CN106661096B - 新的艾塞那肽类似物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及新的艾塞那肽类似物及其用途，上述艾塞那肽类似物为缺失艾塞那肽(exenatide)的氨基酸序列的C‑末端的1个至15个氨基酸，并与脂肪酸相接合(conjugation)的艾塞那肽类似物。与以往的艾塞那肽及作为抗糖尿病药物的利拉鲁肽相比较，本发明呈现出几乎相同水准的抗糖尿效果，并提供可以节约艾塞那肽的制备成本的短长度的艾塞那肽。

Description

新的艾塞那肽类似物及其用途
技术领域
本专利申请对2014年03月21日向韩国专利厅提出的韩国专利申请第10-2014-0033712号主张优先权，上述专利申请的公开事项作为参照插入于本说明书中。
本发明涉及新的艾塞那肽类似物及其用途。
背景技术
艾塞那肽(Exenatide)作为从栖息于美国西南部的毒蜥(Heloderma suspectum)的唾液腺分离的胰高血糖素样肽-1(GLP-1，glucagon-like Peptide-1)的功能性类似物(analog)，被使用为Ⅱ型(TypeⅡ)糖尿病治疗剂。学术名称为“艾塞那肽-4(Exendin-4)”的艾塞那肽作为由39个氨基酸组成的生理活性肽，存在于人的活体内，但与胰高血糖素样肽-1相比，有53％的氨基酸类似，并且，对二肽基肽酶-4(DPP-4，Dipetidyl peptidase-4)之类的分解酶稳定，因此，与胰高血糖素样肽-1相比，体内半衰期比较长。
艾塞那肽每天服用两次，早晚就餐之前服用。由于艾塞那肽通过肾脏排出，因此，并不推荐使用于具有严重的肾功能损伤或末期肾疾病的患者。由于艾塞那肽的排泄并不依赖于肝功能，因此，并不与通过肝来代谢的药物具有相互作用。相反，由于艾塞那肽对胃运动(gastric motility)产生影响，因此，可以与吸收相关地与其他药物产生相互作用。
并且，在艾塞那肽的合成过程中，存在需要过量的试剂和材料费用的缺点。并且，由于反应步骤多，需要按各不同的步骤游离中间体，并存在发生同分异构体的可能性，因而并不容易纯化。
如上所述，存在需要改善以往艾塞那肽的如下缺点的问题：由于艾塞那肽的短的半衰期而需要一天给药两次，并具有高昂的制备成分。因此，对改善艾塞那肽的稳定性和功效，并节约制备成本的方法的研究对于医药产业领域来说是非常重要的技术。
在本说明书全文中，参照了多篇论文及专利文献，并表示了它们的引用。所引用的论文及专利文献的公开内容全部插入于本说明书作为参照，从而更加明确说明本发明所属的技术领域的水平及本发明的内容。
发明内容
要解决的问题
本发明人为了改善作为胰高血糖素样肽-1(Glucagon-like Peptide-1)的功能性类似物来使用于糖尿病治疗剂的艾塞那肽的功效和稳定性、制备方法而付出了努力。结果，研发出了具有与以往的艾塞那肽相同的功效，并对肽分解酶呈现出高的稳定性的短脂肪酸艾塞那肽类似物，从而完成了本发明。
因此，本发明的目的在于，提供艾塞那肽类似物。
本发明的再一目的在于，提供改善、预防或治疗糖尿用药剂学组合物。
本发明的另一目的在于，提供改善、预防或治疗肥胖用药剂学组合物。
本发明的还有一目的在于，提供抑制食欲用药剂学组合物。
本发明的其他目的及优点将通过发明内容、发明要求保护范围及附图来更加明确。
解决问题的方案
根据本发明的一实施方式，本发明提供艾塞那肽类似物，在上述艾塞那肽类似物中，缺失艾塞那肽的氨基酸序列的C-末端的1个至15个氨基酸，并与脂肪酸相接合(conjugation)。
本发明人为了改善作为胰高血糖素样肽-1的功能性类似物来使用于糖尿病治疗剂的艾塞那肽的功效和稳定性、制备方法而付出了努力。结果，研发出了具有与以往的艾塞那肽相同的功效，并对肽分解酶呈现出高的稳定性的短脂肪酸艾塞那肽类似物。
上述艾塞那肽作为胰高血糖素样肽-1受体兴奋剂，属于对通过二肽基肽酶-IV(DPP-IV)来迅速分解的胰高血糖素样肽-1进行模仿的类似物(GLP-1metrics)，上述艾塞那肽为不会因二肽基肽酶-IV而迅速分解，并促进糖依赖性胰岛素的分泌，抑制胰高血糖素的分泌、胃排空及食欲，并呈现出产生β细胞保护效果的胰高血糖素样肽-1的效果的药物。
在本发明的艾塞那肽类似物中，脂肪酸可以与缺失氨基酸的艾塞那肽的多个位置相接合。根据本发明的一实例，脂肪酸与缺失氨基酸的艾塞那肽的赖氨酸(Lys)残基、N-末端或C-末端相接合。例如，脂肪酸可以在缺失氨基酸的艾塞那肽的内部序列(internalsequence)中与赖氨酸残基相接合，并可以与缺失氨基酸的艾塞那肽的N-末端或C-末端相接合。
更具体地，脂肪酸与缺失氨基酸的艾塞那肽的C-末端相接合。
脂肪酸与缺失氨基酸的艾塞那肽相接合的情况既包括直接接合，又包括连接物(Linker)的间接结合。可以使存在于脂肪酸的羧基等官能团和缺失氨基酸的艾塞那肽的官能团(例如，-NH2)发生反应，来形成共价键合，从而形成缺失的艾塞那肽-脂肪酸共轭。根据间接结合方式，在本发明所属技术领域中，由通常用作连接物的化合物介导，来形成缺失的艾塞那肽-脂肪酸共轭。
利用于本发明的连接物可以使用在本发明所属技术领域中用作连接物的任何化合物，并可以根据存在于所缺失的艾塞那肽中的官能团的种类来选择适合的连接物。例如，连接物包含碘代乙酸琥珀酰亚胺酯(N-succinimidyl iodoacetate)、N-羟基琥珀酰亚胺基溴(N-Hydroxysuccinimidyl Bromoacetate)、m-马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺脂(m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester)、m-马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基磺基丁二酰亚胺酯(m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysulfosuccinimide ester)、N-丁酰氧基马来酰亚胺基琥珀酰胺酯(N-Maleimidobutyryloxysuccinamide ester)及赖氨酸，但并不局限于此。
具体地，在缺失氨基酸的艾塞那肽的C-末端还结合有连接物，上述脂肪酸与结合在上述C-末端的连接物相接合。例如，可在缺失氨基酸的艾塞那肽的C-末端结合有赖氨酸作为连接物，并上述赖氨酸可与脂肪酸相接合。在这种情况下，可以由所追加的上述赖氨酸的-NH2官能团和脂肪酸的羧基发生反应，来形成共轭。
根据本发明的一实例，在本发明中，艾塞那肽包含(i)包含序列表中序列1的氨基酸序列的艾塞那肽或(ii)与上述艾塞那肽呈现出类似的活性，并与序列表中序列1的氨基酸序列呈现出最少80％的序列同源性，具体地，呈现出90％序列同源性，更具体地，呈现出95％的序列同源性的艾塞那肽类似物。更具体地，在本发明中，艾塞那肽为包含序列表中序列1的氨基酸序列的艾塞那肽，更具体地，为包含序列表中序列1的氨基酸序列的艾塞那肽。
在本发明的艾塞那肽类似物中，适合的脂肪酸包含本发明所属技术领域公知的多种饱和脂肪酸及不饱和脂肪酸。
