JP2017512457A - 抗pcsk9〜glp−1融合物および使用方法 - Google Patents
抗pcsk9〜glp−1融合物および使用方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2017512457A JP2017512457A JP2016544406A JP2016544406A JP2017512457A JP 2017512457 A JP2017512457 A JP 2017512457A JP 2016544406 A JP2016544406 A JP 2016544406A JP 2016544406 A JP2016544406 A JP 2016544406A JP 2017512457 A JP2017512457 A JP 2017512457A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- glp
- peptide
- pcsk9
- fusion molecule
- seq
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 230000004927 fusion Effects 0.000 title claims abstract description 298
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 47
- DTHNMHAUYICORS-KTKZVXAJSA-N Glucagon-like peptide 1 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC=1N=CNC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CC=CC=C1 DTHNMHAUYICORS-KTKZVXAJSA-N 0.000 claims description 238
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 179
- 102100038955 Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 Human genes 0.000 claims description 159
- 101001098868 Homo sapiens Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 Proteins 0.000 claims description 123
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 60
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 60
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 55
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 claims description 48
- 101001015516 Homo sapiens Glucagon-like peptide 1 receptor Proteins 0.000 claims description 41
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 38
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 37
- 108010086246 Glucagon-Like Peptide-1 Receptor Proteins 0.000 claims description 34
- 102000007446 Glucagon-Like Peptide-1 Receptor Human genes 0.000 claims description 33
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 29
- 102000007330 LDL Lipoproteins Human genes 0.000 claims description 17
- 108010007622 LDL Lipoproteins Proteins 0.000 claims description 17
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 claims description 17
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 17
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 17
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 claims description 17
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 15
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 12
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 12
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 12
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 9
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 9
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 8
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 8
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 8
- 208000001072 type 2 diabetes mellitus Diseases 0.000 claims description 8
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 5
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 5
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 3
- 208000001145 Metabolic Syndrome Diseases 0.000 claims description 2
- 201000000690 abdominal obesity-metabolic syndrome Diseases 0.000 claims description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 claims description 2
- 101710198884 GATA-type zinc finger protein 1 Proteins 0.000 claims 26
- 102400000322 Glucagon-like peptide 1 Human genes 0.000 claims 26
- 101800000224 Glucagon-like peptide 1 Proteins 0.000 description 146
- 102100040918 Pro-glucagon Human genes 0.000 description 118
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 115
- 101710180553 Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 Proteins 0.000 description 82
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 80
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 77
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 49
- 102000053786 human PCSK9 Human genes 0.000 description 46
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 42
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 42
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 42
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 42
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 42
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 39
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 36
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 35
- 102100035360 Cerebellar degeneration-related antigen 1 Human genes 0.000 description 32
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 32
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 30
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 26
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 26
- 101100112922 Candida albicans CDR3 gene Proteins 0.000 description 24
- 102100035361 Cerebellar degeneration-related protein 2 Human genes 0.000 description 24
- 101000737796 Homo sapiens Cerebellar degeneration-related protein 2 Proteins 0.000 description 24
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 24
- 101000737793 Homo sapiens Cerebellar degeneration-related antigen 1 Proteins 0.000 description 23
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 23
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 23
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 23
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 22
- JUFFVKRROAPVBI-PVOYSMBESA-N chembl1210015 Chemical class C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N[C@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO[C@]3(O[C@@H](C[C@H](O)[C@H](O)CO)[C@H](NC(C)=O)[C@@H](O)C3)C(O)=O)O2)O)[C@@H](CO)O1)NC(C)=O)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CO)C(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CC=CC=C1 JUFFVKRROAPVBI-PVOYSMBESA-N 0.000 description 22
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 22
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 22
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 21
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 21
- 238000007410 oral glucose tolerance test Methods 0.000 description 18
- 108010011459 Exenatide Proteins 0.000 description 17
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 17
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 17
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 16
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 16
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 16
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 15
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 15
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 15
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 14
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 14
- 229960001519 exenatide Drugs 0.000 description 14
- -1 Exendin-4 GLP-1 analog Chemical class 0.000 description 13
- 101100135853 Rattus norvegicus Pcsk9 gene Proteins 0.000 description 13
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 13
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 13
- 239000000047 product Substances 0.000 description 12
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 12
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 12
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 11
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 11
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 11
- 238000013262 cAMP assay Methods 0.000 description 10
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 10
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 10
- 238000003998 size exclusion chromatography high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 10
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 9
- 108010019598 Liraglutide Proteins 0.000 description 9
- YSDQQAXHVYUZIW-QCIJIYAXSA-N Liraglutide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCNC(=O)CC[C@H](NC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CC=C(O)C=C1 YSDQQAXHVYUZIW-QCIJIYAXSA-N 0.000 description 9
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 9
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 9
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 9
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 9
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 9
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 9
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 9
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 9
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 9
- 238000000423 cell based assay Methods 0.000 description 8
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 8
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 8
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 7
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 7
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 7
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 7
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 7
- 229960002701 liraglutide Drugs 0.000 description 7
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 7
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 7
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 7
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 7
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 6
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 6
- 108010001831 LDL receptors Proteins 0.000 description 6
- 102000000853 LDL receptors Human genes 0.000 description 6
- 206010028813 Nausea Diseases 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 6
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 6
- 229940090124 dipeptidyl peptidase 4 (dpp-4) inhibitors for blood glucose lowering Drugs 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 6
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 6
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 6
- 230000008693 nausea Effects 0.000 description 6
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 6
- 239000012146 running buffer Substances 0.000 description 6
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 6
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 5
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 238000002330 electrospray ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 5
- 238000007446 glucose tolerance test Methods 0.000 description 5
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 5
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 5
- 238000002868 homogeneous time resolved fluorescence Methods 0.000 description 5
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 5
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 5
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 5
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229940089838 Glucagon-like peptide 1 receptor agonist Drugs 0.000 description 4
- 101001117317 Homo sapiens Programmed cell death 1 ligand 1 Proteins 0.000 description 4
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 4
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 4
- 241000282567 Macaca fascicularis Species 0.000 description 4
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 4
- 108010058003 Proglucagon Proteins 0.000 description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 230000007211 cardiovascular event Effects 0.000 description 4
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 4
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 4
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 4
- 230000002526 effect on cardiovascular system Effects 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 239000003877 glucagon like peptide 1 receptor agonist Substances 0.000 description 4
- 102000048776 human CD274 Human genes 0.000 description 4
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 4
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N (2,4-dichlorophenyl) benzenesulfonate Chemical compound ClC1=CC(Cl)=CC=C1OS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000201370 Autographa californica nucleopolyhedrovirus Species 0.000 description 3
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 description 3
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- 229910052693 Europium Inorganic materials 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101800000221 Glucagon-like peptide 2 Proteins 0.000 description 3
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 3
- 102100029100 Hematopoietic prostaglandin D synthase Human genes 0.000 description 3
- 108091016366 Histone-lysine N-methyltransferase EHMT1 Proteins 0.000 description 3
- 101001098872 Homo sapiens Proprotein convertase subtilisin/kexin type 7 Proteins 0.000 description 3
- 101000946850 Homo sapiens T-lymphocyte activation antigen CD86 Proteins 0.000 description 3
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 3
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 3
- 238000008214 LDL Cholesterol Methods 0.000 description 3
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 description 3
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 3
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 3
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 3
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 3
- 239000012131 assay buffer Substances 0.000 description 3
- 239000012911 assay medium Substances 0.000 description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 3
- 230000003491 cAMP production Effects 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 3
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 3
- 238000013229 diet-induced obese mouse Methods 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- OGPBJKLSAFTDLK-UHFFFAOYSA-N europium atom Chemical group [Eu] OGPBJKLSAFTDLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002866 fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 3
- TWSALRJGPBVBQU-PKQQPRCHSA-N glucagon-like peptide 2 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O)[C@@H](C)CC)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)C1=CC=CC=C1 TWSALRJGPBVBQU-PKQQPRCHSA-N 0.000 description 3
- 230000014101 glucose homeostasis Effects 0.000 description 3
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 3
- 102000049849 human CD86 Human genes 0.000 description 3
- 102000054226 human PCSK7 Human genes 0.000 description 3
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 3
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 3
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 3
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 3
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 description 3
- 230000003285 pharmacodynamic effect Effects 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- GCYXWQUSHADNBF-AAEALURTSA-N preproglucagon 78-108 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC=1N=CNC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CC=CC=C1 GCYXWQUSHADNBF-AAEALURTSA-N 0.000 description 3
