TW201538523A - 抗-pcsk9~glp-1融合物及其使用方法 - Google Patents
抗-pcsk9~glp-1融合物及其使用方法 Download PDFInfo
- Publication number
- TW201538523A TW201538523A TW104105983A TW104105983A TW201538523A TW 201538523 A TW201538523 A TW 201538523A TW 104105983 A TW104105983 A TW 104105983A TW 104105983 A TW104105983 A TW 104105983A TW 201538523 A TW201538523 A TW 201538523A
- Authority
- TW
- Taiwan
- Prior art keywords
- glp
- artificial sequence
- peptide
- pcsk9
- prt
- Prior art date
Links
- 230000004927 fusion Effects 0.000 title claims abstract description 249
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 42
- DTHNMHAUYICORS-KTKZVXAJSA-N Glucagon-like peptide 1 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC=1N=CNC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CC=CC=C1 DTHNMHAUYICORS-KTKZVXAJSA-N 0.000 title claims abstract description 30
- 101710198884 GATA-type zinc finger protein 1 Proteins 0.000 title claims abstract 29
- 102100025101 GATA-type zinc finger protein 1 Human genes 0.000 title abstract 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 720
- 102100038955 Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 Human genes 0.000 claims description 173
- 101001098868 Homo sapiens Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 Proteins 0.000 claims description 119
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 59
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 59
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 58
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 claims description 45
- 101001015516 Homo sapiens Glucagon-like peptide 1 receptor Proteins 0.000 claims description 38
- 108010086246 Glucagon-Like Peptide-1 Receptor Proteins 0.000 claims description 37
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 31
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 29
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 20
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 18
- 102000007330 LDL Lipoproteins Human genes 0.000 claims description 17
- 108010007622 LDL Lipoproteins Proteins 0.000 claims description 17
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 claims description 17
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 16
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 claims description 15
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 13
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims description 13
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 13
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 10
- 230000001603 reducing effect Effects 0.000 claims description 10
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 9
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 8
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 8
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 8
- 208000001072 type 2 diabetes mellitus Diseases 0.000 claims description 8
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 5
- 101000788682 Homo sapiens GATA-type zinc finger protein 1 Proteins 0.000 claims description 2
- 208000001145 Metabolic Syndrome Diseases 0.000 claims description 2
- 201000000690 abdominal obesity-metabolic syndrome Diseases 0.000 claims description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 claims description 2
- 102400000322 Glucagon-like peptide 1 Human genes 0.000 claims 27
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 13
- 102000007446 Glucagon-Like Peptide-1 Receptor Human genes 0.000 claims 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 127
- 101710180553 Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 Proteins 0.000 description 94
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 77
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 74
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 52
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 50
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 42
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 40
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 40
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 40
- 102000053786 human PCSK9 Human genes 0.000 description 40
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 39
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 38
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 38
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 38
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 34
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 34
- 102100032882 Glucagon-like peptide 1 receptor Human genes 0.000 description 33
- 102100035360 Cerebellar degeneration-related antigen 1 Human genes 0.000 description 32
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 31
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 30
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 29
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 26
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 26
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 25
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 25
- 101100112922 Candida albicans CDR3 gene Proteins 0.000 description 24
- 102100035361 Cerebellar degeneration-related protein 2 Human genes 0.000 description 24
- 101000737796 Homo sapiens Cerebellar degeneration-related protein 2 Proteins 0.000 description 24
- 101000737793 Homo sapiens Cerebellar degeneration-related antigen 1 Proteins 0.000 description 23
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 23
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 23
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 23
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 21
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 20
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 20
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 20
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 20
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 18
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 18
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 18
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 18
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 18
- JUFFVKRROAPVBI-PVOYSMBESA-N chembl1210015 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N[C@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO[C@]3(O[C@@H](C[C@H](O)[C@H](O)CO)[C@H](NC(C)=O)[C@@H](O)C3)C(O)=O)O2)O)[C@@H](CO)O1)NC(C)=O)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CO)C(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CC=CC=C1 JUFFVKRROAPVBI-PVOYSMBESA-N 0.000 description 17
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 16
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 16
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 16
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 15
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 125000000174 L-prolyl group Chemical group [H]N1C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[C@@]1([H])C(*)=O 0.000 description 14
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 14
- 238000007410 oral glucose tolerance test Methods 0.000 description 14
- 101100135853 Rattus norvegicus Pcsk9 gene Proteins 0.000 description 13
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 13
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 13
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 13
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 12
- 239000000047 product Substances 0.000 description 12
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 108010011459 Exenatide Proteins 0.000 description 11
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 11
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 11
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 10
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 10
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 10
- 238000003998 size exclusion chromatography high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 10
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 9
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 9
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N aspartic acid group Chemical group N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 9
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 9
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 9
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 9
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 9
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 9
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 9
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 9
- 108010019598 Liraglutide Proteins 0.000 description 8
- YSDQQAXHVYUZIW-QCIJIYAXSA-N Liraglutide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCNC(=O)CC[C@H](NC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CC=C(O)C=C1 YSDQQAXHVYUZIW-QCIJIYAXSA-N 0.000 description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- 229960001519 exenatide Drugs 0.000 description 8
- -1 for example Substances 0.000 description 8
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 7
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 7
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 7
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 7
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 7
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 7
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 7
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 7
- 239000013643 reference control Substances 0.000 description 7
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 6
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 6
- 108010001831 LDL receptors Proteins 0.000 description 6
- 102000000853 LDL receptors Human genes 0.000 description 6
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 6
- 206010028813 Nausea Diseases 0.000 description 6
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 description 6
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 6
- 238000013262 cAMP assay Methods 0.000 description 6
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 6
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 6
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 6
- 229940090124 dipeptidyl peptidase 4 (dpp-4) inhibitors for blood glucose lowering Drugs 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 6
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 6
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 6
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 6
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 6
- 229960002701 liraglutide Drugs 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 230000008693 nausea Effects 0.000 description 6
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 description 6
- 239000012146 running buffer Substances 0.000 description 6
- 108091016366 Histone-lysine N-methyltransferase EHMT1 Proteins 0.000 description 5
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 5
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 5
- 238000000423 cell based assay Methods 0.000 description 5
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 5
- 238000002330 electrospray ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 5
- 238000007446 glucose tolerance test Methods 0.000 description 5
- 238000002868 homogeneous time resolved fluorescence Methods 0.000 description 5
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 5
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 5
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229940089838 Glucagon-like peptide 1 receptor agonist Drugs 0.000 description 4
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 4
- 102100029100 Hematopoietic prostaglandin D synthase Human genes 0.000 description 4
- 101001117317 Homo sapiens Programmed cell death 1 ligand 1 Proteins 0.000 description 4
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 4
- 230000007211 cardiovascular event Effects 0.000 description 4
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 230000002526 effect on cardiovascular system Effects 0.000 description 4
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 4
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 239000003877 glucagon like peptide 1 receptor agonist Substances 0.000 description 4
- 102000048776 human CD274 Human genes 0.000 description 4
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N (2,4-dichlorophenyl) benzenesulfonate Chemical compound ClC1=CC(Cl)=CC=C1OS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LUEWUZLMQUOBSB-FSKGGBMCSA-N (2s,3s,4s,5s,6r)-2-[(2r,3s,4r,5r,6s)-6-[(2r,3s,4r,5s,6s)-4,5-dihydroxy-2-(hydroxymethyl)-6-[(2r,4r,5s,6r)-4,5,6-trihydroxy-2-(hydroxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxan-3-yl]oxy-4,5-dihydroxy-2-(hydroxymethyl)oxan-3-yl]oxy-6-(hydroxymethyl)oxane-3,4,5-triol Chemical compound O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@@H](O[C@@H]2[C@H](O[C@@H](OC3[C@H](O[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H]3O)CO)[C@@H](O)[C@H]2O)CO)[C@H](O)[C@H]1O LUEWUZLMQUOBSB-FSKGGBMCSA-N 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000201370 Autographa californica nucleopolyhedrovirus Species 0.000 description 3
- OBMZMSLWNNWEJA-XNCRXQDQSA-N C1=CC=2C(C[C@@H]3NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](NC(=O)N(CC#CCN(CCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](CC4=CC=CC=C4)NC3=O)C(=O)N)CC=C)NC(=O)[C@@H](N)C)CC3=CNC4=C3C=CC=C4)C)=CNC=2C=C1 Chemical compound C1=CC=2C(C[C@@H]3NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](NC(=O)N(CC#CCN(CCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](CC4=CC=CC=C4)NC3=O)C(=O)N)CC=C)NC(=O)[C@@H](N)C)CC3=CNC4=C3C=CC=C4)C)=CNC=2C=C1 OBMZMSLWNNWEJA-XNCRXQDQSA-N 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 description 3
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- HTQBXNHDCUEHJF-XWLPCZSASA-N Exenatide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CO)C(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CC=CC=C1 HTQBXNHDCUEHJF-XWLPCZSASA-N 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920002581 Glucomannan Polymers 0.000 description 3
- 102100035043 Histone-lysine N-methyltransferase EHMT1 Human genes 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 101001098872 Homo sapiens Proprotein convertase subtilisin/kexin type 7 Proteins 0.000 description 3
- 101000946850 Homo sapiens T-lymphocyte activation antigen CD86 Proteins 0.000 description 3
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 3
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 3
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 3
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 3
- 238000008214 LDL Cholesterol Methods 0.000 description 3
- 101710176384 Peptide 1 Proteins 0.000 description 3
- 108010058003 Proglucagon Proteins 0.000 description 3
- 102000035554 Proglucagon Human genes 0.000 description 3
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 3
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 3
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 3
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 3
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 3
- 239000012131 assay buffer Substances 0.000 description 3
- 239000012911 assay medium Substances 0.000 description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 230000003491 cAMP production Effects 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 3
- 230000000081 effect on glucose Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000002866 fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 229940046240 glucomannan Drugs 0.000 description 3
- 230000014101 glucose homeostasis Effects 0.000 description 3
- 230000002641 glycemic effect Effects 0.000 description 3
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 3
- 102000049849 human CD86 Human genes 0.000 description 3
- 102000054226 human PCSK7 Human genes 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 3
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 3
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 3
- 230000003285 pharmacodynamic effect Effects 0.000 description 3
- 210000002706 plastid Anatomy 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 3
- 108010048078 site 1 membrane-bound transcription factor peptidase Proteins 0.000 description 3
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 3
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 3
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 3
- FUOOLUPWFVMBKG-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoisobutyric acid Chemical compound CC(C)(N)C(O)=O FUOOLUPWFVMBKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000004476 Acute Coronary Syndrome Diseases 0.000 description 2
- 208000031648 Body Weight Changes Diseases 0.000 description 2