具体地，适合本发明的脂肪酸为具有C3至C36的碳原子数的脂肪酸。例如，适合本发明的脂肪酸为选自由丙酸(propionic acid)、丁酸(butyric acid)、戊酸(valericacid)、己酸(caproic acid)、庚酸(enanthic acid)、辛酸(caprylic acid)、壬酸(pelargonic acid)、癸酸(capric acid)、十一酸(undecylic acid)、月桂酸(lauricacid)、十三酸(tridecylic acid)、肉豆蔻酸(myristic acid)、十五酸(pentadecylicacid)、棕榈酸(palmitic acid)、十七烷酸(margaric acid)、硬脂酸(stearic acid)、十九烷酸(nonadecylic acid)、花生酸(arachidic acid)、二十酸(heneicosylic acid)、山嵛酸(behenic acid)、二十二酸(tricosylic acid)、焦油酸(lignoceric acid)、二十五酸(pentacosylic acid)、蜡酸(cerotic acid)、二十七酸(heptacosylic acid)、褐煤酸(montanic acid)、二十九酸(nonacosylic acid)、蜂花酸(melissic acid)、三十一酸(henatriacontylic acid)、虫漆蜡酸(lacceroic acid)、叶虱酸(psyllic acid)、三十四酸(gheddic acid)、三十五酸(ceroplastic acid)及三十六酸(hexatriacontylic acid)组成的组中的脂肪酸。
更具体地，适合本发明的脂肪酸为具有C6至C16的碳原子数的脂肪酸，更具体地，为戊酸、辛酸、壬酸、癸酸、十一酸、月桂酸、十三酸、肉豆蔻酸、十五酸或棕榈酸，进而具体地，为辛酸、壬酸、癸酸、十一酸、月桂酸、十三酸、肉豆蔻酸、十五酸或棕榈酸，尤其具体地，为辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸或棕榈酸。
例如，可以被制成在缺失9个C-末端的氨基酸残基的艾塞那肽的C-末端接合有戊酸、辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸或棕榈酸的本发明的艾塞那肽类似物。并且，可以被制成在缺失7个C-末端的氨基酸残基的艾塞那肽的C-末端接合戊酸、辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸或棕榈酸的本发明的艾塞那肽类似物。
根据本发明的一实例，本发明的艾塞那肽类似物为在缺失9个C-末端的氨基酸残基的艾塞那肽的C-末端接合戊酸、辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸或棕榈酸而成的，更具体地，在缺失9个C-末端的氨基酸残基的艾塞那肽的C-末端结合戊酸、辛酸或癸酸而成的。在这种情况下，脂肪酸可通过在C-末端具有氨基的连接物(例如，赖氨酸连接物)来相结合。
根据本发明的一实例，本发明的艾塞那肽类似物可以为在缺失7个C-末端的氨基酸残基的艾塞那肽的C-末端接合戊酸、辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸或棕榈酸而成的，更具体地，在缺失7个C-末端的氨基酸残基的艾塞那肽的C-末端结合戊酸、辛酸或癸酸而成的。在这种情况下，脂肪酸可通过在C-末端具有氨基的连接物(例如，赖氨酸连接物)来相结合。
根据本发明的一实例，本发明的艾塞那肽类似物是缺失C-末端的1个至10个(更具体地，4个至10个，进而具体地，7个至9个)氨基酸的。
根据本发明的一实例，本发明的艾塞那肽类似物还包含所接合的壳聚糖。壳聚糖可以与所缺失的艾塞那肽的多种位置相接合。在所缺失的艾塞那肽接合壳聚糖的情况既包括直接接合，又包括连接物的间接结合。
本发明的艾塞那肽类似物具有与以往的艾塞那肽几乎相同的稳定性及功效。
根据本发明的一实例，上述艾塞那肽类似物对作为肽分解酶的NEP24.11呈现出与以往的艾塞那肽几乎相同水准的稳定性。
根据本发明的再一实例，上述艾塞那肽类似物在糖尿模型小鼠中呈现出与以往的艾塞那肽几乎相同水准的糖耐性。
根据本发明的另一实例，上述艾塞那肽类似物在糖尿模型小鼠中呈现出比以往的艾塞那肽更加优秀的降血糖效果。
与作为抗糖尿病药物的利拉鲁肽(liraglutide)相比，本发明的这种效果在降血糖方面呈现出更为优秀和持续的效果。
根据本发明的再一实施方式，本发明提供包含本发明的艾塞那肽类似物作为有效成分的改善、预防或治疗糖尿用药剂学组合物。
根据本发明的另一实施方式，本发明提供改善、预防或治疗糖尿的方法，上述改善、预防或治疗糖尿的方法包括向对象(subject)给药药剂学组合物的步骤，上述药剂学组合物包含本发明的艾塞那肽类似物作为有效成分。
包含本发明的艾塞那肽类似物作为有效成分的药剂学组合物可以改善、预防或治疗糖尿。
本说明书所使用的术语“糖尿”意味着以导致葡萄糖-不耐受(intolerance)的胰岛素的相对不足或绝对不足为特征的慢性疾病。术语“糖尿”包括所用种类的糖尿病，例如，包括一型糖尿、二型糖尿及遗传性糖尿。一型糖尿作为胰岛素依赖性糖尿病，主要由β-细胞的破坏所导致。二型糖尿作为胰岛素非依赖性糖尿病，由就餐后的不充分的胰岛素的分泌所导致或由胰岛素耐性所导致。
根据本发明的一实例，上述组合物适用于二型糖尿的改善、预防或治疗。
根据本发明的还有一实施方式，本发明提供包含本发明的艾塞那肽类似物作为有效成分的改善、预防或治疗肥胖用药剂学组合物。
根据本发明的又一实施方式，本发明提供改善、预防或治疗肥胖的方法，上述改善、预防或治疗肥胖的方法包括向对象给药药剂学组合物的步骤，上述药剂学组合物包含本发明的艾塞那肽类似物作为有效成分。
包含本发明的艾塞那肽类似物作为有效成分的药剂学组合物可以改善、预防或治疗肥胖。在本说明书所使用的术语“肥胖”意味着以导致健康异常的程度在体内堆积脂肪组织的状态。
根据本发明的又一实施方式，本发明提供包含本发明的艾塞那肽类似物作为有效成分的抑制食欲用药剂学组合物。
根据本发明的又一实施方式，本发明提供抑制食欲的方法，上述抑制食欲的方法包括向对象给药药剂学组合物的步骤，上述药剂学组合物包含本发明的艾塞那肽类似物作为有效成分。
本说明书所使用的术语“抑制食欲”意味着想要摄取食物的欲望得到抑制。
虽然本发明的药剂学组合物主要以非口服给药方式向人体给药，但有趣的是，如以下实施例所证实，本发明的艾塞那肽类似物本身可以进行口服给药，并发挥治疗功效。根据本发明的一实例，本发明的药剂学组合物为口服给药用组合物。
根据本发明的一实例，本发明的药剂学组合物还包含壳聚糖，上述壳聚糖混合(mix)于药剂学组合物且不与艾塞那肽类似物共价键合。
具有使胰岛素与壳聚糖共价键合来使胰岛素的口服给药变得可能的现有技术(参照：韩国专利第0766820号)。但是，根据这种现有技术，需要使壳聚糖与胰岛素共价键合，而这种共价键合过程在医药品的生产过程中，可在品质管理方面引起大的问题。并且，在这种现有技术中并未提及艾塞那肽。
如在以下实施例中所证实，在包含本发明的艾塞那肽类似物的组合物中简单混合壳聚糖的情况下，很好地发挥基于艾塞那肽类似物的口服给药的功效。这种艾塞那肽类似物的口服给药结果为非常有趣的结果。
在本说明书中，术语“包含…作为有效成分”意味着包含实现以下艾塞那肽衍生物的功效或活性所需的充分的量。本发明的组合物所包含的量的上限可以由本领域技术人员在适当的范围内选择并实施。
在本发明的组合物被制成药剂学组合物的情况下，本发明的药剂学组合物包含药剂学上允许的载体。本发明的药剂学组合物所包含的药剂学上允许的载体作为通常利用于制剂的组合物，虽然包含乳酸、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯树胶、磷酸钙、海藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁及矿物质油等，但并不局限于此。除了上述成分之外，本发明的药剂学组合物还可以包含润滑剂、润湿剂、甜味剂、香味剂、乳化剂、悬浮剂、保鲜剂及体内吸收促进剂等。适合的药剂学上允许的载体及制剂详细记载于雷明顿药物科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)(19th ed.，1995)。