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 3
- 108010048078 site 1 membrane-bound transcription factor peptidase Proteins 0.000 description 3
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 3
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 3
- FUOOLUPWFVMBKG-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoisobutyric acid Chemical compound CC(C)(N)C(O)=O FUOOLUPWFVMBKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101100168093 Caenorhabditis elegans cogc-2 gene Proteins 0.000 description 2
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000051325 Glucagon Human genes 0.000 description 2
- 108010063919 Glucagon Receptors Proteins 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 2
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 2
- 102100026120 IgG receptor FcRn large subunit p51 Human genes 0.000 description 2
- 101710177940 IgG receptor FcRn large subunit p51 Proteins 0.000 description 2
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 101100221487 Mus musculus Cog2 gene Proteins 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 102400000319 Oxyntomodulin Human genes 0.000 description 2
- 101800001388 Oxyntomodulin Proteins 0.000 description 2
- 101710182846 Polyhedrin Proteins 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102000035554 Proglucagon Human genes 0.000 description 2
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 2
- 102100028927 Secretin receptor Human genes 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 230000003178 anti-diabetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 238000013357 binding ELISA Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 239000010432 diamond Substances 0.000 description 2
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 2
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 230000000081 effect on glucose Effects 0.000 description 2
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 2
- 210000001163 endosome Anatomy 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 238000010228 ex vivo assay Methods 0.000 description 2
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 2
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 2
- 108010036598 gastric inhibitory polypeptide receptor Proteins 0.000 description 2
- MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N glucagon Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N 0.000 description 2
- 229960004666 glucagon Drugs 0.000 description 2
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 2
- 235000009200 high fat diet Nutrition 0.000 description 2
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 2
- 102000056448 human GLP1R Human genes 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 2
- 210000003712 lysosome Anatomy 0.000 description 2
- 230000001868 lysosomic effect Effects 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PXZWGQLGAKCNKD-DPNMSELWSA-N molport-023-276-326 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)[C@@H](C)O)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 PXZWGQLGAKCNKD-DPNMSELWSA-N 0.000 description 2
- 230000010807 negative regulation of binding Effects 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N phenylalanine group Chemical group N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- NROKBHXJSPEDAR-UHFFFAOYSA-M potassium fluoride Chemical compound [F-].[K+] NROKBHXJSPEDAR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 102220219560 rs779249550 Human genes 0.000 description 2
- 108700027603 secretin receptor Proteins 0.000 description 2
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 2
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 2
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 229940007428 victoza Drugs 0.000 description 2
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 1
- ICLYJLBTOGPLMC-KVVVOXFISA-N (z)-octadec-9-enoate;tris(2-hydroxyethyl)azanium Chemical compound OCCN(CCO)CCO.CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O ICLYJLBTOGPLMC-KVVVOXFISA-N 0.000 description 1
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CYDQOEWLBCCFJZ-UHFFFAOYSA-N 4-(4-fluorophenyl)oxane-4-carboxylic acid Chemical compound C=1C=C(F)C=CC=1C1(C(=O)O)CCOCC1 CYDQOEWLBCCFJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102220467418 Acyl-coenzyme A thioesterase MBLAC2_E61Q_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102100029457 Adenine phosphoribosyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 108010024223 Adenine phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 102220465452 Angiogenin_K64Q_mutation Human genes 0.000 description 1
- 101001084702 Arabidopsis thaliana Histone H2B.10 Proteins 0.000 description 1
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000031648 Body Weight Changes Diseases 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 101100505076 Caenorhabditis elegans gly-2 gene Proteins 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001529572 Chaceon affinis Species 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 206010010904 Convulsion Diseases 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 101150074155 DHFR gene Proteins 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- HTQBXNHDCUEHJF-XWLPCZSASA-N Exenatide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CO)C(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CC=CC=C1 HTQBXNHDCUEHJF-XWLPCZSASA-N 0.000 description 1
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 1
- 108091006020 Fc-tagged proteins Proteins 0.000 description 1
- 102220558804 Gamma-aminobutyric acid receptor-associated protein_K24Q_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102100039994 Gastric inhibitory polypeptide Human genes 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 description 1
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 description 1
- 108060003199 Glucagon Proteins 0.000 description 1
- 102100040890 Glucagon receptor Human genes 0.000 description 1
- 108010024044 Glucagon-Like Peptide-2 Receptor Proteins 0.000 description 1
- 102100032882 Glucagon-like peptide 1 receptor Human genes 0.000 description 1
- 101800004266 Glucagon-like peptide 1(7-37) Proteins 0.000 description 1
- 102100032879 Glucagon-like peptide 2 receptor Human genes 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 102000017011 Glycated Hemoglobin A Human genes 0.000 description 1
- 108010014663 Glycated Hemoglobin A Proteins 0.000 description 1
- 206010019280 Heart failures Diseases 0.000 description 1
- 241000270431 Heloderma suspectum Species 0.000 description 1
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 1
- 102100035043 Histone-lysine N-methyltransferase EHMT1 Human genes 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000788682 Homo sapiens GATA-type zinc finger protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000840258 Homo sapiens Immunoglobulin J chain Proteins 0.000 description 1
- 101001051093 Homo sapiens Low-density lipoprotein receptor Proteins 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 1
- 208000035150 Hypercholesterolemia Diseases 0.000 description 1
- 208000031226 Hyperlipidaemia Diseases 0.000 description 1
- 108010091358 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 102100029098 Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase Human genes 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 102100029571 Immunoglobulin J chain Human genes 0.000 description 1
- 108020005350 Initiator Codon Proteins 0.000 description 1
- 102000036770 Islet Amyloid Polypeptide Human genes 0.000 description 1
- 108010041872 Islet Amyloid Polypeptide Proteins 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N L-Ornithine Chemical compound NCCC[C@H](N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 239000012515 MabSelect SuRe Substances 0.000 description 1
- 102220611213 Magnesium transporter MRS2 homolog, mitochondrial_H52S_mutation Human genes 0.000 description 1
- 244000137850 Marrubium vulgare Species 0.000 description 1
- 101000788683 Mus musculus GATA-type zinc finger protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 102220527886 NADH-cytochrome b5 reductase 2_H50S_mutation Human genes 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N Orn-delta-NH2 Natural products NCCCC(N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N Ornithine Natural products OC(=O)C(C)CCCN UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 101710094000 Programmed cell death 1 ligand 1 Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102220537303 Protein NDRG2_H30K_mutation Human genes 0.000 description 1
- 101100384800 Prunus dulcis Cgamma1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000700157 Rattus norvegicus Species 0.000 description 1
- 101500026178 Rattus norvegicus Glucagon-like peptide 1 Proteins 0.000 description 1
- 101100288143 Rattus norvegicus Klkb1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101100109192 Rhizobium galegae apt gene Proteins 0.000 description 1
- 239000011542 SDS running buffer Substances 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- 102220497176 Small vasohibin-binding protein_T47D_mutation Human genes 0.000 description 1
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 description 1
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 description 1
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 1
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- 208000032109 Transient ischaemic attack Diseases 0.000 description 1
- 108010015780 Viral Core Proteins Proteins 0.000 description 1
- LWZFANDGMFTDAV-BURFUSLBSA-N [(2r)-2-[(2r,3r,4s)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]-2-hydroxyethyl] dodecanoate Chemical compound CCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@@H](O)[C@H]1OC[C@H](O)[C@H]1O LWZFANDGMFTDAV-BURFUSLBSA-N 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000009824 affinity maturation Effects 0.000 description 1
- 230000008484 agonism Effects 0.000 description 1
- 238000012867 alanine scanning Methods 0.000 description 1
- 229940126575 aminoglycoside Drugs 0.000 description 1
- 229940075564 anhydrous dibasic sodium phosphate Drugs 0.000 description 1
- 230000000340 anti-metabolite Effects 0.000 description 1
- 239000003472 antidiabetic agent Substances 0.000 description 1
- 229940100197 antimetabolite Drugs 0.000 description 1
- 239000002256 antimetabolite Substances 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000008365 aqueous carrier Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N aspartic acid group Chemical group N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001815 biotherapy Methods 0.000 description 1
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N bis-tris Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004579 body weight change Effects 0.000 description 1
- 238000006664 bond formation reaction Methods 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 230000010036 cardiovascular benefit Effects 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000007248 cellular mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004540 complement-dependent cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 208000029078 coronary artery disease Diseases 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000003413 degradative effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000004807 desolvation Methods 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000013118 diabetic mouse model Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- IZEKFCXSFNUWAM-UHFFFAOYSA-N dipyridamole Chemical compound C=12N=C(N(CCO)CCO)N=C(N3CCCCC3)C2=NC(N(CCO)CCO)=NC=1N1CCCCC1 IZEKFCXSFNUWAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011038 discontinuous diafiltration by volume reduction Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 239000002359 drug metabolite Substances 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000010502 episomal replication Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000037406 food intake Effects 0.000 description 1
- 235000012631 food intake Nutrition 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 230000030136 gastric emptying Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960002989 glutamic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- 230000002641 glycemic effect Effects 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000008214 highly purified water Substances 0.000 description 1
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 1
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 230000002218 hypoglycaemic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000003914 insulin secretion Effects 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 1
- 230000000155 isotopic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 229910052747 lanthanoid Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002602 lanthanoids Chemical class 0.000 description 1
- 102000005861 leptin receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010019813 leptin receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000000670 ligand binding assay Methods 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 235000012054 meals Nutrition 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000009988 metabolic benefit Effects 0.000 description 1
- 208000030159 metabolic disease Diseases 0.000 description 1
- HPNSFSBZBAHARI-UHFFFAOYSA-N micophenolic acid Natural products OC1=C(CC=C(C)CCC(O)=O)C(OC)=C(C)C2=C1C(=O)OC2 HPNSFSBZBAHARI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- HPNSFSBZBAHARI-RUDMXATFSA-N mycophenolic acid Chemical compound OC1=C(C\C=C(/C)CCC(O)=O)C(OC)=C(C)C2=C1C(=O)OC2 HPNSFSBZBAHARI-RUDMXATFSA-N 0.000 description 1
- 229960000951 mycophenolic acid Drugs 0.000 description 1
- 206010053219 non-alcoholic steatohepatitis Diseases 0.000 description 1
- 238000013116 obese mouse model Methods 0.000 description 1
- 229960003104 ornithine Drugs 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 239000004031 partial agonist Substances 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 239000000813 peptide hormone Substances 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000037081 physical activity Effects 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 229920000729 poly(L-lysine) polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920001308 poly(aminoacid) Polymers 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229920002643 polyglutamic acid Polymers 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000011698 potassium fluoride Substances 0.000 description 1
- 235000003270 potassium fluoride Nutrition 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 230000009145 protein modification Effects 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000033764 rhythmic process Effects 0.000 description 1
- 102220010430 rs138439950 Human genes 0.000 description 1