- 101100168093 Caenorhabditis elegans cogc-2 gene Proteins 0.000 description 2
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 108010024044 Glucagon-Like Peptide-2 Receptor Proteins 0.000 description 2
- 102100032879 Glucagon-like peptide 2 receptor Human genes 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 2
- 102100026120 IgG receptor FcRn large subunit p51 Human genes 0.000 description 2
- 101710177940 IgG receptor FcRn large subunit p51 Proteins 0.000 description 2
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- 125000000510 L-tryptophano group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C2N([H])C([H])=C(C([H])([H])[C@@]([H])(C(O[H])=O)N([H])[*])C2=C1[H] 0.000 description 2
- 239000012480 LAL reagent Substances 0.000 description 2
- 241000282567 Macaca fascicularis Species 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 101100221487 Mus musculus Cog2 gene Proteins 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 102400000319 Oxyntomodulin Human genes 0.000 description 2
- 101800001388 Oxyntomodulin Proteins 0.000 description 2
- 101710182846 Polyhedrin Proteins 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102100040918 Pro-glucagon Human genes 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 2
- 102100028927 Secretin receptor Human genes 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Chemical compound CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 230000003178 anti-diabetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 2
- 230000004579 body weight change Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 239000010432 diamond Substances 0.000 description 2
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 2
- 210000001163 endosome Anatomy 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 2
- 108010036598 gastric inhibitory polypeptide receptor Proteins 0.000 description 2
- 125000004383 glucosinolate group Chemical group 0.000 description 2
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 235000009200 high fat diet Nutrition 0.000 description 2
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 2
- 102000056448 human GLP1R Human genes 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 2
- 210000003712 lysosome Anatomy 0.000 description 2
- 230000001868 lysosomic effect Effects 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PXZWGQLGAKCNKD-DPNMSELWSA-N molport-023-276-326 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)[C@@H](C)O)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 PXZWGQLGAKCNKD-DPNMSELWSA-N 0.000 description 2
- 230000010807 negative regulation of binding Effects 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- NROKBHXJSPEDAR-UHFFFAOYSA-M potassium fluoride Chemical compound [F-].[K+] NROKBHXJSPEDAR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 2
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 102220219560 rs779249550 Human genes 0.000 description 2
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 2
- 108700027603 secretin receptor Proteins 0.000 description 2
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 2
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 2
- 229940007428 victoza Drugs 0.000 description 2
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 1
- DQJCDTNMLBYVAY-ZXXIYAEKSA-N (2S,5R,10R,13R)-16-{[(2R,3S,4R,5R)-3-{[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy}-5-(ethylamino)-6-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy}-5-(4-aminobutyl)-10-carbamoyl-2,13-dimethyl-4,7,12,15-tetraoxo-3,6,11,14-tetraazaheptadecan-1-oic acid Chemical compound NCCCC[C@H](C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@@H](C)NC(=O)C(C)O[C@@H]1[C@@H](NCC)C(O)O[C@H](CO)[C@H]1O[C@H]1[C@H](NC(C)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 DQJCDTNMLBYVAY-ZXXIYAEKSA-N 0.000 description 1
- ICLYJLBTOGPLMC-KVVVOXFISA-N (z)-octadec-9-enoate;tris(2-hydroxyethyl)azanium Chemical compound OCCN(CCO)CCO.CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O ICLYJLBTOGPLMC-KVVVOXFISA-N 0.000 description 1
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CYDQOEWLBCCFJZ-UHFFFAOYSA-N 4-(4-fluorophenyl)oxane-4-carboxylic acid Chemical compound C=1C=C(F)C=CC=1C1(C(=O)O)CCOCC1 CYDQOEWLBCCFJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XZIIFPSPUDAGJM-UHFFFAOYSA-N 6-chloro-2-n,2-n-diethylpyrimidine-2,4-diamine Chemical compound CCN(CC)C1=NC(N)=CC(Cl)=N1 XZIIFPSPUDAGJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102220467418 Acyl-coenzyme A thioesterase MBLAC2_E61Q_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102100029457 Adenine phosphoribosyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 108010024223 Adenine phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 206010002383 Angina Pectoris Diseases 0.000 description 1
- 102220465452 Angiogenin_K64Q_mutation Human genes 0.000 description 1
- 101001084702 Arabidopsis thaliana Histone H2B.10 Proteins 0.000 description 1
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 101150074155 DHFR gene Proteins 0.000 description 1
- 102100025012 Dipeptidyl peptidase 4 Human genes 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 1
- 108091006020 Fc-tagged proteins Proteins 0.000 description 1
- 102220558804 Gamma-aminobutyric acid receptor-associated protein_K24Q_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102100039994 Gastric inhibitory polypeptide Human genes 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 101800004266 Glucagon-like peptide 1(7-37) Proteins 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 102000017011 Glycated Hemoglobin A Human genes 0.000 description 1
- 108010014663 Glycated Hemoglobin A Proteins 0.000 description 1
- 102000002068 Glycopeptides Human genes 0.000 description 1
- 108010015899 Glycopeptides Proteins 0.000 description 1
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 1
- 206010019280 Heart failures Diseases 0.000 description 1
- 241000270431 Heloderma suspectum Species 0.000 description 1
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 1
- 101000908391 Homo sapiens Dipeptidyl peptidase 4 Proteins 0.000 description 1
- 101001070498 Homo sapiens Golgin subfamily A member 6A Proteins 0.000 description 1
- 101000877314 Homo sapiens Histone-lysine N-methyltransferase EHMT1 Proteins 0.000 description 1
- 101000840258 Homo sapiens Immunoglobulin J chain Proteins 0.000 description 1
- 101001051093 Homo sapiens Low-density lipoprotein receptor Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 1
- 208000035150 Hypercholesterolemia Diseases 0.000 description 1
- 208000031226 Hyperlipidaemia Diseases 0.000 description 1
- 108010091358 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 102100029098 Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 108700002232 Immediate-Early Genes Proteins 0.000 description 1
- 102100029571 Immunoglobulin J chain Human genes 0.000 description 1
- 108020005350 Initiator Codon Proteins 0.000 description 1
- 102000036770 Islet Amyloid Polypeptide Human genes 0.000 description 1
- 108010041872 Islet Amyloid Polypeptide Proteins 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N L-Ornithine Chemical compound NCCC[C@H](N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 239000012515 MabSelect SuRe Substances 0.000 description 1
- 102220611213 Magnesium transporter MRS2 homolog, mitochondrial_H52S_mutation Human genes 0.000 description 1
- 244000137850 Marrubium vulgare Species 0.000 description 1
- 101000788683 Mus musculus GATA-type zinc finger protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 102220527886 NADH-cytochrome b5 reductase 2_H50S_mutation Human genes 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N Orn-delta-NH2 Natural products NCCCC(N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N Ornithine Natural products OC(=O)C(C)CCCN UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 1
- 101710094000 Programmed cell death 1 ligand 1 Proteins 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 102220537303 Protein NDRG2_H30K_mutation Human genes 0.000 description 1
- 241000700157 Rattus norvegicus Species 0.000 description 1
- 101500026178 Rattus norvegicus Glucagon-like peptide 1 Proteins 0.000 description 1
- 101100288143 Rattus norvegicus Klkb1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000011542 SDS running buffer Substances 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- 102220497176 Small vasohibin-binding protein_T47D_mutation Human genes 0.000 description 1
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 description 1
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 1
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000009843 Thyroglobulin Human genes 0.000 description 1
- 108010034949 Thyroglobulin Proteins 0.000 description 1
- 208000032109 Transient ischaemic attack Diseases 0.000 description 1
- 108010015780 Viral Core Proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000009824 affinity maturation Effects 0.000 description 1
- 230000001270 agonistic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012867 alanine scanning Methods 0.000 description 1
- 229940126575 aminoglycoside Drugs 0.000 description 1
- 230000000340 anti-metabolite Effects 0.000 description 1
- 239000003472 antidiabetic agent Substances 0.000 description 1
- 229940100197 antimetabolite Drugs 0.000 description 1
- 239000002256 antimetabolite Substances 0.000 description 1
- 239000008365 aqueous carrier Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013357 binding ELISA Methods 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 238000001815 biotherapy Methods 0.000 description 1
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N bis-tris Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 1
- 229940014641 bydureon Drugs 0.000 description 1
- 229940084891 byetta Drugs 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960005069 calcium Drugs 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000010036 cardiovascular benefit Effects 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000005660 chlorination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 1
- 230000004540 complement-dependent cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 208000029078 coronary artery disease Diseases 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000004807 desolvation Methods 0.000 description 1
- 238000013118 diabetic mouse model Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000013229 diet-induced obese mouse Methods 0.000 description 1
- 230000000378 dietary effect Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 239000002359 drug metabolite Substances 0.000 description 1
- 108010005794 dulaglutide Proteins 0.000 description 1
- 229960005175 dulaglutide Drugs 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 230000010502 episomal replication Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 230000037406 food intake Effects 0.000 description 1
- 235000012631 food intake Nutrition 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000012537 formulation buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 230000030136 gastric emptying Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960002989 glutamic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- 229930182470 glycoside Natural products 0.000 description 1
- 150000002338 glycosides Chemical class 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 1
- 102000055817 human GOLGA6A Human genes 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 1
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 229940126904 hypoglycaemic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000003914 insulin secretion Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 229910052747 lanthanoid Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002602 lanthanoids Chemical class 0.000 description 1
- 102000005861 leptin receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010019813 leptin receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000000670 ligand binding assay Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 235000012054 meals Nutrition 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000009988 metabolic benefit Effects 0.000 description 1
- 208000030159 metabolic disease Diseases 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- HPNSFSBZBAHARI-UHFFFAOYSA-N micophenolic acid Natural products OC1=C(CC=C(C)CCC(O)=O)C(OC)=C(C)C2=C1C(=O)OC2 HPNSFSBZBAHARI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- HPNSFSBZBAHARI-RUDMXATFSA-N mycophenolic acid Chemical compound OC1=C(C\C=C(/C)CCC(O)=O)C(OC)=C(C)C2=C1C(=O)OC2 HPNSFSBZBAHARI-RUDMXATFSA-N 0.000 description 1
- 229960000951 mycophenolic acid Drugs 0.000 description 1
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- 206010053219 non-alcoholic steatohepatitis Diseases 0.000 description 1
- 238000013116 obese mouse model Methods 0.000 description 1
- 229960003104 ornithine Drugs 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 238000010979 pH adjustment Methods 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 239000004031 partial agonist Substances 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 239000000813 peptide hormone Substances 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000037081 physical activity Effects 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000004983 pleiotropic effect Effects 0.000 description 1
- 229920001308 poly(aminoacid) Polymers 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229920002643 polyglutamic acid Polymers 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000011698 potassium fluoride Substances 0.000 description 1
- 235000003270 potassium fluoride Nutrition 0.000 description 1
- 230000003334 potential effect Effects 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- GCYXWQUSHADNBF-AAEALURTSA-N preproglucagon 78-108 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC=1N=CNC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CC=CC=C1 GCYXWQUSHADNBF-AAEALURTSA-N 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 1
- 230000009145 protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000007634 remodeling Methods 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000033764 rhythmic process Effects 0.000 description 1
- 102220010430 rs138439950 Human genes 0.000 description 1
- 102200066678 rs1554618767 Human genes 0.000 description 1
- 102220011343 rs267606538 Human genes 0.000 description 1
- 102200081693 rs397514719 Human genes 0.000 description 1
- 102220279936 rs561759202 Human genes 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 239000012898 sample dilution Substances 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000000391 smoking effect Effects 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000001540 sodium lactate Substances 0.000 description 1
- 235000011088 sodium lactate Nutrition 0.000 description 1
- 229940005581 sodium lactate Drugs 0.000 description 1
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- AIDBEARHLBRLMO-UHFFFAOYSA-M sodium;dodecyl sulfate;2-morpholin-4-ylethanesulfonic acid Chemical compound [Na+].OS(=O)(=O)CCN1CCOCC1.CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O AIDBEARHLBRLMO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229940035044 sorbitan monolaurate Drugs 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 1
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 229910021653 sulphate ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229960000814 tetanus toxoid Drugs 0.000 description 1
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 1
- 229960002175 thyroglobulin Drugs 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 201000010875 transient cerebral ischemia Diseases 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 1
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 1
- 229940117013 triethanolamine oleate Drugs 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004704 ultra performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/605—Glucagons
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/22—Hormones
- A61K38/26—Glucagons
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
- A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
- A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
- A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
- A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
- A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/06—Antihyperlipidemics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Obesity (AREA)
- Hematology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Child & Adolescent Psychology (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Farming Of Fish And Shellfish (AREA)
- Professional, Industrial, Or Sporting Protective Garments (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
本申請案提供抗-PCSK9~GLP-1融合物及其使用方法。
Description
抗-PCSK9~GLP-1融合物及其使用方法。
