JP7425855B2

JP7425855B2 - エキセナチド類似体及びその用途

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Publication number: JP7425855B2
Application number: JP2022509115A
Authority: JP
Inventors: ジェハ・リュ; サンヒュン・チュ; イェガ・パク
Original assignee: エニジェンカンパニー．，リミテッド．
Priority date: 2019-08-13
Filing date: 2020-08-13
Publication date: 2024-01-31
Anticipated expiration: 2040-08-13
Also published as: WO2021029698A1; US20220323548A1; CN115380043A; EP4015528A1; CA3147770A1; JP2022544556A; EP4015528A4

Description

本特許出願は、２０１９年０８月１３日に大韓民国特許庁に提出された大韓民国特許出願第１０－２０１９－００９８９１１号に対して優先権を主張し、該特許出願の開示事項は、本明細書に参照によって組み込まれる。

本特許出願は、２０２０年０８月１２日に大韓民国特許庁に提出された大韓民国特許出願第１０－２０２０－０１０１０８７号に対して優先権を主張し、該特許出願の開示事項は、本明細書に参照によって組み込まれる。

本特許出願は、２０２０年０８月１２日に大韓民国特許庁に提出された大韓民国特許出願第１０－２０２０－０１０１０８８号に対して優先権を主張し、該特許出願の開示事項は、本明細書に参照によって組み込まれる。

本発明は、糖鎖化エキセナチド類似体及びその用途に関する。

本発明は、エキセナチド二量体類似体（二量体アナログ）及びその用途に関する。

生体内で発現するタンパク質に糖が付く過程である糖鎖化（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）は、細胞内小器官であるゴルジ体で起きる反応であり、糖鎖化によって形成された糖タンパク質は、細胞間結合、組織の発達、免疫反応、ホルモン作用などの様々な生体現象に関与すると知られている。１８８０年度に糖の構造の研究が始まり、現在も糖及び糖鎖化に関する活発な研究が続いており、近年、糖鎖化技術を用いた薬物開発研究が行われている現状である。

エキセナチド（Ｅｘｅｎａｔｉｄｅ）は、米国南西部に棲息する大型トカゲ（Ｈｅｌｏｄｅｒｍａｓｕｓｐｅｃｔｕｍ）の唾液腺から分離されたＧＬＰ－１（Ｇｌｕｃａｇｏｎ－ｌｉｋｅＰｅｐｔｉｄｅ－１）の機能的類似体（ａｎａｌｏｇ）であり、２型糖尿病ペプチド治療剤として使用されている。近年、エキセナチドをはじめとするＧＬＰ－１類似体の体内安定性が改善された、持続的作用性の類似体開発が活発に行われている。

学術名‘Ｅｘｅｎｄｉｎ－４’であるエキセナチドは、３９個のアミノ酸から構成された生理活性ペプチドであって、人の生体内に存在するが、ＧＬＰ－１と５３％のアミノ酸が類似しており、ＤＰＰ－４（Ｄｉｐｅｔｉｄｙｌｐｅｐｔｉｄａｓｅ－４）のような分解酵素に安定であるので、ＧＬＰ－１に比べて体内半減期が比較的長い。

エキセナチドは、１日に２回、朝食前及び夕食前に投与する。エキセナチドは腎臓に排泄されるため、深刻な腎臓機能の損傷又は末期腎疾患を持つ患者への使用は推奨されない。

エキセナチドの排泄は、肝機能に依存しないので、肝で代謝される薬物と相互作用を有しない。一方、エキセナチドは、胃腸管運動性（ｇａｓｔｒｉｃｍｏｔｉｌｉｔｙ）に影響を与えるので、吸収と関連して他の薬物と相互作用を起こすことがある。

また、エキセナチドペプチドの合成過程において過量の試薬及び高い材料コストがかかるという短所がある。また、反応段階数が多く、各段階別に中間体を遊離しなければならない他、異性質体の発生する可能性があるため、精製もし難い。

ＧＬＰ－１類似体を用いた新規糖尿病治療剤は活発に研究されているが、その大部分が、薬効持続効果の改善のための剤形開発にフォーカスしているだけで、効能及び安定性を改善した画期的なエキセナチド類似体及び摸写体の開発は殆どない。

一方、エキセナチドは、体内免疫反応による薬物効能低下などの副作用が報告されている実情である。したがって、体内で起きる糖鎖化過程を用いたペプチド薬物の開発は、増進した体内安定性及び改善された免疫原性（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）を示すと期待される。

エキセナチドは、ＧＬＰ－１Ｒ（ｇｌｕｃａｇｏｎ－ｌｉｋｅｐｅｐｔｉｄｅ－１ｒｅｃｅｐｔｏｒ）のアゴニスト（ａｇｏｎｉｓｔ）であって、２型糖尿病ペプチド治療剤として使用されており、近年、エキセナチドをはじめとするＧＬＰ－１類似体の体内安定性と低血糖などの副作用が改善された持続的作用性の類似体開発が活発に行われている。

ＧＬＰ－１Ｒ及びＧＣＧＲ（ｇｌｕｃａｇｏｎｒｅｃｅｐｔｏｒ）はそれぞれ体内のＧＬＰ－１、グルカゴンと結合し、血糖調節によって体内恒常性の維持に重要な働きをする。ＧＬＰ－１Ｒは、大脳皮質及び腸で活性化して食欲を阻害すると同時に腸運動性を減少させ、体重減少に重要に働くものとして知られている。また、ＧＣＧＲは、白色脂肪組織において脂肪分解酵素であるＨＳＬ、ＡＴＧＬ活性の増加、褐色脂肪組織において熱エネルギー発生の増加によって蓄積された脂肪を分解し、体重減少に寄与するものと知られており（ＲＥＦＥＲＥＮＣＥ）、２型糖尿病、肥満を持つ患者を対象にした代謝機能研究においてグルカゴンとＧＬＰ－１を同時に投与したとき、グルカゴンの高血糖危険性がＧＬＰ－１のインスリン分泌増進によって防止され、血糖レベルが安定化し、熱エネルギー発生が増加することを確認した。

これらの結果は、ＧＣＧＲとＧＬＰ－１Ｒを同時に標的する二重標的アゴニスト（Ｄｕａｌａｇｏｎｉｓｔ）が、既存のＧＬＰ－１標的アゴニストに比べて血糖レベル調節及び増進した体重減少効果を保有するだろうという点を示唆し、二重表現アゴニストが、新しい２型糖尿病、肥満という２種類の代謝疾患の同時的な治療のための新しい薬物候補物質になり得ると予想される。

生体内で発現するタンパク質に糖が付く過程である糖鎖化（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）は、細胞内小器官であるゴルジ体で起きる反応であり、糖鎖化によって形成された糖タンパク質は、細胞間結合、組織の発達、免疫反応、ホルモン作用などの様々な生体現象に関与すると知られている。１８８０年度に糖の構造研究が始まり、現在も糖及び糖鎖化に関する活発な研究が続いており、近年、糖鎖化技術を用いた薬物開発研究が行われている現状である。

エキセナチドは、１日に２回、朝食前及び夕食前に投与する。エキセナチドは、腎臓に排泄されるので、深刻な腎臓機能の損傷又は末期腎疾患を持つ患者への使用は推奨されない。

また、エキセナチドペプチドの合成過程において過量の試薬と高い材料コストがかかる短所がある。また、反応段階数が多く、各段階別に中間体を遊離しなければならない他、異性質体が発生する可能性があるため、精製もし難い。

ＧＬＰ－１類似体を用いた新規糖尿病治療剤は活発に研究されているが、その大部分が薬効持続効果の改善のための剤形開発にフォーカスしているだけで、効能及び安定性を改善した画期的なエキセナチド類似体及び摸写体の開発は殆どない。

本発明では、糖鎖化技術を融合したエキセナチド類似体を開発し、薬物の効能及び体内安定性が増進した新規糖尿病治療候補物質を開発しようとする。

本発明の目的は、糖鎖化エキセナチド類似体を提供することである。

本発明の他の目的は、糖鎖化エキセナチド類似体を含む、糖尿病の改善、予防又は治療用の薬剤学的組成物を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、糖鎖化エキセナチド類似体を含む、肥満の改善、予防又は治療用の薬剤学的組成物を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、糖鎖化エキセナチド類似体を含む、糖尿病の改善又は緩和用の食品組成物を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、糖鎖化エキセナチド類似体を含む、肥満の改善又は緩和用の食品組成物を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、糖鎖化エキセナチド類似体を含む、食欲抑制用の食品組成物を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、糖鎖化エキセナチド類似体を、糖尿病の改善、予防又は治療の有効量でそれを必要とする対象に投与し、糖尿病を改善、予防又は治療する方法を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、糖鎖化エキセナチド類似体を、肥満の改善、予防又は治療の有効量でそれを必要とする対象に投与し、肥満を改善、予防又は治療する方法を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、糖鎖化エキセナチド類似体の糖尿病の改善、予防又は治療用途を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、糖鎖化エキセナチド類似体の肥満の改善、予防又は治療用途を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、糖鎖化エキセナチド類似体の食欲抑制用途を提供することである。

本発明者らは、多量抗原性ペプチド（Ｍｕｌｔｉｐｌｅａｎｔｉｇｅｎｉｃｐｅｐｔｉｄｅ，ＭＡＰ）を適用し、ＧＬＰ－１Ｒアゴニストであるエキセナチドに基づき、血糖調節能及び生体内安定性が改善されたエキセナチド二量体類似体を開発し、新規の糖尿病及び肥満治療候補物質を開発しようとする。

本発明の目的は、エキセナチド二量体類似体を提供することである。

本発明の他の目的は、エキセナチド二量体類似体を含む、糖尿病の改善、予防又は治療用の薬剤学的組成物を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、エキセナチド二量体類似体を含む、肥満の改善、予防又は治療用の薬剤学的組成物を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、エキセナチド二量体類似体を含む、糖尿病の改善又は緩和用の食品組成物を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、エキセナチド二量体類似体を含む、肥満の改善又は緩和用の食品組成物を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、エキセナチド二量体類似体を含む、食欲抑制用の食品組成物を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、エキセナチド二量体類似体を、糖尿病の改善、予防又は治療の有効量でそれを必要とする対象に投与し、糖尿病を改善、予防又は治療する方法を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、エキセナチド二量体類似体を、肥満の改善、予防又は治療の有効量でそれを必要とする対象に投与し、肥満を改善、予防又は治療する方法を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、エキセナチド二量体類似体の糖尿病の改善、予防又は治療用途を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、エキセナチド二量体類似体の肥満の改善、予防又は治療用途を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、エキセナチド二量体類似体の食欲抑制用途を提供することである。

本発明は、糖鎖化エキセナチド（ｅｘｅｎａｔｉｄｅ）類似体及びその用途に関する。

以下、本発明をより詳細に説明する。

本発明の一例は、糖鎖化エキセナチド類似体に関する。

本発明において、エキセナチドはＧＬＰ－１受容体亢進剤であって、ジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶ（ＤＰＰ－ＩＶ）によって迅速に分解されるＧＬＰ－１を摸倣した類似体（ＧＬＰ－１ｍｅｔｒｉｃｓ）であり、ＤＰＰ－ＩＶによって迅速に分解されない上に、糖依存的インスリン分泌を促進し、グルカゴン分泌、胃排出及び食欲を抑制し、ベータ細胞保護効果を示すＧＬＰ－１の効果を奏する薬物である。

本発明において、エキセナチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含むエキセナチド、又は配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％以上、９０％以上、９５％以上の配列相同性を示すエキセナチド類似体を含む。

本発明の一例において、エキセナチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含むものでよく、例えば、配列番号１のアミノ酸配列からなるものでよい。

本発明において、エキセナチド類似体は、エキセナチドのアミノ酸配列の一部のアミノ酸が欠失し、脂肪酸が接合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）しているものでよい。

本発明において、欠失は、エキセナチドのアミノ酸配列の１～１５個、１～１４個、１～１３個、１～１２個、１～１１個、１～１０個、１～９個、４～１５個、４～１４個、４～１３個、４～１２個、４～１１個、４～１０個、４～９個、７～１５個、７～１４個、７～１３個、７～１２個、７～１１個、７～１０個、例えば、７～９個のアミノ酸が欠失してよい。

本発明において、欠失は、エキセナチドのアミノ酸配列のＮ末端又はＣ末端のアミノ酸が欠失してよく、例えば、エキセナチドのアミノ酸配列のＣ末端のアミノ酸が欠失してよい。

本発明の一具体例において、欠失は、エキセナチドのアミノ酸配列のＣ末端のアミノ酸が１～１５個、１～１４個、１～１３個、１～１２個、１～１１個、１～１０個、１～９個、４～１５個、４～１４個、４～１３個、４～１２個、４～１１個、４～１０個、４～９個、７～１５個、７～１４個、７～１３個、７～１２個、７～１１個、７～１０個、例えば、７～９個欠失してよい。

