CN117500836A - 用于免疫效应细胞重定向的材料和方法 - Google Patents
用于免疫效应细胞重定向的材料和方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117500836A CN117500836A CN202280039033.XA CN202280039033A CN117500836A CN 117500836 A CN117500836 A CN 117500836A CN 202280039033 A CN202280039033 A CN 202280039033A CN 117500836 A CN117500836 A CN 117500836A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- amino acid
- seq
- acid sequence
- cdr2
- cdr3
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title description 117
- 239000012642 immune effector Substances 0.000 title description 7
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 title description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 title description 6
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 838
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 207
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims abstract description 72
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 49
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 claims abstract description 42
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 claims abstract description 42
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 42
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 42
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims abstract description 38
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 23
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 20
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims abstract description 18
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 810
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 532
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 532
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 532
- 102100032870 Natural cytotoxicity triggering receptor 1 Human genes 0.000 claims description 363
- 108010004217 Natural Cytotoxicity Triggering Receptor 1 Proteins 0.000 claims description 356
- 102000006942 B-Cell Maturation Antigen Human genes 0.000 claims description 263
- BGFTWECWAICPDG-UHFFFAOYSA-N 2-[bis(4-chlorophenyl)methyl]-4-n-[3-[bis(4-chlorophenyl)methyl]-4-(dimethylamino)phenyl]-1-n,1-n-dimethylbenzene-1,4-diamine Chemical compound C1=C(C(C=2C=CC(Cl)=CC=2)C=2C=CC(Cl)=CC=2)C(N(C)C)=CC=C1NC(C=1)=CC=C(N(C)C)C=1C(C=1C=CC(Cl)=CC=1)C1=CC=C(Cl)C=C1 BGFTWECWAICPDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 262
- 108010008014 B-Cell Maturation Antigen Proteins 0.000 claims description 262
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 claims description 202
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 76
- 239000012636 effector Substances 0.000 claims description 40
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 37
- 101000589301 Homo sapiens Natural cytotoxicity triggering receptor 1 Proteins 0.000 claims description 9
- 101000589305 Homo sapiens Natural cytotoxicity triggering receptor 2 Proteins 0.000 claims description 6
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 abstract description 170
- 239000012634 fragment Substances 0.000 abstract description 111
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 abstract description 6
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 abstract description 6
- 101100112922 Candida albicans CDR3 gene Proteins 0.000 description 521
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 49
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 45
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 38
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 36
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 36
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 36
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 36
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 35
- 230000002998 immunogenetic effect Effects 0.000 description 33
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 32
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 31
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 30
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 29
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 26
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 description 25
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 25
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 24
- 101001109508 Homo sapiens NKG2-A/NKG2-B type II integral membrane protein Proteins 0.000 description 19
- 102100022682 NKG2-A/NKG2-B type II integral membrane protein Human genes 0.000 description 19
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 18
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 18
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 17
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 16
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 16
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 15
- 230000014828 interferon-gamma production Effects 0.000 description 14
- 230000006870 function Effects 0.000 description 13
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 13
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 12
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 10
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 10
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 10
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 10
- 241000894007 species Species 0.000 description 10
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 9
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 9
- 244000303258 Annona diversifolia Species 0.000 description 8
- 235000002198 Annona diversifolia Nutrition 0.000 description 8
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 8
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 8
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 8
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 8
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 8
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 8
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 8
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 8
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 8
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 7
- -1 IgG1 Chemical class 0.000 description 7
- 108091007491 NSP3 Papain-like protease domains Proteins 0.000 description 7
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 7
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 7
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 7
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 7
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 7
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 6
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 6
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 6
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 6
- 108010022366 Carcinoembryonic Antigen Proteins 0.000 description 5
- 102100025475 Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 5 Human genes 0.000 description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 5
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 5
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 5
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 5
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 5
- 102100022680 NKG2-D type II integral membrane protein Human genes 0.000 description 5
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 230000004540 complement-dependent cytotoxicity Effects 0.000 description 5
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 5
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 5
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 5
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 5
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 5
- 238000005305 interferometry Methods 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 5
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N Fucose Natural products C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N 0.000 description 4
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- 101001109501 Homo sapiens NKG2-D type II integral membrane protein Proteins 0.000 description 4
- SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N L-fucopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N 0.000 description 4
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 4
- 108010072866 Prostate-Specific Antigen Proteins 0.000 description 4
- 102100038358 Prostate-specific antigen Human genes 0.000 description 4
- 125000002228 disulfide group Chemical group 0.000 description 4
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 4
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 4
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 4
- 230000037432 silent mutation Effects 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 3
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 101000801255 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 17 Proteins 0.000 description 3
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 description 3
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 description 3
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 102100035703 Prostatic acid phosphatase Human genes 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 241001416177 Vicugna pacos Species 0.000 description 3
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 3
- 230000001270 agonistic effect Effects 0.000 description 3
- 102000013529 alpha-Fetoproteins Human genes 0.000 description 3
- 108010026331 alpha-Fetoproteins Proteins 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 3
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 238000007726 management method Methods 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 3
- 108010043671 prostatic acid phosphatase Proteins 0.000 description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 3
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 3
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 3
- VBICKXHEKHSIBG-UHFFFAOYSA-N 1-monostearoylglycerol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(O)CO VBICKXHEKHSIBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 102100025064 Cellular tumor antigen p53 Human genes 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 101150029707 ERBB2 gene Proteins 0.000 description 2
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000721661 Homo sapiens Cellular tumor antigen p53 Proteins 0.000 description 2
- 101000578784 Homo sapiens Melanoma antigen recognized by T-cells 1 Proteins 0.000 description 2
- 241000701806 Human papillomavirus Species 0.000 description 2
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 2
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 2
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 2
- 102100028389 Melanoma antigen recognized by T-cells 1 Human genes 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 2
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108060008683 Tumor Necrosis Factor Receptor Proteins 0.000 description 2
- 102100033726 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 17 Human genes 0.000 description 2
- 102000003425 Tyrosinase Human genes 0.000 description 2
- 108060008724 Tyrosinase Proteins 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 2
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 2
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 2
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 102000050738 human NCR1 Human genes 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 2
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 2
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 2
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 2
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 102000003298 tumor necrosis factor receptor Human genes 0.000 description 2
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 2
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 2
- LKKMLIBUAXYLOY-UHFFFAOYSA-N 3-Amino-1-methyl-5H-pyrido[4,3-b]indole Chemical compound N1C2=CC=CC=C2C2=C1C=C(N)N=C2C LKKMLIBUAXYLOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WEVYNIUIFUYDGI-UHFFFAOYSA-N 3-[6-[4-(trifluoromethoxy)anilino]-4-pyrimidinyl]benzamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CC(C=2N=CN=C(NC=3C=CC(OC(F)(F)F)=CC=3)C=2)=C1 WEVYNIUIFUYDGI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100030310 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid oxidase Human genes 0.000 description 1
- 101710163881 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid oxidase Proteins 0.000 description 1
- 108010032595 Antibody Binding Sites Proteins 0.000 description 1
- 101710145634 Antigen 1 Proteins 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 108091008875 B cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 102100035526 B melanoma antigen 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100021663 Baculoviral IAP repeat-containing protein 5 Human genes 0.000 description 1
- 241000070928 Calligonum comosum Species 0.000 description 1
- 241000282832 Camelidae Species 0.000 description 1
- 102100025570 Cancer/testis antigen 1 Human genes 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 description 1
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 108010008177 Fd immunoglobulins Proteins 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 239000004606 Fillers/Extenders Substances 0.000 description 1
- 102100039717 G antigen 1 Human genes 0.000 description 1
- 102000003688 G-Protein-Coupled Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108090000045 G-Protein-Coupled Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102100021197 G-protein coupled receptor family C group 5 member D Human genes 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 208000034951 Genetic Translocation Diseases 0.000 description 1
- 208000032612 Glial tumor Diseases 0.000 description 1
- 206010018338 Glioma Diseases 0.000 description 1
- 102100041003 Glutamate carboxypeptidase 2 Human genes 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 101000874316 Homo sapiens B melanoma antigen 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000856237 Homo sapiens Cancer/testis antigen 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000886137 Homo sapiens G antigen 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001040713 Homo sapiens G-protein coupled receptor family C group 5 member D Proteins 0.000 description 1
- 101000892862 Homo sapiens Glutamate carboxypeptidase 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000878605 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin epsilon Fc receptor Proteins 0.000 description 1
- 101001014223 Homo sapiens MAPK/MAK/MRK overlapping kinase Proteins 0.000 description 1
- 101001012157 Homo sapiens Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000655352 Homo sapiens Telomerase reverse transcriptase Proteins 0.000 description 1
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 1
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 1
- 108010031794 IGF Type 1 Receptor Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 102000009786 Immunoglobulin Constant Regions Human genes 0.000 description 1
- 108010009817 Immunoglobulin Constant Regions Proteins 0.000 description 1
- 102100023915 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102000048143 Insulin-Like Growth Factor II Human genes 0.000 description 1
- 108090001117 Insulin-Like Growth Factor II Proteins 0.000 description 1
- 102100039688 Insulin-like growth factor 1 receptor Human genes 0.000 description 1
- 102100034872 Kallikrein-4 Human genes 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 102100031413 L-dopachrome tautomerase Human genes 0.000 description 1
- 101710093778 L-dopachrome tautomerase Proteins 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 108010028275 Leukocyte Elastase Proteins 0.000 description 1
- 102100038007 Low affinity immunoglobulin epsilon Fc receptor Human genes 0.000 description 1
- 102100031520 MAPK/MAK/MRK overlapping kinase Human genes 0.000 description 1
- 241000282567 Macaca fascicularis Species 0.000 description 1
- 101100404851 Macaca fascicularis KLRK1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010046938 Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100028123 Macrophage colony-stimulating factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100022430 Melanocyte protein PMEL Human genes 0.000 description 1
- 102000003735 Mesothelin Human genes 0.000 description 1
- 108090000015 Mesothelin Proteins 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 101000589303 Mus musculus Natural cytotoxicity triggering receptor 1 Proteins 0.000 description 1
- GXCLVBGFBYZDAG-UHFFFAOYSA-N N-[2-(1H-indol-3-yl)ethyl]-N-methylprop-2-en-1-amine Chemical compound CN(CCC1=CNC2=C1C=CC=C2)CC=C GXCLVBGFBYZDAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010001657 NK Cell Lectin-Like Receptor Subfamily K Proteins 0.000 description 1
- 102100033174 Neutrophil elastase Human genes 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 102000043276 Oncogene Human genes 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 101710160107 Outer membrane protein A Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019483 Peanut oil Nutrition 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 241000009328 Perro Species 0.000 description 1