糖尿病與較高心血管發病率及死亡率相關。高血壓、高脂血症及糖尿病獨立地與心血管疾病之增加風險相關。患有2型糖尿病之個體與彼等無糖尿病者相比具有2至4倍增加之心血管疾病之風險。
升糖素樣肽-1(GLP-1)稱作具有代謝及心血管益處之多效性肽。其係衍生自前高血糖素原,即一種在不同組織中經處理以形成多種不同高血糖素原衍生之肽(包括升糖素、升糖素樣肽-1(GLP-1)、升糖素樣肽-2(GLP-2)及胃泌酸調節素(OXM))之158個胺基酸前體多肽,該等高血糖素原衍生之肽參與多種生理功能(包括葡萄糖穩態、胰島素分泌、胃排空及腸生長以及食物攝取之調控)。GLP-1係以對應於高血糖素原之胺基酸72至108(前高血糖素原之92至128)之37-胺基酸肽形成產生。主要生物活性形式係30-胺基酸肽激素(GLP-1(7-37)酸),其係在餐後於腸中產生且由豐富內源蛋白酶-DPP4快速降解。Baggio,L.及Drucker,D.,Gasteroenterology,132:2131-2157(2007)。
GLP-1及GLP-1類似物(於GLP-1受體處用作激動劑)已顯示為(例如)2型糖尿病之有效低血糖控制劑。某些GLP-1類似物在售或處於研發中用於治療2型糖尿病,包括(例如)利拉魯肽(liraglutide)(Victoza®,來自Novo Nordisk)、度拉糖肽(dulaglutide)(Eli Lilly)、拜
杜仁(Bydureon)(AZ/BMS)、阿必魯肽(Aliblutide)(GSK)及艾塞那肽(Exenatide)(Byetta®,來自Eli Lilly/Amylin)。
GLP-1療法起始後之主要副作用之一係胃腸副作用、尤其噁心。此副作用係瞬時的,隨時間消退且可藉由劑量遞增減輕。然而,療法限於可耐受胃腸副作用之患者。
PCSK9係LDL膽固醇降低之非酶靶且PCSK9突變與LDL膽固醇及冠狀動脈心臟病減輕相關。Cohen JC,N Engl J Med,354:1264(2006)。PCSK9抗體已顯示可降低史他汀(statin)治療之患者之LDL膽固醇且多個候選者正經歷臨床評論。
儘管對於糖尿病及心血管疾病存在多種個別治療,但需要單一醫藥組合物以解決兩種疾病狀態(及糖尿病與心血管疾病之間之關係)。假定具有雙重活性之單一醫藥化合物將減少副作用、患者順從性之困難,且將增加對個別患者之有益結果且將降低由健康照護系統招致之花費。
根據說明,揭示用於治療糖尿病之雙重活性融合分子,其包含穩定融合至GLP-1肽之抗-PCSK9抗體,其中抗-PCSK9抗體結合PCSK9多肽且GLP-1肽結合GLP-1受體。
在一個態樣中,其中GLP-1肽經由連接體肽融合至PCSK9抗體。
在又一模式中,連接體肽融合至GLP-1肽之C末端。
在一個實施例中,GLP-1肽包含胺基酸序列SEQ ID NO:36。
在一個實施例中,GLP-1肽包含胺基酸序列SEQ ID NO:3。
在一種模式中,其中GLP-1分子之Cys18與連接體肽或與GLP-1肽自身形成二硫鍵。
在一個態樣中,融合分子在動物中控制葡萄糖及/或降低LDL。動物可為人類。
亦揭示用於治療糖尿病之雙重活性融合分子,其包含穩定融合至包含胺基酸序列SEQ ID NO:3之GLP-1肽的抗-PCSK9抗體,其中GLP-1肽之C末端經由肽連接體融合至抗-PCSK9抗體之輕鏈,且其中抗-PCSK9抗體結合PCSK9多肽且GLP-1肽結合GLP-1受體。
所揭示之另一實施例係治療2型糖尿病之方法,其包含向有需要之個體投與本文所述融合分子。
又一態樣包含向有需要之個體投與本文所述融合分子。
在一種模式中,降低個體之低密度脂蛋白(LDL)之方法包含向有需要之個體投與本文所述融合分子。
另一態樣涵蓋控制個體之葡萄糖及降低LDL之方法,其包含向有需要之個體投與本文所述融合分子。
另一態樣涵蓋促進個體之體重減輕及降低LDL之方法,其包含向有需要之個體投與本文所述融合分子。
在一個實施例中,個體患有2型糖尿病。
在另一實施例中,個體患有代謝症候群。
另一態樣係雙重活性融合分子,其包含穩定融合至包含胺基酸序列SEQ ID NO:3之GLP-1肽的抗體,其中GLP-1肽之C末端經由肽連接體融合至抗體之輕鏈,且其中抗體結合靶多肽且GLP-1肽結合GLP-1受體。
又一態樣係雙重活性融合分子,其包含穩定融合至包含胺基酸序列SEQ ID NO:36之GLP-1肽的抗體,其中GLP-1肽之C末端經由肽連接體融合至抗體之輕鏈,且其中抗體結合靶多肽且GLP-1肽結合GLP-1受體。
在一些態樣中,GLP-1分子包含胺基酸序列SEQ ID NO:36。在一些態樣中,抗體係抗-PCSK9抗體。
在某些模式中,抗-PCSK9抗體之輕鏈與胺基酸序列SEQ ID NO:
2至少90%一致。在其他模式中,抗-PCSK9抗體之輕鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO:2。在又一些模式中,抗-PCSK9抗體之重鏈與胺基酸序列SEQ ID NO:1至少90%一致。在一些態樣中,抗-PCSK9抗體之重鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO:1。
在一些實施例中,肽連接體包含胺基酸序列SEQ ID NO:4。在雙重活性融合分子之一些實施例中,GLP-1分子之Cys18與GLP-1肽之C末端形成二硫鍵。
在一些實施例中,雙重活性融合分子用於治療糖尿病。在一些實施例中,雙重活性融合分子控制動物之葡萄糖及/或降低LDL。
在一些模式中,動物係人類。
一些實施例包括用於治療糖尿病之雙重活性融合分子,其包含抗-PCSK9抗體,該抗-PCSK9抗體穩定融合至與包含胺基酸序列SEQ ID NO:29之GLP-1肽相比於人類GLP-1受體處具有降低效能之GLP-1肽,其中GLP-1肽之C末端經由肽連接體融合至抗-PCSK9抗體,且其中抗-PCSK9抗體結合PCSK9多肽且GLP-1肽結合GLP-1受體。在一些實施例中,包含胺基酸序列SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:29之GLP-1肽使用包含SEQ ID NO:4之連接體融合至包含SEQ ID NO:416之胺基酸序列。在其他實施例中,如技術方案25或26之雙重活性融合分子,其中人類GLP-1受體處之效能與包含胺基酸序列SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:29之GLP-1肽相比降低至1/30至1/60。
一些實施例包括編碼本文所述融合分子之經分離多核苷酸。
在某些模式中,涵蓋包含本文所述多核苷酸之載體。在其他模式中,宿主細胞包含本文所述多核苷酸或載體。
在一些實施例中,製造融合分子之方法包含在允許融合分子表現之條件下培養宿主細胞及回收融合分子。
在一些模式中,醫藥組合物包含本文所述融合分子及載劑。在
一些模式中,套組包含本文所述組合物。
其他目標及優點將在下文說明中部分地加以闡述,且根據本說明將部分地顯而易見,或可藉由實踐而知曉。藉助隨附申請專利範圍中特定指出之要素及組合將實現及達成目標及優點。
應理解,前述一般說明及以下詳細說明兩者皆僅為例示性及解釋性且並不限制申請專利範圍。
併入本說明書中並構成本說明書之一部分的附圖圖解說明一個(若干)實施例,並與說明一起用於解釋本文所述之原理。
序列之說明
圖1A係如本文所述雙重作用融合分子之示意圖。圖1B-D顯示抗體-肽融合分子之某些實施例之各個示意圖。
圖1E顯示使用數字編號之PC9編號2可變重鏈與種系序列1-46(DP-7)之比對。差異係以黑框白字顯示。
圖1F顯示使用數字編號之PC9編號2可變重鏈與種系序列VK1 O18 O8(DPK1)之比對。差異係以黑框白字顯示。
圖2A-G顯示結合至抗-PCSK9 mAb之人類PCSK9在重鏈N末端處由抗-PCSK9抗體/GLP-1肽融合物之抑制。
圖3A-G顯示結合至抗-PCSK9 mAb之人類PCSK9在輕鏈N末端處由抗-PCSK9抗體/GLP-1肽融合物之抑制。
圖4A-B顯示在抗體重鏈(A)及輕鏈(B)處人類GLP1-受體由抗-PCSK9抗體/GLP-1肽N末端融合物之活化。
圖5A圖解說明與對照抗體NIP228重鏈融合之GLP-1類似物在大鼠中之穩定性。
圖5B顯示與抗-PCSK9抗體PC9編號2輕鏈融合之艾塞那肽-4(Exendin-4)GLP-1類似物在大鼠中之穩定性。
圖5C顯示與人類IgG4 Fc片段融合之GLP-1類似物在小鼠中之穩
定性。
圖5D顯示與抗-PCSK9抗體PC9編號2輕鏈融合之GLP-1類似物在小鼠中之穩定性。
圖6顯示用以指導PCSK9親和力及GLP-1效能之潛在靶概況。
圖7A提供8種具有納入N-糖基化共有基序之化合物之肽及連接體胺基酸序列。
圖7B提供3種納入二硫鍵之化合物之肽胺基酸序列。
圖8顯示PC9編號2_GLP1分子及抗PC9編號2抗體及用作基準對照之GLP-1Fc(G4)之視覺表現形式。
圖9顯示與對照抗體NIP228重鏈融合之GLP-1類似物NIP228_GLP1_VH在大鼠中之穩定性。
圖10顯示與抗-PCSK9抗體PC9編號2輕鏈融合之GLP-1類似物PC9編號2_GLP-1_VL在小鼠中之穩定性。
圖11顯示與抗-PCSK9抗體PC9編號2輕鏈融合之PC9編號2_DSB編號3(即艾塞那肽-4類似物DSB編號3)在小鼠中之穩定性。
圖12顯示與抗-PCSK9抗體PC9編號2輕鏈融合之PC9編號2_NGS編號7(即GLP-1類似物NGS編號7)在小鼠中之穩定性。
圖13A圖解說明與抗-PCSK9抗體PC9編號2輕鏈融合之GLP-1類似物NGS編號7在小鼠中之穩定性。
圖13B顯示與抗-PCSK9抗體PC9編號2輕鏈融合之艾塞那肽-4類似物DSB編號1在小鼠中之穩定性。
圖13C圖解說明與抗-PCSK9抗體PC9編號2輕鏈融合之艾塞那肽-4類似物DSB編號3在小鼠中之穩定性。
圖14A顯示基準化合物GLP-1-Fc融合物在小鼠中之穩定性。空心正方形:測試分子隨時間在血清中之濃度;空心菱形:相同樣品之「活性」測試分子隨時間之濃度(如藉由GLP-1活性所量測)。
圖14B顯示與抗-PCSK9抗體PC9編號2輕鏈融合之艾塞那肽-4類似物DSB編號1在小鼠中之穩定性。空心正方形:測試分子隨時間在血清中之濃度;空心菱形:相同樣品之「活性」測試分子隨時間之濃度(如藉由GLP-1活性所量測)。
圖15A提供在初始蛋白質A純化後,與抗-PCSK9抗體PC9編號2輕鏈融合之艾塞那肽-4類似物DSB編號1之製備型SEC層析圖。
圖15B提供在初始蛋白質A純化後,與抗-PCSK9抗體PC9編號2輕鏈融合之艾塞那肽-4類似物DSB編號3之製備型SEC層析圖。
圖16顯示在初始蛋白質A純化後,與抗-PCSK9抗體PC9編號2輕鏈融合之艾塞那肽-4類似物DSB編號1之分析型SEC-HPLC概況。
圖17顯示納入半胱胺酸橋之其他艾塞那肽-4變體肽的胺基酸序列。半胱胺酸殘基以黑色顯示,其他突變殘基顯示為加下劃線且C末端帽處之其他甘胺酸殘基以灰色顯示。
圖18提供在初始蛋白質A純化後,與抗-PCSK9抗體PC9編號2輕鏈融合之艾塞那肽-4類似物DSB編號7之製備型SEC層析圖。
圖19提供在初始蛋白質A純化後,與抗-PCSK9抗體PC9編號2輕鏈融合之艾塞那肽-4類似物DSB編號9之製備型SEC層析圖。
圖20顯示與抗-PCSK9抗體PC9編號2輕鏈融合之艾塞那肽-4類似物DSB編號7在大鼠中之穩定性。
圖21圖解說明與抗-PCSK9抗體PC9編號2輕鏈融合之艾塞那肽-4類似物DSB編號9在大鼠中之穩定性。
圖22A顯示在人類中PCSK9/GLP-1融合物對PCSK9阻抑之影響之模擬。
圖22B圖解說明在人類中PCSK9/GLP-1融合分子與度拉糖肽相比之GLP-1激動活性之模擬。
圖23顯示PC9_2_DSB編號7之改良單體概況。
圖24圖解說明在單一靜脈內注射後大鼠中肽/抗體分子之藥物動力學概況。
圖25使用競爭ELISA顯示對人類PCSK9結合至LDL受體之抑制。
圖26顯示HepG2細胞中LDL攝取之人類PCSK9依賴性損失之抑制。
圖27顯示人類GLP-1受體處經改造之效能降低。
圖28A顯示與抗-PCSK9抗體HS9輕鏈融合之艾塞那肽-4 GLP-1類似物DSB7_V19A的人類GLP1r cAMP分析。
圖28B圖解說明與抗-PCSK9抗體HS9輕鏈融合之艾塞那肽-4 GLP-1類似物DSB7_V19A在大鼠中穩定性。
圖29A-D顯示藉由cAMP分析測定之融合分子HS9_DSB7_V19對GLP-1受體之特異性。
圖30A-B顯示隨時間(包括投藥後第7天)之優異葡萄糖控制(A)及體重減輕(B)。
圖31顯示使用不同連接體與GLP-1類似物肽DSB7_V19A融合之HS9抗-PCSK9抗體與人類PCSK9的結合。
圖32顯示使用GLP-1類似物肽DSB7_V19A的人類GLP-1受體活化,該GLP-1類似物肽DSB7_V19A使用不同連接體與抗-PCSK9抗體HS9融合。
圖33圖解說明與GLP-1類似物肽DSB7_V19A融合之抗-PCSK9抗體與人類PCSK9之結合
圖34圖解說明使用與抗-PCSK9抗體融合之GLP-1類似物肽DSB7_V19A之人類GLP-1受體活化
圖35顯示與GLP-1類似物肽DSB7_V19A融合之抗B7-H1抗體2.7A4與人類B7-H1之結合
圖36顯示使用與抗B7-H1抗體2.7A4融合之GLP-1類似物肽DSB7_V19A的人類GLP-1受體活化。
圖37闡述在以60mg/kg、30mg/kg或10mg/kg單一靜脈內注射後融合分子HS9_DSB7_V19A在大鼠中之穩定性。
圖38顯示在以60mg/kg、30mg/kg或10mg/kg單一靜脈內注射HS9_DSB7_V19A後大鼠中之游離PCSK9濃度。
圖39顯示在以60mg/kg單一皮下注射HS9_DSB7_V19A後大鼠中總化合物、GLP-1受體處之活性化合物及游離PCSK9的濃度。
圖40A-C提供口服葡萄糖耐受測試之結果(第0天(A)、第2天(B)、第7天(C)),確認單一皮下投與HS9_DSB7_V19A之能力。
圖41顯示在圖40A-C之口服葡萄糖耐受測試中體重隨時間之變化。
圖42A-C圖解說明口服葡萄糖耐受測試之結果(第0天(A)、第2天(B)、第7天(C))。
圖43提供在圖42A-C之口服葡萄糖耐受測試中體重隨時間之變化。
圖44顯示腹膜內葡萄糖耐受測試中之體重變化。
圖45顯示,在腹膜內葡萄糖耐受測試中與媒劑對照相比,每週HS9_DSB7_V19A展現4小時空腹血糖之劑量依賴性降低。
圖46顯示,每週投藥之HS9_DSB7_V19A展現葡萄糖耐受之劑量依賴性改良,如在研究第22天藉由IPGTT所評價。
圖47A-B顯示飲食誘導之肥胖症小鼠模型中之血糖含量。
圖48A-B顯示飲食誘導之肥胖症小鼠模型中之體重(克)(A)及體重變化%(B)。
圖49顯示在利用HS9_DSB7_V19A之多劑量研究中體重隨時間之變化。
圖50A-B顯示在每週投藥設定下HS9_DSB7_V19A中之GLP-1組份對血糖控制之效應,其中量測進食葡萄糖(A)及終末空腹葡萄糖(B)。
本發明係關於抗體(例如,抗-PCSK9抗體或其抗原結合片段)與GLP-1部分之融合物。
在一個實施例中,融合物構築為:GLP-1部分-連接體-抗體輕鏈
或GLP-1部分-連接體-抗體重鏈。
融合蛋白可構築為遺傳融合物。或者,融合蛋白可經由(例如)半胱胺酸:半胱胺酸二硫鍵構築為化學結合物。
GLP-1部分及抗體部分之其他佈置亦在本文之範疇內。
抗體部分可為抗-PCSK9抗體或其抗原結合片段。在一個實施例中,抗-PCSK9部分提供LDLc(壞膽固醇)降低效應。
在一個實施例中,抗-PCSK9 VL部分可為SEQ ID NO:2(PC9_2_HS9)。在另一實施例中,抗-PCSK9 VL部分可為SEQ ID NO:2之抗原結合部分。在一個實施例中,抗-PCSK9 VL部分可包含SEQ ID NO:2之所有6個CDR。在一個實施例中,抗-PCSK9 VH部分可為抗體之pH依賴性型式,如SEQ ID NO:5中所示。
在一個實施例中,抗體或其抗原結合片段可為pH依賴性,使得結合至抗原之抗體為pH依賴性。此可用於改變抗體及/或抗原之半衰期。在一個實施例中,改變抗體半衰期意指延長半衰期。在一個實施例中,改變抗體半衰期意指縮短半衰期。在一個實施例中,可改變(延長或縮短)抗體半衰期以使其融合配偶體(即GLP-1)之穩定性最大。改變抗原半衰期亦可意指抗原-抗體複合物可改變抗原之半衰期,例
如經由抗體介導之降解(縮短半衰期)或藉由保護抗原免於典型降解過程(延長半衰期)。在一種情況下,抗體於pH 7.4與胞內體pH(即pH 5.5-6.0)相比對抗原可具有較高親和力,使得在pH 5/5/pH 7.4或pH 6.0/pH 7.2之KD比率係2或更大。改造pH依賴性抗體之方法闡述於US 2011/0229489及2014/0044730中,其以引用方式併入本文中。
在一個實施例中,抗-PCSK9部分提供游離PCSK9之持續阻抑。在一個實施例中,提供至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%阻抑。
在一個實施例中,能夠特異性結合PCSK9之抗-PCSK9抗體或其抗原結合片段包含:a.重鏈可變區,其包含與SEQ ID NO:1、5、8或10至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之序列;及b.輕鏈可變區,其包含與SEQ ID NO:2、6、9或11至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之序列。
在一個實施例中,能夠特異性結合PCSK9之抗-PCSK9抗體或其抗原結合片段包含:
a.重鏈可變區CDR1序列,其包含與SEQ ID NO:14相比具有一個突變之序列;
b.重鏈可變區CDR2序列,其包含與SEQ ID NO:15、16、17或18相比具有一個或兩個突變之序列;
c.重鏈可變區CDR3序列,其包含與SEQ ID NO:19相比具有一個突變之序列。
d.輕鏈可變區CDR1序列,其包含與SEQ ID NO:20、21、22或23相比具有一個或兩個突變之序列;
e.輕鏈可變區CDR2序列,其包含與SEQ ID NO:24或25相比具有一個突變之序列;及
f.輕鏈可變區CDR3序列,其包含與SEQ ID NO:26相比具有一個突變之序列。
在一個實施例中,能夠特異性結合PCSK9之抗-PCSK9抗體或其抗原結合片段包含:
a.包含SEQ ID NO:14之重鏈可變區CDR1序列;
b.包含SEQ ID NO:15、16、17或18之重鏈可變區CDR2序列;
c.包含SEQ ID NO:19之重鏈可變區CDR3序列。
d.包含SEQ ID NO:20、21、22或23之輕鏈可變區CDR1序列;
e.包含SEQ ID NO:24或25之輕鏈可變區CDR2序列;及
f.包含SEQ ID NO:26之輕鏈可變區CDR3序列。
在另一實施例中,抗-PCSK9部分可包含抗-PCSK9抗體或抗原結合片段,如以下任一者中所述:US 8,030,457、US 8,062,640、US 8,357,371、US 8,168,762、US 8,563,698、US 8,829,165、US 8,859,741、US 8,188,233、WO 2012/088313、US 2012/0195910、US 8,530,414、US 2013/0189278、US 8,344,144、US 2011/0033465、US 8,188,234、US 8,080,243、US 2011/0229489、US 2010/0233177、US 2013/315927及US 2013/0071405。該等參考文獻中之每一者關於抗-PCSK9抗體及其抗原結合片段之序列及說明皆以引用方式併入。
在一個實施例中,抗-PCSK9部分可包含選自上表1之B組中之序列的重鏈及輕鏈可變區。或者,抗-PCSK9部分可包含具有與上表1之B組之重鏈及輕鏈可變區一致之CDR的重鏈及輕鏈可變區。另外,抗-PCSK9部分可包含選自SEQ ID NO:53、55、57、59、61或63之重鏈可變區及選自SEQ ID NO:54、56、58、60、62或64之輕鏈可變區。或者,抗-PCSK9部分可包含來自SEQ ID NO:53、55、57、59、61或
63中之任一者之重鏈CDR1、CDR2及CDR3及來自SEQ ID NO:54、56、58、60、62或64中之任一者之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3。
在一個實施例中,抗-PCSK9部分可包含選自上表1之C組中之序列之重鏈及輕鏈可變區。或者,抗-PCSK9部分可包含具有與上表1之C組之重鏈及輕鏈可變區一致之CDR的重鏈及輕鏈可變區。另外,抗-PCSK9部分可包含選自SEQ ID NO:65-95之重鏈可變區及選自SEQ ID NO:96-126之輕鏈可變區。或者,抗-PCSK9部分可包含來自SEQ ID NO:65-95中之任一者之重鏈CDR1、CDR2及CDR3及來自SEQ ID NO:96-126中之任一者之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3。
在一個實施例中,抗-PCSK9部分可包含選自上表1之D組中之序列的重鏈及輕鏈可變區。或者,抗-PCSK9部分可包含具有與上表1之D組之重鏈及輕鏈可變區一致之CDR的重鏈及輕鏈可變區。另外,抗-PCSK9部分可包含選自SEQ ID NO:127-218之重鏈可變區及選自SEQ ID NO:219-311之輕鏈可變區。或者,抗-PCSK9部分可包含來自SEQ ID NO:127-218中之任一者之重鏈CDR1、CDR2及CDR3及來自SEQ ID NO:219-311中之任一者之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3。
在一個實施例中,抗-PCSK9部分可包含選自上表1之E組中之序列的重鏈及輕鏈可變區。或者,抗-PCSK9部分可包含具有與上表1之E組之重鏈及輕鏈可變區一致之CDR的重鏈及輕鏈可變區。另外,抗-PCSK9部分可包含選自SEQ ID NO:312-317之重鏈可變區及選自SEQ ID NO:318-323之輕鏈可變區。或者,抗-PCSK9部分可包含來自SEQ ID NO:312-317中之任一者之重鏈CDR1、CDR2及CDR3及來自SEQ ID NO:318-323中之任一者之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3。
在一個實施例中,抗-PCSK9部分可包含選自上表1之F組中之序列的重鏈及輕鏈可變區。或者,抗-PCSK9部分可包含具有與上表1之F組之重鏈及輕鏈可變區一致之CDR的重鏈及輕鏈可變區。另外,抗-
PCSK9部分可包含選自SEQ ID NO:324之重鏈可變區及選自SEQ ID NO:325之輕鏈可變區。或者,抗-PCSK9部分可包含來自SEQ ID NO:324中之任一者之重鏈CDR1、CDR2及CDR3及來自SEQ ID NO:325中之任一者之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3。
在一個實施例中,抗-PCSK9部分可包含選自上表1之G組中之序列的重鏈及輕鏈可變區。或者,抗-PCSK9部分可包含具有與上表1之G組之重鏈及輕鏈可變區一致之CDR的重鏈及輕鏈可變區。另外,抗-PCSK9部分可包含選自SEQ ID NO:326、339、340或343-400之重鏈可變區及選自SEQ ID NO:327、341或342之輕鏈可變區。或者,抗-PCSK9部分可包含來自SEQ ID NO:326、339、340或343-400中之任一者之重鏈CDR1、CDR2及CDR3及來自SEQ ID NO:327、341或342中之任一者之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3。此外,抗-PCSK9部分可包含來自SEQ ID NO:328(HC CDR1)、329(HC CDR2)、331(HC CDR2)、330(HC CDR3)、332(HC CDR3)之重鏈CDR1、CDR2及CDR3及來自SEQ ID NO:333(LC CDR1)、334(LC CDR2)、335(LC CDR3)、336(LC CDR1)、337(LC CDR2)及338(LC CDR3)之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3。在一個實施例中,抗-PCSK9部分可包含包含胺基酸序列SEQ ID NO:491之重鏈可變區及包含胺基酸序列SEQ ID NO:492之輕鏈可變區。或者,抗-PCSK9部分可包含來自SEQ ID NO:493-495之重鏈CDR1、CDR2及CDR3及來自SEQ ID NO:496-498之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3。
在其他實施例中,抗體部分可包含除抗-PCSK9抗體(例如,抗B7-H1抗體)外之抗體。在一個實施例中,抗-B7-H1抗體包含含有胺基酸序列SEQ ID NO:422之重鏈可變區及包含胺基酸序列SEQ ID NO:423之輕鏈可變區。
如本文所用術語抗體或其抗原結合片段係以最廣泛含義使用。其可為藉由習用雜交瘤技術、重組技術產生之人造(例如)單株抗體(mAb)及/或其功能片段。其可包括完整免疫球蛋白分子,例如多株抗體、單株抗體(mAb)、單特異性抗體、雙特異性抗體、多特異性抗體、人類抗體、人類化抗體、動物抗體(例如駱駝科動物抗體)、嵌合抗體以及其部分、片段、區、肽及衍生物(藉由任何已知技術提供,例如但不限於酶裂解、肽合成或重組技術),例如不含輕鏈、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、scFv、抗體片段、雙價抗體、Fd、CDR區或能夠結合抗原或表位之抗體之任何部分或肽序列的免疫球蛋白。在一個實施例中,功能部分係單鏈抗體、單鏈可變片段(scFv)、Fab片段或F(ab')2片段。
若抗體或功能部分能夠與分子特異性反應以藉此使分子結合至抗體,據稱抗體或功能部分「能夠結合」分子。抗體片段或部分可無完整抗體之Fc部分,較完整抗體更快速地自循環清除,且可具有更少的非特異性組織結合。抗體之實例可使用業內熟知方法自完整抗體產生,例如藉由用諸如木瓜蛋白酶(產生Fab片段)或胃蛋白酶(產生F(ab')2片段)等酶進行蛋白分解裂解。抗體之部分可藉由上述方法中之任一者製得,或可藉由使重組分子之一部分表現製得。舉例而言,可將重組抗體之CDR區分離並亞選殖至適當表現載體中。
在一個實施例中,抗體或功能部分係人類抗體。使用人類抗體進行人類療法可減少人類個體中針對非人類序列之免疫反應所致副作用之概率。在另一實施例中,抗體或功能部分經人類化。在另一實施例中,抗體或功能部分係嵌合抗體。可藉此將所關注序列、例如所關注結合位點包括至抗體或功能部分中。
在一個實施例中,抗體可具有IgG、IgA、IgM或IgE同型。在一個實施例中,抗體係IgG。在一個態樣中,抗-PCSK9抗體或其抗原結
合片段可為IgG1。
在一個實施例中,抗-PCSK9抗體或抗原結合片段包含Fc區。將理解,如本文所用之Fc區包括包含抗體恆定區但不包括第一恆定區免疫球蛋白結構域之多肽。因此,Fc係指IgA、IgD及IgG之最後兩個恆定區免疫球蛋白結構域,及IgE及IgM之最後三個恆定區免疫球蛋白結構域,及該等結構域之撓性鉸鏈N末端。對於IgA及IgM,Fc可包括J鏈。對於IgG,Fc包含免疫球蛋白結構域Cγ2及Cγ3(Cγ2及Cγ3)以及Cγ1(Cγ1)與Cγ2(Cγ2)之間之鉸鏈。儘管Fc區之邊界可變,但人類IgG重鏈Fc區通常經界定以在其羧基末端包含殘基C226或P230,其中根據如Kabat等人(1991,NIH Publication 91-3242,National Technical Information Service,Springfield,VA)中之EU索引來編號。「如Kabat中所述之EU索引」係指如Kabat等人在上文文獻中所述之人類IgG1 EU抗體之殘基編號。Fc可係指呈分離形式之此區域,或在抗體、抗體片段或Fc融合蛋白情況中之此區域。
在一個實施例中,抗-PCSK9抗體或其抗原結合部分具有效應物功能降低(例如,ADCC及/或CDC降低)之變體Fc區。在一個實施例中,Fc區不具有可檢測之效應物功能。在一個實施例中,Fc區在一或多個選自234、235及331之位置包含至少一個非天然胺基酸,如依照如Kabat中所述之EU索引所編號。在特定實施例中,本發明提供Fc變體,其中Fc區包含至少一個選自234F、235F、235Y及331S之非天然胺基酸,如依照如Kabat中所述之EU索引所編號。在另一特定實施例中,本發明Fc變體包含234F、235F及331S胺基酸殘基,如依照如Kabat中所述之EU索引所編號。在另一特定實施例中,本發明Fc變體包含234F、235Y及331S胺基酸殘基,如依照如Kabat中所述之EU索引所編號。在具體實施例中,抗-PCSK9抗體或其抗原結合部分具有變
體Fc區,其中變體包含位置234之苯丙胺酸(F)殘基、苯丙胺酸(F)殘基或位置235之麩胺酸(E)殘基及位置331之絲胺酸(S)殘基,如依照如Kabat中所述之EU索引所編號。該等突變組合在下文中稱作三重突變體(TM)。
如依照如Kabat中所述之EU索引所編碼之絲胺酸228脯胺酸突變(S228P)在下文中稱作P突變,已報導其可提高具體IgG4分子之穩定性(Lu等人,J Pharmaceutical Sciences 97(2):960-969,2008)。注意:在Lu等人中,其係作為位置241提及,此乃因其中其使用Kabat編號系統,而非如Kabat中所述之「EU索引」。
此P突變可與L235E組合以進一步敲除ADCC。此突變組合在下文中稱作雙重突變(DM)。
融合分子含有GLP-1部分。GLP-1亦可藉由同義詞升糖素樣肽-1來提及。藉由GLP-1亦提及GLP-1類似物艾塞那肽-4。在一個實施例中,GLP-1部分提供葡萄糖控制及/或體重減輕益處。
在一個實施例中,全長GLP-1分子可用於融合蛋白中。在另一實施例中,GLP-1之片段可用作融合蛋白中之GLP-1部分。
在一個實施例中,GLP-1部分具有一對容許形成二硫鍵之半胱胺酸殘基。在一個實施例中,半胱胺酸係與親體序列相比之經改造半胱胺酸。在一個實施例中,半胱胺酸係E18C突變。
在一個實施例中,與野生型GLP-1(例如,SEQ ID NO:29)或GLP-1類似物(例如,SEQ ID NO:12)相比,在人類GLP-1受體處之GLP-1效能降低。在另一實施例中,在人類GLP-1受體處之GLP-1效能係野生型GLP-1或GLP-1類似物之至多約10分之一、20分之一、30分之一、40分之一、50分之一、60分之一、100分之一、125分之一、150分之一、175分之一、200分之一或225分之一。在另一實施例中,
如與度拉糖肽相比,效能降低類似量。可降低GLP-1效能以容許在減少副作用的同時使PCSK9飽和。在一個實施例中,GLP-1部分可具有至少一個降低GLP-1部分之效能之突變。在一個實施例中,此提供減少副作用(包括但不限於噁心)之益處。在一個實施例中,突變係點突變。在一個實施例中,點突變選自關於艾塞那肽-4之V19A、G2V、E15A或L26I。
在一個實施例中,GLP-1部分包含SEQ ID NO:3、7、12、13或28-42中之任一者。在另一實施例中,GLP-1部分係SEQ ID NO:3、7、12、13或28-42中之任一者之包含至少10、15、20或25個胺基酸之片段。在另一實施例中,GLP-1部分包含與SEQ ID NO:3、7、12、13或28-42中之任一者至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之序列。在另一實施例中,GLP-1部分包含與SEQ ID NO:3、7、12、13或28-42中之任一者相比具有1、2、3、4、5或6個突變之序列。
在一個實施例中,GLP-1部分直接或間接融合至抗-PCSK9抗體之輕鏈或抗原結合片段。在另一實施例中,GLP-1部分直接或間接融合至抗-PCSK9抗體之重鏈或抗原結合片段。
在一個實施例中,連接體可用於構築抗-PCSK9抗體或抗原結合片段與GLP-1部分之間之融合物。在另一實施例中,抗-PCSK9抗體或抗原結合片段可直接偶聯至GLP-1部分。
若使用連接體,則該連接體可選自用於融合蛋白之任何適宜連接體。在一個實施例中,連接體可包含作為一組、兩組、三組或四組重複序列之單獨或與其他胺基酸組合之GGGGS(SEQ ID NO:27)重複序列。在一個實施例中,連接體可包含單獨或與其他胺基酸組合之G與S之其他組合。在一些實施例中,連接體具有C-末端丙胺酸(A)。
在一個實施例中,特定連接體可選自GGGGSGGGGSGGGGSA(SEQ ID NO:4)。在一個實施例中,連接體容許在GLP-1部分之C末端與GLP-1分子之另一部分之間形成二硫鍵,但不與抗體部分形成二硫鍵。在此一情形中,撓性有限之連接體可防止與抗體部分之不期望二硫橋接。
在一個實施例中,連接體與SEQ ID NO:4至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致。
在一個實施例中,藉由在GLP-1部分中進行半胱胺酸取代突變來形成半胱胺酸:半胱胺酸二硫鍵。在一實施例中,突變係E18C。
本發明實施例進一步提供編碼上文章節I中所述融合分子中之任一者之分離、合成或重組之核酸序列。該等核酸編碼本文所述之重鏈及輕鏈序列。或者,該等核酸包括融合至GLP-1部分之抗-PCSK9抗體或抗原結合部分。由於核酸代碼之簡併性,多個核酸將編碼相同胺基酸且皆涵蓋於本文中。
一個實施例包括藉由在其中表現核酸以產生融合分子之條件下培養宿主細胞,之後回收融合分子來產生融合分子之方法。可使用多種細胞系來表現融合分子,包括(但不限於)哺乳動物細胞系。在一個實施例中,細胞系可為人類細胞系。在另一實施例中,可使用細菌或昆蟲細胞系。在一個實施例中,細胞系包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、CHO細胞之變體(例如DG44)、293細胞及NS0細胞。在另一實施例中,細胞系包括VERY、BHK、Hela、COS、MDCK、293F、293T、3T3、W138、BT483、Hs578T、Sp2/0、HTB2、BT2O、T47D、CRL7O3O及HsS78Bst細胞。
重組表現利用含有編碼融合分子之多核苷酸之表現載體的構
築。一旦已獲得多核苷酸,則可藉由業內熟知之重組DNA技術產生用於產生融合分子之載體。表現載體可包括適當轉錄及翻譯控制信號。此可使用活體外重組DNA技術、合成技術及活體內遺傳重組來完成。在一個實施例中,可複製載體包含可操作連接至異源啟動子之編碼抗體或功能部分之核酸序列。
可利用多種宿主表現載體系統來表現融合分子,如在美國專利第5,807,715號中所述。舉例而言,結合載體(例如來自人類巨細胞病毒之主要立即早期基因啟動子元件)之哺乳動物細胞(例如中國倉鼠卵巢細胞(CHO))係抗體之有效表現系統(Foecking等人,Gene,45:101(1986);及Cockett等人,Bio/Technology,8:2(1990))。另外,可選擇調節插入序列之表現,或以期望特定方式修飾並處理基因產物之宿主細胞株。蛋白質產物之該等修飾(例如糖基化)及處理(例如裂解)可對蛋白質之功能非常重要。不同宿主細胞對於蛋白質及基因產物之翻譯後處理及修飾具有特徵性特定機制。可選擇適當細胞系或宿主系統以確保本發明蛋白質之正確修飾及處理。為此,可使用具有用於初級轉錄物之適宜處理、基因產物之糖基化及磷酸化之細胞機構之真核宿主細胞。
在細菌系統中,可端視所表現融合分子之既定用途選擇多種表現載體。例如,在欲產生大量該融合分子時,對於包含該融合分子之醫藥組合物之生成,可期望引導表現大量易純化融合蛋白質產物之載體。該等載體包括(但不限於)大腸桿菌表現載體pUR278(Ruther等人,EMBO,12:1791(1983)),其中編碼序列可個別連接至載體之具有lac Z編碼區之框中,使得產生融合蛋白;pIN載體(Inouye & Inouye,1985,Nucleic Acids Res.13:3101-3109(1985);Van Heeke及Schuster,1989,J.Biol.Chem.,24:5503-5509(1989));及諸如此類。亦可使用pGEX載體將外來多肽表現為與麩胱甘肽-S-轉移酶(GST)之融合蛋
白。一般而言,該等融合蛋白可溶且易於藉由以下方式自溶解細胞純化:吸附並結合至麩胱甘肽-瓊脂糖親和基質,之後在游離麩胱甘肽存在下溶析。pGEX載體設計為將凝血酶及/或因子Xa蛋白酶裂解位點引入所表現多肽中,使得可自GST部分釋放所選殖靶基因產物。
在昆蟲系統中,使用加州苜蓿夜蛾(Autographa californica)核型多角體病毒(AcNPV)作為載體來表現外來基因。病毒在草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)細胞中生長。可將抗體編碼序列個別選殖至病毒之非必需區域(例如,多角體蛋白基因)中並置於AcNPV啟動子(例如多角體蛋白啟動子)控制下。
在哺乳動物宿主細胞中,可利用多種基於病毒之表現系統。在使用腺病毒作為表現載體之情形中,可將所關注編碼序列連接至腺病毒轉錄/翻譯控制複合物(例如,晚期啟動子及三聯前導序列)。然後可藉由活體外或活體內重組將此嵌合基因插入腺病毒基因體中。插入病毒基因體之非必需區域(例如,區域E1或E3)中將產生在經感染宿主中有活力且能表現抗體或功能部分之重組病毒(例如,參見Logan及Shenk,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:355-359(1984))。亦可能需要特定起始信號以有效翻譯所插入抗體或功能部分之編碼序列。該等信號包括ATG起始密碼子及毗鄰序列。此外,起始密碼子一般應在具有期望編碼序列之讀碼框之框中以確保完整插入物之翻譯。該等外源性翻譯控制信號及起始密碼子可具有多種來源(天然及合成兩種來源)。可藉由納入適當轉錄增強子元件、轉錄終止子等來增強表現效率(例如,參見Bittner等人,Methods in Enzymol.,153:51-544(1987))。
可使用穩定表現進行重組蛋白質之長期高產率產生。舉例而言,可生成穩定表現融合分子之細胞系。宿主細胞可經適當改造之包含表達控制元件(例如,啟動子、增強子、轉錄終止子、多聚腺苷酸化位點等)及可選標記物基因之載體來轉變。在引入外來DNA後,可
容許細胞在滋養培養基中生長1-2天,隨後轉換至選擇性培養基中。重組質體中之可選擇標記可賦予選擇抗性且容許將質體穩定整合至其染色體中之細胞生長並形成聚集灶,其繼而可經選殖並擴增成細胞系。可使用編碼融合分子之質體將基因/cDNA引入適於在培養中產生之任一細胞系中。