- 102200066678 rs1554618767 Human genes 0.000 description 1
- 102220011343 rs267606538 Human genes 0.000 description 1
- 102200081693 rs397514719 Human genes 0.000 description 1
- 102220279936 rs561759202 Human genes 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 239000012898 sample dilution Substances 0.000 description 1
- 238000009738 saturating Methods 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000004513 sizing Methods 0.000 description 1
- 230000000391 smoking effect Effects 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000001540 sodium lactate Substances 0.000 description 1
- 235000011088 sodium lactate Nutrition 0.000 description 1
- 229940005581 sodium lactate Drugs 0.000 description 1
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- AIDBEARHLBRLMO-UHFFFAOYSA-M sodium;dodecyl sulfate;2-morpholin-4-ylethanesulfonic acid Chemical compound [Na+].OS(=O)(=O)CCN1CCOCC1.CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O AIDBEARHLBRLMO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000013097 stability assessment Methods 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000003883 substance clean up Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 229960000814 tetanus toxoid Drugs 0.000 description 1
- 238000000293 three-dimensional nuclear magnetic resonance spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 1
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 201000010875 transient cerebral ischemia Diseases 0.000 description 1
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 1
- 229940117013 triethanolamine oleate Drugs 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004704 ultra performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/605—Glucagons
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/22—Hormones
- A61K38/26—Glucagons
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
- A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
- A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
- A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
- A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
- A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/06—Antihyperlipidemics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Obesity (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Child & Adolescent Psychology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Farming Of Fish And Shellfish (AREA)
- Professional, Industrial, Or Sporting Protective Garments (AREA)
- Lining Or Joining Of Plastics Or The Like (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本願は、抗PCSK9−GLP−1融合物および使用のための方法を提供する。【選択図】なし
Description
抗PCSK9〜GLP−1融合物および使用方法。
糖尿病は、心血管罹患率および死亡率の増加に関連している。高血圧、高脂血症、および糖尿病は、独立的に心血管疾患リスクの増大に関連している。2型糖尿病を有する被験体は、糖尿病を有しない場合と比べて心血管疾患リスクが2〜4倍増大する。
グルカゴン様ペプチド−1(GLP−1)は、代謝および心血管における便益を有する多面ペプチドとして公知である。それは、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド−1(GLP−1)、グルカゴン様ペプチド−2(GLP−2)およびオキシントモジュリン(OXM)を含む多数の異なるプログルカゴン由来ペプチドを形成するように異なる組織内で処理される158アミノ酸前駆体ポリペプチドのプレプログルカゴンに由来し、グルコースホメオスタシス、インスリン分泌、胃排出、および腸管成長、ならびに食物摂取の調節を含む、多種多様な生理学的機能に関与する。GLP−1は、プログルカゴンのアミノ酸72〜108(プレプログルカゴンの92〜128)に対応する37アミノ酸ペプチドとして生成される。主要な生物活性形態は、食事後腸内で生成され、豊富に存在する内因性プロテアーゼ−DPP4によって迅速に分解される30アミノ酸ペプチドホルモン(GLP−1(7−37)酸)である。Baggio,L.and Drucker,D.,Gasteroenterology,132:2131−2157(2007)。
GLP−1受容体で作動薬として作用するGLP−1およびGLP−1類似体は、例えば2型糖尿病での有効な低血糖コントロールであることが示されている。例えば、リラグルチド(Novo Nordisk製のVictoza(登録商標))、デュラグルチド(Eli Lilly)、ビデュリオン(AZ/BMS)、アルビグルチド(GSK)およびエキセナチド(Eli Lilly/Amylin製のByetta(登録商標))を含む特定のGLP−1類似体は、2型糖尿病の治療用に販売されているかまたは開発中である。
GLP−1療法の開始後の主な副作用の一つは、胃腸副作用、特に悪心である。この副作用は、一過性であり、経時的に消散し、用量増加により軽減され得る。しかし、治療は、胃腸副作用を許容することができる患者に制限される。
PCSK9は、LDLコレステロールの低下のための非酵素的な標的であり、PCSK9の突然変異は、LDLコレステロールおよび冠動脈心疾患の低下に相関する。Cohen JC,N Engl J Med,354:1264(2006)。PCSK9抗体は、スタチン治療患者においてLDLコレステロールを低下させることが示されており、また複数の候補が臨床的レビューを受けている。
Baggio,L.and Drucker,D.,Gasteroenterology,132:2131−2157(2007)
Cohen JC,N Engl J Med,354:1264(2006)
糖尿病および心血管疾患に対して複数の個別治療が存在する一方、単一の医薬組成物が両方の病態(および糖尿病と心血管疾患との間の関係)に対処するという必要性が存在する。二重の活性を有する単一の医薬化合物を提供することは、副作用、患者のコンプライアンスに伴う困難を低減し、また個々の患者に対する有益なアウトカムを増大させ、また医療システムによって負担されるコストを低減することになる。
本説明に従って開示されるのは、GLP−1ペプチドに安定に融合された抗PCSK9抗体を含む、糖尿病を治療するための二重活性融合分子であって、ここで抗PCSK9抗体はPCSK9ポリペプチドに結合し、かつGLP−1ペプチドはGLP−1受容体に結合する、二重活性融合分子である。
一態様では、GLP−1ペプチドは、リンカーペプチドを介してPCSK9抗体に融合される。
さらなる方法では、リンカーペプチドは、GLP−1ペプチドのC末端に融合される。
一実施形態では、GLP−1ペプチドは、配列番号36のアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、GLP−1ペプチドは、配列番号3のアミノ酸配列を含む。
一方法では、GLP−1分子のCys18は、リンカーペプチドと、またはGLP−1ペプチド自体とジスルフィド架橋を形成する。
一態様では、融合分子は、動物において、グルコースを調節し、および/またはLDLを低下させる。動物はヒトであってもよい。
また開示されるのは、配列番号3のアミノ酸配列を含むGLP−1ペプチドに安定に融合された抗PCSK9抗体を含む糖尿病を治療するための二重活性融合分子であって、ここでGLP−1ペプチドのC末端は、ペプチドリンカーを介して抗PCSK9抗体の軽鎖に融合され、またここで抗PCSK9抗体はPCSK9ポリペプチドに結合し、かつGLP−1ペプチドはGLP−1受容体に結合する、二重活性融合分子である。
開示される別の実施形態は、2型糖尿病を治療する方法であって、それを必要とする被験者に、本明細書に記載の融合分子を投与するステップを含む、方法である。
さらなる態様は、それを必要とする被験者に、本明細書に記載の融合分子を投与するステップを含む。
一方法では、被験体における低密度リポタンパク質(LDL)を低減する方法は、それを必要とする被験者に、本明細書に記載の融合分子を投与するステップを含む。
別の態様は、被験体において、グルコースを調節し、かつLDLを低下させる方法であって、それを必要とする被験者に、本明細書に記載の融合分子を投与するステップを含む、方法を包含する。
別の態様は、被験体において、体重減少を促進し、かつLDLを低下させる方法であって、それを必要とする被験者に、本明細書に記載の融合分子を投与するステップを含む、方法を包含する。
一実施形態では、被験体は2型糖尿病を有する。
別の実施形態では、被験体はメタボリックシンドロームを有する。
さらなる態様は、配列番号3のアミノ酸配列を含むGLP−1ペプチドに安定に融合された抗体を含み、ここでGLP−1ペプチドのC末端は、ペプチドリンカーを介して抗体の軽鎖に融合され、またここで抗体は標的ポリペプチドに結合し、かつGLP−1ペプチドはGLP−1受容体に結合する、二重活性融合分子である。
さらなる態様は、配列番号36のアミノ酸配列を含むGLP−1ペプチドに安定に融合された抗体を含む二重活性融合分子であり、ここでGLP−1ペプチドのC末端は、ペプチドリンカーを介して抗体の軽鎖に融合され、またここで抗体は標的ポリペプチドに結合し、かつGLP−1ペプチドはGLP−1受容体に結合する。
一部の態様では、GLP−1分子は、配列番号36のアミノ酸配列を含む。一部の態様では、抗体は抗PCSK9抗体である。
特定の方法では、抗PCSK9抗体の軽鎖は、配列番号2のアミノ酸配列に対して少なくとも90%同一である。他の方法では、抗PCSK9抗体の軽鎖は、配列番号2のアミノ酸配列を含む。さらなる方法では、抗PCSK9抗体の重鎖は、配列番号1のアミノ酸配列に対して少なくとも90%同一である。一部の態様では、抗PCSK9抗体の重鎖は、配列番号1のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号4のアミノ酸配列を含む。二重活性融合分子の一部の実施形態では、GLP−1分子のCys18は、GLP−1ペプチドのC末端とジスルフィド架橋を形成する。
一部の実施形態では、二重活性融合分子は、糖尿病を治療することを目的とする。一部の実施形態では、二重活性融合分子は、動物において、グルコースを調節し、および/またはLDLを低下させる。
一部の方法では、動物はヒトである。
一部の実施形態は、糖尿病を治療するための二重活性融合分子であって、ヒトGLP−1受容体で、配列番号29のアミノ酸配列を含むGLP−1ペプチドと比べて効力が低下しているGLP−1ペプチドに安定に融合された抗PCSK9抗体を含み、ここでGLP−1ペプチドのC末端は、ペプチドリンカーを介して抗PCSK9抗体に融合され、またここで抗PCSK9抗体はPCSK9ポリペプチドに結合し、かつGLP−1ペプチドはGLP−1受容体に結合する、二重活性融合分子を含む。一部の実施形態では、配列番号28または配列番号29のアミノ酸配列を含むGLP−1ペプチドは、配列番号4を含むリンカーを用いて、配列番号416を含むアミノ酸配列に融合される。さらなる実施形態では、請求項25または26に記載の二重活性融合分子であって、ヒトGLP−1受容体での効力は、配列番号28または配列番号29のアミノ酸配列を含むGLP−1ペプチドと比べて30〜60倍低下する、二重活性融合分子。
一部の実施形態は、本明細書に記載の融合分子をコードする単離されたポリヌクレオチドを含む。
特定の方法では、包含されるのは、本明細書に記載のポリヌクレオチドを含むベクターである。他の方法では、宿主細胞は、本明細書に記載のポリヌクレオチドまたはベクターを含む。
一部の実施形態では、融合分子を作成する方法は、宿主細胞を融合分子の発現を可能にする条件下で培養するステップと、融合分子を回収するステップと、を含む。
一部の方法では、医薬組成物は、本明細書に記載の融合分子および担体を含む。一部の方法では、キットは、本明細書に記載の組成物を含む。
さらなる目的および利点は、一部には以下に続く説明中に示されることになり、また一部には説明から自明となるか、または実行によって学習され得る。対象および利点は、特に添付の特許請求の範囲にて指摘される要素および組み合わせにより、実現され、達成されることになる。
前述の一般的説明および以下の詳細な説明の双方があくまで典型的かつ説明的なものであり、また特許請求の範囲を限定するものではないことは理解されるべきである。
添付の図面は、本明細書に組み込まれ、その一部を構成するものであり、1つの(いくつかの)実施形態を図示し、その記述とともに、本明細書に記載の原則を説明するのに役立つ。
配列の説明
表1は、本実施形態中で参照される特定の配列のリストを提供する。
表1は、本実施形態中で参照される特定の配列のリストを提供する。
実施形態の説明
I.抗PCSK9〜GLP−1融合分子
本開示は、抗体(例えば、抗PCSK9抗体またはその抗原結合断片)とGLP−1部分との融合を対象とする。
I.抗PCSK9〜GLP−1融合分子
本開示は、抗体(例えば、抗PCSK9抗体またはその抗原結合断片)とGLP−1部分との融合を対象とする。
一実施形態では、融合は、
GLP−1部分−リンカー−抗体軽鎖
または
GLP−1部分−リンカー−抗体重鎖
として構築される。
GLP−1部分−リンカー−抗体軽鎖
または
GLP−1部分−リンカー−抗体重鎖
として構築される。
融合タンパク質は、遺伝子融合として構築され得る。あるいは、融合タンパク質は、化学的コンジュゲートとして、例えばシステイン:システインジスルフィド結合を通じて構築してもよい。
GLP−1部分および抗体部分の他の配列もまた、本明細書の範囲内に含まれる。
A.抗体およびその抗原結合断片
1.抗PCSK9部分
抗体部分は、抗PCSK9抗体またはその抗原結合断片であってもよい。一実施形態では、抗PCSK9部分は、LDLc(悪玉コレステロール)低下効果を提供する。
1.抗PCSK9部分
抗体部分は、抗PCSK9抗体またはその抗原結合断片であってもよい。一実施形態では、抗PCSK9部分は、LDLc(悪玉コレステロール)低下効果を提供する。
一実施形態では、抗PCSK9 VL部分は、配列番号2(PC9_2_HS9)であってもよい。別の実施形態では、抗PCSK9 VL部分は、配列番号2の抗原結合部分であってもよい。一実施形態では、抗PCSK9 VL部分は、配列番号2の6つすべてのCDRを含んでもよい。一実施形態では、抗PCSK9 VH部分は、配列番号5に示されるように、抗体のpH依存性バージョンであってもよい。
一実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、抗体の抗原への結合がpH依存性であるように、pH依存性であってもよい。これは、抗体および/または抗原の半減期を変更するため、用いることができる。一実施形態では、抗体半減期を変更することは、半減期を延長することを意味する。一実施形態では、抗体半減期を変更することは、半減期を短縮することを意味する。一実施形態では、抗体半減期は、その融合パートナー(すなわちGLP−1)の安定性を最大化するため、変更(延長または短縮)してもよい。また、抗原半減期を変更することは、抗原抗体複合体が、例えば、抗体媒介性の分解(半減期を短縮すること)を通じて、または抗原を典型的な分解過程から保護すること(半減期を延長すること)により、抗原の半減期を変化させ得ることを意味し得る。一例では、pH5/5/pH7.4またはpH6.0/pH7.2でのKD比が2以上であるように、抗体は、エンドソームpH(すなわちpH5.5〜6.0)と比べて、pH7.4で抗原に対してより高い親和性を有し得る。pH依存性抗体を改変する方法は、米国特許出願公開第2011/0229489号明細書および米国特許出願公開第2014/0044730号明細書(参照により本明細書中に援用される)中に記載されている。
一実施形態では、抗PCSK9部分は、遊離PCSK9の持続的抑制を提供する。一実施形態では、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、または99%の抑制が提供される。
一実施形態では、PCSK9に特異的に結合することが可能な抗PCSK9抗体またはその抗原結合断片は、
a.配列番号1、5、8、または10に対して少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%同一である配列を含む重鎖可変領域;および
b.配列番号2、6、9または11に対して少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%同一である配列を含む軽鎖可変領域
を含む。
a.配列番号1、5、8、または10に対して少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%同一である配列を含む重鎖可変領域;および
b.配列番号2、6、9または11に対して少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%同一である配列を含む軽鎖可変領域
を含む。
一実施形態では、PCSK9に特異的に結合することが可能な抗PCSK9抗体またはその抗原結合断片は、
a.配列番号14と比べて1つの突然変異を有する配列を含む重鎖可変領域CDR1配列;
b.配列番号15、16、17、または18と比べて1つまたは2つの突然変異を有する配列を含む重鎖可変領域CDR2配列;
c.配列番号19と比べて1つの突然変異を有する配列を含む重鎖可変領域CDR3配列.
d.配列番号20、21、22、または23と比べて1つまたは2つの突然変異を有する配列を含む軽鎖可変領域CDR1配列;
e.配列番号24または25と比べて1つの突然変異を有する配列を含む軽鎖可変領域CDR2配列;および
f.配列番号26と比べて1つの突然変異を有する配列を含む軽鎖可変領域CDR3配列
を含む。
a.配列番号14と比べて1つの突然変異を有する配列を含む重鎖可変領域CDR1配列;
b.配列番号15、16、17、または18と比べて1つまたは2つの突然変異を有する配列を含む重鎖可変領域CDR2配列;
c.配列番号19と比べて1つの突然変異を有する配列を含む重鎖可変領域CDR3配列.
d.配列番号20、21、22、または23と比べて1つまたは2つの突然変異を有する配列を含む軽鎖可変領域CDR1配列;
e.配列番号24または25と比べて1つの突然変異を有する配列を含む軽鎖可変領域CDR2配列;および
f.配列番号26と比べて1つの突然変異を有する配列を含む軽鎖可変領域CDR3配列
を含む。
一実施形態では、PCSK9に特異的に結合することが可能な抗PCSK9抗体またはその抗原結合断片は、
a.配列番号14を含む重鎖可変領域CDR1配列;
b.配列番号15、16、17、または18を含む重鎖可変領域CDR2配列;
c.配列番号19を含む重鎖可変領域CDR3配列.
d.配列番号20、21、22、または23を含む軽鎖可変領域CDR1配列;
e.配列番号24または25を含む軽鎖可変領域CDR2配列;および
f.配列番号26を含む軽鎖可変領域CDR3配列
を含む。
a.配列番号14を含む重鎖可変領域CDR1配列;
b.配列番号15、16、17、または18を含む重鎖可変領域CDR2配列;
c.配列番号19を含む重鎖可変領域CDR3配列.
d.配列番号20、21、22、または23を含む軽鎖可変領域CDR1配列;
e.配列番号24または25を含む軽鎖可変領域CDR2配列;および
f.配列番号26を含む軽鎖可変領域CDR3配列
を含む。
別の実施形態では、抗PCSK9部分は、米国特許第8,030,457号明細書、米国特許第8,062,640号明細書、米国特許第8,357,371号明細書、米国特許第8,168,762号明細書、米国特許第8,563,698号明細書、米国特許第8,829,165号明細書、米国特許第8,859,741号明細書、米国特許第8,188,233号明細書、国際公開第2012/088313号パンフレット、米国特許出願公開第2012/0195910号明細書、米国特許第8,530,414号明細書、米国特許出願公開第2013/0189278号明細書、米国特許第8,344,144号明細書、米国特許出願公開第2011/0033465号明細書、米国特許第8,188,234号明細書、米国特許第8,080,243号明細書、米国特許出願公開第2011/0229489号明細書、米国特許出願公開第2010/0233177号明細書、米国特許出願公開第2013/315927号明細書および米国特許出願公開第2013/0071405号明細書のいずれかに記載される通りの抗PCSK9抗体または抗原結合断片を含んでもよい。これらの参考文献の各々は、抗PSCK9抗体およびその抗原結合断片の配列および説明について参照により援用される。
一実施形態では、抗PCSK9部分は、上の表1のグループB中の配列から選択される重鎖および軽鎖可変領域を含んでもよい。あるいは、抗PCSK9部分は、上の表1のグループBからの重鎖および軽鎖可変領域と同一のCDRを有する重鎖および軽鎖可変領域を含んでもよい。加えて、抗PCSK9部分は、配列番号53、55、57、59、61、または63から選択される重鎖可変領域および配列番号54、56、58、60、62、または64から選択される軽鎖可変領域を含んでもよい。あるいは、抗PCSK9部分は、配列番号53、55、57、59、61、または63のいずれか1つからの重鎖CDR1、CDR2、およびCDR3、ならびに配列番号54、56、58、60、62、または64のいずれか1つからの軽鎖CDR1、CDR2、およびCDR3を含んでもよい。
一実施形態では、抗PCSK9部分は、上の表1のグループC中の配列から選択される重鎖および軽鎖可変領域を含んでもよい。あるいは、抗PCSK9部分は、上の表1のグループCからの重鎖および軽鎖可変領域と同一のCDRを有する重鎖および軽鎖可変領域を含んでもよい。加えて、抗PCSK9部分は、配列番号65〜95から選択される重鎖可変領域および配列番号96〜126から選択される軽鎖可変領域を含んでもよい。あるいは、抗PCSK9部分は、配列番号65〜95のいずれか1つからの重鎖CDR1、CDR2、およびCDR3、ならびに配列番号96〜126のいずれか1つからの軽鎖CDR1、CDR2、およびCDR3を含んでもよい。
一実施形態では、抗PCSK9部分は、上の表1のグループD中の配列から選択される重鎖および軽鎖可変領域を含んでもよい。あるいは、抗PCSK9部分は、上の表1のグループDからの重鎖および軽鎖可変領域と同一のCDRを有する重鎖および軽鎖可変領域を含んでもよい。加えて、抗PCSK9部分は、配列番号127〜218から選択される重鎖可変領域および配列番号219〜311から選択される軽鎖可変領域を含んでもよい。あるいは、抗PCSK9部分は、配列番号127〜218のいずれか1つからの重鎖CDR1、CDR2、およびCDR3、ならびに配列番号219〜311のいずれか1つからの軽鎖CDR1、CDR2、およびCDR3を含んでもよい。
一実施形態では、抗PCSK9部分は、上の表1のグループE中の配列から選択される重鎖および軽鎖可変領域を含んでもよい。あるいは、抗PCSK9部分は、上の表1のグループEからの重鎖および軽鎖可変領域と同一のCDRを有する重鎖および軽鎖可変領域を含んでもよい。加えて、抗PCSK9部分は、配列番号312〜317から選択される重鎖可変領域および配列番号318〜323から選択される軽鎖可変領域を含んでもよい。あるいは、抗PCSK9部分は、配列番号312〜317のいずれか1つからの重鎖CDR1、CDR2、およびCDR3、ならびに配列番号318〜323のいずれか1つからの軽鎖CDR1、CDR2、およびCDR3を含んでもよい。
一実施形態では、抗PCSK9部分は、上の表1のグループF中の配列から選択される重鎖および軽鎖可変領域を含んでもよい。あるいは、抗PCSK9部分は、上の表1のグループFからの重鎖および軽鎖可変領域と同一のCDRを有する重鎖および軽鎖可変領域を含んでもよい。加えて、抗PCSK9部分は、配列番号324から選択される重鎖可変領域および配列番号325から選択される軽鎖可変領域を含んでもよい。あるいは、抗PCSK9部分は、配列番号324のいずれか1つからの重鎖CDR1、CDR2、およびCDR3、ならびに配列番号325のいずれか1つからの軽鎖CDR1、CDR2、およびCDR3を含んでもよい。
一実施形態では、抗PCSK9部分は、上の表1のグループG中の配列から選択される重鎖および軽鎖可変領域を含んでもよい。あるいは、抗PCSK9部分は、上の表1のグループGからの重鎖および軽鎖可変領域と同一のCDRを有する重鎖および軽鎖可変領域を含んでもよい。加えて、抗PCSK9部分は、配列番号326、339、340、または343〜400から選択される重鎖可変領域および配列番号327、341、または342から選択される軽鎖可変領域を含んでもよい。あるいは、抗PCSK9部分は、配列番号326、339、340、または343〜400のいずれか1つからの重鎖CDR1、CDR2、およびCDR3、ならびに配列番号327、341、または342のいずれか1つからの軽鎖CDR1、CDR2、およびCDR3を含んでもよい。さらに、抗PCSK9部分は、配列番号328(HC CDR1)、329(HC CDR2)、331(HC CDR2)、330(HC CDR3)、332(HC CDR3)からの重鎖CDR1、CDR2、およびCDR3、ならびに配列番号333(LC CDR1)、334(LC CDR2)、335(LC CDR3)、336(LC CDR1)、337(LC CDR2)、および338(LC CDR3)からの軽鎖CDR1、CDR2、およびCDR3を含んでもよい。一実施形態では、抗PCSK9部分は、配列番号491のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号492のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含んでもよい。あるいは、抗PCSK9部分は、配列番号493〜495からの重鎖CDR1、CDR2、およびCDR3および配列番号496〜498からの軽鎖CDR1、CDR2、およびCDR3を含んでもよい。
他の実施形態では、抗体部分は、抗PCSK9抗体以外の抗体(例えば、抗B7−H1抗体)を含んでもよい。一実施形態では、抗B7−H1抗体は、配列番号422のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号423のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含んでもよい。
2.抗体または抗原結合断片
本明細書で使用されるとき、抗体またはその抗原結合断片という用語は、最も広義に用いられる。それは、従来のハイブリドーマ技術、組換え技術によって産生されるモノクローナル抗体(mAb)および/またはその機能断片などの人工物であってもよい。それは、インタクトな免疫グロブリン分子、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体(mAb)、単一特異性抗体、二重特異性抗体、多特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、動物抗体(例えばラクダ科動物抗体)、キメラ抗体、ならびにそれらの部分、断片、領域、ペプチドおよび誘導体(任意の公知の技術、例えば限定はされないが、酵素切断、ペプチド合成、または組換え技術によって提供される)、例えば、軽鎖が欠損した免疫グロブリン、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv、抗体断片、ダイアボディー、Fd、CDR領域、あるいは抗原またはエピトープに結合することが可能な抗体の任意の部分またはペプチド配列などをいずれも含んでもよい。一実施形態では、機能的部分は、一本鎖抗体、一本鎖可変断片(scFv)、Fab断片、またはF(ab’)2断片である。
本明細書で使用されるとき、抗体またはその抗原結合断片という用語は、最も広義に用いられる。それは、従来のハイブリドーマ技術、組換え技術によって産生されるモノクローナル抗体(mAb)および/またはその機能断片などの人工物であってもよい。それは、インタクトな免疫グロブリン分子、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体(mAb)、単一特異性抗体、二重特異性抗体、多特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、動物抗体(例えばラクダ科動物抗体)、キメラ抗体、ならびにそれらの部分、断片、領域、ペプチドおよび誘導体(任意の公知の技術、例えば限定はされないが、酵素切断、ペプチド合成、または組換え技術によって提供される)、例えば、軽鎖が欠損した免疫グロブリン、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv、抗体断片、ダイアボディー、Fd、CDR領域、あるいは抗原またはエピトープに結合することが可能な抗体の任意の部分またはペプチド配列などをいずれも含んでもよい。一実施形態では、機能的部分は、一本鎖抗体、一本鎖可変断片(scFv)、Fab断片、またはF(ab’)2断片である。
抗体または機能的部分は、分子と特異的に反応し、それにより分子を抗体に結合させることが可能な場合、分子に「結合することが可能」であると言える。抗体断片または部分は、インタクトな抗体のFc断片が欠如し、より迅速に循環系から排除される場合があり、またインタクトな抗体よりも低い非特異性組織結合を有し得る。抗体の例が、当該技術分野で周知の方法を用いて、例えば(Fab断片を産生するための)パパインまたは(F(ab’)2断片を産生するための)ペプシンなどの酵素を用いたタンパク質分解切断により、インタクトな抗体から産生され得る。抗体の部分は、上記の方法のいずれかによって作成するか、または組換え分子の一部分を発現させることによって作成してもよい。例えば、組換え抗体の1つもしくは複数のCDR領域は、単離し、適切な発現ベクターにサブクローン化してもよい。
一実施形態では、抗体または機能的部分はヒト抗体である。ヒト治療におけるヒト抗体の使用は、非ヒト配列に対するヒト個体における免疫学的反応に起因する副作用の機会を減少させ得る。別の実施形態では、抗体または機能的部分はヒト化である。別の実施形態では、抗体または機能的部分はキメラ抗体である。この方法、目的の配列、例えば目的の結合部位などは、抗体または機能的部分に含めることができる。
一実施形態では、抗体は、IgG、IgA、IgM、またはIgEアイソタイプを有し得る。一実施形態では、抗体はIgGである。一態様では、抗PCSK9抗体またはその抗原結合断片は、IgG1であり得る。