本发明的药剂学组合物可以进行口服或非口服给药。
本发明的药剂学组合物的适合的给药量可根据制剂化方法、给药方式、患者的年龄、体重、性别、病理状态、食物、给药时间、给药途径、排泄速度及反应感应性等因素来进行多种处方。以成人为准，本发明的药剂学组合物的通常的给药量为0.001μg/kg至100mg/kg范围。
本发明的药剂学组合物可根据由该发明所属技术领域的普通技术人员容易地实施的方法来利用药剂学上允许的载体和/或赋形剂实现制剂化，从而能够以单位容量形态制备或内入于多容量容器内来制备。此时，剂型也可以为油或水性介质中的溶液、悬浮液、糖浆或乳化液形态或浸膏剂、散剂、粉末剂、颗粒剂、片剂或胶囊剂形态，并还可以包含分散剂或稳定剂。
根据本发明的又一实施方式，本发明提供包含(a)艾塞那肽或其类似物及(b)壳聚糖的口服给药用改善、预防或治疗糖尿或肥胖用药剂学组合物。
本发明的药剂学组合物为可以进行口服给药的组合物。
在本发明的药剂学组合物中，艾塞那肽类似物包含本发明所属技术领域公知的多种类似物。根据本发明的一实例，上述艾塞那肽类似物为上述本发明的艾塞那肽类似物。
根据本发明的一实例，上述壳聚糖为与艾塞那肽或其类似物相接合(conjugation)或混合于药剂学组合物的壳聚糖。
发明的效果
概括本发明的特征及优点如下：
(a)本发明提供艾塞那肽类似物、改善糖尿或肥胖的预防或治疗用药剂学组合物及抑制食欲用药剂学组合物。
(b)与以往的艾塞那肽及作为抗糖尿病药物的利拉鲁肽相比，本发明呈现出几乎相同水准的抗糖尿效果。
(c)本发明提供可节约以往的艾塞那肽的制备成本的短长度的艾塞那肽。
附图说明
图1表示对短艾塞那肽-4类似物进行NEP24.11处理24小时后的剩余肽的比率。
图2a及图2b表示对胰高血糖素样肽-1受体的活性及与Ex-4结构之间的关联性进行比较分析的圆二色(CD)光谱。
图3a至图3c表示对ex4(1-30)-脂肪酸共轭进行NEP24.11处理24小时后的剩余肽的比率。
图4表示对ex4(1-32)-脂肪酸共轭进行NEP24.11处理24小时后的剩余肽的比率。
图5表示短艾塞那肽-4-脂肪酸共轭的胰岛素分泌程度。
图6表示脂肪细胞的短艾塞那肽-4-脂肪酸共轭的脂肪水解(lypolysis)程度。
图7a及图7b示出对4种短艾塞那肽-4-脂肪酸共轭的活体内糖耐量功效进行确认的结果。
图8a及图8b示出对4种短艾塞那肽-4-脂肪酸共轭的24小时活体内抗糖尿功效进行确认的结果。
图9a及图9b示出对4种短艾塞那肽-4-脂肪酸共轭的24小时浓度依赖性抗糖尿功效进行确认的结果。
图10a及图10b作为利拉鲁肽及短艾塞那肽-4-脂肪酸共轭的功效比较实验，示出测血糖第1天的结果。
图11a及图11b作为利拉鲁肽及短艾塞那肽-4-脂肪酸共轭的功效比较实验，示出测血糖第8天的结果。
图12a及图12b作为利拉鲁肽及短艾塞那肽-4-脂肪酸共轭的功效比较实验，示出测血糖第15天的结果。
图13a及图13b示出利用糖尿模型小鼠，并基于Ex4(1-32)K(Cap)的皮下给药的降血糖功效。
图14a及图14b示出利用糖尿模型小鼠，并基于Ex4(1-32)K(Cap)的皮下给药的葡萄糖耐性。
图15a及图15b示出利用糖尿模型小鼠，并基于Ex4(1-32)K(Cap)的皮下给药的长时间降血糖功效。
图16a及图16b与艾塞那肽及利拉鲁肽相比较来示出利用糖尿模型小鼠，并基于Ex4(1-32)K(Cap)的皮下给药的葡萄糖耐性。
图17a及图17b与艾塞那肽及利拉鲁肽相比较来示出利用糖尿模型小鼠，并基于Ex4(1-32)K(Cap)的皮下给药的降血糖功效。
图18a及图18b与艾塞那肽及利拉鲁肽相比较来示出利用糖尿模型小鼠，并基于Ex4(1-32)K(Cap)的口服给药的葡萄糖耐性。
图19a及图19b示出利用糖尿模型小鼠，并基于Ex4(1-32)K(Cap)的口服给药的降血糖功效。
图20a及图20b与二甲双胍(Metformin)及磷酸西他列汀(Sitagliptin)相比较来示出利用糖尿模型小鼠，并基于Ex4(1-32)K(Cap)的口服给药的降血糖功效。
图21a及图21b与二甲双胍相比较来示出利用糖尿模型小鼠，并基于LMWC-Ex4(1-32)K(Cap)的口服给药的葡萄糖耐性。
图22a及图22b与二甲双胍及磷酸西他列汀相比较来示出利用糖尿模型小鼠，并基于LMWC-Ex4(1-32)K(Cap)的口服给药的葡萄糖耐性。
图23a及图23b与二甲双胍相比较来示出利用糖尿模型小鼠，并对LMWC-Ex4(1-32)K(Cap)或Ex4(1-32)K(Cap)及低分子量壳聚糖(LMWC)进行混合后基于口服给药的降血糖功效。
图24a及图24b示出利用糖尿模型小鼠，并基于Ex4(1-32)K(Cap)及低分子量壳聚糖(100μg/kg、200μg/kg、300μg/kg或500μg/kg)的混合口服给药的降血糖功效。
图25a及图25b示出利用糖尿模型小鼠，并基于Ex4(1-32)K(Cap)及低分子量壳聚糖(100μg/kg或50μg/kg)的混合口服给药的降血糖功效。
图26a及图26b示出利用糖尿模型小鼠，并基于Ex4(1-32)K(Cap)单一给药(100μg/kg)及Ex4(1-32)K(Cap)(25μg/kg、50μg/kg或100μg/kg)和低分子量壳聚糖(50μg/kg或100μg/kg)的混合口服给药的葡萄糖耐性。
图27a及图27b示出利用糖尿模型小鼠，并分别混合40μg/kg、100μg/kg或400μg/kg的艾塞那肽及低分子量壳聚糖后，基于口服给药的降血糖功效。
图28a及图28b示出利用糖尿模型小鼠，并基于艾塞那肽(100μg/kg)及低分子量壳聚糖(50或100μg/kg)的混合口服给药的降血糖功效。
图29a及图29b示出利用糖尿模型小鼠，并基于并基于艾塞那肽单一给药(100μg/kg)及并基于艾塞那肽(100μg/kg)、低分子量壳聚糖(50μg/kg)的混合口服给药的降血糖功效。
具体实施方式
以下，通过实施例对本发明进行更加详细的说明。这些实施例仅用于更加具体地说明本发明，根据本发明的要旨，本发明的范围并不局限于这些实施例，这对于本发明所属技术领域的普通技术人员而言使显而易见的。
实施例
术语
在本说明书中，术语“艾塞那肽”为从栖息于美国西南部的毒蜥的唾液腺分离的胰高血糖素样肽-1的功能性类似物。学术名称为“艾塞那肽-4”的艾塞那肽作为由39个氨基酸组成的生理活性肽，与存在于人的活体内的胰高血糖素样肽-1相比，具有53％的氨基酸类似性。在以下实施例中被表示为Ex4的为艾塞那肽。
在本说明书中，术语“短艾塞那肽-4类似物”意味着使艾塞那肽-4的C-末端的序列变得不同的形态。详细内容记载于实施例2。
在本说明书中，术语“Ex4(1-30)K-脂肪酸”为与艾塞那肽的序列表中的第1～30位为止相同，并在C-末端接合K(赖氨酸)的形态，在上述K(赖氨酸)的侧链结合有脂肪酸。
在本说明书中，只要没有特殊标注，用于指定氨基酸及保护基的缩写基于IUPAC-IUB的生物化学命名委员会(Commission of Biochemical Nomenclature)所推荐的术语(Biochemistry，11:1726-1732(1972))。
本说明书所使用的保护基的缩写如下：
Thr：苏氨酸(Threonine)
Glu：谷氨酸(Glutamic acid)
Ser：丝氨酸(Serine)