本発明のエキセナチド類似体における脂肪酸は、アミノ酸配列の一部のアミノ酸が欠失しているエキセナチドの様々な位置に接合しているものでよい。

本発明において、脂肪酸は、当業界に公知の様々な飽和脂肪酸及び不飽和脂肪酸を含む。

本発明において、脂肪酸は、Ｃ_３～Ｃ_３６の炭素数を有する脂肪酸であってよく、例えば、プロピオン酸（ｐｒｏｐｉｏｎｉｃａｃｉｄ）、酪酸（ｂｕｔｙｒｉｃａｃｉｄ）、吉草酸（ｖａｌｅｒｉｃａｃｉｄ）、カプロン酸（ｃａｐｒｏｉｃａｃｉｄ）、エナント酸（ｅｎａｎｔｈｉｃａｃｉｄ）、カプリル酸（ｃａｐｒｙｌｉｃａｃｉｄ）、ペラルゴン酸（ｐｅｌａｒｇｏｎｉｃａｃｉｄ）、カプリン酸（ｃａｐｒｉｃａｃｉｄ）、ウンデシル酸（ｕｎｄｅｃｙｌｉｃａｃｉｄ）、ラウリン酸（ｌａｕｒｉｃａｃｉｄ）、トリデシル酸（ｔｒｉｄｅｃｙｌｉｃａｃｉｄ）、ミリスチン酸（ｍｙｒｉｓｔｉｃａｃｉｄ）、ペンタデシル酸（ｐｅｎｔａｄｅｃｙｌｉｃａｃｉｄ）、パルミチン酸（ｐａｌｍｉｔｉｃａｃｉｄ）、マルガリン酸（ｍａｒｇａｒｉｃａｃｉｄ）、ステアリン酸（ｓｔｅａｒｉｃａｃｉｄ）、ノナデシル酸（ｎｏｎａｄｅｃｙｌｉｃａｃｉｄ）、アラキジン酸（ａｒａｃｈｉｄｉｃａｃｉｄ）、ヘンイコシル酸（ｈｅｎｅｉｃｏｓｙｌｉｃａｃｉｄ）、ベヘン酸（ｂｅｈｅｎｉｃａｃｉｄ）、トリコシル酸（ｔｒｉｃｏｓｙｌｉｃａｃｉｄ）、リグノセリン酸（ｌｉｇｎｏｃｅｒｉｃａｃｉｄ）、ペンタコシル酸（ｐｅｎｔａｃｏｓｙｌｉｃａｃｉｄ）、セロチン酸（ｃｅｒｏｔｉｃａｃｉｄ）、ヘプタコシル酸（ｈｅｐｔａｃｏｓｙｌｉｃａｃｉｄ）、モンタン酸（ｍｏｎｔａｎｉｃａｃｉｄ）、ノナコシル酸（ｎｏｎａｃｏｓｙｌｉｃａｃｉｄ）、メリシン酸（ｍｅｌｉｓｓｉｃａｃｉｄ）、ヘナトリアコンチル酸（ｈｅｎａｔｒｉａｃｏｎｔｙｌｉｃａｃｉｄ）、ラセロイン酸（ｌａｃｃｅｒｏｉｃａｃｉｄ）、プシリン酸（ｐｓｙｌｌｉｃａｃｉｄ）、ゲジン酸（ｇｅｄｄｉｃａｃｉｄ）、セロプラスチン酸（ｃｅｒｏｐｌａｓｔｉｃａｃｉｄ）及びヘキサトリアコンチル酸（ｈｅｘａｔｒｉａｃｏｎｔｙｌｉｃａｃｉｄ）からなる群から選ばれる１種以上であってよいが、これに限定されるものではない。

本発明の一具現例において、脂肪酸は、一部のアミノ酸が欠失しているエキセナチドのアミノ酸配列のＣ末端のＬｙｓ残基、Ｎ末端又はＣ末端に接合したものでよく、例えば、Ｃ末端に接合したものでよい。

本発明において、アミノ酸配列の一部のアミノ酸が欠失しているエキセナチド及び脂肪酸の接合は、直接結合及び／又は間接結合のいずれをも含む。

本発明において、直接結合は、脂肪酸にあるカルボキシル基のような官能基とアミノ酸が欠失しているエキセナチドの官能基（例えば、－ＮＨ_２）とが反応して共有結合を形成することにより、欠失したエキセナチド－脂肪酸の接合を形成することができる。

本発明において、間接結合は、当業界においてリンカーとして通常用いられる化合物が仲介し、欠失したエキセナチド－脂肪酸の接合を形成することができる。

本発明で用いられるリンカーは、当業界でリンカーとして用いられるいかなる化合物も使用可能であり、欠失しているエキセナチドにある官能基の種類に応じて適切なリンカーを選択すればよく、例えば、リンカーは、Ｎ－スクシンイミジルヨードアセテート（Ｎ－ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｉｏｄｏａｃｅｔａｔｅ）、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジルブロモアセテート（Ｎ－ＨｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌＢｒｏｍｏａｃｅｔａｔｅ）、ｍ－マレイミドベンゾイル－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ｍ－Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｂｅｎｚｏｙｌ－Ｎ－ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅｅｓｔｅｒ）、ｍ－マレイミドベンゾイル－Ｎ－ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル（ｍ－Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｂｅｎｚｏｙｌ－Ｎ－ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅｅｓｔｅｒ）、Ｎ－マレイミドブチリルオキシスクシンアミドエステル（Ｎ－Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｂｕｔｙｒｙｌｏｘｙｓｕｃｃｉｎａｍｉｄｅｅｓｔｅｒ）及びＬｙｓを含むが、これに限定されるものではない。

具体的に、アミノ酸が欠失しているエキセナチドは、それのＣ末端にリンカーがさらに結合し、前記脂肪酸は、前記Ｃ末端に結合しているリンカーに接合している。例えば、アミノ酸が欠失しているエキセナチドのＣ末端にリンカーとしてＬｙｓが結合し、このＬｙｓに脂肪酸が接合してよい。この場合、前記追加のＬｙｓの－ＮＨ_２官能基と脂肪酸のカルボキシル基とが反応してコンジュゲートを形成することができる。

本発明において、糖鎖化エキセナチド類似体は、エキセナチド類似体の少なくとも一つのアミノ酸に糖類が結合しているものでよく、糖類が結合しているアミノ酸は、他の一つのアミノ酸に置換された後に糖類が結合したものでよい。

本発明の一具体例において、前記糖類の結合は、配列番号１のアミノ酸配列からなるエキセナチドの１７、２４及び２８番目の位置からなる群から選ばれる１種以上の位置でなされてよいが、これに限定されるものではない。

本発明の一具体例において、前記置換は、配列番号１のアミノ酸配列からなるエキセナチドの１７番目のアミノ酸であるＧｌｕがＣｙｓに置換、配列番号１のアミノ酸配列からなるエキセナチドの２４番目のアミノ酸であるＧｌｕがＣｙｓに置換、及び配列番号１のアミノ酸配列からなるエキセナチドの２８番目のアミノ酸であるＡｓｎがＣｙｓに置換、からなる群から選ばれる１種以上であってよいが、これに限定されるものではない。

本発明において、糖類は、単糖類～１１糖類、２糖類～１１糖類、３糖類～１１糖類、４糖類～１１糖類、５糖類～１１糖類、６糖類～１１糖類、７糖類～１１糖類、８糖類～１１糖類、９糖類～１１糖類、１０糖類～１１糖類、例えば、１１糖類であってよく、具体的には、下記構造式１のブロモアセチルグリカン（Ｂｒｏｍｏａｃｅｔｙｌｇｌｙｃａｎ）及び／又は下記構造式２の１１ＮＣ－Ａｓｎ－Ｆｍｏｃであってよいが、これに限定されるものではない。

［構造式１］

［構造式２］

本明細書において、用語“ＡＧＭ－２１２”は、配列番号１からなるエキセナチドの配列の１番から３２番までの配列からなり、前記配列のＣ末端に、カプリン酸（ｃａｐｒｉｃａｃｉｄ）が側鎖に結合しているリジン（ｌｙｓｉｎｅ）を接合したものであり、Ｅｘ４（１－３２）Ｋ－ｃａｐの配列と明示する。

本明細書において、用語“ＡＧＭ－２１２（Ｅ１７Ｃ－１１ｓｕｇａｒ）”は、Ｅｘ４（１－３２）－ｃａｐの配列において、１７番のグルタミン酸（Ｇｌｕｔａｍｉｃａｃｉｄ，Ｇｌｕ，Ｅ）がＣｙｓに置換され、置換されたアミノ酸に、１１糖類の構造を有する糖が結合した配列である。

本明細書において、用語“ＡＧＭ－２１２（Ｎ２８Ｃ－１１ｓｕｇａｒ）”は、Ｅｘ４（１－３２）－ｃａｐの配列において、２８番のアスパラギン（Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ，Ａｓｎ，Ｎ）がＣｙｓに置換され、置換されたアミノ酸に、１１糖類の構造を有する糖が結合した配列である。

本明細書で用語“ＡＧＭ－２１２（Ｎ２８－１１ｓｕｇａｒ）”はＥｘ４（１－３２）－ｃａｐの配列において、２８番のアスパラギンに、１１糖類の構造を有する糖が結合した配列である。

本明細書において、用語“ＡＧＭ－２１２（Ｅ２４－１１ｓｕｇａｒ）”は、Ｅｘ４（１－３２）－ｃａｐの配列において、２４番のグルタミン酸がＣｙｓに置換され、置換されたアミノ酸に、１１糖類の構造を有する糖が結合した配列である。

本明細書において、用語“ＡＧＭ－２１２（Ｅ１７Ｃ－１１ｓｕｇａｒ＆Ｅ２４Ｃ－１１ｓｕｇａｒ）”は、Ｅｘ４（１－３２）－ｃａｐの配列において、１７番のグルタミン酸をＣｙｓに置換し、２４番のグルタミン酸を置換し、それぞれの置換されたアミノ酸に、１１糖類の構造を有する糖が結合した配列である。

本明細書において、用語“ＡＧＭ－２１２（Ｅ１７Ｃ－１１ｓｕｇａｒ＆Ｎ２８Ｃ－１１ｓｕｇａｒ）”は、Ｅｘ４（１－３２）－ｃａｐの配列において、１７番のグルタミン酸をＣｙｓに置換し、２８番のアスパラギンを置換し、それぞれの置換されたアミノ酸に、１１糖類の構造を有する糖が結合した配列である。

本発明の他の例は、糖鎖化エキセナチド類似体を含む、糖尿病の改善、予防又は治療用の薬剤学的組成物に関する。

本発明の更に他の例は、糖鎖化エキセナチド類似体を含む、肥満の改善、予防又は治療用の薬剤学的組成物に関する。

本発明の薬剤学的組成物において、糖鎖化エキセナチド類似体に関する記載は上述した通りであり、その記載を省略する。

本発明の薬剤学的組成物は、薬剤学的に許容される担体を含むことができる。

本発明において、薬剤学的に許容される担体は、製剤時に通常用いられるものであり、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアガム、リン酸カルシウム、アルジネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、滑石、ステアリン酸マグネシウム及びミネラルオイルなどを含むが、これに限定されるものではない。

本発明の薬剤学的組成物は、前記成分の他に、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含むことができる。適宜の薬剤学的に許容される担体及び製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ（１９ｔｈｅｄ．，１９９５）に詳細に記載されている。

本発明の薬剤学的組成物は、経口又は非経口で投与でき、非経口投与の場合には、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、経皮投与などで投与できる。

本発明の薬剤学的組成物の適度の投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、病的状態、食べ物、投与時間、投与経路、排泄速度及び反応感応性のような要因によって様々であり、熟練した通常の医師は、所望する治療又は予防に効果的な投与量を容易に決定及び処方できる。

本発明の好ましい具現例によれば、本発明の薬剤学的組成物の１日投与量は、０．００１～１００００ｍｇ／ｋｇである。

本発明の薬剤学的組成物は、当該発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者が容易に実施できる方法により、薬剤学的に許容される担体及び／又は賦形剤を用いて製剤化することによって単位容量の形態で製造されるか、或いは多回容量容器内に内入させて製造されてよい。このとき、剤形は、オイル又は水性媒質中の溶液、懸濁液又は乳化液の形態であるか、或いはエキス剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤又はカプセル剤の形態であってもよく、分散剤又は安定化剤をさらに含むことができる。

本明細書において、用語‘有効成分として含む’とは、下記のエキセナチド類似体の効能又は活性を達成するのに十分な量を含むことを意味する。本発明の組成物に含まれた量的上限は、当業者が適切な範囲内で選択して実施できる。

本発明の更に他の例は、糖鎖化エキセナチド類似体を含む、糖尿病の改善又は緩和用の食品組成物に関する。

本発明の更に他の例は、糖鎖化エキセナチド類似体を含む、肥満の改善又は緩和用の食品組成物に関する。

本発明の更に他の例は、糖鎖化エキセナチド類似体を含む、食欲抑制用の食品組成物に関する。

本発明の食品組成物において、糖鎖化エキセナチド類似体に関する記載は上述した通りであり、その記載を省略する。

本発明の組成物が食品組成物である場合には、粉末、顆粒、錠剤、カプセル又は飲料などの形態で製造されてよい。例えば、キャンディ類の各種の食品類、飲料、ガム、茶、ビタミン複合剤、又は健康補助食品類などがある。

