반감기를 향상시킬 수 있는 것으로 여겨진다. 존재하는 경우, 스페이서는 화합물과 친유성 치환기 사이에 공간을 제공하기 위해 사용된다.
친유성 치환기는 아미노산 측쇄 또는 스페이서에 에스테르, 설포닐 에스테르, 티오에스테르, 아미드 또는 설폰아미드를 통해 부착될 수 있다. 따라서, 바람직하게는 친유성 치환기는 에스테르, 설포닐 에스테르, 티오에스테르, 아미드 또는 설폰아미드의 일부를 형성하는 아실 기, 설포닐 기, N 원자, O 원자 또는 S 원자를 포함한다. 바람직하게는, 친유성 치환기내 아실 기는 아미노산 측쇄 또는 스페이서를 가진 아미드 또는 에스테르의 일부를 형성한다.
친유성 치환기는, 탄소 원자 수가 4 내지 30개인 탄화수소 쇄를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 이는 탄소 원자 수가 적어도 8개 또는 12개이고, 바람직하게는, 이는 탄소 원자 수가 24개 이하이거나, 탄소 원자 수가 20개 이하이다. 탄화수소 쇄는 직선형이거나 분지형일 수 있고 포화되거나 불포화될 수 있다. 탄화수소 쇄가 바람직하게는 아미노산 측쇄 또는 스페이서에 대한 부착의 일부를 형성하는 부분, 예를 들어, 아실 기, 설포닐 기, N 원자, O 원자 또는 S 원자로 치환되는 것은 이해될 것이다. 가장 바람직하게는, 탄화수소 쇄는 아실로 치환되며, 따라서 탄화수소 쇄는 알카노일 기, 예를 들어, 팔미토일, 카프로일, 라우로일, 미리스토일 또는 스테아로일의 일부일 수 있다.
따라서, 친유성 치환기는 하기 화학식을 가질 수 있다.
Figure pct00001
상기 식에서,
A는 예를 들어, 아실 기, 설포닐 기, NH, N-알킬, O 원자 또는 S 원자, 바람직하게는 아실일 수 있다. n은 3 내지 29, 바람직하게는 적어도 7 또는 적어도 11, 및 바람직하게는 23 이하, 보다 바람직하게는 19 이하의 정수이다
탄화수소 쇄는 추가로 치환될 수 있다. 예를 들어, 이는 NH2, OH 및 COOH로 부터 선택된 3개 이하의 치환기로 추가로 치환될 수 있다. 탄화수소 쇄가 추가로 치환되는 경우, 바람직하게는 이는 단지 하나의 치환기로 추가로 치환된다. 대안적으로 또는 추가적으로, 탄화수소 쇄는 예를 들어, 하기 나타낸 바와 같은 시클로알칸 또는 헤테로시클로알칸을 포함할 수 있다:
Figure pct00002
바람직하게는, 시클로알칸 또는 헤테로시클로알칸은 6-원 환이다. 가장 바람직하게는, 이는 피페리딘이다.
대안적으로, 친유성 치환기는 부분적으로 또는 완전히 불포화되거나 포화될 수 있는 시클로펜타노페난트렌 골격을 기초로 할 수 있다. 각각의 골격내 탄소 원자는 Me 또는 OH로 치환될 수 있다. 예를 들어, 친유성 치환기는 콜릴, 데옥시콜릴 또는 리쏘콜릴(lithocholyl)일 수 있다.
상기에서 언급한 바와 같이, 친유성 치환기는 스페이서에 의해 아미노산 측쇄에 접합될 수 있다. 존재하는 경우, 스페이서는 친유성 치환기 및 아미노산 측쇄에 부착된다. 스페이서는 에스테르, 설포닐 에스테르, 티오에스테르, 아미드 또는 설폰아미드에 의해 친유성 치환기 및 아미노산 측쇄에 독립적으로 부착될 수 있다. 따라서, 이는 아실, 설포닐, N 원자, O 원자 또는 S 원자로부터 독립적으로 선택된 2개의 부분을 포함할 수 있다. 스페이서는 하기 화학식을 가질 수 있다:
Figure pct00003
상기 식에서,
B 및 D는 각각 독립적으로 아실, 설포닐, NH, N-알킬, O 원자 및 S 원자로부터, 바람직하게는 아실 및 NH로부터 선택된다. 바람직하게는, n은 1 내지 10, 바람직하게는 1 내지 5의 정수이다. 스페이서는 또한 C0 -6 알킬, C0 -6 알킬 아민, C0 -6 알킬 히드록시 및 C0 -6 알킬 카르복시로부터 선택된 하나 이상의 치환기로 추가로 치환될 수 있다.
대안적으로, 스페이서는 2개 이상의 상기 화학식의 반복 단위를 가질 수 있다. B, D 및 n은 각각의 반복 단위에 대해 각각 독립적으로 선택된다. 인접한 반복 단위는 이들의 각각의 B 및 D 부분을 통해 서로에 공유결합으로 부착될 수 있다. 예를 들어, 인접한 반복 단위의 B 및 D 부분은 함께 에스테르, 설포닐 에스테르, 티오에스테르, 아미드 또는 설폰아미드를 형성할 수 있다. 스페이서의 각각의 말단의 자유 B 및 D 단위는 상기 기술한 바와 같이 아미노산 측쇄 및 친유성 치환기에 부착된다.
바람직하게는, 스페이서는 5개 이하, 4개 이하 또는 3개 이하의 반복 단위를 가진다. 가장 바람직하게는 스페이서는 2개의 반복 단위를 가지거나, 단일 반복 단위이다.
스페이서(또는 이것이 반복 단위를 가지는 경우, 스페이서의 하나 이상의 반복 단위)는 예를 들어, 천연 또는 비천연 아미노산일 수 있다. 작용화된 측쇄를 갖는 아미노산의 경우, B 및/또는 D는 아미노산의 측쇄내의 부분일 수 있음은 이해될 것이다. 스페이서는 임의의 천연적으로 존재하거나 비천연인 아미노산일 수 있다. 예를 들어, 스페이서(또는 이것이 반복 단위를 가지는 경우, 스페이서의 하나 이상의 반복 단위)는 Gly, Pro, Ala, Val, Leu, Ile, Met, Cys, Phe, Tyr, Trp, His, Lys, Arg, Gln, Asn, α-Glu, γ-Glu, Asp, Ser, Thr, Gaba, Aib, β-Ala, 5-아미노펜타노일, 6-아미노헥사노일, 7-아미노헵타노일, 8-아미노옥타노일, 9-아미노노나노일 또는 10-아미노데카노일일 수 있다.
예를 들어, 스페이서는 γ-Glu, 가바(Gaba), β-Ala 및 α-Gly로부터 선택된 단일 아미노산일 수 있다.
친유성 치환기는 본 발명의 화합물내 임의의 아미노산 측쇄에 접합될 수 있다. 바람직하게는, 아미노산 측쇄는 스페이서 또는 친유성 치환기와 에스테르, 설포닐 에스테르, 티오에스테르, 아미드 또는 설폰아미드를 형성하기 위한, 카복시, 하이드록실, 티올, 아미드 또는 아민 기를 포함한다. 예를 들어, 친유성 치환기는 Asn, Asp, Glu, Gln, His, Lys, Arg, Ser, Thr, Tyr, Trp, Cys 또는 Dbu, Dpr 또는 Orn에 접합될 수 있다. 바람직하게는, 친유성 치환기는 Lys에 접합된다. 본원에 제공된 화학식에서 Lys로 나타낸 아미노산은 예컨대 친유성 치환기가 첨가되는 Dbu, Dpr 또는 Orn에 의해 치환될 수 있다.
친유성 치환기 및 스페이서의 예는 하기 화학식에 나타낸다:
Figure pct00004
여기서, 본 발명의 화합물에서 Lys 잔기는 아미드 부분을 통해 γ-Glu(스페이서)에 공유결합으로 부착된다. 팔미토일은 아미드 부분을 통해 γ-Glu 스페이서에 공유결합으로 부착된다.
대안적으로 또는 추가적으로, 본 발명의 화합물 내의 하나 이상의 아미노산 측쇄는 예를 들어, 생체내(예컨대, 혈장내)에서 가용성 및/또는 반감기를 증가시키고/시키거나 생체이용율을 증가시키기 위해 중합체성 부분에 접합될 수 있다. 이러한 변형은 또한 치료학적 단백질 및 펩티드의 클리어런스(clearance)(예컨대, 신장 클리어런스)을 감소시키는 것으로 알려져 있다.
중합체성 부분은 바람직하게는 수용성(양친매성 또는 친수성), 무-독성 및 약제학적으로 불활성이다. 적합한 중합체성 부분은 폴리에틸렌 글리콜(PEG), PEG의 동종-중합체 또는 공-중합체, PEG의 모노메틸-치환된 중합체(mPEG), 또는 폴리옥시에틸렌 글리세롤(POG)을 포함한다[예를 들어, Int . J. Hematology 68:1 (1998); Bioconjugate Chem. 6:150 (1995); and Crit . Rev . Therap . Drug Carrier Sys . 9:249 (1992)를 참조].
다른 적합한 중합체성 부분은 폴리-라이신, 폴리-아스파르트산 및 폴리-글루탐산과 같은 폴리-아미노산을 포함한다[예를 들어, Gombotz, et al. (1995), Bioconjugate Chem., vol. 6 : 332-351; Hudecz, et al. (1992), Bioconjugate Chem., vol. 3, 49-57; Tsukada, et al. (1984), J. Natl. Cancer Inst., vol 73, : 721-729; and Pratesi, et al. (1985), Br. J. Cancer, vol. 52: 841-848)를 참조].