可使用多種選擇系統,包括(但不限於),單純皰疹病毒胸苷激酶(Wigler等人,Cell,11:223(1977))、次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶(Szybalska及Szybalski,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,48:202(1992))及腺嘌呤磷酸核糖基轉移酶(Lowy等人,Cell,22:8-17(1980))基因可分別用於tk-、hgprt-或aprT-細胞中。同樣,可使用抗代謝物抗性作為以下基因之選擇基礎:dhfr,其賦予對胺甲喋呤之抗性(Wigler等人,Natl.Acad.Sci.USA,77:357(1980);O'Hare等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,78:1527(1981));gpt,其賦予對黴酚酸之抗性(Mulligan及Berg,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,78:2072(1981));neo,其賦予對胺基糖苷G-418之抗性(Wu及Wu,Biotherapy 3:87-95(1991);Tolstoshev,Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32:573-596(1993);Mulligan,Science 260:926-932(1993);以及Morgan及Anderson,Ann.Rev.Biochem.62:191-217(1993);May,TIB TECH 11(5):155-2 15(1993));及hygro,其賦予對潮黴素之抗性(Santerre等人,Gene,30:147(1984))。可以常規方式應用業內公知之重組DNA技術方法以選擇期望重組純系,且該等方法闡述於(例如)以下文獻中:Ausubel等人(編輯),Current- Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,NY(1993);Kriegler,Gene Transfer and Expression,A Laboratory Manual,Stockton Press,NY(1990);及第12章及第13章,Dracopoli等人(編輯),Current Protocols in Human Genetics,John Wiley & Sons,NY(1994);Colberre-Garapin等人,1981,J.Mol.Biol.,150:1。
一旦藉由重組表現產生融合分子,即可藉由業內已知之任一純化方法來純化該融合分子,例如層析(例如,離子交換層析、親和層析(尤其針對特定抗原蛋白A或蛋白G之親和層析)及粒度分級管柱層析)、離心、差別溶解度或用於純化蛋白質之任何其他標準技術。
另外提供含有有效量之如本文所提供之雙重活性融合分子之組合物(例如,醫藥組合物),其經調配用於治療代謝疾病(例如,2型糖尿病)。
本發明組合物可根據已知方法來調配。適宜製備方法闡述於(例如)Remington's Pharmaceutical Sciences,第19版,A.R.Gennaro編輯,Mack Publishing Co.,Easton,PA(1995)中,其係全文以引用方式併入本文中。組合物可呈多種形式,包括(但不限於)水溶液、乳液、凝膠、懸浮液、凍乾形式或業內已知之任何其他形式。另外,組合物可含有醫藥上可接受之添加劑,包括(例如)稀釋劑、黏合劑、穩定劑及防腐劑。一旦經調配,可將本發明組合物直接投與個體。
可用於本發明組合物之載劑為業內所熟知,且包括(但不限於,例如)甲狀腺球蛋白、白蛋白(例如人類血清白蛋白)、破傷風類毒素及聚胺基酸(例如聚L-離胺酸、聚L-麩胺酸)、流行性感冒、B型肝炎病毒核心蛋白及諸如此類。可使用多種水性載劑,例如水、緩衝水、0.8%鹽水、0.3%甘胺酸、玻尿酸及諸如此類。組合物可藉由習用熟知滅菌技術來滅菌,或可經無菌過濾。可包裝所得組合物以供按原樣使用,或可將其凍乾,將凍乾製劑在投與前與無菌溶液合併。組合物可視需要含有醫藥上可接受之輔助物質以接近生理條件,例如pH調節及緩衝劑、張力調節劑、潤濕劑及諸如此類,例如乙酸鈉、乳酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、去水山梨醇單月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯等。
可使用抗-PCSK9~GLP-1融合物來治療糖尿病或T2型糖尿病。在一個實施例中,患者患有T2型糖尿病。在一個實施例中,患者具有高心血管風險概況。在另一實施例中,患者具有T2型糖尿病及高心血管風險概況二者。高心血管風險概況意指,患者由於以下一或多種因素而具有較高心血管事件風險:高膽固醇、高LDL膽固醇、低HDL膽固醇、高血壓、動脈粥樣硬化、肥胖症、先前心血管事件(包括心絞痛、心臟病發作、暫時性腦缺血發作、中風等)、心血管事件家族史、吸煙、高甘油三酯、缺少身體活動、血糖控制較差及諸如此類。
在其他實施例中,可使用抗-PCSK9~GLP-1融合物來治療其他疾病,包括(但不限於)NASH、肥胖症、高膽固醇血症及主要不良心血管事件(MACE)(包括(但不限於)急性冠狀動脈症候群(ACS)、中風、心臟衰竭及惡性節律異常)。
在一個實施例中,融合分子具有在投與後提高之穩定性。在一個實施例中,提高之穩定性係藉由在活體內投與小鼠中將其與基準對照化合物度拉糖肽(與Fc片段融合之GLP-1類似物)比較來顯示。
在一個實施例中,融合分子在GLP-1受體具有增加之效能。在一個實施例中,相對於基準對照化合物度拉糖肽及/或野生型GLP-1,在人類GLP-1受體顯示減小之效能。
在一些實施例中,融合分子促進個體之體重減輕。
在一個實施例中,融合分子係藉由注射來投與。
在其他實施例中,本發明提供包含雙重活性融合分子之套組,其可用於實施本文所述之方法。在某些態樣中,套組在一或多個容器中包含本文所揭示之雙重活性融合分子。如本文所提供之套組可含有其他組合物用於組合療法。熟習此項技術者將容易地認識到,所揭示之雙重活性融合分子可易於納入業內所熟知之已建立套組形式之一者中。
現在將詳細參照本發明之實例性實施例,其實例圖解說明於附圖中。在任何可能之處,將在全部圖式中使用相同參照符號來指代相同或相似部件。熟習此項技術者考量本文所揭示之說明書及實踐將易知其他實施例。在以下實例中進一步解釋實施例。該等實例不限制申請專利範圍之範疇,但僅用於闡明某些事實例。說明書及實例意欲僅視為實例性,且真實範疇及精神係藉由以下申請專利範圍來指示。
抗-PCSK9抗體PC9編號2(可變重鏈及輕鏈分別為SEQ ID NO.8及9)已經最佳化以:
1_ 藉由將胺基酸回復為對應於最接近人類種系序列者且不顯著影響與PCSK9抗原之結合來降低免疫原性風險。
2_ 藉由使組胺酸殘基VH_52、VL_30及VL_50(Kabat編號)突變來移除與PCSK9之pH依賴性結合。
3_ 改良在生理pH下對人類PCSK9之親和力以在投與PCSK9/GLP-1肽抗體融合分子後有效與靶銜接並達成充分游離PCSK9阻抑。
抗-PCSK9抗體PC9編號2之VH及VL結構域之胺基酸序列與VBASE資料庫中之已知人類種系序列進行比對(Tomlinson,1997;http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/),並藉由序列相似性鑑別可變重鏈及輕鏈之最接近人類種系分別係1-46(DP-7)(SEQ ID 417)及VK1 O18 O8(DPK1)(SEQ ID 418)。圖1E及1F顯示PC9編號2可變結構域與彼等種系序列之比對。
已使用PC9編號2可變結構域之主要胺基酸序列及先前闡述之與使用PBD ID代碼3SQO保存於蛋白質資料庫中之另一抗-PCSK9抗體複
合之人類PCSK9之晶體結構來生成與人類PCSK9抗原複合之抗-PCSK9 PC9編號2抗體之結構模型(Liang等人,2012,J.Pharm.Exp.Ther.,第340卷,第228-236頁)。
使用該結構模型,將以下殘基鑑別為不與PCSK9抗原接觸但仍暴露於溶劑中:可變重鏈中之Arg56、Asn58、Glu61、Lys64及Ser65以及可變輕鏈中之Arg24(Kabat編號)。由於彼等殘基不同於最接近種系序列且可暴露於溶劑中,故其可呈現一些免疫原性風險。不受限於理論,使彼等殘基突變應不會顯著影響抗體牢固結合PCSK9之能力,此乃因彼等殘基應不影響抗體與其抗原之間之相互作用網絡。
然後使用標準分子生物學技術在PC9編號2重鏈序列中引入突變R56S、N58S、E61Q、K64Q及S65G以及在輕鏈中引入K24Q,以生成分別針對可變重鏈及輕鏈之SEQ ID 5及6之抗體PC9編號2_FG。
抗-PCSK9 PC9編號2及PC9編號2_FG係如實例2中所述作為人類IgG1-TM抗體來產生,且如實例17中所述使用Biacore針對與人類PCSK9之結合來表徵。彼等化合物在pH 7.4下之動力學參數概述於表2中。兩種抗體展現類似的對人類PCSK9之結合速率、解離速率及親和力,顯示種系化誘變對抗原結合無影響。
抗-PCSK9抗體PC9編號2及PC9編號2_FG展現pH依賴性結合性質,此乃因其在生理pH下牢固結合至人類PCSK9抗原但在酸性pH下與其靶快速解離。該特徵應使得抗體能在胞內體之酸性區室中與
PCSK9解離,以在細胞表面再循環而非傳送至溶酶體以供降解。此應最終轉化為較長抗體活體內半衰期。
表3比較藉由如實例17中所述但具有以下修改之Biacore測定之該兩種化合物與人類PCSK9在pH7.4(生理)及6.0(酸性)下之解離速率(kd)。在將抗體捕獲至CM5晶片後,經10分鐘注射在運行緩衝液pH7.4(10mM磷酸鈉pH 7.4,150mM氯化鈉,1mg/mL BSA,0.05% Tween20)中稀釋至介於1nM至200nM範圍之濃度之人類PCSK9抗原。在結合期後,在10分鐘解離期中注射pH7.4或pH6.0之運行緩衝液。整體解離速率係使用1:1結合動力學模型來計算。
對於PCSK9/GLP-1融合分子不期望長抗體活體內半衰期,此乃因其可導致能結合PCSK9但在GLP-1類似物肽中降解之藥物代謝物累積,且因此無法活化GLP-1受體。
另外,與PC9編號2抗體(7nM)相比,GLP-1類似物肽在抗-PCSK9 PC9編號2之輕鏈前方之遺傳融合物稍微影響該化合物對人類PCSK9之親和力(19nM),如在實例5、表11中所顯示。則需要PC9編號2_FG之親和力成熟以抗衡GLP-1類似物輕鏈融合物對與人類PCSK9抗原之親和力之負面影響。
為移除pH依賴性結合,需要使重鏈位置52以及輕鏈位置30及50之組胺酸殘基突變。基於與人類PCSK9複合之PC9編號2之上述結構模型及後續分析,將以下突變鑑別為可能有益於抗體與PCSK9之結合
且可能改良親和力:重鏈H52K或H52S、輕鏈H30Y、H30K或H30S以及輕鏈H50Y或H50S。
PC9編號2_FG序列中所有彼等突變之組合皆係使用標準分子生物學技術來生成以產生最佳化抗體。表4概述自組合實驗獲得之不同化合物。
PC9編號2_FG輕鏈中H30S與H50Y突變之組合未能遞送且隨後未生成化合物編號5及編號11。
如實例2中所述作為人類IgG1-TM來產生抗體且如實例3中所述使用表位競爭分析來測試其阻斷PC9編號2與人類PCSK9之結合之能力。資料概述於表5中且顯示,HS7、HS9及HS10之IC50係與親體抗體PC9編號2_FG相比之至多10分之一,表明彼等抗體可對PCSK9具有較PC9編號2_FG顯著更佳之親和力。
抗體HS9已經進一步表徵且如實例17中所述藉由Biacore針對其與人類PCSK9在生理pH下之結合參數與親體抗體PC9編號2_FG進行比較。如表6中所顯示,經改造抗-PCSK9抗體HS9展示與PC9編號2_FG相比,在生理pH下對人類PCSK9之親和力之3倍改良,此主要係由於解離速率(kd)減小所致。
在單獨實驗中,已使用如上文所述之Biacore將HS9抗-PCSK9抗體之pH依賴性結合與PC9編號2_FG進行比較。表7顯示該兩種化合物在生理及酸性pH下之解離常數(kd)。與在pH6.0下較在pH7.4下更快解
離之PC9編號2_FG相反,HS9展示在酸性pH下較在生理pH下更低之kd,顯示其與PCSK9之解離在pH6.0下較在pH7.4下更慢。
雙重作用融合分子係根據如圖1A中所示大比例結構來製造:GLP-1部分-連接體-抗體輕鏈。使用SEQ ID NO:3作為GLP-1部分,使用SEQ ID NO:4作為連接體,且分別使用SEQ ID NO:1及2作為重鏈及輕鏈。
在此實施例中,GLP-1類似物肽之N末端游離以最有效地銜接並活化GLP-1受體;將肽融合至抗體可變結構域之N末端。在多種構築體中在肽末端與可變結構域起點之間使用連接體序列以使融合物對肽及/或抗體活性之影響降至最低。將肽融合於抗體之重鏈或輕鏈處以在每個融合分子中獲得兩個肽部分。該等融合物之大比例結構顯示於圖1B(重鏈融合物)及1C(輕鏈融合物)中。在一些實施例中,可將肽融合於重鏈及輕鏈二者處以展示每個融合分子之4個肽部分(預言性地顯示於圖1D中)。
編碼與抗體可變結構域融合之GLP-1類似物肽之基因係藉由重疊PCR使用標準方法來構建。在DNA片段之5’及3’末端處納入獨特限制位點以使得能在表現載體中選殖。
將具有或不具有肽/連接體融合物之VH結構域選殖至含有人類重鏈恆定結構域及調節元件之載體中,以在哺乳動物細胞中表現完整IgG1三重突變體(IgG1-TM)重鏈。IgG1-TM形式類似於人類IgG1,但
Fc序列納入突變L234F、L235E及P331S以降低其觸發抗體依賴性細胞介導之細胞毒性及補體依賴性細胞毒性之能力(Oganesyan V.等人,2008,Acta Cryst.,D64:700-704)。將具有或不具有肽/連接體融合物之VL結構域選殖至用於表現人類輕鏈恆定結構域及調節元件之載體中,以在哺乳動物細胞中表現完整IgG輕鏈。將OriP片段包括於重鏈及輕鏈表現載體中以促進與CHO細胞一起使用且容許游離型複製。
為獲得IgG及肽抗體融合物,將重鏈及輕鏈表現載體瞬時轉染至30mL(小規模)或400mL(中等規模)CHO哺乳動物細胞中。表8概述可藉由共轉染具有或不具有肽/連接體融合物之重鏈及輕鏈表現載體獲得之不同產物。
表現化合物並分泌至培養基中。彙集收穫物並過濾,之後使用蛋白A層析純化化合物。在適宜大小之MabSelectSure(GE Healthcare Life Sciences)管柱上加載培養上清液並用1×DPBS(Gibco)洗滌。使用0.1M檸檬酸鈉pH 3.0自管柱溶析結合化合物並藉由添加Tris-HCl pH 9.0來中和。對於小規模轉染,使用PD10管柱(GE Healthcare)將所溶析材料緩衝液交換至1×DPBS中。對於中等規模轉染,藉由粒徑篩析層析(SEC)使用HiLoad 16/600 Superdex 200製備級管柱(GE
Healthcare)(對於最多5ml之樣品體積)或HiLoad 26/600 Superdex 200管柱(GE Healthcare)(對於最多12ml之樣品體積)進一步純化所溶析材料。使用1×DPBS作為運行緩衝液實施等度溶析。
化合物濃度係使用消光係數基於胺基酸序列根據Mach,H.等人,Statistical determination of the average values of the extinction coefficients of tryptophan and tyrosine in native proteins,Anal Biochem,200(1):74-80(1992)中之方案以分光光度方式來測定。使用SEC-HPLC及SDS-PAGE分析純化化合物之聚集及降解。SEC-HPLC係藉由將70μL樣品加載至TSKgel G3000SWXL 7.8mm×300mm管柱(Tosoh Bioscience)上,使用1mL/min流速及0.1M無水磷酸氫二鈉加0.1M硫酸鈉(pH 6.8)作為運行緩衝液來實施。SDS-PAGE係藉由將2μg蛋白質加載於Nu PAGE® 4%-12% Bis-Tris(Invitrogen)上,使用1×Nu PAGE® MES SDS運行緩衝液(Invitrogen)來運行。藉由電噴霧離子化質譜(ESI-MS)進一步表徵來自中等規模轉染之化合物之完整性,並使用鱟變形細胞溶解物(LAL)Kinetic-QCL(Lonza)來測試其內毒素含量。對於ESI-MS分析,樣品係以1mg/mL在10mM Tris-HCl pH 8.0中製備。在分析前在37℃下使用10mM DTT還原30分鐘。資料係使用與Waters SYNAPT G1 QTOF質譜儀連接之Waters ACQUITY UPLC® I-Class系統使用MassLynx軟體操作來獲得。所用移動相係高純化水加0.01%三氟乙酸(TFA)、0.1%甲酸(A)及乙腈+0.01% TFA、0.1% FA(B)。重鏈與輕鏈之間之分離係使用2.1mm×50mm Waters BEH300 C4管柱在60℃下加熱來達成。將流速設定於0.3mL/min,總運行時間為22分鐘。將樣品(10pmol)注射至管柱上並以正離子模式使用以下電噴霧源參數獲得MS資料:毛細管電壓:3.4kV,源溫度:81℃,去溶劑化溫度:24℃。資料係在500與4500Da之間獲得。
為評估藉由GLP-1受體激動劑肽與抗-PCSK9抗體之間之遺傳融合生成雙重活性分子之可行性,使用SEQ ID NO:4之連接體將SEQ ID NO:28之GLP-1類似物肽融合至7種不同的先前鑑別之抗-PCSK9抗體之重鏈或輕鏈可變結構域。
1_ PC9編號1,具有SEQ ID NO:10之抗體可變重鏈及SEQ ID NO:11之抗體可變輕鏈。
2_ PC9編號2,具有SEQ ID NO:8之抗體可變重鏈及SEQ ID NO:9之抗體可變輕鏈。
3_ PC9編號3,具有SEQ ID NO:404之抗體可變重鏈及SEQ ID NO:405之抗體可變輕鏈。
4_ PC9編號4,具有SEQ ID NO:406之抗體可變重鏈及SEQ ID NO:407之抗體可變輕鏈。
5_ PC9編號5,具有SEQ ID NO:408之抗體可變重鏈及SEQ ID NO:409之抗體可變輕鏈。
6_ PC9編號6,具有SEQ ID NO:410之抗體可變重鏈及SEQ ID NO:411之抗體可變輕鏈。
7_ PC9編號7,具有SEQ ID NO:412之抗體可變重鏈及SEQ ID NO:413之抗體可變輕鏈。
使用均相時間解析螢光(HTRF)表位競爭分析評價每一肽-抗體融合物之PCSK9活性。在該等分析中,在鏈黴抗生物素蛋白穴狀化合物、生物素化PCSK9與螢光(DyLight 650)標記之抗-PCSK9抗體之間形成螢光共振能量轉移(FRET)複合物。結合與螢光標記之抗體相同或重疊之PCSK9表位之未標記肽-抗體融合物將競爭而導致FRET信號減少。
抗-PCSK9抗體之標記係使用DyLight-650(Thermo Scientific 84536)根據製造商說明書來實施。對於分析,所有樣品及試劑皆係在
含有1×磷酸鹽緩衝鹽水、0.1% BSA(Sigma A9576)及0.4M氟化鉀之分析緩衝液中製備。肽-抗體融合物或對照抗體之測試樣品係在384孔聚丙烯板中藉由3倍連續稀釋來製備。將樣品(5μl)或分析緩衝液(總結合對照孔)轉移至384孔分析板(Costar 3676)中並與1nM鏈黴抗生物素蛋白穴狀化合物(Cisbio 61SAXLB)、0.05-0.5nM生物素化PCSK9及0.1-2nM Dy650標記之抗PCSK9抗體一起以20μl總分析體積在室溫下培育4小時。設置省略生物素化PCSK9之非特異性結合(NSB)對照孔。在320nm下激發後使用Perkin Elmer Envision在665nm及620nm下量測時間解析螢光發射。計算665nm計數/620nm計數之比率並乘以10000以獲得HTRF計數。然後使用以下方程計算δ F%。
結果根據以下方程表示為特異性結合%:
圖2A-G及圖3A-G分別顯示使用未標記之重鏈或輕鏈肽抗體融合物之滴定對人類PCSK9與抗-PCSK9抗體之結合之抑制。使用單獨(對照編號1)的或使用SEQ ID NO:4之連接體與重鏈(對照編號2)或輕鏈(對照編號3)及SEQ ID NO:28之GLP-1類似物肽融合之同型匹配無關抗體NIP228 IgG1-TM作為陰性對照。
使用cAMP產生分析評價每一肽抗體融合物在人類GLP-1受體處之效能。藉由標準方法在CHO細胞中生成表現人類GLP-1受體之穩定細胞系。所測試化合物之GLP-1受體活化將導致下游產生可在功能活性分析中加以量測之cAMP第二傳訊者。使用低蛋白質結合384孔板(Greiner)實施11次測試化合物之1:4連續稀釋,該等稀釋液係在分析培養基(0.1%牛血清白蛋白,於Hanks平衡鹽溶液(GIBCO或Sigma)中,含有0.5mM IBMX(Sigma))中製造。所有樣品稀釋液係以一式兩份製
造。將表現人類GLP-1受體之細胞之冷凍低溫小瓶在水浴中快速解凍,將其轉移至預升溫之分析培養基中並在240×g下旋轉5分鐘。然後使細胞以1×105個細胞/mL之最優化濃度再懸浮於分析緩衝液中,並以5μL/孔分配至黑色淺孔u形底384孔板(Corning)中。將5μL測試化合物自稀釋板轉移至細胞板並在室溫下培育30分鐘。根據製造商之推薦使用cAMP動態2 HTRF套組(Cisbio)遵循二步驟方案來量測cAMP含量。簡言之,抗cAMP穴狀化合物(供體螢光團)及cAMP-d2(受體螢光團)係藉由將每一1/20稀釋於套組中提供之偶聯或溶解緩衝液中來製造。將5μL抗cAMP穴狀化合物添加至分析板之所有孔中並將5μL cAMP-d2添加至所有孔中,但非特異性結合孔除外,僅向其添加偶聯及溶解緩衝液。將板在室溫下培育1小時,然後在Envision(Perkin Elmer)上使用320nm之激發波長以及620nm及665nm之發射波長來讀取。如製造商指南中所述將資料轉變為δ F%,並藉由資料、曲線中點之無約束4參數對數擬合來分析以測定EC50。
重鏈(A)或輕鏈(B)肽抗體融合物對人類GLP-1受體之活化分別顯示於圖4A-B中。分別使用游離人類GLP-1肽(Bachem)及無肽之無關同型匹配NIP228人類IgG1-TM作為陽性及陰性對照。
總而言之,所測試所有融合物皆能與抗-PCSK9抗體競爭結合至人類PCSK9以及活化人類GLP-1受體。GLP-1類似物肽與不同抗-PCSK9抗體之間之彼等融合分子展示雙重活性且可用於提供組合藥理學。
在不使用靶介導之清除時,人類IgG在人類中具有約21天之長循環半衰期。此主要係由於FcRn受體挽救內化抗體所致。在細胞非特異性攝取後,抗體可在胞內體之酸性環境中結合至FcRn並被引導至細胞表面且回到循環中,而非被引導至溶酶體以供降解。
為達成最大效能,與抗-PCSK9抗體分子融合之GLP-1類似物肽應展示足夠長的用於分別由肽及抗體部分介導之GLP-1受體之活化及PCSK9阻抑二者之活體內活性半衰期。例如,若肽在注射後迅速失活,則大部分產物將僅具有PCSK9阻抑功能,且將不會隨時間與GLP-1受體適當銜接以在投藥期間提供有效葡萄糖控制。
為評價現有GLP-1類似物肽呈抗體融合物時之活體內穩定性,生成以下融合物:
1:使用SEQ ID NO:4之連接體將SEQ ID NO:28之GLP-1類似物肽融合至SEQ ID NO:414及415之無關NIP228人類IgG1-TM抗體之重鏈(化合物NIP228_GLP-1_VH)。
2:使用SEQ ID NO:4之連接體將SEQ ID NO:12之艾塞那肽-4肽(源自吉拉毒蜥(Gila monster)唾液之GLP-1類似物)融合至SEQ ID NO 9之抗-PCSK9抗體PC9編號2之輕鏈(化合物PC9編號2_Exe4_VL)。
3:使用SEQ ID NO:4之連接體將SEQ ID NO:28之GLP-1類似物肽融合至SEQ ID NO:416之人類IgG4 Fc片段(化合物GLP-1-Fc)。
4:使用SEQ ID NO:4之連接體將SEQ ID NO:28之GLP-1類似物肽融合至SEQ ID NO 9之抗-PCSK9抗體PC9編號2之輕鏈(化合物PC9編號2_GLP-1_VL)。
在活體外,所有化合物在人類GLP-1受體皆有活性,且在實例3中所述之cAMP分析中展示,NIP228_GLP-1_VH、PC9編號2_Exe4_VL、GLP-1-Fc及PC9編號2_GLP-1_VL之EC50分別為2.08E-10M、1.12E-10M、1.12E-10M及1.03E-10M。
將化合物NIP228_GLP-1_VH及PC9編號2_Exe4_VL靜脈內注射至大鼠並在注射後之若干個時間點收集血清或血漿樣品。測定每一樣品之血清或血漿中之化合物濃度(暴露)及針對GLP-1活性之活性化合物濃度。總化合物(暴露)與GLP-1受體處之活性化合物隨時間衰減之間
之比較提供呈抗體融合物之GLP-1類似物肽之活體內穩定性之評價。
大鼠血漿或血清中總人類IgG1抗體之含量係藉由一般夾心酶聯免疫吸附分析(ELISA)方法使用Gyrolab平臺(Gyros AB)定量。人類IgG1係藉由100μg/mL之生物素化單株抗人類IgG1抗體(用於血漿樣品之純系JDC-10,Southern Biotech;或用於血清樣品之內部(in-house)純系TM446)捕獲並在Gyrolab Bioaffy 200 CD上藉由25nM(用於血漿樣品之BD Pharmingen純系G18-145)或10nM(用於血清樣品之結合位點AU003CUS01)之Alexa標記之單株抗人類IgG1抗體檢測。根據Gyrolab方法將標準品、對照、血漿或血清樣品、洗滌溶液、捕獲及檢測抗體添加至0.2mL 96孔PCR板(Thermo Scientific)中並加載至具有CD200板之機器上。所有樣品係以一式兩份分析。繪製各人類IgG標準品之平均反應對濃度之圖,並使用5參數加權對數模型使用Gyrolab評估器軟體擬合各點。
使用基於離體cAMP細胞之分析來估計大鼠樣品中人類GLP-1受體處之活性肽-抗體融合物之濃度。將參照化合物以已知濃度摻入初始大鼠(naïve rat)血清或血漿中以用作標準品。所有樣品皆在分析培養基中連續稀釋,且對於血清樣品,使用如實例3中所述之cAMP動態2 HTRF套組(Cisbio)檢查,或對於血漿樣品,使用LANCE® Ultra cAMP檢測套組(Perkin Elmer)檢查。
測試樣品係使用與相等參照相同之最高濃度作圖。然後可使用所獲得之EC50值來計算樣品比率(樣品EC50/參照化合物EC50),然後計算活性GLP-1化合物之估計濃度(摻入大鼠血漿或血清中之參照化合物之已知最高濃度/樣品比率)。單獨大鼠血清或血漿對穴狀化合物供體信號具有淬滅效應,且使可能稀釋之cAMP產生濃度依賴性活化。因此,所測試任一化合物必須具有高於大鼠血清或血漿基線(稱為檢測極限)之cAMP活性,以在活性分析中具有可觀察效應。
在3隻Wistar大鼠(Charles River)中以2mg/kg注射化合物NIP228_GLP-1_VH,並在注射後2分鐘、1h、24h、48h、120h、168h及216h在含有dPP4抑制劑之EDTA管中收集每隻動物之血樣。總化合物及活性GLP-1化合物在大鼠血漿中隨時間之濃度顯示於圖5A及9中。無法測定在48h後所收集樣品中之活性化合物之濃度,此乃因其低於分析之量化下限。
在3隻CD大鼠(Charles River)中以1mg/kg注射化合物PC9編號2_Exe4_VL,並在注射後30分鐘、6h、24h、48h、96h、240h及336h在含有dPP4抑制劑之普通管中收集血樣。血清樣品係藉由使管在實驗臺上靜置30分鐘,之後以13000rpm離心2分鐘來製備。在大鼠血清中隨時間之暴露及活性GLP-1化合物之濃度顯示於圖5B中。無法精確測定在48h後收集之樣品中之活性化合物之濃度,此乃因其低於分析之量化下限。
NIP228_GLP-1_VH及PC9編號2_Exe4_VL在大鼠中針對暴露及在GLP-1受體處之活性化合物二者之活體內半衰期呈現於表9中。
對於NIP228_GLP-1_VH及PC9編號2_Exe4_VL化合物二者,在GLP-1受體處之活性之損失顯著快於化合物本身,顯示活體內肽不穩定性。
將化合物GLP-1-Fc及PC9編號2_GLP-1_VL靜脈內注射至健康
C57/B6小鼠(7-8週齡,雌性,Charles River)並在若干個時間點收集血漿樣品。如上所述測定每一樣品在血漿中之化合物濃度(暴露)及針對GLP-1活性之活性化合物濃度。
GLP-1-Fc係以1mg/kg注射。在以下時間點中之每一點殺死3隻小鼠之組:注射前、注射後2分鐘、1h、6h、24h、48h、72h及96h。在含有dPP4抑制劑之EDTA管中收集每一動物之血液。然後將血漿樣品在4℃下以14000rpm離心5min並在分析期間儲存於-80℃下。
PC9編號2_GLP-1_VL係以5mg/kg注射且在以下時間點中之每一點殺死小鼠:注射前、注射後5分鐘、6.5h、24h、72h及168h。如上所述處理樣品。
分別地,GLP-1-Fc在小鼠血漿中隨時間之暴露及活性GLP-1化合物之濃度顯示於圖5C及14A中,且PC9編號2_GLP-1_VL顯示於圖5D及10中。
GLP-1-Fc及PC9編號2_GLP-1_VL在小鼠中針對暴露及活性GLP-1二者之活體內半衰期呈現於表10中。
如針對NIP228_GLP-1_VH及PC9編號2_Exe4_VL在大鼠中所觀察,在小鼠中注射後,GLP-1-Fc及PC9編號2_GLP-1_VL二者在GLP-1受體處之活性之損失快於化合物本身,顯示活體內肽不穩定性。
SEQ ID NO:28及SEQ ID NO:12之GLP-1類似物二者之快速失活
將影響PCsK9/GLP-1融合分子之有效葡萄糖控制,且具有更佳活體內穩定性之GLP-1類似物肽需要經改造。
使用PCSK9抗體作為基準對照。資料呈現於表11中,且PC9編號2_GLP1分子及用作基準對照之抗PC9編號2抗體之視覺表現形式顯示於圖8中。用於指導PCSK9親和力及GLP-1效能之潛在靶概況之可視化提供於圖6中。
在25℃下藉由表面電漿共振(SPR)使用Biacore 2000生物感測器(GE Healthcare)來測定PCSK9結合之結合(ka或kon)、解離(kd或koff)及平衡解離常數(KD)。
首先在CM5感測器晶片(GE Healthcare)上產生蛋白G表面。然後在晶片表面上捕獲人類抗體,之後注射不同濃度之人類、食蟹猴或大鼠PCSK9。首先計算整體解離速率,然後計算整體結合速率,二者皆使用1:1結合動力學模型。
此顯示,融合物僅微弱影響PCSK9結合。
另外,在如實例17中所述之Biacore分析中測試雙重作用融合分子HS9_DSB7以測定其對人類PCSK9之親和力。使用單獨之PCSK9抗體(重鏈及輕鏈分別係SEQ ID 1及2之PC9_2_FG_HS編號9)作為基準對照。表12提供資料。此資料顯示,在物種(人類(Hu)、食蟹猴(Cy)及大鼠)之間,融合物僅微弱影響PCSK9結合。
如實例3中所述在基於cAMP細胞之分析中測試PC9編號2_GLP-1以測定其效能。使用單獨之GLP1肽作為對照且使用GLP-1Fc作為基準。資料呈現於表13中且PC9編號2_GLP1分子及用作基準對照之GLP-1 Fc之視覺表現形式顯示於圖8中。
此資料顯示,在GLP-1類似物肽融合至抗-PCSK9抗體PC9編號2之輕鏈後,GLP-1效能與基準分子GLP-1-Fc相比無顯著損失。
圖14A提供GLP-1-Fc基準在大鼠中之穩定性。基準分子係GLP-1部分與抗體Fc部分之融合物,如圖14A中所顯示。
將化合物GLP-1-Fc靜脈內注射至健康C57/B6小鼠(7-8週齡,雌性,Charles River)中並在若干個時間點收集血漿樣品。如實例4中所述測定每一樣品在血漿中之化合物濃度(暴露)及針對GLP-1活性之活性化合物濃度。
GLP-1-Fc係以1mg/kg注射。在以下時間點中之每一點殺死3隻小鼠之組:注射前、注射後2分鐘、1h、6h、24h、48h、72h及96h。在含有dPP4抑制劑之EDTA管中收集每一動物之血液。然後將血漿樣品在4℃下以14000rpm離心5min並在分析期間儲存於-80℃下。
GLP-1活性之損失速率快於該化合物,顯示肽不穩定性。具有正方形之線條對應於GLP-1-Fc之血清濃度且具有圓形之線對應於相同樣品之GLP-1-Fc活性。參見圖14A。
為改良抗體融合分子之活體內肽穩定性,改造肽周圍之立體阻礙以防止其降解。此係藉由引入巨大糖基序或藉由改造分子間二硫鍵來達成。
已顯示,添加N-糖基化共有基序可增加活體內穩定性及蛋白質作用之持續時間(Elliott S.等人,Nat.Biotech.,2003,21,414-421)。在肽之C末端處或在肽與抗體之間之連接體中納入額外N-糖基化基序(NxS或NxT,其中x可為除脯胺酸外之任一胺基酸)之GLP-1類似物肽已在與抗-PCSK9抗體PC9編號2之輕鏈(抗體輕鏈,SEQ ID NO:9)之融合物中經改造。彼等化合物中八者(N-糖基化位點命名為NGS)之肽及連接體胺基酸序列顯示於圖7A中。用於生成糖基化基序之胺基酸變化係以加下劃線粗體顯示。
在該八種化合物中,僅PC9_2_GLP-1_NGS編號7藉由SDS-PAGE顯示高糖基化產率。此係藉由輕鏈分子量與無糖基化共有序列之對照化合物相比之增加來檢測,且無對應於非糖基化輕鏈產物之可見較低分子量帶。PC9_2_GLP-1_NGS編號7之糖基化係藉由ESI質譜進一步確認。
亦已顯示,引入分子間二硫化鍵可係改良呈游離肽之GLP-1類似物之活體內穩定性之成功方式(Li Y.等人,Peptides,2011,21,1303-1312)。
將納入兩個半胱胺酸殘基以形成二硫鍵以及(若適宜)引入甘胺酸C末端帽以促進結合之艾塞那肽-4肽變體融合至抗-PCSK9抗體PC9編號2之輕鏈(SEQ ID NO:9)。首先生成之三種化合物(二硫鍵命名為DSB)之肽胺基酸序列顯示於圖7B中(如SEQ ID NO:30-32)。半胱胺酸殘基以黑色顯示,其他突變殘基顯示為加下劃線且在C末端帽處之額外甘胺酸殘基以灰色顯示。
對於DSB編號1變體,在位置9改造第一半胱胺酸代替天冬胺酸且使用具有以下序列之納入第二半胱胺酸之C末端帽:GGGGGGGGGGGCGG(SEQ ID NO:401)。
對於DSB編號2變體,在位置4改造第一半胱胺酸代替甘胺酸且使用具有以下序列之納入第二半胱胺酸之C末端帽:GGGGGGGGGGGGCG(SEQ ID NO:402)。
對於DSB編號3變體,在位置18改造第一半胱胺酸代替丙胺酸,但不使用C末端帽。在艾塞那肽-4序列之位置39引入第二半胱胺酸代替絲胺酸。脯胺酸38亦變為甘胺酸以在艾塞那肽-4之色胺酸籠中生成更強撓性,以促進二硫鍵之形成。
輕鏈融合物中之PC9_2_Exe4_DSB編號2在哺乳動物細胞中無顯著表現且未經進一步表徵,但獲得足量之PC9_2_Exe4_DSB編號1及PC9_2_Exe4_DSB編號3。在活體內實驗之前藉由ESI質譜確認融合物之完整性及身份。
如實例4中所述藉由在小鼠中跟蹤隨時間之化合物暴露及活性GLP-1濃度來評價PC9_2_GLP-1_NGS編號7、PC9_2_Exe4_DSB編號1及PC9_2_Exe4_DSB編號3之活體內穩定性。
健康C57/B6小鼠(7-8週齡,雌性,Charles River)接受40mg/kg之PC9_2_GLP-1_NGS編號7、10.8mg/kg之PC9_2_Exe4_DSB編號1或5mg/kg之PC9_2_Exe4_DSB編號3之一次單一靜脈內(IV)劑量。在以下時間點中之每一點殺死3隻小鼠之組:注射前、注射後5分鐘、6h、24h、72h及168h,並在含有dPP4抑制劑之EDTA管中收集每一動物之血液。然後將血漿樣品在4℃下以14000rpm離心5min並在分析期間儲存於-80℃下。
在活體外,所有三種化合物皆在人類GLP-1受體處具有活性,但在cAMP分析中展示不同EC50:PC9_2_GLP-1_NGS編號7、PC9_2_Exe4_DSB編號1及PC9_2_Exe4_DSB編號3分別為1.94-8M、5.25-9M及3.25-10M。基於效能儘可能顯著地調節劑量以在cAMP離體分析中生成高於量化下限之信號,以計算長時間中之活性GLP-1化合物濃度。
分別地,PC9_2_GLP-1_NGS編號7在小鼠血漿中隨時間之暴露及活性GLP-1化合物濃度顯示於圖12及13A中,PC9_2_Exe4_DSB編號1顯示於圖13B及14B中,且PC9_2_Exe4_DSB編號3融合分子顯示於圖11及13C中。
PC9_2_GLP-1_NGS編號7、PC9_2_Exe4_DSB編號1及PC9_2_Exe4_DSB編號3針對暴露及活性GLP-1二者之活體內半衰期呈現於表14中。
與親體分子NIP228_GLP-1_VH及PC9編號2_Exe4_VL(表9)相比,所有三種化合物對於GLP-1活性具有改良之活體內穩定性,且PC9_2_GLP-1_NGS編號7、PC9_2_Exe4_DSB編號1及PC9_2_Exe4_DSB編號3之半衰期分別為76h、約100h及36h。
極為有趣的是,PC9_2_Exe4_DSB編號1在小鼠中長達7天表現完全穩定,在與化合物暴露相比時未觀察到GLP-1活性損失(圖13B)。
該等資料表明,在GLP-1類似物周圍生成立體阻礙可延長抗體融合物中之肽之活體內活性半衰期。
遵循實例4及8A中論述之方案將各種化合物投與小鼠並繪製化合物在血漿中之濃度隨時間之圖。使用如實例3中所述之cAMP分析來測定在人類GLP-1受體處之化合物效能(EC50)。
經由活體內PK/穩定性評價來指導融合分子最佳化。如圖14A、11及12中所顯示,肽改造產生具有增強活體內穩定性概況之融合分子。二硫鍵穩定化產生多種益處,使得活性保留更久且對在GLP-1受體處之效能的影響極小。NGS編號7亦具有改良之穩定性概況,但與DSB編號3(340pM)相比效能較低(19nM)。
圖14A顯示EC50為100pm之GLP-1-Fc基準分子。
圖11顯示EC50為340pM之二硫橋接變體(PC9_2_DSB編號3)(SEQ ID NO:49及SEQ ID NO:8)。
圖12顯示EC50為19nM之n-糖基化變體(PC9_2_NGS編號7)(SEQ ID NO:50及SEQ ID NO:8)。
彼等化合物之活體內半衰期呈現於表15中。
在小鼠模型中評估雙重作用融合分子之Fc暴露及GLP-1活性。以10.8mg/kg靜脈內投藥且活體外效能為5200pM。方案係如實例8中所述。將該等資料與以1mg/kg靜脈內投藥且活體外效能為100pM之GLP-1 Fc基準分子相比。此處使用與實例4中所述類似之方案。結果顯示於圖14A(度拉糖肽)及14B(PCSK9/GLP-1融合物PC9_2_DSB編號1)(SEQ ID NO:48及SEQ ID NO:8)中。GLP-1活性在小鼠中長達7天無損失。
自中等規模批次進行蛋白A純化後材料針對PC9_2_Exe4_DSB編號1及PC9_2_Exe4_DSB編號3之品質較差,此乃因藉由SEC-HPLC檢測到大量聚集體。然後如實例2中所述使用利用Superdex 200製備級管柱之製備型粒徑篩析層析進一步純化化合物。
PC9_2_Exe4_DSB編號1及PC9_2_Exe4_DSB編號3之製備型SEC層析圖分別顯示於圖15A及15B中。顯著比例(25-40%)之材料經聚集,如在早期滯留時間處之額外峰所顯示。收集含有單體化合物之部
分以獲得用於活體內測試之材料。見實例8及9。
藉由在波動包(wavebag,GE Healthcare)中瞬時轉染48.2L CHO哺乳動物細胞進一步評價PC9_2_Exe4_DSB編號1產生之可擴縮性。藉由使用蛋白A管柱,之後使用混合式樹脂進行另外兩個純化步驟來純化化合物。