本発明の食品組成物は、有効成分として食品製造の際に一般に添加される成分を含むことができ、例えば、タンパク質、炭水化物、脂肪、栄養素、調味剤及び香味剤を含む。

上述した炭水化物の例は、単糖類（モノサッカライド）、例えばブドウ糖、果糖など；二糖類（ジサッカライド）、例えばマルトース、スクロース、オリゴ糖など；及び、多糖類（ポリサッカライド）、例えばデキストリン、シクロデキストリンなどのような通常の糖及びキシリトール、ソルビトール、エリトリトールなどの糖アルコールである。香味剤として天然香味剤［タウマチン、ステビア抽出物（例えば、レバウジオシドＡ、グリチルリチンなど）］及び合成香味剤（サッカリン、アスパルテームなど）を使用することができる。例えば、本発明の食品組成物がドリンク剤として製造される場合には、本発明の化合物の他に、クエン酸、液状果糖、砂糖、ブドウ糖、酢酸、リンゴ酸、果汁、杜沖抽出液、ナツメ抽出液、甘草抽出液などもさらに含めることができる。

本発明のさらに他の目的は、エキセナチド類似体を、糖尿病の改善、予防又は治療の有効量でそれを必要とする対象に投与し、糖尿病を改善、予防又は治療する方法を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、エキセナチド類似体を肥満の改善、予防又は治療有効量でそれを必要とする対象に投与し、肥満を改善、予防又は治療する方法を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、エキセナチド類似体の糖尿病の改善、予防又は治療用途を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、エキセナチド類似体の肥満の改善、予防又は治療用途を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、エキセナチド類似体の食欲抑制用途を提供することである。

本発明は、エキセナチド（ｅｘｅｎａｔｉｄｅ）二量体類似体及びその用途に関する。

以下、本発明をより詳細に説明する。

本発明の一例は、エキセナチド二量体類似体に関する。

本発明において、エキセナチド二量体類似体は、エキセナチド（ｅｘｅｎａｔｉｄｅ）のアミノ酸配列の１～１５個のアミノ酸が欠失し、脂肪酸が接合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）したエキセナチド類似体から形成される第１の単量体（第１体、第１の構造単位）；及び、エキセナチド（ｅｘｅｎａｔｉｄｅ）のアミノ酸配列の１～１５個のアミノ酸が欠失し、脂肪酸が接合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）したエキセナチド類似体、又はグルカゴンから形成される第２の単量体（第２体、第２の構造単位）；を含み、前記第１の単量体及び第２の単量体が結合して二量体類似体を形成しているものでよい。

本発明において、エキセナチドは、ＧＬＰ－１受容体亢進剤であって、ジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶ（ＤＰＰ－ＩＶ）によって迅速に分解されるＧＬＰ－１を摸倣した類似体（ＧＬＰ－１ｍｅｔｒｉｃｓ）であり、ＤＰＰ－ＩＶによって迅速に分解されない上に、糖依存的インスリン分泌を促進し、グルカゴン分泌、胃排出及び食欲を抑制し、ベータ細胞保護効果を示すＧＬＰ－１の効果を奏する薬物である。

本発明において、エキセナチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含むエキセナチド又は配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％以上、９０％以上、９５％以上の配列相同性を示すエキセナチド類似体を含む。

本発明において、グルカゴンは配列番号２のアミノ酸配列を含むグルカゴン又は配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％以上、９０％以上、９５％以上の配列相同性を示すグルカゴン類似体を含む。

本発明の一例において、グルカゴンは、配列番号２のアミノ酸配列を含むものでよく、例えば、配列番号２のアミノ酸配列からなるものでよい。

本発明において、前記第２の単量体がエキセナチド類似体である場合に、前記第１の単量体及び第２の単量体の結合は、ジスルフィド結合（二硫化結合）であってよいが、これに限定されるものではない。

本発明において、前記第２の単量体がグルカゴンである場合に、前記第１の単量体及び第２の単量体の結合は、第１の単量体のＣ末端にＬｙｓ残基を付加し、その側鎖にグルカゴンから形成される第２の単量体が結合、又はジスルフィド結合したものでよいが、これに限定されるものではない。

本発明において、脂肪酸は、Ｃ_３～Ｃ_３６の炭素数を有する脂肪酸であってよく、例えば、プロピオン酸（ｐｒｏｐｉｏｎｉｃａｃｉｄ）、酪酸（ｂｕｔｙｒｉｃａｃｉｄ）、吉草酸（ｖａｌｅｒｉｃａｃｉｄ）、カプロン酸（ｃａｐｒｏｉｃａｃｉｄ）、エナント酸（ｅｎａｎｔｈｉｃａｃｉｄ）、カプリル酸（ｃａｐｒｙｌｉｃａｃｉｄ）、ペラルゴン酸（ｐｅｌａｒｇｏｎｉｃａｃｉｄ）、カプリン酸（ｃａｐｒｉｃａｃｉｄ）、ウンデシル酸（ｕｎｄｅｃｙｌｉｃａｃｉｄ）、ラウリン酸（ｌａｕｒｉｃａｃｉｄ）、トリデシル酸（ｔｒｉｄｅｃｙｌｉｃａｃｉｄ）、ミリスチン酸（ｍｙｒｉｓｔｉｃａｃｉｄ）、ペンタデシル酸（ｐｅｎｔａｄｅｃｙｌｉｃａｃｉｄ）、パルミチン酸（ｐａｌｍｉｔｉｃａｃｉｄ）、マルガリン酸（ｍａｒｇａｒｉｃａｃｉｄ）、ステアリン酸（ｓｔｅａｒｉｃａｃｉｄ）、ノナデシル酸（ｎｏｎａｄｅｃｙｌｉｃａｃｉｄ）、アラキジン酸（ａｒａｃｈｉｄｉｃａｃｉｄ）、ヘンイコシル酸（ｈｅｎｅｉｃｏｓｙｌｉｃａｃｉｄ）、ベヘン酸（ｂｅｈｅｎｉｃａｃｉｄ）、トリコシル酸（ｔｒｉｃｏｓｙｌｉｃａｃｉｄ）、リグノセリン酸（ｌｉｇｎｏｃｅｒｉｃａｃｉｄ）、ペンタコシル酸（ｐｅｎｔａｃｏｓｙｌｉｃａｃｉｄ）、セロチン酸（ｃｅｒｏｔｉｃａｃｉｄ）、ヘプタコシル酸（ｈｅｐｔａｃｏｓｙｌｉｃａｃｉｄ）、モンタン酸（ｍｏｎｔａｎｉｃａｃｉｄ）、ノナコシル酸（ｎｏｎａｃｏｓｙｌｉｃａｃｉｄ）、メリシン酸（ｍｅｌｉｓｓｉｃａｃｉｄ）、ヘナトリアコンチル酸（ｈｅｎａｔｒｉａｃｏｎｔｙｌｉｃａｃｉｄ）、ラセロイン酸（ｌａｃｃｅｒｏｉｃａｃｉｄ）、プシリン酸（ｐｓｙｌｌｉｃａｃｉｄ）、ゲジン酸（ｇｅｄｄｉｃａｃｉｄ）、セロプラスチン酸（ｃｅｒｏｐｌａｓｔｉｃａｃｉｄ）及びヘキサトリアコンチル酸（ｈｅｘａｔｒｉａｃｏｎｔｙｌｉｃａｃｉｄ）からなる群から選ばれる１種以上でよいが、これに限定されるものではない。

本発明において、間接結合は、当業界においてリンカーとして一般に用いられる化合物が仲介し、欠失したエキセナチド－脂肪酸の接合を形成することができる。

具体的に、アミノ酸が欠失しているエキセナチドは、それのＣ末端にリンカーがさらに結合し、前記脂肪酸は、前記Ｃ末端に結合したリンカーに接合している。例えば、アミノ酸が欠失しているエキセナチドのＣ末端にリンカーとしてＬｙｓが結合し、このＬｙｓに脂肪酸が接合してよい。この場合、前記追加のＬｙｓの－ＮＨ_２官能基と脂肪酸のカルボキシル基とが反応してコンジュゲートを形成することができる。

本発明において、エキセナチド二量体類似体は、第１の単量体、第２の単量体、又はこれらのそれぞれの一アミノ酸に糖類が結合したものでよい。

本発明において、エキセナチド二量体類似体は、第１の単量体、第２の単量体、又はこれらのそれぞれの一アミノ酸が他の一アミノ酸に置換され、置換されたアミノ酸に糖類が結合したものでよい。

本発明の一具体例において、前記置換は、配列番号１のアミノ酸配列からなるエキセナチドの１７番目のアミノ酸であるＧｌｕがＣｙｓに置換、配列番号１のアミノ酸配列からなるエキセナチドの２４番目のアミノ酸であるＧｌｕがＣｙｓに置換、及び配列番号１のアミノ酸配列からなるエキセナチドの２８番目のアミノ酸であるＡｓｎがＣｙｓに置換、からなる群から選ばれる１種以上でよいが、これに限定されるものではない。

本発明の一具体例において、前記糖類の結合は、配列番号２のアミノ酸配列からなるグルカゴンの１６及び２４番目位置からなる群から選ばれる１種以上の位置でなされてよいが、これに限定されるものではない。

本発明の一具体例において、前記置換は、配列番号２のアミノ酸配列からなるグルカゴンの１６番目のアミノ酸であるＳｅｒがＣｙｓ又はＡｓｎに置換、及び配列番号２のアミノ酸配列からなるグルカゴンの２４番目のアミノ酸であるＧｌｎがＣｙｓ又はＡｓｎに置換、からなる群から選ばれる１種以上であってよいが、これに限定されるものではない。

本発明において、糖類は、単糖類～１１糖類、２糖類～１１糖類、３糖類～１１糖類、４糖類～１１糖類、５糖類～１１糖類、６糖類～１１糖類、７糖類～１１糖類、８糖類～１１糖類、９糖類～１１糖類、１０糖類～１１糖類、例えば、１１糖類でよく、具体的には、下記構造式１のブロモアセチルグリカン（Ｂｒｏｍｏａｃｅｔｙｌｇｌｙｃａｎ）及び／又は下記構造式２の１１ＮＣ－Ａｓｎ－Ｆｍｏｃでよいが、これに限定されるものではない。

［構造式１］

［構造式２］

本明細書において、用語“ＡＧＭ－２１２”とは、配列番号１からなるエキセナチドの配列の１番から３２番までの配列からなり、前記配列Ｃ末端に、カプリン酸（ｃａｐｒｉｃａｃｉｄ）が側鎖に結合しているリジン（ｌｙｓｉｎｅ）を接合したものであり、Ｅｘ４（１－３２）Ｋ－ｃａｐの配列と明示する。

本明細書において、用語“ＡＧＭ－２１２－１”は、ＡＧＭ－２１２の配列において、１７番のグルタミン酸（Ｇｌｕ，Ｅ）がＣｙｓに置換された２個の配列がジスルフィド結合で二量体をなし、各配列の２４番グルタミン酸がＣｙｓに置換され、アミノ酸に１１糖類が結合した配列である。

本明細書において、用語“ＡＧＭ－２１２－２”は、ＡＧＭ－２１２の配列において、１７番のグルタミン酸がＣｙｓに置換された２個の配列がジスルフィド結合で二量体をなし、各配列の２８番アスパラギンがＣｙｓに置換され、１１糖類が結合した配列である。

本明細書において、用語“ＡＧＭ－２１２－３”は、ＡＧＭ－２１２の配列において、Ｃ末端にＬｙｓを付加し、それの側鎖にグルカゴン（Ｇｌｕｃａｇｏｎ）が結合した配列である。

本明細書において、用語“ＡＧＭ－２１２－４”は、ＡＧＭ－２１２の配列において、２８番のアスパラギンに１１糖類が結合し、Ｃ末端にＬｙｓを付加し、それの側鎖にグルカゴンが結合した配列である。

本明細書において、用語“ＡＧＭ－２１２－５”は、ＡＧＭ－２１２の配列において、２８番のアスパラギンに１１糖類が結合し、Ｃ末端にＬｙｓを付加し、それの側鎖にグルカゴンが結合し、グルカゴンの配列において１６番のセリン（Ｓｅｒ，Ｓ）が１１ＮＣ－Ａｓｎに置換され、１１糖類が結合した配列である。

本明細書において、用語“ＡＧＭ－２１２－６”は、ＡＧＭ－２１２の配列において、２８番のアスパラギンに１１糖類が結合し、Ｃ末端にＬｙｓを付加し、それの側鎖にグルカゴンが結合し、グルカゴンの配列において２４番のグルタミン（Ｇｌｎ，Ｑ）が１１ＮＣ－Ａｓｎに置換され、１１糖類が結合した配列である。

本明細書において、用語“ＡＧＭ－２１２－７”は、ＡＧＭ－２１２の配列において、１７番のグルタミン酸（Ｇｌｕ，Ｅ）をＣｙｓに置換し、２４番のグルタミン酸をＣｙｓに置換し、１１糖類が結合した配列と、グルカゴンの配列において、１６番のセリン（Ｓｅｒ，Ｓ）をＣｙｓに置換して１１糖類が結合し、２４番のグルタミン（Ｇｌｎ，Ｑ）をＣｙｓに置換した配列とがジスルフィド結合により二量体として構成された物質である。