Arg：精氨酸(Arginine)
Pro：脯氨酸(Proline)
Leu：亮氨酸(Leucine)
His：组氨酸(Histidine)
Ala：丙氨酸(Alanine)
Gly：甘氨酸(Glycine)
Phe：苯丙氨酸(Phenylalanine)
Asp：天冬氨酸(Aspartic acid)
Lys：赖氨酸(Lysine)
Gln：谷氨酰胺(Glutamine)
Met：蛋氨酸(Methionine)
Ala：丙氨酸(Alanine)
Val：缬氨酸(Valine)
Ile：异亮氨酸(Isoleucine)
Trp：色氨酸(Triptophan)
Asn：天门冬酰胺(Asparagine)
Boc：叔丁氧羰基(t-butyloxycarbonyl)
tBu：叔丁基(t-butyl)
Fmoc：9-芴甲氧羰基(9-Fluorenylmethyloxycarbonyl)
Trt：三苯甲基(triphenylmetyl)
dde：1-(4,4-二甲基-2,6-二氧环己烯)乙酯(1-(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohexylidene)ethyl)
在本说明书全文中，在没有单独提及的情况下，为了表示特定物质的浓度而使用的“％”在固体/固体中为(重量/重量)％，在固体/液体中为(重量/体积)％，在液体/液体中为(体积/体积)％
【实施例1：Ex4(1-32)K-Cap的制备方法】
本发明的Ex4(1-32)K-Cap包含具有在从以下化学式Ⅰ的艾塞那肽的N-末端位于第32位的丝氨酸的序列中追加赖氨酸-脂肪酸(Lysine-fatty acid)的33个氨基酸的肽。
化学式Ⅰ：
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser
为了制备本发明的Ex4(1-32)K-Cap，在三苯甲基树脂(trityl resin)积累Fmoc-Lys(dde)及二甲基甲酰胺(DMF，Dimethylformamide)来制备Fmoc-Ser(tBu)-三苯甲基树脂。在上述Fmoc-Ser(tBu)-三苯甲基树脂中添加包含20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺(N,N-Dimethylformamide；DMF)及包含Fmoc-Pro-OH及羟基苯并三唑(HOBt，hydroxy-benzotriazole)的N,N-二甲基甲酰胺，从而制备Fmoc-Gly-Lys(dde)-三苯甲基树脂。然后，在上述Fmoc-Gly-Lys(dde)-三苯甲基树脂添加包含有20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺，之后，从Fmoc-Gly-OH至Boc-His(Trt)-OH循环共计31次，并实施/并行实施氨基酸的耦合(coupling)，来制备化学式2的肽。
化学式2：
Boc-His(Trt)-Gly-Glu(tBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(tBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Met-Glu(tBu)-Glu(tBu)-Glu(tBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(tBu)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser-Lys(dde)-三苯甲基树脂
在上述化学式2的肽中添加包含2％的NH2NH2·H2O的N,N-二甲基甲酰胺，并去除dde，来制备化学式3的肽。
化学式3：
Boc-His(Trt)-Gly-Glu(tBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(tBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Met-Glu(tBu)-Glu(tBu)-Glu(tBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(tBu)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser-Lys-三苯甲基树脂
在上述化学式3的肽中添加包含癸酸(Capric acid)、羟基苯并三唑及DIC的N,N-二甲基甲酰胺，并实施耦合，从而制备化学式4的肽。
化学式4：
Boc-His(Trt)-Gly-Glu(tBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(tBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Met-Glu(tBu)-Glu(tBu)-Glu(tBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(tBu)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser-Lys(癸酸)-三苯甲基树脂
在上述化学式4的肽中切割保护基后实施纯化，从而制备化学式5的肽。
化学式5：
H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Lys(癸酸)-OH(TFA形态)
对上述化学式5的肽实施盐交换[TFA(trifluoroacetic acid)to AcOH]来制备以下化学式6的Ex4(1-32)K-Cap。
化学式6：
H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Lys(癸酸)-OH(AcOH形态)
【实施例2：短艾塞那肽-4类似物的制备及效果分析】
【短艾塞那肽-4类似物的制备及对NEP24.11的稳定性试验】
艾塞那肽-4的C末端具有胰高血糖素样肽-1不具有的9-AA C末端序列(nine-AAC-terminal sequence)，因此，并不容易分解于NEP24.11等中性肽链内切酶(neutralendopeptidase)(参照：Doyle ME et al.，Regulatory Peptides Volume114，Issues 2–3，15July 2003，Pages 153–158)。
为了对作为肽分解酶的NEP24.11进行稳定性试验，使以往的艾塞那肽-4的C-末端的序列变得不同，并通过以下方法制备多种短艾塞那肽-4(short-exenatide-4)类似物。
【(a)Ex4(1-29)的制备方法】
为了制备Ex4(1-29)，在三苯甲基树脂积累Fmoc-Gly-OH、N,N-二异丙基乙胺(DIEA，N,N-Diisopropylethylamine)及二甲基甲酰胺来制备Fmoc-Gly-三苯甲基树脂。在上述Fmoc-Gly-三苯甲基树脂添加包含20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺及包含Fmoc-Asn(Trt)-OH及羟基苯并三唑的N,N-二甲基甲酰胺来制备Fmoc-Asn(Trt)-Gly-三苯甲基树脂。然后，在上述Fmoc-Asn(Trt)-Gly-三苯甲基树脂添加包含20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺，之后，从Fmoc-Lys(Boc)-OH至Boc-His(Trt)-OH循环共计29次，并实施/并行实施氨基酸的耦合，来制备Ex4(1-29)。