중합체성 부분은 직선형-쇄 또는 분지화된-쇄일 수 있다. 이는 분자량이 500 내지 40,000 Da, 예를 들어, 500 내지 10,000Da, 1000 내지 5000 Da, 10,000 내지 20,000 Da, 또는 20,000 내지 40,000 Da일 수 있다.
본 발명의 화합물은 이러한 부분을 2개 이상 포함할 수 있으며, 여기서 이러한 부분 모두의 총 분자량은 일반적으로 상기에서 제공한 범위 내에 속할 것이다.
중합체성 부분은 아미노산 측쇄의 아미노, 카복실 또는 티올 기에 커플링(공유결합적 연결에 의해)될 수 있다. 바람직한 예는 Cys 잔기의 티올 기 및 Lys 잔기의 엡실론 아미노 기이다. Asp 및 Glu 잔기의 카복실 기가 또한 사용될 수 있다.
숙련가들은 커플링 반응을 수행하는데 사용될 수 있는 적합한 기술을 잘 인식할 것이다. 예를 들어, 메톡시 기를 보유하는 PEG 부분은 제조업자[네크타 써라퓨틱스 에이엘(Nektar Therapeutics AL)]로부터 상업적으로 입수가능한 시약을 사용한 말레이미도 연결에 의해 Cys 티올 기에 커플링시킬 수 있다. 또한 WO 2008/101017호 및 적합한 화학의 세부사항에 대해 위에서 인용된 문헌을 참조하라.
다른 측면에서, 본 발명의 화합물 예를 들어 펩티드 X 내에 하나 이상의 아미노산 측쇄, 중합체성 부분에 접합된다.
추가의 측면에서, 본 발명은 본원 기술된 바와 같은 본 발명의 화합물, 또는 이의 염 또는 유도체를 담체와 함께 혼합되게 포함하는 조성물을 제공한다.
용어 "이의 유도체"는 임의의 하나의 화합물의 유도체를 나타낸다. 유도체는 화합물의 모든 화학적 변형, 모든 보존적인 변경, 모든 전구 약물 및 모든 대사산물을 포함한다.
본 발명은 또한 하기 기술된 바와 같은 병태의 치료를 위한 제약의 제조에서 본 발명의 화합물의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 조성물을 제공하며, 여기서 조성물은 약학적으로 허용가능한 조성물이며, 담체는 약학적으로 허용가능한 담체이다.
펩티드 합성
본 발명의 화합물은 표준 합성 방법, 재조합 발현 시스템, 또는 임의의 다른 당해 분야의 방법에 의해 제조될 수 있다. 따라서 글루카콘 유사체는 예를 들어 하기를 포함하는 방법을 포함하는 다수의 방법으로 합성될 수 있다:
(a) 펩티드를 고체상 또는 액체상 방법의 수단으로 단계적으로 또는 단편 조립에 의해 합성하고, 최종 펩티드 생성물을 분리 및 정제하는 방법; 또는
(b) 펩티드를 인코딩하는 핵산 작제물을 숙주 세포내에서 발현시키고, 발현 생성물을 숙주 세포 배양물로부터 회수하는 방법; 또는
(c) 펩티드를 인코딩하는 핵산 작제물의 무세포 시험관내 발현을 수행하고, 발현 생성물을 회수하는 방법,
또는 방법 (a), (b) 및 (c)의 임의의 조합으로 펩티드의 단편을 수득하고, 이어서 단편을 연결시켜 펩티드를 수득하고, 당해 펩티드를 회수하는 방법.
본 발명의 유사체를 고체 상 또는 액체 상 펩티드 합성을 이용하여 합성하는 것이 바람직하다. 이런 문맥에서, WO 98/11125호 및, 많은 다른 문헌 중에서, 문헌[Fields, GB et al., 2002, "Principles and practice of solidphase peptide synthesis". In: Synthetic Peptides (2nd Edition)] 및 본원의 실시예에 대한 언급이 제공된다.
재조합체 발현의 경우, 본 발명의 핵산 단편은 적합한 벡터내에 일반적으로 삽입되어 본 발명의 핵산 단편을 보유하는 클로닝 또는 발현 벡터를 형성할 것이며; 이러한 신규한 벡터 또한 본 발명의 일부이다. 벡터는, 적용 목적 및 유형에 따라, 플라스미드, 파아지, 코스미드, 미니-염색체 또는 바이러스의 형태일 수 있으나, 또한 특정 세포내에서 단지 일시적으로 발현되는 네이키드(naked) DNA의 형태가 중요한 벡터이다. 본 발명의 바람직한 클로닝 및 발현 벡터(플라스미드 벡터)는 자가 복제함으로써 후속적인 클로닝을 위한 고-수준 발현 또는 고-수준 복제 목적을 위한 높은 카피-수를 가능하게 한다.
일반적으로 요약하면, 발현 벡터는 5'→3' 방향 및 작동가능한 연결로 다음과 같은 특징들을 포함한다: 본 발명의 핵산 단편의 발현을 구동시키기 위한 프로모터, 선택적으로 (세포외 상 또는 적용가능한 경우, 원형질내로) 분비를 가능하게 하는 리더 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열, 본 발명의 펩티드를 인코딩하는 핵산 단편, 및 선택적으로 터미네이터를 인코딩하는 핵산 서열. 이들은 선택가능한 마커 및 복제 기원과 같은 추가의 특징을 포함할 수 있다. 생산자 균주 또는 세포주 내에서 발현 벡터를 사용하여 작업하는 경우, 벡터는 숙주 세포 게놈내로 통합될 수 있는 것이 바람직할 수 있다. 숙련가들은 적합한 벡터에 매우 친숙하며 이들의 특정 요건에 따라 하나를 설계할 수 있다.
본 발명의 벡터는 본 발명의 화합물을 생산하기 위해 숙주 세포를 형질전환시키는데 사용된다. 또한 본 발명의 일부인, 이러한 형질전환된 세포는 본 발명의 핵산 단편 및 벡터의 증식에 사용되거나, 본 발명의 펩티드의 재조합 생산에 사용된 배양된 세포 또는 세포주일 수 있다.
본 발명의 바람직한 형질전환된 세포는 세균[에스케리키아(Escherichia)(예컨대, 이. 콜라이), 바실러스(예컨대, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)), 살모넬라, 또는 마이코박테리움(바람직하게는 비-병원성, 예컨대, 엠. 보비스(M. bovis) BCG)), 효모(예컨대, 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae) 및 피키아 파스토리스(pichia pastoris))], 및 원생동물과 같은 미생물이다. 대안적으로, 형질전환된 세포는 다세포 유기체로부터 기원할 수 있는데, 즉, 이는 진균 세포, 곤충 세포, 조류 세포, 식물 세포 또는 포유동물 세포와 같은 동물 세포일 수 있다. 클로닝 및/또는 최적화된 발현의 목적을 위해, 형질전환된 세포는 본 발명의 핵산 단편을 복제할 수 있는 것이 바람직하다. 핵산 단편을 발현하는 세포는 본 발명의 유용한 실시양태이며; 이들은 본 발명의 펩티드의 소-규모 또는 대-규모 제조를 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 펩티드를 형질전환된 세포를 이용하여 생산하는 경우, 비록 필수적인 것은 아니라도, 발현 생성물이 배양 배지 내로 분비되는 것이 편리하다.
효능
GLP-1 또는 글루카곤(Glu) 수용체에 대한 관련 화합물의 결합은 작용제(agonist) 활성의 지표(indication)로서 사용될 수 있으나, 일반적으로, 관련 수용체에 대한 화합물의 결합으로 야기되는 세포내 시그널링을 측정하는 생물학적 분석을 사용하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 글루카곤 작용제에 의한 글루카곤 수용체의 활성화는 세포 사이클릭 AMP(cAMP) 형성을 자극할 것이다. 유사하게, GLP-1 작용제에 의한 GLP-1 수용체의 활성화는 세포 cAMP 형성을 자극할 것이다. 따라서, 이들 2개의 수용체 중 하나를 발현하는 적합한 세포내에서 cAMP의 생산을 사용하여 관련 수용체 활성을 모니터링할 수 있다. 따라서, 각각 하나의 수용체를 발현하나 다른 것은 발현하지 않는 세포 유형의 적합한 쌍의 사용은 수용체 유형 둘 모두에 대한 작용제 활성을 측정하는데 사용될 수 있다.
숙련가는 적합한 분석(assay) 형식을 인식할 것이며, 실시예들이 하기에 제공된다. GLP-1 수용체 및/또는 글루카곤 수용체는 실시예들에 기술된 수용체의 서열을 가질 수 있다. 예를 들어, 분석은 일차 수탁 번호 GI:4503947을 갖는 인간 글루카곤 수용체(글루카곤-R) 및/또는 일차 수탁 번호 GI:166795283을 갖는 인간 글루카곤-유사 펩티드 1 수용체(GLP-1R)를 사용할 수 있다(여기서, 전구체 단백질의 서열이 언급되며, 물론, 이는 분석이 시그널 서열이 부재하는, 성숙한 단백질을 사용할 수 있음을 이해하여야함).
EC50 값은 제공된 수용체에서 작용제 효능의 수치 척도로서 사용될 수 있다. EC50 값은 특정 분석에서 그 화합물의 최대 활성의 1/2을 달성하는데 요구되는 화합물의 농도의 척도이다. 따라서, 예를 들어, 특정 분석에서 글루카곤의 EC50[GLP-1]보다 낮은 EC50[GLP-1]을 갖는 화합물이 글루카곤 보다 더 높은 GLP-1 수용체 작용제 효능을 갖는 것으로 고려될 수 있다.