在收穫物中檢測到高聚集度(>25%)且單體產物尤其難以有效純化。藉由SEC-HPLC需要3個層析步驟來生成95.9%純度之產物。此對純化產率影響極壞且總回收率為約3.4%。另外,收穫物中之力價為104mg/L,此與使用類似表現系統之單株抗體相比較低。與抗-PCSK9抗體HS9之輕鏈(SEQ ID NO:2)融合之DSB編號1二硫鍵GLP-1類似物之產生得出極為相似之結果。
雙重作用融合分子(PCSK9/GLP-1融合物PC9_2_DSB編號1)(SEQ ID NO:48)具有聚集潛力且在一些實施例中期望選擇單體。在如實例2中所述之蛋白A純化後在分析型SEC-HPLC期間檢測到之聚集體顯示於圖16中。因此,在一些實施例中可期望額外改造以改良單體概況。
生成與PC9編號2之輕鏈(SEQ ID NO:9)融合之其他艾塞那肽-4二硫鍵肽(DSB)以改良肽抗體分子產生期間之單體概況。改造艾塞那肽-4肽之半胱胺酸橋之不同位置以及富含甘胺酸之C末端帽之長度及C末端中之各種甘胺酸點突變以促進形成二硫鍵且最終減少在產生期間可能由於二硫鍵混雜所致之聚集。肽改造工作係使用艾塞那肽-4之3-D NMR結構來指導(Neidigh,JW等人,Biochemistry,2001,40,13188-200.)。
以小規模產生總計10種DSB肽抗-PCSK9融合物並藉由SEC-HPLC針對改良單體概況加以篩選。肽序列闡述於圖17中。
PC9_2_Exe4_DSB編號4不顯著表現且未經進一步表徵。
在蛋白A純化後藉由分析型SEC-HPLC測定之9種融合物與PC9_2_Exe4_VL及PC9_2_Exe4_DSB編號1相比之聚集體百分比闡述於表16中。
在所測試9種化合物中,有4種之聚集體百分比低於10%:PC9_2_Exe4_DSB編號7、PC9_2_Exe4_DSB編號9、PC9_2_Exe4_DSB編號10及PC9_2_Exe4_DSB編號11。PC9_2_Exe4_DSB編號7之聚集體百分比最低,為5.1%,與之相比,早期融合物PC9_2_Exe4_DSB編號1為26.5%。無二硫鍵之艾塞那肽-4抗體融合物PC9_2_Exe4_VL顯示2.9%聚集體。
放大PC9_2_Exe4_DSB編號7及PC9_2_Exe4_DSB編號9之產生的規模以供應足量材料用於實施活體內穩定性實驗。圖18及19分別顯示在如實例2中所述之初始蛋白A純化後PC9_2_Exe4_DSB編號7及
PC9_2_Exe4_DSB編號9之製備型SEC層析圖。與PC9_2_Exe4_DSB編號1及PC9_2_Exe4_DSB編號3(圖15A及B)不同,在該純化步驟期間未檢測到顯著比例之聚集體。
為檢查具有改良單體概況之最佳化DSB肽抗體融合物與艾塞那肽-4抗體融合物相比確實展現優異活體內穩定性,在3隻CD大鼠中靜脈內注射PC9_2_Exe4_DSB編號7及PC9_2_Exe4_DSB編號9,每一化合物分別為10mg/kg及1mg/kg。在注射後30分鐘、6h、24h、48h、96h、240h及336h收集每一動物之血清樣品。如實例4中所述隨時間量測化合物暴露及活性GLP-1濃度。
在cAMP分析中,兩種化合物在人類GLP-1受體處皆具有活性,其中PC9_2_Exe4_DSB編號7之EC50為9.45E-10M且PC9_2_Exe4_DSB編號9之EC50為1.24E-10M。PC9_2_Exe4_DSB編號7之效能為PC9_2_Exe4_DSB編號9之約八分之一且因此係以10倍劑量注射以在cAMP離體分析中在長時間中生成高於量化下限之信號。
PC9_2_Exe4_DSB編號7及PC9_2_Exe4_DSB編號9融合分子在大鼠血清中隨時間之暴露及活性GLP-1化合物之濃度分別顯示於圖20及21中。將活性GLP-1之濃度正規化為在第一時間點(30min)之暴露以簡化分析。
PC9_2_Exe4_DSB編號7及PC9_2_Exe4_DSB編號9針對GLP-1活性之半衰期分別為44.2h及12.5h,與之相比,親體艾塞那肽-4融合分子PC9_2_Exe4_VL為5.7h(見表9)。在96h後收集之PC9_2_Exe4_DSB編號9樣品之活性化合物濃度無法測定,此乃因其低於分析之量化下限。
彼等資料顯示,PC9_2_Exe4_DSB編號7及PC9_2_Exe4_DSB編號9二者皆在呈抗體融合物時具有與親體融合分子相比改良之GLP-1類似物肽之活體內活性半衰期。
如上所述,肽改造可管控聚集概況。對肽中之半胱胺酸橋位置以及肽/GLP-1部分C末端之組成及長度進行突變。
方案如上文所述。
PCSK9/GLP-1融合物(PC9_2_DSB編號7)(SEQ ID NO:51及SEQ ID NO:8)在小規模批次中藉由SEC-HLPC達成>90%單體。在中等規模批次中仍檢測到聚集,但聚集程度顯著低於PCSK9/GLP-1融合物PC9_2_DSB編號1(SEQ ID NO:48及SEQ ID NO:8)。
結果呈現於圖15A、18、23及表16中。
為指導PCSK9/GLP-1融合分子之設計,已使用關於在診療所測試之抗-PCSK9抗體之PCSK9阻抑與親和力之間的關係之先前資料以及關於經批准GLP-1受體激動劑分子利拉魯肽及度拉糖肽之資料研發藥物動力學(PK)-藥效學(PD)模型。
掃描與抗-PCSK9抗體融合之GLP-1類似物肽之效能以鑑別將使用能生成足夠PCSK9阻抑之劑量產生與市售藥物相當之GLP-1活性之最佳範圍。使用度拉糖肽之藥物動力學、血漿蛋白質結合及受體親和力性質實施模擬,以獲得該化合物隨時間之效能正規化GLP-1活性。對於PCSK9/GLP-1融合分子,假定PK性質係針對PCSK9之典型人類抗體之PK性質,且資訊衍生自診療所中之化合物。該等模擬指示,60mg每週皮下劑量之對人類PCSK9之親和力為3.9nM之PCSK9/GLP-1融合物應在投藥期間在穩態下產生大於90% PCSK9阻抑(圖22A)。
使用該投藥方案之模擬指示,PCSK9/GLP-1融合分子在人類GLP-1受體處之效能應在3-5nM內以達成與現有分子相比類似之GLP-1活性(圖22B)。度拉糖肽在彼等模擬中之效能設置為80pM,表明在有效阻抑PCSK9所需之劑量下,PCSK9/GLP1融合分子之效能需要為
度拉糖肽之約30分之一至60分之一以管控與GLP-1受體激動劑分子相關之噁心副作用。
業內熟知降低GLP-1肽或GLP-1類似物之效能之方法係(例如)在肽中之關鍵殘基處突變或引入非天然胺基酸。用於GLP-1肽與受體結合及活性之關鍵殘基尤其藉由丙胺酸掃描來鑑別(Adelhorst,K.等人,J.Bio.Chem.,1994,269,6276-6278)。
為進一步顯示降低在GLP-1受體處之效能之可行性,合成一組呈游離肽之在位置2或3具有突變或非天然胺基酸之GLP-1類似物(使用7-36個GLP-1序列)並在如實例3中所述之cAMP活體外分析中測試其在人類GLP-1受體處之活性。資料概述於下表17中。Aib用於2-胺基異丁酸且Orn用於鳥胺酸。
彼等資料顯示,可調節GLP-1類似物肽之EC50已達成所定義效能降低。
為降低與抗-PCSK9抗體HS9之輕鏈(SEQ ID NO:2)融合之DSB編號7 GLP-1類似物肽(SEQ ID NO:13)之效能,使用標準分子生物學技術在肽中之位置G2、E15、V19、I23或L26引入點突變。總計產生28個肽抗體融合分子之突變體並使用如實例3中所述之cAMP分析測試其在人類GLP-1受體處之活性。化合物及活性資料之列表呈現於表18中。
28種構築體中有5種無活性。其他化合物展示極為不同之在人類GLP1受體處之效能,介於400pM(HS9_DSB7_V19T)至近6μM
(HS9_DSB7_L26Q)範圍內。另外,一些化合物,如HS9_DSB7_G2Y或HS9_DSB7_L26Q係部分激動劑:其在飽和劑量下不提供與GLP-1肽相比相同之活化程度。
基於實例13中之PKPD建模,雙重活性抗-PCSK9抗體GLP-1受體激動劑分子在人類GLP-1受體處之效能需要與GLP-1-Fc基準相比降低至約30分之一至60分之一,以在有效阻抑PCSK9抗原所需之劑量下管控噁心。
4種肽抗體融合物(HS9_DSB7_G2V、HS9_DSB7_E15A、HS9_DSB7_V19A及HS9_DSB7_L26I)展示效能介於700pM與1.4nM之間,對應於與基準GLP1-Fc相比之25至50倍損失。所有該4種化合物在人類GLP-1受體處皆係完全激動劑,且與GLP-1肽相比最大活化百分比大於90%。
以大規模產生所選4種具有期望人類GLP-1R效能之肽抗體融合物(HS9_DSB7_G2V、HS9_DSB7_E15A、HS9_DSB7_V19A及HS9_DSB7_L26I)以支持進一步表徵。為評價化合物在產生期間之聚集傾向,藉由分析型SEC-HPLC測試蛋白A純化後之樣品。資料概述於表19中。
4種融合物中僅有兩種(HS9_DSB7_V19A及HS9_DSB7_L26I)在蛋
白A純化後達成大於90%之單體百分比。HS9_DSB7_V19A呈現大於95%單體之最佳概況。HS9_DSB7_G2V及HS9_DSB7_E15A在產生期間顯著傾向於聚集,且聚集體百分比大於20%,與之相比HS9_DSB7_V19A小於5%。
使用分子量截止值為30kDa之離心旋轉濃縮器來濃縮純化化合物以在默認調配緩衝液中達成50mg/mL之目標濃度。HS9_DSB7_G2V及HS9_DSB7_E15A之濃度分別終止於38.7mg/mL及33.7mg/mL,此乃因注意到進一步減小體積會導致蛋白質濃度下降。在HS9_DSB7_V19A及HS9_DSB7_L26I之濃縮步驟期間未觀察到該問題。
然後將樣品在5℃或40℃下培育4週,之後實施分析型SEC-HPLC以評價儲存穩定性。結果概述於表20中。
HS9_DSB7_V19A及HS9_DSB7_L26I二者展示較HS9_DSB7_G2V及HS9_DSB7_E15A更佳之穩定性參數。例如,前兩者在5℃下每個月之聚集率為約0.3%,與之相比HS9_DSB7_E15A及HS9_DSB7_G2V分別為約0.8%及1.4%。
在3隻CD大鼠中單一靜脈內推注後如實例4中所述評價所選4種具有期望人類GLP-1R效能之肽抗體融合物之藥物動力學概況,HS9_DSB7_G2V、HS9_DSB7_E15A、HS9_DSB7_V19A及HS9_DSB7_L26I分別為60mg/kg、53mg/kg、58.5mg/kg及60mg/kg。使用高劑量之化合物(高於50mg/kg)使PCSK9匯點(sink)長時間飽和以測定線性期期間之PK參數,不測定任何靶介導之藥物處置組份。
在注射後30分鐘、6h、24h、48h、96h、168h、240h及336h收集血樣。4種化合物隨時間之濃度顯示於圖24中且半衰期資料概述於表21中。
儘管序列極為接近且共享相同抗體主鏈,但4種融合物分子具有顯著不同之概況。4種融合物中HS9_DSB7_V19A之活體內半衰期最長,為128h,與之相比,例如HS9_DSB7_L26I僅為39h。
人類、食蟹猴及大鼠PCSK9與GLP-1類似物抗-PCSK9融合物HS9_DSB7_V19A人類IgG1-TM之結合的結合(ka)、解離(kd)及平衡解離常數(KD)係在25℃下藉由表面電漿共振(SPR)使用Biacore 2000生物感測器(GE Healthcare)來測定,基本上如Karlsson等人(J.Immunol.Methods(1991),第145卷,第Dear229-40頁)所述。使用抗-PCSK9抗
體PC9編號3人類IgG1-TM作為基準(SEQ ID NO:404之可變重鏈及SEQ ID NO:405之可變輕鏈)。
首先使用人類抗體捕獲套組及CM5感測器晶片(GE Healthcare)產生小鼠抗人類IgG單株抗體表面。將人類抗體化合物在10μL/分鐘之流速下捕獲3分鐘。將重組人類Avi_PCSK9_Flag_His(內部)、食蟹猴Avi_PCSK9_Flag_His(內部)及His標記之大鼠PCSK9(SinoBiological)在運行緩衝液(10mM磷酸鈉pH 7.4,150mM氯化鈉,1mg/mL BSA,0.05% Tween20)中稀釋至介於1nM至200nM範圍內之濃度並在晶片表面上方注射10分鐘,之後在10分鐘解離期間僅注射運行緩衝液。在每次抗體施加之間使用3M氯化鎂使晶片表面再生。首先計算整體解離速率,之後計算整體結合速率,二者皆使用1:1結合動力學模型。
結果顯示於表22中。
融合分子HS9_DSB7_V19A在pH7.4下對人類PCSK9之親和力為600pM,與基準抗-PCSK9抗體PC9編號3極為相似。有趣的是,與PC9編號3相比,解離常數係四分之一之HS9_DSB7_V19A較不傾向於與人類PCSK9解離。
另外,HS9_DSB7_V19A可在生理pH下牢固結合至食蟹猴及大鼠PCSK9,且平衡解離常數接近人類PCSK9值(分別為1.7nM及570pM)。
藉由解離增強之鑭系元素螢光免疫分析時間解析螢光(DELFIA TRF分析,PerkinElmer)來測定與相關人類蛋白質相比,GLP-1類似物抗-PCSK9融合物HS9_DSB7_V19A人類IgG1-TM對PCSK9之特異性。將PBS中之10μg/mL重組人類Avi_PCSK9_Flag_His(內部)、GST標記之人類PCSK7(Abnova)、GST標記之人類MBTPS1(Abnova)及Flag/His標記之人類CD86(內部)塗佈至96孔免疫分析板中。在洗滌後,以25μg/mL之濃度將HS9_DSB7_V19A添加至經抗原塗佈之孔中。將板在室溫下培育2小時,之後充分洗滌。使用二級銪標記之抗人類IgG抗體(PerkinElmer)檢測經結合HS9_DSB7_V19A人類IgG1-TM。對於人類PCSK7及人類MBTPS1,藉由使用小鼠抗GST IgG(Abcam)作為主要檢測且使用銪標記之抗小鼠IgG(PerkinElmer)作為檢測來評價塗佈至板之抗原。使用銪標記之抗His IgG(PerkinElmer)直接評價人類PCSK9及人類CD86塗層。
結果顯示,HS9_DSB7_V19A人類IgG1-TM牢固結合至人類PCSK9,但不結合至人類PCSK7、人類MBTPS1(PCSK8)或人類CD86(資料未顯示)。
使用ELISA競爭分析來評價GLP-1類似物抗-PCSK9融合物HS9_DSB7_V19A阻斷人類PCSK9與人類LDL受體之結合之能力。分別使用抗-PCSK9抗體HS9及無關同型匹配NIP228人類IgG1-TM作為陽性及陰性對照。
藉由ELISA使用以100ng/mL稀釋於Delfia緩衝液(Perkin Elmer)中之穴狀化合物標記之鏈黴抗生物素蛋白(Perkin Elmer)來檢測1×磷酸鹽緩衝鹽水、3%脫脂乳中之5μg/mL生物素化人類PCSK9(內部)與以10μg/mL塗佈至96孔MaxiSorb板(NUNC)上過夜之人類LDL-R(R&D Systems)之結合。使用在室溫下在LDL受體塗佈孔中與生物素化PCSK9試劑共培育2h之化合物之以100μg/mL開始之3倍連續稀釋液挑戰該相互作用。在Perkin Elmer Envision機器上使用340nm激發及620nm發射讀取螢光信號。藉由減去在未將LDL受體塗佈至板上時獲得之背景信號來計算特異性結合之百分比,該背景信號藉由不使用競爭劑化合物時獲得之最大特異性結合信號減去背景值來正規化。
對PCSK9與LDL受體之結合之生物化學抑制呈現於圖25中。
融合分子HS9_DSB7_V19A可阻斷生物素化人類PCSK9與重組LDL受體之結合,其IC50與陽性對照抗-PCSK9抗體HS9相比類似(分別為4.3E-8M及3.5E-8M)。
如下所述在HepG2肝細胞中測試GLP-1類似物抗-PCSK9融合物HS9_DSB7_V19A阻斷PCSK9活性並恢復LDL攝取之能力。分別使用抗-PCSK9抗體PC9編號2及無關同型匹配NIP228人類IgG1-TM作為陽性及陰性對照。
將人類HepG2細胞以2×104個細胞/孔之濃度接種於黑色透明底96
孔Greiner板中之補充有10%缺乏脂蛋白血清(Sigma)之DMEM培養基(Gibco)中並在37℃(5% CO2)下培育過夜。為將PCSK9與所測試化合物複合,將45nM人類Avi_PCSK9_FLAG_His(內部)與各種濃度之所測試化合物一起或不與該化合物一起在DMEM+10% LPDS中在室溫下培育1小時。自細胞板移除所有培養基並將PCSK9/化合物混合物轉移至該板且培育1小時。隨後將於DMEM+10% LPDS中稀釋至50nM最終濃度之Bodipy-LDL(Molecular Probes)轉移至細胞並將板在37℃(5% CO2)下培育5小時。用PBS充分洗滌細胞,用核染料Hoescht染色並使用最終濃度為3.7%(v/v)之甲醛固定。使用Cellomics ArrayScan VTi高內涵成像系統讀取分析板之細胞相關螢光。在通道1中使用BGRFR_386_23濾器量測Hoescht染色,且在通道2中使用BGRFR_485_20濾器量測Bodipy-LDL。使用分室分析v4算法來分析影像。
對HepG2細胞之LDL攝取之PCSK9依賴性損失之抑制呈現於圖26中。
融合分子HS9_DSB7_V19A可恢復經人類PCSK9處理之HepG2細胞之LDL攝取,其IC50與陽性對照抗-PCSK9抗體PC9編號2相比類似(分別為2.5E-8M及3.1E-8M)。
如先前所述藉由使用過表現所關注受體之穩定細胞系在cAMP產生分析中測試GLP-1類似物抗-PCSK9融合物HS9_DSB7_V19A在人類、食蟹猴、小鼠及大鼠GLP-1受體處之交叉反應性。使用GLP1-Fc融合物(內部)及GLP-1肽作為陽性對照。
在不同GLP-1受體處之效能概述於表23中。
融合分子HS9_DSB7_V19A可活化所測試所有4種物種之GLP-1受體。
為降低DSB7效能,使肽中之某些殘基突變。具有期望效能之肽與SEQ ID NO:2使用連接體SEQ ID NO:4之Ab融合物在此處以綠色三角形顯示,進一步分析其在人類GLP1-R處之特異性及物種交叉反應性。見圖27。
變體顯示為HS9_DSB7_G2V(Gly2->Val)(SEQ ID NO:44及SEQ ID NO:1);HS9_DSB7_E15A(Glu15->Ala)(SEQ ID NO:45及SEQ ID NO:1);HS9_DSB7_V19A(Val19->Ala)(SEQ ID NO:47及SEQ ID NO:1);HS9_DSB7_L26I(Leu26->Ile)(SEQ ID NO:46及SEQ ID NO:1)(與Val19->Ala(SEQ ID NO:3)相比)。選擇該4種變體用於最終表徵。結果顯示於圖27中。
PCSK9/GLP-1融合分子展現對GLP-1受體之期望效能,如圖28A中所顯示。此化合物之效能已經降低以使噁心減至最少。表24顯示,HS9_DSB7_V19A之效能相對於度拉糖肽降低至57.7分之一。此效能之經改造降低提供減少噁心及其他不利效應之期望效應。
實例1之PCSK9/GLP-1融合物展現足以容許每週投藥之Ab暴露/GLP-1活性概況,如例如圖28B之注射至大鼠中之58.5mg/kg HS9_DSB7_V19A在大鼠中之pK穩定性研究中所顯示。在血清中隨時間量測融合化合物之濃度。分析取自大鼠之樣品中測試化合物之活性及測試化合物在血清中之濃度二者。使用來自GLP-1活性部分之資料反算「活性」化合物之濃度。具有實心圓形之線條係HS9_DSB7_V19A之濃度,且具有實心正方形之線條係相同樣品中活性HS9_DSB7_V19A(即,具有GLP-1活性)之濃度。
在如上文所述之cAMP產生分析中藉由使用過表現所關注受體之穩定細胞系測試與以下相關人類受體相比GLP-1類似物抗-PCSK9融合物HS9_DSB7_V19A對GLP-1受體之特異性:升糖素、GIP、GLP-2及胰泌素受體。使用該4種受體中每一者之特異性激動劑肽作為陽性對照。
資料顯示於圖29A-D中(A:升糖素受體;B:GIP受體;C:GLP-2受體;D:胰泌素受體)。
融合分子HS9_DSB7_V19A對GLP-1受體具有特異性且不活化所
測試4種緊密相關之受體中之任一者。
實例2之PCSK9/GLP-1融合分子(HS9_DSB7_V19A(SEQ ID NO:1之重鏈及SEQ ID NO:47之輕鏈融合物))隨時間(包括在投藥後第7天)顯示優異葡萄糖控制及體重減輕。顯示針對度拉糖肽及PC9_2_VH及VL(SEQ ID NO:8及9)之資料。在第0天用化合物對動物投藥,然後隨時間量測其體重以測定體重變化。
融合分子已顯示,其以高親和力結合純化PCSK9,其恢復HEPG2細胞中之LDLc攝取,以期望效能刺激GLP-1R,促進體重減輕,且在大鼠PK中顯示有利的暴露/活性概況以支持每週投藥及持續活體內GLP-1活性。
結果提供於圖30A-B中。
化合物HS9_DSB7_V19A在肽部分與抗體輕鏈之間具有SEQ ID NO:4之連接體,其對應於重複三次之Gly4Ser基序。為研究在融合至抗-PCSK9抗體HS9之輕鏈(輕鏈:SEQ ID NO:2及重鏈:SEQ ID NO:1)時GLP-1類似物肽DSB7_V19A(SEQ ID NO:3)之間之連接體長度的影響,生成3種連接體長度減小之融合物:HS9_DSB7_V19A_L2(SEQ ID NO:419),其連接體對應於重複兩次之Gly4Ser基序(連接體:SEQ ID NO:403);HS9_DSB7_V19A_L1(SEQ ID NO:420),其連接體對應於重複一次之Gly4Ser基序(SEQ ID NO.27);及HS9_DSB7_V19A_L0,其在肽與抗體輕鏈(SEQ ID NO:421)之間無連接體。
藉由ELISA測試化合物與重組人類PCSK9之結合,且使用如實例4中所述之基於cAMP分析細胞之分析測試其在人類GLP-1受體處之活
性。
藉由塗佈1×磷酸鹽緩衝鹽水中之10μg/mL人類PCSK9(內部)實施結合ELISA。在用1×磷酸鹽緩衝鹽水、3%脫脂乳阻斷板後,添加PBS中之100μg/mL化合物並在室溫下培育2h,之後洗滌。使用以100ng/mL稀釋於Delfia緩衝液(Perkin Elmer)中之穴狀化合物標記之Fc特異性抗人類IgG(Perkin Elmer)檢測經結合化合物。在Perkin Elmer Envision機器上使用340nm激發及620nm發射讀取螢光信號。使用HS9_DSB7_V19A作為陽性對照且使用無關同型匹配NIP228來測定背景值。
PCSK9結合及GLP-1受體活化資料分別顯示於圖31及32中。
與HS9_DSB7_V19A相比,所有其他融合分子皆能以類似程度結合人類PCSK9。在基於cAMP細胞之分析中,所測試融合分子亦可活化人類GLP-1受體,但減小連接體長度對化合物效能具有負面影響。在該分析中,HS9_DSB7_V19A、HS9_DSB7_V19A_L2、HS9_DSB7_V19A_L1及HS9_DSB7_V19A_L0之EC50分別為5.0nM、15.6nM、68.7nM及537nM。
使用SEQ ID NO:4之連接體將SEQ ID NO:3)之GLP-1類似物肽DSB7_V19A融合至並非HS9之其他抗-PCSK9抗體之輕鏈:
1_ PC9編號1,具有SEQ ID NO:10之抗體可變重鏈及SEQ ID NO:11之抗體可變輕鏈
2_ PC9編號3,具有SEQ ID NO:404之抗體可變重鏈及SEQ ID NO:405之抗體可變輕鏈。
3_ PC9編號4,具有SEQ ID NO:406之抗體可變重鏈及SEQ ID NO:407之抗體可變輕鏈。
4_ PC9編號5,具有SEQ ID NO:408之抗體可變重鏈及SEQ ID
NO:409之抗體可變輕鏈。
5_ PC9編號6,具有SEQ ID NO:410之抗體可變重鏈及SEQ ID NO:411之抗體可變輕鏈。
6_ PC9編號7,具有SEQ ID NO:412之抗體可變重鏈及SEQ ID NO:413之抗體可變輕鏈。
藉由如實例26中所述之ELISA測試融合物與重組人類PCSK9之結合,且使用如實例4中所述之基於cAMP細胞之分析測試其在人類GLP-1受體處之活性。分別使用HS9_DSB7_V19A及NIP228同型匹配作為陽性及陰性對照。
PCSK9結合及GLP-1受體活化資料分別顯示於圖33及34中。
在人類GLP-1受體cAMP分析中所測試之所有7種化合物皆能活化受體。PC9編號6_DSB7_V19A及PC9編號5_DSB7_V19A在該組之間之效能分別介於1至350nM範圍內。HS9_DSB7_V19A在該分析中具有5nM效能。
另外,藉由ELISA測試之所有融合物皆亦能牢固結合至人類PCSK9,但結合較差之PC9編號7_DSB7_V19A及不結合之PC9編號6_DSB7_V19A例外。
使用SEQ ID NO:4之連接體將SEQ ID NO:3之GLP-1類似物肽DSB7_V19A融合至專利WO2011066389中所述之抗B7-H1抗體2.7A4之輕鏈。抗B7-H1抗體2.7A4具有SEQ ID NO:422之可變重鏈及SEQ ID NO:423之可變輕鏈。
藉由ELISA測試融合物與重組人類B7-H1之結合,且使用如實例4中所述之基於cAMP分析細胞之分析測試其在人類GLP-1受體處之活性。
藉由塗佈1×磷酸鹽緩衝鹽水中之5μg/mL人類B7-H1(內部)來實
施結合ELISA。在用1×磷酸鹽緩衝鹽水、3%脫脂乳阻斷板後,添加PBS中之10μg/mL化合物並在室溫下培育2h,之後洗滌。使用如實例25中所述之穴狀化合物標記之Fc特異性抗人類IgG(Perkin Elmer)來檢測經結合化合物。分別使用抗B7-H1抗體2.7A4及無關同型匹配NIP228作為陽性及陰性對照。
B7-H1結合及GLP-1受體活化資料分別顯示於圖35及36中。
融合物2.7A4_DSB7_V19A能以與陽性對照2.7A4抗體類似之程度結合人類B7-H1。融合物亦可在基於cAMP細胞之分析中以100nM之效能活化人類GLP-1受體,與之相比,HS9_DSB7_V19A之效能為5nM。
在CD大鼠中單一靜脈內推注後,對肽抗體融合物HS9_DSB7_V19A實施PKPD研究,以藉由量測化合物暴露及活性GLP-1濃度二者評價其活體內穩定性,以及藉由量測游離大鼠PCSK9之濃度評價其靶銜接。
融合分子係以10mg/kg、30mg/kg及60mg/kg注射。使用未附接有肽之抗-PCSK9 mAb HS9作為對照且以60mg/kg注射。在以下時間點收集血樣:1:對於10mg/kg處理組,投藥前-0.5h-6h-24h-48h-96h及168h;2:對於30mg/kg處理組,投藥前-0.5h-24h-48h-96h-168h及240h;及3:對於60mg/kg處理組,投藥前-0.5h-24h-72h-168h-336h及504h。
如實例4中所述量化大鼠血清樣品中之總人類IgG1抗體之濃度(暴
露)及活性GLP-1化合物濃度。
對於所測試3種劑量(10mg/kg、30mg/kg及60mg/kg),在大鼠血清中之總體及活性GLP-1化合物隨時間之HS9_DSB7_V19A濃度顯示於圖37中。
總化合物及活性GLP-1二者之曲線下面積(AUC)概述於表25中。計算活性GLP-1與總化合物AUC之間之比率係一種評估活體內穩定性之方式。一者之比率對應於在所測試條件中完全穩定之化合物。
亦已包括包含與抗-PCSK9 mAb PC9編號2之輕鏈融合之艾塞那肽-4之親體融合分子PC9編號2_Exe4(見實例4)之資料以供比較。
與親體分子PC9編號2_Exe4相比,HS9_DSB7_V19A展示較大活性/總體AUC比率,顯示在大鼠中針對在GLP-1受體處之活性改良之活體內穩定性概況。
血清樣品中之游離大鼠PCSK9濃度之測定係基於夾心配體結合分析方法使用MSD®平臺來實施。使用首先非特異性吸附至標準結合MSD®板之碳表面上之抗-PCSK9 mAb HS9來捕獲游離大鼠PCSK9。來自Abcam(產品號ab125251)之抗-PCSK9抗體經MSD® SULFO-TAGTM內部標記且用作檢測試劑。然後使用MSD® Sector Imager 6000(SI6000)儀器讀取板。
藉由量測大鼠血清樣品中游離抗原之濃度來評估HS9_DSB7_V19A與大鼠PCSK9隨時間之銜接。3個投藥組(10mg/kg、30mg/kg及60mg/kg)之資料顯示於表26及圖38中。
在所測試之所有劑量下,HS9_DSB7_V19A能將大鼠PCSK9阻抑至低於90%,但阻抑之持續時間具有劑量依賴性。在HS9_DSB7_V19A分別係以10mg/kg、30mg/kg及60mg/kg投藥時,游離大鼠PCSK9在注射後6h、168h及336h再次可檢測。
在CD大鼠中以60mg/kg單一皮下推注後對GLP-1類似物肽抗體融合物HS9_DSB7_V19A實施藥物動力學研究,以比較投與途徑及其對化合物暴露及活體內穩定性之潛在影響。
融合分子係使用1.5mL/kg方案以40mg/mL注射。在投藥前-6h-24h-48h-96h-168h及240h收集血樣。
如實例4及實例29中所述測定血清樣品中總人類IgG1抗體及活性
GLP-1化合物之濃度以及游離大鼠PCSK9抗原之濃度。
HS9_DSB7_V19A之總體及活性化合物及游離大鼠PCSK9濃度顯示於圖39中。在注射後48h與96h之間觀察到約1000nM之最大化合物濃度。游離大鼠PCSK9之濃度在化合物注射後急劇下降至低於分析之量化下限且可在168h再次檢測。
計算總體及活性化合物二者之曲線下面積(AUC)並與使用來自實例29中所述之單一靜脈內劑量注射之資料之模型預測相比較(表27)。將吸收比例及吸收速率分別設置為75%及0.3d-1。
在以60mg/kg單一皮下注射後HS9_DSB7_V19A之暴露及活性GLP-1 AUC與彼等使用單一靜脈內注射資料預測者類似。此顯示,與靜脈內投與途徑相比,皮下注射途徑對活體內化合物穩定性無顯著影響。
為確認HS9_DSB7_V19A融合分子中之GLP-1類似物肽部分之經改造性質在活體內保持抗糖尿病活性,在正常、肥胖及糖尿病小鼠模型中實施若干個齧齒類動物藥理學研究。
在正常C57Bl6小鼠中以1mg/kg或50mg/kg皮下投與單一劑量之
HS9_DSB7_V19A。藉由在投與HS9_DSB7_V19A後4、48及168小時多次葡萄糖篩查(口服葡萄糖耐受測試)評估融合分子中GLP-1類似物組份之效能。以50mg/kg投與未融合有GLP-1類似物肽之抗-PCSK9 mAb HS9作為葡萄糖耐量之陰性對照,同時分別以0.2mg/kg及1mg/kg投與利拉魯肽(Victoza)及GLP-1類似物-Fcγ4融合物(類似於度拉糖肽)。由於利拉魯肽之半衰期較短,此化合物係在每次葡萄糖篩查之前2小時投與,而GLP-1類似物-Fcγ4融合分子係在與HS9_DSB7_V19A測試化合物相同之時間一次投與。
在實驗前將來自Taconic Denmark之30隻雄性C57Bl6小鼠馴化5天。在研究之第-1天,將動物基於體重隨機化至5個組中。
實驗組如下:
第1組:無GLP-1類似物肽組份之抗-PCSK9 mAb HS9(陰性對照)-50mg/kg皮下劑量
第2組:利拉魯肽(陽性對照)-0.2mg/kg皮下劑量
第3組:HS9_DSB7_V19A-1mg/kg皮下劑量
第4組:HS9_DSB7_V19A-50mg/kg皮下劑量
第5組:GLP-1類似物-Fcγ4融合物-1mg/kg皮下劑量
為評價融合分子中GLP-1類似物組份在投藥後延長時間期間之效能,在第0天、第2天及第7天實施3次口服葡萄糖耐受測試(OGTT)。在口服葡萄糖篩查之前使動物空腹4小時。在第0天OGTT之前4小時一次投與兩種劑量之HS9_DSB7_V19A、無活性對照及GLP-1類似物-Fcγ4融合物。在第0天、第2天及第7天,利拉魯肽(陽性對照)係在每次葡萄糖篩查之前2小時投與。在t=0時,用2g/kg葡萄糖之口服葡萄糖載量篩查所有小鼠。在t=-240分鐘、-120分鐘及0分鐘量測血糖以建立基線,且在t=15分鐘、30分鐘、60分鐘及120分鐘量測血糖以監測對葡萄糖偏移之效應。第0天、第2天及第7天OGTT之結果呈現於圖
40A-C中(第0天(A)、第2天(B)、第7天(C))。
此研究確認以50mg/kg單一皮下投與HS9_DSB7_V19A在正常C57Bl6小鼠中改良葡萄糖耐量至少7天之能力。
作為HS9_DSB7_V19A融合分子中GLP-1類似物組份之效能之另一量度,自第-3天至研究結束時每天一次記錄所有小鼠之體重。以50mg/kg單一皮下投與HS9_DSB7_V19A誘導體重在第1天及第2天短暫降低。體重隨時間變化之百分比顯示於圖41中。
為檢查HS9_DSB7_V19A在正常C57Bl6小鼠中對葡萄糖耐量及體重降低之劑量反應效應並測定其最大有效劑量,以以下實驗組及劑量實施設計類似於上文所述者之研究:
第1組:無GLP-1類似物肽組份之抗-PCSK9 mAb HS9(陰性對照)-50mg/kg皮下劑量
第2組:利拉魯肽(陽性對照)-0.2mg/kg皮下劑量
第3組:HS9_DSB7_V19A-10mg/kg皮下劑量
第4組:HS9_DSB7_V19A-30mg/kg皮下劑量
第5組:HS9_DSB7_V19A-60mg/kg皮下劑量
第6組:GLP-1類似物-Fcγ4融合物-1mg/kg皮下劑量
在第-1天基於體重將動物隨機化至該6個組中(n=6隻動物/組)。如上文,在第0天、第2天及第7天實施OGTT並在t=-240分鐘、-120分鐘、0分鐘、15分鐘、30分鐘、60分鐘及120分鐘量測血糖。
所有3種劑量之HS9_DSB7_V19A在所有三個實施OGTT之時間點皆導致類似程度之改良葡萄糖耐量。圖42A-C圖解說明此口服葡萄糖耐受測試之結果(第0天(A)、第2天(B)、第7天(C))。
與針對葡萄糖穩態改良觀察到缺少劑量反應相比,在此研究中
觀察到對體重降低之劑量依賴性效應。圖43。
在此實驗模型中,單一10mg/kg劑量之HS9_DSB7_V19A在投與後實施7天之OGTT中生成最大有效程度之葡萄糖穩態改良,而相同劑量在研究期間之任一點對體重降低無統計學顯著效應。
為確認HS9_DSB7_V19A在糖尿病模型中對若干個代謝參數之慢性活體內效能,利用db/db(瘦素受體缺陷)小鼠檢查每週投與HS9_DSB7_V19A對空腹葡萄糖、葡萄糖耐量、體重降低及身體質量組合物之效應。
在此研究中檢查HS9_DSB7_V19A在每週經由皮下途徑投藥時之慢性代謝效應。對媒劑對照組及陽性對照GLP-1類似物-Fcγ4融合分子每週兩次皮下投藥。為匹配對研究中所有動物之投藥操作次數,在其他動物接受其第二次每週劑量之媒劑(陰性對照)或陽性對照GLP-1類似物-Fcγ4融合分子之日用媒劑對接受每週劑量之HS9_DSB7_V19A之組投藥。
60隻來自Charles River(意大利)之雄性db/db小鼠主要按體重及糖基化血紅素(HbA1c)隨機化,且其次按4小時空腹血糖隨機化。如下將該等動物隨機化至5組(n=12)中:
第1組:媒劑對照組(磷酸鹽緩衝鹽水)-每週兩次(BIW)皮下投藥
第2組:GLP-1類似物-Fcγ4融合物(陽性對照)-1mg/kg皮下劑量-每週兩次皮下投藥
第3組:HS9_DSB7_V19A-30mg/kg皮下劑量-每週一次(QW)
第4組:HS9_DSB7_V19A-10mg/kg皮下劑量-每週一次(QW)
第5組:HS9_DSB7_V19A-3mg/kg皮下劑量-每週一次(QW)
慢性研究在初始劑量後運行28天。BIW組之最後一次劑量係在研
究第24天,而QW組之最後一次劑量係在研究第21天。此研究之主要效能終點係體重、空腹血糖及葡萄糖耐量。
在處理期間每週三次量測體重。
每週一次在投藥後約24小時量測4小時空腹血糖。
在研究第22天投藥後約24小時藉由腹膜內葡萄糖耐受測試(IPGTT)量測葡萄糖耐量。在投與1g/kg葡萄糖推注之前使動物空腹4小時。在t=0分鐘、15分鐘、30分鐘、60分鐘、120分鐘及180分鐘量測血糖。
此研究中之體重降低並不顯著,但陽性對照GLP-1類似物-Fcγ4融合分子組中之一個時間點例外。所有3種劑量之HS9_DSB7_V19A在28天研究過程期間之任一時間皆不導致顯著體重降低。圖44。
與媒劑對照相比,每週HS9_DSB7_V19A展現4小時空腹血糖之劑量依賴性降低。圖45。
每週投藥之HS9_DSB7_V19A展現葡萄糖耐量之劑量依賴性改良,如在研究第22天藉由IPGTT所評價。圖46。
在飲食誘導之肥胖(DIO)小鼠中以0.1mg/kg、1mg/kg或10mg/kg皮下投與單一劑量之HS9_DSB7_V19A。在投與HS9_DSB7_V19A後4及168小時藉由單獨葡萄糖篩查(腹膜內葡萄糖耐受測試)評估融合分子中GLP-1類似物組份之效能。以10mg/kg一次投與未融合有GLP-1類似物肽之抗-PCSK9 mAb HS9作為對葡萄糖耐量之效應的陰性對照。以1mg/kg每週兩次(BIW)投與先前實驗中使用之GLP-1類似物-Fcγ4融合物(類似於度拉糖肽)作為陽性對照。為模擬陽性對照GLP-1類似物-Fcγ4融合物之投藥方案,用媒劑BIW對陰性對照組及HS9_DSB7_V19A實驗組中之所有動物投藥。研究持續時間為第一劑
量後21天。主要終點係在第0天(投藥後4小時)及第7天在IPGTT中對葡萄糖耐量之效應。次要終點係體重降低。
自Jackson實驗室獲得在研究開始之前食用60%高脂肪飲食15週之50隻雄性21週齡DIO小鼠(JAX:380050)。在即將開始研究之前,基於體重將動物隨機化至5組中。
實驗組(n=10/組)如下:
第1組:無GLP-1類似物肽組份之抗-PCSK9 mAb HS9(陰性對照)-10mg/kg皮下劑量-單一劑量
第2組:HS9_DSB7_V19A-0.1mg/kg皮下劑量-單一劑量
第3組:HS9_DSB7_V19A-1mg/kg皮下劑量-單一劑量
第4組:HS9_DSB7_V19A-10mg/kg皮下劑量-單一劑量
第5組:GLP-1類似物-Fcγ4融合物-1mg/kg皮下劑量-每週兩次投藥(BIW)
為評價在投藥後延長時間中融合分子中GLP-1類似物組份之效能,在第0天及第7天實施兩個腹膜內葡萄糖耐受測試(IPGTT)。在腹膜內葡萄糖篩查之前使動物空腹6小時。所有三種劑量之HS9_DSB7_V19A、無活性對照及GLP-1類似物-Fcγ4融合物皆係在第0天OGTT之前4小時一次投與。GLP-1類似物-Fcγ4融合物係在第0天、第3天、第7天、第10天、第14天、第17天及第21天投與。在第0天在腹膜內葡萄糖篩查之前4小時用測試化合物對所有組投藥,同時在第7天在腹膜內葡萄糖篩查之前4小時投與GLP-1類似物-Fcγ4融合物,同時所有其他組皆僅用媒劑投藥。對於實施IPGTT之每一天,在t=0用1.5g/kg葡萄糖之腹膜內葡萄糖載量對所有小鼠進行篩查。在t=-240分鐘及0分鐘量測血糖以建立基線,且在t=15分鐘、30分鐘、45分鐘、60分鐘、90分鐘及120分鐘量測以監測對葡萄糖偏移之效應。
第0天及第7天IPGTT之結果呈現於圖47A-B中。
為評價HS9_DSB7_V19A中之GLP-1組份對體重之效應,在整個研究過程期間每天將所有動物稱重。對體重之效應呈現於48A-B中。
為建立體重降低之劑量反應,每週一次(QW)以3mg/kg、10mg/kg及30mg/kg將HS9_DSB7_V19A皮下投與飲食誘導之肥胖小鼠。研究持續時間為28天且主要終點係體重降低。血糖參數之次要評估包括包含在整個研究過程期間之進食葡萄糖及終末空腹葡萄糖量測之分析。如在DIO及db/db小鼠二者中之先前研究中,每週兩次(BIW)以1mg/kg皮下投與GLP-1類似物-Fcγ4融合物作為葡萄糖控制及體重減輕二者之陽性對照。