Boc-His(Trt)-Gly-Glu(tBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(tBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Met-Glu(tBu)-Glu(tBu)-Glu(tBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(tBu)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-三苯甲基树脂
【(b)Ex4(1-30)的制备方法】
为了制备Ex4(1-30)，在三苯甲基树脂积累Fmoc-Gly-OH、N,N-二异丙基乙胺及二甲基甲酰胺来制备Fmoc-Gly-三苯甲基树脂。在上述Fmoc-Gly-三苯甲基树脂添加包含20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺及包含Fmoc-Gly-OH及羟基苯并三唑的N,N-二甲基甲酰胺来制备Fmoc-Gly-Gly-三苯甲基树脂。然后，在上述Fmoc-Gly-Gly-三苯甲基树脂添加包含20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺，之后，从Fmoc-Asn(Trt)-OH至Boc-His(Trt)-OH循环共计30次，并实施/并行实施氨基酸的耦合，来制备Ex4(1-30)。
Boc-His(Trt)-Gly-Glu(tBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(tBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Met-Glu(tBu)-Glu(tBu)-Glu(tBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(tBu)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-三苯甲基树脂
【(c)Ex4(1-31)的制备方法】
为了制备Ex4(1-31)，在三苯甲基树脂积累Fmoc-Pro-OH、N,N-二异丙基乙胺及二甲基甲酰胺来制备Fmoc-Pro-三苯甲基树脂。在上述Fmoc-Pro-三苯甲基树脂添加包含20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺及包含Fmoc-Gly-OH及羟基苯并三唑的N,N-二甲基甲酰胺来制备Fmoc-Gly-Pro-三苯甲基树脂。然后，在上述Fmoc-Gly-Pro-三苯甲基树脂添加包含20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺，之后，从Fmoc-Gly-OH至Boc-His(Trt)-OH循环共计31次，并实施/并行实施氨基酸的耦合，来制备Ex4(1-31)。
Boc-His(Trt)-Gly-Glu(tBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(tBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Met-Glu(tBu)-Glu(tBu)-Glu(tBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(tBu)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-三苯甲基树脂
【(d)Ex4(1-32)的制备方法】
为了制备Ex4(1-32)，在三苯甲基树脂积累Fmoc-Ser(tBu)-OH、二异丙基乙胺及N,N-二甲基甲酰胺来制备Fmoc-Ser(tBu)-三苯甲基树脂。在上述Fmoc-Ser(tBu)-三苯甲基树脂添加包含20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺及包含Fmoc-Pro-OH及羟基苯并三唑的N,N-二甲基甲酰胺来制备Fmoc-Pro-Ser(tBu)-三苯甲基树脂。然后，在上述Fmoc-Pro-Ser(tBu)-三苯甲基树脂添加包含20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺，之后，从Fmoc-Gly-OH至Boc-His(Trt)-OH循环共计32次，并实施/并行实施氨基酸的耦合，来制备Ex4(1-32)。
Boc-His(Trt)-Gly-Glu(tBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(tBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Met-Glu(tBu)-Glu(tBu)-Glu(tBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(tBu)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-三苯甲基树脂
【(e)Ex4(1-33)的制备方法】
为了制备Ex4(1-33)，在三苯甲基树脂积累Fmoc-Ser(tBu)-OH、N,N-二异丙基乙胺及二甲基甲酰胺来制备Fmoc-Ser(tBu)-三苯甲基树脂。在上述Fmoc-Ser(tBu)-三苯甲基树脂添加包含20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺及包含Fmoc-Ser(tBu)-OH及羟基苯并三唑的N,N-二甲基甲酰胺来制备Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-三苯甲基树脂。然后，在上述Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-三苯甲基树脂添加包含20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺，之后，从Fmoc-Pro-OH至Boc-His(Trt)-OH循环共计33次，并实施/并行实施氨基酸的耦合，来制备Ex4(1-33)。
Boc-His(Trt)-Gly-Glu(tBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(tBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Met-Glu(tBu)-Glu(tBu)-Glu(tBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(tBu)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-三苯甲基树脂
在艾塞那肽-4的C-末端的序列不同的艾塞那肽-4实施NEP24.11的稳定性试验。使所制备的肽与重组的人类(human)NEP24.11在0小时、4小时、12小时、24小时、48小时、96小时内，在37℃条件下发生反应后，通过高效液相色谱法(HPLC)来对肽的浓度进行分析。结果，确认了Ex4(1-35)、Ex4(1-33)、Ex4(1-32)及Ex4(1-31)类似物对NEP24.11呈现出长的半衰期，但Ex4(1-29)及Ex4(1-30)类似物呈现出短的半衰期。可知艾塞那肽-4的第31位之后的氨基酸序列对NEP24.11的抵抗性起到重要作用(表1及图1)。