本明細書において、用語“ＡＧＭ－２１２－８”は、ＡＧＭ－２１２の配列において１７番のグルタミン酸（Ｇｌｕ，Ｅ）をＣｙｓに置換し、２４番のグルタミン酸をＣｙｓに置換して、１１糖類が結合した配列と、グルカゴンの構成配列において２４番のグルタミン（Ｇｌｎ，Ｑ）をＣｙｓに置換して１１糖類が結合し、１６番のＳｅｒｉｎｅをＣｙｓに置換した配列とがジスルフィド結合により二量体として構成された物質である。

本明細書における用語“ジスルフィド結合”は、２つのＡＧＭ－２１２のＥ１７がＣ１７に置換された後、それぞれのＣ１７－Ｃ１７が互いにジスルフィド結合をなすものでよいが、これに限定されるものではない。

本発明の他の例は、エキセナチド二量体類似体を含む、糖尿病の改善、予防又は治療用の薬剤学的組成物に関する。

本発明の更に他の例は、エキセナチド二量体類似体を含む、肥満の改善、予防又は治療用の薬剤学的組成物に関する。

本発明の薬剤学的組成物において、エキセナチド二量体類似体に関する記載は上述した通りであり、その記載を省略する。

本発明の薬剤学的組成物は、当該発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者が容易に実施できる方法により、薬剤学的に許容される担体及び／又は賦形剤を用いて製剤化することによって単位容量の形態で製造されるか、或いは多回容量容器内に内入させて製造されてよい。このとき、剤形は、オイル又は水性媒質中の溶液、懸濁液又は乳化液の形態であるか、エキス剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤又はカプセル剤の形態であってもよく、分散剤又は安定化剤をさらに含むことができる。

本発明の更に他の例は、エキセナチド二量体類似体を含む、糖尿病の改善又は緩和用の食品組成物に関する。

本発明の更に他の例は、エキセナチド二量体類似体を含む、肥満の改善又は緩和用の食品組成物に関する。

本発明の更に他の例は、エキセナチド二量体類似体を含む、食欲抑制用の食品組成物に関する。

本発明の食品組成物において、エキセナチド二量体類似体に関する記載は上述した通りであり、その記載を省略する。

本発明の組成物が食品組成物である場合には、粉末、顆粒、錠剤、カプセル又は飲料などの形態で製造されてよい。例えば、キャンディ類の各種食品類、飲料、ガム、茶、ビタミン複合剤、又は健康補助食品類などがある。

本明細書において、用語“糖尿病”は、ブドウ糖－非寛容（ｉｎｔｏｌｅｒａｎｃｅ）を招くインスリンの相対的又は絶対的不足として特徴付けられる慢性疾患を意味する。用語“糖尿病”は、あらゆる種類の糖尿病を含み、例えば、１型糖尿病、２型糖尿病及び遺伝性糖尿病を含む。１型糖尿病は、インスリン依存性糖尿病であり、β－細胞の破壊によって主に起きる。２型糖尿病は、インスリン非依存性糖尿病であり、食事後の不十分なインスリン分泌によって起きる又はインスリン耐性によって起きる。

本明細書において、用語“肥満”は、健康に異常を招く程度に脂肪組織が体内に過剰蓄積された状態を意味する。

本明細書において、用語“食欲抑制”は、食べ物を摂取しようとする欲求が抑制されることを意味する。

本発明は、特定残基に糖鎖化したエキセナチド類似体及びその用途に関し、本発明は、従来のエキセナチド及びその類似体に比べて向上した体内安定性を示す新規糖尿病治療物質を提供する。

本発明は、エキセナチド二量体類似体及びその用途に関し、本発明は、従来のエキセナチド及びその類似体に比べて向上した体内安定性を示す新規糖尿病治療物質を提供する。

本発明の一実施例に係る糖鎖化ＡＧＭ－２１２類似体（実施例１－１、１－２及び１－４）のインスリン分泌能をラット膵島（ｒａｔｉｓｌｅｔｓ）でラットインスリンＥＬＩＳＡ（ｒａｔｉｎｓｕｌｉｎＥＬＩＳＡ）によって分析した結果である。

本発明の一実施例に係る糖鎖化ＡＧＭ－２１２類似体（実施例１－５及び１－６）のインスリン分泌能をラット膵島でラットインスリンＥＬＩＳＡによって分析した結果である。

本発明の一実施例に係る糖鎖化ＡＧＭ－２１２類似体を皮下投与し、２型糖尿病マウス動物モデルにおける糖負荷程度を血糖測定器で分析した結果である。本発明の一実施例に係る糖鎖化ＡＧＭ－２１２類似体を皮下投与し、２型糖尿病マウス動物モデルにおける糖負荷程度を血糖測定器で分析した結果である。

本発明の一実施例に係る糖鎖化ＡＧＭ－２１２類似体を皮下投与し、野生型マウス動物モデルにおける薬動力学評価試験を分析した結果である。

本発明の一実施例に係る糖鎖化ＡＧＭ－２１２類似体の免疫原性試験結果である。

本発明の一実施例に係る類似体のインスリン分泌能をラット膵島でラットインスリンＥＬＩＳＡによって分析した結果である。

本発明の一実施例に係るＡＧＭ－２１２－１及びＡＧＭ－２１２－２を含む類似体を皮下投与し、２型糖尿病マウス動物モデルにおける抗糖尿効能を血糖測定器で分析した結果である。

本発明の一実施例に係るＡＧＭ－２１２－３、ＡＧＭ－２１２－４、ＡＧＭ－２１２－５及びＡＧＭ－２１２－６を含む類似体を皮下投与し、２型糖尿病マウス動物モデルにおける抗糖尿効能を血糖測定器で分析した結果である。

本発明の一実施例に係る類似体を皮下投与し、野生型マウス動物モデルにおける薬動力学評価試験を分析した結果である。

本発明の一実施例に係る類似体の食餌調節能試験結果である。

本発明の一実施例に係る類似体の糖耐性改善試験結果である。

本発明の一実施例に係る類似体のインスリン耐性改善試験結果である。

本発明の一実施例に係る類似体の肝内脂肪の蓄積量試験結果である。

本発明の一実施例に係る類似体の熱エネルギー増進効果試験結果である。

本発明の一実施例に係る類似体の熱エネルギー発生関連因子試験結果である。

本発明の一実施例に係る類似体の脂肪分解能試験結果である。

本発明の一実施例に係る類似体の筋肉細胞内脂肪分解能及び熱エネルギー発生効果試験結果である。

エキセナチド（ｅｘｅｎａｔｉｄｅ）のアミノ酸配列の１～１５個のアミノ酸が欠失し、脂肪酸が接合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）した糖鎖化エキセナチド類似体、又はエキセナチド（ｅｘｅｎａｔｉｄｅ）のアミノ酸配列の１～１５個のアミノ酸が欠失し、脂肪酸が接合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）したエキセナチド類似体から形成される第１の単量体；及び、エキセナチド（ｅｘｅｎａｔｉｄｅ）のアミノ酸配列の１～１５個のアミノ酸が欠失し、脂肪酸が接合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）したエキセナチド類似体、又はグルカゴンから形成される第２の単量体；を含み、前記第１の単量体及び第２の単量体が結合して二量体類似体を形成している、エキセナチド二量体類似体。

以下、本発明を下記の実施例を用いてより詳細に説明する。ただし、これらの実施例は、本発明を例示するためのものに過ぎず、本発明の範囲がこれらの実施例によって限定されるものではない。

Ｉ．糖鎖化したエキセナチド類似体

実施例１－１．ＡＧＭ－２１２（Ｅ１７Ｃ－１１ｓｕｇａｒ）の製造

１－１－１．化学式１－１

ＡＧＭ－２１２の構成配列であるＥｘ４（１－３２）Ｋ－ｃａｐを製造するために、トリチルレジン（ｔｒｉｔｙｌｒｅｓｉｎ）にＦｍｏｃ－Ｌｙｓ（ｄｄｅ）－ＯＨ及びＤＭＦを添加してＦｍｏｃ－Ｌｙｓ（ｄｄｅ）トリチルレジンを製造した。Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（ｄｄｅ）トリチルレジンに、２０％ピぺリジン（ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ）が含まれたＤＭＦ及びＦｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ及びＨＯＢｔ（ｈｙｄｒｏｘｙｌ－ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ）を添加し、Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－Ｌｙｓ（ｄｄｅ）トリチルレジンを製造した。Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－Ｌｙｓ（ｄｄｅ）トリチルレジンに、前記作製方法と同一にして順次に、Ｆｍｏｃ－Ｐｒｏ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｓｎ（ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（ｂｏｃ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｉｌｅ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ（ｐｂｆ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｌａ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｍｅｔ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｎ（ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（ｂｏｃ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌｅ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｈｉｓ（ｔｒｔ）－ＯＨを添加し、下の化学式１－１を製造した。

［化学式１－１］

Ｆｍｏｃ－Ｈｉｓ（ｔｒｔ）－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ（ｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－Ａｓｐ（ｔＢｕ）－Ｌｅｕ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－Ｌｙｃ（Ｂｏｃ）－Ｇｌｎ（ｔｒｔ）－Ｍｅｔ－Ｇｌｕ（ｔＢｕ）－Ｇｌｕ（ｔＢｕ）－Ｃｙｓ（ｔＢｕ）－Ａｌａ－Ｖａｌ－Ａｒｇ（ｐｂｆ）－Ｌｅｕ－Ｐｈｅ－Ｉｌｅ－Ｇｌｕ（ｔＢｕ）－Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－Ａｓｎ（ｔｒｔ）－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－Ｌｙｓ（ｄｄｅ）－トリチルレジン

１－１－２．化学式１－２

化学式１－１に、２％ＮＨ_２ＮＨ_２・Ｈ_２Ｏを含むＤＭＦを添加し、ｄｄｅを除去することで、化学式１－２を製造した。

［化学式１－２］

Ｆｍｏｃ－Ｈｉｓ（ｔｒｔ）－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ（ｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－Ａｓｐ（ｔＢｕ）－Ｌｅｕ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－Ｌｙｃ（Ｂｏｃ）－Ｇｌｎ（ｔｒｔ）－Ｍｅｔ－Ｇｌｕ（ｔＢｕ）－Ｇｌｕ（ｔＢｕ）－Ｃｙｓ（ｔｒｔ）－Ａｌａ－Ｖａｌ－Ａｒｇ（ｐｂｆ）－Ｌｅｕ－Ｐｈｅ－Ｉｌｅ－Ｇｌｕ（ｔＢｕ）－Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－Ａｓｎ（ｔｒｔ）－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－Ｌｙｓ－トリチルレジン

１－１－３．化学式１－３

化学式１－２に、カプリン酸、及びＨＯＢｔ及びＤＩＣを含むＤＭＦを添加し、化学式１－３を製造した。

［化学式１－３］

Ｆｍｏｃ－Ｈｉｓ（ｔｒｔ）－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ（ｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－Ａｓｐ（ｔＢｕ）－Ｌｅｕ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－Ｌｙｃ（Ｂｏｃ）－Ｇｌｎ（ｔｒｔ）－Ｍｅｔ－Ｇｌｕ（ｔＢｕ）－Ｇｌｕ（ｔＢｕ）－Ｃｙｓ（ｔｒｔ）－Ａｌａ－Ｖａｌ－Ａｒｇ（ｐｂｆ）－Ｌｅｕ－Ｐｈｅ－Ｉｌｅ－Ｇｌｕ（ｔＢｕ）－Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－Ａｓｎ（ｔｒｔ）－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－Ｌｙｓ（ｃａｐｒｉｃａｃｉｄ）－トリチルレジン

１－１－４．化学式１－４

化学式１－３の保護基を切断した後に精製し、化学式１－４を製造した。

［化学式１－４］

Ｈｉｓ－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ｓｅｒ－Ｌｙｃ－Ｇｌｎ－Ｍｅｔ－Ｇｌｕ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓ－Ａｌａ－Ｖａｌ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ－Ｐｈｅ－Ｉｌｅ－Ｇｌｕ－Ｔｒｐ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ－Ａｓｎ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ（ｃａｐｒｉｃａｃｉｄ）－ＯＨ

１－１－５．化学式１－５

化学式１－４に、１１糖類の構造をなすブロモアセチルグリカン（１１ｓｕｇａｒ）及びＮａＯＨ、リン酸緩衝液（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒ）を添加し、化学式１－５を製造した。

［化学式１－５］

Ｈｉｓ－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ｓｅｒ－Ｌｙｃ－Ｇｌｎ－Ｍｅｔ－Ｇｌｕ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓ（１１ｓｕｇａｒ）－Ａｌａ－Ｖａｌ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ－Ｐｈｅ－Ｉｌｅ－Ｇｌｕ－Ｔｒｐ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ－Ａｓｎ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ（ｃａｐｒｉｃａｃｉｄ）－ＯＨ

実施例１－２．ＡＧＭ－２１２（Ｎ２８Ｃ－１１ｓｕｇａｒ）の製造

実施例１－１の製造過程において２８番目のアミノ酸であるＦｍｏｃ－Ａｓｎ（ｔＢｕ）－ＯＨをＦｍｏｃ－Ｃｙｓ（ｔｒｔ）－ＯＨに替える以外は同一の方法で化学式１－６を製造した。