본 명세서에 기술된 화합물은 전형적으로 Glu-GLP-1 이중 작용제인데, 이들은 글루카곤 수용체 및 GLP-1 수용체 둘 모두에서 cAMP 형성을 자극할 수 있다는 관찰에 의해 측정된 바와 같다. 각각의 수용체의 자극은 독립된 분석에서 측정하고 그 후 서로 비교할 수 있다.
글루카곤 수용체에 대한 EC50 값(EC50 [글루카곤-R])을 GLP-1 수용체에 대한 EC50 값, 제공된 화합물에 대한 (EC50[GLP-1R])을 비교함으로써, 그 화합물의 상대적인 글루카곤 선택성(%)을 하기와 같이 알아낼 수 있다:
상대적인 글루카콘-R 선택성[화합물] = (1/EC50 [글루카곤-R])x100 / (1/EC50 [글루카곤-R] + 1/EC50 [GLP-1R])
상대적인 GLP-1R 선택성을 하기와 같이 유사하게 알아낼 수 있다:
상대적인 GLP-1R 선택성[화합물] = (1/EC50 [GLP-1R])x100 / (1/EC50 [글루카곤-R] + 1/EC50 [GLP-1R])
화합물의 상대적인 선택성은 GLP-1 또는 글루카곤 수용체에 대한 이의 효과를 다른 수용체에 대한 이의 효과에 대해 직접 비교하도록 한다. 예를 들어, 화합물의 상대적인 GLP-1 선택성이 더 높아질수록, 화합물이 글루카곤 수용체와 비교할때 GLP-1 수용체에 대해 더욱 효과적이다.
하기 기술된 분석을 사용하여, 본 발명자들은 인간 글루카곤에 대한 상대적인 GLP-1 선택성이 대략 5%인 것을 알아내었다.
본 발명의 화합물은 특정한 수준의 글루카곤-R 작용제 활성의 경우, 본 화합물은 글루카곤 보다 더 높은 수준의 GLP-1R 작용제 활성(즉, GLP-1 수용체에서 더 높은 효능)을 나타낼 것이라는 점에서 인간 글루카곤 보다 상대적인 GLP-1R 선택성이 더 높다. 글루카곤 및 GLP-1 수용체에서 특정 화합물의 절대 효능이, 적절한 상대적인 GLP-1R 선택성이 달성되는 한, 천연의 인간 글루카곤의 효능보다 더 높거나, 낮거나 또는 대략 동일할 수 있음을 이해할 것이다.
그럼에도 불구하고, 본 발명의 화합물은 인간 글루카곤보다 더 낮은 EC50 [GLP-1R]을 가질 수 있다. 이 화합물은 글루카곤보다 더 낮은 EC50[GLP-1-R]을 가지면서 인간 글루카곤보다 10배 미만, 인간 글루카곤보다 5배 미만, 또는 인간 글루카곤보다 2배 미만인 EC50 [글루카곤-R]을 가질 수 있다.
본 발명의 화합물은 인간 글루카곤보다 2배 미만인 EC50 [글루카곤-R]을 가질 수 있다. 본 화합물은 인간 글루카곤보다 2배 미만인 EC50 [글루카곤-R] 및 인간 글루카곤보다 1/2배 미만, 인간 글루카곤보다 1/5배 미만 또는 인간 글루카곤보다 1/10배 미만인 EC50 [GLP-1R]을 가질 수 있다.
화합물의 상대적인 GLP-1R 선택성은 5% 내지 95%일 수 있다. 예를 들어, 화합물은, 5 내지 20%, 10 내지 30%, 20 내지 50%, 30 내지 70%, 또는 50 내지 80%; 또는 30 내지 50%, 40 내지 60,%, 50 내지 70% 또는 75 내지 95%의 상대적인 선택성을 가질 수 있다.
본 발명의 화합물은 또한 칼시토닌 유전자-관련 펩티드 1(CGRP1), 코르티코트로핀-방출 인자 1 & 2(CRF1 & CRF2), 위 억제 폴리펩티드(GIP), 글루카곤-유사 펩티드 1 & 2(GLP-1 & GLP-2, 글루카곤(GCGR), 세크레틴, 생식선 자극 호르몬 방출 호르몬(GnRH), 파라티로이드-호르몬 1 & 2(PTH1 & PTH2), 혈관작동성 장 펩티드(VPAC1 & VPAC2)와 같은 다른 클래스 B GPCR 수용체에 대하여 효과를 가질 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.
치료학적 용도
본 발명의 화합물은 그 중에서 비만 및 물질대사 질환에 대하여 매력적인 치료적 선택을 제공할 수 있다.
대사 증후군은 한 인간에서 대사 위험 인자 그룹으로 특징화된다. 이들은 복부 비만(복부 내부 기관 주변의 과도한 지방 조직), 동맥경화 유발 이상지혈증[동맥 혈관 벽내에 플라크 축적(plaque buildup)을 조성하는 고 트리글리세라이드, 저 HDL 콜레스테롤 및/또는 고 LDL 콜레스테롤을 포함하는 혈중 지방 질환], 상승된 혈압(고혈압), 인슐린 저항성 및 글루코스 불내성(intolerance), 전혈전증 상태(예컨대, 혈액 중 높은 피브리노겐 또는 플라스미노겐 활성 인자 억제제-1) 및 전염증 상태(예컨대, 혈중 상승된 C-반응성 단백질)을 포함한다.
대사 증후군이 있는 개인은 관동맥성 심장병 및 동맥경화증(예컨대, 뇌졸중 및 말초 혈관병)의 다른 징후와 관련된 기타 질환에도 걸릴 위험이 증가되어 있다. 이러한 증후군에 대한 우세하게 잠재하는 위험 인자는 복부 비만인 것으로 여겨진다.
임의의 특정한 이론으로 구속받고 싶지는 않지만, 본 발명의 화합물은 GluGLP-1 이중 작용제로서 작용하는 것으로 여겨진다. 이중 작용제는 음식 섭취에 있어서의 GLP-1의 효과와 지방 대사에서 글루카곤의 효과를 조합한다. 그러므로 이들은 과도한 지방 축적의 제거를 가속화하고 지속적인 체중감소를 유도하도록 상승적 방식으로 작용한다.
이중 GluGLP-1 작용제의 상승적 효과는 체중에 대한 이의 효과와는 완전히 독립적일 수 있는, 고 콜레스테롤 및 LDL과 같은 심혈관 위험 인자의 감소를 또한 초래할 수 있다.
따라서, 본 발명의 화합물은 체중 증가를 예방하거나, 체중 감소를 촉진하거나, 과체중을 감소시키거나, 병적 비만을 포함하는 비만(예컨대, 식욕, 섭식, 식품 섭취, 칼로리 섭취 및/또는 에너지 소비의 조절에 의해), 뿐만 아니라 비만 관련 염증, 비만 관련 쓸개 질환 및 비만 유도된 수면 무호흡을 포함하나, 이에 한정되지 않는 관련 질환 및 건강 상태를 치료하기 위한 약제로서 사용될 수 있다. 본 발명의 화합물은 또한 대사 증후군, 고혈압, 동맥경화 유발 이상지혈증, 죽상동맥경화증, 동맥경화증, 관상 동맥 심질환 및 뇌졸중의 치료에 사용될 수 있다. 이들은 비만과 관련될 수 있는 모든 상태이다. 그러나, 이들 병태에 있어서 본 발명의 화합물의 효과는 체중에 있어서의 효과를 통해 전체적으로 또는 부분적으로 매개될 수 있거나 이와는 독립적일 수 있다.
특히, 본 발명에서 상술된 화합물은 글루코스 내성에 대해 효과가 없거나 적은 효과를 가지면서 체중 증가를 예방하거나 체중 감소를 촉진하는데 용도를 찾을 수 있다. 상술된 화합물이 적합한 혈당 조절 동물 모델에서 HbA1c 수준에 대해 거의 효과가 없거나 적은 효과를 가지면서 체중 감소에 대해 현저한 효과를 가짐이 밝혀졌다.
따라서 본 발명은 이를 필요로 하는 개체에서, 상기 기술된 바와 같은 병태의 치료에서의 본 발명의 화합물의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 의학적 치료 방법에서의 용도를 위한, 특히 상기 기술된 상태의 치료 방법에서의 용도를 위한, 본 발명의 화합물을 제공한다.
바람직한 측면에서, 상술된 화합물은 체중 증가를 예방하거나 체중 감소를 촉진하는데 사용될 수 있다.
구체적 실시양태에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 개체에서 체중 증가를 예방하거나 체중 감소를 촉진하기 위한 화합물의 용도를 포함한다.
구체적 실시양태에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 개체에서 과체중에 의해 야기되거나 특징지어지는 병태의 치료, 예컨대 비만, 병적 비만, 수술전 병적 비만, 비만 관련 염증, 비만 관련 쓸개 질환, 비만 유도된 수면 무호흡, 고혈압, 동맥경화 유발 이상지혈증, 죽상동맥경화증, 관상동맥 심질환, 말초 동맥 질환, 뇌졸증 또는 미세혈관 질환의 치료 및/또는 예방에서 화합물의 용도를 포함한다.
다른 측면에서, 기술된 화합물은 순환하는 LDL 수준을 저하시키는 방법 및/또는 HDL/LDL 비를 증가시키는 방법에서 사용될 수 있다.
구체적 실시양태에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 개체에서 순환하는 LDL 수준을 저하시키는 방법 및/또는 HDL/LDL 비를 증가시키는 방법에서 화합물의 용도를 포함한다.