3.定常ドメインに対する変更
一実施形態では、抗PCSK9抗体または抗原結合断片はFc領域を含む。本明細書で使用されるFc領域が、第1の定常領域免疫グロブリンドメインを除く、抗体の定常領域を含むポリペプチドを含むことが理解されるであろう。したがって、Fcは、IgA、IgD、およびIgGの最後の2つの定常領域免疫グロブリンドメイン、ならびにIgEおよびIgMの最後の3つの定常領域免疫グロブリンドメイン、ならびにこれらのドメインに対する可動性ヒンジN末端を示す。IgAおよびIgMについては、FcはJ鎖を含み得る。IgGについては、Fcは、免疫グロブリンドメインCガンマ2およびCガンマ3(Cγ2およびCγ3)、ならびにCガンマ1(Cγ1)とCガンマ2(Cγ2)との間のヒンジを含む。Fc領域の境界は変動し得るが、ヒトIgG重鎖Fc領域は通常、そのカルボキシル末端に残基C226またはP230を含むと定義され、ここで付番は、KabatらなどのEUインデックスに従う(1991,NIH Publication 91−3242,National Technical Information Service,Springfield,VA)。「Kabatで示されるEUインデックス」は、Kabatら、上記に記載される通りのヒトIgG1EU抗体の残基付番を示す。Fcは、単離におけるこの領域、あるいは抗体、抗体断片、またはFc融合タンパク質と関連したこの領域を示し得る。
一実施形態では、抗PCSK9抗体または抗原結合断片はFc領域を含む。本明細書で使用されるFc領域が、第1の定常領域免疫グロブリンドメインを除く、抗体の定常領域を含むポリペプチドを含むことが理解されるであろう。したがって、Fcは、IgA、IgD、およびIgGの最後の2つの定常領域免疫グロブリンドメイン、ならびにIgEおよびIgMの最後の3つの定常領域免疫グロブリンドメイン、ならびにこれらのドメインに対する可動性ヒンジN末端を示す。IgAおよびIgMについては、FcはJ鎖を含み得る。IgGについては、Fcは、免疫グロブリンドメインCガンマ2およびCガンマ3(Cγ2およびCγ3)、ならびにCガンマ1(Cγ1)とCガンマ2(Cγ2)との間のヒンジを含む。Fc領域の境界は変動し得るが、ヒトIgG重鎖Fc領域は通常、そのカルボキシル末端に残基C226またはP230を含むと定義され、ここで付番は、KabatらなどのEUインデックスに従う(1991,NIH Publication 91−3242,National Technical Information Service,Springfield,VA)。「Kabatで示されるEUインデックス」は、Kabatら、上記に記載される通りのヒトIgG1EU抗体の残基付番を示す。Fcは、単離におけるこの領域、あるいは抗体、抗体断片、またはFc融合タンパク質と関連したこの領域を示し得る。
一実施形態では、抗PCSK9抗体またはその抗原結合部分は、低下したエフェクター機能(例えば、低下したADCCおよび/またはCDC)を有する変異体Fc領域を有する。一実施形態では、Fc領域は、検出可能なエフェクター機能を有さない。一実施形態では、Fc領域は、Kabatに記載のEUインデックスによって付番されたものとして、234、235、および331から選択される1つ以上の位置に少なくとも1つの非天然アミノ酸を含む。具体的な実施形態では、本発明は、Fc変異体を提供し、ここでFc領域は、Kabatに記載のEUインデックスによって付番されたものとして、234F、235F、235Y、および331Sから選択される少なくとも1つの非天然アミノ酸を含む。さらなる具体的な実施形態では、本発明のFc変異体は、Kabatに記載のEUインデックスによって付番されたものとして、234F、235F、および331Sアミノ酸残基を含む。別の具体的な実施形態では、本発明のFc変異体は、Kabatに記載のEUインデックスによって付番されたものとして、234F、235Y、および331Sアミノ酸残基を含む。特定の実施形態では、抗PCSK9抗体またはその抗原結合部分は、変異体Fc領域を有し、ここで変異体は、Kabatに記載のEUインデックスによって付番されたものとして、位置234にフェニルアラニン(F)残基、位置235にフェニルアラニン(F)残基またはグルタミン酸(E)残基、および位置331にセリン(S)残基を含む。かかる突然変異の組み合わせは以降、三重突然変異体(TM)と称される。
Kabatに記載のEUインデックスによって付番されたものとして、セリン228プロリン突然変異(S228P)(以降、P突然変異と称される)は、特定のIgG4分子の安定性を高めることが報告されている(Lu et al.,J Pharmaceutical Sciences 97(2):960−969,2008)。Lu et al.では、その中で彼らはKabatに記載の「EUインデックス」ではなくKabat付番システムを用いることから、それは位置241と称される。
このP突然変異は、ADCCをさらにノックアウトするため、L235Eと組み合わせてもよい。突然変異のこの組み合わせは以降、二重突然変異(DM)と称される。
B.GLP−1部分
融合分子は、GLP−1部分を含む。GLP−1では、異名のグルカゴン様ペプチド−1をも参照され得る。GLP−1では、GLP−1類似体であるExendin−4をも参照される。一実施形態では、GLP−1部分は、グルコース調節および/または体重減少の恩恵をもたらす。
融合分子は、GLP−1部分を含む。GLP−1では、異名のグルカゴン様ペプチド−1をも参照され得る。GLP−1では、GLP−1類似体であるExendin−4をも参照される。一実施形態では、GLP−1部分は、グルコース調節および/または体重減少の恩恵をもたらす。
一実施形態では、完全長GLP−1分子は、融合タンパク質中で用いてもよい。別の実施形態では、GLP−1の断片は、融合タンパク質中のGLP−1部分として用いてもよい。
一実施形態では、GLP−1部分は、ジスルフィド架橋を可能にするシステイン残基対を有する。一実施形態では、システインは、親配列と比べて操作されたシステインである。一実施形態では、システインはE18C突然変異である。
一実施形態では、GLP−1の効力は、ヒトGLP−1受容体で、野生型GLP−1(例えば配列番号29)またはGLP−1類似体(例えば配列番号12)と比べて低下する。別の実施形態では、ヒトGLP−1受容体でのGLP−1の効力は、野生型GLP−1またはGLP−1類似体よりも少なくとも約10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、100倍、125倍、150倍、175倍、200倍、または225倍低い。別の実施形態では、効力はデュラグルチドと比べてほぼ同量低下する。GLP−1の効力は、副作用を低減しながらPCSK9の飽和を可能にする程度に低下し得る。一実施形態では、GLP−1部分は、GLP−1部分の効力を低減する少なくとも1つの突然変異を有し得る。一実施形態では、これは、限定はされないが悪心を含む副作用を低減するという恩恵をもたらす。一実施形態では、突然変異は点突然変異である。一実施形態では、点突然変異は、Exendin−4についてはV19A、G2V、E15A、またはL26Iから選択される。
一実施形態では、GLP−1部分は、配列番号3、7、12、13、または28〜42のいずれかを含む。別の実施形態では、GLP−1部分は、少なくとも10、15、20、または25アミノ酸を含む、配列番号3、7、12、13、または28〜42のいずれかの断片である。さらなる実施形態では、GLP−1部分は、配列番号3、7、12、13、または28〜42のいずれかに対して少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%同一である配列を含む。さらなる実施形態では、GLP−1部分は、配列番号3、7、12、13、または28〜42のいずれかと比べて1、2、3、4、5、または6つの突然変異を有する配列を含む。
C.融合およびリンカー
一実施形態では、GLP−1部分は、抗PCSK9抗体の軽鎖または抗原結合断片に直接的または間接的に融合される。別の実施形態では、GLP−1部分は、抗PCSK9抗体の重鎖または抗原結合断片に直接的または間接的に融合される。
一実施形態では、GLP−1部分は、抗PCSK9抗体の軽鎖または抗原結合断片に直接的または間接的に融合される。別の実施形態では、GLP−1部分は、抗PCSK9抗体の重鎖または抗原結合断片に直接的または間接的に融合される。
一実施形態では、リンカーは、抗PCSK9抗体または抗原結合断片とGLP−1部分との融合物を構築するため、用いてもよい。別の実施形態では、抗PCSK9抗体または抗原結合断片は、GLP−1部分に直接的にコンジュゲートしてもよい。
リンカーが用いられる場合、リンカーは、融合タンパク質に対する任意の好適なリンカーから選択してもよい。一実施形態では、リンカーは、単独でまたは他のアミノ酸と組み合わせて、1、2、3、または4セットのリピートのいずれかとして、GGGGS(配列番号27)リピートを含んでもよい。一実施形態では、リンカーは、単独でまたは他のアミノ酸と組み合わせて、GおよびSの他の組み合わせを含んでもよい。一部の実施形態では、リンカーは、C末端アラニン(A)を有する。
一実施形態では、具体的なリンカーは、GGGGSGGGGSGGGGSA(配列番号4)から選択してもよい。一実施形態では、リンカーは、抗体部分の場合には該当しないが、GLP−1部分のC末端とGLP−1分子の別の部分との間にジスルフィド架橋の形成を可能にする。かかる例において、柔軟性が制限されたリンカーは、抗体部分への望ましくないジスルフィド架橋を阻止し得る。
一実施形態では、リンカーは、配列番号4に対して少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%同一である。
一実施形態では、システイン:システインジスルフィド架橋は、GLP−1部分においてシステイン置換変異を作成することによって形成される。一実施形態では、突然変異はE18Cである。
II.融合分子をコードする核酸
本実施形態は、上のセクションIに記載の融合分子のいずれかをコードする単離、合成、または組換え核酸配列をさらに提供する。かかる核酸は、本明細書に示される重鎖および軽鎖配列をコードする。あるいは、かかる核酸は、GLP−1部分に部分的に融合された抗PCSK9抗体または抗原結合部分を含む。核酸コードの縮重によって複数の核酸が同じアミノ酸をコードすることになり、すべては本明細書中に包含される。
本実施形態は、上のセクションIに記載の融合分子のいずれかをコードする単離、合成、または組換え核酸配列をさらに提供する。かかる核酸は、本明細書に示される重鎖および軽鎖配列をコードする。あるいは、かかる核酸は、GLP−1部分に部分的に融合された抗PCSK9抗体または抗原結合部分を含む。核酸コードの縮重によって複数の核酸が同じアミノ酸をコードすることになり、すべては本明細書中に包含される。
III.融合分子、製剤、および医薬組成物を作成する方法
一実施形態は、融合分子を生成するように核酸が発現される条件下で宿主細胞を培養し、その後融合分子を回収することにより、融合分子を生成する方法を含む。融合分子を発現するため、限定はされないが哺乳類細胞株を含む種々の細胞株を用いてもよい。一実施形態では、細胞株はヒトであってもよい。別の実施形態では、細菌または昆虫細胞株を用いてもよい。一実施形態では、細胞株は、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、CHO細胞(例えばDG44)の変異体、293細胞、およびNS0細胞を含む。別の実施形態では、細胞株は、VERY、BHK、Hela、COS、MDCK、293F、293T、3T3、W138、BT483、Hs578T、Sp2/0、HTB2、BT2O、T47D、CRL7O3O、およびHsS78Bst細胞を含む。
一実施形態は、融合分子を生成するように核酸が発現される条件下で宿主細胞を培養し、その後融合分子を回収することにより、融合分子を生成する方法を含む。融合分子を発現するため、限定はされないが哺乳類細胞株を含む種々の細胞株を用いてもよい。一実施形態では、細胞株はヒトであってもよい。別の実施形態では、細菌または昆虫細胞株を用いてもよい。一実施形態では、細胞株は、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、CHO細胞(例えばDG44)の変異体、293細胞、およびNS0細胞を含む。別の実施形態では、細胞株は、VERY、BHK、Hela、COS、MDCK、293F、293T、3T3、W138、BT483、Hs578T、Sp2/0、HTB2、BT2O、T47D、CRL7O3O、およびHsS78Bst細胞を含む。
組換え発現では、融合分子をコードするポリヌクレオチドを有する発現ベクターの構築が用いられる。一旦ポリヌクレオチドが得られていれば、融合分子を生成するためのベクターは、当該技術分野で周知の組換えDNA技術により生成してもよい。発現ベクターは、適切な転写および翻訳制御シグナルを含んでもよい。これは、インビトロ組換えDNA技術、合成技術、およびインビボ遺伝的組換えを用いて行ってもよい。一実施形態では、複製可能なベクターは、異種プロモーターに作動可能に連結された抗体または機能的部分をコードする核酸配列を含む。
種々の宿主−発現ベクター系は、米国特許第5,807,715号明細書中に記載されるように融合分子を発現するために用いてもよい。例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)などの哺乳類細胞は、ヒトサイトメガロウイルス(cytomegalovirus)由来の主要な中間体初期遺伝子プロモーター要素などのベクターと併用すると、抗体のための有効な発現系である(Foecking et al.,Gene,45:101(1986);およびCockett et al.,Bio/Technology,8:2(1990))。さらに、挿入された配列の発現を調節するか、または所望される特異的な様式で遺伝子産物を修飾し、プロセシングする宿主細胞株を選択してもよい。タンパク質産物のかかる修飾(例えばグリコシル化)およびプロセシング(例えば切断)は、タンパク質の機能にとって重要であり得る。種々の宿主細胞は、タンパク質および遺伝子産物の翻訳後プロセシングおよび修飾における特徴および特異的機構を有する。適切な細胞株または宿主系は、本発明のタンパク質の正確な修飾およびプロセシングを保証するように選択することができる。この目的のため、遺伝子産物の一次転写、グリコシル化、およびリン酸化の適切なプロセシングのための細胞機構を有する真核宿主細胞を用いてもよい。
細菌系においては、いくつかの発現ベクターは、融合分子が発現されることを意図した用途に応じて選択してもよい。例えば、融合分子を含む医薬組成物の作成を目的として大量のかかる融合分子の生成が意図される場合、容易に精製される高レベルの融合タンパク質産物の発現を誘導するベクターが望ましい場合がある。かかるベクターとして、限定はされないが、融合タンパク質が生成されるようにコード配列が個別にlac Zコード領域とフレームを揃えてベクターに連結可能である大腸菌(E.Coli)発現ベクターpUR278(Ruther et al.,EMBO,12:1791(1983));pINベクター(Inouye & Inouye,1985,Nucleic Acids Res.13:3101−3109(1985);Van Heeke & Schuster,1989,J.Biol.Chem.,24:5503−5509(1989))などが挙げられる。pGEXベクターもまた、外来ポリペプチドをグルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST)との融合タンパク質として発現するように用いてもよい。一般に、かかる融合タンパク質は、可溶性であり、グルタチオン−アガロース親和性マトリックスへの吸着および結合、その後の遊離グルタチオンの存在下での溶出により、溶解細胞から容易に精製することができる。pGEXベクターは、クローン化標的遺伝子産物がGST部分から放出され得るように、トロンビンおよび/または第Xa因子プロテアーゼ切断部位を発現されるポリペプチドに導入するように設計される。
昆虫系では、オートグラファカリフォルニカ(Autographa californica)核多角体病ウイルス(AcNPV)は、外来遺伝子を発現するためのベクターとして用いられる。ウイルスは、ツマジロクサヨトウ(Spodoptera frugiperda)細胞内で成長する。タンパク質コード配列は、ウイルスの非必須領域(例えばポリヘドリン遺伝子)に個別にクローン化され、AcNPVプロモーター(例えば、ポリヘドリンプロモーター)の制御下に置くことができる。
哺乳類宿主細胞では、いくつかのウイルスに基づく発現系を用いてもよい。アデノウイルスが発現ベクターとして用いられる場合、目的のコード配列は、アデノウイルス転写/翻訳制御複合体、例えば後期プロモーターおよび三部分リーダー配列(tripartite leader sequence)に連結してもよい。次に、このキメラ遺伝子は、インビトロまたはインビボ組換えにより、アデノウイルスゲノムに挿入してもよい。ウイルスゲノムの非必須領域(例えば領域E1またはE3)への挿入は、生存可能でかつ感染宿主内で抗体または機能的部分を発現可能な組換えウイルスを生じることになる(例えば、Logan & Shenk,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:355−359(1984)を参照)。特異的な開始シグナルはまた、挿入された抗体または機能的部分のコード配列の効率的翻訳に要求される場合がある。これらのシグナルは、ATG開始コドンおよび隣接配列を含む。さらに、開始コドンは、全挿入物の翻訳を保証するには、一般に、所望されるコード配列のリーディングフレームとフレームを揃える必要がある。これらの外因性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然および合成の双方で種々の起源を有し得る。発現の効率は、適切な転写エンハンサー要素、転写ターミネーターなどを含めることにより、高めることができる(例えば、Bittner et al.,Methods in Enzymol.,153:51−544(1987)を参照)。
安定的発現は、組換えタンパク質の長期にわたる高収量の生成のため、用いることができる。例えば、融合分子を安定的に発現する細胞株は作成可能である。宿主細胞は、発現制御要素(例えば、プロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など)を含む適切に操作されたベクターおよび選択可能マーカー遺伝子を用いて形質転換することができる。外来DNAの導入後、細胞は、強化培地中で1〜2日間成長させておいてもよく、次に選択培地に変更される。組換えプラスミド中の選択可能マーカーは、選択に耐性を与え、プラスミドを染色体に安定的に組み込んだ細胞が成長し、フォーカスを形成することを可能にし、それは次いで細胞株にクローン化し、拡張することができる。融合分子をコードするプラスミドは、遺伝子/cDNAを、培養液中での生成に適した任意の細胞株に導入するため、用いることができる。
いくつかの選択系を用いてもよく、例えば限定はされないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(Wigler et al.,Cell,11:223(1977)),ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Szybalska & Szybalski,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,48:202(1992))、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Lowy et al.,Cell,22:8−17(1980))遺伝子は各々、tk−、hgprt−またはaprT−細胞において用いることができる。また、代謝拮抗物質耐性は、以下の遺伝子、すなわち、メトトレキサートに対する耐性を与えるdhfr(Wigler et al.,Natl.Acad.Sci.USA,77:357(1980);O’Hare et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,78:1527(1981));ミコフェノール酸に対する耐性を与えるgpt(Mulligan & Berg,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,78:2072(1981));アミノグリコシドG−418に対する耐性を与えるneo(Wu and Wu,Biotherapy 3:87−95(1991);Tolstoshev,Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32:573−596(1993);Mulligan,Science 260:926−932(1993);およびMorgan and Anderson,Ann.Rev.Biochem.62:191−217(1993);May,TIB TECH 11(5):155−215(1993));ならびにハイグロマイシンに対する耐性を与えるhygro(Santerre et al.,Gene,30:147(1984))の選択における基盤として用いることができる。組換えDNA技術に関する一般的に当該技術分野で公知の方法は、所望される組換えクローンを選択するため、ルーチン的に適用してもよく、かかる方法は、例えば、Ausubel et al.(eds.),Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,NY(1993);Kriegler,Gene Transfer and Expression,A Labolatory Manual,Stockton Press,NY(1990);およびin Chapters 12 and 13,Dracopoli et al.(eds.),Current Protocols in Human Genetics,John Wiley & Sons,NY(1994);Colberre−Garapin et al.,1981,J.Mol.Biol.,150:1に記載されている。
融合分子は、組換え発現によって生成されている場合、精製についての当該技術分野で公知の任意の方法により、例えばクロマトグラフィー(例えば、イオン交換、親和性、特に特異的抗原のプロテインAまたはプロテインGに対する親和性によるもの、およびサイジングカラムクロマトグラフィー)、遠心分離、示差溶解度(differential solubility)により、またはタンパク質精製用の任意の他の標準的技法により、精製してもよい。
さらに、提供されるのは、代謝疾患、例えば2型糖尿病の治療用に配合された、本明細書に提供される有効量の二重活性融合分子を含有する組成物、例えば医薬組成物である。
本開示の組成物は、公知の方法に従って配合することができる。好適な調製方法が、例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences,19th Edition,A.R.Gennaro,ed.,Mack Publishing Co.,Easton,PA(1995)(その全体が参照により本明細書中に援用される)に記載されている。組成物は、種々の形態、例えば限定はされないが、水溶液、乳濁液、ゲル、懸濁液、凍結乾燥形態、または当該技術分野で公知の任意の他の形態であり得る。さらに、組成物は、例えば、希釈剤、結合剤、安定剤、および防腐剤を含む、薬学的に許容できる添加剤を含有し得る。一旦配合されると、本開示の組成物は、被験体に直接的に投与することができる。
本開示の組成物で使用可能な担体は、当該技術分野で周知であり、限定はされないが、例えば、甲状腺グロブリン、ヒト血清アルブミンなどのアルブミン、破傷風トキソイド、およびポリアミノ酸、例えば、ポリL−リジン、ポリL−グルタミン酸、インフルエンザ、B型肝炎ウイルスコアタンパク質などを含む。種々の水性担体、例えば、水、緩衝化水、0.8%生理食塩水、0.3%グリシン、ヒアルロン酸などは使用可能である。組成物は、従来の周知される滅菌技法により滅菌可能か、または濾過滅菌可能である。得られた組成物は、そのまま用いるためにパッケージングするか、または凍結乾燥することができ、凍結乾燥調製物は投与前に滅菌溶液と結合されている。組成物は、生理的状態に近づけるのに必要とされる薬学的に許容できる助剤物質、例えばpH調整剤および緩衝剤、等張化剤、浸潤剤など、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンラウリン酸モノエステル、トリエタノールアミンオレアート(triethanolamineoleate)などを含有し得る。
IV.抗PCSK9〜GLP−1融合分子を使用するための方法およびキット
抗PCSK9〜GLP−1融合物は、糖尿病またはT2型糖尿病を治療するため、用いてもよい。一実施形態では、患者はT2型糖尿病を有する。一実施形態では、患者は、高い心血管リスク特性を有する。別の実施形態では、患者は、T2型糖尿病と高心血管リスク特性の双方を有する。高心血管リスク特性は、患者が、1つ以上の要素、すなわち、高コレステロール、高LDLコレステロール、低HDLコレステロール、高血圧、アテローム動脈硬化症、肥満、先行的な心血管イベント(狭心症、心臓発作、一過性脳虚血発作、脳卒中などを含む)、心血管イベントの家族歴、喫煙、高トリグリセリド、身体活動性の不足、調節不良の血糖などに起因し、より高い心血管イベントリスクを有することを意味する。
抗PCSK9〜GLP−1融合物は、糖尿病またはT2型糖尿病を治療するため、用いてもよい。一実施形態では、患者はT2型糖尿病を有する。一実施形態では、患者は、高い心血管リスク特性を有する。別の実施形態では、患者は、T2型糖尿病と高心血管リスク特性の双方を有する。高心血管リスク特性は、患者が、1つ以上の要素、すなわち、高コレステロール、高LDLコレステロール、低HDLコレステロール、高血圧、アテローム動脈硬化症、肥満、先行的な心血管イベント(狭心症、心臓発作、一過性脳虚血発作、脳卒中などを含む)、心血管イベントの家族歴、喫煙、高トリグリセリド、身体活動性の不足、調節不良の血糖などに起因し、より高い心血管イベントリスクを有することを意味する。
他の実施形態では、抗PCSK9〜GLP−1融合物は、限定はされないが、NASH、肥満、高コレステロール血症、および主要な有害な心血管イベント(MACE)、例えば限定はされないが、急性冠症候群(ACS)、脳卒中、心不全、および悪性リズム障害を含む他の疾患を治療するため、用いてもよい。
一実施形態では、融合分子は、投与時、安定性が高まっている。一実施形態では、安定性の高まりは、マウスへのインビボ投与において、それをベンチマーク対照化合物のデュラグルチド、Fc断片と融合されたGLP−1類似体と比較することによって示される。
一実施形態では、融合分子は、GLP−1受容体で増強された効力を有する。一実施形態では、効力の低下は、ベンチマーク対照化合物デュラグルチドおよび/または野生型GLP−1にわたりヒトGLP−1受容体で示される。
一部の実施形態では、融合分子は、被験体において体重減少を促進する。
一実施形態では、融合分子は、注射により投与される。
他の実施形態では、本開示は、本明細書に記載の方法を実施するために用いることができる、二重活性融合分子を含むキットを提供する。特定の態様では、キットは、1つ以上の容器内に本明細書に開示される二重活性融合分子を含む。本明細書に提供されるキットは、併用療法のための追加的な組成物を含み得る。当業者は、開示される二重活性融合分子を当該技術分野で周知の確立されたキット形式の一つに容易に組み込むことができることを容易に理解するであろう。
ここでは本例示的実施形態が詳細に参照されることになり、その例は添付の図面において図示される。同じ参照番号は、可能な限り、同一または同様の部分を指すように図面全体を通じて用いられることになる。他の実施形態は、本明細書に開示される明細書および実行の考察から当業者に明らかであろう。本実施形態は、以下の実施例においてさらに説明される。これらの実施例は、特許請求の範囲の範囲を限定することはなく、単に特定の実施形態を明らかにするのに役立つ。本明細書および実施例があくまで例示的なものとして解釈され、真の範囲および精神が以下の特許請求の範囲によって示されるように意図されている。
実施例1 抗体最適化
抗PCSK9抗体PC9#2(可変重鎖および軽鎖に対して各々、配列番号8および9)は次のように最適化されている。
1_PCSK9抗原への結合に有意に影響することなく、アミノ酸を最も近いヒト生殖系列配列に対応するものに復帰させることにより、免疫原性リスクを低減する。
2_ヒスチジン残基VH_52、VL_30およびVL_50(Kabat付番)を突然変異させることにより、PCSK9へのpH依存性結合を除去する。
3_PCSK9/GLP−1ペプチド抗体融合分子の投与後、標的と効率的に会合させ、十分な遊離PCSK9の抑制を達成するため、生理学的pHでヒトPCSK9に対する親和性を改善する。
抗PCSK9抗体PC9#2(可変重鎖および軽鎖に対して各々、配列番号8および9)は次のように最適化されている。
1_PCSK9抗原への結合に有意に影響することなく、アミノ酸を最も近いヒト生殖系列配列に対応するものに復帰させることにより、免疫原性リスクを低減する。
2_ヒスチジン残基VH_52、VL_30およびVL_50(Kabat付番)を突然変異させることにより、PCSK9へのpH依存性結合を除去する。
3_PCSK9/GLP−1ペプチド抗体融合分子の投与後、標的と効率的に会合させ、十分な遊離PCSK9の抑制を達成するため、生理学的pHでヒトPCSK9に対する親和性を改善する。
A)生殖系列化(Germlining)
抗PCSK9抗体PC9#2のVHおよびVLドメインのアミノ酸配列をVBASEデータベース内の公知のヒト生殖系列配列に整列し(Tomlinson,1997;http://vbase.mrc−cpe.cam.ac.uk/)、配列類似性により、最も近いヒト生殖系列が、可変重鎖および軽鎖に対して各々、1−46(DP−7)(配列番号417)およびVK1O18O8(DPK1)(配列番号418)であることが同定された。図1Eおよび1Fは、PC9#2可変ドメインとその生殖系列配列との整列化を示している。
抗PCSK9抗体PC9#2のVHおよびVLドメインのアミノ酸配列をVBASEデータベース内の公知のヒト生殖系列配列に整列し(Tomlinson,1997;http://vbase.mrc−cpe.cam.ac.uk/)、配列類似性により、最も近いヒト生殖系列が、可変重鎖および軽鎖に対して各々、1−46(DP−7)(配列番号417)およびVK1O18O8(DPK1)(配列番号418)であることが同定された。図1Eおよび1Fは、PC9#2可変ドメインとその生殖系列配列との整列化を示している。
ヒトPCSK9抗原と複合した抗PCSK9 PC9#2抗体の構造モデルが、PC9#2可変ドメインの一次アミノ酸配列を用いて作成され、別の抗PCSK9抗体と複合したヒトPCSK9の先行的に記載された結晶構造が、PBD IDコード3SQOを用いて、タンパク質データバンク(Protein Data Bank)に寄託されている(Liang et al.,2012,J.Pharm.Exp.Ther.,Vol.340,p228−236)。
その構造モデルを用いて、以下の残基、すなわち可変重鎖におけるArg56、Asn58、Glu61、Lys64およびSer65、ならびに可変軽鎖におけるArg24(Kabat付番)が、PCSK9抗原と非接触であるにもかかわらず溶媒に曝露されたものとして同定された。それらの残基が最も近い生殖系列配列と異なり、溶媒に曝露され得ることから、それらはいくつかの免疫原性リスクを呈し得る。理論に縛られることはないが、それらの残基の突然変異は、同残基が抗体とその抗原との間の相互作用ネットワークに寄与しないものであることから、抗体がPCSK9に強力に結合する能力に有意に影響するものではない。
次に、可変重鎖および軽鎖の各々に対する配列番号5および6の抗体PC9#2_FGを作成するため、標準の分子生物学技術を用いて、突然変異R56S、N58S、E61Q、K64QおよびS65GをPC9#2重鎖配列に、またK24Qを軽鎖に導入した。
抗PCSK9のPC9#2およびPC9#2_FGを、実施例2に記載のようにヒトIgG1−TM抗体として生成し、実施例17に記載のようにBiacoreを用いてヒトPCSK9への結合について特徴づけた。それらの化合物におけるpH7.4での動態パラメータを表2にまとめる。両抗体は、ヒトPCSK9に対して類似のオンレート、オフレートおよび親和性を呈し、これは生殖系列化突然変異誘発が抗原結合に対して影響を有しなかったことを示す。
B)pH依存性結合を除去し、ヒトPCSK9に対する親和性を改善すること
抗PCSK9抗体のPC9#2およびPC9#2_FGは、生理学的pHでヒトPCSK9抗原に強力に結合するが、酸性pHでその標的から迅速に解離することから、pH依存性の結合特性を呈する。その特徴は、抗体が、リソソームに送られて分解されるのでなく、細胞表面で再利用されるように、エンドソームの酸性区画内でPCSK9から解離することを可能にするものとする。この場合、インビボ半減期がより長い抗体に最終的に翻訳されるはずである。