［化学式１－６］

Ｈｉｓ－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ｓｅｒ－Ｌｙｃ－Ｇｌｎ－Ｍｅｔ－Ｇｌｕ－Ｇｌｕ－Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ｖａｌ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ－Ｐｈｅ－Ｉｌｅ－Ｇｌｕ－Ｔｒｐ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ－Ｃｙｓ（１１ｓｕｇａｒ）－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ（ｃａｐｒｉｃａｃｉｄ）－ＯＨ

実施例１－３．ＡＧＭ－２１２（Ｎ２８－１１ｓｕｇａｒ）の製造

実施例１－１の製造過程において２８番目のアミノ酸であるＦｍｏｃ－Ａｓｎ（ｔＢｕ）－ＯＨを図２の１１ＮＣ－Ａｓｎ－Ｆｍｏｃに替える以外は同一の方法で化学式１－７を製造した。

［化学式１－７］

Ｈｉｓ－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ｓｅｒ－Ｌｙｃ－Ｇｌｎ－Ｍｅｔ－Ｇｌｕ－Ｇｌｕ－Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ｖａｌ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ－Ｐｈｅ－Ｉｌｅ－Ｇｌｕ－Ｔｒｐ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ－Ａｓｎ（１１ｓｕｇａｒ）－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ（ｃａｐｒｉｃａｃｉｄ）－ＯＨ

実施例１－４．ＡＧＭ－２１２（Ｅ２４Ｃ－１１ｓｕｇａｒ）の製造

実施例１－１の製造過程において２４番目のアミノ酸であるＦｍｏｃ－Ｇｌｕ（ｔＢｕ）－ＯＨをＦｍｏｃ－Ｃｙｓ（ｔｒｔ）－ＯＨに替える以外は同一の方法で化学式１－８を製造した。

［化学式１－８］

Ｈｉｓ－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ｓｅｒ－Ｌｙｃ－Ｇｌｎ－Ｍｅｔ－Ｇｌｕ－Ｇｌｕ－Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ｖａｌ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ－Ｐｈｅ－Ｉｌｅ－Ｃｙｓ（１１ｓｕｇａｒ）－Ｔｒｐ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ－Ａｓｎ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ（ｃａｐｒｉｃａｃｉｄ）－ＯＨ

実施例１－５．ＡＧＭ－２１２（Ｅ１７Ｃ－１１ｓｕｇａｒ＆Ｅ２４Ｃ－１１ｓｕｇａｒ）の製造

１－５－１．化学式１－９

実施例１－１の製造過程において２４番目のアミノ酸であるＦｍｏｃ－Ｇｌｕ（ｔＢｕ）－ＯＨをＦｍｏｃ－Ｃｙｓ（ｔｒｔ）－ＯＨに替え、化学式１－９を製造した。

［化学式１－９］

Ｈｉｓ－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ｓｅｒ－Ｌｙｃ－Ｇｌｎ－Ｍｅｔ－Ｇｌｕ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓ－Ａｌａ－Ｖａｌ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ－Ｐｈｅ－Ｉｌｅ－Ｃｙｓ－Ｔｒｐ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ－Ａｓｎ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ（ｃａｐｒｉｃａｃｉｄ）－ＯＨ

１－５－２．化学式１－１０

化学式１－９に、１１糖類の構造をなすブロモアセチルグリカン（１１ｓｕｇａｒ）及びＮａＯＨ、リン酸緩衝液を添加し、化学式１－１０を製造した。

［化学式１－１０］

Ｈｉｓ－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ｓｅｒ－Ｌｙｃ－Ｇｌｎ－Ｍｅｔ－Ｇｌｕ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓ（１１ｓｕｇａｒ）－Ａｌａ－Ｖａｌ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ－Ｐｈｅ－Ｉｌｅ－Ｃｙｓ（１１ｓｕｇａｒ）－Ｔｒｐ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ－Ａｓｎ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ（ｃａｐｒｉｃａｃｉｄ）－ＯＨ

実施例１－６．ＡＧＭ－２１２（Ｅ１７Ｃ－１１ｓｕｇａｒ＆Ｎ２８Ｃ－１１ｓｕｇａｒ）の製造

１－６－１．化学式１－１１

実施例１－１の製造過程において２８番目のアミノ酸であるＦｍｏｃ－Ａｓｎ（ｔＢｕ）－ＯＨをＦｍｏｃ－Ｃｙｓ（ｔｒｔ）－ＯＨに替え、化学式１－１１を製造した。

［化学式１－１１］

Ｈｉｓ－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ｓｅｒ－Ｌｙｃ－Ｇｌｎ－Ｍｅｔ－Ｇｌｕ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓ－Ａｌａ－Ｖａｌ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ－Ｐｈｅ－Ｉｌｅ－Ｇｌｕ－Ｔｒｐ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ（ｃａｐｒｉｃａｃｉｄ）－ＯＨ

１－６－２．化学式１－１２

化学式１－１１に、１１糖類の構造をなすブロモアセチルグリカン（１１ｓｕｇａｒ）及びＮａＯＨ、リン酸緩衝液を添加し、化学式１－１２を製造した。

［化学式１－１２］

Ｈｉｓ－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ｓｅｒ－Ｌｙｃ－Ｇｌｎ－Ｍｅｔ－Ｇｌｕ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓ（１１ｓｕｇａｒ）－Ａｌａ－Ｖａｌ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ－Ｐｈｅ－Ｉｌｅ－Ｇｌｕ－Ｔｒｐ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ－Ｃｙｓ（１１ｓｕｇａｒ）－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ（ｃａｐｒｉｃａｃｉｄ）－ＯＨ

実験例１－１．類似体のＧＬＰ－１受容体結合力確認

実施例１－１～実施例１－６で製造した類似体のＧＬＰ－１受容体に対する結合力を調べるために、ルシフェラーゼ分析システム（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅａｓｓａｙｓｙｓｔｅｍ）を使用した。ルシフェラーゼ分析システムは、細胞の特定受容体に対するリガンドの結合力を測定して受容体の活性程度が確認できる方法である。

具体的に、線維芽細胞株であるＣＶ－１（１×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、韓国細胞株銀行）を９６ウェル白血球培養皿に２４時間培養後に、ヒトＧＬＰ－１Ｒ（ｐｃＤＮＡ３．１＿ｈＧＬＰ－１Ｒ）、ｃＡＭＰｒｅｓｐｏｎｓｅｅｌｅｍｅｎｔ（ＣＲＥ，ｐｃＤＮＡ３．１＿ｈＣＲＥ）を添加して形質転換（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）した。２４時間培養後に、無血清培地に交替し、１６時間培養後に、各類似体を６時間処理した。活性化されたＧＬＰ－１Ｒを用いてレポーター遺伝子であるルシフェラーゼの発現程度をルミノメーター（ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ）を用いて定量し、その結果を表２に示した。

表２から確認できるように、ＡＧＭ－２１２は、Ｅｘ４と同等なＧＬＰ－１Ｒに対する活性を示し、１１ｓｕｇａｒの結合したＡＧＭ－２１２類似体は、Ｅｘ４又はＡＧＭ－２１２に比べて少し減少した活性を示した。糖鎖化によって各類似体の活性が減少するが、依然としてｎＭレベルの結合力を有することが分かった。

実験例１－２．類似体のインスリン分泌能確認

実施例１－１～実施例１－６で製造した類似体のインスリン分泌能を確認するために、ラット膵島に対する類似体の糖依存性インスリン分泌能を確認した。

具体的に、ＳＤラット（ダムルサイエンス）８週齢の膵臓を抽出し、膵島（ｉｓｌｅｔｓ）を分離した。分離された膵島に、２８ｍＭグルコースにおける各類似体を濃度別（１０ｎＭ、１００ｎＭ）に処理した後、ラットインスリンＥＬＩＳＡキットを用いて、分泌されたインスリン量を測定し、その結果を図１、図２、表３及び表４に示した。

図１、図２、表３及び表４から確認できるように、１１ｓｕｇａｒの結合した類似体はいずれも、濃度依存的にインスリン分泌を増進させ、且つ、Ｅｘ４及びＡＧＭ－２１２に比べてより増進したインスリン分泌能が確認された。

実験例１－３．類似体の糖負荷効果確認

実施例１－１～実施例１－４で製造した類似体の糖負荷効果を確認するために、２型糖尿病マウスモデルであるＣ５７ＢＫＳ／Ｊｄｂｄｂマウス（５～７週齢、中央実験動物）を１６時間絶食後に、各類似体を１０ｎｍｏｌｅ／ｋｇで皮下投与し、３０分後にブドウ糖（１．５ｇ／ｋｇ）を腹腔に投与した。１２０分間、０、１５、３０、４５、６０、９０、１２０分にマウス尾静脈から抽出した血液を用いて血糖測定器（ａｃｕ－ｃｈｅｃｋ，Ｒｏｃｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で血糖を測定し、その結果を図３Ａ及び図３Ｂに示した。

図３Ａ及び図３Ｂから確認できるように、いずれのＡＧＭ－２１２類似体もＥｘ４及びＡＧＭ－２１２と同等な糖負荷効能を示した。この結果は、糖鎖化したＡＧＭ－２１２類似体がＥｘ４の生物学的な活性を有していることを意味する。

実験例１－４．類似体の薬動力学試験

実施例１－２及び実施例１－３で製造した類似体の薬動力学（ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ）試験を実施した。野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（雄、５～６週齢、ｎ＝５）を用い、各類似体を５０ｎｍｏｌｅ／ｋｇで皮下投与後に、各０、０．５、１、２、４、８、１０、１２、１４、２４時間に血液を抽出した。抽出した血液の血漿を分離し、Ｅｘｅｎｄｉｎ－４ＥＩＡを用いて定量分析を行った。結果分析は、Ｗｉｎｎｏｌｉｎプログラムを用いて薬物動態パラメータ（Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓｐａｒａｍｅｔｅｒ）を決定し、その結果を図４及び表５に示した。

図４及び表５から確認できるように、ＡＧＭ－２１２（Ｎ２８－１１ｓｕｇａｒ）がＡＧＭ－２１２と類似の半減期を示しており、ＡＧＭ－２１２（Ｎ２８Ｃ－１１ｓｕｇａｒ）では、Ｅｘ４に比べては増進した半減期が観察されたが、ＡＧＭ－２１２（Ｎ２８－１１ｓｕｇａｒ）に比べては少し減少したレベルを示すことを確認した。この結果から、糖鎖化したとき、体内半減期には影響を与えないことが分かる。

実験例１－５．類似体の免疫原性試験

糖鎖化ＡＧＭ－２１２類似体に対する免疫原性試験をするために、野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（雄、６週齢）を用い、各Ｅｘ４とＡＧＭ－２１２（Ｎ２８Ｃ－１１ｓｕｇａｒ）に１ｍｇ／ｋｇでフロインド完全アジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓｃｏｍｐｌｅｔｅａｄｊｕｖａｎｔ）（ｓｉｇｍａ）を添加し、週に１回ずつ合計３回皮下投与した。血液を抽出し、アンチドラッグ抗体分析キット（ａｎｔｉｄｒｕｇａｎｔｉｂｏｄｙａｓｓａｙｋｉｔ）を用いて生成された抗体を定量分析し、その結果を図５に示した。

図５から確認できるように、Ｅｘ４を投与した群では、Ｅｘ４に対するｌｇＧの抗体が約１０ｐｇ／ｍｌが形成されたのに対し、糖鎖化ＡＧＭ－２１２類似体を投与した群では、形成された抗体が検出されないことを確認した。この結果は、糖鎖化ＡＧＭ－２１２類似体が糖鎖化によってその免疫原性が改善されたことを意味する。

実験例１－６．類似体の溶解度試験

糖鎖化した類似体は糖の結合によって増進した溶解度（ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ）を有し得るので、糖鎖化ＡＧＭ－２１２類似体に対する溶解度試験を行った。ＡＧＭ－２１２（Ｎ２８Ｃ－１１ｓｕｇａｒ）及びＡＧＭ－２１２（Ｅ１７Ｃ－１１ｓｕｇａｒ＆Ｎ２８Ｃ－１１ｓｕｇａｒ）をそれぞれ１０ｍｇ／ｍｌとし、Ｈ_２Ｏ及びＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒｅｄｓａｌｉｎｅ）における溶解度を、ＨＰＬＣを用いて調べ、その結果を表６に示した。

表６から確認できるように、Ｅｘ４は、全ての溶媒で１０ｍｇ／ｍｌの溶解度を有するが、ＡＧＭ－２１２は、Ｈ_２Ｏでは少し減少した溶解度を有することが分かり、ＰＢＳではＥｘ４に比べて約０．５倍以上の溶解度を示した。糖鎖化類似体は、全ての溶媒でＡＧＭ－２１２に比べては増進した溶解度を示し、１１ｓｕｇａｒが１つ及び２つで結合した類似体の溶解度を比較する時、結合した糖の数の増加により、さらに増進した溶解度を有することを発見した。