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 101000589306 Rattus norvegicus Natural cytotoxicity triggering receptor 1 Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102220492414 Ribulose-phosphate 3-epimerase_H35A_mutation Human genes 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 101710173693 Short transient receptor potential channel 1 Proteins 0.000 description 1
- 101710173694 Short transient receptor potential channel 2 Proteins 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100037253 Solute carrier family 45 member 3 Human genes 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 101800001271 Surface protein Proteins 0.000 description 1
- 108010002687 Survivin Proteins 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 108010017842 Telomerase Proteins 0.000 description 1
- 108010034949 Thyroglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000009843 Thyroglobulin Human genes 0.000 description 1
- LVTKHGUGBGNBPL-UHFFFAOYSA-N Trp-P-1 Chemical compound N1C2=CC=CC=C2C2=C1C(C)=C(N)N=C2C LVTKHGUGBGNBPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000044209 Tumor Suppressor Genes Human genes 0.000 description 1
- 108700025716 Tumor Suppressor Genes Proteins 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 238000012452 Xenomouse strains Methods 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000008484 agonism Effects 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150043733 artA gene Proteins 0.000 description 1
- 210000004507 artificial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000006664 bond formation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 239000012707 chemical precursor Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 1
- 229960004407 chorionic gonadotrophin Drugs 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 239000003405 delayed action preparation Substances 0.000 description 1
- 238000002716 delivery method Methods 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000000779 depleting effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 description 1
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 239000007884 disintegrant Substances 0.000 description 1
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000008175 fetal development Effects 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 1
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 description 1
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 1
- 239000003205 fragrance Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YQEMORVAKMFKLG-UHFFFAOYSA-N glycerine monostearate Natural products CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC(CO)CO YQEMORVAKMFKLG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SVUQHVRAGMNPLW-UHFFFAOYSA-N glycerol monostearate Natural products CCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(O)CO SVUQHVRAGMNPLW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 229940093915 gynecological organic acid Drugs 0.000 description 1
- 102000046935 human TNFRSF17 Human genes 0.000 description 1
- 239000003906 humectant Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229920001477 hydrophilic polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001146 hypoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008004 immune attack Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000006058 immune tolerance Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 1
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 230000007794 irritation Effects 0.000 description 1
- 108010024383 kallikrein 4 Proteins 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 230000021633 leukocyte mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 1
- 230000029226 lipidation Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- ZLNQQNXFFQJAID-UHFFFAOYSA-L magnesium carbonate Chemical compound [Mg+2].[O-]C([O-])=O ZLNQQNXFFQJAID-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000001095 magnesium carbonate Substances 0.000 description 1
- 229910000021 magnesium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000012737 microarray-based gene expression Methods 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 238000012243 multiplex automated genomic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 239000006179 pH buffering agent Substances 0.000 description 1
- 239000000312 peanut oil Substances 0.000 description 1
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 1
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 1
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 description 1
- 229920001481 poly(stearyl methacrylate) Polymers 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 239000003380 propellant Substances 0.000 description 1
- QQONPFPTGQHPMA-UHFFFAOYSA-N propylene Natural products CC=C QQONPFPTGQHPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004805 propylene group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([*:1])C([H])([H])[*:2] 0.000 description 1
- 108010079891 prostein Proteins 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 238000002818 protein evolution Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 102000016914 ras Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010014186 ras Proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N saccharin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)NS(=O)(=O)C2=C1 CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 239000008159 sesame oil Substances 0.000 description 1
- 235000011803 sesame oil Nutrition 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- RYYKJJJTJZKILX-UHFFFAOYSA-M sodium octadecanoate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O RYYKJJJTJZKILX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 239000003549 soybean oil Substances 0.000 description 1
- 235000012424 soybean oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000003206 sterilizing agent Substances 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 150000005846 sugar alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 239000000454 talc Substances 0.000 description 1
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 229940126622 therapeutic monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 229960002175 thyroglobulin Drugs 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 238000009736 wetting Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
一种分子，该分子包含用于接合或活化自然杀伤(NK)细胞的第一工具和用于结合肿瘤细胞的第二工具，其中该分子能够诱导针对该肿瘤细胞的NK细胞依赖性细胞毒性。一种分子，该分子尤其包含自然杀伤细胞衔接器，其包括抗NKG2d分子、抗NKp46分子和包含这些分子或其片段的多特异性分子，以及编码所述分子的核酸和表达载体、包含所述载体的重组细胞和包含所述分子的组合物。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年3月31日提交的美国序列号63/168,605、2021年3月31日提交的美国序列号63/168,611、2021年3月31日提交的美国序列号63/168,618、2021年3月31日提交的美国序列号63/168,621、2021年3月31日提交的美国序列号63/168,628的权益，这些专利中的每一者全文以引用方式并入本文。
以电子方式提交的参考序列表
本申请含有序列表，该序列表作为ASCII形式的序列表经由EFS-Web以电子方式递交，文件名为“14620-648-228_SEQ_LISTING”，创建日期为2022年3月24日，并且大小为181,332字节。经由EFS-Web提交的该序列表是本说明书的一部分并且全文以引用方式并入本文。
1.技术领域
本公开尤其涉及自然杀伤细胞衔接器，包括抗NKG2d分子、抗NKp46分子和包含这些分子或其片段的多特异性分子，以及编码该分子的核酸和表达载体、包含该载体的重组细胞和包含该分子的组合物。还提供了制备该分子的方法和使用该分子将免疫效应细胞针对肿瘤细胞重定向的方法。
2.背景技术
肿瘤细胞可以通过抗体在治疗上靶向破坏。治疗性抗体可使用多种机制使免疫效应细胞与靶肿瘤细胞接合以进行破坏。使用结合肿瘤细胞的双特异性抗体(bsAb)和使它们紧密靠近的效应细胞，可以将效应细胞针对肿瘤细胞重定向。另选地，单克隆抗体(mAb)可通过它们的可变区与肿瘤细胞接合，并通过Fc区与主要在单核细胞、巨噬细胞和NK细胞上表达的Fc g受体之间的相互作用募集效应细胞。
3.发明内容
本发明人率先发现了本文所述的多特异性抗体，该多特异性抗体包含与在自然杀伤(NK)细胞上表达的第一抗原结合的第一结合结构域和与在肿瘤细胞上表达的第二抗原结合的第二结合结构域。
在一个方面，本文提供了一种多特异性抗体，该多特异性抗体包含与在自然杀伤(NK)细胞上表达的第一抗原结合的第一结合结构域和与第二抗原结合的第二结合结构域。
在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，该第一抗原是NK细胞活化受体。
在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，该第一抗原是NKG2d。
在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，该第一结合结构域包含：重链可变区(VH)，其包含(a)具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ IDNO:5的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的VH CDR3；(b)具有SEQ IDNO:10的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的VH CDR3；(c)具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的VH CDR3；(d)具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ IDNO:23的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的VH CDR3；或(e)具有SEQ ID NO:28的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:29的氨基酸序列的VHCDR2和具有SEQ ID NO:30的氨基酸序列的VH CDR3；以及轻链可变区(VL)，其包含(a)具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的VL CDR3；(b)具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VL CDR3；(c)
具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的VL CDR3；(d)具有SEQ ID NO:25的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:27的氨基酸序列的VL CDR3；或(e)具有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:32的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的VL CDR3。
在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，该第一结合结构域包含：具有SEQID NO:2的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的VL。
在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，该第一结合结构域包含：(i)重链可变区(VH)，其包含(a)具有SEQ ID NO:36的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQID NO:37的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的VH CDR3；(b)具有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的VHCDR2和具有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的VH CDR3；(c)具有SEQ ID NO:48的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:49的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:50的氨基酸序列的VH CDR3；(d)具有SEQ ID NO:54的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:55的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:56的氨基酸序列的VH CDR3；或(e)具有SEQ ID NO:60的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:61的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:62的氨基酸序列的VH CDR3；以及(ii)轻链可变区(VL)，其包含(a)具有SEQ ID NO:39的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:40的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的VL CDR3；(b)具有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:47的氨基酸序列的VL CDR3；(c)具有SEQ ID NO:51的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:52的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:53的氨基酸序列的VL CDR3；(d)具有SEQ ID NO:57的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:58的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:59的氨基酸序列的VL CDR3；或(e)具有SEQ ID NO:63的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:64的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:65的氨基酸序列的VL CDR3。
在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，该第一结合结构域包含：具有SEQID NO:34的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:35的氨基酸序列的VL。
在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，该第一抗原是NKp46。
在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，该第一结合结构域包含：(i)重链可变区(VH)，其包含(a)具有SEQ ID NO:69的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQID NO:70的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的VH CDR3；(b)具有SEQ ID NO:75的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:76的氨基酸序列的VHCDR2和具有SEQ ID NO:77的氨基酸序列的VH CDR3；(c)具有SEQ ID NO:81的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:82的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:83的氨基酸序列的VH CDR3；(d)具有SEQ ID NO:87的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:88的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:89的氨基酸序列的VH CDR3；或(e)具有SEQ ID NO:93的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:94的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:95的氨基酸序列的VH CDR3；以及(ii)轻链可变区(VL)，其包含(a)具有SEQ ID NO:72的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:73的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:74的氨基酸序列的VL CDR3；(b)具有SEQ ID NO:78的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:79的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:80的氨基酸序列的VL CDR3；(c)具有SEQ ID NO:84的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:85的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:86的氨基酸序列的VL CDR3；(d)具有SEQ ID NO:90的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:91的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:92的氨基酸序列的VL CDR3；或(e)具有SEQ ID NO:96的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:97的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:98的氨基酸序列的VL CDR3。
在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，该第一结合结构域包含：具有SEQID NO:67的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:68的氨基酸序列的VL。
在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，该第二抗原位于细胞表面上。
在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，该第二抗原在肿瘤细胞上表达。
在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，该第二抗原是肿瘤特异性抗原(TSA)或肿瘤相关抗原(TAA)。
在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，该第二抗原是BCMA。
在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，第二抗原是GPRC5d。
在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，该第一结合结构域是人源化的。在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，该第二结合结构域是人源化的。在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，该第一结合结构域和该第二结合结构域两者均是人源化的。
在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，该多特异性抗体是IgG抗体。
在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，该IgG抗体是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体。
在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，该IgG抗体是IgG1抗体。
在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，该IgG1包含沉默突变。在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，该IgG1包含AAS突变。在一些实施方案中，包含该AAS突变的该多特异性抗体可诱导肿瘤细胞的NK细胞依赖性细胞毒性。
在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，该IgG1包含用于增强抗体的效应子功能的突变。在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，该IgG1包含K248E/T437R突变。在一些实施方案中，包含该K248E/T437R突变的该多特异性抗体缺乏抗NK细胞的细胞毒性。
在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，对该Fc区进行非岩藻糖修饰。
在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，该多特异性抗体是双特异性抗体。
在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，该双特异性抗体呈两脚台支架构型(bipod-scaffold configuration)。
在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，该第一结合结构域是Fab区，并且该第二结合结构域是scFv区。
在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，该双特异性抗体呈莫里森支架构型(Morrison-scaffold configuration)。
在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，该第一结合结构域包含两个Fab区，并且该第二结合结构域包含两个scFv区。
在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，该多特异性抗体缺乏抗NK细胞的细胞毒性。
在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，该多特异性抗体在体外以小于约500pM的IC50诱导肿瘤细胞的NK细胞依赖性细胞毒性。在一些实施方案中，该多特异性抗体在体外以小于约300pM的IC50诱导肿瘤细胞的NK细胞依赖性细胞毒性。在一些实施方案中，该多特异性抗体在体外以小于约100pM的IC50诱导肿瘤细胞的NK细胞依赖性细胞毒性。在一些实施方案中，该多特异性抗体在体外以小于约50pM的IC50诱导肿瘤细胞的NK细胞依赖性细胞毒性。在一些实施方案中，该多特异性抗体在体外以小于约20pM的IC50诱导肿瘤细胞的NK细胞依赖性细胞毒性。在一些实施方案中，该多特异性抗体在体外以小于约15pM的IC50诱导肿瘤细胞的NK细胞依赖性细胞毒性。在一些实施方案中，该多特异性抗体在体外以小于约10pM的IC50诱导肿瘤细胞的NK细胞依赖性细胞毒性。
在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，用NK效应细胞和表达该第二抗原的靶细胞的混合物评估该IC50。
在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，效应细胞与靶细胞的比率为约0.01:1至约10:1。在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，效应细胞与靶细胞的比率为约0.01:1至约5:1。在一些实施方案中，效应细胞与靶细胞的比率为约0.1:1至约2:1。在一些实施方案中，效应细胞与靶细胞的比率为约1:1。
在另一方面，提供了编码本文提供的多特异性抗体的核酸。还提供了一种载体，该载体包含编码本文提供的多特异性抗体的核酸。还提供了包含载体的宿主细胞，该载体包含编码本文提供的多特异性抗体的核酸。还提供了一种试剂盒，该试剂盒包括包含编码本文提供的多特异性抗体的核酸的载体以及用于该载体的包装。
在另一方面，本文提供了一种结合NKG2d的抗体，该抗体包含：(i)重链可变区(VH)，其包含(a)具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的VH CDR3；(b)具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的VH CDR3；(c)具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的VH CDR3；(d)具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ IDNO:23的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的VH CDR3；或(e)具有SEQ ID NO:28的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:29的氨基酸序列的VHCDR2和具有SEQ ID NO:30的氨基酸序列的VH CDR3；以及(ii)轻链可变区(VL)，其包含(a)具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的VL CDR3；(b)具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VL CDR3；(c)具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的VLCDR2和具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的VL CDR3；(d)具有SEQ ID NO:25的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:27的氨基酸序列的VL CDR3；或(e)具有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:32的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的VL CDR3。
在本文提供的结合NKG2d的抗体的一些实施方案中，该第一结合结构域包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的VL。
在另一方面，本文提供了一种结合NKG2d的抗体，该抗体包含：(i)重链可变区(VH)，其包含(a)具有SEQ ID NO:36的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的VH CDR3；(b)具有SEQ IDNO:42的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的VH CDR3；(c)具有SEQ ID NO:48的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:49的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:50的氨基酸序列的VH CDR3；(d)具有SEQ ID NO:54的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ IDNO:55的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:56的氨基酸序列的VH CDR3；或(e)具有SEQ ID NO:60的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:61的氨基酸序列的VHCDR2和具有SEQ ID NO:62的氨基酸序列的VH CDR3；以及(ii)轻链可变区(VL)，其包含(a)具有SEQ ID NO:39的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:40的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的VL CDR3；(b)具有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的VLCDR1、具有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:47的氨基酸序列的VLCDR3；(c)具有SEQ ID NO:51的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:52的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:53的氨基酸序列的VL CDR3；(d)具有SEQ ID NO:57的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:58的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:59的氨基酸序列的VL CDR3；或(e)具有SEQ ID NO:63的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:64的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:65的氨基酸序列的VL CDR3。
在本文提供的结合NKG2d的抗体的一些实施方案中，该第一结合结构域包含：具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:35的氨基酸序列的VL。