【表1】
肽 序列 T1/2(h)
Ex4 HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPPS ＞96
GLP-1 HAEGTFTSDV SSYLEGQAAK EFIAWLVKGR 5.5
Ex4(1-29) HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNG 9.1
Ex4(1-30) HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG 9.3
Ex4(1-31) HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG P 32.4
Ex4(1-32) HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PS 65.2
Ex4(1-33) HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSS 57.0
Ex4(1-35) HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGA ＞96
【对短艾塞那肽-4类似物的胰高血糖素样肽-1受体的活性及圆二色光谱】
为了对短艾塞那肽-4类似物的胰高血糖素样肽-1受体的活性和Ex-4结构之间的关联性进行比较分析而实施荧光素酶(luciferase)分析及圆二色光谱实验。
在本研究中所使用的荧光素酶分析系统(luciferase assay system)为可以确认药物(ligand)与细胞的受体相结合，并在细胞内呈现出多大活性的分析方法。使作为成纤维细胞株的cv-1(1×106cells/ml)在96孔细胞培养板中培养24小时后，分别在培养50毒感染复数(MOI，multiplicity of infection)、25毒感染复数的病毒的96孔细胞培养板处理插入于腺病毒的胰高血糖素样肽-1受体和环磷酸腺苷反应元件(CRE，cAMP responseelement)荧光素酶，并培养3小时，之后，在更换为没有胎牛血清的培养基后培养16小时。在进行培养后，对各个短艾塞那肽-4类似物进行处理，并在培养6小时后，借助实现活性化的胰高血糖素样肽-1受体，并使用照度计(luminometer)来对作为报道基因的荧光素酶的表达程度进行定量。
结果，确认了Ex4(1-30)、Ex4(1-31)、Ex4(1-32)、Ex4(1-33)及Ex4(1-35)类似物的胰高血糖素样肽-1受体的活性呈现出与作为阳性对照组的Ex4类似的形态。但是，在Ex4(1-29)的情况下，确认了胰高血糖素样肽-1受体的活性比艾塞那肽-4具有10倍左右的活性差异(表2及图2a至图2b)。
【表2】
Figure GDA0002899963210000121
【实施例2：短艾塞那肽-4-脂肪酸共轭的制备及效果分析】
【短艾塞那肽-4-脂肪酸共轭的制备及活性及稳定性比较试验】
为了改善短艾塞那肽-4的稳定性，在艾塞那肽-4的C末端接合多种脂肪酸，来制备短艾塞那肽-4-脂肪酸共轭后，对NEP24.11的稳定性试验和胰高血糖素样肽-1受体的活性进行比较。实验方法与上述实施例1相同。结果，Ex4(1-30)K-Cap及Ex4(1-30)K-Pal类似物对胰高血糖素样肽-1受体的活性优秀(表3及表4、图3a至图3c及图4)。
【表3】
Figure GDA0002899963210000122
【表4】
Figure GDA0002899963210000123
Figure GDA0002899963210000131
【针对胰腺β细胞的短艾塞那肽-4-脂肪酸共轭的胰岛素分泌评价】
对从大鼠(rat)提取的作为胰腺β细胞的INS-1的多个类似物的胰岛素分泌程度进了解。在包含11.1mM的葡萄糖的KRH缓冲液中分别处理10nM及100nM的艾塞那肽-4和各个类似物，并利用酶联免疫吸附测定(ELISA)来对12小时后分泌的胰岛素浓度进行定量。结果，可以确认所有短艾塞那肽-4-脂肪酸共轭比艾塞那肽-4增加的胰岛素分泌程度，尤其，Ex4(1-32)K(Cap)呈现出最高的胰岛素分泌程度(图5)。
【针对脂肪细胞的短艾塞那肽-4-脂肪酸共轭的脂肪水解(lipolysis)程度评价】
利用脂肪细胞(adipocyte)对作为前脂肪细胞(preadipocyte)的3T3-L1进行分化诱导后，测定短艾塞那肽-4-脂肪酸共轭的脂肪水解程度。在24孔细胞培养板中培养24小时的3T3-L1(3×104cells/ml)后，更换为包含10％的胎牛血清(FBS，fetal bovine serum)、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX，3-Isobutyl-1-methylxanthine)及地塞米松(dexamethasone)的培养基，并培养48小时。之后，更换为包含10％的胎牛血清和胰岛素的培养基，并每隔2天～3天更换为相同组成成分的培养基，一直培养至14天，从而诱导向脂肪细胞的分化。在所分化的脂肪细胞处理各个短艾塞那肽-4-脂肪酸共轭后，对在向细胞外排出的甘油(glycerol)中诱导的过氧化氢(hydrogen peroxide)(H2O2)的量进行定量。
结果，可以确认与艾塞那肽-4相比，所有类似物促进脂肪细胞的脂肪水解程度(图6)。
【利用糖尿模型小鼠的短艾塞那肽-4-脂肪酸共轭的糖耐量试验】
使雄性db/db小鼠(6周龄～12周龄)绝食18小时后，分别以20nmol/kg的浓度皮下给药4种短艾塞那肽-4-脂肪酸共轭的Ex4(1-30)K-Pal、Ex4(1-30)K-Cap、Ex4(1-32)K-Pal及Ex4(1-32)K-Cap，并在经过30分钟后，通过腹腔投入葡萄糖(1.5g/kg)。在经过0分钟、15分钟、30分钟、60分钟及120分钟后，从小鼠的尾部末端采集血液，并利用血糖仪(Accu-check，Roche，Germany)测定血糖，来确认降血糖功效。结果，确认了4种均与作为阳性对照组的艾塞那肽类似地对葡萄糖具有显著的耐性(图7a及图7b)。
【利用糖尿模型小鼠的短艾塞那肽-4-脂肪酸共轭的抗糖尿效果试验(antidiabetic effect test)】
分别以20nmol/kg的浓度向雄性db/db小鼠(6周龄～12周龄)皮下给药4种艾塞那肽衍生物Ex4(1-30)K-Pal、Ex4(1-30)K-Cap、Ex4(1-32)K-Pal及Ex4(1-32)K-Cap后，在每隔0小时、1小时、2小时、4小时、6小时、8小时、12小时、19小时、24小时时，从小鼠的尾部末端采集血液，并利用血糖仪测定血糖。结果，确认了4种均与作为阳性对照组的艾塞那肽类似地呈现出有意义的降血糖功效，尤其，Ex4(1-30)K-Cap及Ex4(1-32)K-Cap呈现出比Ex4(1-30)K-Pal及Ex4(1-32)K-Pal更优秀的降血糖功效(图8a及图8b)。
【利用糖尿模型小鼠的短艾塞那肽-4-脂肪酸共轭的浓度依赖性功效比较实验】
制备以两种浓度制备而成的4种短艾塞那肽-4-脂肪酸共轭。以1nmol/kg及5nmol/kg的浓度分别向作为糖尿模型小鼠的雄性db/db小鼠(6周龄～12周龄)皮下给药Ex4(1-30)K-Pal、Ex4(1-30)K-Cap、Ex4(1-32)K-Pal及Ex4(1-32)K-Cap后，在0小时、1小时、2小时、4小时、6小时、8小时、12小时、19小时、24小时后从小鼠的尾部末端采集血液，并利用血糖仪测定血糖。结果，4种均与作为阳性对照组的艾塞那肽类似地呈现出作为浓度依赖性的降血糖功效(图9a及图9b)。