抗PCSK9抗体のPC9#2およびPC9#2_FGは、生理学的pHでヒトPCSK9抗原に強力に結合するが、酸性pHでその標的から迅速に解離することから、pH依存性の結合特性を呈する。その特徴は、抗体が、リソソームに送られて分解されるのでなく、細胞表面で再利用されるように、エンドソームの酸性区画内でPCSK9から解離することを可能にするものとする。この場合、インビボ半減期がより長い抗体に最終的に翻訳されるはずである。
表3は、以下の修飾ではなく、実施例17に記載のようにBiacoreによって測定されたpH7.4(生理学的)およびpH6.0(酸性)でのヒトPCSK9とのそれら2つの化合物のオフレート(kd)を比較したものである。CM5チップ上への抗体捕捉後、ランニングバッファーpH7.4(10mMリン酸ナトリウム、pH7.4、150mM塩化ナトリウム、1mg/mL BSA、0.05%ツイーン20)中、1nM〜200nMの範囲の濃度に希釈されたヒトPCSK9抗原を10分間注射した。会合段階後、pH7.4またはpH6.0でのランニングバッファーを10分の解離段階にわたり注射した。全体的な解離速度を、1:1の結合動力学的モデルを用いて算出した。
インビボ半減期が長い抗体は、PCSK9に結合できるが、GLP−1類似体ペプチド中で分解され、ひいてはGLP−1受容体を活性化することができない、薬物代謝産物の蓄積をもたらし得ることから、PCSK9/GLP−1融合分子にとって望ましくない。
さらに、抗PCSK9 PC9#2の軽鎖に面するGLP−1類似体ペプチドの遺伝子融合は、実施例5、表11に示すように、PC9#2抗体(7nM)と比べて、ヒトPCSK9(19nM)に対する化合物の親和性に少し影響していた。次に、PC9#2_FGの親和性成熟は、ヒトPCSK9抗原に対する親和性に対するGLP−1類似体の軽鎖融合の負の影響を均衡させるため、必要とされた。
pH依存性結合を除去するため、重鎖の位置52ならびに軽鎖の位置30および50におけるヒスチジン残基は、突然変異を受ける必要がある。上記の構造モデルおよびその後のヒトPCSK9と複合したPC9#2の分析に基づき、以下の突然変異、すなわち重鎖H52KまたはH52S、軽鎖H30Y、H30KまたはH30Sおよび軽鎖H50YまたはH50Sが、PCSK9への抗体結合にとって潜在的に有利なものとして同定され、親和性の改善をもたらすことができた。
最適化された抗体を産生するため、PC9#2_FGの配列内でのそれらすべての突然変異の組み合わせを、標準の分子生物学技術を用いて作成した。表4は、組み合わせ実験から得られた種々の化合物をまとめたものである。
PC9#2_FG軽鎖におけるH30SおよびH50Y突然変異の組み合わせは機能できず、その後、化合物#5および#11は作成されていない。
抗体は、実施例2に記載のようにヒトIgG1−TMとして生成し、実施例3に記載されるようにエピトープ競合アッセイを用いて、PC9#2のヒトPCSK9への結合を遮断するその能力について試験した。データは、表5にまとめ、HS7、HS9およびHS10が親抗体PC9#2_FGと比べて少なくとも10倍低いIC50を有することを示し、これはそれら抗体がPCSK9に対してPC9#2_FGより有意に優れた親和性を有し得ることを示唆する。
抗体HS9は、実施例17に記載のように、Biacoreにより、生理学的pHでのヒトPCSK9に対するその結合パラメータについてさらに特徴づけ、親抗体PC9#2_FGと比較している。表6に示すように、操作された抗PCSK9抗体HS9は、主にオフレート(kd)の低下に起因し、生理学的pHでのヒトPCSK9に対する親和性について、PC9#2_FGと比べて3倍の改善を示す。
別々の実験において、HS9抗PCSK9抗体のpH依存性結合を、上記のようにBiacoreを用いてPC9#2_FGと比較している。表7は、それら2つの化合物についての生理学的pHおよび酸性pHでの解離定数(kd)を示している。pH6.0ではpH7.4でよりも迅速に解離するPC9#2_FGに対して、HS9は、酸性pHで生理学的pHでよりも低いkdを示し、これはHS9がpH6.0ではpH7.4でよりも緩徐にPCSK9から解離することを示す。
実施例2 二重作用融合分子の調製
二重作用融合分子は、GLP−1部分−リンカー−抗体軽鎖についての図1Aで示される大規模構造に従って作成した。配列番号3をGLP−1部分として用い、配列番号4をリンカーとして用い、また配列番号1および2を各々、重鎖および軽鎖として用いた。
二重作用融合分子は、GLP−1部分−リンカー−抗体軽鎖についての図1Aで示される大規模構造に従って作成した。配列番号3をGLP−1部分として用い、配列番号4をリンカーとして用い、また配列番号1および2を各々、重鎖および軽鎖として用いた。
この実施形態では、GLP−1受容体を最も効率的に会合させ、活性化するため、GLP−1類似体ペプチドのN末端を遊離させ、ペプチドを抗体可変ドメインのN末端に融合した。ペプチドおよび/または抗体の活性に対する融合の影響を最小化するため、リンカー配列を、ペプチドの末端と可変ドメインの開始点との間の多数の構築物において用いた。1つの融合分子あたり2つのペプチド部分を得るため、ペプチドは抗体の重鎖または軽鎖のいずれかで融合した。かかる融合物の大規模構造は、図1B(重鎖融合)および図1C(軽鎖融合)に示す。一部の実施形態では、ペプチドは、(図1D中に予測的に示す)1つの融合分子あたり4つのペプチド部分を呈するように、重鎖および軽鎖の双方に融合してもよい。
抗体可変ドメインとの融合物中のGLP−1類似体ペプチドをコードする遺伝子は、標準的方法を用いて重複PCRにより構築した。固有の制限部位は、発現ベクター中でのクローニングを可能にするため、DNA断片の5’および3’末端に組み込んだ。
VHドメインは、ペプチド/リンカー融合の有無にかかわらず、哺乳類細胞内で全IgG1三重突然変異体(IgG1−TM)重鎖を発現するように、ヒト重鎖定常ドメインおよび調節エレメントを有するベクターにクローン化した。IgG1−TM形式は、ヒトIgG1に類似しているが、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性および補体依存性細胞傷害性を誘発するその能力を低減するように、Fc配列に突然変異L234F、L235EおよびP331Sを組み入れている(Oganesyan V.et al.,2008,Acta Cryst.,D64:700_704)。VLドメインは、ペプチド/リンカー融合の有無にかかわらず、哺乳類細胞内で全IgG軽鎖を発現するように、ヒト軽鎖定常ドメインおよび調節エレメントの発現用ベクターにクローン化した。OriP断片は、CHO細胞での使用を促進する、またエピソーム複製を可能にするように、重鎖および軽鎖発現ベクター中に含めた。
IgGおよびペプチド抗体融合物を得るため、重鎖および軽鎖を発現するベクターを、30mL(小規模)または400mL(中規模)のCHO哺乳類細胞に一過性にトランスフェクトした。表8は、ペプチド/リンカー融合の有無にかかわらず、重鎖および軽鎖を発現するベクターの同時トランスフェクションによって得られ得る種々の生成物をまとめている。
化合物は、発現させ、培地に分泌させた。回収物をプールし、プロテインAクロマトグラフィーを用いる化合物精製前に濾過した。培養上清を適切なサイズのMabSelectSure(GE Healthcare Life Sciences)のカラムに負荷し、1×DPBS(Gibco)で洗浄した。結合化合物は、0.1Mクエン酸ナトリウムpH3.0を用いてカラムから溶出させ、pH9.0でのトリス−HClの添加により中和した。小規模トランスフェクションにおいては、溶出材料に対して、PD10カラム(GE Healthcare)を用いて1×DPBSに緩衝液交換を行った。中規模トランスフェククションにおいては、溶出材料は、最大5mlの試料容積に対するHiLoad 16/600 Superdex 200プレップグレードカラム(GE Healthcare)または最大12mlの試料容積に対するHiLoad 26/600 Superdex 200カラム(GE Healthcare)のいずれかを用いて、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)により、さらに精製した。ランニングバッファーとして1×DPBSを用いて、定組成溶離を実施した。
化合物濃度を、Mach,H.et al.,Statistical determination of the average values of the extinction coefficients of tryptophan and tyrosine in native proteins,Anal Biochem,200(1):74−80(1992)におけるプロトコルによるアミノ酸配列に基づく吸光係数を用いて、分光光度的に測定した。精製した化合物を、SEC−HPLCおよびSDS−PAGEを用いて、凝集および分解について分析した。SEC−HPLCを、1mL/分の流速およびランニングバッファーとしてpH6.8での0.1M無水二塩基性リン酸ナトリウム+0.1M硫酸ナトリウムを用いて、70μLの試料をTSKgel G3000SWXL 7.8mm×300mmカラム(Tosoh Bioscience)に負荷することにより実施した。SDS−PAGEは、1×Nu PAGE(登録商標)MES SDSランニングバッファー(Invitrogen)を用いて、2μgのタンパク質をNu PAGE(登録商標)4%〜12%ビス−トリス(Invitrogen)に負荷することにより実行する。中規模のトランスフェククションからの化合物を、エレクトロスプレーイオン化質量分析(ESI−MS)により、完全性についてさらに特徴づけ、カブトガニ血球抽出成分(LAL)Kinetic−QCL(Lonza)を用いて、内生毒素レベルについて試験した。ESI−MS分析においては、試料をpH8.0の10mMトリス−HCl中、1mg/mLで調製した。分析前、10mM DTTを用いて37℃で30分の還元を実施した。データは、Waters SYNAPT G1 QTOF質量分析計と連結されたWaters ACQUITY UPLC(登録商標)I−Classシステムを用いて得て、MassLynxソフトウェアを用いて操作した。用いた移動相は、高度精製水+0.01%トリフルオロ酢酸(TFA)、0.1%ギ酸(A)およびアセトニトリル+0.01%TFA、0.1%FA(B)であった。重鎖と軽鎖の分離は、60℃で加熱した2.1mm×50mmのWaters BEH300 C4カラムを用いて行った。流速は0.3mL/分に設定し、全実行時間は22分であった。試料(10pmol)をカラムに注入し、MSデータは、以下のエレクトロスプレーソースパラメータ、すなわち、キャピラリー電圧:3.4kV、ソース温度:81℃、脱溶媒和温度:24℃を用いて、正のイオンモードで得た。データは、500〜4500Daの間で得た。
実施例3 抗PCSK9抗体との遺伝子融合物中のGLP−1類似体のインビトロ特徴づけ
GLP−1受容体作動薬ペプチドと抗PCSK9抗体との間の遺伝子融合によって二重活性分子を作成する実現可能性を評価するため、配列番号28のGLP−1類似体ペプチドを、配列番号4のリンカーを用いて、7つの異なる予め同定された抗PCSK9抗体の重鎖または軽鎖可変ドメインに融合した。
GLP−1受容体作動薬ペプチドと抗PCSK9抗体との間の遺伝子融合によって二重活性分子を作成する実現可能性を評価するため、配列番号28のGLP−1類似体ペプチドを、配列番号4のリンカーを用いて、7つの異なる予め同定された抗PCSK9抗体の重鎖または軽鎖可変ドメインに融合した。
1_配列番号10の抗体可変重鎖および配列番号11の抗体可変軽鎖を有するPC9#1。
2_配列番号8の抗体可変重鎖および配列番号9の抗体可変軽鎖を有するPC9#2。
3_配列番号404の抗体可変重鎖および配列番号405の抗体可変軽鎖を有するPC9#3。
4_配列番号406の抗体可変重鎖および配列番号407の抗体可変軽鎖を有するPC9#4。
5_配列番号408の抗体可変重鎖および配列番号409の抗体可変軽鎖を有するPC9#5。
6_配列番号410の抗体可変重鎖および配列番号411の抗体可変軽鎖を有するPC9#6。
7_配列番号412の抗体可変重鎖および配列番号413の抗体可変軽鎖を有するPC9#7。
各ペプチド−抗体融合物のPCSK9活性は、均一時間分解蛍光(HTRF)エピトープ競合アッセイを用いて評価した。これらのアッセイでは、蛍光共鳴エネルギー伝達(FRET)複合体は、ストレプトアビジンクリプテート、ビオチン化PCSK9および蛍光(DyLight650)標識抗PCSK9抗体の間で形成される。PCSK9の同じまたは重複エピトープに結合する非標識ペプチド−抗体融合物は、蛍光標識抗体によって結合される場合、競合し、FRETシグナルの低下を生じることになる。
抗PCSK9抗体の標識は、DyLight−650(Thermo Scientific 84536)を用いて、製造業者の使用説明書に従って実施した。アッセイにおいては、すべての試料および試薬は、1×リン酸塩緩衝生理食塩水、0.1%BSA(Sigma A9576)および0.4Mフッ化カリウムを含有するアッセイ緩衝液で調製した。ペプチド−抗体融合物または対照抗体の試験試料を、3倍連続希釈により、384ウェルのポリプロピレンプレート内で調製した。試料(5μl)またはアッセイ緩衝液(全結合対照ウェル)を、384ウェルのアッセイプレート(Costar3676)に移し、20μlの全アッセイ容積中、1nMのストレプトアビジンクリプテート(Cisbio 61SAXLB)、0.05〜0.5nMのビオチン化PCSK9および0.1〜2nMのDy650標識抗PCSK9抗体とともに、室温で4時間インキュベートした。非特異的結合(NSB)対照ウェルは、ビオチン化PCSK9を省いて設定した。665nmおよび620nmでの時間分解蛍光発光は、Perkin Elmer Envisionを用いて320nmでの励起後に測定した。665nmカウント/620nmカウントの比を算出し、10000を乗じてHTRFカウントを得た。次に、デルタF%は以下の方程式を用いて算出した。
図2A〜Gおよび図3A〜Gは各々、非標識の重鎖または軽鎖ペプチド抗体融合物の適定を用いての、ヒトPCSK9の抗PCSK9抗体への結合の阻害を示す。アイソタイプ適合無関係抗体NIP228 IgG1−TMの単独(対照#1)または配列番号4のリンカーを用いての重鎖(対照#2)または軽鎖(対照#3)と配列番号28のGLP−1類似体ペプチドとの融合物を負の対照として用いた。
各ペプチド抗体融合物のヒトGLP−1受容体での効力は、cAMP産生アッセイを用いて評価した。ヒトGLP−1受容体を発現する安定な細胞株は、標準的方法により、CHO細胞において作成した。試験化合物によるGLP−1受容体の活性化は、機能的活性アッセイで測定可能であるcAMP二次メッセンジャーの下流生成をもたらすことになる。低いタンパク質結合性の384ウェルプレート(Greiner)を、アッセイ培地(0.5mM IBMX(Sigma)を含有するHanks平衡食塩水(GIBCOまたはSigma)中、0.1%ウシ血清アルブミン)中で作成した試験化合物の1:4の連続希釈を11回行うために用いた。すべての試料の希釈物は、二通りに作成した。ヒトGLP−1受容体を発現する細胞の凍結クライオバイアルを、水槽中で迅速に解凍し、予め温めたアッセイ培地に移し、240×gで5分間回転させた。次に、細胞を、1×105細胞/mLの最適化濃度でアッセイ緩衝液に再懸濁し、黒色の浅いウェルのU底384ウェルプレート(Corning)に5uL/ウェルで分注した。5μLの試験化合物を、希釈プレートから細胞板へ移し、室温で30分間インキュベートした。cAMPレベルは、製造業者の推奨通り、2ステップのプロトコルに従い、cAMP dynamic 2 HTRFキット(Cisbio)で測定した。つまり、抗cAMPクリプテート(ドナーフルオロフォア)およびcAMP−d2(アクセプターフルオロフォア)を、キット中に提供されるコンジュゲートおよび溶解用緩衝液で各々1/20に希釈することにより、別々に作成した。5uLの抗cAMPクリプテートを、アッセイプレートのすべてのウェルに添加し、5uLのcAMP−d2を、非特異的結合ウェルを除くすべてのウェルに添加した(コンジュゲートおよび溶解用緩衝液のみを添加)。プレートは、室温で1時間インキュベートし、次に320nmの励起波長ならびに620nmおよび665nmの放射波長を用いて、Envision(Perkin Elmer)で読み取った。データは、製造業者のガイドラインに記載のように%デルタFに変換し、制約のないデータの4パラメータロジスティックフィット、曲線中点によって分析し、EC50を判定した。
重鎖(A)または軽鎖(B)ペプチド抗体融合物によるヒトGLP−1受容体の活性化を各々、図4A〜Bに示す。遊離ヒトGLP−1ペプチド(Bachem)およびペプチドを有しない無関係アイソタイプ適合NIP228ヒトIgG1−TMを各々、正の対照および負の対照として用いた。
結論として、すべての試験融合物がヒトPCSK9への結合ならびにヒトGLP−1受容体の活性化に対して抗PCSK9抗体と競合することができた。GLP−1類似体ペプチドと異なる抗PCSK9抗体との間の融合分子は、二重活性を呈し、また複合薬理(combined pharmacology)をもたらすように用いることができる。
実施例4 抗体融合物中に存在するGLP−1類似体のインビボ安定性
標的媒介性排除を伴わず、ヒトIgGは、ヒトで約21日の長い循環半減期を有する。これは特に、FcRn受容体による内在化抗体の救済に起因する。細胞による非特異的取り込み後、抗体は、エンドソームの酸性環境下でFcRnに結合し、細胞表面に誘導され、リソソームで分解されることなく循環に戻され得る。
標的媒介性排除を伴わず、ヒトIgGは、ヒトで約21日の長い循環半減期を有する。これは特に、FcRn受容体による内在化抗体の救済に起因する。細胞による非特異的取り込み後、抗体は、エンドソームの酸性環境下でFcRnに結合し、細胞表面に誘導され、リソソームで分解されることなく循環に戻され得る。
抗PCSK9抗体分子との融合物中のGLP−1類似体ペプチドは、最大の有効性を得るためには、ペプチドおよび抗体部分によって各々媒介されるGLP−1受容体の活性化およびPCSK9の抑制の双方に対して、十分なインビボ活性半減期を呈する必要がある。例えば、ペプチドが注射後に迅速に不活性化される場合、生成物の大半はPCSK9の抑制に対してのみ機能的となり、投与期間を通じて効率的なグルコース調節を提供するように長期間GLP−1受容体に適切に会合することはない。
抗体融合物中の場合に存在するGLP−1類似体ペプチドのインビボ安定性を評価するため、以下の融合物を作成した。
1:配列番号28のGLP−1類似体ペプチドを、配列番号4のリンカーを用いて、配列番号414および415の無関係NIP228ヒトIgG1−TM抗体の重鎖に融合させた(化合物NIP228_GLP−1_VH)。
2:配列番号12のアメリカドクトカゲ(Gila monster)の唾液由来のGLP−1類似体であるExendin−4ペプチドを、配列番号4のリンカーを用いて、配列番号9の抗PCSK9抗体PC9#2の軽鎖に融合させた(化合物PC9#2_Exe4_VL)。
3:配列番号28のGLP−1類似体ペプチドを、配列番号4のリンカーを用いて、配列番号416のヒトIgG4 Fc断片に融合させた(化合物GLP−1−Fc)。
4:配列番号28のGLP−1類似体ペプチドを、配列番号4のリンカーを用いて、配列番号9の抗PCSK9抗体PC9#2の軽鎖に融合させた(化合物PC9#2_GLP−1_VL)。
1:配列番号28のGLP−1類似体ペプチドを、配列番号4のリンカーを用いて、配列番号414および415の無関係NIP228ヒトIgG1−TM抗体の重鎖に融合させた(化合物NIP228_GLP−1_VH)。
2:配列番号12のアメリカドクトカゲ(Gila monster)の唾液由来のGLP−1類似体であるExendin−4ペプチドを、配列番号4のリンカーを用いて、配列番号9の抗PCSK9抗体PC9#2の軽鎖に融合させた(化合物PC9#2_Exe4_VL)。
3:配列番号28のGLP−1類似体ペプチドを、配列番号4のリンカーを用いて、配列番号416のヒトIgG4 Fc断片に融合させた(化合物GLP−1−Fc)。
4:配列番号28のGLP−1類似体ペプチドを、配列番号4のリンカーを用いて、配列番号9の抗PCSK9抗体PC9#2の軽鎖に融合させた(化合物PC9#2_GLP−1_VL)。
すべての化合物は、インビトロでヒトGLP−1受容体で活性があり、実施例3に記載のcAMPアッセイにおいて、EC50、すなわち、NIP228_GLP−1_VH、PC9#2_Exe4_VL、GLP−1−FcおよびPC9#2_GLP−1_VLに対して各々、2.08E−10M、1.12E−10M、1.12E−10Mおよび1.03E−10Mを呈する。
化合物NIP228_GLP−1_VHおよびPC9#2_Exe4_VLをラットの静脈内に注射し、血清または血漿試料を注射後のいくつかの時点で採取した。血清または血漿中の化合物濃度(曝露)およびGLP−1活性に対する活性化合物の濃度を、各試料について測定した。全化合物(曝露)およびGLP−1受容体での活性化合物の経時的低下の間の比較は、抗体融合物中のGLP−1類似体ペプチドにおけるインビボ安定性の評価を提供する。
ラット血漿または血清中の全ヒトIgG1抗体のレベルは、Gyrolabプラットフォーム(Gyros AB)を用いて、一般的なサンドイッチ酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)法により定量化した。ヒトIgG1は、100ug/mLのビオチン化モノクローナル抗ヒトIgG1抗体(クローンJDC−10、Southern Biotech(血漿試料用)または内製クローンTM446(血清試料用))により捕捉し、Gyrolab Bioaffy 200CD上の25nM(BD PharmingenクローンG18−145(血漿試料用))または10nM(結合部位AU003CUS01(血清試料用))でのAlexa標識モノクローナル抗ヒトIgG1抗体により検出した。標準、対照、血漿または血清試料、洗浄溶液、捕捉および検出抗体を、Gyrolab法に従い、0.2mLの96ウェルPCRプレート(Thermo Scientific)に添加し、CD200プレートを備えた装置に負荷した。全試料を2通りに分析した。各ヒトIgG標準の平均応答を濃度に対してプロットし、Gyrolab Evaluatorソフトウェアを用いて、5パラメータ加重ロジスティックモデルを用いて点を適合させた。
ラット試料中のヒトGLP−1受容体での活性のあるペプチド−抗体融合物の濃度を、エクスビボcAMPの細胞に基づくアッセイを用いて評価した。参照化合物を、標準として用いられるべき既知の濃度でナイーブラット血清または血漿に添加した。全試料をアッセイ培地で連続希釈し、血清試料について実施例3に記載のようにcAMP dynamic 2 HTRFキット(Cisbio)を用いるか、または血漿試料についてLANCE(登録商標)Ultra cAMP検出キット(Perkin Elmer)を用いて試験した。
試験試料を、等価な参照として同じ最高濃度を用いてプロットした。次に、得られたEC50値を、試料比(試料EC50/参照化合物EC50)と、次に活性GLP−1化合物の評価濃度(ラット血漿または血清に添加された参照化合物の公知の最高濃度/試料比)とを算出するのに用いることができた。ラット血清または血漿は単独で、クリプテートドナーシグナルに対してクエンチング効果を有し、希釈することが可能なcAMPの濃度依存性活性化をもたらす。したがって、任意の試験化合物は、活性アッセイにおいて観察可能な効果を有するように、ラット血清または血漿ベースラインの場合を超えるcAMP活性(検出の限界と称される)を有する必要がある。
化合物NIP228_GLP−1_VHをウィスターラット(Charles River)3匹に2mg/kgで注射し、各動物における血液試料を、注射から2分、1時間、24時間、48時間、120時間、168時間および216時間経過後、dPP4阻害剤を含有するEDTA管に採取した。ラット血漿中の全化合物および活性GLP−1化合物の経時的濃度を、図5Aおよび図9に示す。48時間後に採取した試料中の活性化合物の濃度は、アッセイの定量の下限を下回ったことから測定不能である。
化合物PC9#2_Exe4_VLをCDラット(Charles River)3匹に1mg/kgで注射し、血液試料を、注射から30分、6時間、24時間、48時間、96時間、240時間および336時間経過後、dPP4阻害剤を含有する簡単な管に採取した。血清試料を、管をベンチ上に30分間放置し、その後13000rpmで2分間遠心分離することにより調製した。ラット血清中の曝露および活性GLP−1化合物における経時的濃度を図5Bに示す。48時間後に採取した試料中の活性化合物の濃度は、アッセイの定量の下限を下回ったことから正確に測定できない。
NIP228_GLP−1_VHおよびPC9#2_Exe4_VLの曝露およびGLP−1受容体での活性化合物の双方についてのラットでのインビボ半減期を表9に示す。
NIP228_GLP−1_VHおよびPC9#2_Exe4_VL化合物の双方においては、GLP−1受容体での活性は、化合物自体よりもはるかに迅速に失われ、これはインビボでのペプチドの不安定性を示している。
化合物GLP−1−FcおよびPC9#2_GLP−1_VLを、健常C57/B6マウス(7〜8週齢、雌、Charles River)に静脈内注射し、血漿試料をいくつかの時点で採取した。血漿中の化合物濃度(曝露)およびGLP−1活性における活性化合物の濃度を、上記の各試料に対して測定した。
GLP−1−Fcを1mg/kgで注射した。マウス3匹の群を、以下の時点、すなわち、注射前、注射から2分、1時間、6時間、24時間、48時間、72時間および96時間経過後の各々で屠殺した。各動物における血液は、dPP4阻害剤を含有するEDTA管に採取した。次に、血漿試料は、摂氏4度、14000rpmで5分間遠心分離し、次の分析用に−80℃で貯蔵した。
PC9#2_GLP−1_VLを5mg/kgで注射し、マウスを、以下の時点、すなわち注射前、注射から5分、6.5時間、24時間、72時間および168時間経過後の各々で屠殺した。試料は上記のように処理した。
GLP−1−Fcにおけるマウス血漿中の経時的な曝露および活性GLP−1化合物の濃度を図5Cおよび図14Aに示し、PC9#2_GLP−1_VLについては各々、図5Dおよび図10に示す。
曝露および活性GLP−1の双方について、GLP−1−FcおよびPC9#2_GLP−1_VLにおけるマウスでのインビボ半減期を表10に示す。
ラットでのNIP228_GLP−1_VHおよびPC9#2_Exe4_VLについての観察によると、マウスへの注射後、GLP−1−FcおよびPC9#2_GLP−1_VLの双方におけるGLP−1受容体での活性は、化合物自体よりも迅速に失われ、これはインビボでのペプチドの不安定性を示している。
配列番号28および配列番号12のGLP−1類似体双方における迅速な不活性化は、PCSK9/GLP−1融合分子における効率的なグルコース調節に影響することになり、より優れたインビボ安定性を有するGLP−1類似体ペプチドを操作する必要がある。
実施例5 huPCSK9に対する親和性
PCSK9抗体をベンチマーク対照として用いた。データは表11に示し、PC9#2_GLP1分子およびベンチマーク対照として用いた抗PC9#2抗体の視覚的表現を図8に示す。PCSK9の親和性およびGLP−1の効力を示す可視化した有望な目標特性を図6に提供する。
PCSK9抗体をベンチマーク対照として用いた。データは表11に示し、PC9#2_GLP1分子およびベンチマーク対照として用いた抗PC9#2抗体の視覚的表現を図8に示す。PCSK9の親和性およびGLP−1の効力を示す可視化した有望な目標特性を図6に提供する。
PCSK9結合に対する会合(kaまたはkon)、解離(kdまたはkoff)および平衡解離定数(KD)は、Biacore 2000バイオセンサー(GE Healthcare)を用いて、表面プラズモン共鳴(SPR)により、摂氏25度で測定した。
まずプロテインG表面をCM5センサーチップ(GE Healthcare)上に作成した。次に、種々の濃度のヒト、カニクイザルまたはラットPCSK9を注射する前に、ヒト抗体をチップ表面上に捕捉した。まず全体的な解離速度を、その後全体的なオン速度を、いずれも1:1の結合動力学的モデルを用いて算出した。
これは、融合物がPCSK9結合にあくまでわずかに影響していることを示す。
加えて、二重作用融合分子HS9_DSB7を、そのヒトPCSK9への親和性を測定するため、実施例17に記載のようにBiacoreアッセイで試験した。PCSK9抗体単独(重鎖および軽鎖の各々に対する配列番号1および2のPC9_2_FG_HS#9)をベンチマーク対照として用いた。表12はデータを提供する。このデータは、融合物が種(ヒト(Hu)、カニクイザルサル(Cy)およびラット)を通じてPCSK9結合にあくまでわずかに影響していることを示す。
実施例6 cAMPの細胞に基づくアッセイにおけるGLP−1の効力
PC9#2_GLP−1を、実施例3に記載のように、その効力を測定するため、cAMPの細胞に基づくアッセイで試験した。GLP1ペプチド単独を対照として用い、GLP−1Fcをベンチマークとして用いた。データは表13に示し、PC9#2_GLP1分子およびベンチマーク対照として用いたGLP−1 Fcの視覚的表現を図8に示す。
PC9#2_GLP−1を、実施例3に記載のように、その効力を測定するため、cAMPの細胞に基づくアッセイで試験した。GLP1ペプチド単独を対照として用い、GLP−1Fcをベンチマークとして用いた。データは表13に示し、PC9#2_GLP1分子およびベンチマーク対照として用いたGLP−1 Fcの視覚的表現を図8に示す。
このデータは、GLP−1類似体ペプチドと抗PCSK9抗体PC9#2の軽鎖との融合後、GLP−1の効力に、ベンチマーク分子のGLP−1−Fcと比べて有意な低下がなかったことを示す。
実施例7 デュラグルチド:ベンチマーク分子
図14Aは、GLP−1−Fcベンチマークのラットでの安定性を提供する。ベンチマーク分子は、図14Aに示すように、GLP−1部分の抗体のFc部分への融合物である。
図14Aは、GLP−1−Fcベンチマークのラットでの安定性を提供する。ベンチマーク分子は、図14Aに示すように、GLP−1部分の抗体のFc部分への融合物である。
化合物GLP−1−Fcを、健常C57/B6マウス(7〜8週齢、雌、Charles River)に静脈内注射し、血漿試料を注射後のいくつかの時点で採取した。血漿中の化合物濃度(曝露)およびGLP−1活性についての活性化合物の濃度を、実施例4に記載のように各試料に対して測定した。
GLP−1−Fcを1mg/kgで注射した。マウス3匹の群を、以下の時点、すなわち、注射前、注射から2分、1時間、6時間、24時間、48時間、72時間および96時間経過後の各々で屠殺した。各動物における血液は、dPP4阻害剤を含有するEDTA管に採取した。次に、血漿試料は、摂氏4度、14000rpmで5分間遠心分離し、次の分析用に−80℃で貯蔵した。
GLP−1活性は、化合物よりも迅速な速度で失われ、これはペプチドの不安定性を示す。四角を伴う線は、GLP−1−Fcの血清濃度に対応し、丸を伴う線は、同一試料におけるGLP−1−Fcの活性に対応する。図14Aを参照のこと。
実施例8 増強されたインビボ安定性特性を有する融合分子
A)増強されたインビボ安定性特性を有する抗体融合物中のGLP−1類似体ペプチドを評価すること
抗体融合分子のペプチドのインビボ安定性を改善するため、ペプチドを、分解から保護するようにその周辺の立体障害を改変した。これは巨大な糖モチーフを導入するか、または分子間ジスルフィド架橋を改変するかのいずれかにより行った。
A)増強されたインビボ安定性特性を有する抗体融合物中のGLP−1類似体ペプチドを評価すること
抗体融合分子のペプチドのインビボ安定性を改善するため、ペプチドを、分解から保護するようにその周辺の立体障害を改変した。これは巨大な糖モチーフを導入するか、または分子間ジスルフィド架橋を改変するかのいずれかにより行った。
N−グリコシル化共通モチーフの付加がインビボ安定性およびタンパク質の作用持続時間を増加させ得ることは実証されている(Elliott S.et al.,Nat.Biotech.,2003,21,414_421)。ペプチドのC末端にまたはペプチドと抗体との間のリンカー中に、余分なN−グリコシル化モチーフのNxSまたはNxT(ここでxは、プロリン以外の任意のアミノ酸であり得る)を組み込んだGLP−1類似体ペプチドは、抗PCSK9抗体PC9#2の軽鎖(抗体軽鎖、配列番号9)との融合物中で改変されている。それら化合物のうちの8つにおけるペプチドおよびリンカーのアミノ酸配列(N−グリコシル化部位はNGSと命名)は、図7Aに示す。グリコシル化モチーフを作成するためのアミノ酸変化は、太字下線で示す。
それら8つの化合物の中でPC9_2_GLP−1_NGS#7のみが、SDS−PAGEによると、高いグリコシル化収率を示す。これは、グリコシル化共通配列を含まない対照化合物と比べての軽鎖の分子量増加によって検出され、非グリコシル化軽鎖生成物に対応するより低分子のバンドは認められなかった。PC9_2_GLP−1_NGS#7におけるグリコシル化は、ESI質量分析により、さらに確認された。
分子間ジスルフィド結合を導入することが、遊離ペプチドとしてのGLP−1類似体のインビボ安定性を改善するための優れた手法であり得ることもまた示されている(Li Y.et al.,Peptides,2011,21,1303_1312)。