약학적 조성물
본 발명의 화합물, 또는 이의 염은 약학적으로 허용가능한 담체 중에 치료학적 유효량의 본 발명의 화합물, 또는 이의 염을 전형적으로 포함하는 저장 또는 투여용으로 제조된 약학적 조성물로서 제형화될 수 있다.
본 발명의 화합물의 치료학적 유효량은 투여 경로, 치료되는 포유동물의 유형, 및 고려되는 특정 포유동물의 물리적 특성에 의존할 것이다. 이들 인자 및 이러한 양을 측정하는 것과 이들 인자 및 이들의 관계는 의학 분야의 숙련된 의사에게 잘 공지되어 있다. 이러한 투여량 및 투여 방법은 최적 효능을 달성하기 위해 조절할 수 있으며, 의학 분야의 숙련자에게 잘 공지된 체중, 식품, 동시처리되는 의약 및 기타 인자와 같은 인자들에 의존할 수 있다. 인간용으로 가장 적절한 투여량 크기 및 투여 요법은 본 발명에 의해 수득된 결과에 의해 안내될 수 있으며, 적절히 설계된 임상 시험에서 확인될 수 있다.
유효 튜여량 및 치료 프로토콜은 실험실 동물에서 낮은 투여량으로 개시한 후 효과를 모니터링하는 동안 투여량을 증가시키며, 투여량 레지멘을 또한 전신계적으로 변화시켜 측정할 수 있다. 다수의 인자는 제공된 대상체에 대해 최적의 투여량을 측정하는 경우 임상의가 고려할 수 있다. 이러한 고려는 숙련가에게 공지되어 있다.
용어 "약학적으로 허용가능한 담체"는 임의의 표준 약학적 담체를 포함한다. 치료학적 용도를 위한 약학적으로 허용가능한 담체는 약학 분야에 잘 공지되어 있으며 예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro edit. 1985)]에 기술되어 있다. 예를 들어, 약산성 또는 생리학적 pH의 멸균 염수 및 인산염-완충된 염수를 사용할 수 있다. pH 완충제는 인산염, 시트르산염, 아세트산염, 트리스/하이드록시메틸)아미노메탄(TRIS), N-트리스(하이드록시메틸)메틸-3-아미노프로판설폰산(TAPS), 중탄산 암모늄, 디에탄올아민, 바람직한 완충제인 히스티딘, 아르기닌, 라이신 또는 아세테이트, 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 이 용어는 인간을 포함하는 동물에서 사용하기 위해 미국 약전(US Pharmacopeia)에 열거된 임의의 제제를 추가로 포함한다.
용어 "약학적으로 허용가능한 염"은 화합물의 임의의 하나의 염을 말한다. 염은 산 부가염 및 염기성염과 같은 약학적으로 허용가능한 염을 포함한다. 산 부가염의 예는 염산염, 시트르산염 및 아세트산염을 포함한다. 염기성 염의 예는, 양이온이 나트륨 및 칼륨과 같은 알칼리 금속, 칼슘과 같은 알칼리 토 금속 및 암모늄 이온 +N (R3) 3(R4)(여기서, R3 및 R4는 독립적으로 선택적으로 치환된 C1 -6-알킬, 선택적으로 치환된 C2 -6-알케닐, 선택적으로 치환된 아릴, 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴임) 중에서 선택되는 염을 포함한다. 약학적으로 허용가능한 염의 다른 예는 문헌["Remington's Pharmaceutical Sciences", 17th edition. Ed. Alfonso R. Gennaro (Ed.), Mark Publishing Company, Easton, PA, U.S.A., 1985 and more recent editions, and in the Encyclopaedia of Pharmaceutical Technology]에 기술되어 있다.
"치료"는 유리하거나 바람직한 임상 결과를 얻기 위한 시도이다. 본 발명의 목적을 위해, 유리하거나 바람직한 임상 결과는 검출가능하거나 검출가능하지 않은, 증상의 완화, 질환의 정도의 감소, 질환의 안정화된(즉, 악화되지 않은) 상태, 질환 진행의 지연 또는 저하, 질환 상태의 완화 또는 경감, 및 진정(부분적이거나 또는 전체적으로)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. "치료"는 또한 치료를 제공받지 않을 경우 예측 수명과 비교하여 연장된 수명을 의미할 수 있다. "치료"는 장애의 발달을 예방하거나 병리학을 변경시키는 의도로 수행된 개입이다. 따라서, "치료"는 치료학적 치료 및 예방적 또는 방지적 조치 둘 모두를 나타낸다. 치료가 요구되는 인간들은 이미 장애를 가진 인간들 및 장애가 방지되어야 하는 인간들을 포함한다.
약제학적 조성물은 단위 투여량 형태일 수 있다. 이러한 형태에서, 본 조성물은 적절한 양의 활성 성분을 함유하는 단위 투여량으로 분할된다. 단위 투여량 형태는 포장된 제제일 수 있으며, 제제의 별개의 양을 함유하는 포장, 예를 들어, 포장된 정제, 캡슐 및 바이알 또는 앰플 중의 분말일 수 있다. 단위 투여량 형태는 또한 캡슐, 카세제(cachet) 또는 정제 자체일 수 있거나, 이는 적절한 수의 임의의 이들 포장된 형태일 수 있다. 이는 예를 들어, 펜(pen) 형태의 단일 투여량의 주사가능한 형태로 제공될 수 있다. 특정 실시양태에서, 포장된 형태는 사용을 위한 설명서와 함께 라벨 또는 첨부문서를 포함한다. 조성물은 특정의 적합한 경로 및 투여 수단을 위해 제형화될 수 있다. 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제는 경구, 직장, 비강, 국소(볼내 및 설하 포함), 질내 또는 비경구(피하, 근육내, 정맥내, 피내 및 경피 포함) 투여에 적합한 제형에 사용된 것들을 포함한다. 제형은 편리하게는 단위 투여량 형태로 제공될 수 있으며, 또한 약제학 분야에 잘 공지된 임의의 방법으로 제조할 수 있다.
피하 또는 경피 투여 방식이 본원에 기술된 화합물에 특히 적합할 수 있다. 본 발명의 조성물은 화합물의 안정성의 추가적인 증가, 생체이용률 증가, 용해도 증가, 부작용 감소, 당업자에게 잘 알려진 시간 치료 달성, 및 환자 순응도 증가 또는 이의 임의의 조합을 위하여 예를 들어, 공유, 소수성 및 정전기적 상호작용을 통해 약물 담체, 약물 전달 시스템 및 진보된 약물 전달 시스템 중에 추가로 배합되거나 이에 부착될 수 있다. 담체, 약물 전달 시스템 및 진보된 약물 전달 시스템의 예는, 이로 제한되지는 않지만, 중합체 예를 들어, 셀룰로오스 및 유도체, 폴리사카라이드, 예를 들어, 덱스트란 및 유도체, 전분 및 유도체, 폴리(비닐 알코올), 아크릴레이트 및 메타크릴레이트 중합체, 폴리락틱 및 폴리글리콜릭산 및 그의 공-중합체 차단(block), 폴리에틸렌 글리콜, 담체 단백질, 예를 들어 알부민, 겔, 예를 들어, 온도민감성 시스템, 예를 들어, 당업자에게 잘 알려진 공-중합체 시스템 차단, 미셀(micelle), 리포솜, 마이크로스피어, 나노입자, 액체 클리스털 및 이의 분산물, 액체-물 시스템 중 상 행동(phase behaviour)의 당업자에게 잘 알려진, L2 상 및 이의 분산물, 뿐만아니라 중합성 미셀, 복합 에멀전, 자가-에멀전화, 자가-마이크로에멀전화, 시클로덱스트린 및 그의 유도체, 및 덴드리머를 포함한다.
조합 치료법
상술된 바와 같이, 다음에서 본 발명의 화합물에 대한 언급은 또한 약학적으로 허용가능한 염 또는 이의 용매화물 뿐만 아니라 본 발명의 하나 초과의 상이한 화합물을 포함하는 조성물까지 확장되는 것으로 이해될 것이다.
본 발명의 화합물은 비만, 고혈압, 이상지혈증 또는 당뇨병 치료용 제제와의 조합 치료요법의 일부로서 투여될 수 있다.
이러한 경우에, 2개의 활성제는 함께 또는 별개로, 그리고 동일한 약학적 제형의 일부로서 또는 별개의 제형으로서 제공될 수 있다.
따라서, 화합물 또는 이의 염은 또한 글루카곤-유사 펩티드 수용체 1 작용제, 펩티드 YY 또는 이의 유사체, 칸나비노이드 수용체 1 길항제, 리파제 억제제, 멜라노코르틴 수용체 4 작용제, 또는 멜라닌 농축 호르몬 수용체 1 길항제를 포함하나, 이에 한정되지 않는 항-비만제와 조합하여 사용될 수 있다.
본 발명의 화합물 또는 이의 염은 안지오텐신-전환 효소 억제제, 안지오텐신 II 수용체 차단제, 이뇨제, 베타-차단제 또는 칼슘 채널 차단제를 포함하나, 이에 한정되지 않는 항-고혈압제와 함께 사용될 수 있다.