ＩＩ．エキセナチド二量体類似体

実施例２－１．ＡＧＭ－２１２－１の製造

２－１－１．化学式２－１

トリチルレジン（ｔｒｉｔｙｌｒｅｓｉｎ）にＦｍｏｃ－Ｌｙｓ（ｄｄｅ）－ＯＨ及びＤＭＦを添加し、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（ｄｄｅ）トリチルレジンを製造した。Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（ｄｄｅ）トリチルレジンに、２０％ピぺリジン（ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ）が含まれたＤＭＦ及びＦｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ及びＨＯＢｔ（ｈｙｄｒｏｘｙｌ－ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ）を添加し、Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－Ｌｙｓ（ｄｄｅ）トリチルレジンを製造した。Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－Ｌｙｓ（ｄｄｅ）トリチルレジンに、前記作製方法と同一にして順次に、Ｆｍｏｃ－Ｐｒｏ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｓｎ（ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（ｂｏｃ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｉｌｅ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ（ｐｂｆ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｌａ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ａｃｍ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｍｅｔ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｎ（ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（ｂｏｃ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌｅ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｈｉｓ（ｔｒｔ）－ＯＨを添加し、下の化学式２－１を製造した。

［化学式２－１］

Ｆｍｏｃ－Ｈｉｓ（ｔｒｔ）－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ（ｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－Ａｓｐ（ｔＢｕ）－Ｌｅｕ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－Ｌｙｃ（Ｂｏｃ）－Ｇｌｎ（ｔｒｔ）－Ｍｅｔ－Ｇｌｕ（ｔＢｕ）－Ｇｌｕ（ｔＢｕ）－Ｃｙｓ（Ａｃｍ）－Ａｌａ－Ｖａｌ－Ａｒｇ（ｐｂｆ）－Ｌｅｕ－Ｐｈｅ－Ｉｌｅ－Ｃｙｓ（ｔｒｔ）－Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－Ａｓｎ（ｔｒｔ）－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－Ｌｙｓ（ｄｄｅ）－トリチルレジン

２－１－２．化学式２－２

化学式２－１に、２％ＮＨ_２ＮＨ_２・Ｈ_２Ｏを含むＤＭＦを添加し、ｄｄｅを除去することで、化学式２－２を製造した。

［化学式２－２］

Ｆｍｏｃ－Ｈｉｓ（ｔｒｔ）－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ（ｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－Ａｓｐ（ｔＢｕ）－Ｌｅｕ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－Ｌｙｃ（Ｂｏｃ）－Ｇｌｎ（ｔｒｔ）－Ｍｅｔ－Ｇｌｕ（ｔＢｕ）－Ｇｌｕ（ｔＢｕ）－Ｃｙｓ（Ａｃｍ）－Ａｌａ－Ｖａｌ－Ａｒｇ（ｐｂｆ）－Ｌｅｕ－Ｐｈｅ－Ｉｌｅ－Ｃｙｓ（ｔｒｔ）－Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－Ａｓｎ（ｔｒｔ）－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－Ｌｙｓ－トリチルレジン

２－１－３．化学式２－３

化学式２－２に、カプリン酸、及びＨＯＢｔ及びＤＩＣを含むＤＭＦを添加し、化学式２－３を製造した。

［化学式２－３］

Ｆｍｏｃ－Ｈｉｓ（ｔｒｔ）－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ（ｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－Ａｓｐ（ｔＢｕ）－Ｌｅｕ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－Ｌｙｃ（Ｂｏｃ）－Ｇｌｎ（ｔｒｔ）－Ｍｅｔ－Ｇｌｕ（ｔＢｕ）－Ｇｌｕ（ｔＢｕ）－Ｃｙｓ（Ａｃｍ）－Ａｌａ－Ｖａｌ－Ａｒｇ（ｐｂｆ）－Ｌｅｕ－Ｐｈｅ－Ｉｌｅ－Ｃｙｓ（ｔｒｔ）－Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－Ａｓｎ（ｔｒｔ）－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－Ｌｙｓ（ｃａｐｒｉｃａｃｉｄ）－トリチルレジン

２－１－４．化学式２－４

化学式２－３の保護基を切断した後に精製し、化学式２－４を製造した。

［化学式２－４］

Ｈｉｓ－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ｓｅｒ－Ｌｙｃ－Ｇｌｎ－Ｍｅｔ－Ｇｌｕ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓ（Ａｃｍ）－Ａｌａ－Ｖａｌ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ－Ｐｈｅ－Ｉｌｅ－Ｃｙｓ－Ｔｒｐ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ－Ａｓｎ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ（ｃａｐｒｉｃａｃｉｄ）－ＯＨ

２－１－５．化学式２－５

化学式２－４に、１１糖類の構造をなすブロモアセチルグリカン（１１ｓｕｇａｒ）及びＮａＯＨ、リン酸緩衝液を添加し、化学式２－５を製造した。

［化学式２－５］

Ｈｉｓ－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ｓｅｒ－Ｌｙｃ－Ｇｌｎ－Ｍｅｔ－Ｇｌｕ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓ（Ａｃｍ）－Ａｌａ－Ｖａｌ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ－Ｐｈｅ－Ｉｌｅ－Ｃｙｓ（１１ｓｕｇａｒ）－Ｔｒｐ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ－Ａｓｎ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ（ｃａｐｒｉｃａｃｉｄ）－ＯＨ

２－１－６．ＡＧＭ－２１２－１

化学式２－５に、酢酸銀及びヨード、５０％酢酸を添加し、表１のＡＧＭ－２１２－１を製造した。

実施例２－２．ＡＧＭ－２１２－２の製造

実施例２－１の製造過程において２８番目のアミノ酸であるＦｍｏｃ－Ａｓｎ（ｔＢｕ）－ＯＨをＦｍｏｃ－Ｃｙｓ（ｔｒｔ）－ＯＨに替える以外は同一の方法で表１のＡＧＭ－２１２－２を製造した。

実施例２－３．ＡＧＭ－２１２－３の製造

２－３－１．化学式２－６

トリチルレジンにＦｍｏｃ－Ｌｙｓ－ＯＨ及びＤＭＦを添加してＦｍｏｃ－Ｌｙｓトリチルレジンを製造した。前記実施例２－１の製造過程において１７番のＦｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ａｃｍ）－ＯＨをＦｍｏｃ－Ｇｌｕ（ｔＢｕ）－ＯＨに置換する以外は同一にして化学式２－６を製造した。

［化学式２－６］

Ｈｉｓ－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ｓｅｒ－Ｌｙｃ－Ｇｌｎ－Ｍｅｔ－Ｇｌｕ－Ｇｌｕ－Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ｖａｌ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ－Ｐｈｅ－Ｉｌｅ－Ａｓｎ－Ｔｒｐ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ－Ａｓｎ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ（ｃａｐｒｉｃａｃｉｄ）－Ｌｙｓ－ＯＨ

２－３－２．化学式２－７

グルカゴンを製造するために、トリチルレジンにＦｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ及びＤＭＦを添加し、Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）トリチルレジンを製造した。Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）トリチルレジンに、２０％ピぺリジン（ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ）が含まれたＤＭＦ及びＦｍｏｃ－Ａｓｎ（ｔｒｔ）－ＯＨ及びＨＯＢｔ（ｈｙｄｒｏｘｙｌ－ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ）を添加し、Ｆｍｏｃ－Ａｓｎ（ｔｒｔ）－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）トリチルレジンを製造した。Ｆｍｏｃ－Ａｓｎ（ｔｒｔ）－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）トリチルレジンに、前記作製方法と同一にして順次に、Ｆｍｏｃ－Ｍｅｔ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｎ（ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｎ（ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｌａ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ（ｐｂｆ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ（ｐｂｆ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ，Ｆｍｏｒ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ－ＯＨ，Ｆｍｏｒ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｎ（ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｈｉｓ（ｔｒｔ）－ＯＨを添加し、下の化学式２－７を製造した。

［化学式２－７］

Ｆｍｏｃ－Ｈｉｓ（ｔｒｔ）－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－Ｇｌｎ（ｔｒｔ）－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－Ａｓｐ（ｔＢｕ）－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－Ｌｙｓ（ｔｒｔ）－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）－Ｌｅｕ－Ａｓｐ（ｔＢｕ）－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－Ａｒｇ（ｐｂｆ）－Ａｒｇ（ｐｂｆ）－Ａｌａ－Ｇｌｎ（ｔｒｔ）－Ａｓｐ（ｔＢｕ）－Ｐｈｅ－Ｖａｌ－Ｇｌｎ（ｔｒｔ）－Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）－Ｌｅｕ－Ｍｅｔ－Ａｓｎ（ｔｒｔ）－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－トリチルレジン

２－３－３．化学式２－８

化学式２－７の保護基を切断して精製し、化学式２－８を製造した。

［化学式２－８］

Ｈｉｓ－Ｓｅｒ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ｔｙｒ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｓｅｒ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ａｌａ－Ｇｌｎ－Ａｓｐ－Ｐｈｅ－Ｖａｌ－Ｇｌｎ－Ｔｒｐ－Ｌｅｕ－Ｍｅｔ－Ａｓｎ－Ｔｈｒ－ＯＨ

２－３－４．ＡＧＭ－２１２－３

前記化学式２－６と化学式２－８に、２０％ピぺリジン（ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ）が含まれたＤＭＦ及びＨＯＢｔ（ｈｙｄｒｏｘｙｌ－ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ）を添加し、化学式２－８の３４番Ｌｙｓの側鎖に化学式２－８の３０番Ｔｈｒが結合した表１のＡＧＭ－２１２－３を製造した。

実施例２－４．ＡＧＭ－２１２－４の製造

実施例２－３において化学式２－６の構成配列のうち２８番のＡｓｎを１１ＮＣ－Ａｓｎ－Ｆｍｏｃに置換して製造後に、化学式２－８の物質に、２０％ピぺリジン（ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ）が含まれたＤＭＦ及びＨＯＢｔ（ｈｙｄｒｏｘｙｌ－ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ）を添加し、化学式２－６の３４番Ｌｙｓの側鎖に結合した表１のＡＧＭ－２１２－４を製造した。

実施例２－５．ＡＧＭ－２１２－５の製造

前記実施例２－４の製造過程において化学式２－６の構成配列のうち１６番Ｓｅｒを１１ＮＣ－Ａｓｎ－Ｆｍｏｃに置換する以外は同一の製造方法で表１のＡＧＭ－２１２－５を製造した。

実施例２－６．ＡＧＭ－２１２－６の製造

実施例２－４の製造過程において化学式２－６の構成配列のうち２４番Ｇｌｎを１１ＮＣ－Ａｓｎ－Ｆｍｏｃに置換する以外は同一の製造方法で表１のＡＧＭ－２１２－６を製造した。

実施例２－７．ＡＧＭ－２１２－７の製造

２－７－１．化学式２－９

実施例２－５の作製過程において１６番のＳｅｒをＣｙｓ（Ａｃｍ）に置換し、２４番のグルタミンをＣｙｓに置換することで、化学式２－９を製造した。

［化学式２－９］

Ｈｉｓ－Ｓｅｒ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ｔｙｒ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｃｙｓ（Ａｃｍ）－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ａｌａ－Ｇｌｎ－Ａｓｐ－Ｐｈｅ－Ｖａｌ－Ｃｙｓ－Ｔｒｐ－Ｌｅｕ－Ｍｅｔ－Ａｓｎ－Ｔｈｒ－ＯＨ

２－７－２．化学式２－１０

化学式２－９に、１１糖類の構造をなすブロモアセチルグリカン（１１ｓｕｇａｒ）及びＮａＯＨ、リン酸緩衝液を添加し、化学式２－１０を製造した。

［化学式２－１０］

Ｈｉｓ－Ｓｅｒ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ｔｙｒ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｃｙｓ（Ａｃｍ）－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ａｌａ－Ｇｌｎ－Ａｓｐ－Ｐｈｅ－Ｖａｌ－Ｃｙｓ（１１ｓｕｇａｒ）－Ｔｒｐ－Ｌｅｕ－Ｍｅｔ－Ａｓｎ－Ｔｈｒ－ＯＨ

２－７－３．ＡＧＭ－２１２－７

化学式２－５と化学式２－１０に、酢酸銀及びヨード、５０％酢酸を添加し、表１のＡＧＭ－２１２－７を製造した。

実施例２－８．ＡＧＭ－２１２－８の製造

２－８－１．化学式２－１１

実施例２－５の作製過程において１６番のＳｅｒをＣｙｓに置換し、２４番のＧｌｎをＣｙｓ（Ａｃｍ）に置換することで、化学式２－１１を製造した。

［化学式２－１１］

Ｈｉｓ－Ｓｅｒ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ｔｙｒ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｃｙｓ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ａｌａ－Ｇｌｎ－Ａｓｐ－Ｐｈｅ－Ｖａｌ－Ｃｙｓ（Ａｃｍ）－Ｔｒｐ－Ｌｅｕ－Ｍｅｔ－Ａｓｎ－Ｔｈｒ－ＯＨ

２－８－２．化学式２－１２

化学式２－１１に、１１糖類の構造をなすブロモアセチルグリカン（１１ｓｕｇａｒ）及びＮａＯＨ、リン酸緩衝液を添加し、化学式２－１２を製造した。

［化学式２－１２］

Ｈｉｓ－Ｓｅｒ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ｔｙｒ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｃｙｓ（１１ｓｕｇａｒ）－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ａｌａ－Ｇｌｎ－Ａｓｐ－Ｐｈｅ－Ｖａｌ－Ｃｙｓ（Ａｃｍ）－Ｔｒｐ－Ｌｅｕ－Ｍｅｔ－Ａｓｎ－Ｔｈｒ－ＯＨ