ジスルフィド架橋を形成するための2つのシステイン残基、また適切な場合、その結合を促進するためのグリシンC末端キャップを組み込んだExendin−4ペプチド変異体を、抗PCSK9抗体PC9#2の軽鎖(配列番号9)に融合した。最初に作成した3つの化合物におけるペプチドアミノ酸配列(ジスルフィド架橋はDSBと命名)は、(配列番号30〜32として)図7Bに示す。システイン残基は黒色で示し、他の突然変異残基は下線で示し、またC末端キャップでの付加的なグリシン残基は灰色で示す。
DSB#1変異体においては、最初のシステインは、位置9でアスパラギン酸の代わりに改変されたものであり、配列:GGGGGGGGGGGCGG(配列番号401)のC末端キャップは、第2のシステインを組み込んで用いた。
DSB#2変異体においては、最初のシステインは、位置4でグリシンの代わりに改変されたものであり、配列:GGGGGGGGGGGGCG(配列番号402)のC末端キャップは、第2のシステインを組み込んで用いた。
DSB#3変異体においては、最初のシステインは、位置18でアラニンの代わりに改変されたものであり、C末端キャップは用いなかった。第2のシステインは、セリンの代わりにExendin−4配列の位置39に導入した。ジスルフィド架橋の形成を促進するため、Exendin−4のトリプトファンケージ中でより柔軟性が出るように、プロリン38をグリシンに改変した。
軽鎖融合物中のPC9_2_Exe4_DSB#2は、哺乳類細胞内で有意に発現することはなく、さらなる特徴づけは行わなかったが、十分な量のPC9_2_Exe4_DSB#1およびPC9_2_Exe4_DSB#3が得られた。融合物の完全性および同一性は、インビボ実験前のESI質量分析により確認された。
PC9_2_GLP−1_NGS#7、PC9_2_Exe4_DSB#1およびPC9_2_Exe4_DSB#3のインビボ安定性を、実施例4に記載のように、経時的な化合物の曝露および活性GLP−1における濃度の双方をフォローすることにより、マウスにおいて評価した。
健常C57/B6マウス(7〜8週齢、雌、Charles River)は、40mg/kgでのPC9_2_GLP−1_NGS#7、10.8mg/kgでのPC9_2_Exe4_DSB#1または5mg/kgでのPC9_2_Exe4_DSB#3を、1単回静脈内(IV)用量で受けた。マウス3匹の群を、以下の時点、すなわち、注射前、注射から5分、6時間、24時間、72時間および168時間経過後の各々で屠殺し、各動物における血液は、dPP4阻害剤を含有するEDTA管に採取した。次に、血漿試料は、摂氏4度、14000rpmで5分間遠心分離し、次の分析用に−80℃で貯蔵した。
3つすべての化合物は、インビトロでヒトGLP−1受容体で活性があるが、cAMPアッセイにおいて、異なるEC50、すなわち、PC9_2_GLP−1_NGS#7、PC9_2_Exe4_DSB#1およびPC9_2_Exe4_DSB#3の各々に対して、1.94-8M、5.25-9Mおよび3.25-10Mを呈する。有意な期間にわたる活性GLP−1化合物の濃度を算出するため、用量を、cAMPエクスビボアッセイにおける定量の下限を超えるシグナルを生成するような効力に基づき、可能な限り調整した。
経時的なマウス血漿中の曝露および活性GLP−1化合物の濃度は各々、PC9_2_GLP−1_NGS#7では図12および図13Aに示し、PC9_2_Exe4_DSB#1では図13Bおよび図14Bに示し、またPC9_2_Exe4_DSB#3融合分子では図11および図13Cに示す。
曝露および活性GLP−1の双方におけるPC9_2_GLP−1_NGS#7、PC9_2_Exe4_DSB#1およびPC9_2_Exe4_DSB#3のインビボ半減期を表14に示す。
親分子NIP228_GLP−1_VHおよびPC9#2_Exe4_VL(表9)と比べて、3つすべての化合物は、GLP−1活性において改善されたインビボ安定性を有し、PC9_2_GLP−1_NGS#7、PC9_2_Exe4_DSB#1およびPC9_2_Exe4_DSB#3における半減期は各々、76時間、約100時間および36時間である。
かなり興味深いことに、PC9_2_Exe4_DSB#1は、マウスにおいて最大7日間十分な安定性を呈し、化合物曝露と比べた場合、GLP−1活性の低下は認められない(図13B)。
かかるデータは、GLP−1類似体周辺に立体障害を作成することで、抗体融合物中のペプチドのインビボ活性半減期を増加させ得ることを示唆している。
B)増強されたインビボ安定性特性を有する融合分子を評価すること
実施例4および8Aで考察したプロトコルは、様々な化合物をマウスに投与すること、また血漿中の化合物の濃度を経時的にプロットすることに従う。ヒトGLP−1受容体での化合物の効力(EC50)は、実施例3に記載のように、cAMPアッセイを用いて測定した。
実施例4および8Aで考察したプロトコルは、様々な化合物をマウスに投与すること、また血漿中の化合物の濃度を経時的にプロットすることに従う。ヒトGLP−1受容体での化合物の効力(EC50)は、実施例3に記載のように、cAMPアッセイを用いて測定した。
融合分子の最適化は、インビボPK/安定性の評価を通じて導かれた。図14A、図11および図12に示すように、ペプチドを改変することにより、増強されたインビボ安定性特性を有する融合分子が生成された。GLP−1受容体での効力への影響が最小で活性の保持が延長される場合のジスルフィド架橋の安定化とともに、利点が認められた。NGS#7はまた、改善された安定性特性を有するが、DSB#3(340pM)と比べて低い効力(19nM)を有する。
図14Aは、100pmのEC50を有するGLP−1−Fcベンチマーク分子を示す。
図11は、340pMのEC50を有するジスルフィド架橋変異体(PC9_2_DSB#3)(配列番号49および配列番号8)を示す。
図12は、19nMのEC50を有するn−グリコシル化変異体(PC9_2_NGS#7)(配列番号50および配列番号8)を示す。
それらの化合物におけるインビボ半減期を表15に示す。
実施例9 PCSK9/GLP−1融合物は理想的な安定性/活性特性を示す
二重作用融合分子を、マウスモデルにおけるFc−曝露およびGLP−1活性について評価した。用量は静脈内へ10.8mg/kgであり、インビトロ効力は5200pMであった。プロトコルは実施例8に記載の通りであった。データは、静脈内へ1mg/kgの用量でかつ100pMのインビトロ効力を有するGLP−1 Fcベンチマーク分子と比べた。ここでは類似のプロトコルを実施例4に記載の通りに用いた。結果は、図14A(デュラグルチド)および図14B(PCSK9/GLP−1融合物PC9_2_DSB#1)(配列番号48および配列番号8)に示す。最大7日間、マウスにおけるGLP−1活性の低下はなかった。
二重作用融合分子を、マウスモデルにおけるFc−曝露およびGLP−1活性について評価した。用量は静脈内へ10.8mg/kgであり、インビトロ効力は5200pMであった。プロトコルは実施例8に記載の通りであった。データは、静脈内へ1mg/kgの用量でかつ100pMのインビトロ効力を有するGLP−1 Fcベンチマーク分子と比べた。ここでは類似のプロトコルを実施例4に記載の通りに用いた。結果は、図14A(デュラグルチド)および図14B(PCSK9/GLP−1融合物PC9_2_DSB#1)(配列番号48および配列番号8)に示す。最大7日間、マウスにおけるGLP−1活性の低下はなかった。
実施例10 分子内ジスルフィド架橋を有する早期GLP−1類似体ペプチド抗体融合物の産生および精製
多くの凝集体がSEC−HPLCにより検出されたように、中規模バッチからのプロテインA精製後の材料の品質は、PC9_2_Exe4_DSB#1およびPC9_2_Exe4_DSB#3において不良であった。次に、Superdex 200プレップグレードカラムを用いる分取サイズ排除クロマトグラフィーを、実施例2に記載のように、化合物をさらに精製するために用いた。
多くの凝集体がSEC−HPLCにより検出されたように、中規模バッチからのプロテインA精製後の材料の品質は、PC9_2_Exe4_DSB#1およびPC9_2_Exe4_DSB#3において不良であった。次に、Superdex 200プレップグレードカラムを用いる分取サイズ排除クロマトグラフィーを、実施例2に記載のように、化合物をさらに精製するために用いた。
PC9_2_Exe4_DSB#1およびPC9_2_Exe4_DSB#3における分取SECクロマトグラムを各々、図15Aおよび図15Bに示す。材料の有意な割合(25〜40%)が、早期の保持時間での追加的なピークによって示されるように凝集する。インビボ試験に用いられる材料を得るため、単量体化合物を含有する画分を採取した。実施例8および9を参照のこと。
さらに、PC9_2_Exe4_DSB#1産生のスケーラビリティを、wavebag(GE Healthcare)に一過性にトランスフェクトされた48.2LのCHO哺乳類細胞により評価した。化合物を、プロテインAカラムを用いて精製し、その後、2つの追加的な精製ステップを、混合モード樹脂を用いて行った。
採取物中に高レベルの凝集(>25%)を検出し、単量体生成物の効率的精製が特に困難であった。生成物をSEC−HPLCにより95.9%の純度で生成するには、3つのクロマトグラフィーステップが必要であった。これは精製収率にとって極めて有害であり、全体的回復は約3.4%であった。さらに、採取物中の滴定量は、類似の発現系を用いて、モノクローナル抗体と比べて低い104mg/Lであった。抗PCSK9抗体HS9の軽鎖(配列番号2)との融合物中のDSB#1ジスルフィド架橋GLP−1類似体の生成により、酷似した結果がもたらされた。
実施例11 凝集
二重作用融合分子(PCSK9/GLP−1融合物PC9_2_DSB#1)(配列番号48)は凝集の可能性を有し、一部の実施形態では、単量体を選択することが所望される。実施例2に記載のようにプロテインA精製後の分析用SEC−HPLCの間に検出された凝集体を図16に示す。したがって、一部の実施形態では、単量体特性を改善するため、さらなる改変が所望され得る。
二重作用融合分子(PCSK9/GLP−1融合物PC9_2_DSB#1)(配列番号48)は凝集の可能性を有し、一部の実施形態では、単量体を選択することが所望される。実施例2に記載のようにプロテインA精製後の分析用SEC−HPLCの間に検出された凝集体を図16に示す。したがって、一部の実施形態では、単量体特性を改善するため、さらなる改変が所望され得る。
実施例12 増強された単量体特性を有する抗体融合物中のGLP−1類似体ペプチド
ペプチド抗体分子の産生中の単量体特性を改善するため、PC9#2の軽鎖(配列番号9)との融合物中の付加的なExendin−4ジスルフィド架橋ペプチド(DSB)を作成した。ジスルフィド結合の形成を促進し、おそらくはジスルフィドスクランブリングに起因する産生中の凝集を最終的に低減するため、システイン架橋の様々な位置ならびにグリシンリッチC末端キャップの長さおよびExendin−4ペプチドのC末端での様々なグリシン点突然変異を改変した。ペプチド改変作業は、Exendin−4の三次元NMR構造を用いて導かれた(Neidigh,JW et al.,Biochemistry,2001,40,13188−200)。
ペプチド抗体分子の産生中の単量体特性を改善するため、PC9#2の軽鎖(配列番号9)との融合物中の付加的なExendin−4ジスルフィド架橋ペプチド(DSB)を作成した。ジスルフィド結合の形成を促進し、おそらくはジスルフィドスクランブリングに起因する産生中の凝集を最終的に低減するため、システイン架橋の様々な位置ならびにグリシンリッチC末端キャップの長さおよびExendin−4ペプチドのC末端での様々なグリシン点突然変異を改変した。ペプチド改変作業は、Exendin−4の三次元NMR構造を用いて導かれた(Neidigh,JW et al.,Biochemistry,2001,40,13188−200)。
合計で10のDSBペプチド抗PCSK9融合物を、小規模に生成し、SEC−HPLCにより、改善された単量体特性についてスクリーニングした。ペプチド配列は図17に記載する。PC9_2_Exe4_DSB#4は、有意に発現することがなく、さらなる特徴づけをしなかった。
プロテインA精製後、分析用SEC−HPLCによって測定された、PC9_2_Exe4_VLおよびPC9_2_Exe4_DSB#1と比べての9つの融合物における凝集体の百分率は、表16に記載する。
試験した9つの中の4つの化合物、すなわちPC9_2_Exe4_DSB#7、PC9_2_Exe4_DSB#9、PC9_2_Exe4_DSB#10およびPC9_2_Exe4_DSB#11が、10%未満の凝集体百分率を達成している。PC9_2_Exe4_DSB#7は、初期融合物PC9_2_Exe4_DSB#1における26.5%と比べて5.1%の最低の凝集体百分率を有する。ジスルフィド架橋を有しないExendin−4抗体融合物のPC9_2_Exe4_VLは、2.9%の凝集体を示す。
PC9_2_Exe4_DSB#7およびPC9_2_Exe4_DSB#9の生成は、インビボ安定性実験を実施するのに十分な量で材料を供給するため、スケールアップさせた。図18および図19は、実施例2に記載される通りの初期プロテインA精製後のPC9_2_Exe4_DSB#7およびPC9_2_Exe4_DSB#9各々の分取SECクロマトグラムを示す。その精製ステップの間、PC9_2_Exe4_DSB#1およびPC9_2_Exe4_DSB#3(図15AおよびB)と異なり、有意な割合の凝集体は検出されなかった。
改善された単量体特性を有する最適化されたDSBペプチド抗体融合物が、Exendin−4抗体融合物と比べてより優れたインビボ安定性を確かに呈することをチェックするため、PC9_2_Exe4_DSB#7およびPC9_2_Exe4_DSB#9を、各化合物につき各々10mg/kgおよび1mg/kgで、CDラット3匹に静脈内注射した。各動物における血清試料を、注射から30分、6時間、24時間、48時間、96時間、240時間および336時間経過後、採取した。化合物曝露および活性GLP−1の濃度を、実施例4に記載のように経時的に測定した。
両化合物は、cAMPアッセイにおいてヒトGLP−1受容体で活性を示し、EC50は、PC9_2_Exe4_DSB#7では9.45E−10Mであり、PC9_2_Exe4_DSB#9では1.24E−10Mである。PC9_2_Exe4_DSB#7は、効力がPC9_2_Exe4_DSB#9より約8倍低く、これは、有意な期間にわたり、cAMPエクスビボアッセイにおける定量の下限を超えるシグナルを生成するため、10倍高い用量が注射されているためである。
PC9_2_Exe4_DSB#7およびPC9_2_Exe4_DSB#9融合分子における経時的なラット血清中の曝露および活性GLP−1化合物の濃度を各々、図20および21に示す。活性GLP−1の濃度は、分析を簡略化するため、最初の時点(30分)で曝露に対して正規化した。
PC9_2_Exe4_DSB#7およびPC9_2_Exe4_DSB#9は、GLP−1活性における半減期として、親Exendin−4融合分子PC9_2_Exe4_VLに対する5.7時間と比べて各々、44.2時間および12.5時間を有する(表9を参照))。96時間後に採取したPC9_2_Exe4_DSB#9試料に対する活性化合物の濃度は、アッセイの定量の下限を下回ったことから測定することができない。
それらのデータは、PC9_2_Exe4_DSB#7およびPC9_2_Exe4_DSB#9の双方は、抗体融合物中に存在する場合、親融合分子と比べて、GLP−1類似体ペプチドの改善されたインビボ活性半減期を有することを示している。
上記のように、ペプチド改変により、凝集特性を管理することができる。突然変異をペプチドおよび組成物の中のシステイン架橋の位置に設けるとともに、GLP−1部分のペプチド/C末端の長さを改変した。
プロトコルは上記のとおりである。
PCSK9/GLP−1融合物(PC9_2_DSB#7)(配列番号51および配列番号8)では、小規模バッチ内でのSEC−HLPCにより、>90%の単量体が得られた。凝集体は中規模バッチ内でも検出されたが、PCSK9/GLP−1融合物PC9_2_DSB#1(配列番号48および配列番号8)よりもはるかに低い広がりであった。
結果を図15A、図18、図23および表16に示す。
実施例13 抗PCSK9抗体との融合物中のGLP−1類似体ペプチドの薬物動態学および薬力学モデリング
PCSK9/GLP−1融合分子を設計に導くため、薬物動態学(PK)−薬力学(PD)モデルを、診療所において試験されたPCSK9の抑制と抗PCSK9抗体の親和性との間の関係に関する先行データ、ならびに認可されたGLP−1受容体作動薬分子のリラグルチドおよびデュラグルチドに関するデータを用いて開発している。
PCSK9/GLP−1融合分子を設計に導くため、薬物動態学(PK)−薬力学(PD)モデルを、診療所において試験されたPCSK9の抑制と抗PCSK9抗体の親和性との間の関係に関する先行データ、ならびに認可されたGLP−1受容体作動薬分子のリラグルチドおよびデュラグルチドに関するデータを用いて開発している。
抗PCSK9抗体との融合物中のGLP−1類似体ペプチドの効力は、市販薬と同等のGLP−1活性を生じることになる最適範囲を同定するため、十分なPCSK9抑制をもたらすことができる用量を用いて精査した。シミュレーションを、デュラグルチドの薬物動態、血漿タンパク質結合、および受容体親和性特性を用いて、その化合物の経時的な効力−正規化されたGLP−1活性を得るために実施した。PCSK9/GLP−1融合分子においては、PK特性は、PCSK9に特異的な典型的なヒト抗体のものであると仮定し、その情報は診療所内の化合物から得た。これらのシミュレーションによると、ヒトPCSK9に対して3.9nMの親和性を有するPCSK9/GLP−1融合物の皮下への60mgの1週用量が、定常状態で投与期間にわたって90%を超えるPCSK9抑制を生じるはずであることが示される(図22A)。
その投与計画を用いたシミュレーションによると、ヒトGLP−1受容体でのPCSK9/GLP−1融合分子の効力が、既存の分子と比べて類似のGLP−1活性を得るには、3〜5nMの範囲内である必要があることが示される(図22B)。それらのシミュレーションにおけるデュラグルチドの効力は80pMに設定し、これは、PCSK9/GLP1融合分子の効力が、GLP−1受容体作動薬分子に伴う悪心副作用をPCSK9を効率的に抑制するのに必要とされる用量で管理するように、デュラグルチドよりも約30〜60倍低い必要があることを示唆する。
実施例14 ヒトGLP−1受容体で効力が低下したGLP−1類似体ペプチド
GLP−1ペプチドまたはGLP−1類似体の効力を低減するための方法は、例えば、ペプチド中の主要な残基で非天然アミノ酸を突然変異させるかまたは導入するものとして当該技術分野で周知である。GLP−1ペプチドの受容体への結合および活性における重要な残基がアラニン走査により同定されたことは注目すべきである(Adelhorst,K.et al.,J.Bio.Chem.,1994,269,6276−6278)。
GLP−1ペプチドまたはGLP−1類似体の効力を低減するための方法は、例えば、ペプチド中の主要な残基で非天然アミノ酸を突然変異させるかまたは導入するものとして当該技術分野で周知である。GLP−1ペプチドの受容体への結合および活性における重要な残基がアラニン走査により同定されたことは注目すべきである(Adelhorst,K.et al.,J.Bio.Chem.,1994,269,6276−6278)。
GLP−1受容体での効力を低減することの実現可能性をさらに実証するため、7〜36のGLP−1配列を用いての位置2または3に突然変異または非天然アミノ酸を有するGLP−1類似体のパネルは、遊離ペプチドとして合成し、実施例3に記載のようにcAMPインビトロアッセイにおいて、ヒトGLP−1受容体での活性について試験した。データは、下の表17にまとめる。Aibは2−アミノイソ酪酸に対応し、Ornはオルニチンに対応する。
それらのデータは、GLP−1類似体ペプチドのEC50が、規定された効力低下を得るように調節可能であることを示す。
実施例15 ヒトGLP−1受容体での効力が低下した抗体融合物中のGLP−1類似体ペプチド
抗PCSK9抗体HS9の軽鎖(配列番号2)との融合物中のDSB#7GLP−1類似体ペプチド(配列番号13)の効力を低減するため、標準の分子生物学技術を用いて、ペプチド中の位置G2、E15、V19、I23またはL26に点突然変異を導入した。ペプチド抗体融合分子の全部で28の突然変異体を生成し、実施例3に記載のようにcAMPアッセイを用いてヒトGLP−1受容体での活性について試験した。化合物のリストおよび活性データを表18に示す。
抗PCSK9抗体HS9の軽鎖(配列番号2)との融合物中のDSB#7GLP−1類似体ペプチド(配列番号13)の効力を低減するため、標準の分子生物学技術を用いて、ペプチド中の位置G2、E15、V19、I23またはL26に点突然変異を導入した。ペプチド抗体融合分子の全部で28の突然変異体を生成し、実施例3に記載のようにcAMPアッセイを用いてヒトGLP−1受容体での活性について試験した。化合物のリストおよび活性データを表18に示す。
28中5つの構築物が不活性である。それ以外の化合物は、ヒトGLP1受容体で、HS9_DSB7_V19Tにおける400pMからHS9_DSB7_L26Qにおける約6uMにかけての範囲で非常に多様な効力を呈する。さらに、HS9_DSB7_G2YまたはHS9_DSB7_L26Qのような一部の化合物は、部分作動薬であり、GLP−1ペプチドと比べて、飽和用量で同じレベルの活性化をもたらすことはない。
実施例13におけるPKPDモデリングに基づき、二重活性のある抗PCSK9抗体GLP−1受容体作動薬分子は、PCSK9抗原を効率的に抑制するのに必要とされる用量で悪心を管理するため、GLP−1−Fcベンチマークと比べて約30〜60倍のヒトGLP−1受容体での効力低下を有する必要がある。
4つのペプチド抗体融合物(HS9_DSB7_G2V、HS9_DSB7_E15A、HS9_DSB7_V19AおよびHS9_DSB7_L26I)は、ベンチマークGLP1−Fcと比べて25〜50倍の低下に対応する700pM〜1.4nMの間の効力を呈する。それら4つすべての化合物は、GLP−1ペプチドと比べて90%を超える最大活性化の百分率を有する、ヒトGLP−1受容体での完全作動薬である。
実施例16 抗PCSK9抗体との融合物中のGLP−1類似体ペプチドの特徴づけ
A)抗PCSK9抗体との融合物中のGLP−1類似体ペプチドの開発可能性(Developability)評価
さらなる特徴づけを支援するため、所望されるヒトGLP−1Rでの効力から選択した4つのペプチド抗体融合物(HS9_DSB7_G2V、HS9_DSB7_E15A、HS9_DSB7_V19AおよびHS9_DSB7_L26I)を大規模に生成させた。化合物が生成中に凝集する傾向を評価するため、プロテインA精製後の試料を、分析用SEC−HPLCにより試験した。データを表19にまとめる。
A)抗PCSK9抗体との融合物中のGLP−1類似体ペプチドの開発可能性(Developability)評価
さらなる特徴づけを支援するため、所望されるヒトGLP−1Rでの効力から選択した4つのペプチド抗体融合物(HS9_DSB7_G2V、HS9_DSB7_E15A、HS9_DSB7_V19AおよびHS9_DSB7_L26I)を大規模に生成させた。化合物が生成中に凝集する傾向を評価するため、プロテインA精製後の試料を、分析用SEC−HPLCにより試験した。データを表19にまとめる。
4つの中の2つの融合物のみ(HS9_DSB7_V19AおよびHS9_DSB7_L26I)が、プロテインA精製後に90%を超える単量体の百分率を達成している。HS9_DSB7_V19Aは、95%を超える単量体を伴う最良の特性を呈する。HS9_DSB7_G2VおよびHS9_DSB7_E15Aは、有意に生成中に凝集する傾向があり、凝集体の百分率はHS9_DSB7_V19Aにおける5%未満に対して20%を超える。
精製化合物は、デフォルトの調製用緩衝液中で50mg/mLの目標濃度を達成するため、30kDaの分子量カットオフを有する遠心スピン濃縮器を用いて濃縮した。さらなる容積低下がタンパク質濃度の低下をもたらすことが認められたことから、HS9_DSB7_G2VおよびHS9_DSB7_E15Aの濃縮は各々、38.7および33.7mg/mLで停止させた。かかる問題は、HS9_DSB7_V19AおよびHS9_DSB7_L26Iの濃縮ステップの間、認められなかった。
次に、貯蔵安定性を評価するため、試料を摂氏5度または摂氏40度で4週間インキュベートし、その後分析用SEC−HPLCを施した。結果を表20にまとめる。
HS9_DSB7_V19AおよびHS9_DSB7_L26Iの双方は、HS9_DSB7_G2VおよびHS9_DSB7_E15Aよりも優れた安定性パラメータを呈する。例えば、最初の2つは、摂氏5度で、HS9_DSB7_E15AおよびHS9_DSB7_G2V各々における0.8%および1.4%と比べて、約0.3%の1か月あたりの凝集割合を有する。
B)抗PCSK9抗体との融合物中のGLP−1類似体ペプチドのラットにおける単回静脈内用量での薬物動態
所望されるヒトGLP−1Rでの効力から選択した4つのペプチド抗体融合物の薬物動態学的特性を、CDラット3匹へのHS9_DSB7_G2V、HS9_DSB7_E15A、HS9_DSB7_V19AおよびHS9_DSB7_L26I各々に対する60、53、58.5および60mg/kgでの単回静脈内ボーラス後、実施例4に記載のように評価した。標的媒介性の薬物動態成分を全く伴うことなく、PCSK9シンク(sink)を有意な期間飽和させ、線形位相の間でのPKパラメータを測定するため、高用量の化合物(50mg/kg超)を用いた。
所望されるヒトGLP−1Rでの効力から選択した4つのペプチド抗体融合物の薬物動態学的特性を、CDラット3匹へのHS9_DSB7_G2V、HS9_DSB7_E15A、HS9_DSB7_V19AおよびHS9_DSB7_L26I各々に対する60、53、58.5および60mg/kgでの単回静脈内ボーラス後、実施例4に記載のように評価した。標的媒介性の薬物動態成分を全く伴うことなく、PCSK9シンク(sink)を有意な期間飽和させ、線形位相の間でのPKパラメータを測定するため、高用量の化合物(50mg/kg超)を用いた。
血液試料は、注射から30分、6時間、24時間、48時間、96時間、168時間、240時間および336時間経過後に採取した。4つの化合物における経時的濃度を図24に示し、半減期データを表21にまとめる。
4つの融合分子は、配列が酷似しており、同じ抗体骨格を共有するにもかかわらず、有意な異なる特性を有する。HS9_DSB7_V19Aは、4つの融合物の中で、例えばHS9_DSB7_L26Iに対するわずか39時間と比べて、128時間の最長のインビボ半減期を有する。
実施例17 抗PCSK9抗体との融合物中のGLP−1類似体ペプチドの種間でのPCSK9に対する親和性および動態パラメータの測定
ヒト、カニクイザルおよびラットPCSK9のGLP−1類似体抗PCSK9融合物HS9_DSB7_V19AヒトIgG1−TMへの結合における会合(ka)、解離(kd)および平衡解離定数(KD)を、本質的にはKarlssonら(J.Immunol.Methods(1991),vol.145,p.Dear229−40)に記載のように、Biacore 2000バイオセンサー(GE Healthcare)を用いて、表面プラズモン共鳴(SPR)により、摂氏25度で測定した。抗PCSK9抗体PC9#3ヒトIgG1−TMはベンチマークとして用いた(配列番号404の可変重鎖および配列番号405の可変軽鎖。
ヒト、カニクイザルおよびラットPCSK9のGLP−1類似体抗PCSK9融合物HS9_DSB7_V19AヒトIgG1−TMへの結合における会合(ka)、解離(kd)および平衡解離定数(KD)を、本質的にはKarlssonら(J.Immunol.Methods(1991),vol.145,p.Dear229−40)に記載のように、Biacore 2000バイオセンサー(GE Healthcare)を用いて、表面プラズモン共鳴(SPR)により、摂氏25度で測定した。抗PCSK9抗体PC9#3ヒトIgG1−TMはベンチマークとして用いた(配列番号404の可変重鎖および配列番号405の可変軽鎖。
まず、マウス抗ヒトIgGモノクローナル抗体表面を、ヒト抗体捕捉キットおよびCM5センサーチップ(GE Healthcare)を用いて作成した。ヒト抗体化合物は、10μL/分の流速で3分間捕捉した。組換えヒトAvi_PCSK9_Flag_His(社内)、カニクイザルAvi_PCSK9_Flag_His(社内)およびHisタグ化ラットPCSK9(SinoBiological)を、ランニングバッファー(10mMリン酸ナトリウム、pH7.4、150mM塩化ナトリウム、1mg/mLのBSA、0.05%ツイーン20)で1nM〜200nMの範囲の濃度に希釈し、チップ表面上に10分間注射し、その後わずか10分間の解離段階にランニングバッファーを供した。チップの表面を、各抗体適用の間、3M塩化マグネシウムを用いて再生させた。まず全体的な解離速度を、その後全体的なオン速度を、いずれも1:1の結合動力学的モデルを用いて算出した。
結果は表22に示す。
融合分子HS9_DSB7_V19Aは、600pMのヒトPCSK9に対するpH7.4での親和性を有し、ベンチマーク抗PCSK9抗体PC9#3と酷似している。興味深いことに、4倍低い解離定数を有するHS9_DSB7_V19Aは、PC9#3と比べてヒトPCSK9から解離する傾向がより低い。
さらに、HS9_DSB7_V19Aは、生理学的pHでカニクイザルおよびラットPCSK9に強力に結合することができ、平衡解離定数はヒトPCSK9値に近い(各々、1.7nMおよび570pM)。
実施例18 抗PCSK9抗体との融合物中のGLP−1類似体ペプチドと密に関連したヒトタンパク質と比べてのPCSK9に対する特異性
GLP−1類似体抗PCSK9融合物HS9_DSB7_V19AヒトIgG1−TMと関連したヒトタンパク質と比べてのPCSK9に対する特異性は、解離増強ランタニド蛍光免疫測定法による時間分解蛍光(DELFIA TRFアッセイ、PerkinElmer)により測定した。組換えヒトAvi_PCSK9_Flag_His(社内)、GSTタグ化ヒトPCSK7(Abnova)、GSTタグ化ヒトMBTPS1(Abnova)およびFlag/Hisタグ化ヒトCD86(社内)を、PBS中、10μg/mLで96ウェル免疫測定用プレートにコーティングした。洗浄後、HS9_DSB7_V19Aを、25μg/mLの濃度で、抗原でコーティングしたウェルに添加した。プレートを、徹底洗浄前に室温で2時間インキュベートした。結合されたHS9_DSB7_V19AヒトIgG1−TMを、二次ユウロピウム標識抗ヒトIgG抗体(PerkinElmer)を用いて検出した。プレートへの抗原のコーティングは、マウス抗GST IgG(Abcam)を一次として、またユウロピウム標識抗マウスIgG(PerkinElmer)をヒトPCSK7およびヒトMBTPS1に対する検出として用いることによって評価した。ヒトPCSK9およびヒトCD86のコーティングは、ユウロピウム標識抗His IgG(PerkinElmer)を用いて直接的に評価した。
GLP−1類似体抗PCSK9融合物HS9_DSB7_V19AヒトIgG1−TMと関連したヒトタンパク質と比べてのPCSK9に対する特異性は、解離増強ランタニド蛍光免疫測定法による時間分解蛍光(DELFIA TRFアッセイ、PerkinElmer)により測定した。組換えヒトAvi_PCSK9_Flag_His(社内)、GSTタグ化ヒトPCSK7(Abnova)、GSTタグ化ヒトMBTPS1(Abnova)およびFlag/Hisタグ化ヒトCD86(社内)を、PBS中、10μg/mLで96ウェル免疫測定用プレートにコーティングした。洗浄後、HS9_DSB7_V19Aを、25μg/mLの濃度で、抗原でコーティングしたウェルに添加した。プレートを、徹底洗浄前に室温で2時間インキュベートした。結合されたHS9_DSB7_V19AヒトIgG1−TMを、二次ユウロピウム標識抗ヒトIgG抗体(PerkinElmer)を用いて検出した。プレートへの抗原のコーティングは、マウス抗GST IgG(Abcam)を一次として、またユウロピウム標識抗マウスIgG(PerkinElmer)をヒトPCSK7およびヒトMBTPS1に対する検出として用いることによって評価した。ヒトPCSK9およびヒトCD86のコーティングは、ユウロピウム標識抗His IgG(PerkinElmer)を用いて直接的に評価した。
結果によると、HS9_DSB7_V19AヒトIgG1−TMが、ヒトPCSK7、ヒトMBTPS1(PCSK8)またはヒトCD86ではなく(データは示さず)、ヒトPCSK9に強力に結合することが示された。
実施例19 抗PCSK9抗体との融合物中のGLP−1類似体ペプチドを用いたヒトPCSK9のLDL受容体への結合の遮断
GLP−1類似体抗PCSK9融合物HS9_DSB7_V19AがヒトPCSK9のヒトLDL受容体への結合を遮断する能力を、ELISA競合アッセイを用いて評価した。抗PCSK9抗体HS9および無関係アイソタイプ一致NIP228ヒトIgG1−TMを各々、正の対照および負の対照として用いた。