본 발명의 화합물 또는 이의 염은 스타틴, 파이브레이트, 니아신 및/또는 콜레스테롤 흡수 억제제를 포함하나, 이에 한정되지 않는 이상지혈증제와 함께 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 화합물 또는 이의 염은 메트포르민, 설포닐우레아, 글리니드, DPP-IV 억제제, 글리타존, 상이한 GLP-1 작용제 또는 인슐린을 포함하나, 이에 한정되지 않는 항-당뇨병제와 함께 사용될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 화합물 또는 이의 염은 적절한 혈당 조절을 달성하기 위해 인슐린, DPP-IV 억제제, 설포닐우레아 또는 메트포르민, 특히 설포닐우레아 또는 메트포르민과 함께 사용된다. 더욱더 바람직한 실시양태에서, 화합물 또는 이의 염은 적절한 혈당 조절을 달성하기 위해 인슐린 또는 인슐린 유사체와 함께 조합하여 사용된다. 인슐린 유사체의 예는 란투스, 노보라피드, 후말로그, 노보믹스 및 악트라판 HM을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
방법
글루카곤 유사체의 일반적인 합성
고체상 펩티드 합성(SPPS)을 폴리스티렌 수지(TentaGel S Ram) 상에서 NMP내 표준 Fmoc 전략을 사용하여 초음파 보조된 합성기에서 수행하였다. HATU를 염기로서 DIPEA와 함께 커플링 시약으로 사용하였다. 피페리딘(NMP중 20%)을 탈보호에 사용하였다. 적용가능한 경우, 슈도프롤린: Fmoc-Phe-Thr(.Psi. Me, Me pro)-OH 및 Fmoc-Asp-Ser(.Psi., Me, Me pro)-OH[노바바이오켐(NovaBiochem)으로부터 시판]을 사용하였다.
사용된 약자는 하기와 같다:
ivDde: 1-(4,4-디메틸-2,6-디옥소시클로헥실리덴)3-메틸-부틸
Dde: 1-(4,4-디메틸-2,6-디옥소시클로헥실리덴)-에틸
DCM:　디클로로메탄
DMF:　N,N-디메틸포름아미드
DIPEA:　디이소프로필에틸아민
EtOH: 에탄올
Et2O:　디에틸 에테르
HATU:　N-[(디메틸아미노)-1H-1,2,3-트리아졸[4,5-b]피리딘-1-일메틸렌]-N-메킬메탄암모늄 헥사플루오로포스페이트 N-옥사이드
MeCN:　아세토니트릴
NMP:　N-메틸피롤리돈
TFA: 트리플루오로아세트산
TIS:　트리이소프로필실란
절단:
조 펩티드를 실온에서 2시간 동안 95/2.5/2.5% (v/v) TFA/TIS/물로 처리함으로써 수지로부터 절단하였다. 서열내 메티오닌을 가진 펩티드의 경우, 95/5 % (v/v) TFA/EDT의 혼합물을 사용하였다. 대부분의 TFA를 감압하에 제거하고 조 펩티드를 침전시키고 디에틸에테르로 세척하고 주위 온도에서 고정 중량으로 건조되도록 하였다.
아실화된 글루카곤 유사체의 일반적인 합성
라이신상의 엡실론-아민을 아실화하는 것 외에, 펩티드를 여전히 수지에 부착시키고 측쇄 기 상에서 완전히 보호한 채 펩티드 골격을 라이신 잔기의 측쇄 상에서 아실화시킨 것을 제외하고는, 펩티드 골격을 글루카곤 유사체의 일반적인 합성을 위해 위에서 기술한 바와 같이 합성하였다. 아실화될 라이신은 Fmoc-Lys(ivDde)-OH 또는 Fmoc-Lys(Dde)-OH를 사용하여 통합시켰다. 펩티드의 N-말단은 NMP에서 Boc2O를 사용하여 Boc 기로 보호한다. 펩티드는 여전히 수지에 부착되어 있는 반면, ivDde 보호 기는 NMP 중에서 5% 하이드라진 수화물을 사용하여 선택적으로 분해하였다. 그 후, 보호되지 않은 라이신 측쇄를 Fmoc-Glu-OtBu와 같은 스페이서 아미노산과 우선적으로 커플링시키고, 피페리딘으로 탈보호시키고, 상기 기술한 바와 같은 표준 펩티드 커플링 방법을 사용하여 지방산으로 아실화시켰다. 대안적으로, N-말단에서 히스티딘을 Boc-His(Boc)-OH로 개시하여 혼입시킬 수 있다. 수지로부터의 절단 및 정제는 상기 기술한 바와 같이 수행한다.
인간 글루카곤- 및 GLP -1 수용체를 발현하는 세포주의 생성
인간 글루카곤 수용체(글루카곤-R)(일차 수탁 번호 P47871) 또는 인간 글루카곤-유사 펩티드 1 수용체(GLP-1R)(일차 수탁 번호 P43220)를 암호화하는 cDNA를 cDNA 클론 BC104854(MGC:132514/IMAGE:8143857) 또는 BC112126(MGC:138331/IMAGE:8327594)으로부터 각각 클로닝하였다. 글루카곤-R 또는 GLP-1-R을 암호화하는 DNA를 아클로닝(subcloning)용의 말단 제한 부위를 암호화하는 프라이머를 사용하여 PCR로 증폭시켰다. 5'-말단 프라이머는 효율적인 해독을 보증하기 위해 근처의 코작 컨센서스 서열(Kozak consensus sequence)을 추가로 암
호화하였다. 글루카곤-R 및 GLP-1-R을 인코딩하는 DNA의 정확도를 DNA 서열분석으로 확인하였다. 글루카곤-R 또는 GLP-1-R을 암호화하는 PCR 생성물을 네오마이신(G418) 내성 마커를 함유하는 포유동물 발현 벡터내로 아클로닝하였다.
글루카곤-R 또는 GLP-1-R을 인코딩하는 포유동물 발현 벡터를 표준 인산 칼슘 형질감염 방법에 의해 HEK293 세포 내로 형질감염시켰다. 형질감염 48시간 후, 세포를 제한된 희석 클로닝을 위해 접종(seeding)하고 배양 배지 속에서 1 mg/ml G418로 선택하였다.
3주 후 글루카곤-R 및 GLP-1-R 발현 세포의 12개의 생존하는 콜로니를 택하여, 증식시키고 하기 기술한 바와 같이 글루카곤-R 및 GLP-1-R 효능을 시험하였다. 하나의 글루카곤-R 발현 클론 및 하나의 GLP-1-R 발현 클론을 화합물 프로파일링을 위해 선택하였다.
글루카곤 수용체 및 GLP -1 수용체 효능 분석
인간 글루카곤-R, 또는 인간 GLP-1-R을 발현하는 HEK293 세포를 웰당 40,000개 세포로 0.01% 폴리-L-라이신이 코팅된 96-웰 미세역가 플레이트내에 접종하고 100 ㎕의 성장 배지 중의 배양물 속에서 1일 동안 성장시켰다. 분석 당일에, 성장 배지를 제거하고 세포를 200 ㎕의 타이로드 완충제(Tyrode buffer)로 1회 세척하였다. 세포를 증가하는 농도의 시험 펩티드, 100μM IBMX, 및 6 mM 글루코스를 함유하는 100 ㎕의 타이로드 완충제 속에서 15분 동안 37℃로 인큐베이션시켰다. 반응을 25 ㎕의 0.5 M HCl을 가하여 중지시키고 얼음 상에서 60분 동안 인큐베이션시켰다. cAMP 함량을 플래쉬플레이트®(FlashPlate®) cAMP 키트[제조원: 퍼킨-엘머(Perkin-Elmer)]를 사용하여 평가하였다. EC50 및 참조 화합물(글루카곤 및 GLP-1)과 비교한 상대적인 효능을 컴퓨터 보조된 곡선 핏팅으로 평가하였다.
HbA1c 측정
헤모글로빈 A1C(HbA1c)의 수준을 측정함으로써 개체의 글루코스 수준에 대한 화합물의 장기간 효과를 평가하는 것이 가능하다. HbA1c는 헤모글로빈의 글리코실화된 형태로 세포에서 HbA1c의 수준은 그의 생애 시간(lifetime) 동안 세포가 노출되는 글루코스의 평균 수준을 반영한다. 마우스에서, HbA1c는 이전 4주 동안 평균 혈액 글루코스 수준에 대한 적절한 바이오마커이며, 대략 47일의 에리스로사이트의 생애 스팬(life span)에 의해 제한되기 때문이다(Abbrecht & Littell, 1972; J. Appl. Physiol. 32, 443-445).
HbA1c 측정은 시료 중 HbA1c를 항-HbA1c와 반응시켜 가용성 항원-항체 복합체를 형성하는 탁도계적 억제 면역분석(Turbidimetric INhibition ImmunoAssay)(TINIA)을 기초로 한다. 과량의 항-HbA1c 항체와 반응하는 폴리햅텐의 첨가는 불용성 항체-폴리햅텐 복합체를 형성하며, 이는 탁도계적(turbidimetrically)으로 측정될 수 있다. 용혈된 시료 중 유리된 헤모글로빈은 특성화된 흡수 스펙트럼을 가지는 유사체로 전환되고, 이는 전인큐베이션 상(preincubation phase) 동안에 이중채색적(bichromatically)으로 측정된다. 최종 결과는 총 헤모글로빈의 HbA1c 퍼센트로서 나타낸다(Cobas®Application note A1C-2).
콜레스테롤 수준 측정
분석은 효소적 비색(colorimetric) 방법이다. 마그네슘 이온의 존재하에, 덱스트란 설페이트는 선택적으로 LDL, VLDLA 및 킬로미크론과 수용성 복합체를 형성하며, 이는 PEG-변형된 효소에 저항성이 있다. HDL 콜레스테롤은 콜레스테롤 에스테라제 및 아미노 기에 PEG와 커플링된 콜레스테롤 옥시다제에 의해 효소적으로 측정된다. 콜레스테롤 에스테르는 유리 콜리스테롤 및 지방산으로 정량적으로 분해된다. HDL 콜레스테롤은 콜레스-4-엔-3-원(choles-4-en-3-one) 및 H2O2로 효소적으로 산화되고, 형성된 H2O2가 비색적으로 측정된다(Cobas® Application note HDLC3).