在另一方面，本文提供了一种结合NKp46的抗体，该抗体包含：(i)重链可变区(VH)，其包含(a)具有SEQ ID NO:69的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:70的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的VH CDR3；(b)具有SEQ IDNO:75的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:76的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:77的氨基酸序列的VH CDR3；(c)具有SEQ ID NO:81的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:82的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:83的氨基酸序列的VH CDR3；(d)具有SEQ ID NO:87的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ IDNO:88的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:89的氨基酸序列的VH CDR3；或(e)具有SEQ ID NO:93的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:94的氨基酸序列的VHCDR2和具有SEQ ID NO:95的氨基酸序列的VH CDR3；以及(ii)轻链可变区(VL)，其包含(a)具有SEQ ID NO:72的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:73的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:74的氨基酸序列的VL CDR3；(b)具有SEQ ID NO:78的氨基酸序列的VLCDR1、具有SEQ ID NO:79的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:80的氨基酸序列的VLCDR3；(c)具有SEQ ID NO:84的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:85的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:86的氨基酸序列的VL CDR3；(d)具有SEQ ID NO:90的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:91的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:92的氨基酸序列的VL CDR3；或(e)具有SEQ ID NO:96的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:97的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:98的氨基酸序列的VL CDR3。
在本文提供的结合NKp46的抗体的一些实施方案中，该第一结合结构域包含：具有SEQ ID NO:67的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:68的氨基酸序列的VL。
在另一方面，本文提供了一种编码本文提供的抗体的核酸。还提供了一种载体，该载体包含编码本文提供的抗体的核酸。还提供了包含载体的宿主细胞，该载体包含编码本文提供的抗体的核酸。还提供了一种试剂盒，该试剂盒包括：包含编码本文提供的抗体的核酸的载体，和用于该载体的包装。
在又另一方面，本文提供了一种药物组合物，该药物组合物包含本文提供的多特异性抗体和药学上可接受的载体，其中该多特异性抗体包含：与在自然杀伤(NK)细胞上表达的第一抗原结合的第一结合结构域和与第二抗原结合的第二结合结构域。
在本文提供的药物组合物的一些实施方案中，该第一抗原是NK细胞活化受体。
在本文提供的药物组合物的一些实施方案中，该第一抗原是NKG2d。
在本文提供的药物组合物的一些实施方案中，该第一抗原是NKp46。
在本文提供的药物组合物的一些实施方案中，该第二抗原位于细胞表面上。
在本文提供的药物组合物的一些实施方案中，该第二抗原在肿瘤细胞上表达。
在本文提供的药物组合物的一些实施方案中，该第二抗原是肿瘤特异性抗原(TSA)或肿瘤相关抗原(TAA)。
在本文提供的药物组合物的一些实施方案中，该第二抗原是BCMA。
在本文提供的药物组合物的一些实施方案中，第二抗原是GPRC5d。
在本文提供的药物组合物的一些实施方案中，该第一结合结构域是人源化的。在本文提供的药物组合物的一些实施方案中，该第二结合结构域是人源化的。在本文提供的药物组合物的一些实施方案中，该第一结合结构域和该第二结合结构域两者均是人源化的。
在本文提供的药物组合物的一些实施方案中，多特异性抗体是IgG抗体。
在本文提供的药物组合物的一些实施方案中，该IgG抗体是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体。
在本文提供的药物组合物的一些实施方案中，该IgG抗体是IgG1抗体。
在本文提供的药物组合物的一些实施方案中，该IgG1包含沉默突变。在本文提供的药物组合物的一些实施方案中，该IgG1包含AAS突变。
在本文提供的药物组合物的一些实施方案中，该IgG1包含用于增强抗体的效应子功能的突变。在本文提供的药物组合物的一些实施方案中，该IgG1包含K248E/T437R突变。
在本文提供的药物组合物的一些实施方案中，对该Fc区进行非岩藻糖修饰。
在本文提供的药物组合物的一些实施方案中，多特异性抗体是双特异性抗体。
在本文提供的药物组合物的一些实施方案中，该双特异性抗体呈两脚台支架构型。
在本文提供的药物组合物的一些实施方案中，该第一结合结构域是Fab区，并且该第二结合结构域是scFv区。
在本文提供的药物组合物的一些实施方案中，该双特异性抗体呈莫里森支架构型。
在本文提供的药物组合物的一些实施方案中，该第一结合结构域包含两个Fab区，并且该第二结合结构域包含两个scFv区。
在本文提供的药物组合物的一些实施方案中，该多特异性抗体在体外以小于约500pM的IC50诱导肿瘤细胞的NK细胞依赖性细胞毒性。在一些实施方案中，该多特异性抗体在体外以小于约300pM的IC50诱导肿瘤细胞的NK细胞依赖性细胞毒性。在一些实施方案中，该多特异性抗体在体外以小于约100pM的IC50诱导肿瘤细胞的NK细胞依赖性细胞毒性。在一些实施方案中，该多特异性抗体在体外以小于约50pM的IC50诱导肿瘤细胞的NK细胞依赖性细胞毒性。在一些实施方案中，该多特异性抗体在体外以小于约20pM的IC50诱导肿瘤细胞的NK细胞依赖性细胞毒性。在一些实施方案中，该多特异性抗体在体外以小于约15pM的IC50诱导肿瘤细胞的NK细胞依赖性细胞毒性。在一些实施方案中，该多特异性抗体在体外以小于约10pM的IC50诱导肿瘤细胞的NK细胞依赖性细胞毒性。
在本文提供的药物组合物的一些实施方案中，用NK效应细胞和表达该第二抗原的靶细胞的混合物评估该IC50。
在本文提供的药物组合物的一些实施方案中，效应细胞与靶细胞的比率为约0.01:1至约10:1。在本文提供的药物组合物的一些实施方案中，效应细胞与靶细胞的比率为约0.01:1至约5:1。在一些实施方案中，效应细胞与靶细胞的比率为约0.1:1至约2:1。在一些实施方案中，效应细胞与靶细胞的比率为约1:1。
在又另一方面，本文提供了一种用于制备多特异性抗体的方法，该方法包括向宿主细胞中引入一种或多种核酸，该一种或多种核酸编码与在NK细胞上表达的第一抗原结合的第一结合结构域和与第二抗原结合的第二结合结构域。
在用于制备本文提供的多特异性抗体的方法的一些实施方案中，该第一抗原是NK细胞活化受体。
在用于制备本文提供的多特异性抗体的方法的一些实施方案中，其中该多特异性抗体是本文提供的多特异性抗体。
在用于制备本文提供的多特异性抗体的方法的一些实施方案中，第一抗原是NKp46。在用于制备本文提供的多特异性抗体的方法的一些实施方案中，第一抗原是NKG2d。
在用于制备本文提供的多特异性抗体的方法的一些实施方案中，该第二抗原位于细胞表面上。
在用于制备本文提供的多特异性抗体的方法的一些实施方案中，该第二抗原在肿瘤细胞上表达。
在用于制备本文提供的多特异性抗体的方法的一些实施方案中，该第二抗原是肿瘤特异性抗原(TSA)或肿瘤相关抗原(TAA)。
在用于制备本文提供的多特异性抗体的方法的一些实施方案中，该第二抗原是BCMA。
在用于制备本文提供的多特异性抗体的方法的一些实施方案中，第二抗原是GPRC5d。
在用于制备本文提供的多特异性抗体的方法的一些实施方案中，该第一结合结构域是人源化的。在用于制备本文提供的多特异性抗体的方法的一些实施方案中，该第二结合结构域是人源化的。在用于制备本文提供的多特异性抗体的方法的一些实施方案中，该第一结合结构域和该第二结合结构域两者均是人源化的。
在用于制备本文提供的多特异性抗体的方法的一些实施方案中，该多特异性抗体是IgG抗体。
在用于制备本文提供的多特异性抗体的方法的一些实施方案中，该IgG抗体是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体。
在用于制备本文提供的多特异性抗体的方法的一些实施方案中，该IgG抗体是IgG1抗体。
在本文提供的方法的一些实施方案中，该IgG1包含沉默突变。在本文提供的方法的一些实施方案中，该IgG1包含AAS突变。
在本文提供的方法的一些实施方案中，该IgG1包含用于增强抗体的效应子功能的突变。在本文提供的方法的一些实施方案中，该IgG1包含K248E/T437R突变。
在本文提供的方法的一些实施方案中，对该Fc区进行非岩藻糖修饰。
在用于制备本文提供的多特异性抗体的方法的一些实施方案中，该多特异性抗体是双特异性抗体。
在用于制备本文提供的多特异性抗体的方法的一些实施方案中，该双特异性抗体呈两脚台支架构型。
在用于制备本文提供的多特异性抗体的方法的一些实施方案中，该第一结合结构域是Fab区，并且该第二结合结构域是scFv区。
在用于制备本文提供的多特异性抗体的方法的一些实施方案中，该双特异性抗体呈莫里森支架构型。
在用于制备本文提供的多特异性抗体的方法的一些实施方案中，该第一结合结构域包含两个Fab区，并且该第二结合结构域包含两个scFv区。
在用于制备本文提供的多特异性抗体的方法的一些实施方案中，该多特异性抗体在体外以小于约500pM的IC50诱导肿瘤细胞的ΝK细胞依赖性细胞毒性。在一些实施方案中，该多特异性抗体在体外以小于约300pM的IC50诱导肿瘤细胞的ΝK细胞依赖性细胞毒性。在一些实施方案中，该多特异性抗体在体外以小于约100pM的IC50诱导肿瘤细胞的ΝK细胞依赖性细胞毒性。在一些实施方案中，该多特异性抗体在体外以小于约50pM的IC50诱导肿瘤细胞的ΝK细胞依赖性细胞毒性。在一些实施方案中，该多特异性抗体在体外以小于约20pM的IC50诱导肿瘤细胞的ΝK细胞依赖性细胞毒性。在一些实施方案中，该多特异性抗体在体外以小于约15pM的IC50诱导肿瘤细胞的ΝK细胞依赖性细胞毒性。在一些实施方案中，该多特异性抗体在体外以小于约10pM的IC50诱导肿瘤细胞的ΝK细胞依赖性细胞毒性。
在用于制备本文提供的多特异性抗体的方法的一些实施方案中，用ΝK效应细胞和表达该第二抗原的靶细胞的混合物评估该IC50。
在用于制备本文提供的多特异性抗体的方法的一些实施方案中，效应细胞与靶细胞的比率为约0.01:1至约10:1。在用于制备本文提供的多特异性抗体的方法的一些实施方案中，效应细胞与靶细胞的比率为约0.01:1至约5:1。在一些实施方案中，效应细胞与靶细胞的比率为约0.1:1至约2:1。在一些实施方案中，效应细胞与靶细胞的比率为约1:1。
在另一方面，本文提供了一种将NK细胞引导至靶细胞的方法，该方法包括使该NK细胞与多特异性抗体接触，从而将该NK细胞引导至该靶细胞，其中该多特异性抗体包含与NK细胞上的第一抗原结合的第一结合结构域和与靶细胞上的第二抗原结合的第二结合结构域。
在另一方面，本文提供了多特异性抗体用于将NK细胞引导至靶细胞的用途，该用途包括使该NK细胞与该多特异性抗体接触，从而将该NK细胞引导至该靶细胞，其中该多特异性抗体包含与NK细胞上的第一抗原结合的第一结合结构域和与靶细胞上的第二抗原结合的第二结合结构域。
在另一方面，本文提供了一种使NK细胞活化的方法，该方法包括使该NK与多特异性抗体接触，其中该多特异性抗体包含与该NK细胞上的第一抗原结合的第一结合结构域和与靶细胞上的第二抗原结合的第二结合结构域。
在另一方面，本文提供了多特异性抗体用于使NK细胞活化的用途，该用途包括使该NK与该多特异性抗体接触，其中该多特异性抗体包含与该NK细胞上的第一抗原结合的第一结合结构域和与靶细胞上的第二抗原结合的第二结合结构域。
在另一方面，本文提供了一种抑制在细胞表面上表达第二抗原的靶细胞的生长或增殖的方法，该方法包括使该靶细胞与多特异性抗体接触，其中该多特异性抗体包含与NK细胞上的第一抗原结合的第一结合结构域和与该第二抗原结合的第二结合结构域。
在另一方面，本文提供了多特异性抗体用于抑制在细胞表面上表达第二抗原的靶细胞的生长或增殖的用途，该多特异性抗体的用途包括使该靶细胞与该多特异性抗体接触，其中该多特异性抗体包含与NK细胞上的第一抗原结合的第一结合结构域和与该第二抗原结合的第二结合结构域。
在另一方面，本文提供了一种用于在受试者中消除表达第二抗原的靶细胞或治疗全部或部分地由表达该第二抗原的靶细胞引起的疾病或病症的方法，该方法包括向该受试者施用有效量的多特异性抗体，其中该多特异性抗体包含与NK细胞上的第一抗原结合的第一结合结构域和与该第二抗原结合的第二结合结构域。
在另一方面，本文提供了多特异性抗体用于在受试者中消除表达第二抗原的靶细胞或治疗全部或部分地由表达该第二抗原的靶细胞引起的疾病或病症的用途，该用途包括向该受试者施用有效量的多特异性抗体，其中该多特异性抗体包含与NK细胞上的第一抗原结合的第一结合结构域和与该第二抗原结合的第二结合结构域。
在一些实施方案中，受试者是有需要的受试者。在一些实施方案中，受试者是人。
在一些实施方案中，疾病或障碍为癌症。在一些实施方案中，癌症是血癌。在一些实施方案中，癌症是实体瘤癌症。
在本文提供的方法的一些实施方案中，该第一抗原是NK细胞活化受体。
在本文提供的方法的一些实施方案中，第一抗原是NKG2d。在本文提供的方法的一些实施方案中，第一抗原是NKp46。在一些实施方案中，该多特异性抗体是本文提供的多特异性抗体。
在本文提供的方法的一些实施方案中，该第二抗原位于细胞表面上。
在本文提供的方法的一些实施方案中，该第二抗原在肿瘤细胞上表达。
在本文提供的方法的一些实施方案中，该第二抗原是肿瘤特异性抗原(TSA)或肿瘤相关抗原(TAA)。
在本文提供的方法的一些实施方案中，该第二抗原是BCMA。
在本文提供的方法的一些实施方案中，第二抗原是GPRC5d。
在本文提供的方法的一些实施方案中，该第一结合结构域是人源化的。在本文提供的方法的一些实施方案中，该第二结合结构域是人源化的。在本文提供的方法的一些实施方案中，该第一结合结构域和该第二结合结构域两者均是人源化的。
在本文提供的方法的一些实施方案中，多特异性抗体是IgG抗体。
在本文提供的方法的一些实施方案中，该IgG抗体是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体。
在本文提供的方法的一些实施方案中，该IgG抗体是IgG1抗体。
在本文提供的方法的一些实施方案中，该IgG1包含沉默突变。在本文提供的方法的一些实施方案中，该IgG1包含AAS突变。
在本文提供的方法的一些实施方案中，该IgG1包含用于增强抗体的效应子功能的突变。在本文提供的方法的一些实施方案中，该IgG1包含K248E/T437R突变。
在本文提供的方法的一些实施方案中，对该Fc区进行非岩藻糖修饰。
在本文提供的方法的一些实施方案中，多特异性抗体是双特异性抗体。
在本文提供的方法的一些实施方案中，该双特异性抗体呈两脚台支架构型。
在本文提供的方法的一些实施方案中，该第一结合结构域是Fab区，并且该第二结合结构域是scFv区。
在本文提供的方法的一些实施方案中，该双特异性抗体呈莫里森支架构型。
在本文提供的方法的一些实施方案中，该第一结合结构域包含两个Fab区，并且该第二结合结构域包含两个scFv区。
在本文提供的方法的一些实施方案中，该多特异性抗体在体外以小于约500pM的IC50诱导肿瘤细胞的NK细胞依赖性细胞毒性。在一些实施方案中，该多特异性抗体在体外以小于约300pM的IC50诱导肿瘤细胞的NK细胞依赖性细胞毒性。在一些实施方案中，该多特异性抗体在体外以小于约100pM的IC50诱导肿瘤细胞的NK细胞依赖性细胞毒性。在一些实施方案中，该多特异性抗体在体外以小于约50pM的IC50诱导肿瘤细胞的NK细胞依赖性细胞毒性。在一些实施方案中，该多特异性抗体在体外以小于约20pM的IC50诱导肿瘤细胞的NK细胞依赖性细胞毒性。在一些实施方案中，该多特异性抗体在体外以小于约15pM的IC50诱导肿瘤细胞的NK细胞依赖性细胞毒性。在一些实施方案中，该多特异性抗体在体外以小于约10pM的IC50诱导肿瘤细胞的NK细胞依赖性细胞毒性。
在本文提供的方法的一些实施方案中，用NK效应细胞和表达该第二抗原的靶细胞的混合物评估该IC50。
在本文提供的方法的一些实施方案中，效应细胞与靶细胞的比率为约0.01:1至约10:1。在本文提供的方法的一些实施方案中，效应细胞与靶细胞的比率为约0.01:1至约5:1。在一些实施方案中，效应细胞与靶细胞的比率为约0.1:1至约2:1。在一些实施方案中，效应细胞与靶细胞的比率为约0.5:1。在一些实施方案中，效应细胞与靶细胞的比率为约1:1。
在另一方面，本文提供了一种分子，该分子包含用于接合或活化NK细胞的第一工具和用于结合肿瘤细胞的第二工具，其中该分子能够诱导针对该肿瘤细胞的NK细胞依赖性细胞毒性。
在本文提供的分子的一些实施方案中，该第一工具包含与在NK细胞上表达的第一抗原结合的第一结合结构域，并且该第二工具包含与在肿瘤细胞上表达的第二抗原结合的第二结合结构域。
在本文提供的分子的一些实施方案中，该第一抗原是NK细胞活化受体。
在本文提供的分子的一些实施方案中，第一抗原是NKG2d。
在本文提供的分子的一些实施方案中，第一抗原是NKp46。
在本文提供的分子的一些实施方案中，该第二抗原是肿瘤特异性抗原(TSA)或肿瘤相关抗原(TAA)。
在本文提供的分子的一些实施方案中，该第二抗原是BCMA。
在本文提供的分子的一些实施方案中，第二抗原是GPRC5d。
在另一方面，本文提供了一种用于制备与多于一个靶分子结合的分子的方法，该方法包括：用于执行获得能够与NK细胞上的第一抗原结合的结合结构域的功能的步骤；用于执行获得能够与肿瘤细胞上的第二抗原结合的结合结构域的功能的步骤；以及用于执行提供能够与该第一抗原和该第二抗原结合的分子的功能的步骤。
在另一方面，本文提供了一种将NK细胞引导至靶细胞的方法，该方法包括使该NK细胞与本文提供的分子接触。
在另一方面，本文提供了一种使NK细胞活化的方法，该方法包括使该NK细胞与本文提供的分子接触。
在另一方面，本文提供了一种抑制靶细胞的生长或增殖的方法，该方法包括使该靶细胞与本文提供的分子接触。
在另一方面，本文提供了一种用于在受试者中消除表达第二抗原的靶细胞或治疗全部或部分地由表达该第二抗原的靶细胞引起的疾病或病症的方法，该方法包括施用有效量的本文提供的分子。
4.附图说明
图1示出了用NKGW1免疫的Omnirat的血清滴度结果。
图2示出了基于珠的NK细胞激动测定。
图3示出了用NKp46免疫的Omnirat的血清滴度结果。
图4示出了bsAb的构型。
图5A-图5D示出了BsAb介导基于NK细胞的细胞毒性的能力的分析的结果。
图6示出了附加的结合BCMA的单价mAb和bsAb的构型。
图7示出了通过用1ng/ml TGFb预处理72小时的ADCC中NK细胞的去增强，以及通过在效应分子N46B10.AFU中掺入NKp46结合臂对ADCC的功能性拯救。
图8A-8C示出了与不含NKp46结合臂的BCMB1106.AFU相比，通过在效应分子N46B10.AFU中掺入NKp46结合臂，在低氧条件下ADCC中NK细胞的增强。
图9示出了在人血清存在下BCMA×NKp46双特异性分子缺乏抗NK CDC活性，这与显示出可滴定的抗NK CDC杀伤的抗CD38阳性对照mAb相反。
5.具体实施方式
本公开部分地基于与NK细胞上的抗原结合的新分子和包含这些新分子或其片段的多特异性结合分子，以及这些新分子的先进特性，这些新分子是诸如包含能够与NK细胞上存在的第一抗原结合的第一工具；和能够与例如肿瘤细胞上的第二抗原结合的第二工具的分子。
5.1.定义
本文描述或引用的技术和程序包括本领域技术人员通常熟知的和/或使用常规方法通常采用的那些，诸如例如以下文献中描述的广泛利用的方法：MolecularCloning: ALaboratoryManual(Sambrook等人，第3版2001)；Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel等人编辑，2003)；Therapeutic Monoclonal Antibodies:From Bench toClinic(An编辑，2009)；Monoclonal Antibodies:Methods and Protocols(Albitar编辑，2010)；以及Antibody Engineering，第1卷和第2卷(Kontermann和Dübel编辑，第2版，2010)。
除非本文另有定义，否则本说明书中使用的技术和科学术语具有本领域普通技术人员通常理解的含义。出于解释本说明书的目的，将应用以下术语描述，并且只要适当，以单数使用的术语也将包括复数，反之亦然。在所阐述的术语的任何描述与以引用方式并入本文的任何文档冲突的情况下，将以下面所阐述的术语的描述为准。
术语“抗体”、“免疫球蛋白”或“Ig”在本文中可互换使用，并且以最广泛的意义使用，并且具体地涵盖例如单克隆抗体(包括激动剂、拮抗剂、中和抗体、全长或完整的单克隆抗体)、具有多表位或单表位特异性的抗体组合物、多克隆或单价抗体、多价抗体以及由至少两种完整抗体形成的多特异性抗体(例如，双特异性抗体，只要它们表现出期望的生物活性即可)，如下文所述。抗体可以是人的、人源化的、嵌合的和/或亲和力成熟的，以及来自其他物种例如小鼠和兔等的抗体。术语“抗体”旨在包括免疫球蛋白多肽类别内的B细胞的多肽产物，其能够与特定分子抗原结合并且由两对相同的多肽链组成，其中每对具有一条重链(约50kDa-70kDa)和一条轻链(约25kDa)，每条链的每个氨基末端部分包括约100个至约130个或更多个氨基酸的可变区，并且每条链的每个羧基末端部分包括恒定区。参见例如，Antibody Engineering(Borrebaeck编辑，第2版，1995)；和Kuby，Immunology(第3版，1997)。在具体实施方案中，特异性分子抗原可被本文提供的抗体结合，包括多肽或表位。抗体还包括但不限于合成抗体、重组产生的抗体、羊驼抗体或其人源化变体、细胞内抗体和抗独特(抗Id)抗体。如本文所用，术语“抗体”还包括具有Fc区和上述任一者的功能性片段(例如，抗原结合片段)的任何结合分子，该功能性片段是指抗体重链或轻链多肽的一部分并保留该片段所源自的抗体的一部分或全部结合活性。功能性片段(例如，抗原结合片段)的非限制性示例包括单链Fv(scFv)(例如，包括单特异性、双特异性等)、Fab片段、F(ab')片段、F(ab)2片段、F(ab')2片段、二硫键连接的Fv(dsFv)、Fd片段、Fv片段、双抗体、三抗体、四抗体和微抗体。具体地，本文提供的抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，例如，含有结合抗原的抗原结合位点的抗原结合结构域或分子(例如，抗体的一个或多个CDR)。此类抗体片段可见于例如Harlow和Lane，Antibodies:ALaboratory Manual(1989)；Mol.Biology and Biotechnology:A Comprehensive Desk Reference(Myers编辑，1995)；Huston等人，1993，Cell Biophysics22:189-224；Plückthun和Skerra，1989，Meth.Enzymol.178:497-515；和Day，Advanced Immunochemistry(第2版，1990)。本文提供的抗体可以是免疫球蛋白分子的任何类别(例如IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)或任何亚类(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)。抗体可以是激动性抗体或拮抗性抗体。
“抗原”是抗体可选择性结合的结构。靶抗原可以是多肽、碳水化合物、核酸、脂质、半抗原或其他天然存在的或合成的化合物。在一些实施方案中，靶抗原是多肽。在某些实施方案中，抗原与细胞缔合，例如，存在于细胞上或细胞中。
“完整”抗体是包含抗原结合位点以及恒定结构域(CL)和至少重链恒定区CH1、CH2和CH3的抗体。恒定区可包括人恒定区或其氨基酸序列变体。在某些实施方案中，完整抗体具有一种或多种效应子功能。
术语“结合(binds)”或“结合(binding)”是指分子之间的相互作用，包括例如形成复合物。相互作用可以是例如非共价相互作用，包括氢键、离子键、疏水相互作用和/或范德华相互作用。复合物还可包括通过共价键或非共价键、相互作用或力保持在一起的两个或多个分子的结合。抗体上的单个抗原结合位点和靶分子诸如抗原的单个表位之间的总非共价相互作用的强度是抗体或功能性片段对该表位的亲和力。结合分子(例如抗体)与单价抗原的解离速率(koff)与缔合速率(kon)的比率(koff/kon)为解离常数KD，其与亲和力成反比。KD值越低，抗体的亲和力越高。KD值随着抗体和抗原的不同复合物而变化，并且取决于kon和koff两者。本文所提供的抗体的解离常数KD可使用本文提供的任何方法或本领域技术人员众所周知的任何其他方法来确定。一个结合位点处的亲和力并不总是反映抗体与抗原之间的相互作用的真实强度。当含有多个重复抗原决定簇的复合抗原(诸如多价抗原)与含有多个结合位点的抗体接触时，抗体与抗原在一个位点处的相互作用将增加在第二个位点处反应的概率。多价抗体与抗原之间的这种多重相互作用的强度称为亲合力。
与本文所述的抗体相关的术语，诸如“结合”、“特异性结合”和类似术语在本文中也可互换使用，并且是指特异性结合抗原诸如多肽的抗原结合结构域的抗体。结合或特异性结合抗原的抗体或抗原结合结构域可与相关抗原交叉反应。在某些实施方案中，结合或特异性结合抗原的抗体或抗原结合结构域不与其他抗原交叉反应。结合或特异性结合抗原的抗体或抗原结合结构域可例如通过免疫测定、或本领域技术人员已知的其他技术来鉴定。在一些实施方案中，如使用实验技术诸如放射性免疫测定(RIA)和酶联免疫吸附测定(ELISA)确定的，当抗体或抗原结合结构域以比与任何交叉反应性抗原更高的亲和力结合抗原时，它结合或特异性结合抗原。典型地，特异性或选择性反应将为背景信号或噪声的至少两倍，并且可以是背景的10倍以上。参见例如Fundamental Immunology332-36(Paul编辑，第2版，1989)有关结合特异性的讨论。在某些实施方案中，抗体或抗原结合结构域与“非靶”蛋白的结合程度小于抗体或抗原结合结构域与其特定靶抗原结合的约10％，例如，如通过荧光活化细胞分选(FACS)分析或RIA所确定的。关于诸如“特异性结合”、“特异性地结合”或“特异于”的术语意指与非特异性相互作用明显不同的结合。特异性结合可例如通过确定与对照分子的结合相比的分子的结合来测量，该对照分子通常是不具有结合活性的类似结构的分子。例如，特异性结合可通过与类似于靶的对照分子竞争来确定，例如过量的未标记靶。在这种情况下，如果标记靶与探针的结合被过量的未标记靶竞争性地抑制，则指示特异性结合。与抗原结合的抗体或抗原结合结构域包括能够以足够亲和力结合抗原的一种抗体或抗原结合结构域，使得抗体可用作例如靶向抗原的诊断剂或治疗剂。在某些实施方案中，与抗原结合的抗体或抗原结合结构域具有小于或等于1000nM、800nM、500nM、250nM、100nM、50nM、10nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、0.9nM、0.8nM、0.7nM、0.6nM、0.5nM、0.4nM、0.3nM、0.2nM或0.1nM的解离常数(KD)。在某些实施方案中，抗体或抗原结合结构域结合在来自不同物种(例如，在人和食蟹猕猴物种之间)的抗原中保守的抗原表位。
“结合亲和力”通常是指分子(例如，结合蛋白诸如抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如，抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另外指明，否则如本文所用，“结合亲和力”是指内在结合亲和力，其反映结合对的成员(例如，抗体与抗原)之间的1:1相互作用。结合分子X对其结合配偶体Y的亲和力通常可由解离常数(KD)表示。亲和力可通过本领域已知的常见方法测量，包括本文所述的那些。低亲和力抗体通常缓慢结合抗原并且倾向于易于解离，而高亲和力抗体通常更快地结合抗原并且趋向于更长地保持结合。测量结合亲和力的多种方法是本领域已知的，其中的任何方法都可用于本公开的目的。具体的例示性实施方案包括以下。在一个实施方案中，“KD”或“KD值”可通过本领域已知的测定例如通过结合测定来测量。KD可在RIA中测量，例如用目的抗体及其抗原的Fab版本进行(Chen等人，J.Mol Biol，1999，293:865-81)。KD或KD值也可通过使用生物层干涉仪(BLI)测量或者通过使用例如/>系统或通过/>使用例如/>2000或3000的表面等离子共振(SPR)测定测量。“结合速率”或“缔合的速率”或“缔合速率”或“kon”也可用上述相同的生物层干涉测量法(BLI)或表面等离子共振(SPR)技术使用例如/>2000或/>3000系统来确定。
在某些实施方案中，抗体可包含“嵌合”序列，其中重链和/或轻链的一部分与来源于特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的对应序列相同或同源，而链的剩余部分与来源于另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的对应序列相同或同源，只要它们表现出期望的生物活性即可(参见美国专利4,816,567；和Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1984，81:6851-55)。嵌合序列可包括人源化序列。
在某些实施方案中，抗体可包含非人(例如，鼠)抗体的“人源化”形式的部分，这些抗体是嵌合抗体并包括人免疫球蛋白(例如，受体抗体)，其中天然CDR残基被来自非人物种诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物(例如，供体抗体)的具有期望的特异性、亲和力和能力的对应CDR残基替换。在一些情况下，人免疫球蛋白的一个或多个FR区残基被对应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含受体抗体或供体抗体中没有的残基。进行这些修饰以进一步改善抗体性能。人源化抗体重链或轻链可包含基本上所有的至少一个或多个可变区，其中所有或基本上所有的CDR对应于非人免疫球蛋白的那些，并且所有或基本上所有的FR是人免疫球蛋白序列的那些。在某些实施方案中，人源化抗体将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的恒定区的至少一部分。进一步的细节参见Jones等人，Nature，1986，321:522-25；Riechmann等人，Nature，1988，332:323-29；Presta，Curr.Op.Struct.Biol.，1992，2:593-96；Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1992，89:4285-89；美国专利6,800,738；6,719,971；6,639,055；6,407,213；和6,054,297。
在某些实施方案中，抗体可包含“完全人抗体”或“人抗体”的部分，其中这些术语在本文中可互换使用并且是指包含人可变区和例如人恒定区的抗体。在具体实施方案中，这些术语是指包含人来源的可变区和恒定区的抗体。在某些实施方案中，“完全人”抗体还可涵盖结合多肽并由核酸序列编码的抗体，该核酸序列是人种系免疫球蛋白核酸序列的天然存在的体细胞变体。术语“完全人抗体”包括具有对应于如Kabat等人所述的人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体(参见Kabat等人(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH公布号91-3242)。“人抗体”是指具有与由人产生和/或已使用用于制备人抗体的任何技术制备的抗体的氨基酸序列相对应的氨基酸序列的抗体。人抗体的这一定义特别排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。可使用本领域已知的各种技术来产生人抗体，包括噬菌体展示文库(Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.，1991，227:381；Marks等人，1991，J.Mol.Biol.，1991，222:581)和酵母展示文库(Chao等人，Nature Protocols，2006，1:755-68)。也可用于制备人单克隆抗体的方法描述于Cole等人，Monoclonal Antibodies andCancer Therapy 77(1985)；Boerner等人，J.Immunol.，1991，147(1):86-95；以及van Dijk和van de Winkel，Curr.Opin.Pharmacol.，2001，5:368-74。人抗体可通过将抗原施用到转基因动物来制备，该转基因动物已被修饰以响应于抗原攻击而产生此类抗体，但其内源性基因座已被禁用，例如小鼠(参见例如，Jakobovits，Curr.Opin.Biotechnol.，1995，6(5):561-66；Brüggemann和Taussing，Curr.Opin.Biotechnol.，1997，8(4):455-58；和关于XENOMOUSETM技术的美国专利6,075,181和6,150,584)。还参见例如Li等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2006，103:3557-62关于经由人B细胞杂交瘤技术生成的人抗体。
在某些实施方案中，抗体可包含“重组人抗体”的部分，其中该短语包括通过重组手段制备、表达、产生或分离的人抗体，诸如使用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体、从重组组合人抗体文库中分离的抗体、从人免疫球蛋白基因的转基因和/或转染色体的动物(例如，小鼠或牛)中分离的抗体(参见例如，Taylor,L.D.等人，Nucl.Acids Res.，1992，20:6287-6295)或通过涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接到其他DNA序列的任何其他手段制备、表达、产生或分离的抗体。此类重组人抗体可具有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区(参见Kabat,E.A.等人(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH公布号91-3242)。然而，在某些实施方案中，对此类重组人抗体进行体外诱变(或者，当使用针对人Ig序列的转基因动物时，进行体内体细胞诱变)，并且因此重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是这样的序列，其虽然衍生自人种系VH和VL序列并与之相关，但可能不天然存在于体内人抗体种系组库内。
在某些实施方案中，抗体可包含“单克隆抗体”的一部分，其中如本文所用的术语是指从基本上均一的抗体群体中获得的抗体，例如，除了可能以少量存在的天然存在的突变之外，组成群体的单个抗体是相同的，并且每个单克隆抗体通常将识别抗原上的单个表位。在具体实施方案中，如本文所用，“单克隆抗体”是由单个杂交瘤或其他细胞产生的抗体。术语“单克隆”不限于用于制备抗体的任何特定方法。例如，可用于本公开的单克隆抗体可通过首先由Kohler等人，1975，Nature 256:495描述的杂交瘤方法制备，或者可在细菌或真核动物或植物细胞中使用重组DNA方法制备(参见例如，美国专利4,816,567)。“单克隆抗体”也可使用例如描述于Clackson等人，Nature，1991，352:624-28和Marks等人，J.Mol.Biol.，1991，222:581-97中的技术从噬菌体抗体库中分离。用于制备克隆细胞系和由此表达的单克隆抗体的其他方法在本领域中是众所周知的。参见例如Short Protocolsin Molecular Biology(Ausubel等人编辑，第5版，2002)。
典型的4链抗体单元是由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链组成的异四聚体糖蛋白。在IgG的情况下，4链单元通常为约150,000道尔顿。每条L链通过一个共价二硫键与H链连接，而两条H链根据H链同种型通过一个或多个二硫键彼此连接。每条H和L链还具有规则间隔的链内二硫键。每条H链在N-末端具有可变结构域(VH)，随后是α链和γ链中的每一条的三个恒定结构域(CH)以及μ和ε同种型的四个CH结构域。每条L链在N-末端具有可变结构域(VL)，随后在其另一端具有恒定结构域(CL)。VL与VH对准，并且CL与重链的第一恒定结构域(CH1)对准。据信特定的氨基酸残基在轻链和重链可变结构域之间形成界面。VH和VL的配对一起形成单个抗原结合位点。对于不同类别的抗体的结构和特性，参见例如Basicand Clinical Immunology 71(Stites等人编辑，第8版，1994)；和Immunobiology(Janeway等人编辑，第5版，2001)。
术语“Fab”或“Fab区”是指结合抗原的抗体区。常规IgG通常包含两个Fab区，每个Fab区驻留在Y形IgG结构的两个臂中的一个臂上。每个Fab区通常由重链和轻链中的每一者的一个可变区和一个恒定区构成。更具体地，Fab区中重链的可变区和恒定区为VH和CH1区，并且Fab区中的轻链的可变区和恒定区为VL和CL区。Fab区中的VH、CH1、VL和CL可以各种方式布置以赋予根据本公开的抗原结合能力。例如，VH和CH1区可在一个多肽上，并且VL和CL区可在单独的多肽上，类似于常规IgG的Fab区。另选地，VH、CH1、VL和CL区可全部在同一多肽上并以不同的顺序取向，如下文部分更详细描述的。
术语“可变区”、“可变结构域”、“V区”或“V结构域”是指抗体的轻链或重链的一部分，其通常位于轻链或重链的氨基末端，并且在重链中具有约120至130个氨基酸的长度以及在轻链中具有约100至110个氨基酸的长度，并且用于每个特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。重链的可变区可被称为“VH”。轻链的可变区可被称为“VL”。术语“可变”是指可变区的某些片段在抗体之间在序列上广泛不同的事实。V区介导抗原结合并限定特定抗体对其特定抗原的特异性。然而，可变性在可变区的110个氨基酸跨度上不是均匀分布的。相反，V区由较少可变(例如，相对不变)的称为框架区(FR)的约15-30个氨基酸的延伸组成，其被称为“高变区”的较大可变性(例如，极端可变性)的较短区域分开，该较短区域各自长约9-12个氨基酸。重链和轻链可变区各自包含四个FR，主要采用β片构型，由三个高变区连接，它们形成连接β折叠结构的环并且在一些情况下形成其部分。每条链中的高变区通过FR并与来自另一条链的高变区紧密靠近地保持在一起，有助于抗体的抗原结合位点的形成(参见例如，Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest(第5版，1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但表现出各种效应子功能，诸如抗体参与抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)。不同抗体之间的可变区在序列上广泛不同。在具体实施方案中，可变区是人可变区。