GLP−1類似体抗PCSK9融合物HS9_DSB7_V19AがヒトPCSK9のヒトLDL受容体への結合を遮断する能力を、ELISA競合アッセイを用いて評価した。抗PCSK9抗体HS9および無関係アイソタイプ一致NIP228ヒトIgG1−TMを各々、正の対照および負の対照として用いた。
1×リン酸塩緩衝生理食塩水、3%スキムミルク中、5ug/mLでのビオチン化ヒトPCSK9(社内)の、10ug/mLで96ウェルMaxiSorbプレート(NUNC)上に一晩コーティングしたヒトLDL−R(R&D Systems)への結合を、Delfiaバッファー(Perkin Elmer)中、100ng/mLで希釈したクリプテート標識ストレプトアビジン(Perkin Elmer)を用いて、ELISAにより検出した。その相互作用は、LDL受容体でコーティングしたウェル内のビオチン化PCSK9試薬とともに室温で2時間同時インキュベートした化合物の100ug/mLで開始する3倍連続希釈を用いて負荷した。蛍光シグナルは、340nmの励起および620nmの放射を用いて、Perkin Elmer Envision装置で読み取った。特異的結合の百分率は、LDL受容体をプレート上にコーティングしない場合に得られるバックグラウンドシグナルを減算し、競合化合物を伴わない場合に得られる最大特異的結合シグナルからバックグラウンドレベルを減算して正規化することによって算出した。
PCSK9のLDL受容体への結合の生化学的阻害を図25に示す。
融合分子HS9_DSB7_V19Aは、ビオチン化ヒトPCSK9の、正の対照の抗PCSK9抗体HS9における3.5E〜8MのIC50と比べて類似の4.3E〜8のIC50を有する組換えLDL受容体への結合を遮断し得る。
実施例20 抗PCSK9抗体との融合物中のGLP−1類似体ペプチドで処置されたHEPG2細胞によるLDL取り込み
GLP−1類似体抗PCSK9融合物HS9_DSB7_V19AがPCSK9活性を遮断し、LDL取り込みを回復させる能力は、以下のようにHepG2肝細胞内で試験した。抗PCSK9抗体PC9#2および無関係アイソタイプ一致NIP228ヒトIgG1−TMを各々、正の対照および負の対照として用いた。
GLP−1類似体抗PCSK9融合物HS9_DSB7_V19AがPCSK9活性を遮断し、LDL取り込みを回復させる能力は、以下のようにHepG2肝細胞内で試験した。抗PCSK9抗体PC9#2および無関係アイソタイプ一致NIP228ヒトIgG1−TMを各々、正の対照および負の対照として用いた。
ヒトHepG2細胞を、10%リポタンパク質欠損血清(Sigma)を添加したDMEM培地(Gibco)中、2×104細胞/ウェルの濃度で、黒色の清澄な底の96ウェルGreinerプレートに播種し、摂氏37度(5%CO2)で一晩インキュベートした。PCSK9を試験化合物と複合させるため、45nMのヒトAvi_PCSK9_FLAG_His(社内)を、試験化合物を伴う場合と伴わない場合に、DMEM+10%LPDS中、様々な濃度、室温で1時間インキュベートした。すべての培地を細胞板から除去し、PCSK9/化合物の混合物をプレートに移し、1時間インキュベートした。次に、DMEM+10%LPDSで50nMの最終濃度まで希釈したBodipy−LDL(Molecular Probes)を細胞に移し、プレートを摂氏37度(5%CO2)で5時間インキュベートした。細胞をPBSで完全に洗浄し、核色素Hoeschtで染色し、3.7%(v/v)の最終濃度でホルムアルデヒドを用いて固定した。アッセイプレートは、Cellomics ArrayScan VTiハイコンテントイメージングシステムを用いて、細胞結合蛍光について読み取った。Hoescht染色は、BGRFR_386_23フィルターを用いてチャンネル1で、またBodipy−LDLは、BGRFR_485_20フィルターを用いてチャンネル2で測定した。画像は、Compartmental Analysis v4アルゴリズムを用いて分析した。
HepG2細胞によるLDL取り込みのPCSK9依存性低下の阻害を図26に示す。
融合分子HS9_DSB7_V19Aは、正の対照の抗PCSK9抗体PC9#2における3.1E〜8MのIC50と比べて類似の2.5E〜8のIC50を有するヒトPCSK9で処置したHepG2細胞により、LDL取り込みを回復させ得る。
実施例21 抗PCSK9抗体との融合物中のGLP−1類似体ペプチドの種間でのGLP−1受容体での効力
ヒト、カニクイザル、マウスおよびラットGLP−1受容体でのGLP−1類似体抗PCSK9融合物HS9_DSB7_V19Aの交差反応性を、目的の受容体を過剰発現する安定な細胞株を用いることによって、前述のようにcAMP産生アッセイで試験した。GLP1−Fc融合物(社内)およびGLP−1ペプチドを、正の対照として用いた。
ヒト、カニクイザル、マウスおよびラットGLP−1受容体でのGLP−1類似体抗PCSK9融合物HS9_DSB7_V19Aの交差反応性を、目的の受容体を過剰発現する安定な細胞株を用いることによって、前述のようにcAMP産生アッセイで試験した。GLP1−Fc融合物(社内)およびGLP−1ペプチドを、正の対照として用いた。
異なるGLP−1受容体での効力を表23にまとめる。
融合分子HS9_DSB7_V19Aは、4つすべての試験種間でGLP−1受容体を活性化し得る。
実施例22 いくつかの化合物はヒトGLP−1受容体での効力を低減することによって同定された
DSB7の効力を低減するため、ペプチド中の特定の残基を突然変異させた。所望される効力での配列番号4のリンカーを用いた配列番号2に対するペプチド抗体融合物(ここで緑色三角形で示される)を、ヒトGLP1−Rでの特異性および種交差反応についてさらに分析した。図27を参照のこと。
DSB7の効力を低減するため、ペプチド中の特定の残基を突然変異させた。所望される効力での配列番号4のリンカーを用いた配列番号2に対するペプチド抗体融合物(ここで緑色三角形で示される)を、ヒトGLP1−Rでの特異性および種交差反応についてさらに分析した。図27を参照のこと。
変異体は、HS9_DSB7_G2V(Gly2−>Val)(配列番号44および配列番号1);HS9_DSB7_E15A(Glu15−>Ala)(配列番号45および配列番号1);HS9_DSB7_V19A(Val19−>Ala)(配列番号47および配列番号1);HS9_DSB7_L26I(Leu26−>Ile)(配列番号46および配列番号1)(Val19−>Ala(配列番号3)と比較)として示す。これら4つの変異体は、最終的な特徴づけに選択した。結果を図27に示す。
実施例23 効力が低下した融合分子
PCSK9/GLP−1融合分子は、図28Aに示すように、GLP−1受容体に対して所望される効力を示す。この化合物の効力は、悪心を最小限にするように低減されている。表24は、HS9_DSB7_V19Aがデュラグルチドに対して57.7倍低下した効力を有することを示す。この操作された効力の低下は、悪心や他の有害作用を低減するような所望される効果をもたらす。
PCSK9/GLP−1融合分子は、図28Aに示すように、GLP−1受容体に対して所望される効力を示す。この化合物の効力は、悪心を最小限にするように低減されている。表24は、HS9_DSB7_V19Aがデュラグルチドに対して57.7倍低下した効力を有することを示す。この操作された効力の低下は、悪心や他の有害作用を低減するような所望される効果をもたらす。
実施例1のPCSK9/GLP−1融合物は、例えば図28Bに示すように、週毎の投与を可能にするのに十分な抗体曝露/GLP−1活性特性を示す。ラットでのpK安定性試験では、58.5mg/kgのHS9_DSB7_V19Aをラットに注射した。融合化合物の濃度は、血清中で経時的に測定する。ラットから採取した試料は、血清中の試験化合物の活性と試験化合物の濃度の双方について分析する。GLP−1活性部分から得たデータは、「活性」化合物の濃度について再計算するために用いる。黒丸を伴う線は、HS9_DSB7_V19Aの濃度であり、黒四角を伴う線は、同一試料における活性HS9_DSB7_V19A(すなわちGLP−1活性を有する)の濃度である。
実施例24 抗PCSK9抗体との融合物中のGLP−1類似体ペプチドと密に関連したヒト受容体と比べてのGLP−1受容体に対する特異性
GLP−1受容体に対するGLP−1類似体抗PCSK9融合物HS9_DSB7_V19Aの関連のヒト受容体と比べての特異性を、目的の受容体、すなわち、グルカゴン、GIP、GLP−2およびセクレチン受容体を過剰発現する安定な細胞株を用いることによって、前述のようにcAMP産生アッセイで試験した。4つの受容体の各々に対して特異的な作動薬ペプチドを正の対照として用いた。
GLP−1受容体に対するGLP−1類似体抗PCSK9融合物HS9_DSB7_V19Aの関連のヒト受容体と比べての特異性を、目的の受容体、すなわち、グルカゴン、GIP、GLP−2およびセクレチン受容体を過剰発現する安定な細胞株を用いることによって、前述のようにcAMP産生アッセイで試験した。4つの受容体の各々に対して特異的な作動薬ペプチドを正の対照として用いた。
データは、図29A〜D(A:グルカゴン受容体、B:GIP受容体、C:GLP−2受容体、D:セクレチン受容体)に示す。
融合分子HS9_DSB7_V19Aは、GLP−1受容体に対して特異的であり、4つの試験対象の密に関連した受容体のいずれも活性化しない。
実施例25 融合分子のさらなる特徴づけにより好ましいインビボ特性が示される
実施例2のPCSK9/GLP−1融合分子(HS9_DSB7_V19A(配列番号1の重鎖および配列番号47の軽鎖融合物))は、投与後7日目を含み、経時的なより優れたグルコース調節および体重減少を示す。データは、デュラグルチドならびにPC9_2_VHおよびVL(配列番号8および9)に対して示す。動物に0日目に化合物を投与し、次にそれらの体重を経時的に測定し、体重変化を測定した。
実施例2のPCSK9/GLP−1融合分子(HS9_DSB7_V19A(配列番号1の重鎖および配列番号47の軽鎖融合物))は、投与後7日目を含み、経時的なより優れたグルコース調節および体重減少を示す。データは、デュラグルチドならびにPC9_2_VHおよびVL(配列番号8および9)に対して示す。動物に0日目に化合物を投与し、次にそれらの体重を経時的に測定し、体重変化を測定した。
融合分子は、高親和性に精製PCSK9に結合し、HEPG2細胞内でのLDLc取り込みを回復させ、GLP−1Rを所望される効力で刺激し、体重減少を促進し、また週毎の投与および持続的なGLP−1のインビボ活性を支援するようなラットPKでの好ましい曝露/活性特性を示すことを示している。
結果を図30A〜Bに提供する。
実施例26 抗PCSK9抗体との融合物中のGLP−1類似体ペプチドの活性に対するリンカーの影響
化合物HS9_DSB7_V19Aは、ペプチド部分と抗体軽鎖との間に3回リピートするGly4Serモチーフに対応する配列番号4のリンカーを有する。抗PCSK9抗体HS9の軽鎖(軽鎖:配列番号2および重鎖:配列番号1)と融合される場合のGLP−1類似体ペプチドDSB7_V19A(配列番号3)との間のリンカー長の影響を検討するため、リンカー長が短縮された3つの融合物、すなわち、Gly4Serモチーフの2回リピートに対応するリンカー(リンカー:配列番号403)を有するHS9_DSB7_V19A_L2(配列番号419)、Gly4Serモチーフの1回リピートに対応するリンカー(配列番号27)を有するHS9_DSB7_V19A_L1(配列番号420)、およびペプチドと抗体軽鎖との間にリンカーを有しないHS9_DSB7_V19A_L0(配列番号421)を作成した。
化合物HS9_DSB7_V19Aは、ペプチド部分と抗体軽鎖との間に3回リピートするGly4Serモチーフに対応する配列番号4のリンカーを有する。抗PCSK9抗体HS9の軽鎖(軽鎖:配列番号2および重鎖:配列番号1)と融合される場合のGLP−1類似体ペプチドDSB7_V19A(配列番号3)との間のリンカー長の影響を検討するため、リンカー長が短縮された3つの融合物、すなわち、Gly4Serモチーフの2回リピートに対応するリンカー(リンカー:配列番号403)を有するHS9_DSB7_V19A_L2(配列番号419)、Gly4Serモチーフの1回リピートに対応するリンカー(配列番号27)を有するHS9_DSB7_V19A_L1(配列番号420)、およびペプチドと抗体軽鎖との間にリンカーを有しないHS9_DSB7_V19A_L0(配列番号421)を作成した。
化合物は、ELISAによる組換えヒトPCSK9に対する結合と、実施例4に記載のようにcAMPアッセイの細胞に基づくアッセイを用いるヒトGLP−1受容体での活性との双方について試験した。
結合ELISAを、1×リン酸塩緩衝生理食塩水中、10ug/mLでヒトPCSK9(社内)をコーティングすることによって実施した。プレートを1×リン酸塩緩衝生理食塩水、3%スキムミルクでブロッキング後、化合物を、PBS中、100ug/mLで添加し、洗浄前に室温で2時間インキュベートした。結合化合物は、Delfiaバッファー(Perkin Elmer)中、100ng/mLで希釈したクリプテート標識Fcに特異的な抗ヒトIgG(Perkin Elmer)を用いて検出した。蛍光シグナルは、340nmの励起および620nmの放射を用いて、Perkin Elmer Envision装置で読み取った。HS9_DSB7_V19Aを正の対照として用い、無関係アイソタイプ一致NIP228を、バックグラウンドレベルを測定するのに用いた。
PCSK9結合およびGLP−1受容体活性化のデータは各々、図31および図32に示す。
すべての追加的な融合分子は、ヒトPCSK9に、HS9_DSB7_V19Aと比べて類似のレベルまで結合することができる。試験融合分子はまた、cAMPの細胞に基づくアッセイにおいてヒトGLP−1受容体を活性化することができるが、リンカー長を低減することは、化合物の効力に対して負の影響を有することである。そのアッセイでは、HS9_DSB7_V19A、HS9_DSB7_V19A_L2、HS9_DSB7_V19A_L1およびHS9_DSB7_V19A_L0におけるEC50は各々、5.0nM、15.6nM、68.7nMおよび537nMである。
実施例27 抗PCSK9抗体との融合物中の安定なGLP−1類似体ペプチドのインビトロ特徴づけ
配列番号3)のGLP−1類似体ペプチドDSB7_V19Aを、配列番号4のリンカーを用いて、HS9以外の抗PCSK9抗体の軽鎖に融合した。
1_配列番号10の抗体可変重鎖および配列番号11の抗体可変軽鎖を有するPC9#1
2_配列番号404の抗体可変重鎖および配列番号405の抗体可変軽鎖を有するPC9#3
3_配列番号406の抗体可変重鎖および配列番号407の抗体可変軽鎖を有するPC9#4
4_配列番号408の抗体可変重鎖および配列番号409の抗体可変軽鎖を有するPC9#5
5_配列番号410の抗体可変重鎖および配列番号411の抗体可変軽鎖を有するPC9#6
6_配列番号412の抗体可変重鎖および配列番号413の抗体可変軽鎖を有するPC9#7
配列番号3)のGLP−1類似体ペプチドDSB7_V19Aを、配列番号4のリンカーを用いて、HS9以外の抗PCSK9抗体の軽鎖に融合した。
1_配列番号10の抗体可変重鎖および配列番号11の抗体可変軽鎖を有するPC9#1
2_配列番号404の抗体可変重鎖および配列番号405の抗体可変軽鎖を有するPC9#3
3_配列番号406の抗体可変重鎖および配列番号407の抗体可変軽鎖を有するPC9#4
4_配列番号408の抗体可変重鎖および配列番号409の抗体可変軽鎖を有するPC9#5
5_配列番号410の抗体可変重鎖および配列番号411の抗体可変軽鎖を有するPC9#6
6_配列番号412の抗体可変重鎖および配列番号413の抗体可変軽鎖を有するPC9#7
融合物は、実施例26に記載のようにELISAによる組換えヒトPCSK9に対する結合と、実施例4に記載のようにcAMPの細胞に基づくアッセイを用いるヒトGLP−1受容体での活性との双方について試験した。HS9_DSB7_V19AおよびNIP228アイソタイプ一致を各々、正の対照および負の対照として用いた。
PCSK9結合およびGLP−1受容体活性化のデータは各々、図33および図34に示す。
ヒトGLP−1受容体cAMPアッセイで試験した7つすべての化合物が、受容体を活性化することができる。パネルの中の効力は、PC9#6_DSB7_V19AおよびPC9#5_DSB7_V19Aの各々において1〜350nMの範囲である。HS9_DSB7_V19Aは、そのアッセイにおいて5nMの効力を有する。
さらに、すべての試験融合物はまた、ELISAによると、ヒトPCSK9に、結合が弱いPC9#7_DSB7_V19Aおよび結合しないPC9#6_DSB7_V19Aを例外として、強力に結合することができる。
実施例28 抗B7−H1抗体との融合物中の安定なGLP−1類似体ペプチドのインビトロ特徴づけ
配列番号3のGLP−1類似体ペプチドDSB7_V19Aは、配列番号4のリンカーを用いて、特許の国際公開第2011066389号パンフレットに記載の抗B7−H1抗体2.7A4の軽鎖に融合させた。抗B7−H1抗体2.7A4は、配列番号422の可変重鎖および配列番号423の可変軽鎖を有する。
配列番号3のGLP−1類似体ペプチドDSB7_V19Aは、配列番号4のリンカーを用いて、特許の国際公開第2011066389号パンフレットに記載の抗B7−H1抗体2.7A4の軽鎖に融合させた。抗B7−H1抗体2.7A4は、配列番号422の可変重鎖および配列番号423の可変軽鎖を有する。
融合物は、ELISAによる組換えヒトB7−H1に対する結合と、実施例4に記載のようにcAMPアッセイの細胞に基づくアッセイを用いるヒトGLP−1受容体での活性との双方について試験した。
結合ELISAを、1×リン酸塩緩衝生理食塩水中、5ug/mLでヒトB7−H1(社内)をコーティングすることによって実施した。プレートを1×リン酸塩緩衝生理食塩水、3%スキムミルクでブロッキング後、化合物を、PBS中、10ug/mLで添加し、洗浄前に室温で2時間インキュベートした。結合化合物は、実施例25に記載のように、クリプテート標識Fcに特異的な抗ヒトIgG(Perkin Elmer)を用いて検出した。抗B7−H1抗体2.7A4および無関係アイソタイプ一致NIP228を各々、正の対照および負の対照として用いた。
B7−H1結合およびGLP−1受容体活性化のデータは各々、図35および図36に示す。
融合物2.7A4_DSB7_V19Aは、ヒトB7−H1に、正の対照の2.7A4抗体と類似のレベルまで結合することができる。融合物はまた、cAMPの細胞に基づくアッセイにおいて、ヒトGLP−1受容体をHS9_DSB7_V19Aにおける5nMと比べて100nMの効力で活性化することができる。
実施例29 単回静脈内投与後の抗PCSK9抗体との融合物中のGLP−1類似体ペプチドのラットでの薬物動態学および薬力学
CDラットにおける単回静脈内ボーラス後のペプチド抗体融合HS9_DSB7_V19AについてのPKPD試験は、そのインビボ安定性を化合物曝露および活性GLP−1の濃度の双方を測定することによって、また標的会合を遊離ラットPCSK9の濃度を測定することによって評価するために実施した。
CDラットにおける単回静脈内ボーラス後のペプチド抗体融合HS9_DSB7_V19AについてのPKPD試験は、そのインビボ安定性を化合物曝露および活性GLP−1の濃度の双方を測定することによって、また標的会合を遊離ラットPCSK9の濃度を測定することによって評価するために実施した。
融合分子を10、30および60mg/kgで注射した。抗PCSK9 mAb HS9は、それにペプチドが結合することがなく、対照として用い、60mg/kgで注射した。血液試料は次のように採取した。
1:10mg/kg治療群に対して、投与前−0.5時間−6時間−24時間−48時間−96時間および168時間;
2:30mg/kg治療群に対して、投与前−0.5時間−24時間−48時間−96時間−168時間および240時間;および
3:60mg/kg治療群に対して、投与前−0.5時間−24時間−72時間−168時間−336時間および504時間
1:10mg/kg治療群に対して、投与前−0.5時間−6時間−24時間−48時間−96時間および168時間;
2:30mg/kg治療群に対して、投与前−0.5時間−24時間−48時間−96時間−168時間および240時間;および
3:60mg/kg治療群に対して、投与前−0.5時間−24時間−72時間−168時間−336時間および504時間
ラット血清試料中の全ヒトIgG1抗体(曝露)の濃度および活性GLP−1化合物の濃度を、実施例4に記載のように定量化した。
3つの試験用量(10、30および60mg/kg)に対するラット血清中の全および活性GLP−1化合物のHS9_DSB7_V19Aの経時的濃度を図37に示す。
全化合物および活性GLP−1の双方における曲線下面積(AUC)は、表25にもまとめる。活性GLP−1および全化合物のAUC間の比を算出することは、インビボ安定性を評価するための一方法である。1つの比は、試験条件下での完全に安定な化合物に対応している。
抗PCSK9 mAb PC9#2との軽鎖融合物中のExendin−4を含む親融合分子PC9#2_Exe4(実施例4を参照)におけるデータもまた、比較のために含めている。
HS9_DSB7_V19Aは、親分子PC9#2_Exe4と比べてより大きい活性/全AUC比を呈し、これはGLP−1受容体での活性におけるラットでの改善されたインビボ安定性特性を示す。
血清試料中の遊離ラットPCSK9濃度の測定は、MSD(登録商標)プラットフォームを用いるサンドイッチリガンド結合アッセイ法に基づいた。遊離ラットPCSK9を、最初にStandard Bind MSD(登録商標)プレートの炭素表面上に非特異的に吸着する抗PCSK9 mAb HS9を用いて捕捉した。Abcam製の抗PCSK9抗体(製品番号ab125251)を、社内でMSD(登録商標)SULFO−TAG(商標)を用いて標識し、検出試薬として用いた。次にプレートを、MSD(登録商標)Sector Imager 6000(SI6000)装置を用いて読み取った。
HS9_DSB7_V19AのラットPCSK9への経時的会合を、ラット血清試料中の遊離抗原の濃度を測定することによって評価した。3つの投与群(10、30および60mg/kg)におけるデータは、表26および図38に示す。
HS9_DSB7_V19Aは、ラットPCSK9を、すべての試験用量で90%未満に抑制することができるが、抑制の持続時間は用量依存性である。遊離ラットPCSK9は、HS9_DSB7_V19Aが10、30および60mg/kgで投与されるとき、注射から各々6時間、168時間および336時間経過後に再び検出可能である。
実施例30 単回皮下投与後の抗PCSK9抗体との融合物中のGLP−1類似体ペプチドのラットでの薬物動態学および薬力学
CDラットにおける60mg/kgでの単回皮下ボーラス後のGLP−1類似体ペプチド抗体融合物HS9_DSB7_V19Aについての薬物動態試験を、投与の経路ならびに化合物曝露およびインビボ安定性に対するその潜在的な影響を比較するため、実施した。
CDラットにおける60mg/kgでの単回皮下ボーラス後のGLP−1類似体ペプチド抗体融合物HS9_DSB7_V19Aについての薬物動態試験を、投与の経路ならびに化合物曝露およびインビボ安定性に対するその潜在的な影響を比較するため、実施した。
融合分子を、1.5mL/kgの処方計画を用いて40mg/mLで注射した。血液試料を、投与前−6時間−24時間−48時間−96時間−168時間および240時間経過後に採取した。
血清試料中の全ヒトIgG1抗体の濃度および活性GLP−1化合物の濃度ならびに遊離ラットPCSK9抗原の濃度を、実施例4および実施例29に記載のように測定した。
HS9_DSB7_V19Aにおける全および活性化合物ならびに遊離ラットPCSK9濃度を図39に示す。約1000nMの最大化合物濃度が、注射後48時間〜96時間の間に認められた。遊離ラットPCSK9の濃度は、化合物注射後、アッセイの定量の下限未満に急激に低下しており、168時間後に再び検出することができる。
実施例29に記載の単回静脈内用量注射からのデータを用いて予測をモデリングするため、全および活性化合物の双方における曲線下面積(AUC)を算出し、比較した(表27)。吸収フラクションおよび吸収速度を各々、75%および0.3d-1に設定した。
60mg/kgでの単回皮下注射後のHS9_DSB7_V19Aの曝露および活性GLP−1のAUCは、単回静脈注射データを用いて予測した値と類似している。これは、注射の皮下経路が、静脈内投与経路と比べて、化合物のインビボ安定性に対して有意な影響を有しないことを示す。
実施例31 抗PCSK9抗体との融合物中のGLP−1類似体ペプチドの齧歯類での薬理学的抗糖尿病効果
HS9_DSB7_V19A融合分子のGLP−1類似体ペプチド部分の改変された性質により、抗糖尿病活性がインビボで保持されたことを確認するため、正常、肥満、および糖尿病マウスモデルにおけるいくつかの齧歯類薬理学試験を実施した。
HS9_DSB7_V19A融合分子のGLP−1類似体ペプチド部分の改変された性質により、抗糖尿病活性がインビボで保持されたことを確認するため、正常、肥満、および糖尿病マウスモデルにおけるいくつかの齧歯類薬理学試験を実施した。
A)C57Bl6マウスにおける耐糖能に対するHS9_DSB7_V19Aの急性および亜急性効果
単回用量のHS9_DSB7_V19Aを、正常C57Bl6マウスの皮下に1または50mg/kgのいずれかで投与した。融合分子のGLP−1類似体成分の有効性を、複数のグルコース負荷(経口グルコース負荷試験)により、HS9_DSB7_V19Aの投与から4、48、および168時間後に評価した。融合されたGLP−1類似体ペプチドを含まない抗PCSK9 mAb HS9を耐糖能における負の対照として50mg/kgで投与した一方、リラグルチド(Victoza)およびGLP−1類似体−Fcγ4融合物(デュラグルチドに類似)を各々、0.2および1mg/kgで投与した。リラグルチドの半減期が短いことから、この化合物は各グルコース負荷の2時間前に投与した一方、GLP−1類似体−Fcγ4融合分子はHS9_DSB7_V19A試験化合物と同時に1回投与した。
単回用量のHS9_DSB7_V19Aを、正常C57Bl6マウスの皮下に1または50mg/kgのいずれかで投与した。融合分子のGLP−1類似体成分の有効性を、複数のグルコース負荷(経口グルコース負荷試験)により、HS9_DSB7_V19Aの投与から4、48、および168時間後に評価した。融合されたGLP−1類似体ペプチドを含まない抗PCSK9 mAb HS9を耐糖能における負の対照として50mg/kgで投与した一方、リラグルチド(Victoza)およびGLP−1類似体−Fcγ4融合物(デュラグルチドに類似)を各々、0.2および1mg/kgで投与した。リラグルチドの半減期が短いことから、この化合物は各グルコース負荷の2時間前に投与した一方、GLP−1類似体−Fcγ4融合分子はHS9_DSB7_V19A試験化合物と同時に1回投与した。
Taconic Denmarkから得た雄C57Bl6マウス30匹を、実験前5日間気候順応させた。試験の1日目、動物を体重に基づいて5群に無作為化した。
実験群は次の通りであった。
グループ1:GLP−1類似体ペプチド成分を含まない抗PCSK9 mAb HS9(負の対照)−50mg/kg皮下用量
グループ2:リラグルチド(正の対照)−0.2mg/kg皮下用量
グループ3:HS9_DSB7_V19A−1mg/kg皮下用量
グループ4:HS9_DSB7_V19A−50mg/kg皮下用量
グループ5:GLP−1類似体−Fcγ4融合物−1mg/kg皮下用量
グループ1:GLP−1類似体ペプチド成分を含まない抗PCSK9 mAb HS9(負の対照)−50mg/kg皮下用量
グループ2:リラグルチド(正の対照)−0.2mg/kg皮下用量
グループ3:HS9_DSB7_V19A−1mg/kg皮下用量
グループ4:HS9_DSB7_V19A−50mg/kg皮下用量
グループ5:GLP−1類似体−Fcγ4融合物−1mg/kg皮下用量
融合分子のGLP−1類似体成分の有効性を投与後長期にわたって評価するため、3つの経口グルコース負荷試験(OGTT)を0日目、2日目および7日目に実施した。動物を、経口グルコース負荷前に4時間絶食させた。HS9_DSB7_V19A、不活性対照およびGLP−1類似体−Fcγ4融合物の用量はいずれも、0日目、OGTTの4時間前に1回投与した。0日目、2日目および7日目、リラグルチド(正の対照)を各グルコース負荷の2時間前に投与した。t=0マウスで、全マウスに、経口グルコース負荷として2g/kgグルコースを負荷した。血糖は、ベースラインを確立するのにt=−240分、−120分および0分に、またグルコース可動域に対する効果を監視するのにt=15分、30分、60分および120分に測定する。0日目、2日目および7日目のOGTTの結果を、図40A〜C(0日目(A)、2日目(B)、7日目(C))に示す。
本試験では、50mg/kgでのHS9_DSB7_V19Aの単回皮下投与の、正常C57Bl6マウスでの少なくとも7日間の耐糖能を改善する能力を確認する。
HS9_DSB7_V19A融合分子のGLP−1類似体成分の有効性のさらなる測定として、すべての体重を−3日目から試験の終了にかけて1日1回記録した。1および2日目、50mg/kgでのHS9_DSB7_V19Aの単回皮下投与が、体重における一過性の低下を誘発した。経時的なパーセント体重変化を図41に示す。
B)C57Bl6マウス−用量応答における耐糖能に対するHS9_DSB7_V19Aの急性および亜急性効果
用量応答効果を試験し、また正常C57Bl6マウスでの耐糖能および体重低下に対するHS9_DSB7_V19Aの最大有効用量を測定するため、設計的に上記の試験に類似する試験を、以下の実験群および用量で実施した。
グループ1:GLP−1類似体ペプチド成分を含まない抗PCSK9 mAb HS9(負の対照)−50mg/kg皮下用量
グループ2:リラグルチド(正の対照)−0.2mg/kg皮下用量
グループ3:HS9_DSB7_V19A−10mg/kg皮下用量
グループ4:HS9_DSB7_V19A−30mg/kg皮下用量
グループ5:HS9_DSB7_V19A−60mg/kg皮下用量
グループ6:GLP−1類似体−Fcγ4融合物−1mg/kg皮下用量
用量応答効果を試験し、また正常C57Bl6マウスでの耐糖能および体重低下に対するHS9_DSB7_V19Aの最大有効用量を測定するため、設計的に上記の試験に類似する試験を、以下の実験群および用量で実施した。
グループ1:GLP−1類似体ペプチド成分を含まない抗PCSK9 mAb HS9(負の対照)−50mg/kg皮下用量
グループ2:リラグルチド(正の対照)−0.2mg/kg皮下用量
グループ3:HS9_DSB7_V19A−10mg/kg皮下用量
グループ4:HS9_DSB7_V19A−30mg/kg皮下用量
グループ5:HS9_DSB7_V19A−60mg/kg皮下用量
グループ6:GLP−1類似体−Fcγ4融合物−1mg/kg皮下用量
−1日目、動物を、体重に基づいて、これら6グループに無作為化した(n=動物6匹/1群)。前述のとおり、OGTTを0、2および7日目に実施し、血糖をt=−240、−120、0、15、30、60および120分に測定した。
HS9_DSB7_V19Aの全部で3つの用量により、OGTTを実施した全部で3つの時点で類似レベルの改善された耐糖能が得られた。図42A〜Cは、この経口グルコース負荷試験からの結果を図示する(0日目(A)、2日目(B)、7日目(C))。
グルコースホメオスタシスの改善において認められる用量応答の欠如と対照的に、体重低下に対する明確な用量依存性効果が本試験で認められた。図43。
本実験モデルでは、HS9_DSB7_V19Aの単回10mg/kg用量により、投与後7日目に実施したOGTTでグルコースホメオスタシスにおける最大有効レベルの改善が得られた一方、同用量は、試験中の任意の時点で体重低下に対して統計学的に有意な効果を有しなかった。
C)糖尿病db/dbマウスモデルにおけるHS9_DSB7_V19Aの慢性代謝効果
糖尿病モデルにおけるいくつかの代謝パラメータに対するHS9_DSB7_V19Aの慢性ビボ有効性を確認するため、db/db(レプチン受容体欠損)マウスを、HS9_DSB7_V19Aの週投与の空腹時グルコース、耐糖能、体重低下および体重組成に対する効果を試験するために用いた。
糖尿病モデルにおけるいくつかの代謝パラメータに対するHS9_DSB7_V19Aの慢性ビボ有効性を確認するため、db/db(レプチン受容体欠損)マウスを、HS9_DSB7_V19Aの週投与の空腹時グルコース、耐糖能、体重低下および体重組成に対する効果を試験するために用いた。
本試験では、発明者らは、HS9_DSB7_V19Aの慢性代謝効果を、皮下経路を介する週投与時に試験した。溶媒対照群および正の対照GLP−1類似体−Fcγ4融合分子を隔週に皮下投与した。投与操作の数を本試験における全動物に一致させるため、HS9_DSB7_V19Aの週用量を受ける群は、他の動物が溶媒(負の対照)または正の対照GLP−1類似体−Fcγ4融合分子のいずれかの2週用量を受けた日に溶媒の投与を受けた。
Charles River,Italyから得た雄db/dbマウス60匹は、一次的に体重およびグリコシル化ヘモグロビン(HbA1c)について、また二次的に4時間空腹時血糖について無作為化した。これらの動物は、次のように5群(n=12)に無作為化した。
グループ1:溶媒対照群(リン酸塩緩衝生理食塩水)−隔週(BIW)の皮下投与
グループ2:GLP−1類似体−Fcγ4融合物(正の対照)−1mg/kg皮下用量・隔週の皮下投与