２－８－３．ＡＧＭ－２１２－８

化学式２－６と化学式２－１２に、酢酸銀及びヨード、５０％酢酸を添加し、表７のＡＧＭ－２１２－８を製造した。

実験例２－１．類似体のＧＬＰ－１受容体結合力確認

実施例２－１～２－６で製造した類似体のＧＬＰ－１受容体に対する結合力を調べるために、ルシフェラーゼ分析システムを用いた。ルシフェラーゼ分析システムは、細胞の特定受容体に対するリガンドの結合力を測定し、受容体の活性程度が確認できる方法である。

具体的に、線維芽細胞株であるＣＶ－１（１×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、韓国細胞株銀行）を９６ウェル白血球培養皿に２４時間培養後に、ヒトＧＬＰ－１Ｒ（ｐｃＤＮＡ３．１＿ｈＧＬＰ－１Ｒ）、ｃＡＭＰｒｅｓｐｏｎｓｅｅｌｅｍｅｎｔ（ＣＲＥ，ｐｃＤＮＡ３．１＿ｈＣＲＥ）を添加して形質転換（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）する。２４時間培養後に、無血清培地に交替し、１６時間培養後に、各類似体を６時間処理する。活性化されたＧＬＰ－１Ｒを用いてレポーター遺伝子であるルシフェラーゼの発現程度をルミノメーターで定量し、その結果を表８に示した。

表８から確認できるように、ＡＧＭ－２１２－１及びＡＧＭ－２１２－２において、Ｅｘ４に比べて約６倍以上増進したＥＣ５０レベルを確認した。この結果は、ジスルフィド結合により構成された糖鎖化したエキセナチド同種類似体がＧＬＰ－１受容体に対して、既存のＥｘ４に比べて、さらにはＡＧＭ－２１２に比べても高い活性を有することが分かる。ＡＧＭ－２１２－３では、１０倍程度減少したＥＣ５０レベルが観察され、ＡＧＭ－２１２－４、ＡＧＭ－２１２－５及びＡＧＭ－２１２－６は、ＡＧＭ－２１２－３に比べて４～５倍程度減少した活性が観察できた。この結果は、グルカゴンとエキセナチド類似体とがジスルフィド結合で結合し、ＧＬＰ－１受容体に対して活性が少し減少することが分かり、それらの異種類似体構成のうちグルカゴンの糖鎖化は、ＧＬＰ－１受容体の活性を減少させることが分かる。ただし、全ての類似体がＧＬＰ－１受容体に対してｎＭレベルの高い結合力を示し、これは、選択的且つ特異的なアゴニストの機能を有することが分かる。

その結果、ＡＧＭ－２１２は、Ｅｘ４と同等なＧＬＰ－１Ｒに対する活性を示し、１１糖類の結合したＡＧＭ－２１２類似体は、Ｅｘ４又はＡＧＭ－２１２に比べて少し減少した活性が確認された。１１ｓｕｇａｒによって各類似体の活性が減少するが、依然としてｎＭレベルの結合力を有することが分かった。

実験例２－２．類似体のインスリン分泌能確認

実施例２－１及び実施例２－２で製造した類似体のインスリン分泌能を確認するために、ラット膵島に対する類似体の糖依存性インスリン分泌能を確認した。ＳＤラット（ダムルサイエンス）８週齢の膵臓を抽出し、膵島を分離した。分離された膵島を、２８ｍＭグルコースにおける各類似体を濃度別（１０ｎＭ、１００ｎＭ）に処理した後、ラットインスリンＥＬＩＳＡキットを用いて、分泌されたインスリン量を測定し、その結果を図６及び表９に示した。

図６及び表９から確認できるように、糖鎖化エキセナチド同種類似体がエキセナチド及びＡＧＭ－２１２に比べて、濃度依存的に増進したインスリン分泌能を示していることを確認した。

実験例２－３．類似体の抗糖尿効果確認

実施例２－１～実施例２－６で製造した類似体の抗糖尿効果を確認するために、２型糖尿病マウスモデルであるＣ５７ＢＫＳ／Ｊｄｂｄｂマウス（５～７週齢、中央実験動物）で血糖降下効果を確認した。

具体的に、各類似体を２０ｎｍｏｌｅ／ｋｇで皮下投与し、０、１、２、４、６、８、１２、１８、２４、４４、４８時間経過後に、マウスの尾静脈血液を採取して血糖レベルを測定し、その結果を図７Ａ～図８Ｂに示した。

図７Ａ及び図７Ｂから確認できるように、ＡＧＭ－２１２－２が、Ｅｘ４及びＡＧＭ－２１２に比べてより増進した血糖降下程度を示していることを確認した。ＡＧＭ－２１２－１との活性結果を比較すると、ＡＧＭ－２１２－１の２４番Ｃｙｓの糖鎖化が、減少した抗糖尿効能を示すことが分かった。

図８Ａ及び図８Ｂから確認できるように、ＡＧＭ－２１２－３、ＡＧＭ－２１２－４、ＡＧＭ－２１２－５がいずれも有意の抗糖尿効能を示したが、ＡＧＭ－２１２に比べては少し減少した効能を示すことを確認した。ＡＧＭ－２１２－４、ＡＧＭ－２１２－５、ＡＧＭ－２１２－６は、ＡＧＭ－２１２－３の構成配列のうちグルカゴンの構成残基に糖が結合した構造であるが、抗糖尿効能においては各残基による大きな活性差は見られないことを確認した。ＡＧＭ－２１２－７、ＡＧＭ－２１２－８はそれぞれ、異なる残基に糖鎖化したグルカゴンとＡＧＭ－２１２とがジスルフィド結合により構成された形態であり、Ｅｘ４と類似の抗糖尿能を有することを確認した。

実験例２－４．類似体の薬動力学（ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ）試験

実施例２－１～実施例２－８で製造した類似体の薬動力学試験を実施した。野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（雄、５～６週齢、ｎ＝５）を利用、各類似体を５０ｎｍｏｌｅ／ｋｇで皮下投与後に、各０、０．５、１、２、４、８、１０、１２、１４及び２４時間に血液を抽出した。抽出した血液の血漿を分離し、Ｅｘｅｎｄｉｎ－４ＥＩＡを用いて定量分析を行った。結果分析は、Ｗｉｎｎｏｌｉｎプログラムを用いて薬物動態パラメータを決定し、その結果を図９Ａ及び図９Ｂに示した。

図９Ａ、図９Ｂ及び表１０から確認できるように、全ての類似体がＥｘ４に比べて顕著に増進した半減期を示しており、具体的に、ＡＧＭ－２１２－１、ＡＧＭ－２１２－２、ＡＧＭ－２１２－３、ＡＧＭ－２１２－４、ＡＧＭ－２１２－５、ＡＧＭ－２１２－６、ＡＧＭ－２１２－７、ＡＧＭ－２１２－８がいずれも、ＡＧＭ－２１２に比べて約１～１．５倍以上増進した半減期レベルを示すことを確認した。この結果は、エキセナチド二量体類似体がジスルフィド結合のような特定結合によって生体内安定性が大きく増進していることを示す。

実験例２－５．類似体の肥満疾病動物モデルにおける体重及び食餌調節能確認

実施例２－３で製造した類似体の肥満疾病動物モデルにおける体重減少及び食餌調節能試験評価を行った。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを対象に肥満と高血糖症状を同時に保有するように、６０％以上脂肪が含まれている高脂肪食物摂取を誘導した肥満疾病動物モデルを作製した。１６週齢の肥満疾病マウスを対象に、９週間、ＡＧＭ－２１２－３及びＡＧＭ－２１２－４を５０ｎｍｏｌｅ／ｋｇで１日１回皮下投与した。その結果を、図１０Ａ～図１０Ｃ及び表１１に示した。

図１０Ａ～図１０Ｃ及び表１１から確認できるように、３週目から、各類似体を投与した群の体重が有意に減少することを確認し、５週目から、ＡＧＭ－２１２、又はＡＧＭ－２１２とグルカゴンとの同時投与群に比べて、有意の差を示すことを確認した。実験の終了した９週目から、ＡＧＭ－２１２－３及びＡＧＭ－２１２－４を投与した群の食物摂取量も有意に減少することを確認した。

実験例２－６．類似体の肥満疾病動物モデルにおける糖耐性改善効果確認

実施例２－５の実験過程において７週に該当する期間にＡＧＭ－２１２－３による糖耐性改善効果を確認した。具体的に、実験７週目の肥満疾病同マウスを１６時間絶食させた後、各類似体を１０ｎｍｏｌｅ／ｋｇで皮下投与し、３０分後に、ブドウ糖（１．５ｇ／ｋｇ）を腹腔に投与した。１２０分間、０、１５、３０、４５、６０、９０、１２０分にマウス尾静脈から抽出した血液を用いて血糖測定器（ａｃｕ－ｃｈｅｃｋ，Ｒｏｃｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で血糖を測定し、その結果を図１１Ａ、図１１Ｂ及び表１２に示した。

図１１Ａ、図１１Ｂ及び表１２から確認できるように、各類似体を投与したマウス群の血糖が減少しており、対照群に比べて、各血糖測定時間帯に有意の血糖減少を示した。この結果は、類似体の長期投与による肥満疾病マウスの糖耐性が改善されたことを示唆する。

実験例２－７．類似体の肥満疾病動物モデルにおけるインスリン耐性改善効果確認

肥満による体内脂肪の蓄積量増加は、インスリンを生産する膵島（ｉｓｌｅｔ）のベータ細胞に対する脂肪毒性を増加させてインスリン生産量を減少させ、食後増加した血糖に対してそれを吸収、貯蔵する組織である肝、筋肉におけるインスリン消費を阻害し、高インスリン血症とインスリンの機能減少を誘導して高血糖症状を誘発する主原因であるインスリン抵抗性増加の主原因として報告されている。

実験例２－５の９週肥満疾病マウスを使用した長期投与実験８週に該当する期間にインスリン耐性実験を行い、薬物の長期投与によるインスリンに対する敏感性（ｉｎｓｕｌｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）を確認し、長期投与実験終了後にマウス血液を採取し、マウスインスリンＥＬＩＳＡを用いて血中インスリン濃度を分析し、インスリン抵抗性（ｉｎｓｕｌｉｎｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）の改善の有無を確認した。

具体的に、長期投与実験８週目の肥満疾病マウスを６時間絶食させた後、各類似体を１ｎｍｏｌ／ｋｇの濃度で皮下投与し、３０分経過後に、インスリン（１ｕｎｉｔ／ｋｇ）を腹腔投与した。０、１５、３０、６０、９０、１２０分経過後にマウスの尻尾から血液を採取し、それを血糖測定器（ａｃｃ－ｃｈｅｃｋ，Ｒｏｃｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で血糖を測定してインスリンに対する敏感性を分析し、その結果を図１２Ａ、図１２Ｂ、表１３、及び表１４に示した。

図１２Ａ、図１２Ｂ及び表１３から確認できるように、各類似体を投与した実験群の血糖が、腹腔投与したインスリンに対して高い敏感性を示し、血糖が迅速に減少することを確認した。

また、表１４から確認できるように、実験終了後、類似体を投与したマウス群の血中インスリン濃度が有意に減少していることを確認した。

これらの結果は、ＡＧＭ－２１２－３及びＡＧＭ－２１２－４の長期投与により、インスリン敏感性、高インスリン血症が改善され、肥満疾病マウスのインスリン機能の回復を誘導したことを示唆する。

実験例２－８．類似体の肥満疾病動物モデルにおける肝内脂肪の蓄積量変化確認

高脂肪食物摂取による過体重、肥満の発生は、代謝組織である肝内脂肪の蓄積及び肝細胞内脂質合成などを増加させ、代謝疾患である非アルコール性脂肪肝（ｎｏｎ－ａｌｃｏｈｏｌｉｃｆａｔｔｙｌｉｖｅｒｄｉｓｅａｓｅ）の発病率を増加させる原因と知られている。ＡＧＭ－２１２－３の長期投与による肥満疾病マウスの体重減少が、関連している代謝疾患である脂肪肝の症状緩和に影響を与えるかどうか確認するために、脂質確認染色法であるオイルレッドＯ染色（ＯｉｌｒｅｄＯｓｔａｉｎｉｎｇ）を用いて肝組織内脂質量を分析し、また、肝組織を分解して細胞内脂質貯蔵形態であるトリグリセリド（Ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ）の量を確認した。

具体的に、実験例２－５の９週長期投与実験終了後にマウス肝を摘出し、各葉（ｌｏｂｅ）別に区分し、一部は４％ホルムアルデヒドに入れて固定させた後、パラフィンブロックを製造してスライスした後、作られたスライドに、脂質確認染色試薬であるオイルレッドＯを処理して染色させた後、これを顕微鏡で観察した。肝組織内トリグリセリド量の測定は、分離した肝組織を７０ｕｍセルストレーナー（ｃｅｌｌｓｔｒａｉｎｅｒ）を用いて分解した後、１４，０００ｒｐｍで遠心分離して得られたトリグリセリドを含む上澄液を一定の比率に希釈した後、トリグリセリドＥＬＩＳＡを用いて分析し、その結果を、図１３Ａ及び図１３Ｂに示した。