自Jackson實驗室獲得在研究開始之前食用60%高脂肪飲食15週之雄性21週齡DIO小鼠(JAX:380050)。在即將開始研究之前,基於體重將動物隨機化至5組中(n=8隻動物/組)。
實驗組(n=8/組)如下:
第1組:媒劑對照
第2組:HS9_DSB7_V19A-3mg/kg皮下劑量-每週一次(QW)
第3組:HS9_DSB7_V19A-10mg/kg皮下劑量-每週一次(QW)
第4組:HS9_DSB7_V19A-30mg/kg皮下劑量-每週一次(QW)
第5組:GLP-1類似物-Fcγ4融合物-1mg/kg皮下劑量-每週兩次投藥(BIW)
為評價HS9_DSB7_V19A中之GLP-1組份對體重之效應(此研究之主要終點),在整個研究過程期間每天對所有動物稱重。對體重之效應呈現於圖49中。
作為次要終點且為評價HS9_DSB7_V19A中之GLP-1組份在每週投藥設定中對血糖控制之效應,在第0天、第7天、第11天、第14天、第21天及第26天量測進食葡萄糖且在研究即將結束之前(第28天)量測
空腹葡萄糖。結果呈現於圖50A-B中。
認為上文書面說明足以使得熟習此項技術者能實踐該等實施例。以上說明及實例詳述某些實施例且闡述本發明者預計之最佳模式。然而,應瞭解,不論上文文本呈現有多詳細,可以多種方式實踐該等實施例且申請專利範圍包括其任何等效形式。
<110> 美商麥迪紐有限責任公司
英商梅迪繆思有限公司
<120> 抗-PCSK9-GLP-1融合物及其使用方法
<130> PCSK-100TW1
<140> 104105983
<141> 2015-02-24
<150> 61/944,550
<151> 2014-02-25
<150> 61/943,300
<151> 2014-02-21
<160> 510
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 1
<210> 2
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 2
<210> 3
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 3
<210> 4
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成肽
<400> 4
<210> 5
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 5
<210> 6
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 6
<210> 7
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 7
<210> 8
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 8
<210> 9
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 9
<210> 10
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 10
<210> 11
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 11
<210> 12
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 12
<210> 13
<211> 57
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 13
<210> 14
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成肽
<400> 14
<210> 15
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成肽
<400> 15
<210> 16
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成肽
<400> 16
<210> 17
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成肽
<400> 17
<210> 18
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成肽
<400> 18
<210> 19
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成肽
<400> 19
<210> 20
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成肽
<400> 20
<210> 21
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成肽
<400> 21
<210> 22
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成肽
<400> 22
<210> 23
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成肽
<400> 23
<210> 24
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成肽
<400> 24
<210> 25
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成肽
<400> 25
<210> 26
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成肽
<400> 26
<210> 27
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成肽
<400> 27
<210> 28
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 28
<210> 29
<211> 31
<212> PRT
<213> 智人
<400> 29
<210> 30
<211> 53
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 30
<210> 31
<211> 53
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 31
<210> 32
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 32
<210> 33
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 33
<210> 34
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 34
<210> 35
<211> 53
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 35
<210> 36
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 36
<210> 37
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 37
<210> 38
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 38
<210> 39
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 39
<210> 40
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 40
<210> 41
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 41
<210> 42
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 42
<210> 43
<211> 155
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 43
<210> 44
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 44
<210> 45
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 45
<210> 46
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 46
<210> 47
<211> 164
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 47
<210> 48
<211> 177
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 48
<210> 49
<211> 163
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 49
<210> 50
<211> 155
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 50
<210> 51
<211> 165
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 51
<210> 52
<211> 164
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 52
<210> 53
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 53
<210> 54
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 54
<210> 55
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 55
<210> 56
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 56
<210> 57
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 57
<210> 58
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 58
<210> 59
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 59
<210> 60
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 60
<210> 61
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 61
<210> 62
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 62
<210> 63
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 63
<210> 64
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 64
<210> 65
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 65
<210> 66
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 66
<210> 67
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 67
<210> 68
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 68
<210> 69
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 69
<210> 70
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 70
<210> 71
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 71
<210> 72
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 72
<210> 73
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 73
<210> 74
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 74
<210> 75
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 75
<210> 76
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 76
<210> 77
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 77
<210> 78
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 78
<210> 79
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 79
<210> 80
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 80
<210> 81
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 81
<210> 82
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 82
<210> 83
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 83
<210> 84
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 84
<210> 85
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 85
<210> 86
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 86
<210> 87
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 87
<210> 88
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 88
<210> 89
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 89
<210> 90
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 90
<210> 91
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 91
<210> 92
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 92
<210> 93
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 93
<210> 94
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 94
<210> 95
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 95
<210> 96
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 96
<210> 97
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 97
<210> 98
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 98
<210> 99
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 99
<210> 100
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 100
<210> 101
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 101
<210> 102
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 102
<210> 103
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 103
<210> 104
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 104
<210> 105
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 105
<210> 106
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 106
<210> 107
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 107
<210> 108
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 108
<210> 109
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 109
<210> 110
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 110
<210> 111
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 111
<210> 112
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 112
<210> 113
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 113
<210> 114
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 114
<210> 115
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 115
<210> 116
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 116
<210> 117
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 117
<210> 118
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 118
<210> 119
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 119
<210> 120
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 120
<210> 121
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 121
<210> 122
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 122
<210> 123
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 123
<210> 124
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 124
<210> 125
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 125
<210> 126
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 126
<210> 127
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 127
<210> 128
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 128
<210> 129
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 129
<210> 130
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 130
<210> 131
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 131
<210> 132
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 132
<210> 133
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 133
<210> 134
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 134
<210> 135
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 135
<210> 136
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 136
<210> 137
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 137
<210> 138
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 138
<210> 139
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 139
<210> 140
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 140
<210> 141
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 141
<210> 142
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 142
<210> 143
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 143
<210> 144
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 144
<210> 145
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 145
<210> 146
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 146
<210> 147
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 147
<210> 148
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 148
<210> 149
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 149
<210> 150
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 150
<210> 151
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 151
<210> 152
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 152
<210> 153
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 153
<210> 154
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 154
<210> 155
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 155
<210> 156
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 156
<210> 157
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 157
<210> 158
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 158
<210> 159
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 159
<210> 160
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 160
<210> 161
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 161
<210> 162
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 162
<210> 163
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 163
<210> 164
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 164
<210> 165
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 165
<210> 166
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 166
<210> 167
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 167
<210> 168
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 168
<210> 169
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 169
<210> 170
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 170
<210> 171
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 171
<210> 172
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 172
<210> 173
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 173
<210> 174
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 174
<210> 175
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 175
<210> 176
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 176
<210> 177
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 177
<210> 178
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 178
<210> 179
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 179
<210> 180
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 180
<210> 181
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 181
<210> 182
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 182
<210> 183
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 183
<210> 184
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 184
<210> 185
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 185
<210> 186
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 186
<210> 187
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 187
<210> 188
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 188
<210> 189
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 189
<210> 190
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 190
<210> 191
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 191
<210> 192
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 192
<210> 193
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 193
<210> 194
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 194
<210> 195
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 195
<210> 196
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 196
<210> 197
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 197
<210> 198
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 198
<210> 199
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 199
<210> 200
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 200
<210> 201
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 201
<210> 202
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 202
<210> 203
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 203
<210> 204
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 204
<210> 205
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 205
<210> 206
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 206
<210> 207
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 207
<210> 208
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 208
<210> 209
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 209
<210> 210
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 210
<210> 211
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 211
<210> 212
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 212
<210> 213
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 213
<210> 214
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 214
<210> 215
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 215
<210> 216
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 216
<210> 217
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 217
<210> 218
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 218
<210> 219
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 219
<210> 220
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 220
<210> 221
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 221
<210> 222
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 222
<210> 223
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 223
<210> 224
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 224
<210> 225
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 225
<210> 226
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 226
<210> 227
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 227
<210> 228
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 228
<210> 229
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 229
<210> 230
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 230
<210> 231
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 231
<210> 232
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 232
<210> 233
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 233
<210> 234
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 234
<210> 235
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 235
<210> 236
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 236
<210> 237
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 237
<210> 238
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 238
<210> 239