【利用糖尿模型小鼠的短艾塞那肽-4-脂肪酸共轭的功效比较实验】
向雄性db/db小鼠(6周龄～12周龄)皮下给药200μg/kg的利拉鲁肽、100μg/kg的Ex4(1-30)K-Cap及100μg/kg的Ex4(1-32)K-Cap，并为了在经过1天、8天、15天后观察降血糖效果而在给药后的0小时、1小时、2小时、4小时、6小时、8小时、12小时、19小时、24小时从小鼠的尾部末端采集血液，并利用血糖仪测定血糖。结果，确认了4种均由Ex4(1-30)K-Cap及Ex4(1-32)K-Cap(C)呈现出与利拉鲁肽类似或比利拉鲁肽更优秀的的效果(AUC比较)，在24小时中的血糖值也比利拉鲁肽低或与利拉鲁肽相同。通过上述实验，确认Ex4(1-30)K-Cap及Ex4(1-32)K-Cap可以具有与利拉鲁肽类似的功效持续时间的可能性(图10a至图12b)。
【实施例3：Ex4(1-32)K(Cap)的特性分析】
【利用糖尿模型小鼠的Ex4(1-32)K(Cap)(皮下)糖耐量试验】
使雄性db/db小鼠(6周龄～12周龄)绝食18小时后，分别以0.005nmol/kg、0.01nmol/kg、0.1nmol/kg、1nmol/kg及5nmol/kg的浓度向绝食的糖尿模型小鼠给药(皮下)短艾塞那肽-脂肪酸共轭的Ex4(1-32)K(Cap)，并在经过30分钟后，通过腹腔投入葡萄糖(1.5g/kg)。在经过0分钟、20分钟、40分钟、60分钟、90分钟、120分钟、180分钟后，从小鼠的尾部末端采集血液，并利用血糖仪测定血糖。结果，确认了作为Ex4(1-32)K(Cap)的浓度依赖性的降血糖功效(图13a及图13b)。
为了与作为阳性对照组的艾塞那肽相比较，分别以0.1nmol/kg及1nmol/kg的浓度向绝食的小鼠给药(皮下)Ex4(1-32)K(Cap)和艾塞那肽，并在经过30分钟后，通过腹腔投入葡萄糖(1.5g/kg)。在经过0分钟、20分钟、40分钟、75分钟、120分钟、180分钟后，从小鼠的尾部末端采集血液，并利用血糖仪测定血糖。结果，确认了与作为Ex4(1-32)K(Cap)的浓度依赖性的降血糖功效及艾塞那肽类似地对葡萄糖具有显著的耐性(图14a及图14b)。
【利用糖尿模型小鼠的Ex4(1-32)K(Cap)(皮下)抗糖尿效果试验(antidiabeticeffect test)】
以0.1nmol/kg、1nmol/kg、5nmol/kg及20nmol/kg的浓度向db/db小鼠(6周龄～12周龄)给药短艾塞那肽-脂肪酸共轭的Ex4(1-32)K(Cap)，并为了与作为阳性对照组的艾塞那肽相比较而分别以1nmol/kg及5nmol/kg的浓度给药(皮下)艾塞那肽，并在0小时、1小时、2小时、4小时、7小时、9小时、12小时、16小时、24小时、38小时、43小时、48小时时，从小鼠的尾部末端采集血液，并确认降血糖功效。结果，确认了作为Ex4(1-32)K(Cap)的浓度依赖性的降血糖功效，并确认在给药1nmol/kg及5nmol/kg的相同容量时，作为阳性对照组的艾塞那肽在24小时恢复为初始血糖，相反，Ex4(1-32)K(Cap)在48小时内呈现出降血糖持续效果，从而呈现出更为优秀的降血糖功效(图15a及图15b)。
【利用糖尿模型小鼠的Ex4(1-32)K(Cap)(皮下)功效比较实验】
为了对艾塞那肽类似物及利拉鲁肽的降血糖功效而分别以20nmol/kg的浓度向绝食18小时的db/db小鼠皮下给药作为阳性对照组的短艾塞那肽-脂肪酸共轭Ex4(1-32)K(Cap)、艾塞那肽及利拉鲁肽后，腹腔注射葡萄糖来确认经过0分钟、20分钟、40分钟、60分钟、90分钟、120分钟、180分钟后的药物的降血糖功效。结果，确认了Ex4(1-32)K(Cap)与作为阳性对照组的艾塞那肽及利拉鲁肽类似地对葡萄糖具有显著的耐性(图16a及图16b)。
为了对作为阳性对照组的艾塞那肽及利拉鲁肽进行比较，分别以4nmol/kg及20nmol/kg的浓度的相糖尿模型小鼠皮下给药短艾塞那肽-脂肪酸共轭Ex4(1-32)K(Cap)，并分别以20nmol/kg的浓度向糖尿模型小鼠皮下给药艾塞那肽及利拉鲁肽后，经过0小时、1小时、2小时、4小时、6小时、8小时、12小时、19小时、24小时、28小时、33小时、43小时、48小时，之后确认降血糖功效。结果，确认了Ex4(1-32)K(Cap)呈现出比作为阳性对照组的艾塞那肽及利拉鲁肽更为优秀的降血糖功效(图17a及图17b)。
【利用糖尿模型小鼠的Ex4(1-32)K(Cap)(口服)功效比较实验】
分别以1.9mg/kg(500nmol/kg)的浓度向绝食18小时的ob/ob小鼠(6周龄～12周龄)给药(口入)短艾塞那肽-脂肪酸共轭的Ex4(1-32)K(Cap)后，腹腔注射葡萄糖，并在经过0分钟、20分钟、40分钟、60分钟、90分钟、120分钟、180分钟后，确认药物的降血糖功效。结果，确认了当进行口服给药时，Ex4(1-32)K(Cap)比作为阳性对照组的利拉鲁肽更优秀的对葡萄糖具有显著的耐性(图18a及图18b)。
【利用糖尿模型小鼠的Ex4(1-32)K(Cap)(口服)糖耐量试验】
分别以0.1mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg及5mg/kg的浓度向绝食18小时的ob/ob小鼠(6周龄～12周龄)给药(口服)短艾塞那肽-脂肪酸共轭的Ex4(1-32)K(Cap)后，腹腔注射葡萄糖，并在经过0分钟、20分钟、40分钟、60分钟、90分钟、120分钟、180分钟后，确认药物的降血糖功效。结果，确认了作为Ex4(1-32)K(Cap)的浓度依赖性的降血糖功效(图19a及图19b)。
【利用糖尿模型小鼠的Ex4(1-32)K(Cap)(口服)功效比较实验2】
为了对作为阳性对照组的二甲双胍及西他列汀进行比较，以4mg/kg的浓度向绝食18小时的db/db小鼠口服给药短艾塞那肽-脂肪酸共轭Ex4(1-32)K(Cap)，并以二甲双胍300mg/kg及西他列汀3mg/kg的浓度分别向绝食的糖尿模型小鼠进行口服给药后，腹腔注射葡萄糖，并在经过0分钟、20分钟、40分钟、60分钟、90分钟、120分钟、180分钟后，确认药物的降血糖功效。结果，确认了Ex4(1-32)K(Cap)与二甲双胍及磷酸西他列汀类似地对葡萄糖具有显著的耐性(图20a及图20b)。
【实施例4：LMWC-Ex4(1-32)K(Cap)C的效果分析】
【利用糖尿模型小鼠的Ex4(1-32)K(Cap)的低分子量壳聚糖共轭(口服)糖耐量试验】
制备出在短艾塞那肽-脂肪酸共轭Ex4(1-32)K(Cap)接合低分子量壳聚糖的LMWC-Ex4(1-32)K(Cap)C。低分子量壳聚糖为不会影响艾塞那肽类似物的C-末端的活性的药物载体。分别以0.078mg/kg(20nmol/kg)、0.388mg/kg(100nmol/kg)及1.947mg/kg(500nmol/kg)的容量给药LMWC-Ex4(1-32)K(Cap)C，并进行糖耐量，在经过0分钟、20分钟、40分钟、60分钟、90分钟、120分钟、180分钟后，从小鼠的尾部末端采集血液，来确认降血糖功效。结果，确认了当以1.947mg/kg(500nmol/kg)的容量进行口服给药时，LMWC-Ex4(1-32)K(Cap)C与作为阳性对照组的二甲双胍类似地对葡萄糖具有有意义的耐性(图21a及图21b)。