LDL의 직접적인 측정은 비이온 세척제에 의한 LDL의 선택적인 미셀러리(micellary) 가용화 및 당 화합물과 지질단백질(VLDL 및 킬로미크론)의 상호작용을 이용한다. 세척제와 당 화합물의 조합은 혈장에서 LDL의 선택적인 측정을 가능케한다. 시험 원리는 콜레스테롤 및 HDL의 것과 동일하나, 당 및 세척제로 인하여 오로지 LDL-콜레스테롤 에스테르만이 유리 콜레스테롤 및 지방산으로 분해된다. 그 후 유리 콜레스테롤은 산화되고 형성된 H2O 2 가 비색적으로 측정된다(Application note LDL_C, Cobas®).
시험된 GPCR -B 표적
칼시토닌 유전자-관련 펩티드 1(CGRP1), 코르티코트로핀-방출 인자 1 & 2(CRF1 & CRF2), 위장 억제 폴리펩티드(GIP), 글루카곤-유사 펩티드 1 & 2 (GLP-1 & GLP-2, 글루카곤(GCGR), 세크레틴, 성선 자극 호르몬 방출 호르몬(GnRH), 파라티로이드-호르몬 1 & 2(PTH1 & PTH2), 혈관작동성 장 펩티드(VPAC1 & VPAC2)에 대한 수용체
다른 클래스 B 수용체에 대한 분석 설계
작용제 활성화 퍼센트 측정은 시료 화합물(글루카곤 유사체)을 분석하고 각각의 프로파일링된 GPCR에 대한 Emax 대조군을 참조함으로써 수득하였다. 길항제 억제 퍼센트 측정은 시료 화합물을 분석하고 각각의 프로파일링된 GPCR에 대한 대조군 EC80 웰을 참조함으로써 수득하였다. 작용제 및 길항제 분석 런(run)을 위한 "이중 첨가" 분석 프로토콜을 사용하여 시료를 러닝시켰다. 프로토콜 설계는 하기와 같다:
화합물 제조 매스터 스톡 용액(Master stock solution)
달리 특정되지 않는 한, 시료 화합물을 모든 희석이 포함된 100% 무수 DMSO 중에 희석시켰다. 시료 화합물이 상이한 용매 중 제공될 경우, 모든 매스터 스톡 희석을 특정한 용매 중에 수행하였다. 모든 대조군 웰은 시료 화합물 웰과 같이 동일한 용매 최종 농도를 함유하였다.
분석을 위한 화합물 플레이트
글루카곤 유사체를 매스터 스톡 용액으로부터 딸 플레이트(daughter plate)로 이동시키고 이를 분석에 이용하였다. 각각의 시료 화합물을 적절한 농도에서 분석 완충제(20mM HEPES 및 2.5mM 프로베네시드를 가진 1x HBSS)으로 희석시켜 최종적인 소정의 농도를 수득하였다.
칼슘 유입 분석 작용제 분석 포맷
글루카곤 유사체를 100nM 및 1nM로 두벌로(duplicate) 플레이팅하였다. 여기 기술된 농도는 길항제 분석 동안에 화합물의 최종 농도를 반영한다. 참조 작용제는 분석 대조군으로서 역할을 하는 상술된 바와 같이 핸들링하였다. 참조 작용제는 Emax에 대하여 기술된 바와 같이 핸들링하였다. 분석을 FLIPRTETRA을 사용하여 90초 동안 판독하였다.
길항제 분석 포맷
앞서 결정된 EC80 수치를 사용하여, 모든 전-인큐베이션시킨 시료 화합물 및 참조 작용제의 EC80을 가진 참조 길항제(적용가능할 경우) 웰을 자극하였다.
FLIPRTETRA(이 첨가는 각각의 웰에 참조 작용제를 첨가함)를 사용해 180초 동안 판독하고- 그 후 형광 측정값을 수집하여 IC50-수치를 계산하였다.
사이노몰거스 ( cynomolgus ) 원숭이에서 PK
사이노몰거스 원숭이(수컷, N=2)에게 1일째 및 8일째에 단일 투여량으로 정맥내로 20 nmol의 화합물 6/kg 및 피하로 20 nmol의 화합물 6/kg를 각각 투여하였다. 혈장 시료를 다음의 시간 지점에서 취하였다; 투여 전, 정맥 내 투여 후 5, 10, 30분, 1, 2, 4, 8, 12, 24 및 36 시간, 및 투여 전, 피하 투여 후 10, 30분, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 36 및 48 시간. 비히클을 pH 7.4 (25 mM 소듐 포스페이트, 25 mM NaCl)에서 25 mM 포스페이트 완충된 염수로 구성하였다. 혈장 시료를 단백질 침강, 이어서 고체 상 추출 및 LC-MS/MS 분석을 사용해 분석하였다. 약물동역학 파라미터를 WinNonLin 버전 4.1에서 비-구획 분석을 사용하여 계산하였다.
db / db 마우스에서 HbA1c 에 대한 Glu - GLP -1 작용제 화합물 6의 6주간 피하 투여의 효과
5-6주령의 db/db(BKS.Cg-m +/+ Lepr db /J) 수컷 마우스를 찰스 리버 레보레토리즈(Charles River Laboratories, Germany)로부터 수득하여 정상 사료 및 물에 자유롭게 접근가능한 그들에게 새로운 환경에 적응시켰다. 동물을 유사한 평균 HbA1c를 가진 그룹으로 층상화시키고 화합물 6(1, 2.5, 및 5 nmol/kg) 또는 비히클을 피하로 일일 2회 6주 동안 투여하였다. 연구 전반에 걸쳐, 체중을 매일 기록하고, 펩티드의 체중-정정된 투여량을 투여하기 위해 사용하였다. 처리 전에 HbA1c 수준을 혈액 시료 상에서 측정한 후, 연구 동안 매주 한번 측정하였다. 최종 혈액 샘플링 직후, 모든 동물을 희생시켰다.
식이 유도된 비만 마우스(30주 고-지방 식이)에서 경구 글루코스 내성 및 체중에 대한 이중 Glu - GLP -1 작용제 화합물 6으로 3주간 처리한 효과
6주령 C57Bl/6J 수컷 마우스를 고 지방 식이 및 물에 자유롭게 접근가능한 그들에게 새로운 환경에 적응시켰다. 36주령 동물을 유사한 평균 절식(6시간) 혈액 글루코스(꼬리의 끝(tip)으로부터 취한 혈액 시료로부터 평가됨)로 무작위로 그룹화시켰다. 마우스를 화합물 6 또는 비히클로 3주 동안 피하로 일일 2회 처리하였다. 체중을 매일 기록하였다. 펩티드 처리 후, 동물을 6시간 절식에 처하고, 경구 글루코스 내성 시험(OGTT)을 수행하였다. 동물을 아침에 펩티드 또는 비히클로 투여하였다. 대략 4시간 후에, 초기 혈액 시료(절식 혈액 글루코스 수준)을 취하였다. 그 후 글루코스의 경구 투여량을 투여하고 동물을 그들의 사육장으로 돌려보냈다(t = 0). BG는 t=15 분, t=30 분, t=60 분, t=90 분 및 t=120 분에서 측정하였다. 혈액 샘플링 직후에 모든 동물을 CO2 마취, 이어서 경추 파열법에 의해 희생시켰다.
도 1: db/db 마우스에서 6주간 처리기간에 걸쳐 HbA1c 변화에 대한 Glu-GLP-1 이중 작용제 화합물 6의 피하 투여의 효과. 데이터는 n=11/그룹을 가진 평균±SEM으로 나타낸다. 동일한 시간 지점에서 비히클과 비교하여 * p<0.05, **p<0.01, *** p<0.001.
도 2: db/db 마우스에서 6주간 처리기간에 걸쳐 체중 증가에 대한 Glu-GLP-1 작용제 화합물 6의 피하 투여의 효과. 데이터는 n = 11/그룹을 가진 평균±SEM으로 나타낸다. 비히클과 비교하여 ** p<0.01, ***p<0.001.
도 3: 고 지방 급식 C57BL/6J 마우스에서 체중에 대한 Glu-GLP-1 작용제 화합물 6의 피하 투여의 효과. 데이터는 평균±SEM으로 나타낸다.
도 4: 고 지방 급식 C57BL/6J 마우스에서 OGTT 동안 글루코스 곡선 하부 면적에 대한 Glu-GLP-1 작용제 화합물 6의 피하 투여의 효과. 데이터는 평균±SEM으로 나타낸다. * p<0.05.
도 5: 처리전에 비히클(PBS)로 30주 동안 처리(s.c.) 후, 30주 동안 고 지방 식이를 한 마우스를 10 nmol/kg 엑센딘-4 또는 10 nmol/kg 화합물 6으로 3주 동안 일일 2회 처리한 3주 처리의 지방에 대한 효과. CHO: 총 콜레스테롤; HDL: 고 밀도 콜레스테롤; LDL: 저 밀도 콜레스테롤; TRIG: 트리글리세라이드; HDL/LDL: HDL과 LDL 사이의 비.
도 6: 고 지방 급식 C57BL/6J 마우스에서 체중 증가에 대한 화합물 6 및 화합물 7의 효과.
본 발명을 하기 실시예에 의해서 추가로 설명한다.
실시예 1: 글루카곤 및 GLP -1 수용체에 대한 효능
Figure pct00005
표 1: EC50 수치는 상기 기술된 바와 같이 측정하였다.