図１３Ａ、図１３Ｂ及び表１５から確認できるように、ＡＧＭ－２１２－３を投与したマウスの肝内オイルレッドＯで染色された脂質範囲が減少していることが確認でき、肝組織内トリグリセリド量も有意に減少していることを確認した。

前記結果は、ＡＧＭ－２１２－３の長期投与による体重減少が、肥満疾病マウスへの高脂肪食物摂取による脂肪肝発生危険を減少させる効能を保有していることを示唆する。

実験例２－９．類似体の肥満疾病動物モデルにおける血中代謝関与因子量変化確認

血糖調節ホルモンのインスリン、食餌調節ホルモンのレプチンの血中濃度は、２型糖尿病、肥満発生時に各ホルモンに対する組織における抵抗性によって正常値よりも高くなり、このような症状をそれぞれ、高インスリン血症、高レプチン血症といい、代謝疾患診断の標識としている。コレステロール、トリグリセロイドのような脂質の血中濃度の増加、すなわち高脂血症は、過体重、肥満の代表的な症状であって、肥満度を測定する代表的な標識である。

実験例２－５におけるＡＧＭ－２１２－３の長期投与によってインスリン、レプチン抵抗性及び肥満度のような代謝異常症状の改善が誘導されたかどうかを確認するために、実験終了後にマウス血液を採取し、確認しようとする各因子に該当するＥＬＩＳＡ検査によって血中代謝関与因子量を分析し、その結果を表１３に示した。

表１４から確認できるように、ＡＧＭ－２１２－３を投与したマウス群の血中インスリン、レプチン濃度が有意に減少しており、コレステロール、トリグリセリドの脂質濃度も有意に減少している。

前記結果は、ＡＧＭ－２１２－３の投与による肥満疾病マウスの高脂肪食物摂取によって発生する代謝ホルモンに対する抵抗性及び高脂血症の改善が誘導されたことを示唆する。

実験例２－１０．類似体の肥満疾病動物モデルにおける熱エネルギー発生増進効果確認

グルカゴン及びグルカゴンレセプターの褐色脂肪組織における相互作用によって誘導される熱エネルギー発生増加は、タンパク質であるＵＣＰ－１（Ｕｎｃｏｕｐｌｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ１）のミトコンドリアにおける発現を増加させ、脂肪酸を酸化させて発生したアセチルＣｏＡの酸化、還元過程中に発生する水素の酸化的リン酸化、すなわち呼吸への使用を防ぎ、ＵＣＰ１を通過するようにし、この際に発生したエネルギーを熱として放出させることにより、体内蓄積された脂肪の消費を増加させ、体重減少に主要な働きをすることが報告された。

ＡＧＭ－２１２－３の熱エネルギー発生増進効果を確認するために、１６週齢肥満疾病マウス（ＤｉｅｔｉｎｄｕｃｅｄｏｂｅｓｅＣ５７ＢＬ／６）を対象に５週間１日１回皮下投与した後、熱エネルギー発生量、運動量、呼吸係数、直腸内温度を測定した。

具体的に、５週間長期投与したマウスを、エネルギー代謝分析機器である間接熱量測定システム（ｉｎｄｉｒｅｃｔｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｙｓｙｓｔｅｍ）と連結された代謝飼育場（Ｍｅｔａｂｏｌｉｃｃａｇｅ）で２４時間飼育しながら、呼吸によって消費される酸素量、放出される二酸化炭素量を１時間間隔で測定し、熱エネルギー発生量と体内消費される栄養素選好度が確認できる指標である呼吸係数（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｑｕｏｔｉｅｎｔ）を分析した。２４時間後、マウスは代謝飼育場から取り出してサーマルプローブ（ｔｈｅｒｍａｌｐｒｏｂｅ）を肛門から挿入して直腸温度を測定し、その結果を図１４Ａ及び図１４Ｂに示した。

図１４Ａ、図１４Ｂ及び表１６から確認できるように、１２時間間隔で測定した昼、夜の時間帯にＡＧＭ－２１２－３を投与したマウス群の熱エネルギー消費量、直腸内温度が有意に増加していることを確認した。一方、運動量は、対照群と比較して運動パターンの変化はあるが、全体運動量では有意の変化が起きていないことを確認した。また、呼吸係数は、昼、夜の時間帯にいずれも０．７に近似し、有意の減少を示した。

前記結果は、肥満疾病マウスの運動量に関係なく、類似体によるグルカゴン活性の長期的な維持によって、脂肪を消費する熱エネルギー発生が増加し、体重減少に主要に作用したことを示唆する。

実験例２－１１．類似体の肥満疾病動物モデルにおける熱エネルギー発生関与因子量変化確認

実験例２－１０におけるＡＧＭ－２１２－３の熱エネルギー発生増進機序を検証するために、５週長期投与実験後にマウス褐色脂肪組織を分離し、ウェスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ）と定量的実時間重合酵素連鎖反応（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｒｅａｌｔｉｍｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ，ｑＲＴ－ＰＣＲ）を用いて、熱エネルギー発生機序の主要因子であるＵＣＰ１、ＰＲＤＭ１６、ＣＩＤＥＡの発現量を分析した。また、４％パラホルムアルデヒドに固定された褐色脂肪組織を対象にＵＣＰ１に特異的親和性（ａｆｆｉｎｉｔｙ）を有する抗体を処理して、褐色脂肪組織内ＵＣＰ１発現量を観察し、その結果を図１５Ａ及び図１５Ｂに示した。

図１５Ａ、図１５Ｂ、表１７、及び表１８から確認できるように、類似体を投与した群の褐色脂肪組織内ＵＣＰ１タンパク質発現量、ＵＣＰ－１、ＰＲＤＭ１６、ＣＩＤＥＡｍＲＮＡ発現量はいずれも、対照群と比較して有意に増加していることを確認した。また、免疫組織化学（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ＩＨＣ）イメージでも、褐色脂肪組織内ＵＣＰ１量が対照群と対比して増加していることを確認した。

前記結果は、ＡＧＭ－２１２－３が褐色脂肪組織におけるグルカゴン受容体を活性化させ、熱エネルギー発生関与因子の発現を調節する信号伝達経路の発生を増加させたことを示唆する。

実験例２－１２．類似体の脂肪分解能確認

ＡＧＭ－２１２－３の長期投与による脂肪組織の減少及び組織内脂質合成／分解機序の主要因子の発現量変化を確認するために、前記実験例２－１１の長期投与実験終了後に、睾丸部、鼠蹊部白色脂肪組織と皮下褐色脂肪組織を分離し、各組織別の大きさを測定した後、ウェスタンブロット、ｑＲＴ－ＰＣＲを用いて各代謝因子の発現量変化を分析し、その結果を図１６Ａ～図１６Ｅに示した。

図１６Ａ～図１６Ｅから確認できるように、実験群マウスの睾丸部白色脂肪組織において脂肪分解信号伝達における重要な因子であるプロテインキナーゼＡ（ＰｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅＡ）と脂質分解酵素であるＨＳＬのタンパク質発現が有意に増加していることを、ウェスタンブロットで確認した。

また、脂質分解酵素であるＡＴＧＬ、ＨＳＬと脂肪分解作用の主要因子であるペリリピン（Ｐｅｒｉｌｉｐｉｎ）のｍＲＮＡ発現量が有意に増加しており、脂質合成及び細胞内脂肪酸吸収に関与するＣＤ３６、ＰＰＡＲｒ、Ｃ／ＥＢＰａ、ＦＡＢＰ４のｍＲＮＡ発現量は有意に減少していることを、ｑＲＴ－ＰＣＲで確認した。

なお、実験群マウスの鼠蹊部白色脂肪組織内脂質合成信号伝達の主要因子であるＦＡＳのタンパク質発現量とＳＣＤ、ＡＣＡＣＡ１のｍＲＮＡ発現量は減少しているのに対し、脂肪酸のベータ酸化（Ｂｅｔａ－ｏｘｉｄａｔｉｏｎ）信号伝達の主要因子であるＡＣＳＬ１のタンパク質発現量、そしてＣＰＴ１ａ、ＣＰＴ２、ＣＡＣＴ、ＰＧＣ－１ａのタンパク質、ｍＲＮＡ発現量が有意に増加していることを、ウェスタンブロット、ｑＲＴ－ＰＣＲで確認した。

実験例２－１３．類似体の筋肉細胞内脂肪分解能及び熱エネルギー発生効果確認

骨格筋は、基礎代謝率の主な原因になる器官であり、褐色脂肪と同じ機序によって熱エネルギー発生を増加させ、体重調節に重要な役割を担当するものと報告されている。

そこで、ＡＧＭ－２１２－３が筋肉における熱エネルギー発生を増加させ得るかどうかの機能検証のために、根源細胞株であるＣ２Ｃ１２を対象に、脂質合成、分解、脂肪酸輸送信号伝達に関連した代謝因子の発現量変化を、ウェスタンブロット、ｑＲＴ－ＰＣＲによって分析し、その結果を図１７Ａ～図１７Ｃに示した。

図１７Ａ～図１７Ｃから確認できるように、ウェスタンブロットによれば、Ｃ２Ｃ１２細胞内熱エネルギー発生信号伝達経路の主要信号伝達子であるＡＭＰＫのリン酸化程度が、脂肪酸であるパルミチン酸（０．７５ｍＭ）を処理した場合に、対照群と比較して減少する傾向を示すが、類似体の濃度別処理（１０ｎＭ、２０ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ）時に、濃度依存的にＡＭＰＫのリン酸化程度が有意に増加した。

また、ｑＲＴ－ＰＣＲでは、Ｃ２Ｃ１２細胞内脂肪酸代謝及びミトコンドリア基質内脂肪酸輸送関与因子（ＡＣＳＬ１、ＣＰＴ１ａ、ＣＰＴ２、ＣＡＣＴ）と脂肪酸のベータ酸化信号伝達因子（Ａｃｏｘ１、ＰＧＣ－１ａ、ＦｏｘＡ２）のｍＲＮＡ発現量が、処理した接合体の濃度依存的に有意に増加しているのに対し、脂質合成信号伝達因子（ＦＡＳ、ＳＲＥＢＰ－１ｃ）のｍＲＮＡ発現量は、接合体の濃度依存的に減少していることを確認した。

前記結果は、ＡＧＭ－２１２－３が褐色脂肪と同様に、骨格筋においても熱エネルギー発生を増加させ、脂質合成を阻害することができ、有用な体重減少能を保有していることを示唆する。

本発明は、糖鎖化エキセナチド類似体及びその用途、及びエキセナチド二量体類似体及びその用途に関する。

Claims

エキセナチドのアミノ酸配列のＣ末端の７～９個のアミノ酸が欠失し、カプリン酸が接合したエキセナチド類似体から形成される第１の単量体；及び
エキセナチドのアミノ酸配列のＣ末端の７～９個のアミノ酸が欠失し、カプリン酸が接合したエキセナチド類似体、又はグルカゴンから形成される第２の単量体；を含み、
前記第１の単量体及び前記第２の単量体が結合して二量体類似体を形成しており、
前記カプリン酸は、アミノ酸が欠失したエキセナチドのＣ末端にリジンリンカーを介して接合したものであり、
前記エキセナチドのアミノ酸配列は、
１）配列番号１のアミノ酸配列；
２）配列番号１のアミノ酸配列の１７番目、２４番目及び２８番目の少なくとも１つがＣｙｓに置換されたアミノ酸配列；
３）配列番号１のアミノ酸配列の２４番目及び２８番目の少なくとも１つがＣｙｓに置換され、前記置換されたアミノ酸に１１糖が結合したアミノ酸配列；又は
４）配列番号１のアミノ酸配列の２８番目に１１糖が結合したアミノ酸配列であり、
前記グルカゴンのアミノ酸配列は、
１）配列番号２のアミノ酸配列；
２）配列番号２のアミノ酸配列の１６番目及び２４番目の少なくとも１つがＣｙｓ又はＡｓｎに置換されたアミノ酸配列；又は
３）配列番号２のアミノ酸配列の１６番目及び２４番目の少なくとも１つがＣｙｓ又はＡｓｎに置換され、前記置換されたアミノ酸に１１糖が結合したアミノ酸配列であり、
前記第２の単量体がエキセナチド類似体である場合に、前記第１の単量体及び前記第２の単量体の結合は、ジスルフィド結合により生成され、
前記第２の単量体がグルカゴンである場合に、前記第１の単量体及び前記第２の単量体の結合は、前記第１の単量体のＣ末端にＬｙｓ残基を付加し、その側鎖にグルカゴンから形成される前記第２の単量体を結合することにより、又はジスルフィド結合により生成される、エキセナチド二量体類似体。
請求項１に記載のエキセナチド二量体類似体を含む、糖尿病の改善、予防又は治療用の薬剤学的組成物。
請求項１に記載のエキセナチド二量体類似体を含む、肥満の改善、予防又は治療用の薬剤学的組成物。
請求項１に記載のエキセナチド二量体類似体を含む、糖尿病の改善又は緩和用の食品組成物。
請求項１に記載のエキセナチド二量体類似体を含む、肥満の改善又は緩和用の食品組成物。
請求項１に記載のエキセナチド二量体類似体を含む、食欲抑制用の食品組成物。