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 239
<210> 240
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 240
<210> 241
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 241
<210> 242
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 242
<210> 243
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 243
<210> 244
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 244
<210> 245
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 245
<210> 246
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 246
<210> 247
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 247
<210> 248
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 248
<210> 249
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 249
<210> 250
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 250
<210> 251
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 251
<210> 252
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 252
<210> 253
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 253
<210> 254
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 254
<210> 255
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 255
<210> 256
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 256
<210> 257
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 257
<210> 258
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 258
<210> 259
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 259
<210> 260
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 260
<210> 261
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 261
<210> 262
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 262
<210> 263
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 263
<210> 264
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 264
<210> 265
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 265
<210> 266
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 266
<210> 267
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 267
<210> 268
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 268
<210> 269
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 269
<210> 270
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 270
<210> 271
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 271
<210> 272
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 272
<210> 273
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 273
<210> 274
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 274
<210> 275
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 275
<210> 276
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 276
<210> 277
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 277
<210> 278
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 278
<210> 279
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 279
<210> 280
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 280
<210> 281
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 281
<210> 282
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 282
<210> 283
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 283
<210> 284
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 284
<210> 285
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 285
<210> 286
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 286
<210> 287
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 287
<210> 288
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 288
<210> 289
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 289
<210> 290
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 290
<210> 291
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 291
<210> 292
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 292
<210> 293
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 293
<210> 294
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 294
<210> 295
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 295
<210> 296
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 296
<210> 297
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 297
<210> 298
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 298
<210> 299
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 299
<210> 300
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 300
<210> 301
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 301
<210> 302
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 302
<210> 303
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 303
<210> 304
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 304
<210> 305
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 305
<210> 306
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 306
<210> 307
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 307
<210> 308
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 308
<210> 309
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 309
<210> 310
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 310
<210> 311
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 311
<210> 312
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 312
<210> 313
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 313
<210> 314
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 314
<210> 315
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 315
<210> 316
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 316
<210> 317
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 317
<210> 318
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 318
<210> 319
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 319
<210> 320
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 320
<210> 321
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 321
<210> 322
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 322
<210> 323
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 323
<210> 324
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 324
<210> 325
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 325
<210> 326
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 326
<210> 327
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 327
<210> 328
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> Asn或Asp
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> Trp或Tyr
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> Ser、Thr或Ala
<400> 328
<210> 329
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> Ile、Arg、Trp、Leu或Met
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> Tyr或Asp
<220>
<221> MOD_RES
<222> (13)..(13)
<223> Asn、Arg、His、Ser、Lys或Gln
<220>
<221> MOD_RES
<222> (15)..(15)
<223> Ser或Asn
<220>
<221> MOD_RES
<222> (16)..(16)
<223> Pro、Gln或His
<220>
<221> MOD_RES
<222> (17)..(17)
<223> Ser、Lys、Asn或Arg
<400> 329
<210> 330
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Tyr、Arg或His
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> Trp、Tyr、Gly、Ala或Phe
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> Tyr或Ser
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> Lys、Arg、Thr、Gly、Ser、Asp、Glu、His或Asn
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> Pro、Ser、Gly、Asp、Ala、His、Arg或Tyr
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> Leu、Tyr、Phe、Ala、Asp、His、Pro或Ser
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> Phe或Ser
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> Ile、Val、Tyr、Phe或Asn
<400> 330
<210> 331
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> Ile或Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (13)..(13)
<223> Asn、Arg、His或Ser
<220>
<221> MOD_RES
<222> (16)..(16)
<223> Pro或Gln
<400> 331
<210> 332
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> Lys、Gly、Arg、Ser、Asp、Glu、His、Asn或Gln
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> Pro、Gly、Asp、Ser、Ala、His、Arg或Tyr
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> Leu、Ala、Tyr、Asp、Phe、His、Pro、Ser或Val
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> Ile、Tyr、Phe或Asn
<400> 332
<210> 333
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> Arg、Lys、His、Asn、Gln或Ser
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> Leu或Phe
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> Tyr或His
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> Ser、Arg或Gly
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> Asn或Thr
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> Asn、Arg、His或Ser
<220>
<221> MOD_RES
<222> (15)..(15)
<223> Tyr或Phe
<220>
<221> MOD_RES
<222> (17)..(17)
<223> Ala或Thr
<400> 333
<210> 334
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> Trp、Phe或Leu
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> Ala或Thr
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> Thr、Ile、Ala或Val
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> Glu、Ala或Lys
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> Ser或Thr
<400> 334
<210> 335
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> Ser或Tyr
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> Ser或Thr
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> Phe、Tyr、Leu、Thr、His、Ile、Asn、Pro或Ser
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> Ile、Arg、Val、Tyr、Asp、Phe、Gly、His、Leu、Asn或Ser
<400> 335
<210> 336
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (15)..(15)
<223> Tyr或Phe
<220>
<221> MOD_RES
<222> (17)..(17)
<223> Ala或Thr
<400> 336
<210> 337
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> Trp、Phe或Leu
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> Glu或Lys
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> Ser或Thr
<400> 337
<210> 338
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> Phe、Tyr、Thr、Ile、Asn或Ser
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> Ile、Tyr、Arg、Phe、His、Leu、Asn或Ser
<400> 338
<210> 339
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (31)..(31)
<223> Asn或Asp
<220>
<221> MOD_RES
<222> (33)..(33)
<223> Trp或Tyr
<220>
<221> MOD_RES
<222> (35)..(35)
<223> Ser、Thr或Ala
<220>
<221> MOD_RES
<222> (50)..(50)
<223> Ile、Arg、Trp、Leu或Met
<220>
<221> MOD_RES
<222> (57)..(57)
<223> Tyr或Asp
<220>
<221> MOD_RES
<222> (59)..(59)
<223> Asn、Arg、His、Ser、Lys或Gln
<220>
<221> MOD_RES
<222> (61)..(61)
<223> Ser或Asn
<220>
<221> MOD_RES
<222> (62)..(62)
<223> Pro、Gln或His
<220>
<221> MOD_RES
<222> (63)..(63)
<223> Ser、Lys、Asn或Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (100)..(100)
<223> Tyr、Arg或His
<220>
<221> MOD_RES
<222> (101)..(101)
<223> Trp、Tyr或Gly
<220>
<221> MOD_RES
<222> (102)..(102)
<223> Tyr或Ser
<220>
<221> MOD_RES
<222> (103)..(103)
<223> Lys、Arg、Thr、Gly、Ser、Asp、Glu、His、Asn或Gln
<220>
<221> MOD_RES
<222> (104)..(104)
<223> Pro、Ser、Gly、Asp、Ala、His、Arg或Tyr
<220>
<221> MOD_RES
<222> (105)..(105)
<223> Leu、Tyr、Phe、Ala、Asp、His、Pro、Ser或Val
<220>
<221> MOD_RES
<222> (106)..(106)
<223> Phe或Ser
<220>
<221> MOD_RES
<222> (108)..(108)
<223> Ile、Val、Tyr、Phe或Asn
<400> 339
<210> 340
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (31)..(31)
<223> Asn或Asp
<220>
<221> MOD_RES
<222> (33)..(33)
<223> Trp或Tyr
<220>
<221> MOD_RES
<222> (35)..(35)
<223> Ser、Thr或Ala
<220>
<221> MOD_RES
<222> (50)..(50)
<223> Ile或Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (59)..(59)
<223> Asn、Arg、His、Ser、Lys或Gln
<220>
<221> MOD_RES
<222> (62)..(62)
<223> Pro或Gln
<220>
<221> MOD_RES
<222> (103)..(103)
<223> Lys、Gly、Arg、Ser、Asp、Glu、His、Asn或Gln
<220>
<221> MOD_RES
<222> (104)..(104)
<223> Pro、Gly、Asp、Ser、Ala、His、Arg或Tyr
<220>
<221> MOD_RES
<222> (105)..(105)
<223> Leu、Ala、Tyr、Asp、Phe、His、Pro、Ser或Val
<220>
<221> MOD_RES
<222> (108)..(108)
<223> Ile、Tyr、Phe或Asn
<400> 340
<210> 341
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (24)..(24)
<223> Arg、Lys、His、Asn、Gln或Ser
<220>
<221> MOD_RES
<222> (30)..(30)
<223> Leu或Phe
<220>
<221> MOD_RES
<222> (31)..(31)
<223> Tyr或His
<220>
<221> MOD_RES
<222> (33)..(33)
<223> Ser、Arg或Gly
<220>
<221> MOD_RES
<222> (34)..(34)
<223> Asn或Thr
<220>
<221> MOD_RES
<222> (35)..(35)
<223> Asn、Arg、His或Ser
<220>
<221> MOD_RES
<222> (38)..(38)
<223> Tyr或Phe
<220>
<221> MOD_RES
<222> (40)..(40)
<223> Ala或Thr
<220>
<221> MOD_RES
<222> (56)..(56)
<223> Trp、Phe或Leu
<220>
<221> MOD_RES
<222> (57)..(57)
<223> Ala或Thr
<220>
<221> MOD_RES
<222> (59)..(59)
<223> Thr、Ile、Ala或Val
<220>
<221> MOD_RES
<222> (61)..(61)
<223> Glu、Ala或Lys
<220>
<221> MOD_RES
<222> (62)..(62)
<223> Ser或Thr
<220>
<221> MOD_RES
<222> (98)..(98)
<223> Ser或Tyr
<220>
<221> MOD_RES
<222> (99)..(99)
<223> Ser或Thr
<220>
<221> MOD_RES
<222> (100)..(100)
<223> Phe、Tyr、Leu、Thr、His、Ile、Asn、Pro或Ser
<220>
<221> MOD_RES
<222> (102)..(102)
<223> Ile、Arg、Val、Tyr、Asp、Phe、Gly、His、Leu、Asn或Ser
<400> 341
<210> 342
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (38)..(38)
<223> Tyr或Phe
<220>
<221> MOD_RES
<222> (40)..(40)
<223> Ala或Thr
<220>
<221> MOD_RES
<222> (56)..(56)
<223> Trp、Phe或Leu
<220>
<221> MOD_RES
<222> (61)..(61)
<223> Glu或Lys
<220>
<221> MOD_RES
<222> (62)..(62)
<223> Ser或Thr
<220>
<221> MOD_RES
<222> (100)..(100)
<223> Phe、Tyr、Thr、Ile、Asn或Ser
<220>
<221> MOD_RES
<222> (102)..(102)
<223> Ile、Tyr、Arg、Phe、His、Leu、Asn或Ser
<400> 342
<210> 343
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 343
<210> 344
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 344
<210> 345
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 345
<210> 346
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 346
<210> 347
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 347
<210> 348
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 348
<210> 349
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 349
<210> 350
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 350
<210> 351
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 351
<210> 352
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 352
<210> 353
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 353
<210> 354
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 354
<210> 355
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 355
<210> 356
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 356
<210> 357
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 357
<210> 358
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 358
<210> 359
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 359
<210> 360
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 360
<210> 361
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 361
<210> 362
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 362
<210> 363
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 363
<210> 364
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 364
<210> 365
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 365
<210> 366
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 366
<210> 367
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 367
<210> 368
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 368
<210> 369
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 369
<210> 370
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 370
<210> 371
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 371
<210> 372
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 372
<210> 373
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 373
<210> 374
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 374
<210> 375
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 375
<210> 376
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 376
<210> 377
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 377
<210> 378
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 378
<210> 379
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 379
<210> 380
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 380
<210> 381
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 381
<210> 382
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 382
<210> 383
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 383
<210> 384
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 384
<210> 385
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 385
<210> 386
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 386
<210> 387
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 387
<210> 388
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 388
<210> 389
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 389
<210> 390
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 390
<210> 391
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 391
<210> 392
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 392
<210> 393
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 393
<210> 394
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 394
<210> 395
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 395
<210> 396
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 396
<210> 397
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 397
<210> 398
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 398
<210> 399
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 399
<210> 400
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 400
<210> 401
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成肽
<400> 401
<210> 402
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成肽