실시예 2 : 원숭이에서 피하 및 정맥내 투여 후의 약물동역학 연구
화합물 6을 인간에서 의도된 경로인, 피하 투여 후에 약물동역학 및 생체이용률을 시험하기 위해 원숭이에 투여하였다. 화합물 6은 43% ± 8.1의 생체이용률, 8.2 시간 ± 2.0의 t1 /2 및 4 내지 8 시간 사이의 tmax를 보였다. 화합물 6의 약물동역학 프로파일은 피하 경로에 의해 실현 가능한 투여량의 일일 1회 투여 후 인간에서 글루카곤과 GLP-1 수용체 둘 모두에서 EC50 초과의 일정한 노출을 예상할 것 같다.
실시예 3: db / db 마우스에서 HbA1c 에 대한 Glu - GLP -1 작용제 화합물 6의 6주간 피하 투여의 효과
동물을 3일 기간 동안 100 ㎕ 비히클(일일 1회)을 피하 주사하여 동물이 핸들링(handling) 및 주사에 익숙해지도록 하였다. 동물을 유사한 평균 HbA1c로 무작위로 그룹화시켰다. 그 후 마우스를 화합물 6(1, 2.5, 또는 5 nmol/kg) 또는 비히클로 피하에 일일 2회 처리하였다. 처리하기 전 및 6주간 처리 동안 매주 한번, 혈액 시료를 안와후 정맥 얼기로부터 취하였다.
혈액 시료는 Cobas c111 분석기(Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)를 사용해 HbA1c에 대하여 분석하였다. HbA1c 분석에 대한 시료는 샘플링 24 시간 이내에 분석하였다.
연구 전반을 통하여, 체중을 매일 기록하고 펩티드의 체중-정정된 투여량을 투여하는데 사용하였다. 용액은 투여 직전에 제조하였다.
db/db 마우스 모델로부터 예상된 바와 같이, 시간에 걸쳐 HbA1c에서 증가가관찰되었다(도 1). 6주 처리 동안에, 본 발명자들은 비히클 그룹에서 HbA1c에서 27% 증가를 관찰하였다.
모든 투여량에서, 화합물 6은 비히클-처리된 동물에서 시간에 걸쳐 나타난 HbA1c에서의 증가를 어느 시점에서도 감소시키지 않았다(도 1).
6주 처리 동안에, 본 발명자들은 비히클 그룹에서 체중에서 22% 증가를 관찰하였다. 화합물 6(5 nmol/kg)은 비히클과 비교하여 체중 증가를 현저하게 감소시켰다(p<0.0001, 도 2).
db/db 마우스에서 HbA1c에 의해 평가된 바와 같이 혈당 조절에 대한 이중 Glu-GLP-1 작용제 화합물 6을 6주간 처리한 효과를 조사하였다.
예상한 바와 같이, db/db 마우스 모델은 시간에 걸쳐 HbA1c에서 증가를 보였다. 6주 동안 화합물 6으로 처리한 것은 비히클-처리된 db/db 마우스에서 시간에 걸쳐 나타난 HbA1c에서의 증가를 현저히 감소시키지 않았다.
6주 동안 화합물 6(5 nmol/kg)으로 처리한 것은 비히클-처리된 db/db 마우스에서 시간에 걸쳐 나타난 체중 증가가 현저히 감소하였다.
실시예 4 : 식이 유도된 비만 C57BL /6J 마우스(6달간 고 지방 식이)에서 경구 글루코스 내성 및 체중에 대한 Glu - GLP -1 작용제 화합물 6의 3주간 피하 투여의 효과
체중
화합물 6은 체중을 38.7 %(p<0.05) 감소시켰다(도 3). 흥미롭게도, 3주 동안 화합물 6으로 처리한 고 지방 급식 동물에 의해 수득된 체중을 일반적인 사료(chow) 식이 상에서 비-처리된 대조군 동물에 의해 수득된 바와 같은 동일한 체중에 대해 안정화시켰다(도 3).
OGTT(경구 글루코스 내성 시험)
3주 동안 화합물 6으로 처리한 것은 글루코스 내성에 대해 어떠한 현저한 효과도 없었다(AUC에서의 감소로서 측정함)(도 4).
화합물 6은 일반적인 사료 식이 상의 비-처리된 대조군 동물에서 나타난 바와 같은 수준으로 식이 유도된 비만 마우스(30주 고 지방 식이)에서 체중을 현저하게 감소시켰다(도 3). 화합물 6의 효과는 절식 혈액 글루코스를 현저하게 감소시켰다. 화합물 6은 경구 글루코스 내성을 현저하게 증가시키지 않았다.
체중 감소 및 글루코스 핸들링에서 이들 차이점은 GLP-1 작용제 화합물 6의 효능(표 1) 및/또는 GLP-1 수용체 상에 노출을 반영할 수 있다. 차이점은 작용 메커니즘에서 GLP-1 및 GLP-1 유사체 및 Glu-GLP-1 작용제 사이의 차이점과 또한 관련될 수 있다. 엑센딘-4 및 다른 GLP-1 유사체는 글루코스-의존성 인슐린 분비 자극, 위장 비우기의 억제 및 글루카곤 분비의 억제를 통한 혈액 글루코스를 조절하는 것으로 알려져 있다. GLP-1 수용체에 대한 이들의 이러한 역할 이외에도, 화합물 6은 또한 GluR과 결합하고 GluR를 활성화시킨다(표 1 참조).
식이 유도된 비만 마우스에서, 화합물 6은 체중을 현저하게 감소시켰다. 화합물 6은 경구 글루코스 내성 시험 동안에 측정된 글루코스 내성을 개선시키지 않았다.
실시예 5: 30주간 고 지방 식이 급식 마우스에서 지질에 대한 Glu - GLP -1 작용제 화합물 6의 3주간 피하 투여의 효과
처리전에 30주간 고 지방 식이를 거친 마우스를 비히클(PBS), 10 nmol/kg 엑센딘-4 또는 10 nmol/kg 화합물 6으로 3주간 일일 2회 처리하여 지질에 대한 효과를 측정하였다(도 5). 효과를 LDL, HDL 및 트리글리세라이드(CHO: 총 콜레스테롤; HDL: 고 밀도 콜레스테롤; LDL: 저 밀도 콜레스테롤; TRIG: 트리글리세라이드; HDL/LDL: HDL과 LDL 사이의 비) 상에서 측정하였다.
화합물 6이 총 콜레스테롤, HDL, LDL(P < 0.001) 및 트리글리세라이드(P < 0.05)을 현저하게 감소시키는 반면, HDL/LDL 비는 현저하게 증가시킴이 증명되었다(p < 0.001)(도 5). HDL/LDL 비는 심 질환에 대한 위험의 지표로서 간주된다. 이 비가 높을수록, 심장 마비의 위험 또는 다른 심혈관 문제가 더 적다.
실시예 6: CGRP 및 다른 수용체에 대한 화합물 6의 카운터스크린(counterscreen)
화합물 6을 1 (1.25), 100 (125) 및 10,000 (12,500) nM에서 칼시토닌 유전자-관련 펩티드 1(CGRP1), 코르티코트로핀-방출 인자 1 & 2(CRF1 & CRF2), 위장 억제 폴리펩티드(GIP), 글루카곤-유사 펩티드 1 & 2(GLP-1 & GLP-2, 글루카곤(GCGR), 세크레틴, 생식선 자극 호르몬 방출 호르몬(GnRH), 파라티로이드-호르몬 1 & 2(PTH1 & PTH2), 혈관작동성 장 펩티드(VPAC1 & VPAC2)에 대하여 작용제 및 길항제 활성을 시험하였다.
다음의 수용체에 대한 작용제 활성을 관찰하였다:
GLP-1 수용체: 12.5 μM 및 125 nM에서 화합물 6은 작용제 활성을 나타냈다.
글루카곤 수용체 화합물 6은 12.5 μM 및 125 nM에서 작용제 활성을 나타냈다.
다음의 수용체에 대한 길항제 활성을 관찰하였다:
CRF2 수용체: 화합물 6은 10 μM에서 길항제 활성을 나타냈다.
GIP 수용체: 화합물 6은 10μM 및 100 nM에서 길항체 활성을 나타냈다.
세크레틴 수용체: 화합물 6은 10μM에서 길항제 활성을 나타냈다.
실시예 7: 고 지방 식이 C57BL /6J 마우스에서 체중 증가에 대한 화합물 6 및 7의 효과.
C57BL/6J 마우스를 고 지방 식이 및 물이 자유롭게 접근가능한 그들에게 새로운 환경에서 4주간 적응시켰다. 그 후, 마우스를 화합물 6 및 화합물 7(2가지 투여량: 0.5 및 5 nmol/kg) 또는 비히클로 10일 동안 일일 2회 처리하였다. 연구 전반을 통해, 체중을 매일 기록하고 펩티드의 체중-정정된 투여량을 투여하는데 사용하였다(도 6). 마우스를 경추 파열법으로 희생시켰다.
화합물 6 및 화합물 7은 고 지방 급식 C57BL/6J 마우스에서 투여량 둘 모두(0.5 및 5nmol/kg)에서 체중 증가를 현저하게 감소시켰다.