术语“根据Kabat的可变区残基编号”或“如Kabat中的氨基酸位置编号”及其变型是指Kabat等人(出处同上)中用于抗体编译的重链可变区或轻链可变区的编号系统。使用该编号系统，实际线性氨基酸序列可含有对应于可变结构域的FR或CDR的缩短或插入的更少或另外的氨基酸。例如，重链可变结构域可包括在残基52之后的单个氨基酸插入(根据Kabat的残基52a)和在残基82之后的三个插入残基(例如，根据Kabat的残基82a、82b和82c等)。通过在抗体序列的同源区与“标准”Kabat编号序列比对，可确定给定抗体的Kabat残基编号。当提及可变结构域中的残基(大约轻链的残基1-107和重链的残基1-113)时，通常使用Kabat编号系统(例如，Kabat等人，出处同上)。当提及免疫球蛋白重链恒定区中的残基时，通常使用“EU编号系统”或“EU索引”(例如，Kabat等人中报道的EU索引，出处同上)。“如Kabat中的EU索引”是指人IgG1 EU抗体的残基编号。其他编号系统已由例如AbM、Chothia、Contact、IMGT和AHon描述。
当参考抗体使用时，术语“重链”是指约50-70kDa的多肽链，其中氨基末端部分包括约120至130个或更多个氨基酸的可变区，并且羧基末端部分包括恒定区。基于重链恒定区的氨基酸序列，恒定区可以是五种不同类型中的一种类型(例如同种型)，称为α(α)、δ(δ)、ε(ε)、γ(γ)和μ(μ)。不同的重链大小不同：α、δ和γ含有大约450个氨基酸，而μ和ε含有大约550个氨基酸。当与轻链结合时，这些不同类型的重链分别产生五种众所周知的类别(例如，同种型)的抗体，即IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，包括IgG的四个亚类，即IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
当参考抗体使用时，术语“轻链”是指约25kDa的多肽链，其中氨基末端部分包括约100至约110个氨基酸的可变区，并且羧基末端部分包括恒定区。轻链的近似长度为211至217个氨基酸。基于恒定结构域的氨基酸序列，存在两种不同类型，称为κ(κ)或λ(λ)。
如本文所用，术语“高变区”、“HVR”、“互补决定区”和“CDR”可互换使用。“CDR”是指免疫球蛋白(Ig或抗体)VHβ-片框架的非框架区内的三个高变区(H1、H2或H3)中的一个高变区，或抗体VLβ-片框架的非框架区内的三个高变区(L1、L2或L3)中的一个高变区。因此，CDR是散布在框架区序列内的可变区序列。
CDR区是本领域技术人员众所周知的，并且已由众所周知的编号系统定义。例如，Kabat互补决定区(CDR)是基于序列变异性的，并且是最常用的(参见例如，Kabat等人，出处同上)。Chothia相反是指结构环的位置(参见例如，Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.，1987，196:901-17)。当使用Kabat编号惯例编号时，Chothia CDR-H1环的末端在H32和H34之间变化，这取决于环的长度(这是因为Kabat编号方案将插入置在H35A和H35B处；如果35A和35B都不存在，则环以32结束；如果仅35A存在，则环以33结束；如果35A和35B都存在，则环以34结束)。AbM高变区代表Kabat CDR和Chothia结构环之间的折衷，并被Oxford Molecular的AbM抗体建模软件使用(参见例如Antibody Engineering，第2卷(Kontermann和Dübel编辑，第2版，2010)。“contact”高变区是基于对可获得的复杂晶体结构的分析。已经开发出来并被广泛采用的另一通用编号系统为ImMunoGeneTics(IMGT)Information(Lafranc等人，Dev.Comp.Immunol.，2003，27(1):55-77)。IMGT是专门研究人和其他脊椎动物的免疫球蛋白(IG)、T细胞受体(TCR)和主要组织相容性复合物(MHC)的整合信息系统。在本文中，CDR根据氨基酸序列以及轻链或重链内的位置两者来引用。由于CDR在免疫球蛋白可变结构域结构内的“位置”在物种之间是保守的，并且存在于称为环的结构中，因此通过使用根据结构特征比对可变结构域序列的编号系统，CDR和构架残基容易鉴定。该信息可用于将来自一个物种的免疫球蛋白的CDR残基移植和替换到通常来自人抗体的受体框架中。Honegger和Plückthun开发了一个另外的编号系统(AHon)，J.Mol.Biol.，2001，309:657-70)。编号系统之间的对应关系，包括例如Kabat编号和IMGT唯一编号系统，为本领域技术人员所熟知(参见例如Kabat，出处同上；Chothia和Lesk，出处同上；Martin，出处同上；Lefranc等人，出处同上)。来自这些高变区或CDR中的每一者的残基在下文中指出。
给定CDR的边界可根据用于识别的方案而变化。因此，除非另有说明，否则给定抗体或其区域(诸如可变区)的术语“CDR”和“互补决定区”以及抗体或其区域的单独CDR(例如，CDR-H1、CDR-H2)应理解为涵盖如上文所述的任何已知方案所定义的互补决定区。在一些情况下，指定用于识别特定CDR或CDR的方案，诸如由Kabat、Chothia或Contact方法定义的CDR。在其他情况下，给出了CDR的特定氨基酸序列。
高变区可包括如下“扩展高变区”：VL中的24-36或24-34(L1)、46-56或50-56(L2)和89-97或89-96(L3)，以及VH中的26-35或26-35A(H1)、50-65或49-65(H2)和93-102、94-102或95-102(H3)。
术语“恒定区”或“恒定结构域”是指轻链和重链的羧基末端部分，其不直接参与抗体与抗原的结合，但表现出各种效应子功能，诸如与Fc受体的相互作用。该术语是指免疫球蛋白分子的相对于免疫球蛋白的其他部分(包含抗原结合位点的可变区)具有更保守的氨基酸序列的部分。恒定区可包含重链的CH1、CH2和CH3区和轻链的CL区。
术语“框架”或“FR”是指侧接CDR的那些可变区残基。FR残基存在于例如嵌合的、人源化的、人的结构域抗体、双价抗体、线性抗体和双特异性抗体中。FR残基是除高变区残基或CDR残基之外的那些可变结构域残基。VH和VL区中的每一者中通常存在四个FR区。VH中的FR区是VH FR1、VH FR2、VH FR3和VH FR4(或FR H1、FR H2、FR H3和FR H4)。VL中的FR区是VLFR1、VL FR2、VL FR3和VL FR4(或FR L1、FR L2、FR L3和FR L4)。
术语“Fc区”在本文中用于定义免疫球蛋白重链的C端区域，包括例如天然序列Fc区、重组Fc区和变异Fc区。尽管免疫球蛋白重链的Fc区的边界可能变化，但人IgG重链Fc区通常被定义为从位置Cys226的氨基酸残基或从Pro230延伸到其羧基末端。Fc区的C-末端赖氨酸(残基447根据EU编号系统)可例如在抗体的生产或纯化期间或通过重组工程化编码抗体重链的核酸来去除。因此，完整抗体的组合物可包括去除了所有K447残基的抗体群、没有去除K447残基的抗体群体、以及具有含和不含K447残基的抗体混合物的抗体群体。“功能性Fc区”具有天然序列Fc区的“效应子功能”。示例性“效应子功能”包括C1q结合；CDC；Fc受体结合；ADCC；吞噬作用；细胞表面受体(例如，B细胞受体)的下调等。此类效应子功能通常需要Fc区与结合区或结合结构域(例如，抗体可变区或结构域)组合，并且可使用本领域技术人员已知的各种测定来评估。“变体Fc区”包括由于至少一个氨基酸修饰(例如，取代、添加或缺失)而与天然序列Fc区的氨基酸序列不同的氨基酸序列。在某些实施方案中，变体Fc区与天然序列Fc区或亲本多肽的Fc区相比具有至少一个氨基酸取代，例如，在天然序列Fc区或亲本多肽的Fc区中约一至约十个氨基酸取代，或约一至约五个氨基酸取代。本文的变体Fc区可与天然序列Fc区和/或亲本多肽的Fc区具有至少约80％的同源性，或者与其具有至少约90％的同源性，例如与其具有至少约95％的同源性。
当与抗原或抗体相关使用时，术语“变体”可以指与天然或未修饰序列相比包含一个或多个(诸如例如约1个至约25个、约1个至约20个、约1个至约15个、约1个至约10个、或约1个至约5个)氨基酸序列取代、缺失和/或添加的肽或多肽。
术语“同一性”是指如通过比对和比较序列所确定的两个或更多个多肽分子或者两个或更多个核酸分子的序列之间的关系。相对于参考多肽序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”定义为候选序列中与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比，在比对序列并引入缺口(如果需要的话)以实现最大的序列同一性百分比之后，不考虑任何保守置换作为序列同一性的一部分。出于确定氨基酸序列同一性百分比的目的进行的比对可以本领域技术范围内的多种方式实现，例如使用可公开获得的计算机软件诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或MEGALIGN(DNAStar,Inc.)软件。本领域技术人员可确定用于比对序列的合适参数，包括在所比较序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。
氨基酸残基/位置的“修饰”是指一级氨基酸序列与起始氨基酸序列相比的变化，其中变化是由涉及所述氨基酸残基/位置的序列改变引起的。例如，典型的修饰包括残基被另一个氨基酸取代(例如保守或非保守取代)、与所述残基/位置相邻的一个或多个(例如，通常少于5个、4个或3个)氨基酸的插入和/或所述残基/位置的缺失。
如本文所用，“表位”是本领域的术语，并且是指抗体可特异性结合的抗原的局部区域。表位可以是线性表位或构象、非线性或不连续表位。在多肽抗原的情况下，例如，表位可以是多肽的连续氨基酸(“线性”表位)，或者表位可包含来自多肽的两个或更多个非连续区域的氨基酸(“构象”、“非线性”或“不连续”表位)。本领域技术人员将理解，一般来讲，线性表位可取决于或不取决于二级、三级或四级结构。例如，在一些实施方案中，抗体与一组氨基酸结合，而无论它们是否在天然三维蛋白质结构中折叠。在其他实施方案中，抗体需要构成表位的氨基酸残基表现出特定的构象(例如弯曲、扭曲、翻转或折叠)以便识别和结合表位。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，并且是指任何长度的氨基酸的聚合物。该聚合物可以是直链或支链的，其可包含经修饰的氨基酸，并且其可夹杂有非氨基酸。该术语还涵盖已被天然修饰或通过干预修饰的氨基酸聚合物；例如二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或修饰。该定义还包括例如含有一种或多种氨基酸类似物(包括但不限于非天然氨基酸)以及本领域已知的其他修饰的多肽。应当理解，因为本公开的多肽可基于抗体或免疫球蛋白超家族的其他成员，所以在某些实施方案中，“多肽”可作为单链或两个或更多个相关链出现。
术语“载体”是指用于携带或包含核酸序列的物质，该核酸序列包括例如编码如本文所述的抗体的核酸序列，以便将核酸序列引入宿主细胞。适用的载体包括例如表达载体、质粒、噬菌体载体、病毒载体、附加体和人工染色体，其可包括可操作用于稳定整合到宿主细胞染色体中的选择序列或标记。另外，载体可包括一个或多个选择性标记基因和适当的表达控制序列。可包括的选择性标记基因例如提供对抗生素或毒素的抗性，补充营养缺陷，或提供不在培养基中的关键营养物。表达控制序列可包括本领域众所周知的组成型和诱导型启动子、转录增强子、转录终止子等。当两个或更多个核酸分子被共表达时(例如，抗体重链和轻链或抗体VH和VL两者)，两种核酸分子都可被插入例如单个表达载体或单独的表达载体中。对于单个载体表达，编码核酸可操作地连接到一个共同表达控制序列或连接到不同的表达控制序列，诸如一个诱导型启动子和一个组成型启动子。将核酸分子引入宿主细胞可使用本领域众所周知的方法来确认。此类方法包括例如核酸分析，诸如mRNA的Northern印迹或聚合酶链反应(PCR)扩增、用于基因产物表达的免疫印迹或其他合适的分析方法，以测试引入的核酸序列或其对应基因产物的表达。本领域技术人员应理解，核酸分子以足以产生期望产物的量表达，并且进一步理解，可使用本领域众所周知的方法优化表达水平以获得足够的表达。
如本文所用，术语“宿主”是指动物，诸如哺乳动物(例如，人)。
如本文所用，术语“宿主细胞”是指可用核酸分子转染的特定受试者细胞和此类细胞的后代或潜在后代。此类细胞的后代可与用核酸分子转染的亲本细胞不同，由于可在后代中发生的突变或环境影响或者由于核酸分子整合到宿主细胞基因组中。
“分离的核酸”是基本上与天然序列自然伴随的其他基因组DNA序列以及蛋白质或复合物诸如核糖体和聚合酶分离的核酸，例如RNA、DNA或混合核酸。“分离的”核酸分子是与存在于该核酸分子的天然来源中的其他核酸分子分离的核酸分子。此外，“分离的”核酸分子，诸如cDNA分子，当通过重组技术产生时可基本上不含其他细胞材料或培养基，或当化学合成时基本上不含化学前体或其他化学品。在一个具体实施方案中，分离或纯化编码如本文所述的抗体的一种或多种核酸分子。该术语涵盖已从其天然存在的环境中去除的核酸序列，并且包括重组或克隆的DNA分离物和化学合成的类似物或通过异源系统生物合成的类似物。基本上纯的分子可包括该分子的分离形式。
如在本文中可互换使用的“多核苷酸”、“核苷酸”或“核酸”是指任何长度的核苷酸的聚合物并且包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基和/或它们的类似物，或是可通过DNA或RNA聚合酶或通过合成反应掺入聚合物中的任何底物。多核苷酸可包含修饰的核苷酸，诸如甲基化核苷酸及其类似物。如本文所用，“寡核苷酸”是指短的、通常单链的合成多核苷酸，其长度通常但不一定少于约200个核苷酸。术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”不是相互排斥的。以上针对多核苷酸的描述同样并且完全适用于寡核苷酸。产生本公开的抗体的细胞可包括亲本杂交瘤细胞，以及其中已引入编码抗体的核酸的细菌和真核宿主细胞。除非另有说明，否则本文所公开的任何单链多核苷酸序列的左侧末端是5'末端；双链多核苷酸序列的左侧方向被称为5'方向。新生RNA转录物的5'至3'添加方向被称为转录方向；DNA链上具有与RNA转录物相同序列的序列区域，其在RNA转录物的5'至5'端，被称为“上游序列”；DNA链上具有与RNA转录物相同序列的序列区域，其在RNA转录物的3'至3'端，被称为“下游序列”。
如本文所用，术语“多特异性抗体”是指包含多个免疫球蛋白可变结构域序列的抗体，其中该多个免疫球蛋白可变结构域序列中的第一免疫球蛋白可变结构域序列对第一表位具有结合特异性，并且该多个免疫球蛋白可变结构域序列中的第二免疫球蛋白可变结构域序列对第二表位具有结合特异性。在一个实施方案中，第一表位和第二表位不重叠或基本上不重叠。在一个实施方案中，第一表位和第二表位在不同抗原例如不同蛋白质(或多聚体蛋白质的不同亚基)上。在一个实施方案中，多特异性抗体包含第三、第四或第五免疫球蛋白可变结构域。在一个实施方案中，多特异性抗体是双特异性抗体分子、三特异性抗体分子或四特异性抗体分子。
如本文所用，术语“双特异性抗体”是指结合不超过两个表位或两个抗原的多特异性抗体。双特异性抗体的特征在于对第一表位(例如，NKG2d或NKp46抗原上的表位)具有结合特异性的第一免疫球蛋白可变结构域序列和对第二表位(例如，肿瘤相关抗原(例如，BCMA或GPRC5d抗原)上的表位)具有结合特异性的第二免疫球蛋白可变结构域序列。在一个实施方案中，第一表位和第二表位在不同抗原例如不同蛋白质(或多聚体蛋白质的不同亚基)上。在一个实施方案中，双特异性抗体包含对第一表位具有结合特异性的重链可变结构域序列和轻链可变结构域序列以及对第二表位具有结合特异性的重链可变结构域序列和轻链可变结构域序列。在一个实施方案中，双特异性抗体包含对第一表位具有结合特异性的半抗体或其片段以及对第二表位具有结合特异性的半抗体或其片段。在一个实施方案中，双特异性抗体包含对第一表位具有结合特异性的scFv或其片段以及对第二表位具有结合特异性的scFv或其片段。在一个实施方案中，第一表位位于NKG2d上，并且第二表位位于BCMA上。在一个实施方案中，第一表位位于NKG2d上，并且第二表位位于GPRC5d上。在一个实施方案中，第一表位位于NKp46上，并且第二表位位于BCMA上。在一个实施方案中，第一表位位于NKp46上，并且第二表位位于GPRC5d上。
如本文所用，术语“NKG2d”是指NKG2-D II型整联膜蛋白。NKG2d也可被称为“NK细胞受体D”、“使NKG2-D活化的NK受体”、“CD314”。除非另外指明，否则术语“NKG2d”包括由细胞(包括NK细胞)天然表达或者能够在用编码那些多肽的基因或cDNA转染的细胞上表达的任何NKG2d变体、同种型和物种同源物，在具体的实施方案中，“NKG2d”是人NKG2d。
如本文所用，术语“NKp46”是指自然杀伤细胞p46相关蛋白。NKp46也可被称为“天然细胞毒性触发受体1”、“NK-p46”、“CD335”。除非另外指明，否则术语“NKp46”包括由细胞(包括NK细胞)天然表达或者能够在用编码那些多肽的基因或cDNA转染的细胞上表达的任何NKp46变体、同种型和物种同源物，在具体的实施方案中，“NKp46”是人NKp46。
如本文所用，术语“BCMA”是指B细胞成熟抗原，也被称为TNFRSF17或CD269，是肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族的成员。除非另外指明，否则术语“BCMA”包括由细胞(包括癌症细胞)天然表达或者能够在用编码那些多肽的基因或cDNA转染的细胞上表达的任何BCMA变体、同种型和物种同源物，在具体的实施方案中，“BCMA”是人BCMA。
如本文所用，术语“GPRC5d”是指G蛋白偶联受体家族C组5成员D。除非另外指明，否则术语“GPRC5d”包括由细胞(包括癌症细胞)天然表达或者能够在用编码那些多肽的基因或cDNA转染的细胞上表达的任何GPRC5d变体、同种型和物种同源物，在具体的实施方案中，“GPRC5d”是人GPRC5d。
如本文所用，术语“药学上可接受的”意指在动物并且更具体地在人中使用的由联邦或州政府的监管机构批准的或在美国药典、欧洲药典或其他公认的药典中列出的。
“赋形剂”意指药学上可接受的材料、组合物或媒介物，诸如液体或固体填充剂、稀释剂、溶剂或包封材料。赋形剂包括例如包封材料或添加剂，诸如吸收促进剂、抗氧化剂、粘结剂、缓冲液、载体、包衣剂、着色剂、稀释剂、崩解剂、乳化剂、增量剂、填充剂、调味剂、保湿剂、润滑剂、香料、防腐剂、推进剂、释放剂、灭菌剂、甜味剂、增溶剂、润湿剂以及它们的混合物。术语“赋形剂”还可指稀释剂、佐剂(例如，弗氏佐剂(完全或不完全))或媒介物。
在一些实施方案中，赋形剂是药学上可接受的赋形剂。药学上可接受的赋形剂的示例包括缓冲液，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量(例如，少于约10个氨基酸残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖醇，诸如甘露醇或山梨糖醇；成盐抗衡离子，诸如钠；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEENTM、聚乙二醇(PEG)和PLURONICSTM。药学上可接受的赋形剂的其他示例描述于Remington和Gennaro，Remington's Pharmaceutical Sciences(第18版，1990)中。
在一个实施方案中，每种组分在与药物制剂的其他成分相容的意义上是“药学上可接受的”，并且适用于与人和动物的组织或器官接触而没有过度毒性、刺激、过敏反应、免疫原性或其他问题或并发症，与合理的益处/风险比相称。参见，例如LippincottWilliams&Wilkins:Philadelphia,PA,2005；Handbook ofPharmaceutical Excipients，第6版；Rowe等人编辑；The Pharmaceutical Press and the American PharmaceuticalAssociation:2009；Handbook of Pharmaceutical Additives，第3版；Ash和Ash编辑；Gower Publishing Company:2007；Pharmaceutical Preformulation and Formulation，第2版；Gibson编辑；CRC Press LLC:Boca Raton,FL,2009。在一些实施方案中，药学上可接受的赋形剂在所采用的剂量和浓度下对暴露于其的细胞或哺乳动物无毒。在一些实施方案中，药学上可接受的赋形剂是pH缓冲水溶液。
在一些实施方案中，赋形剂是无菌液体，诸如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源诸如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等的那些。当静脉内施用组合物(例如，药物组合物)时，水是示例性赋形剂。盐水溶液和右旋糖水溶液以及甘油溶液也可用作液体赋形剂，尤其是用于注射溶液。赋形剂还可包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等。如果需要，组合物还可含有少量润湿剂或乳化剂或pH缓冲剂。组合物可采用溶液、悬浮液、乳液、片剂、丸剂、胶囊、粉末、缓释制剂等形式。口服组合物，包括制剂，可包含标准赋形剂，诸如药物级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。
例如，包含药物化合物的组合物可含有抗体，例如以分离或纯化的形式与合适量的赋形剂一起。
如本文所用，术语“有效量”或“治疗有效量”是指足以产生期望结果的本文提供的抗体或药物组合物的量。
术语“受试者”和“患者”可互换使用。如本文所用，在某些实施方案中，受试者是哺乳动物，诸如非灵长类动物(例如，牛、猪、马、猫、狗、大鼠等)或灵长类动物(例如，猴和人)。在具体实施方案中，受试者是人。在一个实施方案中，受试者是被诊断患有病症或障碍的哺乳动物，例如人。在另一个实施方案中，受试者是具有发展病症或障碍的风险的哺乳动物，例如人。
“施用”(administer或administration)是指将存在于体外的物质注射或以其他方式物理递送至患者体内的动作，诸如通过粘膜、皮内、静脉内、肌内、皮下递送和/或本文所述或本领域已知的任何其他物理递送方法。
如本文所用，术语“治疗”(treat、treatment和treating)是指由施用一种或多种疗法引起的疾病或病症的进展、严重程度和/或持续时间的减少或改善。治疗可通过评估是否已存在与潜在障碍相关的一种或多种症状的减少、减轻和/或缓解来确定，使得尽管患者可能仍然受到潜在障碍的折磨，但观察到患者的改善。术语“治疗”包括管理和改善疾病。术语“管理”(manage、managing和management)是指受试者从不一定导致疾病治愈的疗法中获得的有益效果。
术语“预防”(prevention、preventing和prevention)是指降低疾病、障碍、病症或相关联症状发作(或复发)的可能性。
术语“约”和“大约”意指在给定值或范围的20％内、15％内、10％内、9％内、8％内、7％内、6％内、5％内、4％内、3％内、2％内、1％内或更小。
如本公开和权利要求书中所用，单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数形式，除非上下文清楚表明并非如此。
应当理解，在本文中用术语“包括”描述实施方案的任何地方，还提供了根据“由……组成”和/或“基本上由……组成”描述的其他类似实施方案。还应理解，在本文中用短语“基本上由...组成”描述实施方案的任何地方，还提供了根据“由……组成”描述的其他类似实施方案。
如在短语诸如“A与B之间”或“A-B之间”中使用的术语“之间”是指包括A和B两者的范围。
如在短语诸如“A和/或B”中使用的术语“和/或”在此旨在包括A和B两者；A或B；A(单独)；和B(单独)。同样，如在短语诸如“A、B和/或C”中使用的术语“和/或”旨在涵盖以下实施方案中的每个实施方案：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；和C(单独)。
5.2.结合分子
5.2.1.NK细胞结合分子
在一个方面，本文提供了与NK细胞的细胞表面抗原结合的结合分子，诸如抗体或其片段。在一些实施方案中，该抗原是NKG2d。在一些实施方案中，该抗原是NKp46。
在一个方面，本文提供了与NKG2d结合的抗体。在一些实施方案中，该抗体包含重链可变区和轻链可变区。在一些实施方案中，NKG2d抗体不是单结构域抗体或纳米抗体。在一些实施方案中，NKG2d抗体是人源化抗体。
在一些实施方案中，本文提供了与NKG2d特异性结合并且可以调节NK细胞活性的抗体。在一些实施方案中，本文提供的NKG2d抗体可以调节NK细胞的接合。在一些实施方案中，本文提供的NKG2d抗体可以使NK细胞活化。在具体的实施方案中，NK细胞是人NK细胞。
在某些实施方案中，本文提供了抗NKG2d抗体，该抗体包含本文所述的抗体中的任一者的VH区、VL区、VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和/或VL CDR3。在一些实施方案中，本文提供了抗NKG2d抗体，该抗体包含本文所述的抗体中的任一者的VH区。在一些实施方案中，本文提供了抗NKG2d抗体，该抗体包含本文所述的抗体中的任一者的VL区。在一些实施方案中，本文提供了抗NKG2d抗体，该抗体包含本文所述的抗体中的任一者的VH区和本文所述的抗体中的任一者的VL区。在一些实施方案中，本文提供了抗NKG2d抗体，该抗体包含本文所述的抗体中的任一者的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3。在一些实施方案中，本文提供了抗NKG2d抗体，该抗体包含本文所述的抗体中的任一者的VL CDR1、VL CDR2和VLCDR3。在一些实施方案中，本文提供了抗NKG2d抗体，该抗体包含本文所述的抗体中的任一者的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3；和本文所述的抗体中的任一者的VL CDR1、VL CDR2和VLCDR3。在序列表以及表3、4、7和表8中提供了本文提供的NKG2d抗体的代表性VH和VL氨基酸序列，包括VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗体是人源化抗体。在某些实施方案中，抗体是IgG抗体。在其他实施方案中，IgG抗体是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体。在一些实施方案中，该抗体是双特异性抗体。在某些实施方案中，该抗体是多价的。在其他实施方案中，该抗体能够结合至少三个抗原。在一些实施方案中，该抗体能够结合至少五个抗原。
在某些实施方案中，提供了是完整的抗体的抗NKG2d抗体。在其他实施方案中，提供的是抗NKG2d抗体是抗NKG2d抗体的抗原结合片段。在一些实施方案中，抗NKG2d抗体的抗原结合片段是功能性片段。在一些实施方案中，抗原结合片段是双价抗体。在一些实施方案中，抗原结合片段是Fab。在一些实施方案中，抗原结合片段是Fab’。在一些实施方案中，抗原结合片段是F(ab’)2。在一些实施方案中，抗原结合片段是Fv片段。在一些实施方案中，抗原结合片段是二硫键稳定的Fv片段(dsFv)。在一些实施方案中，抗原结合片段是(dsFv)2。在一些实施方案中，抗原结合片段是双特异性dsFv(dsFv-dsFv’)。在一些实施方案中，抗原结合片段是二硫键稳定的双价抗体(ds双价抗体)。在一些实施方案中，抗原结合片段是单链抗体分子(scFv)。在一些实施方案中，抗原结合片段是单结构域抗体(sdAb)。在一些实施方案中，抗原结合片段是scFv二聚体(二价双价抗体)。在一些实施方案中，抗原结合片段是由包含一个或多个CDR的抗体的一部分形成的多特异性抗体。在一些实施方案中，抗原结合片段是结构域抗体。在一些实施方案中，抗原结合片段是二价结构域抗体。在一些实施方案中，抗原结合片段是与抗原结合但不包含完整抗体结构的抗体片段。
在具体的实施方案中，NKG2d抗体包含VH区和VL区。在一些实施方案中，NKG2d抗体是单链抗体。在一些实施方案中，NKG2d抗体是单结构域抗体。在一些实施方案中，抗原结合片段是骆驼化单结构域抗体。在一些实施方案中，NKG2d抗体是纳米抗体。在某些实施方案中，NKG2d抗体是VHH抗体。在某些实施方案中，NKG2d抗体是美洲驼抗体。在一些实施方案中，NKG2d抗体不是单链抗体。在一些实施方案中，NKG2d抗体不是单结构域抗体。在一些实施方案中，NKG2d抗体不是纳米抗体。在某些实施方案中，NKG2d抗体不是VHH抗体。在某些实施方案中，NKG2d抗体不是美洲驼抗体。在一些实施方案中，NKG2d抗体是多特异性抗体。在其他实施方案中，NKG2d是双特异性抗体。在某些实施方案中，多特异性抗体包含本文提供的NKG2d抗体的抗原结合片段。在其他实施方案中，双特异性抗体包含本文提供的NKG2d抗体的抗原结合片段。在一些实施方案中，NKG2d抗体是激动性抗体。在某些实施方案中，NKG2d抗体使NK细胞活化。在一些实施方案中，NKG2d抗体调节NK细胞的活性。在一些实施方案中，NKG2d抗体既不活化也不灭活NK细胞的活性。在具体的实施方案中，NK细胞是人NK细胞。
在一些实施方案中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3序列根据Kabat编号系统。在一些实施方案中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3序列根据Chothia编号系统。在一些实施方案中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VLCDR1、VL CDR2和VL CDR3序列根据示例性编号系统。在一些实施方案中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3序列根据Contact编号系统。在一些实施方案中，VHCDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3序列根据IMGT编号系统。在一些实施方案中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3序列根据AbM编号系统。本文提供了某些抗体实施方案的6个CDR(VH CDR1-3和VL CDR1-3)的示例性组。设想了其它CDR组并且在本文所提供的抗体实施方案的范围内。
在一些实施方案中，本文提供的抗体结合NKG2d。在一些实施方案中，结合NKG2d的抗体包含VH，该VH包含分别具有SEQ ID NO:2的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3。在一些实施方案中，结合NKG2d的抗体包含VL，该VL包含分别具有SEQ ID NO:3的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VLCDR3。在一些实施方案中，结合NKG2d的抗体包含：(i)VH，该VH包含分别具有SEQ ID NO:2的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3；和(ii)VL，该VL包含分别具有SEQ ID NO:3的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR1、VLCDR2和VL CDR3。在一些实施方案中，根据Kabat编号方案、IMGT编号方案、AbM编号方案、Chothia编号方案、Contact编号方案或它们的组合确定CDR1、CDR2或CDR3。在一些实施方案中，结合NKG2d的抗体包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的VH。在一些实施方案中，结合NKG2d的抗体包含具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，结合NKG2d的抗体包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的VL。
在一些实施方案中，结合NKG2d的抗体包含：(i)VH，该VH包含分别具有SEQ ID NO:4、5和6的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3；和(ii)VL，该VL包含分别具有SEQ IDNO:7、8和9的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。在一些实施方案中，结合NKG2d的抗体包含：(i)VH，该VH包含分别具有SEQ ID NO:10、11和12的氨基酸序列的VH CDR1、VHCDR2和VH CDR3；和(ii)VL，该VL包含分别具有SEQ ID NO:13、14和15的氨基酸序列的VLCDR1、VL CDR2和VL CDR3。在一些实施方案中，结合NKG2d的抗体包含：(i)VH，该VH包含分别具有SEQ ID NO:16、17和18的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3；和(ii)VL，该VL包含分别具有SEQ ID NO:19、20和21的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。在一些实施方案中，结合NKG2d的抗体包含：(i)VH，该VH包含分别具有SEQ ID NO:22、23和24的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3；和(ii)VL，该VL包含分别具有SEQ ID NO:25、26和27的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。在一些实施方案中，结合NKG2d的抗体包含：(i)VH，该VH包含分别具有SEQ ID NO:28、29和30的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VHCDR3；和(ii)VL，该VL包含分别具有SEQ ID NO:31、32和33的氨基酸序列的VL CDR1、VLCDR2和VL CDR3。
在一些实施方案中，抗体还包含SEQ ID NO:2和/或SEQ ID NO:3的一个或多个框架区。在一些实施方案中，本文提供的抗体是人源化抗体。本文所述的框架区是基于CDR编号系统的边界确定的。换句话讲，如果CDR是通过例如例如Kabat、IMGT或Chothia来确定的，则构架区是可变区中CDR周围的氨基酸残基，从N-末端到C-末端的形式：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。例如，FR1被定义为由例如Kabat编号系统、IMGT编号系统或Chothia编号系统定义的CDR1氨基酸残基的N-末端氨基酸残基，FR2被定义为由例如Kabat编号系统、IMGT编号系统或Chothia编号系统定义的CDR1与CDR2氨基酸残基之间的氨基酸残基，FR3被定义为由例如Kabat编号系统、IMGT编号系统或Chothia编号系统定义的CDR2与CDR3氨基酸残基之间的氨基酸残基，并且FR4被定义为由例如Kabat编号系统、IMGT编号系统或Chothia编号系统定义的CDR3氨基酸残基的C-末端氨基酸残基。
在一些实施方案中，结合NKG2d的抗体包含VH，该VH包含分别具有SEQ ID NO:34的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3。在一些实施方案中，结合NKG2d的抗体包含VL，该VL包含分别具有SEQ ID NO:35的VL CDR1、VL CDR2和VLCDR3的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。在一些实施方案中，结合NKG2d的抗体包含：(i)VH，该VH包含分别具有SEQ ID NO:34的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3；和(ii)VL，该VL包含分别具有SEQ ID NO:35的VL CDR1、VLCDR2和VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。在一些实施方案中，根据Kabat编号方案、IMGT编号方案、AbM编号方案、Chothia编号方案、Contact编号方案或它们的组合确定CDR1、CDR2或CDR3。在一些实施方案中，结合NKG2d的抗体包含具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的VH。在一些实施方案中，结合NKG2d的抗体包含具有SEQ ID NO:35的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，结合NKG2d的抗体包含具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:35的氨基酸序列的VL。
在一些实施方案中，结合NKG2d的抗体包含：(i)VH，该VH包含分别具有SEQ ID NO:36、37和38的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3；和(ii)VL，该VL包含分别具有SEQID NO:39、40和41的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。在一些实施方案中，结合NKG2d的抗体包含：(i)VH，该VH包含分别具有SEQ ID NO:42、43和44的氨基酸序列的VHCDR1、VH CDR2和VH CDR3；和(ii)VL，该VL包含分别具有SEQ ID NO:45、46和47的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。在一些实施方案中，结合NKG2d的抗体包含：(i)VH，该VH包含分别具有SEQ ID NO:48、49和50的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3；和(ii)VL，该VL包含分别具有SEQ ID NO:51、52和53的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。在一些实施方案中，结合NKG2d的抗体包含：(i)VH，该VH包含分别具有SEQ ID NO:54、55和56的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3；和(ii)VL，该VL包含分别具有SEQ ID NO:57、58和59的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。在一些实施方案中，结合NKG2d的抗体包含：(i)VH，该VH包含分别具有SEQ ID NO:60、61和62的氨基酸序列的VH CDR1、VHCDR2和VH CDR3；和(ii)VL，该VL包含分别具有SEQ ID NO:63、64和65的氨基酸序列的VLCDR1、VL CDR2和VL CDR3。