<400> 402
<210> 403
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成肽
<400> 403
<210> 404
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 404
<210> 405
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 405
<210> 406
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 406
<210> 407
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 407
<210> 408
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 408
<210> 409
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 409
<210> 410
<211> 131
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 410
<210> 411
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 411
<210> 412
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 412
<210> 413
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 413
<210> 414
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 414
<210> 415
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 415
<210> 416
<211> 228
<212> PRT
<213> 智人
<400> 416
<210> 417
<211> 99
<212> PRT
<213> 智人
<400> 417
<210> 418
<211> 90
<212> PRT
<213> 智人
<400> 418
<210> 419
<211> 266
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 419
<210> 420
<211> 261
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 420
<210> 421
<211> 256
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 421
<210> 422
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 422
<210> 423
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 423
<210> 424
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 424
<210> 425
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 425
<210> 426
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 426
<210> 427
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 427
<210> 428
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 428
<210> 429
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 429
<210> 430
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 430
<210> 431
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 431
<210> 432
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 432
<210> 433
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 433
<210> 434
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 434
<210> 435
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 435
<210> 436
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 436
<210> 437
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 437
<210> 438
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 438
<210> 439
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 439
<210> 440
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 440
<210> 441
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 441
<210> 442
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 442
<210> 443
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 443
<210> 444
<211> 164
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 444
<210> 445
<211> 164
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 445
<210> 446
<211> 164
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 446
<210> 447
<211> 164
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 447
<210> 448
<211> 164
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 448
<210> 449
<211> 164
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 449
<210> 450
<211> 164
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 450
<210> 451
<211> 164
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 451
<210> 452
<211> 164
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 452
<210> 453
<211> 164
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 453
<210> 454
<211> 164
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 454
<210> 455
<211> 164
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 455
<210> 456
<211> 164
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 456
<210> 457
<211> 164
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 457
<210> 458
<211> 164
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 458
<210> 459
<211> 164
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 459
<210> 460
<211> 164
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 460
<210> 461
<211> 164
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 461
<210> 462
<211> 164
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 462
<210> 463
<211> 164
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 463
<210> 464
<211> 164
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 464
<210> 465
<211> 164
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 465
<210> 466
<211> 164
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 466
<210> 467
<211> 164
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 467
<210> 468
<211> 164
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 468
<210> 469
<211> 164
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 469
<210> 470
<211> 164
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 470
<210> 471
<211> 164
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 471
<210> 472
<211> 164
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 472
<210> 473
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 473
<210> 474
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 474
<210> 475
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 475
<210> 476
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 476
<210> 477
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 477
<210> 478
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 478
<210> 479
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 479
<210> 480
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 480
<210> 481
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 481
<210> 482
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成肽
<400> 482
<210> 483
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成肽
<400> 483
<210> 484
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成肽
<400> 484
<210> 485
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成肽
<400> 485
<210> 486
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成肽
<400> 486
<210> 487
<211> 176
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 487
<210> 488
<211> 162
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 488
<210> 489
<211> 154
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 489
<210> 490
<211> 164
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 490
<210> 491
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 491
<210> 492
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 492
<210> 493
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成肽
<400> 493
<210> 494
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成肽
<400> 494
<210> 495
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成肽
<400> 495
<210> 496
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成肽
<400> 496
<210> 497
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成肽
<400> 497
<210> 498
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成肽
<400> 498
<210> 499
<211> 98
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 499
<210> 500
<211> 90
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 500
<210> 501
<211> 47
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 501
<210> 502
<211> 47
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 502
<210> 503
<211> 47
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 503
<210> 504
<211> 47
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 504
<210> 505
<211> 47
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 505
<210> 506
<211> 47
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 506
<210> 507
<211> 47
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 507
<210> 508
<211> 47
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 508
<210> 509
<211> 47
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成多肽
<400> 509
<210> 510
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之說明:合成肽
<400> 510
Claims (40)
- 一種用於治療糖尿病之雙重活性融合分子,其包含抗-PCSK9抗體穩定融合至GLP-1肽,其中該抗-PCSK9抗體結合PCSK9多肽且該GLP-1肽結合GLP-1受體。
- 如請求項1之融合分子,其中該GLP-1肽經由連接體肽融合至該PCSK9抗體。
- 如請求項2之融合分子,其中該連接體肽融合至該GLP-1肽之C端。
- 如請求項1至3中任一項之融合分子,其中該GLP-1肽包含SEQ ID NO:36之胺基酸序列。
- 如請求項1至3中任一項之融合分子,其中該GLP-1肽包含SEQ ID NO:3之胺基酸序列。
- 如請求項5之融合分子,其中該GLP-1肽之Cys18與該GLP-1肽之C端形成二硫鍵。
- 如請求項1至6中任一項之融合分子,其中該融合分子在動物中控制葡萄糖及/或減少LDL。
- 如請求項7之融合分子,其中該動物係人類。
- 一種用於治療糖尿病之雙重活性融合分子,其包含抗-PCSK9抗體穩定融合至包含SEQ ID NO:3之胺基酸序列之GLP-1肽,其中該GLP-1肽之C端經由肽連接體融合至該抗-PCSK9抗體,且其中該抗-PCSK9抗體結合PCSK9多肽且該GLP-1肽結合GLP-1受體。
- 如請求項9之雙重活性融合分子,其中該GLP-1肽經由肽連接體融合至該抗-PCSK9抗體之輕鏈。
- 如請求項9之雙重活性融合分子,其中該GLP-1肽經由肽連接體融合至該抗-PCSK9抗體之重鏈。
- 一種雙重活性融合分子,其包含抗體穩定融合至包含SEQ ID NO:3之胺基酸序列之GLP-1肽,其中該GLP-1肽之C端經由肽連接體融合至該抗體,且其中該抗體結合靶多肽及該GLP-1肽結合GLP-1受體。
- 如請求項12之雙重活性融合分子,其中該抗體係抗-PCSK9抗體。
- 如請求項13之雙重活性融合分子,其中該GLP-1肽經由肽連接體融合至該抗-PCSK9抗體之輕鏈。
- 如請求項13之雙重活性融合分子,其中該GLP-1肽經由肽連接體融合至該抗-PCSK9抗體之重鏈。
- 如請求項10或14之雙重活性融合分子,其中該抗-PCSK9抗體之輕鏈與SEQ ID NO:2之胺基酸序列至少90%一致。
- 如請求項16之雙重活性融合分子,其中該抗-PCSK9抗體之輕鏈包含SEQ ID NO:2之胺基酸序列。
- 如請求項11或15之雙重活性融合分子,其中該抗-PCSK9抗體之重鏈與SEQ ID NO:1之胺基酸序列至少90%一致。
- 如請求項18之雙重活性融合分子,其中該抗-PCSK9抗體之重鏈包含SEQ ID NO:1之胺基酸序列。
- 如請求項12至19中任一項之雙重活性融合分子,其中該肽連接體包含SEQ ID NO:4之胺基酸序列。
- 如請求項12至20中任一項之雙重活性融合分子,其中該雙重活性融合分子用於治療糖尿病。
- 如請求項12至21中任一項之雙重活性融合分子,其中該GLP-1肽之Cys18與該GLP-1肽之C端形成二硫鍵。
- 如請求項12至22中任一項之雙重活性融合分子,其中該雙重活性融合分子在動物中控制葡萄糖及/或減少LDL。
- 如請求項23之雙重活性融合分子,其中該動物係人類。
- 一種用於治療糖尿病之雙重活性融合分子,其包含抗-PCSK9抗體穩定融合至與包含SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:29之胺基酸序列之GLP-1肽相比在人類GLP-1受體具有降低效能之GLP-1肽,其中該GLP-1肽之C端經由肽連接體融合至該抗-PCSK9抗體,且其中該抗-PCSK9抗體結合PCSK9多肽且該GLP-1肽結合GLP-1受體。
- 如請求項25之雙重活性融合分子,其中使用包含SEQ ID NO:4之連接體將包含SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:29之胺基酸序列之該GLP-1肽融合至包含SEQ ID NO:416之胺基酸序列。
- 如請求項25或26之雙重活性融合分子,其中與包含SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:29之胺基酸序列之GLP-1肽相比,在人類GLP-1受體之效能降低至30分之一至60分之一。
- 一種治療2型糖尿病之方法,其包含向有需要之個體投與如請求項1至27中任一項之融合分子。
- 一種控制個體之葡萄糖之方法,其包含向有需要之個體投與如請求項1至27中任一項之融合分子。
- 一種減少個體之低密度脂蛋白(LDL)之方法,其包含向有需要之個體投與如請求項1至27中任一項之融合分子。
- 一種在個體中控制葡萄糖並減少LDL之方法,其包含向有需要之個體投與如請求項1至27中任一項之融合分子。
- 一種在個體中促進體重減輕、控制葡萄糖並減少LDL之方法,其包含向有需要之個體投與如請求項1至27中任一項之融合分子。
- 如請求項28至32中任一項之方法,其中該個體患有2型糖尿病。
- 如請求項28至32中任一項之方法,其中該個體患有代謝症候群。
- 一種經分離之多核苷酸,其編碼如請求項1至27中任一項之融合分子。
- 一種載體,其包含如請求項35之多核苷酸。
- 一種宿主細胞,其包含如請求項35之多核苷酸或如請求項36之載體。
- 一種製造如請求項1至27中任一項之融合分子之方法,其包含如請求項37之宿主細胞在容許表現該融合分子之條件下培養,及回收該融合分子。
- 一種醫藥組合物,其包含如請求項1至27中任一項之融合分子及載劑。
- 一種套組,其包含如請求項39之組合物。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201461943300P | 2014-02-21 | 2014-02-21 | |
US201461944550P | 2014-02-25 | 2014-02-25 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
TW201538523A true TW201538523A (zh) | 2015-10-16 |
Family
ID=53879052
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
TW104105983A TW201538523A (zh) | 2014-02-21 | 2015-02-24 | 抗-pcsk9~glp-1融合物及其使用方法 |
Country Status (12)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US10077319B2 (zh) |
EP (1) | EP3107937A4 (zh) |
JP (1) | JP2017512457A (zh) |
KR (1) | KR20160124787A (zh) |
CN (1) | CN106232627A (zh) |
BR (1) | BR112016017402A2 (zh) |
CA (1) | CA2935285A1 (zh) |
MX (1) | MX2016009858A (zh) |
RU (1) | RU2016137264A (zh) |
SG (1) | SG11201606684YA (zh) |
TW (1) | TW201538523A (zh) |
WO (1) | WO2015127273A1 (zh) |
Families Citing this family (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US10058630B2 (en) * | 2012-10-22 | 2018-08-28 | Concievalve, Llc | Methods for inhibiting stenosis, obstruction, or calcification of a stented heart valve or bioprosthesis |
US20170198059A1 (en) * | 2014-07-14 | 2017-07-13 | Amgen Inc. | Crystalline antibody formulations |
MA40475A (fr) | 2014-08-19 | 2017-06-28 | Fayadat Dilman Laurence | Anticorps anti-tigit |
EP3334757A4 (en) | 2015-08-14 | 2019-04-03 | Merck Sharp & Dohme Corp. | ANTI-TIGIT ANTIBODIES |
RU2747877C2 (ru) | 2016-01-13 | 2021-05-17 | Ново Нордиск А/С | Аналоги эфр(а) с заместителями - жирными кислотами |
CN108699126B (zh) | 2016-03-03 | 2022-12-06 | 诺和诺德股份有限公司 | Glp-1衍生物及其用途 |
CA3027487A1 (en) | 2016-06-14 | 2017-12-21 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Anti-c5 antibodies and uses thereof |
WO2018026742A1 (en) * | 2016-08-01 | 2018-02-08 | Askgene Pharma Inc. | Novel antibody-albumin-drug conjugates (aadc) and methods for using them |
US11130794B2 (en) | 2017-07-19 | 2021-09-28 | Novo Nordisk A/S | Bifunctional compounds |
US11365265B2 (en) | 2017-12-13 | 2022-06-21 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Anti-C5 antibody combinations and uses thereof |
TW202028229A (zh) | 2018-10-05 | 2020-08-01 | 丹麥商諾佛 儂迪克股份有限公司 | 包含胰島素肽及egf(a)肽之雙功能化合物 |
WO2021029698A1 (ko) * | 2019-08-13 | 2021-02-18 | 애니젠 주식회사 | 엑세나타이드 유사체 및 이의 용도 |
Family Cites Families (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP2505207B1 (en) * | 2005-01-14 | 2015-04-22 | Wuxi Grandchamp Pharmaceutical Technology Co., Ltd. | Modified exendins and uses thereof |
EP4049673A1 (en) * | 2007-01-08 | 2022-08-31 | The Trustees of the University of Pennsylvania | Glp-1 receptor antagonist for use in the treatment of post-prandial hypoglycemia or congenital hyperinsulinism |
WO2009020802A2 (en) * | 2007-08-03 | 2009-02-12 | Eli Lilly And Company | Treatment for obesity |
MA33221B1 (fr) * | 2009-03-27 | 2012-04-02 | Glaxo Group Ltd | Fusions de médicament et conjugués afférents |
CN101665799A (zh) * | 2009-06-29 | 2010-03-10 | 华东师范大学 | 一种Exendin-4衍生物的重组制备方法和应用 |
CN101993485B (zh) * | 2009-08-20 | 2013-04-17 | 重庆富进生物医药有限公司 | 促胰岛素分泌肽类似物同源二聚体及其用途 |
SG10201507722QA (en) | 2010-03-11 | 2015-10-29 | Rinat Neuroscience Corp | ANTIBODIES WITH pH DEPENDENT ANTIGEN BINDING |
WO2011149999A2 (en) | 2010-05-27 | 2011-12-01 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Method for preparing antibodies having improved properties |
JOP20200043A1 (ar) * | 2011-05-10 | 2017-06-16 | Amgen Inc | طرق معالجة أو منع الاضطرابات المختصة بالكوليسترول |
US9255154B2 (en) * | 2012-05-08 | 2016-02-09 | Alderbio Holdings, Llc | Anti-PCSK9 antibodies and use thereof |
TWI513705B (zh) | 2012-06-11 | 2015-12-21 | Lilly Co Eli | 纖維母細胞生長因子21蛋白質 |
TW201625669A (zh) * | 2014-04-07 | 2016-07-16 | 賽諾菲公司 | 衍生自艾塞那肽-4(Exendin-4)之肽類雙重GLP-1/升糖素受體促效劑 |
TW201625668A (zh) * | 2014-04-07 | 2016-07-16 | 賽諾菲公司 | 作為胜肽性雙重glp-1/昇糖素受體激動劑之艾塞那肽-4衍生物 |
TW201625670A (zh) | 2014-04-07 | 2016-07-16 | 賽諾菲公司 | 衍生自exendin-4之雙重glp-1/升糖素受體促效劑 |
-
2015
- 2015-02-20 EP EP15752581.7A patent/EP3107937A4/en not_active Withdrawn
- 2015-02-20 BR BR112016017402A patent/BR112016017402A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2015-02-20 US US15/117,985 patent/US10077319B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2015-02-20 RU RU2016137264A patent/RU2016137264A/ru not_active Application Discontinuation
- 2015-02-20 SG SG11201606684YA patent/SG11201606684YA/en unknown
- 2015-02-20 WO PCT/US2015/016911 patent/WO2015127273A1/en active Application Filing
- 2015-02-20 MX MX2016009858A patent/MX2016009858A/es unknown
- 2015-02-20 CN CN201580009513.1A patent/CN106232627A/zh active Pending
- 2015-02-20 CA CA2935285A patent/CA2935285A1/en not_active Abandoned
- 2015-02-20 JP JP2016544406A patent/JP2017512457A/ja active Pending
- 2015-02-20 KR KR1020167024260A patent/KR20160124787A/ko unknown
- 2015-02-24 TW TW104105983A patent/TW201538523A/zh unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20160369010A1 (en) | 2016-12-22 |
CA2935285A1 (en) | 2015-08-27 |
MX2016009858A (es) | 2017-01-26 |
BR112016017402A2 (pt) | 2017-10-17 |
RU2016137264A (ru) | 2018-03-26 |
RU2016137264A3 (zh) | 2018-11-30 |
SG11201606684YA (en) | 2016-09-29 |
KR20160124787A (ko) | 2016-10-28 |
EP3107937A4 (en) | 2017-11-15 |
EP3107937A1 (en) | 2016-12-28 |
US10077319B2 (en) | 2018-09-18 |
JP2017512457A (ja) | 2017-05-25 |
WO2015127273A1 (en) | 2015-08-27 |
CN106232627A (zh) | 2016-12-14 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
TW201538523A (zh) | 抗-pcsk9~glp-1融合物及其使用方法 | |
JP7080955B2 (ja) | 遺伝子操作された免疫グロブリン重鎖-軽鎖対およびその使用 | |
EP2494062B1 (en) | Anti-glp-1r antibodies and their uses | |
JP7274417B2 (ja) | 4-1bb結合タンパク質及びその使用 | |
TWI773699B (zh) | 免疫球蛋白及其用途 | |
US20230324389A1 (en) | Compositions and methods related to activatable therapeutic agents | |
TW201617366A (zh) | 新穎抗人類Tie2抗體 | |
JP2020524661A (ja) | 胃抑制ペプチド受容体(gipr)に対するアンタゴニスト結合タンパク質/glp−1受容体アゴニスト融合タンパク質を使用した代謝障害の治療又は寛解方法 | |
KR102072650B1 (ko) | 성선 자극 호르몬의 생체 활성을 강화시키는 리간드 | |
CN117980328A (zh) | 活化的肝星状细胞(hsc)的消耗及其用途 | |
WO2023031615A1 (en) | Polypeptides | |
TW202210513A (zh) | 抗igf-1受體人源化抗體 | |
US20190092877A1 (en) | Anti-pcsk9-glp-1 fusions and methods for use | |
BR112021000391A2 (pt) | Composições e métodos relacionados a construtos do domínio de ligação fc-antígeno manipulado direcionado a ccr4 | |
WO2023030503A1 (en) | Anti-acvr2a antibodies and uses thereof | |
JP2023531790A (ja) | Fgfr1/klb標的化アゴニスト抗原結合タンパク質およびglp-1rアゴニストペプチドとのそのコンジュゲート | |
TW202337904A (zh) | IL-1β結合蛋白之材料及方法 | |
JP2024507823A (ja) | 免疫監視を増強するために制御性t細胞を標的化するための材料及び方法 | |
CN117545505A (zh) | 具有工程化抗体恒定区变体的分子 | |
KR20240070496A (ko) | 활성화된 간 성상세포(hscs)의 고갈 및 이의 용도 | |
CN117597365A (zh) | 多特异性fgf21受体激动剂及其应用 | |
CN117500836A (zh) | 用于免疫效应细胞重定向的材料和方法 | |
EA041709B1 (ru) | Иммуноглобулины и их применение |