<110> ZEALAND PHARMA A/S <120> GLUCAGON ANALOGUES <130> IPA121122 <150> PA 2010 00550 <151> 2010-06-23 <150> 61/358,623 <151> 2010-06-25 <160> 17 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide sequence <400> 1 His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser 1 5 10 15 Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr 20 25 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide sequence <400> 2 Lys Arg Asn Arg Asn Asn Ile Ala 1 5 <210> 3 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide sequence <400> 3 His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser 1 5 10 15 Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn 20 25 30 Arg Asn Asn Ile Ala 35 <210> 4 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide sequence <400> 4 His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu 1 5 10 15 Arg Arg Ala Lys Asp Phe Ile Glu Trp Leu Leu Ser Ala 20 25 <210> 5 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (27)..(27) <223> Xaa = K(HEXADECANOYL-ISOGLU) <400> 5 His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu 1 5 10 15 Arg Arg Ala Lys Asp Phe Ile Glu Trp Leu Xaa Ser Ala 20 25 <210> 6 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Xaa = K(HEXADECANOYL-ISOGLU) <400> 6 His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu 1 5 10 15 Arg Arg Ala Xaa Asp Phe Ile Glu Trp Leu Leu Ser Ala 20 25 <210> 7 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Xaa = K(HEXADECANOYL-ISOGLU) <400> 7 His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu 1 5 10 15 Arg Arg Ala Lys Asp Phe Ile Glu Trp Leu Leu Xaa Ala 20 25 <210> 8 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Xaa = K(HEXADECANOYL-ISOGLU) <400> 8 His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Xaa 1 5 10 15 Arg Arg Ala Lys Asp Phe Ile Glu Trp Leu Leu Ser Ala 20 25 <210> 9 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Xaa = K(HEXADECANOYL-ISOGLU) <400> 9 His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu 1 5 10 15 Xaa Arg Ala Lys Asp Phe Ile Glu Trp Leu Leu Ser Ala 20 25 <210> 10 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa = Aib <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Xaa = K(Hexadecanoyl-isoGlu) <400> 10 Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu Xaa 1 5 10 15 Arg Ala Lys Asp Phe Ile Glu Trp Leu Leu Ser Ala 20 25 <210> 11 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is selected from Ser and Aib <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Xaa is selected from Glu and Lys, Cys or Orn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Xaa is selected from Arg and Lys, Cys or Orn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Xaa is selected from Lys and Cys or Orn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> Xaa is selected from Glu and Lys, Cys or Orn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (27)..(27) <223> Xaa is selected from Leu and Lys, Cys or Orn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Xaa is selected from Ser and Lys, Cys, Orn or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29)..(29) <223> Xaa is Ala or absent <400> 11 His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Xaa 1 5 10 15 Xaa Arg Ala Xaa Asp Phe Ile Xaa Trp Leu Xaa Xaa Xaa 20 25 <210> 12 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide sequence <400> 12 His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu 1 5 10 15 Arg Arg Ala Lys Asp Phe Ile Glu Trp Leu Lys Ser Ala 20 25 <210> 13 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide sequence <400> 13 His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu 1 5 10 15 Arg Arg Ala Lys Asp Phe Ile Glu Trp Leu Leu Ser Ala 20 25 <210> 14 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide sequence <400> 14 His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu 1 5 10 15 Arg Arg Ala Lys Asp Phe Ile Glu Trp Leu Leu Lys Ala 20 25 <210> 15 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide sequence <400> 15 His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Lys 1 5 10 15 Arg Arg Ala Lys Asp Phe Ile Glu Trp Leu Leu Ser Ala 20 25 <210> 16 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide sequence <400> 16 His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu 1 5 10 15 Lys Arg Ala Lys Asp Phe Ile Glu Trp Leu Leu Ser Ala 20 25 <210> 17 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa = Aib <400> 17 Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu Lys 1 5 10 15 Arg Ala Lys Asp Phe Ile Glu Trp Leu Leu Ser Ala 20 25

Claims (19)

  1. 다음 화학식을 갖는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염:
    R1-X-Z-R2
    상기 식에서,
    R1은 H, C1 -4 알킬, 아세틸, 포르밀, 벤조일 또는 트리플루오로아세틸이고;
    R2는 OH 또는 NH2이며;
    X는 다음 화학식 I:
    His-X2-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-X16-X17-Arg-Ala-X20-Asp-Phe-Ile-X24-Trp-Leu-X27-X28-X29 (I)를 갖는 펩티드이고,
    여기에서,
    X2는 Ser 및 Aib로부터 선택되고;
    X16는 Glu 및 Y로부터 선택되고;
    X17는 Arg 및 Y로부터 선택되고;
    X20는 Lys 및 Y로부터 선택되고;
    X27은 Leu 및 Y로부터 선택되고;
    X28는 Ser 및 Y로부터 선택되거나 부재하며;
    X29는 Ala이거나 부재하며;
    여기서 X16, X17, X20, X27 및 X28 중 적어도 하나가 Y이며;
    여기서 각각의 잔기 Y는 독립적으로 Lys, Cys 및 Orn으로부터 선택되며;
    여기서 X의 적어도 하나의 아미노산 잔기 Y의 측쇄가 다음 화학식:
    (i) Z1 [여기서 Z1은 Y의 측쇄에 직접적으로 접합된 친유성 부분임]; 또는
    (ii) Z1Z2 [여기서 Z1은 친유성 부분이며, Z2는 스페이서이고, Z1은 Z2를 통해 Y의 측쇄에 접합됨]을 갖는 친유성 치환기에 접합되며;
    Z는 부재하거나 Ala, Leu, Ser, Thr, Tyr, Cys, Glu, Lys, Arg, Dbu, Dpr 및 Orn으로 구성된 그룹으로부터 독립적으로 선택된 1-20개 아미노산 단위의 서열임.
  2. 제 1항에 있어서, 다음 서열을 갖는 것인 화합물:
    HSQGTFTSDYSKYLDERRAKDFIEWLKSA
    HSQGTFTSDYSKYLDERRAKDFIEWLLSA
    HSQGTFTSDYSKYLDERRAKDFIEWLLKA
    HSQGTFTSDYSKYLDKRRAKDFIEWLLSA
    HSQGTFTSDYSKYLDEKRAKDFIEWLLSA 또는
    H-Aib-QGTFTSDYSKYLDEKRAKDFIEWLLSA.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 친유성 치환기가 16번, 17번, 20번, 27번 또는 28번 위치에서 아미노산 잔기에 부착되는 것인 화합물.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, R1이 H인 것인 화합물.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, R2가 NH2인 것인 화합물.
  6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 다음 서열을 갖는 것인 화합물:
    H-HSQGTFTSDYSKYLDERRAKDFIEWL-K(헥사데카노일-이소Glu)-SA -NH2
    H-HSQGTFTSDYSKYLDERRA-K(헥사데카노일-이소Glu)-DFIEWLLSA -NH2
    H-HSQGTFTSDYSKYLDERRAKDFIEWLL-K(헥사데카노일-이소Glu)-A -NH2
    H-HSQGTFTSDYSKYLD-K(헥사데카노일-이소Glu)-RRAKDFIEWLLSA -NH2
    H-HSQGTFTSDYSKYLDE-K(헥사데카노일-이소Glu)-RAKDFIEWLLSA -NH2 또는
    H-H-Aib-QGTFTSDYSKYLDE-K(헥사데카노일-이소Glu)-RAKDFIEWLLSA-NH2 .
  7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물에서 하나 이상의 아미노산 측쇄가 중합성 부분에 접합되는 것인 화합물.
  8. 제 7항에 있어서, 펩티드 X에서 하나 이상의 아미노산 측쇄가 중합성 부분에 접합되는 것인 화합물.
  9. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 따른 화합물, 또는 이의 염 또는 유사체를 담체와 함께 혼합되게 포함하는 조성물.
  10. 제 9항에 있어서, 조성물이 약학적으로 허용가능한 조성물이며, 담체가 약학적으로 허용가능한 담체인 것인 조성물.
  11. 의약 치료 방법에 사용하기 위한 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 따른 화합물.
  12. 이를 필요로 하는 개체에서 체중 증가를 예방하거나 체중 감소를 촉진하는 방법에 사용하기 위한 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 따른 화합물.
  13. 이를 필요로 하는 개체에서 순환 LDL 수준을 저하시키고/저하시키거나 HDL/LDL 비를 증가시키는 방법에 사용하기 위한 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 따른 화합물.
  14. 과체중에 의해 야기되거나 특징지어지는 병태의 치료 방법에서 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 따른 화합물의 용도.
  15. 이를 필요로 하는 개체에서 비만, 병적 비만, 수술전 병적 비만, 비만 관련 염증, 비만 관련 쓸개 질환, 비만 유도된 수면 무호흡, 고혈압, 동맥경화 유발 이상지혈증, 죽상동맥경화증, 동맥경화증, 관상 동맥 심질환, 말초 동맥 질환, 뇌졸증 또는 미세혈관 질환의 치료 및/또는 예방 방법에서 제 1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 화합물의 용도.
  16. 비만, 이상지혈증 또는 고혈압의 치료를 위한 제제와 함께 조합 치료법의 일부로서 투여되는 것인 제 11항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 화합물, 용도 또는 방법.
  17. 제 16항에 있어서, 비만의 치료를 위한 제제가 글루카곤-유사 펩티드 수용체 1 작용제, 펩티드 YY 수용체 작용제 또는 이의 유사체, 칸나비노이드 수용체 1 길항제, 리파제 억제제, 멜라노코르틴 수용체 4 작용제 또는 멜라닌 농축 호르몬 수용체 1 길항제인 것인 화합물, 용도 또는 방법.
  18. 제 16항에 있어서, 고혈압 치료를 위한 제제가 안지오텐신-전환 효소 억제제, 안지오텐신 II 수용체 차단제, 이뇨제, 베타-차단제 또는 칼슘 채널 차단제인 것인 화합물, 용도 또는 방법.
  19. 제 16항에 있어서, 이상지혈증 치료를 위한 제제가 스타틴, 파이브레이트, 니아신 및/또는 콜레스테롤 흡수 억제제인 것인 화합물, 용도 또는 방법.
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