在一些实施方案中，抗体还包含SEQ ID NO:34和/或SEQ ID NO:35的一个或多个框架区。在一些实施方案中，本文提供的抗体是人源化抗体。本文所述的框架区是基于CDR编号系统的边界确定的。换句话讲，如果CDR是通过例如例如Kabat、IMGT或Chothia来确定的，则构架区是可变区中CDR周围的氨基酸残基，从N-末端到C-末端的形式：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。例如，FR1被定义为由例如Kabat编号系统、IMGT编号系统或Chothia编号系统定义的CDR1氨基酸残基的N-末端氨基酸残基，FR2被定义为由例如Kabat编号系统、IMGT编号系统或Chothia编号系统定义的CDR1与CDR2氨基酸残基之间的氨基酸残基，FR3被定义为由例如Kabat编号系统、IMGT编号系统或Chothia编号系统定义的CDR2与CDR3氨基酸残基之间的氨基酸残基，并且FR4被定义为由例如Kabat编号系统、IMGT编号系统或Chothia编号系统定义的CDR3氨基酸残基的C-末端氨基酸残基。
在某些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段包含相对于上述抗体中的任一种具有某些百分比同一性的氨基酸序列。
两个序列(例如，氨基酸序列或核酸序列)之间的同一性百分比的测定可使用数学算法来完成。用于比较两个序列的数学算法的非限制性示例为Karlin和Altschul,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87:22642268(1990)的算法，如Karlin和Altschul,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:58735877(1993)中那样进行修改。此类算法并入Altschul等人，J.Mol.Biol.215:403(1990)的NBLAST和XBLAST程序中。可用NBLAST核苷酸程序参数集进行BLAST核苷酸检索，例如，对于评分＝100，字长＝12，以获得与本文所述的核酸分子同源的核苷酸序列。可用XBLAST程序参数集进行BLAST蛋白质检索，例如，对于得分50，字长＝3，以获得与本文所述的蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的空位比对，可如Altschul等人，Nucleic Acids Res.25:33893402(1997)所述那样利用空位BLAST。另选地，可使用PSI BLAST执行检测分子之间的距离关系(Id.)的迭代检索。当利用BLAST、空位BLAST和PSI Blast程序时，可使用相应程序(例如XBLAST和NBLAST)的默认参数(参见例如，万维网上的国家生物技术信息中心(NCBI)，ncbi.nlm.nih.gov)。用于比较序列的数学算法的另一非限制性示例为Myers和Miller,CABIOS 4:11-17(1998)的算法。此类算法并入ALIGN程序(版本2.0)中，其是GCG序列比对软件包的一部分。当利用ALIGN程序比较氨基酸序列时，可使用PAM120权重残基表、空位长度罚分12、空位罚分4。两个序列之间的同一性百分比可使用与上述那些类似的技术来确定，允许或不允许空位。在计算百分比同一性时，通常仅计数精确匹配。
在一些实施方案中，提供了一种抗NKG2d抗体，其包含与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少约75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性中的任一者的VH。在一些实施方案中，提供了一种抗NKG2d抗体，其包含与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少约75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性中的任一者的VL。在一些实施方案中，提供了一种抗NKG2d抗体，其包含与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少约75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性中的任一者的VH，和与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少约75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性中的任一者的VL。
在一些实施方案中，提供了一种抗NKG2d抗体，其包含与SEQ ID NO:34的氨基酸序列具有至少约75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性中的任一者的VH。在一些实施方案中，提供了一种抗NKG2d抗体，其包含与SEQ ID NO:35的氨基酸序列具有至少约75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性中的任一者的VL。在一些实施方案中，提供了一种抗NKG2d抗体，其包含与SEQ ID NO:34的氨基酸序列具有至少约75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性中的任一者的VH，和与SEQ IDNO:35的氨基酸序列具有至少约75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性中的任一者的VL。
在一些实施方案中，相对于参考序列，具有至少约75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性中的任一者的VH或VL序列含有取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但包含该序列的抗体保留与NKG2d结合的能力。在一些实施方案中，总共1个至10个氨基酸已被取代、插入和/或缺失。在一些实施方案中，取代、插入或缺失发生在CDR之外的区域中(即，在FR中)。
在另一方面，本文提供了与本文所述的NKG2d抗体中的任一者竞争与NKG2d结合的抗体。在另一方面，本文提供了与本文所述的NKG2d抗体中的任一者结合相同表位的抗体。在另一方面，提供了一种NKG2d抗体，其结合NKG2d上的表位，该表位与由本文所述的NKG2d抗体结合的NKG2d上的表位重叠。
在一个方面，提供了一种抗体，其与NKG2d参考抗体竞争与NKG2d结合。在另一方面，提供了一种NKG2d抗体，其与NKG2d参考抗体结合相同的NKG2d表位。在另一方面，提供了一种NKG2d抗体，其结合NKG2d上的表位，该表位与由NKG2d参考抗体结合的NKG2d上的表位重叠。
在一个实施方案中，NKG2d参考抗体包含：(i)VH，该VH包含分别具有VH CDR1、VHCDR2和VH CDR3的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，这些VH CDR属于具有SEQ IDNO:2的氨基酸序列的VH；和(ii)VL，该VL包含分别具有VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，这些VL CDR属于具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的VL。在一个实施方案中，NKG2d参考抗体包含：(i)VH，该VH包含分别具有VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，这些VH CDR属于具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的VH；和(ii)VL，该VL包含分别具有VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，这些VL CDR属于具有SEQ ID NO:35的氨基酸序列的VL。
在一个方面，本文提供了与NKp46结合的抗体。在一些实施方案中，该抗体包含重链可变区和轻链可变区。在一些实施方案中，NKp46抗体不是单结构域抗体或纳米抗体。在一些实施方案中，NKp46抗体是人源化抗体。
在一些实施方案中，本文提供了与NKp46特异性结合并且可以调节NK细胞活性的抗体。在一些实施方案中，本文提供的NKp46抗体可以调节NK细胞的接合。在一些实施方案中，本文提供的NKp46抗体可以使NK细胞活化。在具体的实施方案中，NK细胞是人NK细胞。
在某些实施方案中，本文提供了抗NKp46抗体，该抗体包含本文所述的抗体中的任一者的VH区、VL区、VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和/或VL CDR3。在一些实施方案中，本文提供了抗NKp46抗体，该抗体包含本文所述的抗体中的任一者的VH区。在一些实施方案中，本文提供了抗NKp46抗体，该抗体包含本文所述的抗体中的任一者的VL区。在一些实施方案中，本文提供了抗NKp46抗体，该抗体包含本文所述的抗体中的任一者的VH区和本文所述的抗体中的任一者的VL区。在一些实施方案中，本文提供了抗NKp46抗体，该抗体包含本文所述的抗体中的任一者的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3。在一些实施方案中，本文提供了抗NKp46抗体，该抗体包含本文所述的抗体中的任一者的VL CDR1、VL CDR2和VLCDR3。在一些实施方案中，本文提供了抗NKp46抗体，该抗体包含本文所述的抗体中的任一者的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3；和本文所述的抗体中的任一者的VL CDR1、VL CDR2和VLCDR3。在序列表以及表14至表15中提供了本文提供的NKp46抗体的代表性VH和VL氨基酸序列，包括VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗体是人源化抗体。在某些实施方案中，抗体是IgG抗体。在其他实施方案中，IgG抗体是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体。在一些实施方案中，该抗体是双特异性抗体。在某些实施方案中，该抗体是多价的。在其他实施方案中，该抗体能够结合至少三个抗原。在一些实施方案中，该抗体能够结合至少五个抗原。
在某些实施方案中，提供了是完整的抗体的NKp46抗体。在其他实施方案中，提供的是NKp46抗体是NKp46抗体的抗原结合片段。在一些实施方案中，NKp46抗体的抗原结合片段是功能性片段。在一些实施方案中，抗原结合片段是双价抗体。在一些实施方案中，抗原结合片段是Fab。在一些实施方案中，抗原结合片段是Fab’。在一些实施方案中，抗原结合片段是F(ab’)2。在一些实施方案中，抗原结合片段是Fv片段。在一些实施方案中，抗原结合片段是二硫键稳定的Fv片段(dsFv)。在一些实施方案中，抗原结合片段是(dsFv)2。在一些实施方案中，抗原结合片段是双特异性dsFv(dsFv-dsFv’)。在一些实施方案中，抗原结合片段是二硫键稳定的双价抗体(ds双价抗体)。在一些实施方案中，抗原结合片段是单链抗体分子(scFv)。在一些实施方案中，抗原结合片段是单结构域抗体(sdAb)。在一些实施方案中，抗原结合片段是scFv二聚体(二价双价抗体)。在一些实施方案中，抗原结合片段是由包含一个或多个CDR的抗体的一部分形成的多特异性抗体。在一些实施方案中，抗原结合片段是结构域抗体。在一些实施方案中，抗原结合片段是二价结构域抗体。在一些实施方案中，抗原结合片段是与抗原结合但不包含完整抗体结构的抗体片段。
在具体的实施方案中，NKp46抗体包含VH区和VL区。在一些实施方案中，NKp46抗体是单链抗体。在一些实施方案中，NKp46抗体是单结构域抗体。在一些实施方案中，抗原结合片段是骆驼化单结构域抗体。在一些实施方案中，NKp46抗体是纳米抗体。在某些实施方案中，NKp46抗体是VHH抗体。在某些实施方案中，NKp46抗体是美洲驼抗体。在一些实施方案中，NKp46抗体不是单链抗体。在一些实施方案中，NKp46抗体不是单结构域抗体。在一些实施方案中，NKp46抗体不是纳米抗体。在某些实施方案中，NKp46抗体不是VHH抗体。在某些实施方案中，NKp46抗体不是美洲驼抗体。在一些实施方案中，NKp46抗体是多特异性抗体。在其他实施方案中，NKp46是双特异性抗体。在某些实施方案中，多特异性抗体包含本文提供的NKp46抗体的抗原结合片段。在其他实施方案中，双特异性抗体包含本文提供的NKp46抗体的抗原结合片段。在一些实施方案中，NKp46抗体是激动性抗体。在某些实施方案中，NKp46抗体使NK细胞活化。在一些实施方案中，NKp46抗体调节NK细胞的活性。在一些实施方案中，NKp46抗体既不活化也不灭活NK细胞的活性。在具体的实施方案中，NK细胞是人NK细胞。
在一些实施方案中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3序列根据Kabat编号系统。在一些实施方案中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3序列根据Chothia编号系统。在一些实施方案中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VLCDR1、VL CDR2和VL CDR3序列根据示例性编号系统。在一些实施方案中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3序列根据Contact编号系统。在一些实施方案中，VHCDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3序列根据IMGT编号系统。在一些实施方案中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3序列根据AbM编号系统。本文提供了某些抗体实施方案的6个CDR(VH CDR1-3和VL CDR1-3)的示例性组。设想了其它CDR组并且在本文所提供的抗体实施方案的范围内。
在一些实施方案中，本文提供的抗体结合NKp46。在一些实施方案中，结合NKp46的抗体包含VH，该VH包含分别具有SEQ ID NO:67的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3。在一些实施方案中，结合NKp46的抗体包含VL，该VL包含分别具有SEQ ID NO:68的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VLCDR3。在一些实施方案中，结合NKp46的抗体包含：(i)VH，该VH包含分别具有SEQ ID NO:67的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3；和(ii)VL，该VL包含分别具有SEQ ID NO:68的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR1、VLCDR2和VL CDR3。在一些实施方案中，根据Kabat编号方案、IMGT编号方案、AbM编号方案、Chothia编号方案、Contact编号方案或它们的组合确定CDR1、CDR2或CDR3。在一些实施方案中，结合NKp46的抗体包含具有SEQ ID NO:67的氨基酸序列的VH。在一些实施方案中，结合NKp46的抗体包含具有SEQ ID NO:68的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，结合NKp46的抗体包含具有SEQ ID NO:67的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:68的氨基酸序列的VL。
在一些实施方案中，结合NKp46的抗体包含：(i)VH，该VH包含分别具有SEQ ID NO:69、70和71的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3；和(ii)VL，该VL包含分别具有SEQID NO:72、73和74的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。在一些实施方案中，结合NKp46的抗体包含：(i)VH，该VH包含分别具有SEQ ID NO:75、76和77的氨基酸序列的VHCDR1、VH CDR2和VH CDR3；和(ii)VL，该VL包含分别具有SEQ ID NO:78、79和80的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。在一些实施方案中，结合NKp46的抗体包含：(i)VH，该VH包含分别具有SEQ ID NO:81、82和83的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3；和(ii)VL，该VL包含分别具有SEQ ID NO:84、85和86的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。在一些实施方案中，结合NKp46的抗体包含：(i)VH，该VH包含分别具有SEQ ID NO:87、88和89的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3；和(ii)VL，该VL包含分别具有SEQ ID NO:90、91和92的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。在一些实施方案中，结合NKp46的抗体包含：(i)VH，该VH包含分别具有SEQ ID NO:93、94和95的氨基酸序列的VH CDR1、VHCDR2和VH CDR3；和(ii)VL，该VL包含分别具有SEQ ID NO:96、97和98的氨基酸序列的VLCDR1、VL CDR2和VL CDR3。
在一些实施方案中，抗体还包含SEQ ID NO:67和/或SEQ ID NO:68的一个或多个框架区。在一些实施方案中，本文提供的抗体是人源化抗体。本文所述的框架区是基于CDR编号系统的边界确定的。换句话讲，如果CDR是通过例如例如Kabat、IMGT或Chothia来确定的，则构架区是可变区中CDR周围的氨基酸残基，从N-末端到C-末端的形式：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。例如，FR1被定义为由例如Kabat编号系统、IMGT编号系统或Chothia编号系统定义的CDR1氨基酸残基的N-末端氨基酸残基，FR2被定义为由例如Kabat编号系统、IMGT编号系统或Chothia编号系统定义的CDR1与CDR2氨基酸残基之间的氨基酸残基，FR3被定义为由例如Kabat编号系统、IMGT编号系统或Chothia编号系统定义的CDR2与CDR3氨基酸残基之间的氨基酸残基，并且FR4被定义为由例如Kabat编号系统、IMGT编号系统或Chothia编号系统定义的CDR3氨基酸残基的C-末端氨基酸残基。
在某些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段包含相对于上述抗体中的任一种具有某些百分比同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，提供了一种抗NKp46抗体，其包含与SEQ ID NO:67的氨基酸序列具有至少约75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性中的任一者的VH。在一些实施方案中，提供了一种抗NKp46抗体，其包含与SEQ ID NO:68的氨基酸序列具有至少约75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性中的任一者的VL。在一些实施方案中，提供了一种抗NKp46抗体，其包含与SEQ ID NO:67的氨基酸序列具有至少约75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性中的任一者的VH，和与SEQ ID NO:68的氨基酸序列具有至少约75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性中的任一者的VL。
在一些实施方案中，相对于参考序列，具有至少约75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性中的任一者的VH或VL序列含有取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但包含该序列的抗体保留与NKp46结合的能力。在一些实施方案中，总共1个至10个氨基酸已被取代、插入和/或缺失。在一些实施方案中，取代、插入或缺失发生在CDR之外的区域中(即，在FR中)。
在另一方面，本文提供了与本文所述的NKp46抗体中的任一者竞争与NKp46结合的抗体。在另一方面，本文提供了与本文所述的NKp46抗体中的任一者结合相同表位的抗体。在另一方面，提供了一种NKp46抗体，其结合NKp46上的表位，该表位与由本文所述的NKp46抗体结合的NKp46上的表位重叠。
在一个方面，提供了一种抗体，其与NKp46参考抗体竞争与NKp46结合。在另一方面，提供了一种NKp46抗体，其与NKp46参考抗体结合相同的NKp46表位。在另一方面，提供了一种NKp46抗体，其结合NKp46上的表位，该表位与由NKp46参考抗体结合的NKp46上的表位重叠。
在一个实施方案中，NKp46参考抗体包含：(i)VH，该VH包含分别具有VH CDR1、VHCDR2和VH CDR3的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，这些VH CDR属于具有SEQ IDNO:67的氨基酸序列的VH；和(ii)VL，该VL包含分别具有VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，这些VL CDR属于具有SEQ ID NO:68的氨基酸序列的VL。
本文提供的抗体可以来自任何动物来源，包括鸟和哺乳动物(例如，人、猴、鼠、驴、绵羊、兔、山羊、豚鼠、骆驼、马或鸡)。在某些实施方案中，本文提供的抗体是人或人源化单克隆抗体。如本文所用，“人”抗体包括具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗体，并且包括从人免疫球蛋白文库或从表达来自人基因的抗体的小鼠分离的抗体。
在某些实施方案中，抗体是全小鼠抗体。在某些实施方案中，抗体是小鼠-人嵌合抗体。在某些实施方案中，抗体是人源化抗体。在某些实施方案中，抗体是全人抗体。在其他实施方案中，本文提供的抗体是人源化抗体(例如，包含人恒定区和框架区)。本文提供的抗体可以是双特异性的、三特异性的或更高的多特异性。
在一些实施方案中，本文提供的抗体或抗原结合片段以小于1000nM的KD结合NKG2d。在一些实施方案中，本文提供的抗体或抗原结合片段以小于100nM的KD结合NKG2d。在一些实施方案中，本文提供的抗体或抗原结合片段以小于50nM的KD结合NKG2d。在一些实施方案中，本文提供的抗体或抗原结合片段以小于40nM的KD结合NKG2d。在一些实施方案中，本文提供的抗体或抗原结合片段以小于30nM的KD结合NKG2d。在一些实施方案中，本文提供的抗体或抗原结合片段以小于20nM的KD结合NKG2d。在一些实施方案中，本文提供的抗体或抗原结合片段以小于10nM的KD结合NKG2d。在一些实施方案中，本文提供的抗体或抗原结合片段以小于9nM的KD结合NKG2d。在一些实施方案中，本文提供的抗体或抗原结合片段以小于8nM的KD结合NKG2d。在一些实施方案中，本文提供的抗体或抗原结合片段以小于7nM的KD结合NKG2d。在一些实施方案中，本文提供的抗体或抗原结合片段以小于6nM的KD结合NKG2d。在一些实施方案中，本文提供的抗体或抗原结合片段以小于5nM的KD结合NKG2d。在一些实施方案中，本文提供的抗体或抗原结合片段以小于4nM的KD结合NKG2d。在一些实施方案中，本文提供的抗体或抗原结合片段以小于3nM的KD结合NKG2d。在一些实施方案中，本文提供的抗体或抗原结合片段以小于2nM的KD结合NKG2d。在一些实施方案中，本文提供的抗体或抗原结合片段以小于1nM的KD结合NKG2d。在一些实施方案中，本文提供的抗体或抗原结合片段以小于0.1nM的KD结合NKG2d。在一些实施方案中，本文提供的抗体或抗原结合片段以小于0.01nM的KD结合NKG2d。KD或KD值还可通过本领域中任何已知的方法来测量，例如，使用生物层干涉法(BLI)或表面等离子体共振(SPR)测定由使用例如/>系统、或由/>使用例如/>TM-2000或/>TM-3000来测量。“结合速率”或“缔合的速率”或“缔合速率”或“kon”也可用上述相同的生物层干涉测量法(BLI)或表面等离子共振(SPR)技术使用例如/> TM-2000或/>TM-3000系统来确定。在一个具体的实施方案中，KD通过/>测定来确定。在一些实施方案中，NKG2d是人NKG2d。在一些实施方案中，NKG2d是食蟹猕猴NKG2d。在一些实施方案中，NKG2d是大鼠NKG2d。在其他实施方案中，NKG2d是小鼠NKG2d。
在其他实施方案中，本文提供的抗体或抗原结合片段以小于1000nM的KD结合NKp46。在一些实施方案中，本文提供的抗体或抗原结合片段以小于100nM的KD结合NKp46。在一些实施方案中，本文提供的抗体或抗原结合片段以小于50nM的KD结合NKp46。在一些实施方案中，本文提供的抗体或抗原结合片段以小于40nM的KD结合NKp46。在一些实施方案中，本文提供的抗体或抗原结合片段以小于30nM的KD结合NKp46。在一些实施方案中，本文提供的抗体或抗原结合片段以小于20nM的KD结合NKp46。在一些实施方案中，本文提供的抗体或抗原结合片段以小于10nM的KD结合NKp46。在一些实施方案中，本文提供的抗体或抗原结合片段以小于9nM的KD结合NKp46。在一些实施方案中，本文提供的抗体或抗原结合片段以小于8nM的KD结合NKp46。在一些实施方案中，本文提供的抗体或抗原结合片段以小于7nM的KD结合NKp46。在一些实施方案中，本文提供的抗体或抗原结合片段以小于6nM的KD结合NKp46。在一些实施方案中，本文提供的抗体或抗原结合片段以小于5nM的KD结合NKp46。在一些实施方案中，本文提供的抗体或抗原结合片段以小于4nM的KD结合NKp46。在一些实施方案中，本文提供的抗体或抗原结合片段以小于3nM的KD结合NKp46。在一些实施方案中，本文提供的抗体或抗原结合片段以小于2nM的KD结合NKp46。在一些实施方案中，本文提供的抗体或抗原结合片段以小于1nM的KD结合NKp46。在一些实施方案中，本文提供的抗体或抗原结合片段以小于0.1nM的KD结合NKp46。在一些实施方案中，本文提供的抗体或抗原结合片段以小于0.01nM的KD结合NKp46。KD或KD值还可通过本领域中任何已知的方法来测量，例如，使用生物层干涉法(BLI)或表面等离子体共振(SPR)测定由使用例如/>Red96系统、或由/>使用例如/>TM-2000或/>TM-3000来测量。“结合速率”或“缔合的速率”或“缔合速率”或“kon”也可用上述相同的生物层干涉测量法(BLI)或表面等离子共振(SPR)技术使用例如/>TM-2000或/>TM-3000系统来确定。在一个具体的实施方案中，KD通过/>测定来确定。在一些实施方案中，NKp46是人NKp46。在一些实施方案中，NKp46是食蟹猕猴NKp46。在一些实施方案中，NKp46是大鼠NKp46。在其他实施方案中，NKp46是小鼠NKp46。
在一些实施方案中，本文提供了与NKG2d特异性结合并且可以调节NK细胞活性的抗体。在一些实施方案中，本文提供了与NKG2d特异性结合并且可以调节表达NKG2d的免疫效应细胞的活性的抗体。
在一些实施方案中，本文提供了与NKp46特异性结合并且可以调节NK细胞活性的抗体。
在一些实施方案中，本文提供了与NKp46特异性结合并且可以调节表达NKp46的免疫效应细胞的活性的抗体。在一些实施方案中，表达NKp46的免疫效应细胞是T细胞。在一些实施方案中，T细胞是γδT细胞。在一些实施方案中，T细胞是先天淋巴细胞的粘膜群体。
在一些实施方案中，本文提供了与NKp46特异性结合并且可以调节T细胞活性的抗体。在一些实施方案中，T细胞是γδT细胞。在一些实施方案中，T细胞是先天淋巴细胞的粘膜群体。
在一些实施方案中，本文所述的抗体可使NK细胞活化。在一些实施方案中，本文所述的抗体使NK细胞活性活化至少约10％。在一些实施方案中，本文所述的抗体使NK细胞活性活化至少约20％。在一些实施方案中，本文所述的抗体使NK细胞活性活化至少约30％。在一些实施方案中，本文所述的抗体使NK细胞活性活化至少约40％。在一些实施方案中，本文所述的抗体使NK细胞活性活化至少约50％。在一些实施方案中，本文所述的抗体使NK细胞活性活化至少约60％。在一些实施方案中，本文所述的抗体使NK细胞活性活化至少约70％。在一些实施方案中，本文所述的抗体使NK细胞活性活化至少约80％。在一些实施方案中，本文所述的抗体使NK细胞活性活化至少约90％。在一些实施方案中，本文所述的抗体使NK细胞活性活化至少约95％。在某些实施方案中，本文所述的抗体使NK细胞活性活化至少约15％至约65％。在某些实施方案中，本文所述的抗体使NK细胞活性活化至少约20％至约65％。在某些实施方案中，本文所述的抗体使NK细胞活性活化至少约30％至约65％。在具体的实施方案中，NK细胞是人NK细胞。
在一些实施方案中，本文所述的抗体可促进NK细胞的IFNg产生。在一些实施方案中，本文所述的抗体将NK细胞的IFNg产生促进至少10％。在一些实施方案中，本文所述的抗体将NK细胞的IFNg产生促进至少20％。在一些实施方案中，本文所述的抗体将NK细胞的IFNg产生促进至少30％。在一些实施方案中，本文所述的抗体将NK细胞的IFNg产生促进至少40％。在一些实施方案中，本文所述的抗体将NK细胞的IFNg产生促进至少50％。在一些实施方案中，本文所述的抗体将NK细胞的IFNg产生促进至少60％。在一些实施方案中，本文所述的抗体将NK细胞的IFNg产生促进至少70％。在一些实施方案中，本文所述的抗体将NK细胞的IFNg产生促进至少80％。在一些实施方案中，本文所述的抗体将NK细胞的IFNg产生促进至少90％。在一些实施方案中，本文所述的抗体将NK细胞的IFNg产生促进至少95％。在某些实施方案中，本文所述的抗体将NK细胞的IFNg产生促进至少约15％至约65％。在某些实施方案中，本文所述的抗体将NK细胞的IFNg产生促进至少约20％至约65％。在某些实施方案中，本文所述的抗体将NK细胞的IFNg产生促进至少约30％至约65％。在具体的实施方案中，NK细胞是人NK细胞。
5.2.2.多特异性分子
本文提供的多特异性分子包含能够与存在于NK细胞上的抗原结合的结合结构域。在一些实施方案中，该抗原是NKG2d。在一些实施方案中，该抗原是NKp46。在一些实施方案中，第一结合结构域是如所描述的或来源于上述抗体。
除了上述结构域之外，本文提供的多特异性分子包含能够与第二抗原结合的附加结构域。在一些实施方案中，第二结合结构域能够与在肿瘤细胞上表达的抗原结合。在一些实施方案中，第二结合结构域能够与肿瘤特异性抗原(TSA)或肿瘤相关抗原(TAA)结合。在一些实施方案中，第二结合结构域能够与BCMA结合。在一些实施方案中，第二结合结构域能够与GPRC5d结合。
肿瘤抗原是由肿瘤细胞产生的蛋白，可以引发免疫应答，特别是T细胞介导的免疫应答。示例性的肿瘤抗原包括但不限于胶质瘤相关抗原、癌胚性抗原(CEA)、β-人绒毛膜促性腺激素、甲胎蛋白(AFP)、凝集素反应性AFP、甲状腺球蛋白、RAGE-1、MN-CAIX、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2(AS)、肠羧基酯酶、mut hsp70-2、M-CSF、前列腺酶、前列腺特异性抗原(PSA)、PAP、NY-ESO-1、LAGE-la、p53、prostein、PSMA、HER2/neu、存活蛋白和端粒酶、前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA-1)、MAGE、ELF2M、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、ephrinB2、胰岛素生长因子(IGF)-I、IGF-II、IGF-I受体和间皮素。
在一些实施方案中，肿瘤抗原包含与恶性肿瘤相关的一个或多个抗原性癌症表位。恶性肿瘤表达许多可作为免疫攻击的靶抗原的蛋白质。这些分子包括但不限于组织特异性抗原，诸如黑素瘤中的MART-1、酪氨酸酶和gp100，以及前列腺癌中的前列腺酸性磷酸酶(PAP)和前列腺特异性抗原(PSA)。其他靶分子属于转化相关分子的组，诸如癌基因HER2/Neu/ErbB-2。又一组靶抗原是癌胚胎抗原，诸如癌胚抗原(CEA)。
在一些实施方案中，肿瘤抗原是肿瘤特异性抗原(TSA)或肿瘤相关抗原(TAA)。TSA对于肿瘤细胞是独有的，并且不出现在体内的其他细胞上。TAA相关抗原不是肿瘤细胞独有的，而是在未能诱导对抗原的免疫耐受状态的条件下也在正常细胞上表达。抗原在肿瘤上的表达可以在能够使免疫系统对抗原应答的条件下发生。TAA可以是在胎儿发育期间(当免疫系统不成熟时)在正常细胞上表达并且不能应答的抗原，或者它们可以是通常以极低水平存在于正常细胞上但以高得多的水平在肿瘤细胞上表达的抗原。
TSA或TAA抗原的非限制性示例包括：分化抗原诸如MART-1/MelanA(MART-I)、gp100(Pmel 17)、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2和肿瘤特异性多谱系抗原诸如MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、pl5；过表达的胚抗原诸如CEA；过度表达的癌基因和突变的肿瘤抑制基因，诸如p53、Ras、HER2/neu；由染色体易位产生的独特肿瘤抗原；诸如BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR；和病毒抗原，诸如爱泼斯坦巴尔病毒抗原EBVA及人乳头瘤病毒(HPV)抗原E6和E7。
在一些实施方案中，本文提供的多特异性分子是多特异性抗体。本文提供的抗体包括但不限于合成抗体、单克隆抗体、重组产生的抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体等。
特别地，本文提供的抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有与抗原免疫特异性地结合的抗原结合位点的分子。本文提供的免疫球蛋白分子可以是免疫球蛋白分子的任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。在一些实施方案中，抗体是IgG抗体。在一些实施方案中，IgG抗体是IgG1抗体。在一些实施方案中，IgG抗体是IgG2、IgG3或IgG4抗体。
在一些实施方案中，本文提供的各种多特异性分子包含抗体的变体和/或衍生物，该抗体包括保留与表位特异性地结合的能力的抗体片段。在本文提供的各种多特异性分子的其他实施方案中，第一结合结构域和/或第二结合结构域是抗体的变体和/或衍生物，该抗体包括保留与表位特异性地结合的能力的抗体片段。示例性片段包括Fab片段(含有抗原结合结构域并包含通过二硫键桥接的轻链和部分重链的抗体片段)；Fab'(含有单个抗结合结构域的抗体片段，该抗结合结构域包含Fab和通过铰链区的重链的附加部分)；F(ab')2(通过重链的铰链区中的链间二硫键连接的两个Fab'分子；Fab'分子可以针对相同或不同的表位)；双特异性Fab(具有两个抗原结合结构域的Fab分子，其中每个抗原结合结构域可以针对不同的表位)；包含可变区的单链Fab链，也称为scFv(通过10个至25个氨基酸的链连接在一起的抗体的单个轻链和重链的可变抗原结合决定区)；二硫键连接的Fv或dsFv(通过二硫键连接在一起的抗体的单个轻链和重链的可变抗原结合决定区)；羊驼VH(抗体的单重链的可变抗原结合决定区，其中VH界面处的一些氨基酸是天然存在的羊驼抗体的重链中发现的那些氨基酸)；双特异性scFv(具有两个抗原结合结构域的scFv或dsFv分子，其中每个抗原结合结构域可以针对不同的表位)；双抗体(当第一scFv的VH结构域与第二scFv的VL结构域组装并且第一scFv的VL结构域与第二scFv的VH结构域组装时形成的二聚化scFv；双抗体的两个抗原结合区可以针对相同或不同的表位)；三抗体(三聚化的scFv，以类似于双抗体的方式形成，但是其中在单个复合物中产生三个抗原结合结构域；三个抗原结合结构域可以针对相同或不同的表位)；和四抗体(四聚化的scFv，以类似于双抗体的方式形成，但是其中在单个复合物中产生四个抗原结合结构域；四个抗原结合结构域可以针对相同或不同的表位)。抗体的衍生物还包括抗体结合位点的一个或多个CDR序列。当存在两个或更多个CDR序列时，CDR序列可在支架上连接在一起。在某些实施方案中，本文提供的抗体包含单链Fv(“scFv”)。scFv是包含抗体的VH结构域和VL结构域的抗体片段，其中这些结构域存在于单个多肽链中。通常，该scFv多肽还包含在VH结构域与VL结构域之间的多肽接头，该多肽接头使得该scFv能够形成抗原结合所需的结构。关于scFv的综述参见Pluckthun在ThePharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg和Moore编辑，Springer-Verlag，New York，第269-315页(1994)中。
在具体的实施方案中，与NKG2d结合的抗体包含VH区和VL区。在一些实施方案中，NKG2d抗体是单链抗体。在一些实施方案中，NKG2d抗体是单结构域抗体。在一些实施方案中，NKG2d抗体是纳米抗体。在某些实施方案中，NKG2d抗体是VHH抗体。在某些实施方案中，NKG2d抗体是美洲驼抗体。在一些实施方案中，NKG2d抗体不是单链抗体。在一些实施方案中，NKG2d抗体不是单结构域抗体。在一些实施方案中，NKG2d抗体不是纳米抗体。在某些实施方案中，NKG2d抗体不是VHH抗体。在某些实施方案中，NKG2d抗体不是美洲驼抗体。在一些实施方案中，NKG2d抗体是多特异性抗体。在其他实施方案中，NKG2d抗体是双特异性抗体。在某些实施方案中，多特异性抗体包含本文提供的NKG2d抗体的抗原结合片段。在其他实施方案中，双特异性抗体包含本文提供的NKG2d抗体的抗原结合片段。
在具体的实施方案中，本文提供了结合NKG2d的多特异性抗体。在一些实施方案中，多特异性抗体是双特异性抗体。在一些实施方案中，多特异性抗体是三特异性抗体。在一些实施方案中，多特异性抗体是四特异性抗体。在一个实施方案中，多特异性NKG2d抗体包含：(a)结合NKG2d的第一结合结构域，以及(b)结合第二靶标的第二结合结构域。在一个实施方案中，多特异性NKG2d抗体包含：(a)结合NKG2d的第一结合结构域，(b)结合第二靶标的第二结合结构域，以及(c)结合第三靶标的第三结合结构域。在一个实施方案中，多特异性NKG2d抗体包含：(a)结合NKG2d的第一结合结构域，(b)结合第二靶标的第二结合结构域，(c)结合第三靶标的第三结合结构域，以及(d)结合第四靶标的第四结合结构域。