【利用糖尿模型小鼠的Ex4(1-32)K(Cap)的低分子量壳聚糖共轭(口服)功效比较实验】
为了对作为阳性对照组的二甲双胍及西他列汀进行比较，以4mg/kg的浓度向绝食18小时的短艾塞那肽-脂肪酸共轭Ex4(1-32)K(Cap)给药(口服)接合有低分子量壳聚糖的LMWC-Ex4(1-32)K(Cap)C，并以二甲双胍300mg/kg及西他列汀3mg/kg的浓度分别向绝食的糖尿模型小鼠进行给药(口服)，并在经过60分钟后，腹腔注射葡萄糖，并在经过0分钟、20分钟、40分钟、60分钟、90分钟、120分钟、180分钟后，从小鼠的尾部末端采集血液，来确定降血糖功效。结果，确认了LMWC-Ex4(1-32)K(Cap)C与作为阳性对照组的二甲双胍类似地，比磷酸西他列汀更为优秀地对葡萄糖具有显著的耐性(图22a及图22b)。
【利用糖尿模型小鼠的Ex4(1-32)K(Cap)的低分子量壳聚糖混合给药(口服)糖耐量试验】
就在短艾塞那肽-脂肪酸共轭Ex4(1-32)K(Cap)混合低分子量壳聚糖的溶液而言，分别以相同的40μg/kg、100μg/kg及400μg/kg的容量混合Ex4(1-32)K(Cap)和低分子量壳聚糖，并向绝食18小时的db/db小鼠口服给药，并在经过60分钟后，腹腔注射葡萄糖，并在经过0分钟、20分钟、40分钟、60分钟、90分钟、120分钟、180分钟后，实施药物的糖耐量试验。结果，在Ex4(1-32)K(Cap)中混合低分子量壳聚糖来给药时，确认了作为浓度依赖性的降血糖功效(图23a及图23b)。
【利用糖尿模型小鼠的Ex4(1-32)K(Cap)的低分子量壳聚糖混合给药(口服)功效比较实验】
为了确认在短艾塞那肽-脂肪酸共轭Ex4(1-32)K(Cap)的给药(口服)中混合低分子量壳聚糖的容量的效果，向绝食18小时的db/db小鼠口服给药在100μg/kg容量的Ex4(1-32)K(Cap)分别以100μg/kg、200μg/kg、300μg/kg及500μg/kg的容量混合低分子量壳聚糖，并在经过60分钟后，腹腔注射葡萄糖，在经过0分钟、20分钟、40分钟、60分钟、100分钟、120分钟、180分钟后，实施了药物的糖耐量试验。结果，在Ex4(1-32)K(Cap)混合低分子量壳聚糖来给药时，在100-500μg/kg容量中，在100μg/kg的低的容量中确认了降血糖功效(图24a及图24b)。
在100μg/kg容量的Ex4(1-32)K(Cap)分别混合100μg/kg及50μg/kg容量的低分子量壳聚糖，并向绝食18小时的db/db小鼠口服给药，在经过60分钟后，腹腔注射葡萄糖，并在经过0分钟、20分钟、40分钟、60分钟、100分钟、120分钟、180分钟后，实施糖耐量试验。结果，当在Ex4(1-32)K(Cap)混合低分子量壳聚糖来给药时，与100μg/kg的低分子量壳聚糖相比，在50μg/kg容量的低分子量壳聚糖中确认了降血糖功效(图25a及图25b)。
为了100μg/kg容量的Ex4(1-32)K(Cap)的单一给药和低分子量壳聚糖混合物的口服给药进行比较，向绝食的糖尿模型小鼠给药100μg/kg的Ex4(1-32)K(Cap)，并向绝食的糖尿模型小鼠口服给药分别混合25μg/kg、50μg/kg及100μg/kg的Ex4(1-32)K(Cap)和25μg/kg及50μg/kg容量的低分子量壳聚糖，并在经过60分钟后，腹腔注射葡萄糖，并在0分钟、20分钟、40分钟、60分钟、90分钟、120分钟、180分钟后实施药物的糖耐量试验。结果，确认了与100μg/kg的Ex4(1-32)K(Cap)的单一给药相比，100μg/kg的Ex4(1-32)K(Cap)和50μg/kg的低分子量壳聚糖混合物的口服给药更优秀地对葡萄糖具有显著的耐性，并且，当向绝食的糖尿模型小鼠给药(口服)Ex4(1-32)K(Cap)时，为了附加的降血糖功效而最少需要50μg/kg的低分子量壳聚糖混合容量(图26a及图26b)。
【利用糖尿模型小鼠的艾塞那肽的低分子量壳聚糖混合给药(口服)糖耐量试验】
口服给药分别以相同的40μg/kg、100μg/kg及400μg/kg的容量混合艾塞那肽和低分子量壳聚糖的溶液，并在经过60分钟后，腹腔注射葡萄糖，并在0分钟、20分钟、40分钟、60分钟、90分钟、120分钟、180分钟后实施药物的糖耐量试验。结果，当在艾塞那肽混合低分子量壳聚糖来给药时，确认了作为浓度依赖性的降血糖功效(图27a及图27b)。
【利用糖尿模型小鼠的艾塞那肽的低分子量壳聚糖混合给药(口服)功效比较实验】
向绝食18小时的糖尿模型小鼠口服给药在100μg/kg容量的艾塞那肽中分别混合100μg/kg及50μg/kg容量的低分子量壳聚糖的溶液，并在经过60分钟后，腹腔注射葡萄糖，并在0分钟、20分钟、40分钟、90分钟、120分钟、180分钟后实施药物的糖耐量试验。结果，当在艾塞那肽混合低分子量壳聚糖来给药时，与100μg/kg的低分子量壳聚糖相比，在50μg/kg容量的低分子量壳聚糖50μg/kg中确认了附加的降血糖功效(图28a及图28b)。
为了对100μg/kg容量的艾塞那肽的单一给药和低分子量壳聚糖的混合口服给药进行比较，向绝食18小时的糖尿模型小鼠给药100μg/kg的艾塞那肽，并向绝食18小时的糖尿模型小鼠给药(口服)混合有100μg/kg的艾塞那肽和50μg/kg容量的低分子量壳聚糖的溶液，并在经过60分钟后，腹腔注射葡萄糖，并在0分钟、20分钟、40分钟、60分钟、90分钟、120分钟、180分钟后实施药物的糖耐量试验。结果，确认了与100μg/kg的艾塞那肽的单一用药相比，在100μg/kg的艾塞那肽混合50μg/kg的低分子量壳聚糖的给药(口服)更优秀地对葡萄糖具有显著的耐性(图29a及图29b)。
以上，对本发明的特定部分进行了详细记述，而对本发明所属技术领域的普通技术人员而言，这种具体记述仅为优选的实例，本发明的范围并不局限于此是显而易见的。因此，本发明的实质性的范围应由发明要求保护范围及其等同技术方案定义。
Figure IDA0001117573790000011

Claims (9)

1.一种艾塞那肽类似物，其缺失艾塞那肽的氨基酸序列的C-末端的7个至9个氨基酸，并与脂肪酸相接合，其中
上述艾塞那肽的氨基酸序列为序列表中的序列1，
上述脂肪酸选自：戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸、十一酸、月桂酸、十三酸、肉豆蔻酸、十五酸、棕榈酸、十七烷酸、硬脂酸、十九烷酸和花生酸，且
上述脂肪酸经赖氨酸接头与缺失上述氨基酸的艾塞那肽的C-末端相接合。
2.根据权利要求1所述的艾塞那肽类似物，其中上述脂肪酸为辛酸、壬酸、癸酸、十一酸、月桂酸、十三酸、肉豆蔻酸、十五酸或棕榈酸。
3.一种改善、预防或治疗糖尿用药剂学组合物，其包含权利要求1至2中任一项所述的艾塞那肽类似物作为有效成分。
4.一种改善、预防或治疗肥胖用药剂学组合物，其包含权利要求1至2中任一项所述的艾塞那肽类似物作为有效成分。
5.一种抑制食欲用药剂学组合物，其包含权利要求1至2中任一项所述的艾塞那肽类似物作为有效成分。
6.根据权利要求3至5中任一项所述的药剂学组合物，其中上述药剂学组合物为口服给药用组合物。
7.权利要求1至2中任一项所述的上述艾塞那肽类似物用于制造改善、预防或治疗糖尿的药剂学组合物的用途。
8.权利要求1至2中任一项所述的上述艾塞那肽类似物用于制造改善、预防或治疗肥胖的药剂学组合物的用途。
9.权利要求1至2中任一项所述的上述艾塞那肽类似物用于制造抑制食欲的药剂学组合物的用途。
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