グループ3:HS9_DSB7_V19A−30mg/kg皮下用量−週1回(QW)
グループ4:HS9_DSB7_V19A−10mg/kg皮下用量−週1回(QW)
グループ5:HS9_DSB7_V19A−3mg/kg皮下用量−週1回(QW)
グループ1:溶媒対照群(リン酸塩緩衝生理食塩水)−隔週(BIW)の皮下投与
グループ2:GLP−1類似体−Fcγ4融合物(正の対照)−1mg/kg皮下用量・隔週の皮下投与
グループ3:HS9_DSB7_V19A−30mg/kg皮下用量−週1回(QW)
グループ4:HS9_DSB7_V19A−10mg/kg皮下用量−週1回(QW)
グループ5:HS9_DSB7_V19A−3mg/kg皮下用量−週1回(QW)
慢性試験は、初期投与後28日間実施した。BIW群の最終投与は試験24日目である一方、QW群の最終投与は試験21日目であった。本試験の主要な有効性エンドポイントは、体重、空腹時血糖、および耐糖能である。
体重は、治療期間中、3週毎に測定した。
4時間空腹時血糖は、週1回、投与から約24時間後に測定した。
耐糖能は、試験22日目、投与から約24時間後、腹腔内グルコース負荷試験(IPGTT)により測定した。動物は、1g/kgグルコースボーラスの投与前の4時間、絶食させた。血糖は、t=0、15、30、60、120、および180分に測定した。
本試験における体重低下は、正の対照GLP−1類似体−Fcγ4融合分子群における1時点を除いて有意でなかった。HS9_DSB7_V19Aの全部で3つの用量は、28日の試験過程でのいずれの時刻でも有意な体重低下を生じなかった。図44。
1週間のHS9_DSB7_V19Aは、溶媒対照と比べると、4時間空腹時血糖において用量依存性の低下を示した。図45。
毎週投与したHS9_DSB7_V19Aは、試験22日目、IPGTTによる評価として、耐糖能における用量依存性の改善を示した。図46。
D)食餌誘発性肥満(DIO)マウスモデルにおける耐糖能に対する単回用量HS9_DSB7_V19Aの急性効果
HS9_DSB7_V19Aの単回用量を、食餌誘発性肥満(DIO)マウスの皮下に0.1、1または10mg/kgで投与した。融合分子のGLP−1類似体成分の有効性を、HS9_DSB7_V19Aの投与から4および168時間後、別々のグルコース負荷(腹腔内グルコース負荷試験)により評価した。融合されたGLP−1類似体ペプチドを含まない抗PCSK9 mAb HS9を、耐糖能に対する効果における負の対照として10mg/kgで1回投与した。正の対照として、先行実験で用いたGLP−1類似体−Fcγ4融合物(デュラグルチドに類似)を、隔週に(BIW)1mg/kgで投与した。正の対照GLP−1類似体−Fcγ4融合物の投与計画について模擬実験を行うため、負の対照群およびHS9_DSB7_V19A実験群における全動物に、溶媒をBIWに投与した。試験持続時間は、初回投与後の21日間であった。一次エンドポイントは、0日目(投与から4時間後)および7日目でのIPGTTにおける耐糖能に対する効果であった。二次エンドポイントは、体重低下であった。
HS9_DSB7_V19Aの単回用量を、食餌誘発性肥満(DIO)マウスの皮下に0.1、1または10mg/kgで投与した。融合分子のGLP−1類似体成分の有効性を、HS9_DSB7_V19Aの投与から4および168時間後、別々のグルコース負荷(腹腔内グルコース負荷試験)により評価した。融合されたGLP−1類似体ペプチドを含まない抗PCSK9 mAb HS9を、耐糖能に対する効果における負の対照として10mg/kgで1回投与した。正の対照として、先行実験で用いたGLP−1類似体−Fcγ4融合物(デュラグルチドに類似)を、隔週に(BIW)1mg/kgで投与した。正の対照GLP−1類似体−Fcγ4融合物の投与計画について模擬実験を行うため、負の対照群およびHS9_DSB7_V19A実験群における全動物に、溶媒をBIWに投与した。試験持続時間は、初回投与後の21日間であった。一次エンドポイントは、0日目(投与から4時間後)および7日目でのIPGTTにおける耐糖能に対する効果であった。二次エンドポイントは、体重低下であった。
試験開始前、15週間の60%高脂肪食に対する21週齢雄DIOマウス50匹を、Jackson labsから得た(JAX:380050)。試験開始直前、動物を、体重に基づいて5群に無作為化した。
実験群(n=10匹/群)は次の通りであった。
グループ1:GLP−1類似体ペプチド成分を含まない抗PCSK9 mAb HS9(負の対照)−10mg/kg皮下用量−単回用量
グループ2:HS9_DSB7_V19A−0.1mg/kg皮下用量−単回用量
グループ3:HS9_DSB7_V19A−1mg/kg皮下用量_単回用量
グループ4:HS9_DSB7_V19A−10mg/kg皮下用量−単回用量
グループ5:GLP−1類似体−Fcγ4融合物−1mg/kg皮下用量・隔週投与(BIW)
グループ1:GLP−1類似体ペプチド成分を含まない抗PCSK9 mAb HS9(負の対照)−10mg/kg皮下用量−単回用量
グループ2:HS9_DSB7_V19A−0.1mg/kg皮下用量−単回用量
グループ3:HS9_DSB7_V19A−1mg/kg皮下用量_単回用量
グループ4:HS9_DSB7_V19A−10mg/kg皮下用量−単回用量
グループ5:GLP−1類似体−Fcγ4融合物−1mg/kg皮下用量・隔週投与(BIW)
融合分子のGLP−1類似体成分の有効性を投与後長期にわたって評価するため、2つの腹腔内グルコース負荷試験(IPGTT)を0および7日目に実施した。動物を、IPグルコース負荷前に6時間絶食させた。HS9_DSB7_V19A、不活性対照およびGLP−1類似体−Fcγ4融合物の全部で3つの用量を、0日目、OGTTの4時間前に1回投与した。GLP−1類似体−Fcγ4融合物を、0、3、7、10、14、17および21日目に投与した。0日目、全群にIPグルコース負荷の4時間前に試験化合物を投与する一方、7日目、IPグルコース負荷の4時間前にGLP−1類似体−Fcγ4融合物を投与し、他方、他のすべての群に溶媒のみを投与した。IPGTTを実施した各日においては、t=0マウスで、全マウスに、IPグルコース負荷として1.5g/kgグルコースを負荷した。血糖は、ベースラインを確立するのにt=−240分および0分に、またグルコース可動域に対する効果を監視するのにt=15分、30分、45分、60分、90分および120分に測定した。
0および7日目のIPGTTの結果を図47A〜Bに示す。
体重に対するHS9_DSB7_V19AのGLP−1成分の効果を評価するため、試験の全過程にかけて全動物を毎日秤量した。体重に対する効果を図48A〜Bに示す。
E)DIOマウスでの体重に対するHS9_DSB7_V19Aの複数回用量の効果
体重低下における用量−応答を確立するため、HS9_DSB7_V19Aを、週1回(QW)、3、10および30mg/kgで食餌誘発性肥満マウスの皮下に投与した。試験の持続時間は28日であり、一次エンドポイントは体重低下であった。血糖パラメータの二次評価は、分析を含み、試験の全過程を通じての供給グルコースおよび終了時空腹時血糖の測定を含んだ。DIOおよびdb/dbマウス双方における我々の先行試験と同様、GLP−1類似体−Fcγ4融合物を、グルコース調節および体重低下の双方における正の対照として、1mg/kgで隔週に(BIW)皮下投与した。
体重低下における用量−応答を確立するため、HS9_DSB7_V19Aを、週1回(QW)、3、10および30mg/kgで食餌誘発性肥満マウスの皮下に投与した。試験の持続時間は28日であり、一次エンドポイントは体重低下であった。血糖パラメータの二次評価は、分析を含み、試験の全過程を通じての供給グルコースおよび終了時空腹時血糖の測定を含んだ。DIOおよびdb/dbマウス双方における我々の先行試験と同様、GLP−1類似体−Fcγ4融合物を、グルコース調節および体重低下の双方における正の対照として、1mg/kgで隔週に(BIW)皮下投与した。
試験開始前、15週間の60%高脂肪食に対する21週齢雄DIOマウスを、Jackson labsから得た(JAX:380050)。試験開始直前、動物を、体重に基づいて5群に無作為化した(n=動物8匹/群)。
実験群(n=8匹/群)は次の通りであった。
グループ1:溶媒対照
グループ2:HS9_DSB7_V19A−3mg/kg皮下用量−週1回(QW)
グループ3:HS9_DSB7_V19A−10mg/kg皮下用量−週1回(QW)
グループ4:HS9_DSB7_V19A−30mg/kg皮下用量−週1回(QW)
グループ5:GLP−1類似体−Fcγ4融合物−1mg/kg皮下用量・隔週投与(BIW)
グループ1:溶媒対照
グループ2:HS9_DSB7_V19A−3mg/kg皮下用量−週1回(QW)
グループ3:HS9_DSB7_V19A−10mg/kg皮下用量−週1回(QW)
グループ4:HS9_DSB7_V19A−30mg/kg皮下用量−週1回(QW)
グループ5:GLP−1類似体−Fcγ4融合物−1mg/kg皮下用量・隔週投与(BIW)
体重に対するHS9_DSB7_V19AのGLP−1成分の効果(本試験の一次エンドポイント)を評価するため、試験の全過程にかけて全動物を毎日秤量した。体重に対する効果を図49に示す。
二次エンドポイントとして、また週用量設定において血糖調節に対するHS9_DSB7_V19AのGLP−1成分の効果を評価するため、供給グルコースを0、7、11、14、21および26日目に測定し、空腹時グルコースを試験終了(28日目)直前に測定した。結果を図50A〜Bに示す。
等価物
前述の明細書は、当業者が実施形態を実施することを可能にするのに十分であると考えられる。前述の説明および実施例は、特定の実施形態を詳述し、本発明者によって考察されたベストモードを記述する。しかし、前述が本文中でいかに詳細に見え得るとしても、実施形態が多くの方法で実行され、かつ特許請求の範囲がその任意の等価物を含み得ることは理解されるであろう。
前述の明細書は、当業者が実施形態を実施することを可能にするのに十分であると考えられる。前述の説明および実施例は、特定の実施形態を詳述し、本発明者によって考察されたベストモードを記述する。しかし、前述が本文中でいかに詳細に見え得るとしても、実施形態が多くの方法で実行され、かつ特許請求の範囲がその任意の等価物を含み得ることは理解されるであろう。
Claims (40)
- GLP−1ペプチドに安定に融合された抗PCSK9抗体を含む糖尿病を治療するための二重活性融合分子であって、ここで前記抗PCSK9抗体はPCSK9ポリペプチドに結合し、また前記GLP−1ペプチドはGLP−1受容体に結合する、二重活性融合分子。
- 前記GLP−1ペプチドが、前記PCSK9抗体にペプチドリンカーを介して融合される、請求項1に記載の融合分子。
- 前記ペプチドリンカーが、前記GLP−1ペプチドのC末端に融合される、請求項2に記載の融合分子。
- 前記GLP−1ペプチドが、配列番号36のアミノ酸配列を含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の融合分子。
- 前記GLP−1ペプチドが、配列番号3のアミノ酸配列を含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の融合分子。
- 前記GLP−1ペプチドのCys18が、前記GLP−1ペプチドのC末端とジスルフィド架橋を形成する、請求項5に記載の融合分子。
- 動物において、グルコースを調節し、および/またはLDLを低下させる、請求項1〜6のいずれか一項に記載の融合分子。
- 前記動物がヒトである、請求項7に記載の融合分子。
- 配列番号3のアミノ酸配列を含むGLP−1ペプチドに安定に融合された抗PCSK9抗体を含む糖尿病を治療するための二重活性融合分子であって、ここで前記GLP−1ペプチドのC末端は、前記抗PCSK9抗体にペプチドリンカーを介して融合され、また前記抗PCSK9抗体はPCSK9ポリペプチドに結合し、かつ前記GLP−1ペプチドはGLP−1受容体に結合する、二重活性融合分子。
- 前記GLP−1ペプチドが、前記抗PCSK9抗体の軽鎖にペプチドリンカーを介して融合される、請求項9に記載の二重活性融合分子。
- 前記GLP−1ペプチドが、前記抗PCSK9抗体の重鎖にペプチドリンカーを介して融合される、請求項9に記載の二重活性融合分子。
- 配列番号3のアミノ酸配列を含むGLP−1ペプチドに安定に融合された抗体を含む二重活性融合分子であって、ここで前記GLP−1ペプチドのC末端は、前記抗体にペプチドリンカーを介して融合され、また前記抗体は標的ポリペプチドに結合し、かつ前記GLP−1ペプチドはGLP−1受容体に結合する、二重活性融合分子。
- 前記抗体が抗PCSK9抗体である、請求項12に記載の二重活性融合分子。
- 前記GLP−1ペプチドが、前記抗PCSK9抗体の軽鎖にペプチドリンカーを介して融合される、請求項13に記載の二重活性融合分子。
- 前記GLP−1ペプチドが、前記抗PCSK9抗体の重鎖にペプチドリンカーを介して融合される、請求項13に記載の二重活性融合分子。
- 前記抗PCSK9抗体の軽鎖が、配列番号2のアミノ酸配列と少なくとも90%同一である、請求項10または14に記載の二重活性融合分子。
- 前記抗PCSK9抗体の軽鎖が、配列番号2のアミノ酸配列を含む、請求項16に記載の二重活性融合分子。
- 前記抗PCSK9抗体の重鎖が、配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも90%同一である、請求項11または15に記載の二重活性融合分子。
- 前記抗PCSK9抗体の重鎖が、配列番号1のアミノ酸配列を含む、請求項18に記載の二重活性融合分子。
- 前記ペプチドリンカーが、配列番号4のアミノ酸配列を含む、請求項12〜19のいずれか一項に記載の二重活性融合分子。
- 前記二重活性融合分子が糖尿病の治療を目的とする、請求項12〜20のいずれか一項に記載の二重活性融合分子。
- 前記GLP−1ペプチドの前記Cys18が、前記GLP−1ペプチドのC末端とジスルフィド架橋を形成する、請求項12〜21のいずれか一項に記載の二重活性融合分子。
- 動物において、グルコースを調節し、および/またはLDLを低下させる、請求項12〜22のいずれか一項に記載の二重活性融合分子。
- 前記動物がヒトである、請求項23に記載の二重活性融合分子。
- 配列番号28または配列番号29のアミノ酸配列を含むGLP−1ペプチドと比べて、前記ヒトGLP−1受容体で低下した効力を有するGLP−1ペプチドに安定に融合された抗PCSK9抗体を含む、糖尿病を治療するための二重活性融合分子であって、ここで前記GLP−1ペプチドのC末端は、ペプチドリンカーを介して前記抗PCSK9抗体に融合され、また前記抗PCSK9抗体はPCSK9ポリペプチドに結合し、かつ前記GLP−1ペプチドはGLP−1受容体に結合する、二重活性融合分子。
- 配列番号28または配列番号29のアミノ酸配列を含む前記GLP−1ペプチドは、配列番号4を含むリンカーを用いて、配列番号416を含むアミノ酸配列に融合される、請求項25に記載の二重活性融合分子。
- 前記ヒトGLP−1受容体での前記効力は、配列番号28または配列番号29のアミノ酸配列を含むGLP−1ペプチドと比べて30〜60倍低下する、請求項25または26に記載の二重活性融合分子。
- 2型糖尿病を治療する方法であって、それを必要とする被験者に、請求項1〜27のいずれか一項に記載の融合分子を投与するステップを含む、方法。
- 被験体におけるグルコースを調節する方法であって、それを必要とする被験者に、請求項1〜27のいずれか一項に記載の融合分子を投与するステップを含む、方法。
- 被験体における低密度リポタンパク質(LDL)を低減する方法であって、それを必要とする被験者に、請求項1〜27のいずれか一項に記載の融合分子を投与するステップを含む、方法。
- 被験体におけるグルコースを調節し、かつLDLを低下させる方法であって、それを必要とする被験者に、請求項1〜27のいずれか一項に記載の融合分子を投与するステップを含む、方法。
- 被験体における体重減少を促進し、グルコースを調節し、かつLDLを低下させる方法であって、それを必要とする被験者に、請求項1〜27のいずれか一項に記載の融合分子を投与するステップを含む、方法。
- 前記被験体が2型糖尿病を有する、請求項28〜32のいずれか一項に記載の方法。
- 前記被験体がメタボリックシンドロームを有する、請求項28〜32のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1〜27のいずれか一項に記載の融合分子をコードする単離されたポリヌクレオチド。
- 請求項35に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 請求項35に記載のポリヌクレオチドまたは請求項36に記載のベクターを含む宿主細胞。
- 請求項1〜27のいずれか一項に記載の融合分子を作成する方法であって、請求項35に記載の宿主細胞を前記融合分子の発現を可能にする条件下で培養するステップと、前記融合分子を回収するステップと、を含む、方法。
- 請求項1〜27のいずれか一項に記載の融合分子、および担体を含む医薬組成物。
- 請求項39に記載の組成物を含むキット。
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201461943300P | 2014-02-21 | 2014-02-21 | |
US61/943,300 | 2014-02-21 | ||
US201461944550P | 2014-02-25 | 2014-02-25 | |
US61/944,550 | 2014-02-25 | ||
PCT/US2015/016911 WO2015127273A1 (en) | 2014-02-21 | 2015-02-20 | Anti-pcsk9~glp-1 fusions and methods for use |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2017512457A true JP2017512457A (ja) | 2017-05-25 |
Family
ID=53879052
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2016544406A Pending JP2017512457A (ja) | 2014-02-21 | 2015-02-20 | 抗pcsk9〜glp−1融合物および使用方法 |
Country Status (12)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US10077319B2 (ja) |
EP (1) | EP3107937A4 (ja) |
JP (1) | JP2017512457A (ja) |
KR (1) | KR20160124787A (ja) |
CN (1) | CN106232627A (ja) |
BR (1) | BR112016017402A2 (ja) |
CA (1) | CA2935285A1 (ja) |
MX (1) | MX2016009858A (ja) |
RU (1) | RU2016137264A (ja) |
SG (1) | SG11201606684YA (ja) |
TW (1) | TW201538523A (ja) |
WO (1) | WO2015127273A1 (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2020528049A (ja) * | 2017-07-19 | 2020-09-17 | ノヴォ ノルディスク アー/エス | 二機能性化合物 |
JP2022544556A (ja) * | 2019-08-13 | 2022-10-19 | エニジェン カンパニー.,リミテッド. | エキセナチド類似体及びその用途 |
Families Citing this family (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US10058630B2 (en) * | 2012-10-22 | 2018-08-28 | Concievalve, Llc | Methods for inhibiting stenosis, obstruction, or calcification of a stented heart valve or bioprosthesis |
WO2016010927A1 (en) * | 2014-07-14 | 2016-01-21 | Amgen Inc. | Crystalline antibody formulations |
JO3664B1 (ar) | 2014-08-19 | 2020-08-27 | Merck Sharp & Dohme | أجسام مضادة لـ tigit |
CN115925931A (zh) | 2015-08-14 | 2023-04-07 | 默沙东公司 | 抗tigit抗体 |
BR112018013820A2 (pt) | 2016-01-13 | 2018-12-11 | Novo Nordisk A/S | análogos de egf(a) com substituintes de ácido graxo |
JP7053480B2 (ja) | 2016-03-03 | 2022-04-12 | ノヴォ ノルディスク アー/エス | Glp-1誘導体及びその使用 |
UA124734C2 (uk) | 2016-06-14 | 2021-11-10 | Рідженерон Фармасьютікалз, Інк. | Антитіло проти с5 і його застосування |
WO2018026742A1 (en) * | 2016-08-01 | 2018-02-08 | Askgene Pharma Inc. | Novel antibody-albumin-drug conjugates (aadc) and methods for using them |
JP2021506241A (ja) | 2017-12-13 | 2021-02-22 | リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドRegeneron Pharmaceuticals, Inc. | 抗c5抗体組み合わせ物およびその使用 |
AR116605A1 (es) | 2018-10-05 | 2021-05-26 | Novo Nordisk As | Compuestos bifuncionales que comprenden péptidos de insulina y péptidos de egf(a) |
Family Cites Families (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP4785206B2 (ja) * | 2005-01-14 | 2011-10-05 | ウクスィ・グランドチャンプ・ファーマシューティカル・テクノロジー・カンパニー・リミテッド | 修飾されたエキセンディン(Exendins)及びその使用 |
EP3456340B1 (en) * | 2007-01-08 | 2022-02-16 | The Trustees of the University of Pennsylvania | Glp-1 receptor antagonist for use in the treatment of congenital hyperinsulinism |
WO2009020802A2 (en) * | 2007-08-03 | 2009-02-12 | Eli Lilly And Company | Treatment for obesity |
CN104127880A (zh) * | 2009-03-27 | 2014-11-05 | 葛兰素集团有限公司 | 药用融合体和缀合物 |
CN101665799A (zh) * | 2009-06-29 | 2010-03-10 | 华东师范大学 | 一种Exendin-4衍生物的重组制备方法和应用 |
CN101993485B (zh) * | 2009-08-20 | 2013-04-17 | 重庆富进生物医药有限公司 | 促胰岛素分泌肽类似物同源二聚体及其用途 |
CN102844332B (zh) | 2010-03-11 | 2015-08-19 | 瑞纳神经科学公司 | 呈pH依赖性抗原结合的抗体 |
CA2799595C (en) | 2010-05-27 | 2022-08-16 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Method for preparing antibodies having improved properties |
JOP20200043A1 (ar) * | 2011-05-10 | 2017-06-16 | Amgen Inc | طرق معالجة أو منع الاضطرابات المختصة بالكوليسترول |
US9255154B2 (en) * | 2012-05-08 | 2016-02-09 | Alderbio Holdings, Llc | Anti-PCSK9 antibodies and use thereof |
TWI513705B (zh) * | 2012-06-11 | 2015-12-21 | Lilly Co Eli | 纖維母細胞生長因子21蛋白質 |
TW201625669A (zh) | 2014-04-07 | 2016-07-16 | 賽諾菲公司 | 衍生自艾塞那肽-4(Exendin-4)之肽類雙重GLP-1/升糖素受體促效劑 |
TW201625668A (zh) | 2014-04-07 | 2016-07-16 | 賽諾菲公司 | 作為胜肽性雙重glp-1/昇糖素受體激動劑之艾塞那肽-4衍生物 |
TW201625670A (zh) * | 2014-04-07 | 2016-07-16 | 賽諾菲公司 | 衍生自exendin-4之雙重glp-1/升糖素受體促效劑 |
-
2015
- 2015-02-20 SG SG11201606684YA patent/SG11201606684YA/en unknown
- 2015-02-20 BR BR112016017402A patent/BR112016017402A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2015-02-20 MX MX2016009858A patent/MX2016009858A/es unknown
- 2015-02-20 US US15/117,985 patent/US10077319B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2015-02-20 EP EP15752581.7A patent/EP3107937A4/en not_active Withdrawn
- 2015-02-20 KR KR1020167024260A patent/KR20160124787A/ko unknown
- 2015-02-20 CN CN201580009513.1A patent/CN106232627A/zh active Pending
- 2015-02-20 JP JP2016544406A patent/JP2017512457A/ja active Pending
- 2015-02-20 CA CA2935285A patent/CA2935285A1/en not_active Abandoned
- 2015-02-20 WO PCT/US2015/016911 patent/WO2015127273A1/en active Application Filing
- 2015-02-20 RU RU2016137264A patent/RU2016137264A/ru not_active Application Discontinuation
- 2015-02-24 TW TW104105983A patent/TW201538523A/zh unknown
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2020528049A (ja) * | 2017-07-19 | 2020-09-17 | ノヴォ ノルディスク アー/エス | 二機能性化合物 |
JP7339236B2 (ja) | 2017-07-19 | 2023-09-05 | ノヴォ ノルディスク アー/エス | 二機能性化合物 |
JP2022544556A (ja) * | 2019-08-13 | 2022-10-19 | エニジェン カンパニー.,リミテッド. | エキセナチド類似体及びその用途 |
JP7425855B2 (ja) | 2019-08-13 | 2024-01-31 | エニジェン カンパニー.,リミテッド. | エキセナチド類似体及びその用途 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
KR20160124787A (ko) | 2016-10-28 |
SG11201606684YA (en) | 2016-09-29 |
CN106232627A (zh) | 2016-12-14 |
WO2015127273A1 (en) | 2015-08-27 |
BR112016017402A2 (pt) | 2017-10-17 |
RU2016137264A3 (ja) | 2018-11-30 |
EP3107937A1 (en) | 2016-12-28 |
EP3107937A4 (en) | 2017-11-15 |
US20160369010A1 (en) | 2016-12-22 |
TW201538523A (zh) | 2015-10-16 |
MX2016009858A (es) | 2017-01-26 |
CA2935285A1 (en) | 2015-08-27 |
US10077319B2 (en) | 2018-09-18 |
RU2016137264A (ru) | 2018-03-26 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2017512457A (ja) | 抗pcsk9〜glp−1融合物および使用方法 | |
TWI773699B (zh) | 免疫球蛋白及其用途 | |
JP2020508054A (ja) | 抗タウ抗体及びその使用方法 | |
CN113166247A (zh) | 能够结合cd3和cd137但不同时结合cd3和cd137的抗原结合分子 | |
US20230324389A1 (en) | Compositions and methods related to activatable therapeutic agents | |
CN113278076A (zh) | 含有改变了抗体可变区的抗原结合分子 | |
TW201617366A (zh) | 新穎抗人類Tie2抗體 | |
US20230287040A1 (en) | Barcoded xten polypeptides and compositions thereof, and methods for making and using the same | |
JP2020524661A (ja) | 胃抑制ペプチド受容体(gipr)に対するアンタゴニスト結合タンパク質/glp−1受容体アゴニスト融合タンパク質を使用した代謝障害の治療又は寛解方法 | |
CN117980328A (zh) | 活化的肝星状细胞(hsc)的消耗及其用途 | |
WO2022212470A2 (en) | Materials and methods for immune effector cells redirection | |
US20190092877A1 (en) | Anti-pcsk9-glp-1 fusions and methods for use | |
CN113195533B (zh) | 抗序列相似家族19成员a5的抗体及其使用方法 | |
BR112021000391A2 (pt) | Composições e métodos relacionados a construtos do domínio de ligação fc-antígeno manipulado direcionado a ccr4 | |
WO2023030503A1 (en) | Anti-acvr2a antibodies and uses thereof | |
US20220267456A1 (en) | Materials and methods for targeting regulatory t cells for enhancing immune surveillance | |
JP2023531790A (ja) | Fgfr1/klb標的化アゴニスト抗原結合タンパク質およびglp-1rアゴニストペプチドとのそのコンジュゲート | |
CN117545505A (zh) | 具有工程化抗体恒定区变体的分子 | |
KR20240005823A (ko) | 다중특이적 fgf21 수용체 효능제 및 그의 용도 | |
CN117597365A (zh) | 多特异性fgf21受体激动剂及其应用 | |
CN117500836A (zh) | 用于免疫效应细胞重定向的材料和方法 |