在某些实施方案中，本文提供了一种双特异性抗体，该双特异性抗体包含：(a)与NKG2d结合的第一结合结构域，和(b)与不是NKG2d的第二靶标结合的第二结合结构域。在另一方面，本文提供了一种双特异性抗体，该双特异性抗体包含：(a)与NKG2d结合的第一结合结构域，和(b)与第二靶标结合的第二结合结构域，该第二靶标与在肿瘤细胞上表达的抗原结合。在一些实施方案中，第二结合结构域结合BCMA。在一些实施方案中，第二结合结构域与GPRC5d结合。
在某些实施方案中，本文提供了一种抗NKG2d双特异性抗体，该双特异性抗体包含与具有本文所述的抗体中的任一者的VH区、VL区、VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VLCDR2和/或VL CDR3的NKG2d结合的结合结构域。在一些实施方案中，本文提供了一种抗NKG2d双特异性抗体，该双特异性抗体包含与具有本文所述的抗体中的任一者的VH区的NKG2d结合的结合结构域。在一些实施方案中，本文提供了一种抗NKG2d双特异性抗体，该双特异性抗体包含与具有本文所述的抗体中的任一者的VL区的NKG2d结合的结合结构域。在一些实施方案中，本文提供了一种抗NKG2d双特异性抗体，该双特异性抗体包含与具有本文所述的抗体中的任一者的VH区和本文所述的抗体中的任一者的VL区的NKG2d结合的结合结构域。在一些实施方案中，本文提供了一种抗NKG2d双特异性抗体，该双特异性抗体包含与具有所述的抗体中的任一者的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的NKG2d结合的结合结构域。在一些实施方案中，本文提供了一种抗NKG2d双特异性抗体，该双特异性抗体包含与具有本文所述的抗体中的任一者的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的NKG2d结合的结合结构域。在一些实施方案中，本文提供了一种抗NKG2d双特异性抗体，该双特异性抗体包含与具有本文所述的抗体中的任一者的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的NKG2d结合的结合结构域；和本文所述的抗体中的任一者的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。
在某些实施方案中，抗NKG2d抗体是双特异性抗体。在一些实施方案中，抗NKG2d双特异性抗体还包含与具有本文提供的抗BCMA抗体的VH区、VL区、VH CDR1、VH CDR2、VHCDR3、VL CDR1、VL CDR2和/或VL CDR3的BCMA结合的第二结合结构域。在一些实施方案中，抗NKG2d双特异性抗体还包含与具有本文提供的抗BCMA抗体的VH区的BCMA结合的第二结合结构域。在一些实施方案中，抗NKG2d双特异性抗体还包含与具有本文提供的抗BCMA抗体的VL区的BCMA结合的第二结合结构域。在一些实施方案中，抗NKG2d双特异性抗体还包含与具有本文提供的抗BCMA抗体的VH区和本文提供的抗BCMA抗体的VL区的BCMA结合的第二结合结构域。在一些实施方案中，抗NKG2d双特异性抗体还包含与具有本文提供的抗BCMA抗体的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的BCMA结合的第二结合结构域。在一些实施方案中，抗NKG2d双特异性抗体还包含与具有本文提供的抗BCMA抗体的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的BCMA结合的第二结合结构域。在一些实施方案中，抗NKG2d双特异性抗体还包含与具有本文提供的抗BCMA抗体的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3以及本文提供的抗BCMA抗体的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的BCMA结合的第二结合结构域。
在某些实施方案中，抗NKG2d抗体是双特异性抗体。在一些实施方案中，抗NKG2d双特异性抗体还包含与具有本文提供的抗GPRC5d抗体的VH区、VL区、VH CDR1、VH CDR2、VHCDR3、VL CDR1、VL CDR2和/或VL CDR3的GPRC5d结合的第二结合结构域。在一些实施方案中，抗NKG2d双特异性抗体还包含与具有本文提供的抗GPRC5d抗体的VH区的GPRC5d结合的第二结合结构域。在一些实施方案中，抗NKG2d双特异性抗体还包含与具有本文提供的抗GPRC5d抗体的VL区的GPRC5d结合的第二结合结构域。在一些实施方案中，抗NKG2d双特异性抗体还包含与具有本文提供的抗GPRC5d抗体的VH区和本文提供的抗GPRC5d抗体的VL区的GPRC5d结合的第二结合结构域。在一些实施方案中，抗NKG2d双特异性抗体还包含与具有本文提供的抗GPRC5d抗体的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的GPRC5d结合的第二结合结构域。在一些实施方案中，抗NKG2d双特异性抗体还包含与具有本文提供的抗GPRC5d抗体的VLCDR1、VL CDR2和VL CDR3的GPRC5d结合的第二结合结构域。在一些实施方案中，抗NKG2d双特异性抗体还包含与具有本文提供的抗GPRC5d抗体的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3以及本文提供的抗GPRC5d抗体的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的GPRC5d结合的第二结合结构域。
在一些实施方案中，结合NKG2d的第一结合结构域是如所描述的或来源于上述抗体。在本文提供的多特异性抗体的一些具体的实施方案中，结合NKG2d的第一结合结构域包含：(i)VH，该VH包含分别具有SEQ ID NO:4、5和6的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VHCDR3；和(ii)VL，该VL包含分别具有SEQ ID NO:7、8和9的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，结合NKG2d的第一结合结构域包含：(i)VH，该VH包含分别具有SEQ ID NO:10、11和12的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VHCDR3；和(ii)VL，该VL包含分别具有SEQ ID NO:13、14和15的氨基酸序列的VL CDR1、VLCDR2和VL CDR3。在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，结合NKG2d的第一结合结构域包含：(i)VH，该VH包含分别具有SEQ ID NO:16、17和18的氨基酸序列的VH CDR1、VHCDR2和VH CDR3；和(ii)VL，该VL包含分别具有SEQ ID NO:19、20和21的氨基酸序列的VLCDR1、VL CDR2和VL CDR3。在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，结合NKG2d的第一结合结构域包含：(i)VH，该VH包含分别具有SEQ ID NO:22、23和24的氨基酸序列的VHCDR1、VH CDR2和VH CDR3；和(ii)VL，该VL包含分别具有SEQ ID NO:25、26和27的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，结合NKG2d的第一结合结构域包含：(i)VH，该VH包含分别具有SEQ ID NO:28、29和30的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3；和(ii)VL，该VL包含分别具有SEQ ID NO:31、32和33的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，结合NKG2d的第一结合结构域包含VH，该VH包含分别具有SEQ ID NO:2的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3。在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，结合NKG2d的第一结合结构域包含VL，该VL包含分别具有SEQ ID NO:3的VLCDR1、VL CDR2和VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，结合NKG2d的第一结合结构域包含：(i)VH，该VH包含分别具有SEQ ID NO:2的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3；和(ii)VL，该VL包含分别具有SEQ ID NO:3的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，结合NKG2d的第一结合结构域包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的VH。在一些实施方案中，结合NKG2d的第一结合结构域包含具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的VL。在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，结合NKG2d的第一结合结构域包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的VL。在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，结合NKG2d的第一结合结构域包含VH，该VH包含与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，结合NKG2d的第一结合结构域包含VL，该VL包含与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，结合NKG2d的第一结合结构域包含：VH，该VH包含与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列；以及VL，该VL包含与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。
在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，结合NKG2d的第一结合结构域包含：(i)VH，该VH包含分别具有SEQ ID NO:36、37和38的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VHCDR3；和(ii)VL，该VL包含分别具有SEQ ID NO:39、40和41的氨基酸序列的VL CDR1、VLCDR2和VL CDR3。在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，结合NKG2d的第一结合结构域包含：(i)VH，该VH包含分别具有SEQ ID NO:42、43和44的氨基酸序列的VH CDR1、VHCDR2和VH CDR3；和(ii)VL，该VL包含分别具有SEQ ID NO:45、46和47的氨基酸序列的VLCDR1、VL CDR2和VL CDR3。在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，结合NKG2d的第一结合结构域包含：(i)VH，该VH包含分别具有SEQ ID NO:48、49和50的氨基酸序列的VHCDR1、VH CDR2和VH CDR3；和(ii)VL，该VL包含分别具有SEQ ID NO:51、52和53的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，结合NKG2d的第一结合结构域包含：(i)VH，该VH包含分别具有SEQ ID NO:54、55和56的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3；和(ii)VL，该VL包含分别具有SEQ ID NO:57、58和59的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，结合NKG2d的第一结合结构域包含：(i)VH，该VH包含分别具有SEQ ID NO:60、61和62的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3；和(ii)VL，该VL包含分别具有SEQ ID NO:63、64和65的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，结合NKG2d的第一结合结构域包含VH，该VH包含分别具有SEQ ID NO:34的VH CDR1、VHCDR2和VH CDR3的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3。在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，结合NKG2d的第一结合结构域包含VL，该VL包含分别具有SEQ ID NO:35的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，结合NKG2d的第一结合结构域包含：(i)VH，该VH包含分别具有SEQ ID NO:34的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VHCDR3；和(ii)VL，该VL包含分别具有SEQ ID NO:35的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，结合NKG2d的第一结合结构域包含具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的VH。在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，结合NKG2d的第一结合结构域包含具有SEQ ID NO:35的氨基酸序列的VL。在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，结合NKG2d的第一结合结构域包含具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:35的氨基酸序列的VL。在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，结合NKG2d的第一结合结构域包含VH，该VH包含与SEQ ID NO:34的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，结合NKG2d的第一结合结构域包含VL，该VL包含与SEQ ID NO:35的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，结合NKG2d的第一结合结构域包含：VH，该VH包含与SEQ ID NO:34的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列；以及VL，该VL包含与SEQ ID NO:35的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，结合NKG2d的第一结合结构域的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3氨基酸序列根据Kabat编号系统。在一些实施方案中，结合NKG2d的第一结合结构域的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3氨基酸序列根据Chothia编号系统。在一些实施方案中，结合NKG2d的第一结合结构域的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3氨基酸序列根据AbM编号系统。在一些实施方案中，结合NKG2d的第一结合结构域的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VLCDR3氨基酸序列根据Contact编号系统。在一些实施方案中，结合NKG2d的第一结合结构域的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3氨基酸序列根据IMGT编号系统。
在本文提供的多特异性NKG2d抗体的一些实施方案中，第一结合结构域结合NKG2d抗原。在一些实施方案中，第一结合结构域结合NKG2d表位。在一些实施方案中，第一结合结构域与NKG2d特异性结合。在一些实施方案中，第一结合结构域的VH CDR1、VH CDR2、VHCDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3形成NKG2d的抗原的结合位点。在一些实施方案中，第一结合结构域的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3形成NKG2d的表位的结合位点。在一些实施方案中，NKG2d存在于NK细胞的表面上。
在另一方面，本文提供了一种多特异性抗体，其与本文所述的NKG2d抗体中的任一者竞争与NKG2d结合。在另一方面，本文提供了一种多特异性抗体，其与本文所述的NKG2d抗体中的任一者结合相同表位。在另一方面，提供了一种多特异性NKG2d抗体，其结合NKG2d上的表位，该表位与由本文所述的NKG2d抗体结合的NKG2d上的表位重叠。
在一个方面，提供了一种多特异性抗体，其与NKG2d参考抗体竞争与NKG2d结合。在另一方面，提供了一种多特异性NKG2d抗体，其与NKG2d参考抗体结合相同的NKG2d表位。在另一方面，提供了一种多特异性NKG2d抗体，其结合NKG2d上的表位，该表位与由NKG2d参考抗体结合的NKG2d上的表位重叠。
在一个实施方案中，NKG2d参考抗体包含：(i)VH，该VH包含分别具有VH CDR1、VHCDR2和VH CDR3的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，这些VH CDR属于具有SEQ IDNO:2的氨基酸序列的VH；和(ii)VL，该VL包含分别具有VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，这些VL CDR属于具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的VL。在一个实施方案中，NKG2d参考抗体包含：(i)VH，该VH包含分别具有VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，这些VH CDR属于具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的VH；和(ii)VL，该VL包含分别具有VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，这些VL CDR属于具有SEQ ID NO:35的氨基酸序列的VL。
在本文提供的多特异性NKG2d抗体的一些实施方案中，第二靶标不是NKG2d抗原。在本文提供的多特异性NKG2d抗体的一些实施方案中，第三靶标不是NKG2d抗原。在本文提供的多特异性NKG2d抗体的一些实施方案中，第四靶标不是NKG2d抗原。在本文提供的多特异性NKG2d抗体的一些实施方案中，第二靶标不是NKG2d抗原，并且第三靶标不是NKG2d抗原。在本文提供的多特异性NKG2d抗体的一些实施方案中，第二靶标不是NKG2d抗原，并且第四靶标不是NKG2d抗原。在本文提供的多特异性NKG2d抗体的一些实施方案中，第三靶标不是NKG2d抗原，并且第四靶标不是NKG2d抗原。在本文提供的多特异性NKG2d抗体的一些实施方案中，第二靶标不是NKG2d抗原，第三靶标不是NKG2d抗原，并且第四靶标不是NKG2d抗原。在本文提供的多特异性NKG2d抗体的一些实施方案中，第二靶标不是NKG2d表位。在本文提供的多特异性NKG2d抗体的一些实施方案中，第三靶标不是NKG2d表位。在本文提供的多特异性NKG2d抗体的一些实施方案中，第四靶标不是NKG2d表位。在本文提供的多特异性NKG2d抗体的一些实施方案中，第二靶标不是NKG2d表位，并且第三靶标不是NKG2d表位。在本文提供的多特异性NKG2d抗体的一些实施方案中，第二靶标不是NKG2d表位，并且第四靶标不是NKG2d表位。在本文提供的多特异性NKG2d抗体的一些实施方案中，第三靶标不是NKG2d表位，并且第四靶标不是NKG2d表位。在本文提供的多特异性NKG2d抗体的一些实施方案中，第二靶标不是NKG2d表位，第三靶标不是NKG2d表位，并且第四靶标不是NKG2d表位。在本文提供的多特异性NKG2d抗体的一些实施方案中，第二靶标是BCMA。在本文提供的多特异性NKG2d抗体的一些实施方案中，第二靶标是GPRC5d。
本文提供的多特异性抗体与存在于NK细胞的表面上的NKG2d的结合以及与存在于第二靶细胞的表面上的第二靶抗原的结合可例如导致杀死第二靶细胞。在其他实施方案中，本文提供的多特异性抗体与存在于NK细胞的表面上的NKG2d的结合以及与第二靶抗原的结合可例如导致NK细胞的活化。在一些实施方案中，本文提供了一种双特异性抗体，其包含：(a)与NKG2d结合的第一结合结构域，和(b)与癌细胞表面上存在的癌症抗原结合的第二结合结构域。在一些实施方案中，癌细胞表面上的抗原是肿瘤特异性抗原。在一些实施方案中，癌细胞表面上的抗原是肿瘤相关抗原。在一些实施方案中，癌细胞表面上的抗原是新抗原。在某些实施方案中，双特异性抗体的第一结合结构域特异性结合NKG2d。在一些实施方案中，NKG2d存在于NK细胞的表面上。在一些实施方案中，当双特异性抗体与NK细胞的表面上的NKG2d和癌细胞的表面上的抗原结合时，癌细胞被杀死。
在另一方面，本文提供了一种双特异性抗体，其包含：(a)与NKG2d结合的第一结合结构域，和(b)与BCMA结合的第二结合结构域。在某些实施方案中，双特异性抗体的第一结合结构域特异性结合NKG2d。在一些实施方案中，NKG2d存在于NK细胞的表面上。在一些实施方案中，BCMA位于细胞的表面上。在某些实施方案中，NKG2d存在于NK细胞的表面上，并且BCMA位于细胞的表面上。在一些实施方案中，当双特异性抗体与NK细胞表面上的NKG2d和细胞表面上的BCMA结合时，表面有BCMA的细胞被杀死。在一些实施方案中，BCMA位于癌细胞的表面上。在某些实施方案中，NKG2d存在于NK细胞的表面上，并且BCMA位于癌细胞的表面上。在一些实施方案中，当双特异性抗体与NK细胞的表面上的NKG2d和癌细胞的表面上的BCMA结合时，癌细胞被杀死。在某些实施方案中考虑了包含本文提供的NKG2d抗体中的任一者作为第一结合结构域的双特异性抗体。此外，在某些实施方案中还考虑了包含作为第一结合结构域的本文提供的NKG2d抗体中的任一者和与BCMA结合的第二结合结构域的双特异性抗体。
在一些实施方案中，本文提供的多特异性抗体是双特异性抗体，该双特异性抗体包含：(a)与NKG2d结合的第一结合结构域，和(b)与BCMA结合的第二结合结构域，其中结合BCMA的第二结合结构域包含：(i)VH，该VH包含分别具有SEQ ID NO:101、102和103的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3；和(ii)VL，该VL包含分别具有SEQ ID NO:104、105和106的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，结合BCMA的第二结合结构域包含：(i)VH，该VH包含分别具有SEQ ID NO:107、108和109的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3；和(ii)VL，该VL包含分别具有SEQ ID NO:110、111和112的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，结合BCMA的第二结合结构域包含：(i)VH，该VH包含分别具有SEQ ID NO:113、114和115的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3；和(ii)VL，该VL包含分别具有SEQ ID NO:116、117和118的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，结合BCMA的第二结合结构域包含：(i)VH，该VH包含分别具有SEQ ID NO:119、120和121的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3；和(ii)VL，该VL包含分别具有SEQ ID NO:122、123和124的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，结合BCMA的第二结合结构域包含：(i)VH，该VH包含分别具有SEQ ID NO:125、126和127的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3；和(ii)VL，该VL包含分别具有SEQ ID NO:128、129和130的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VLCDR3。在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，结合BCMA的第二结合结构域包含VH，该VH包含分别具有SEQ ID NO:99的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3。在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，结合BCMA的第二结合结构域包含VL，该VL包含分别具有SEQ ID NO:100的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，结合BCMA的第二结合结构域包含：(i)VH，该VH包含分别具有SEQ ID NO:99的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3；和(ii)VL，该VL包含分别具有SEQID NO:100的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，结合BCMA的第二结合结构域包含具有SEQ IDNO:99的氨基酸序列的VH。在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，结合BCMA的第二结合结构域包含具有SEQ ID NO:100的氨基酸序列的VL。在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，结合BCMA的第二结合结构域包含具有SEQ ID NO:99的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:100的氨基酸序列的VL。在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，结合BCMA的第二结合结构域包含VH，该VH包含与SEQ ID NO:99的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，结合BCMA的第二结合结构域包含VL，该VL包含与SEQ ID NO:100的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，结合BCMA的第二结合结构域包含：VH，该VH包含与SEQ ID NO:99的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列；以及VL，该VL包含与SEQ ID NO:100的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。
在另一方面，本文提供了一种双特异性抗体，其包含：(a)与NKG2d结合的第一结合结构域，和(b)与GPRC5d结合的第二结合结构域。在某些实施方案中，双特异性抗体的第一结合结构域特异性结合NKG2d。在一些实施方案中，NKG2d存在于NK细胞的表面上。在一些实施方案中，GPRC5d位于细胞的表面上。在某些实施方案中，NKG2d存在于NK细胞的表面上，并且GPRC5d位于细胞的表面上。在一些实施方案中，当双特异性抗体与NK细胞表面上的NKG2d和细胞表面上的GPRC5d结合时，表面有GPRC5d的细胞被杀死。在一些实施方案中，GPRC5d位于癌细胞的表面上。在某些实施方案中，NKG2d存在于NK细胞的表面上，并且GPRC5d位于癌细胞的表面上。在一些实施方案中，当双特异性抗体与NK细胞的表面上的NKG2d和癌细胞的表面上的GPRC5d结合时，癌细胞被杀死。在某些实施方案中考虑了包含本文提供的NKG2d抗体中的任一者作为第一结合结构域的双特异性抗体。此外，在某些实施方案中还考虑了包含作为第一结合结构域的本文提供的NKG2d抗体中的任一者和与GPRC5d结合的第二结合结构域的双特异性抗体。
在一些实施方案中，本文提供的多特异性抗体是双特异性抗体，该双特异性抗体包含：(a)与NKG2d结合的第一结合结构域，和(b)与GPRC5d结合的第二结合结构域，其中结合GPRC5d的第二结合结构域包含：(i)VH，该VH包含分别具有SEQ ID NO:133、134和135的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3；和(ii)VL，该VL包含分别具有SEQ ID NO:136、137和138的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，结合GPRC5d的第二结合结构域包含：(i)VH，该VH包含分别具有SEQ ID NO:139、140和141的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3；和(ii)VL，该VL包含分别具有SEQID NO:142、143和144的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，结合GPRC5d的第二结合结构域包含：(i)VH，该VH包含分别具有SEQID NO:145、146和147的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3；和(ii)VL，该VL包含分别具有SEQ ID NO:148、149和150的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，结合GPRC5d的第二结合结构域包含：(i)VH，该VH包含分别具有SEQ ID NO:151、152和153的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3；和(ii)VL，该VL包含分别具有SEQ ID NO:154、155和156的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VLCDR3。在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，结合GPRC5d的第二结合结构域包含：(i)VH，该VH包含分别具有SEQ ID NO:157、158和159的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VHCDR3；和(ii)VL，该VL包含分别具有SEQ ID NO:160、161和162的氨基酸序列的VL CDR1、VLCDR2和VL CDR3。在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，结合GPRC5d的第二结合结构域包含VH，该VH包含分别具有SEQ ID NO:131的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3。在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，结合GPRC5d的第二结合结构域包含VL，该VL包含分别具有SEQ ID NO:132的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，结合GPRC5d的第二结合结构域包含：(i)VH，该VH包含分别具有SEQ ID NO:131的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3；和(ii)VL，该VL包含分别具有SEQ ID NO:132的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR1、VLCDR2和VL CDR3。在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，结合GPRC5d的第二结合结构域包含具有SEQ ID NO:131的氨基酸序列的VH。在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，结合GPRC5d的第二结合结构域包含具有SEQ ID NO:132的氨基酸序列的VL。在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，结合GPRC5d的第二结合结构域包含具有SEQ IDNO:131的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:132的氨基酸序列的VL。在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，结合GPRC5d的第二结合结构域包含VH，该VH包含与SEQ ID NO:131的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，结合GPRC5d的第二结合结构域包含VL，该VL包含与SEQ ID NO:132的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，结合GPRC5d的第二结合结构域包含：VH，该VH包含与SEQ ID NO:131的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列；以及VL，该VL包含与SEQ ID NO:132的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。
在具体的实施方案中，提供了一种多特异性抗体，其包含本文提供的NKG2d抗体，呈杵臼结构形式。在具体的实施方案中，提供了一种双特异性抗体，其包含本文提供的NKG2d抗体，呈杵臼结构形式。在具体的实施方案中，提供了一种三特异性抗体，其包含本文提供的NKG2d抗体，呈杵臼结构形式。在具体的实施方案中，提供了一种四特异性抗体，其包含本文提供的NKG2d抗体，呈杵臼结构形式。可使用本领域熟知的方法将其他特异性添加到呈杵臼结构形式的抗体中(例如，将scFv添加到N-末端或C-末端)。此外，制备多特异性抗体的其他形式和方法也是本领域已知的并且被考虑。在一些实施方案中，本文提供的NKG2d抗体包含在双特异性抗体中。在一些实施方案中，本文提供的NKG2d抗体包含在三特异性抗体中。在一些实施方案中，本文提供的NKG2d抗体包含在四特异性抗体中。在一些实施方案中，本文提供的NKG2d双特异性抗体包含在多特异性抗体中。
在某些实施方案中，本文提供的多特异性抗体包含：第一结合结构域，该第一结合结构域包含与第一NKG2d表位结合的本文提供的NKG2d抗体；以及第二结合结构域，该第二结合结构域与第二表位结合，其中第一NKG2d表位和第二表位不同。在某些实施方案中，本文提供的双特异性抗体包含：第一结合结构域，该第一结合结构域包含与第一NKG2d表位结合的本文提供的NKG2d抗体；以及第二结合结构域，该第二结合结构域与第二表位结合，其中第一NKG2d表位和第二表位不同。在某些实施方案中，本文提供的三特异性抗体包含：第一结合结构域，该第一结合结构域包含与第一NKG2d表位结合的本文提供的NKG2d抗体；第二结合结构域，该第二结合结构域与第二表位结合；以及第三结合结构域，该第三结合结构域与第三表位结合，其中第一NKG2d表位、第二表位和第三表位不同。在某些实施方案中，本文提供的四特异性抗体包含：第一结合结构域，该第一结合结构域包含与第一NKG2d表位结合的本文提供的NKG2d抗体；第二结合结构域，该第二结合结构域与第二表位结合；第三结合结构域，该第三结合结构域与第三表位结合；以及第四结合结构域，该第四结合结构域与第四表位结合，其中第一NKG2d表位、第二表位、第三表位和第四表位不同。在某些实施方案中，本文提供的多特异性抗体包含：第一结合结构域，该第一结合结构域包含与第一NKG2d抗原结合的本文提供的NKG2d抗体；以及第二结合结构域，该第二结合结构域与第二抗原结合，其中第一NKG2d抗原和第二抗原不同。在某些实施方案中，本文提供的双特异性抗体包含：第一结合结构域，该第一结合结构域包含与第一NKG2d抗原结合的本文提供的NKG2d抗体；以及第二结合结构域，该第二结合结构域与第二抗原结合，其中第一NKG2d抗原和第二抗原不同。在某些实施方案中，本文提供的三特异性抗体包含：第一结合结构域，该第一结合结构域包含与第一NKG2d抗原结合的本文提供的NKG2d抗体；第二结合结构域，该第二结合结构域与第二抗原结合；以及第三结合结构域，该第三结合结构域与第三抗原结合，其中第一NKG2d抗原、第二抗原和第三抗原不同。在某些实施方案中，本文提供的四特异性抗体包含：第一结合结构域，该第一结合结构域包含与第一NKG2d抗原结合的本文提供的NKG2d抗体；第二结合结构域，该第二结合结构域与第二抗原结合；第三结合结构域，该第三结合结构域与第三抗原结合；以及第四结合结构域，该第四结合结构域与第四抗原结合，其中第一NKG2d抗原、第二抗原、第三抗原和第四抗原不同。在一个具体的实施方案中，本文提供的NKG2d抗体或其抗原结合片段与NKG2d特异性结合。
在一些实施方案中，多特异性抗体包含重链可变区和轻链可变区。在一些实施方案中，第一结合结构域包含重链可变区和轻链可变区。在一些实施方案中，第二结合结构域包含重链可变区和轻链可变区。在一些实施方案中，第一结合结构域包含重链可变区和轻链可变区，并且第二结合结构域包含重链可变区和轻链可变区。在一些实施方案中，NKG2d抗体不是单结构域抗体或纳米抗体。在一些实施方案中，第三结合结构域包含重链可变区和轻链可变区。在一些实施方案中，第四结合结构域包含重链可变区和轻链可变区。
在某些实施方案中，NKG2d多特异性抗体或其抗原结合片段与位于NKG2d上的第一表位和第二靶抗原的第二表位结合。在一些实施方案中，本文提供了一种多特异性抗体，其包含：(a)与NKG2d抗原结合的第一结合结构域，和(b)与第二靶抗原结合的第二结合结构域。在一些实施方案中，本文提供了一种多特异性抗体，其包含：(a)与NKG2d抗原特异性结合的第一结合结构域，和(b)与第二靶抗原特异性结合的第二结合结构域。在一些实施方案中，本文提供了一种多特异性抗体，其包含：(a)与NKG2d抗原上的第一表位结合的第一结合结构域，和(b)与第二靶抗原上的第二表位结合的第二结合结构域。在一些实施方案中，本文提供了一种多特异性抗体，其包含：(a)与NKG2d抗原上的第一表位特异性结合的第一结合结构域，和(b)与第二靶抗原上的第二表位特异性结合的第二结合结构域。
在具体的实施方案中，NKG2d抗原位于NK细胞的表面上。在某些实施方案中，第二靶抗原不是NKG2d。NKG2d多特异性抗体与存在于NK细胞的表面上的NKG2d的结合以及与存在于第二靶细胞的表面上的第二靶抗原的结合可例如导致杀死第二靶细胞。在其他实施方案中，NKG2d多特异性抗体与存在于NK细胞的表面上的NKG2d的结合以及与第二靶抗原的结合可例如导致NK细胞的活化。
在另一方面，本文提供了一种多特异性抗体，其包含与NKG2d结合的第一结合结构域以及与BCMA结合的第二结合结构域(“多特异性NKG2d/BCMA抗体”)。在一些实施方案中，多特异性NKG2d/BCMA抗体是双特异性抗体。在一些实施方案中，多特异性NKG2d/BCMA抗体是三特异性抗体。在一些实施方案中，多特异性NKG2d/BCMA抗体是四特异性抗体。
在一些实施方案中，本文提供的多特异性NKG2d/BCMA抗体包含：(a)结合NKG2d的第一结合结构域，和(b)与BCMA结合的第二结合结构域。在一个实施方案中，多特异性NKG2d/BCMA抗体包含：(a)结合NKG2d的第一结合结构域，和(b)与BCMA结合的第二结合结构域，以及(c)与第三靶标结合的第三结合结构域。在一个实施方案中，多特异性NKG2d/BCMA抗体包含：(a)结合NKG2d的第一结合结构域，和(b)与BCMA结合的第二结合结构域，(c)与第三靶标结合的第三结合结构域，以及(d)与第四靶标结合的第四结合结构域。
在本文提供的多特异性NKG2d/BCMA抗体的一些实施方案中，结合NKG2d的第一结合结构域包含VH，该VH包含分别具有VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，这些VH CDR属于具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的VH。在本文提供的多特异性NKG2d/BCMA抗体的一些实施方案中，结合NKG2d的第一结合结构域包含VL，该VL包含分别具有VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，这些VLCDR属于具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的VL。在本文提供的多特异性NKG2d/BCMA抗体的一些实施方案中，结合NKG2d的第一结合结构域包含：(i)VH，该VH包含分别具有VH CDR1、VHCDR2和VH CDR3的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，这些VH CDR属于具有SEQ IDNO:2的氨基酸序列的VH；和(ii)VL，该VL包含分别具有VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，这些VL CDR属于具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的VL。在本文提供的多特异性NKG2d/BCMA抗体的一些实施方案中，结合NKG2d的第一结合结构域包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的VH。在本文提供的多特异性NKG2d/BCMA抗体的一些实施方案中，结合NKG2d的第一结合结构域包含具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的VL。在本文提供的多特异性NKG2d/BCMA抗体的一些实施方案中，结合NKG2d的第一结合结构域包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的VL。
在本文提供的多特异性NKG2d/BCMA抗体的一些实施方案中，结合NKG2d的第一结合结构域包含VH，该VH包含分别具有VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，这些VH CDR属于具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的VH。在本文提供的多特异性NKG2d/BCMA抗体的一些实施方案中，结合NKG2d的第一结合结构域包含VL，该VL包含分别具有VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，这些VL CDR属于具有SEQ ID NO:35的氨基酸序列的VL。在本文提供的多特异性NKG2d/BCMA抗体的一些实施方案中，结合NKG2d的第一结合结构域包含：(i)VH，该VH包含分别具有VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，这些VH CDR属于具有SEQID NO:34的氨基酸序列的VH；和(ii)VL，该VL包含分别具有VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，这些VL CDR属于具有SEQ ID NO:35的氨基酸序列的VL。在本文提供的多特异性NKG2d/BCMA抗体的一些实施方案中，结合NKG2d的第一结合结构域包含具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的VH。在本文提供的多特异性NKG2d/BCMA抗体的一些实施方案中，结合NKG2d的第一结合结构域包含具有SEQ ID NO:35的氨基酸序列的VL。在本文提供的多特异性NKG2d/BCMA抗体的一些实施方案中，结合NKG2d的第一结合结构域包含具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:35的氨基酸序列的VL。
在本文提供的多特异性NKG2d/BCMA抗体的一些实施方案中，结合NKG2d的第一结合结构域的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3氨基酸序列根据Kabat编号系统。在本文提供的多特异性NKG2d/BCMA抗体的一些实施方案中，结合NKG2d的第一结合结构域的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3氨基酸序列根据Chothia编号系统。在本文提供的多特异性NKG2d/BCMA抗体的一些实施方案中，结合NKG2d的第一结合结构域的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3氨基酸序列根据AbM编号系统。在本文提供的多特异性NKG2d/BCMA抗体的一些实施方案中，结合NKG2d的第一结合结构域的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3氨基酸序列根据Contact编号系统。在本文提供的多特异性NKG2d/BCMA抗体的一些实施方案中，结合NKG2d的第一结合结构域的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3氨基酸序列根据IMGT编号系统。
在本文提供的多特异性NKG2d/BCMA抗体的一些实施方案中，第一结合结构域结合NKG2d抗原。在本文提供的多特异性NKG2d/BCMA抗体的一些实施方案中，第一结合结构域结合NKG2d表位。在本文提供的多特异性NKG2d/BCMA抗体的一些实施方案中，第一结合结构域与NKG2d特异性结合。在本文提供的多特异性NKG2d/BCMA抗体的一些实施方案中，第一结合结构域的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3形成NKG2d的抗原的结合位点。在本文提供的多特异性NKG2d/BCMA抗体的一些实施方案中，第一结合结构域的VHCDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3形成NKG2d的表位的结合位点。在本文提供的多特异性NKG2d/BCMA抗体的一些实施方案中，NKG2d存在于NK细胞的表面上。
在本文提供的多特异性NKG2d/BCMA抗体的一些实施方案中，结合BCMA的第二结合结构域包含VH，该VH包含分别具有SEQ ID NO:99的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3。在本文提供的多特异性NKG2d/BCMA抗体的一些实施方案中，结合BCMA的第二结合结构域包含VL，该VL包含分别具有SEQ ID NO:100的VL CDR1、VLCDR2和VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。在本文提供的多特异性NKG2d/BCMA抗体的一些实施方案中，结合BCMA的第二结合结构域包含：(i)VH，该VH包含分别具有SEQ ID NO:99的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VHCDR3；和(ii)VL，该VL包含分别具有SEQ ID NO:100的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。在本文提供的多特异性NKG2d/BCMA抗体的一些实施方案中，结合BCMA的第二结合结构域包含具有SEQ ID NO:99的氨基酸序列的VH。在本文提供的多特异性NKG2d/BCMA抗体的一些实施方案中，结合BCMA的第二结合结构域包含具有SEQID NO:100的氨基酸序列的VL。在本文提供的多特异性NKG2d/BCMA抗体的一些实施方案中，结合BCMA的第二结合结构域包含具有SEQ ID NO:99的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:100的氨基酸序列的VL。
在本文提供的多特异性NKG2d/BCMA抗体的一些实施方案中，结合BCMA的第二结合结构域的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3氨基酸序列根据Kabat编号系统。在本文提供的多特异性NKG2d/BCMA抗体的一些实施方案中，结合BCMA的第二结合结构域的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3氨基酸序列根据Chothia编号系统。在本文提供的多特异性NKG2d/BCMA抗体的一些实施方案中，结合BCMA的第二结合结构域的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3氨基酸序列根据AbM编号系统。在本文提供的多特异性NKG2d/BCMA抗体的一些实施方案中，结合BCMA的第二结合结构域的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3氨基酸序列根据Contact编号系统。在本文提供的多特异性NKG2d/BCMA抗体的一些实施方案中，结合BCMA的第二结合结构域的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3氨基酸序列根据IMGT编号系统。
在本文提供的多特异性NKG2d/BCMA抗体的一些实施方案中，第二结合结构域结合BCMA抗原。在本文提供的多特异性NKG2d/BCMA抗体的一些实施方案中，第二结合结构域结合BCMA表位。在本文提供的多特异性NKG2d/BCMA抗体的一些实施方案中，第二结合结构域与BCMA特异性结合。在本文提供的多特异性NKG2d/BCMA抗体的一些实施方案中，第二结合结构域的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3形成BCMA的抗原的结合位点。在一些实施方案中，第二结合结构域的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3形成BCMA的表位的结合位点。在一些实施方案中，BCMA存在于肿瘤细胞的表面上。
在本文提供的多特异性NKG2d/BCMA抗体的一些实施方案中，第三靶标不是NKG2d抗原。在本文提供的多特异性NKG2d/BCMA抗体的一些实施方案中，第四靶标不是NKG2d抗原。在本文提供的多特异性NKG2d/BCMA抗体的一些实施方案中，第三靶标不是NKG2d抗原，并且第四靶标不是NKG2d抗原。在本文提供的多特异性NKG2d/BCMA抗体的一些实施方案中，第三靶标不是BCMA抗原。在本文提供的多特异性NKG2d/BCMA抗体的一些实施方案中，第四靶标不是BCMA抗原。在本文提供的多特异性NKG2d/BCMA抗体的一些实施方案中，第三靶标不是BCMA抗原，并且第四靶标不是BCMA抗原。在本文提供的多特异性NKG2d/BCMA抗体的一些实施方案中，第三靶标不是NKG2d表位。在本文提供的多特异性NKG2d/BCMA抗体的一些实施方案中，第四靶标不是NKG2d表位。在本文提供的多特异性NKG2d/BCMA抗体的一些实施方案中，第三靶标不是NKG2d表位，并且第四靶标不是NKG2d表位。在本文提供的多特异性NKG2d/BCMA抗体的一些实施方案中，第三靶标不是BCMA表位。在本文提供的多特异性NKG2d/BCMA抗体的一些实施方案中，第四靶标不是BCMA表位。在本文提供的多特异性NKG2d/BCMA抗体的一些实施方案中，第三靶标不是BCMA表位，并且第四靶标不是BCMA表位。
在具体实施方案中，靶标来自哺乳动物。在具体实施方案中，靶标来自大鼠。在具体实施方案中，靶标来自小鼠。在具体实施方案中，靶标来自灵长目动物。在具体实施方案中，靶标来自人。
在具体的实施方案中，以杵臼结构形式提供了多特异性NKG2d/BCMA抗体。在具体的实施方案中，以杵臼结构形式提供了双特异性NKG2d/BCMA抗体。在具体实施方案中，以杵臼结构形式提供了三特异性抗体。在具体实施方案中，以杵臼结构形式提供了四特异性抗体。可使用本领域熟知的方法将其他特异性添加到呈杵臼结构形式的抗体中(例如，将scFv添加到N-末端或C-末端)。此外，制备多特异性抗体的其他形式和方法也是本领域已知的并且被考虑。在一些实施方案中，本文提供的NKG2d/BCMA抗体包含在双特异性抗体中。在一些实施方案中，本文提供的NKG2d/BCMA抗体包含在三特异性抗体中。在一些实施方案中，本文提供的NKG2d/BCMA抗体包含在四特异性抗体中。在一些实施方案中，本文提供的NKG2d/BCMA双特异性抗体包含在多特异性抗体中。
在某些实施方案中，本文提供的三特异性NKG2d/BCMA抗体包含：第一结合结构域，该第一结合结构域包含与NKG2d表位结合的本文提供的NKG2d抗体；第二结合结构域，该第二结合结构域包含与BCMA表位结合的本文提供的BCMA抗体；以及第三结合结构域，该第三结合结构域与第三表位结合，其中NKG2d表位、BCMA表位和第三表位不同。在某些实施方案中，本文提供的四特异性抗体包含：第一结合结构域，该第一结合结构域包含与NKG2d表位结合的本文提供的NKG2d抗体；第二结合结构域，该第二结合结构域包含与BCMA表位结合的本文提供的BCMA抗体；第三结合结构域，该第三结合结构域与第三表位结合；以及第四结合结构域，该第四结合结构域与第四表位结合，其中NKG2d表位、BCMA表位、第三表位和第四表位不同。在某些实施方案中，本文提供的三特异性抗体包含：第一结合结构域，该第一结合结构域包含与NKG2d抗原结合的本文提供的NKG2d抗体；第二结合结构域，该第二结合结构域包含与BCMA抗原结合的本文提供的BCMA抗体；以及第三结合结构域，该第三结合结构域与第三抗原结合，其中NKG2d抗原、BCMA抗原和第三抗原不同。在某些实施方案中，本文提供的四特异性抗体与NKG2d抗原结合；第二结合结构域，该第二结合结构域包含与BCMA抗原结合的本文提供的BCMA抗体；第三结合结构域，该第三结合结构域与第三抗原结合，以及第四结合结构域，该第四结合结构域与第四抗原结合，其中NKG2d抗原、BCMA抗原、第三抗原和第四抗原不同。在本文提供的多特异性NKG2d/BCMA抗体的某些实施方案中，与NKG2d结合的第一结合结构域与NKG2d特异性结合。在本文提供的多特异性NKG2d/BCMA抗体的其他实施方案中，与BCMA结合的第二结合结构域与BCMA特异性结合。在本文提供的多特异性NKG2d/BCMA抗体的又一些实施方案中，与NKG2d结合的第一结合结构域与NKG2d特异性结合，并且与BCMA结合的第二结合结构域与BCMA特异性结合。
在一些实施方案中，多特异性NKG2d/BCMA抗体包含重链可变区和轻链可变区。在一些实施方案中，第一结合结构域包含重链可变区和轻链可变区。在一些实施方案中，第二结合结构域包含重链可变区和轻链可变区。在一些实施方案中，第一结合结构域包含重链可变区和轻链可变区，并且第二结合结构域包含重链可变区和轻链可变区。在一些实施方案中，NKG2d抗体不是单结构域抗体或纳米抗体。在一些实施方案中，第三结合结构域包含重链可变区和轻链可变区。在一些实施方案中，第四结合结构域包含重链可变区和轻链可变区。
在某些实施方案中，NKG2d/BCMA多特异性抗体或其抗原结合片段与位于NKG2d上的第一表位和位于BCMA上的第二表位结合。在一些实施方案中，本文提供了一种多特异性NKG2d/BCMA抗体，其包含：(a)与NKG2d抗原结合的第一结合结构域，和(b)与BCMA抗原结合的第二结合结构域。在一些实施方案中，本文提供了一种多特异性NKG2d/BCMA抗体，其包含：(a)与NKG2d抗原特异性结合的第一结合结构域，和(b)与BCMA抗原特异性结合的第二结合结构域。在一些实施方案中，本文提供了一种多特异性NKG2d/BCMA抗体，其包含：(a)与NKG2d抗原上的第一表位结合的第一结合结构域，和(b)与BCMA抗原上的第二表位结合的第二结合结构域。在一些实施方案中，本文提供了一种多特异性抗体，其包含：(a)与NKG2d抗原上的第一表位特异性结合的第一结合结构域，和(b)与BCMA抗原上的第二表位特异性结合的第二结合结构域。
在具体的实施方案中，NKG2d抗原位于NK细胞的表面上。在具体的实施方案中，BCMA抗原位于肿瘤细胞的表面上。NKG2d/BCMA多特异性抗体与存在于NK细胞表面上的NKG2d和存在于肿瘤细胞表面上的BCMA的结合可例如导致杀死肿瘤细胞。在其他实施方案中，NKG2d/BCMA多特异性抗体与存在于NK细胞表面上的NKG2d和存在于肿瘤细胞表面上的BCMA的结合可例如导致NK细胞的活化。
在另一方面，本文提供了多特异性抗体，该多特异性抗体包含与NKG2d结合的第一结合结构域以及与GPRC5d结合的第二结合结构域(“多特异性NKG2d/GPRC5d抗体”)。在一些实施方案中，多特异性NKG2d/GPRC5d抗体是双特异性抗体。在一些实施方案中，多特异性NKG2d/GPRC5d抗体是三特异性抗体。在一些实施方案中，多特异性NKG2d/GPRC5d抗体是四特异性抗体。
在一个实施方案中，多特异性NKG2d/GPRC5d抗体包含：(a)结合NKG2d的第一结合结构域，和(b)与GPRC5d结合的第二结合结构域。在一个实施方案中，多特异性NKG2d/GPRC5d抗体包含：(a)结合NKG2d的第一结合结构域，和(b)与GPRC5d结合的第二结合结构域，以及(c)与第三靶标结合的第三结合结构域。在一个实施方案中，多特异性NKG2d/GPRC5d抗体包含：(a)结合NKG2d的第一结合结构域，和(b)与GPRC5d结合的第二结合结构域，(c)与第三靶标结合的第三结合结构域，以及(d)与第四靶标结合的第四结合结构域。
在本文提供的多特异性NKG2d/GPRC5d抗体的一些实施方案中，结合NKG2d的第一结合结构域包含VH，该VH包含分别具有VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的氨基酸序列的VHCDR1、VH CDR2和VH CDR3，这些VH CDR属于具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的VH。在本文提供的多特异性NKG2d/GPRC5d抗体的一些实施方案中，结合NKG2d的第一结合结构域包含VL，该VL包含分别具有VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VLCDR3，这些VL CDR属于具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的VL。在本文提供的多特异性NKG2d/GPRC5d抗体的一些实施方案中，结合NKG2d的第一结合结构域包含：(i)VH，该VH包含分别具有VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，这些VH CDR属于具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的VH；和(ii)VL，该VL包含分别具有VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，这些VL CDR属于具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的VL。在本文提供的多特异性NKG2d/GPRC5d抗体的一些实施方案中，结合NKG2d的第一结合结构域包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的VH。在本文提供的多特异性NKG2d/GPRC5d抗体的一些实施方案中，结合NKG2d的第一结合结构域包含具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的VL。在本文提供的多特异性NKG2d/GPRC5d抗体的一些实施方案中，结合NKG2d的第一结合结构域包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的VL。
在本文提供的多特异性NKG2d/GPRC5d抗体的一些实施方案中，结合NKG2d的第一结合结构域包含VH，该VH包含分别具有VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的氨基酸序列的VHCDR1、VH CDR2和VH CDR3，这些VH CDR属于具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的VH。在本文提供的多特异性NKG2d/GPRC5d抗体的一些实施方案中，结合NKG2d的第一结合结构域包含VL，该VL包含分别具有VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VLCDR3，这些VL CDR属于具有SEQ ID NO:35的氨基酸序列的VL。在本文提供的多特异性NKG2d/GPRC5d抗体的一些实施方案中，结合NKG2d的第一结合结构域包含：(i)VH，该VH包含分别具有VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，这些VHCDR属于具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的VH；和(ii)VL，该VL包含分别具有VL CDR1、VLCDR2和VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，这些VL CDR属于具有SEQ IDNO:35的氨基酸序列的VL。在本文提供的多特异性NKG2d/GPRC5d抗体的一些实施方案中，结合NKG2d的第一结合结构域包含具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的VH。在本文提供的多特异性NKG2d/GPRC5d抗体的一些实施方案中，结合NKG2d的第一结合结构域包含具有SEQ IDNO:35的氨基酸序列的VL。在本文提供的多特异性NKG2d/GPRC5d抗体的一些实施方案中，结合NKG2d的第一结合结构域包含具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:35的氨基酸序列的VL。
在本文提供的多特异性NKG2d/GPRC5d抗体的一些实施方案中，结合NKG2d的第一结合结构域的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3氨基酸序列根据Kabat编号系统。在本文提供的多特异性NKG2d/GPRC5d抗体的一些实施方案中，结合NKG2d的第一结合结构域的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3氨基酸序列根据Chothia编号系统。在本文提供的多特异性NKG2d/GPRC5d抗体的一些实施方案中，结合NKG2d的第一结合结构域的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3氨基酸序列根据AbM编号系统。在本文提供的多特异性NKG2d/GPRC5d抗体的一些实施方案中，结合NKG2d的第一结合结构域的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3氨基酸序列根据Contact编号系统。在本文提供的多特异性NKG2d/GPRC5d抗体的一些实施方案中，结合NKG2d的第一结合结构域的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3氨基酸序列根据IMGT编号系统。
在本文提供的多特异性NKG2d/GPRC5d抗体的一些实施方案中，第一结合结构域结合NKG2d抗原。在本文提供的多特异性NKG2d/GPRC5d抗体的一些实施方案中，第一结合结构域结合NKG2d表位。在本文提供的多特异性NKG2d/GPRC5d抗体的一些实施方案中，第一结合结构域与NKG2d特异性结合。在本文提供的多特异性NKG2d/GPRC5d抗体的一些实施方案中，第一结合结构域的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3形成NKG2d的抗原的结合位点。在本文提供的多特异性NKG2d/GPRC5d抗体的一些实施方案中，第一结合结构域的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3形成NKG2d的表位的结合位点。在本文提供的多特异性NKG2d/GPRC5d抗体的一些实施方案中，NKG2d存在于NK细胞的表面上。
在本文提供的多特异性NKG2d/GPRC5d抗体的一些实施方案中，结合GPRC5d的第二结合结构域包含VH，该VH包含分别具有SEQ ID NO:131的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3。在本文提供的多特异性NKG2d/GPRC5d抗体的一些实施方案中，结合GPRC5d的第二结合结构域包含VL，该VL包含分别具有SEQ ID NO:132的VLCDR1、VL CDR2和VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。在本文提供的多特异性NKG2d/GPRC5d抗体的一些实施方案中，结合GPRC5d的第二结合结构域包含：(i)VH，该VH包含分别具有SEQ ID NO:131的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的氨基酸序列的VH CDR1、VHCDR2和VH CDR3；和(ii)VL，该VL包含分别具有SEQ ID NO:132的VL CDR1、VL CDR2和VLCDR3的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。在本文提供的多特异性NKG2d/GPRC5d抗体的一些实施方案中，结合GPRC5d的第二结合结构域包含具有SEQ ID NO:131的氨基酸序列的VH。在本文提供的多特异性NKG2d/GPRC5d抗体的一些实施方案中，结合GPRC5d的第二结合结构域包含具有SEQ ID NO:132的氨基酸序列的VL。在本文提供的多特异性NKG2d/GPRC5d抗体的一些实施方案中，结合GPRC5d的第二结合结构域包含具有SEQ ID NO:131的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:132的氨基酸序列的VL。
在本文提供的多特异性NKG2d/GPRC5d抗体的一些实施方案中，结合GPRC5d的第二结合结构域的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3氨基酸序列根据Kabat编号系统。在本文提供的多特异性NKG2d/GPRC5d抗体的一些实施方案中，结合GPRC5d的第二结合结构域的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3氨基酸序列根据Chothia编号系统。在本文提供的多特异性NKG2d/GPRC5d抗体的一些实施方案中，结合GPRC5d的第二结合结构域的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3氨基酸序列根据AbM编号系统。在本文提供的多特异性NKG2d/GPRC5d抗体的一些实施方案中，结合GPRC5d的第二结合结构域的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3氨基酸序列根据Contact编号系统。在本文提供的多特异性NKG2d/GPRC5d抗体的一些实施方案中，结合GPRC5d的第二结合结构域的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VLCDR3氨基酸序列根据IMGT编号系统。
在本文提供的多特异性NKG2d/GPRC5d抗体的一些实施方案中，第二结合结构域结合GPRC5d抗原。在本文提供的多特异性NKG2d/GPRC5d抗体的一些实施方案中，第二结合结构域结合GPRC5d表位。在本文提供的多特异性NKG2d/GPRC5d抗体的一些实施方案中，第二结合结构域与GPRC5d特异性地结合。在本文提供的多特异性NKG2d/GPRC5d抗体的一些实施方案中，第二结合结构域的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3形成GPRC5d的抗原的结合位点。在一些实施方案中，第二结合结构域的VH CDR1、VH CDR2、VHCDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3形成GPRC5d的表位的结合位点。在一些实施方案中，GPRC5d存在于肿瘤细胞的表面上。
在本文提供的多特异性NKG2d/GPRC5d抗体的一些实施方案中，第三靶标不是NKG2d抗原。在本文提供的多特异性NKG2d/GPRC5d抗体的一些实施方案中，第四靶标不是NKG2d抗原。在本文提供的多特异性NKG2d/GPRC5d抗体的一些实施方案中，第三靶标不是NKG2d抗原，并且第四靶标不是NKG2d抗原。在本文提供的多特异性NKG2d/GPRC5d抗体的一些实施方案中，第三靶标不是GPRC5d抗原。在本文提供的多特异性NKG2d/GPRC5d抗体的一些实施方案中，第四靶标不是GPRC5d抗原。在本文提供的多特异性NKG2d/GPRC5d抗体的一些实施方案中，第三靶标不是GPRC5d抗原，并且第四靶标不是GPRC5d抗原。在本文提供的多特异性NKG2d/GPRC5d抗体的一些实施方案中，第三靶标不是NKG2d表位。在本文提供的多特异性NKG2d/GPRC5d抗体的一些实施方案中，第四靶标不是NKG2d表位。在本文提供的多特异性NKG2d/GPRC5d抗体的一些实施方案中，第三靶标不是NKG2d表位，并且第四靶标不是NKG2d表位。在本文提供的多特异性NKG2d/GPRC5d抗体的一些实施方案中，第三靶标不是GPRC5d表位。在本文提供的多特异性NKG2d/GPRC5d抗体的一些实施方案中，第四靶标不是GPRC5d表位。在本文提供的多特异性NKG2d GPRC5d抗体的一些实施方案中，第三靶标不是GPRC5d表位，并且第四靶标不是GPRC5d表位。
在具体实施方案中，靶标来自哺乳动物。在具体实施方案中，靶标来自大鼠。在具体实施方案中，靶标来自小鼠。在具体实施方案中，靶标来自灵长目动物。在具体实施方案中，靶标来自人。
在具体实施方案中，以杵臼结构形式提供了多特异性NKG2d/GPRC5d抗体。在具体实施方案中，以杵臼结构形式提供了双特异性NKG2d/GPRC5d抗体。在具体实施方案中，以杵臼结构形式提供了三特异性抗体。在具体实施方案中，以杵臼结构形式提供了四特异性抗体。可使用本领域熟知的方法将其他特异性添加到呈杵臼结构形式的抗体中(例如，将scFv添加到N-末端或C-末端)。此外，制备多特异性抗体的其他形式和方法也是本领域已知的并且被考虑。在一些实施方案中，本文提供的NKG2d/GPRC5d抗体包含在双特异性抗体中。在一些实施方案中，本文提供的NKG2d/GPRC5d抗体包含在三特异性抗体中。在一些实施方案中，本文提供的NKG2d/GPRC5d抗体包含在四特异性抗体中。在一些实施方案中，本文提供的NKG2d/GPRC5d双特异性抗体包含在多特异性抗体中。
在某些实施方案中，本文提供的三特异性NKG2d/GPRC5d抗体包含：第一结合结构域，该第一结合结构域包含与NKG2d表位结合的本文提供的NKG2d抗体；第二结合结构域，该第二结合结构域包含与GPRC5d表位结合的本文提供的GPRC5d抗体；以及第三结合结构域，该第三结合结构域与第三表位结合，其中NKG2d表位、GPRC5d表位和第三表位不同。在某些实施方案中，本文提供的四特异性抗体包含：第一结合结构域，该第一结合结构域包含与NKG2d表位结合的本文提供的NKG2d抗体；第二结合结构域，该第二结合结构域包含与GPRC5d表位结合的本文提供的GPRC5d抗体；第三结合结构域，该第三结合结构域与第三表位结合；以及第四结合结构域，该第四结合结构域与第四表位结合，其中NKG2d表位、GPRC5d表位、第三表位和第四表位不同。在某些实施方案中，本文提供的三特异性抗体包含：第一结合结构域，该第一结合结构域包含与NKG2d抗原结合的本文提供的NKG2d抗体；第二结合结构域，该第二结合结构域包含与GPRC5d抗原结合的本文提供的GPRC5d抗体；以及第三结合结构域，该第三结合结构域与第三抗原结合，其中NKG2d抗原、GPRC5d抗原和第三抗原不同。在某些实施方案中，本文提供的四特异性抗体与NKG2d抗原结合；第二结合结构域，该第二结合结构域包含与GPRC5d抗原结合的本文提供的GPRC5d抗体；第三结合结构域，该第三结合结构域与第三抗原结合，以及第四结合结构域，该第四结合结构域与第四抗原结合，其中NKG2d抗原、GPRC5d抗原、第三抗原和第四抗原不同。在本文提供的多特异性NKG2d/GPRC5d抗体的某些实施方案中，与NKG2d结合的第一结合结构域与NKG2d特异性地结合。在本文提供的多特异性NKG2d/GPRC5d抗体的其他实施方案中，与GPRC5d结合的第二结合结构域与GPRC5d特异性地结合。在本文提供的多特异性NKG2d/GPRC5d抗体的又一些实施方案中，与NKG2d结合的第一结合结构域与NKG2d特异性地结合，并且与GPRC5d结合的第二结合结构域与GPRC5d特异性地结合。
在一些实施方案中，多特异性NKG2d/GPRC5d抗体包含重链可变区和轻链可变区。在一些实施方案中，第一结合结构域包含重链可变区和轻链可变区。在一些实施方案中，第二结合结构域包含重链可变区和轻链可变区。在一些实施方案中，第一结合结构域包含重链可变区和轻链可变区，并且第二结合结构域包含重链可变区和轻链可变区。在一些实施方案中，NKG2d抗体不是单结构域抗体或纳米抗体。在一些实施方案中，第三结合结构域包含重链可变区和轻链可变区。在一些实施方案中，第四结合结构域包含重链可变区和轻链可变区。
在某些实施方案中，NKG2d/GPRC5d多特异性抗体或其抗原结合片段与位于NKG2d上的第一表位和位于GPRC5d上的第二表位结合。在一些实施方案中，本文提供了一种多特异性NKG2d/GPRC5d抗体，其包含：(a)与NKG2d抗原结合的第一结合结构域，和(b)与GPRC5d抗原结合的第二结合结构域。在一些实施方案中，本文提供了一种多特异性NKG2d/GPRC5d抗体，其包含：(a)与NKG2d抗原特异性结合的第一结合结构域，和(b)与GPRC5d抗原特异性结合的第二结合结构域。在一些实施方案中，本文提供了一种多特异性NKG2d/GPRC5d抗体，其包含：(a)与NKG2d抗原上的第一表位结合的第一结合结构域，和(b)与GPRC5d抗原上的第二表位结合的第二结合结构域。在一些实施方案中，本文提供了一种多特异性抗体，其包含：(a)与NKG2d抗原上的第一表位特异性结合的第一结合结构域，和(b)与GPRC5d抗原上的第二表位特异性结合的第二结合结构域。
在具体的实施方案中，NKG2d抗原位于NK细胞的表面上。在具体的实施方案中，GPRC5d抗原位于肿瘤细胞的表面上。NKG2d/GPRC5d多特异性抗体与存在于NK细胞表面上的NKG2d和存在于肿瘤细胞表面上的GPRC5d的结合可例如导致杀死肿瘤细胞。在其他实施方案中，NKG2d/GPRC5d多特异性抗体与存在于NK细胞表面上的NKG2d和存在于肿瘤细胞表面上的GPRC5d的结合可例如导致NK细胞的活化。
在具体的实施方案中，NKp46抗体包含VH区和VL区。在一些实施方案中，NKp46抗体是单链抗体。在一些实施方案中，NKp46抗体是单结构域抗体。在一些实施方案中，NKp46抗体是纳米抗体。在某些实施方案中，NKp46抗体是VHH抗体。在某些实施方案中，NKp46抗体是美洲驼抗体。在一些实施方案中，NKp46抗体不是单链抗体。在一些实施方案中，NKp46抗体不是单结构域抗体。在一些实施方案中，NKp46抗体不是纳米抗体。在某些实施方案中，NKp46抗体不是VHH抗体。在某些实施方案中，NKp46抗体不是美洲驼抗体。在一些实施方案中，NKp46抗体是多特异性抗体。在其他实施方案中，NKp46是双特异性抗体。在某些实施方案中，多特异性抗体包含本文提供的NKp46抗体的抗原结合片段。在其他实施方案中，双特异性抗体包含本文提供的NKp46抗体的抗原结合片段。
在具体的实施方案中，本文提供了结合NKp46的多特异性抗体。在一些实施方案中，多特异性抗体是双特异性抗体。在一些实施方案中，多特异性抗体是三特异性抗体。在一些实施方案中，多特异性抗体是四特异性抗体。在一个实施方案中，多特异性NKp46抗体包含：(a)结合NKp46的第一结合结构域，以及(b)结合第二靶标的第二结合结构域。在一个实施方案中，多特异性NKp46抗体包含：(a)结合NKp46的第一结合结构域，(b)结合第二靶标的第二结合结构域，以及(c)结合第三靶标的第三结合结构域。在一个实施方案中，多特异性NKp46抗体包含：(a)结合NKp46的第一结合结构域，(b)结合第二靶标的第二结合结构域，(c)结合第三靶标的第三结合结构域，以及(d)结合第四靶标的第四结合结构域。
在另一方面，本文提供了双特异性抗体，该双特异性抗体包含：(a)与NKp46结合的第一结合结构域，和(b)与不是NKp46的第二靶标结合的第二结合结构域。在另一方面，本文提供了一种双特异性抗体，该双特异性抗体包含：(a)与NKp46结合的第一结合结构域，和(b)与第二靶标结合的第二结合结构域，该第二靶标与在肿瘤细胞上表达的抗原结合。在一些实施方案中，第二结合结构域结合BCMA。在一些实施方案中，第二结合结构域与GPRC5d结合。
在某些实施方案中，本文提供了一种抗NKp46双特异性抗体，该双特异性抗体包含与具有本文所述的抗体中的任一者的VH区、VL区、VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VLCDR2和/或VL CDR3的NKp46结合的结合结构域。在一些实施方案中，本文提供了一种抗NKp46双特异性抗体，该双特异性抗体包含与具有本文所述的抗体中的任一者的VH区的NKp46结合的结合结构域。在一些实施方案中，本文提供了一种抗NKp46双特异性抗体，该双特异性抗体包含与具有本文所述的抗体中的任一者的VL区的NKp46结合的结合结构域。在一些实施方案中，本文提供了一种抗NKp46双特异性抗体，该双特异性抗体包含与具有本文所述的抗体中的任一者的VH区和本文所述的抗体中的任一者的VL区的NKp46结合的结合结构域。在一些实施方案中，本文提供了一种抗NKp46双特异性抗体，该双特异性抗体包含与具有所述的抗体中的任一者的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的NKp46结合的结合结构域。在一些实施方案中，本文提供了一种抗NKp46双特异性抗体，该双特异性抗体包含与具有本文所述的抗体中的任一者的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的NKp46结合的结合结构域。在一些实施方案中，本文提供了一种抗NKp46双特异性抗体，该双特异性抗体包含与具有本文所述的抗体中的任一者的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的NKp46结合的结合结构域；和本文所述的抗体中的任一者的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。
在某些实施方案中，抗NKp46抗体是双特异性抗体。在一些实施方案中，抗NKp46双特异性抗体还包含与具有本文提供的抗BCMA抗体的VH区、VL区、VH CDR1、VH CDR2、VHCDR3、VL CDR1、VL CDR2和/或VL CDR3的BCMA结合的第二结合结构域。在一些实施方案中，抗NKp46双特异性抗体还包含与具有本文提供的抗BCMA抗体的VH区的BCMA结合的第二结合结构域。在一些实施方案中，抗NKp46双特异性抗体还包含与具有本文提供的抗BCMA抗体的VL区的BCMA结合的第二结合结构域。在一些实施方案中，抗NKp46双特异性抗体还包含与具有本文提供的抗BCMA抗体的VH区和本文提供的抗BCMA抗体的VL区的BCMA结合的第二结合结构域。在一些实施方案中，抗NKp46双特异性抗体还包含与具有本文提供的抗BCMA抗体的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的BCMA结合的第二结合结构域。在一些实施方案中，抗NKp46双特异性抗体还包含与具有本文提供的抗BCMA抗体的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的BCMA结合的第二结合结构域。在一些实施方案中，抗NKp46双特异性抗体还包含与具有本文提供的抗BCMA抗体的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3以及本文提供的抗BCMA抗体的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的BCMA结合的第二结合结构域。
在某些实施方案中，抗NKp46抗体是双特异性抗体。在一些实施方案中，抗NKp46双特异性抗体还包含与具有本文提供的抗GPRC5d抗体的VH区、VL区、VH CDR1、VH CDR2、VHCDR3、VL CDR1、VL CDR2和/或VL CDR3的GPRC5d结合的第二结合结构域。在一些实施方案中，抗NKp46双特异性抗体还包含与具有本文提供的抗GPRC5d抗体的VH区的GPRC5d结合的第二结合结构域。在一些实施方案中，抗NKp46双特异性抗体还包含与具有本文提供的抗GPRC5d抗体的VL区的GPRC5d结合的第二结合结构域。在一些实施方案中，抗NKp46双特异性抗体还包含与具有本文提供的抗GPRC5d抗体的VH区和本文提供的抗GPRC5d抗体的VL区的GPRC5d结合的第二结合结构域。在一些实施方案中，抗NKp46双特异性抗体还包含与具有本文提供的抗GPRC5d抗体的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的GPRC5d结合的第二结合结构域。在一些实施方案中，抗NKp46双特异性抗体还包含与具有本文提供的抗GPRC5d抗体的VLCDR1、VL CDR2和VL CDR3的GPRC5d结合的第二结合结构域。在一些实施方案中，抗NKp46双特异性抗体还包含与具有本文提供的抗GPRC5d抗体的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3以及本文提供的抗GPRC5d抗体的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的GPRC5d结合的第二结合结构域。
在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，结合NKp46的第一结合结构域是如所描述的或来源于上述抗体。在本文提供的多特异性抗体的一些具体的实施方案中，结合NKp46的第一结合结构域包含：(i)VH，该VH包含分别具有SEQ ID NO:69、70和71的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3；和(ii)VL，该VL包含分别具有SEQ ID NO:72、73和74的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，结合NKp46的第一结合结构域包含：(i)VH，该VH包含分别具有SEQ ID NO:75、76和77的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3；和(ii)VL，该VL包含分别具有SEQ ID NO:78、79和80的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，结合NKp46的第一结合结构域包含：(i)VH，该VH包含分别具有SEQ ID NO:81、82和83的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3；和(ii)VL，该VL包含分别具有SEQ ID NO:84、85和86的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，结合NKp46的第一结合结构域包含：(i)VH，该VH包含分别具有SEQ ID NO:87、88和89的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3；和(ii)VL，该VL包含分别具有SEQID NO:90、91和92的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，结合NKp46的第一结合结构域包含：(i)VH，该VH包含分别具有SEQ IDNO:93、94和95的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3；和(ii)VL，该VL包含分别具有SEQ ID NO:96、97和98的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，结合NKp46的第一结合结构域包含VH，该VH包含分别具有SEQ IDNO:67的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3。在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，结合NKp46的第一结合结构域包含VL，该VL包含分别具有SEQ ID NO:68的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VLCDR3。在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，结合NKp46的第一结合结构域包含：(i)VH，该VH包含分别具有SEQ ID NO:67的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的氨基酸序列的VHCDR1、VH CDR2和VH CDR3；和(ii)VL，该VL包含分别具有SEQ ID NO:68的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，结合NKp46的第一结合结构域包含具有SEQ ID NO:67的氨基酸序列的VH。在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，结合NKp46的第一结合结构域包含具有SEQID NO:68的氨基酸序列的VL。在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，结合NKp46的第一结合结构域包含具有SEQ ID NO:67的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:68的氨基酸序列的VL。在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，结合NKp46的第一结合结构域包含VH，该VH包含与SEQ ID NO:67的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，结合NKp46的第一结合结构域包含VL，该VL包含与SEQ ID NO:68的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，结合NKp46的第一结合结构域包含：VH，该VH包含与SEQ ID NO:67的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列；以及VL，该VL包含与SEQ ID NO:68的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，结合NKp46的第一结合结构域的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3氨基酸序列根据Kabat编号系统。在一些实施方案中，结合NKp46的第一结合结构域的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3氨基酸序列根据Chothia编号系统。在一些实施方案中，结合NKp46的第一结合结构域的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3氨基酸序列根据AbM编号系统。在一些实施方案中，结合NKp46的第一结合结构域的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VLCDR3氨基酸序列根据Contact编号系统。在一些实施方案中，结合NKp46的第一结合结构域的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3氨基酸序列根据IMGT编号系统。
在本文提供的多特异性NKp46抗体的一些实施方案中，第一结合结构域结合NKp46抗原。在一些实施方案中，第一结合结构域结合NKp46表位。在一些实施方案中，第一结合结构域与NKp46特异性结合。在一些实施方案中，第一结合结构域的VH CDR1、VH CDR2、VHCDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3形成NKp46的抗原的结合位点。在一些实施方案中，第一结合结构域的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3形成NKp46的表位的结合位点。在一些实施方案中，NKp46存在于NK细胞的表面上。
在另一方面，本文提供了一种多特异性抗体，其与本文所述的NKp46抗体中的任一者竞争与NKp46结合。在另一方面，本文提供了一种多特异性抗体，其与本文所述的NKp46抗体中的任一者结合相同表位。在另一方面，提供了一种多特异性NKp46抗体，其结合NKp46上的表位，该表位与由本文所述的NKp46抗体结合的NKp46上的表位重叠。
在一个方面，提供了一种多特异性抗体，其与NKp46参考抗体竞争与NKp46结合。在另一方面，提供了一种多特异性NKp46抗体，其与NKp46参考抗体结合相同的NKp46表位。在另一方面，提供了一种多特异性NKp46抗体，其结合NKp46上的表位，该表位与由NKp46参考抗体结合的NKp46上的表位重叠。
在一个实施方案中，NKp46参考抗体包含：(i)VH，该VH包含分别具有VH CDR1、VHCDR2和VH CDR3的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，这些VH CDR属于具有SEQ IDNO:67的氨基酸序列的VH；和(ii)VL，该VL包含分别具有VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，这些VL CDR属于具有SEQ ID NO:68的氨基酸序列的VL。
在本文提供的多特异性NKp46抗体的一些实施方案中，第二靶标不是NKp46抗原。在本文提供的多特异性NKp46抗体的一些实施方案中，第三靶标不是NKp46抗原。在本文提供的多特异性NKp46抗体的一些实施方案中，第四靶标不是NKp46抗原。在本文提供的多特异性NKp46抗体的一些实施方案中，第二靶标不是NKp46抗原，并且第三靶标不是NKp46抗原。在本文提供的多特异性NKp46抗体的一些实施方案中，第二靶标不是NKp46抗原，并且第四靶标不是NKp46抗原。在本文提供的多特异性NKp46抗体的一些实施方案中，第三靶标不是NKp46抗原，并且第四靶标不是NKp46抗原。在本文提供的多特异性NKp46抗体的一些实施方案中，第二靶标不是NKp46抗原，第三靶标不是NKp46抗原，并且第四靶标不是NKp46抗原。在本文提供的多特异性NKp46抗体的一些实施方案中，第二靶标不是NKp46表位。在本文提供的多特异性NKp46抗体的一些实施方案中，第三靶标不是NKp46表位。在本文提供的多特异性NKp46抗体的一些实施方案中，第四靶标不是NKp46表位。在本文提供的多特异性NKp46抗体的一些实施方案中，第二靶标不是NKp46表位，并且第三靶标不是NKp46表位。在本文提供的多特异性NKp46抗体的一些实施方案中，第二靶标不是NKp46表位，并且第四靶标不是NKp46表位。在本文提供的多特异性NKp46抗体的一些实施方案中，第三靶标不是NKp46表位，并且第四靶标不是NKp46表位。在本文提供的多特异性NKp46抗体的一些实施方案中，第二靶标不是NKp46表位，第三靶标不是NKp46表位，并且第四靶标不是NKp46表位。在本文提供的多特异性NKp46抗体的一些实施方案中，第二靶标是BCMA。在本文提供的多特异性NKp46抗体的一些实施方案中，第二靶标是GPRC5d。
本文提供的多特异性抗体与存在于NK细胞的表面上的NKp46的结合以及与存在于第二靶细胞的表面上的第二靶抗原的结合可例如导致杀死第二靶细胞。在其他实施方案中，本文提供的多特异性抗体与存在于NK细胞的表面上的NKp46的结合以及与第二靶抗原的结合可例如导致NK细胞的活化。在一些实施方案中，本文提供了一种双特异性抗体，其包含：(a)与NKp46结合的第一结合结构域，和(b)与癌细胞表面上存在的癌症抗原结合的第二结合结构域。在一些实施方案中，癌细胞表面上的抗原是肿瘤特异性抗原。在一些实施方案中，癌细胞表面上的抗原是肿瘤相关抗原。在一些实施方案中，癌细胞表面上的抗原是新抗原。在某些实施方案中，双特异性抗体的第一结合结构域特异性结合NKp46。在一些实施方案中，NKp46存在于NK细胞的表面上。在一些实施方案中，当双特异性抗体与NK细胞的表面上的NKp46和癌细胞的表面上的抗原结合时，癌细胞被杀死。
本文提供的多特异性抗体与存在于T细胞的表面上的NKp46的结合以及与存在于第二靶细胞的表面上的第二靶抗原的结合可例如导致杀死第二靶细胞。在其他实施方案中，本文提供的多特异性抗体与存在于T细胞的表面上的NKp46的结合以及与第二靶抗原的结合可例如导致T细胞的活化。在一些实施方案中，本文提供了一种双特异性抗体，其包含：(a)与NKp46结合的第一结合结构域，和(b)与癌细胞表面上存在的癌症抗原结合的第二结合结构域。在一些实施方案中，癌细胞表面上的抗原是肿瘤特异性抗原。在一些实施方案中，癌细胞表面上的抗原是肿瘤相关抗原。在一些实施方案中，癌细胞表面上的抗原是新抗原。在某些实施方案中，双特异性抗体的第一结合结构域特异性结合NKp46。在一些实施方案中，NKp46存在于T细胞的表面上。在一些实施方案中，当双特异性抗体与T细胞的表面上的NKp46和癌细胞的表面上的抗原结合时，癌细胞被杀死。在一些实施方案中，T细胞是γδT细胞。在一些实施方案中，T细胞是先天淋巴细胞的粘膜群体。
在另一方面，本文提供了一种双特异性抗体，其包含：(a)与NKp46结合的第一结合结构域，和(b)与BCMA结合的第二结合结构域。在某些实施方案中，双特异性抗体的第一结合结构域特异性结合NKp46。在一些实施方案中，NKp46存在于NK细胞的表面上。在一些实施方案中，BCMA位于细胞的表面上。在某些实施方案中，NKp46存在于NK细胞的表面上，并且BCMA位于细胞的表面上。在一些实施方案中，当双特异性抗体与NK细胞表面上的NKp46和细胞表面上的BCMA结合时，表面有BCMA的细胞被杀死。在一些实施方案中，BCMA位于癌细胞的表面上。在某些实施方案中，NKp46存在于NK细胞的表面上，并且BCMA位于癌细胞的表面上。在一些实施方案中，当双特异性抗体与NK细胞的表面上的NKp46和细胞的表面上的BCMA结合时，癌细胞被杀死。在某些实施方案中考虑了包含本文提供的NKp46抗体中的任一者作为第一结合结构域的双特异性抗体。此外，在某些实施方案中还考虑了包含作为第一结合结构域的本文提供的NKp46抗体中的任一者和与BCMA结合的第二结合结构域的双特异性抗体。
在一些实施方案中，本文提供的多特异性抗体是双特异性抗体，该双特异性抗体包含：(a)与NKp46结合的第一结合结构域，和(b)与BCMA结合的第二结合结构域，其中结合BCMA的第二结合结构域包含：(i)VH，该VH包含分别具有SEQ ID NO:101、102和103的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3；和(ii)VL，该VL包含分别具有SEQ ID NO:104、105和106的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，结合BCMA的第二结合结构域包含：(i)VH，该VH包含分别具有SEQ ID NO:107、108和109的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3；和(ii)VL，该VL包含分别具有SEQ ID NO:110、111和112的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，结合BCMA的第二结合结构域包含：(i)VH，该VH包含分别具有SEQ ID NO:113、114和115的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3；和(ii)VL，该VL包含分别具有SEQ ID NO:116、117和118的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，结合BCMA的第二结合结构域包含：(i)VH，该VH包含分别具有SEQ ID NO:119、120和121的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3；和(ii)VL，该VL包含分别具有SEQ ID NO:122、123和124的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，结合BCMA的第二结合结构域包含：(i)VH，该VH包含分别具有SEQ ID NO:125、126和127的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3；和(ii)VL，该VL包含分别具有SEQ ID NO:128、129和130的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VLCDR3。在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，结合BCMA的第二结合结构域包含VH，该VH包含分别具有SEQ ID NO:99的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3。在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，结合BCMA的第二结合结构域包含VL，该VL包含分别具有SEQ ID NO:100的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，结合BCMA的第二结合结构域包含：(i)VH，该VH包含分别具有SEQ ID NO:99的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3；和(ii)VL，该VL包含分别具有SEQID NO:100的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，结合BCMA的第二结合结构域包含具有SEQ IDNO:99的氨基酸序列的VH。在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，结合BCMA的第二结合结构域包含具有SEQ ID NO:100的氨基酸序列的VL。在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，结合BCMA的第二结合结构域包含具有SEQ ID NO:99的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:100的氨基酸序列的VL。在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，结合BCMA的第二结合结构域包含VH，该VH包含与SEQ ID NO:99的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，结合BCMA的第二结合结构域包含VL，该VL包含与SEQ ID NO:100的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，结合BCMA的第二结合结构域包含：VH，该VH包含与SEQ ID NO:99的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列；以及VL，该VL包含与SEQ ID NO:100的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。
在另一方面，本文提供了一种双特异性抗体，其包含：(a)与NKp46结合的第一结合结构域，和(b)与GPRC5d结合的第二结合结构域。在某些实施方案中，双特异性抗体的第一结合结构域特异性结合NKp46。在一些实施方案中，NKp46存在于NK细胞的表面上。在一些实施方案中，GPRC5d位于细胞的表面上。在某些实施方案中，NKp46存在于NK细胞的表面上，并且GPRC5d位于细胞的表面上。在一些实施方案中，当双特异性抗体与NK细胞表面上的NKp46和细胞表面上的GPRC5d结合时，表面有GPRC5d的细胞被杀死。在一些实施方案中，GPRC5d位于癌细胞的表面上。在某些实施方案中，NKp46存在于NK细胞的表面上，并且GPRC5d位于癌细胞的表面上。在一些实施方案中，当双特异性抗体与NK细胞的表面上的NKp46和癌细胞的表面上的GPRC5d结合时，癌细胞被杀死。在某些实施方案中考虑了包含本文提供的NKp46抗体中的任一者作为第一结合结构域的双特异性抗体。此外，在某些实施方案中还考虑了包含作为第一结合结构域的本文提供的NKp46抗体中的任一者和与GPRC5d结合的第二结合结构域的双特异性抗体。
在一些实施方案中，本文提供的多特异性抗体是双特异性抗体，该双特异性抗体包含：(a)与NKp46结合的第一结合结构域，和(b)与GPRC5d结合的第二结合结构域，其中结合GPRC5d的第二结合结构域包含：(i)VH，该VH包含分别具有SEQ ID NO:133、134和135的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3；和(ii)VL，该VL包含分别具有SEQ ID NO:136、137和138的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，结合GPRC5d的第二结合结构域包含：(i)VH，该VH包含分别具有SEQ ID NO:139、140和141的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3；和(ii)VL，该VL包含分别具有SEQID NO:142、143和144的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，结合GPRC5d的第二结合结构域包含：(i)VH，该VH包含分别具有SEQID NO:145、146和147的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3；和(ii)VL，该VL包含分别具有SEQ ID NO:148、149和150的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，结合GPRC5d的第二结合结构域包含：(i)VH，该VH包含分别具有SEQ ID NO:151、152和153的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3；和(ii)VL，该VL包含分别具有SEQ ID NO:154、155和156的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VLCDR3。在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，结合GPRC5d的第二结合结构域包含：(i)VH，该VH包含分别具有SEQ ID NO:157、158和159的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VHCDR3；和(ii)VL，该VL包含分别具有SEQ ID NO:160、161和162的氨基酸序列的VL CDR1、VLCDR2和VL CDR3。在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，结合GPRC5d的第二结合结构域包含VH，该VH包含分别具有SEQ ID NO:131的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3。在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，结合GPRC5d的第二结合结构域包含VL，该VL包含分别具有SEQ ID NO:132的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，结合GPRC5d的第二结合结构域包含：(i)VH，该VH包含分别具有SEQ ID NO:131的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3；和(ii)VL，该VL包含分别具有SEQ ID NO:132的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR1、VLCDR2和VL CDR3。在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，结合GPRC5d的第二结合结构域包含具有SEQ ID NO:131的氨基酸序列的VH。在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，结合GPRC5d的第二结合结构域包含具有SEQ ID NO:132的氨基酸序列的VL。在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，结合GPRC5d的第二结合结构域包含具有SEQ IDNO:131的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:132的氨基酸序列的VL。在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，结合GPRC5d的第二结合结构域包含VH，该VH包含与SEQ ID NO:131的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，结合GPRC5d的第二结合结构域包含VL，该VL包含与SEQ ID NO:132的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，结合GPRC5d的第二结合结构域包含：VH，该VH包含与SEQ ID NO:131的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列；以及VL，该VL包含与SEQ ID NO:132的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。
在具体的实施方案中，提供了一种多特异性抗体，其包含本文提供的NKp46抗体，呈杵臼结构形式。在具体的实施方案中，提供了一种双特异性抗体，其包含本文提供的NKp46抗体，呈杵臼结构形式。在具体的实施方案中，提供了一种三特异性抗体，其包含本文提供的NKp46抗体，呈杵臼结构形式。在具体的实施方案中，提供了一种四特异性抗体，其包含本文提供的NKp46抗体，呈杵臼结构形式。可使用本领域熟知的方法将其他特异性添加到呈杵臼结构形式的抗体中(例如，将scFv添加到N-末端或C-末端)。此外，制备多特异性抗体的其他形式和方法也是本领域已知的并且被考虑。在一些实施方案中，本文提供的NKp46抗体包含在双特异性抗体中。在一些实施方案中，本文提供的NKp46抗体包含在三特异性抗体中。在一些实施方案中，本文提供的NKp46抗体包含在四特异性抗体中。在一些实施方案中，本文提供的NKp46双特异性抗体包含在多特异性抗体中。
在某些实施方案中，本文提供的多特异性抗体包含：第一结合结构域，该第一结合结构域包含与第一NKp46表位结合的本文提供的NKp46抗体；以及第二结合结构域，该第二结合结构域与第二表位结合，其中第一NKp46表位和第二表位不同。在某些实施方案中，本文提供的双特异性抗体包含：第一结合结构域，该第一结合结构域包含与第一NKp46表位结合的本文提供的NKp46抗体；以及第二结合结构域，该第二结合结构域与第二表位结合，其中第一NKp46表位和第二表位不同。在某些实施方案中，本文提供的三特异性抗体包含：第一结合结构域，该第一结合结构域包含与第一NKp46表位结合的本文提供的NKp46抗体；第二结合结构域，该第二结合结构域与第二表位结合；以及第三结合结构域，该第三结合结构域与第三表位结合，其中第一NKp46表位、第二表位和第三表位不同。在某些实施方案中，本文提供的四特异性抗体包含：第一结合结构域，该第一结合结构域包含与第一NKp46表位结合的本文提供的NKp46抗体；第二结合结构域，该第二结合结构域与第二表位结合；第三结合结构域，该第三结合结构域与第三表位结合；以及第四结合结构域，该第四结合结构域与第四表位结合，其中第一NKp46表位、第二表位、第三表位和第四表位不同。在某些实施方案中，本文提供的多特异性抗体包含：第一结合结构域，该第一结合结构域包含与第一NKp46抗原结合的本文提供的NKp46抗体；以及第二结合结构域，该第二结合结构域与第二抗原结合，其中第一NKp46抗原和第二抗原不同。在某些实施方案中，本文提供的双特异性抗体包含：第一结合结构域，该第一结合结构域包含与第一NKp46抗原结合的本文提供的NKp46抗体；以及第二结合结构域，该第二结合结构域与第二抗原结合，其中第一NKp46抗原和第二抗原不同。在某些实施方案中，本文提供的三特异性抗体包含：第一结合结构域，该第一结合结构域包含与第一NKp46抗原结合的本文提供的NKp46抗体；第二结合结构域，该第二结合结构域与第二抗原结合；以及第三结合结构域，该第三结合结构域与第三抗原结合，其中第一NKp46抗原、第二抗原和第三抗原不同。在某些实施方案中，本文提供的四特异性抗体包含：第一结合结构域，该第一结合结构域包含与第一NKp46抗原结合的本文提供的NKp46抗体；第二结合结构域，该第二结合结构域与第二抗原结合；第三结合结构域，该第三结合结构域与第三抗原结合；以及第四结合结构域，该第四结合结构域与第四抗原结合，其中第一NKp46抗原、第二抗原、第三抗原和第四抗原不同。在一个具体的实施方案中，本文提供的NKp46抗体或其抗原结合片段与NKp46特异性结合。
在一些实施方案中，多特异性抗体包含重链可变区和轻链可变区。在一些实施方案中，第一结合结构域包含重链可变区和轻链可变区。在一些实施方案中，第二结合结构域包含重链可变区和轻链可变区。在一些实施方案中，第一结合结构域包含重链可变区和轻链可变区，并且第二结合结构域包含重链可变区和轻链可变区。在一些实施方案中，NKp46抗体不是单结构域抗体或纳米抗体。在一些实施方案中，第三结合结构域包含重链可变区和轻链可变区。在一些实施方案中，第四结合结构域包含重链可变区和轻链可变区。
在某些实施方案中，NKp46多特异性抗体或其抗原结合片段与位于NKp46上的第一表位和第二靶抗原的第二表位结合。在一些实施方案中，本文提供了一种多特异性抗体，其包含：(a)与NKp46抗原结合的第一结合结构域，和(b)与第二靶抗原结合的第二结合结构域。在一些实施方案中，本文提供了一种多特异性抗体，其包含：(a)与NKp46抗原特异性结合的第一结合结构域，和(b)与第二靶抗原特异性结合的第二结合结构域。在一些实施方案中，本文提供了一种多特异性抗体，其包含：(a)与NKp46抗原上的第一表位结合的第一结合结构域，和(b)与第二靶抗原上的第二表位结合的第二结合结构域。在一些实施方案中，本文提供了一种多特异性抗体，其包含：(a)与NKp46抗原上的第一表位特异性结合的第一结合结构域，和(b)与第二靶抗原上的第二表位特异性结合的第二结合结构域。
在具体的实施方案中，NKp46抗原位于NK细胞的表面上。在某些实施方案中，第二靶抗原不是NKp46。NKp46多特异性抗体与存在于NK细胞的表面上的NKp46的结合以及与存在于第二靶细胞的表面上的第二靶抗原的结合可例如导致杀死第二靶细胞。在其他实施方案中，NKp46多特异性抗体与存在于NK细胞的表面上的NKp46的结合以及与第二靶抗原的结合可例如导致NK细胞的活化。
在具体实施方案中，NKp46抗原位于T细胞的表面上。在某些实施方案中，第二靶抗原不是NKp46。NKp46多特异性抗体与存在于T细胞的表面上的NKp46结合以及与存在于第二靶细胞的表面上的第二靶抗原结合可例如导致杀死第二靶细胞。在其他实施方案中，NKp46多特异性抗体与存在于T细胞的表面上的NKp46的结合，以及第二靶抗原的结合可例如导致T细胞的活化。在一些实施方案中，T细胞是γδT细胞。在一些实施方案中，T细胞是先天淋巴细胞。
在另一方面，本文提供了一种多特异性抗体，其包含与NKp46结合的第一结合结构域以及与BCMA结合的第二结合结构域(“多特异性NKp46/BCMA抗体”)。在一些实施方案中，多特异性NKp46/BCMA抗体是双特异性抗体。在一些实施方案中，多特异性NKp46/BCMA抗体是三特异性抗体。在一些实施方案中，多特异性NKp46/BCMA抗体是四特异性抗体。
在一些实施方案中，本文提供的多特异性NKp46/BCMA抗体包含：(a)结合NKp46的第一结合结构域，和(b)与BCMA结合的第二结合结构域。在一个实施方案中，多特异性NKp46/BCMA抗体包含：(a)结合NKp46的第一结合结构域，和(b)与BCMA结合的第二结合结构域，以及(c)与第三靶标结合的第三结合结构域。在一个实施方案中，多特异性NKp46/BCMA抗体包含：(a)结合NKp46的第一结合结构域，和(b)与BCMA结合的第二结合结构域，(c)与第三靶标结合的第三结合结构域，以及(d)与第四靶标结合的第四结合结构域。
在本文提供的多特异性NKp46/BCMA抗体的一些实施方案中，结合NKp46的第一结合结构域包含VH，该VH包含分别具有VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，这些VH CDR属于具有SEQ ID NO:67的氨基酸序列的VH。在本文提供的多特异性NKp46/BCMA抗体的一些实施方案中，结合NKp46的第一结合结构域包含VL，该VL包含分别具有VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，这些VL CDR属于具有SEQ ID NO:68的氨基酸序列的VL。在本文提供的多特异性NKp46/BCMA抗体的一些实施方案中，结合NKp46的第一结合结构域包含：(i)VH，该VH包含分别具有VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，这些VH CDR属于具有SEQID NO:67的氨基酸序列的VH；和(ii)VL，该VL包含分别具有VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，这些VL CDR属于具有SEQ ID NO:68的氨基酸序列的VL。在本文提供的多特异性NKp46/BCMA抗体的一些实施方案中，结合NKp46的第一结合结构域包含具有SEQ ID NO:67的氨基酸序列的VH。在本文提供的多特异性NKp46/BCMA抗体的一些实施方案中，结合NKp46的第一结合结构域包含具有SEQ ID NO:68的氨基酸序列的VL。在本文提供的多特异性NKp46/BCMA抗体的一些实施方案中，结合NKp46的第一结合结构域包含具有SEQ ID NO:67的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:68的氨基酸序列的VL。
在本文提供的多特异性NKp46/BCMA抗体的一些实施方案中，结合NKp46的第一结合结构域的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3氨基酸序列根据Kabat编号系统。在本文提供的多特异性NKp46/BCMA抗体的一些实施方案中，结合NKp46的第一结合结构域的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3氨基酸序列根据Chothia编号系统。在本文提供的多特异性NKp46/BCMA抗体的一些实施方案中，结合NKp46的第一结合结构域的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3氨基酸序列根据AbM编号系统。在本文提供的多特异性NKp46/BCMA抗体的一些实施方案中，结合NKp46的第一结合结构域的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3氨基酸序列根据Contact编号系统。在本文提供的多特异性NKp46/BCMA抗体的一些实施方案中，结合NKp46的第一结合结构域的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3氨基酸序列根据IMGT编号系统。
在本文提供的多特异性NKp46/BCMA抗体的一些实施方案中，第一结合结构域结合NKp46抗原。在本文提供的多特异性NKp46/BCMA抗体的一些实施方案中，第一结合结构域结合NKp46表位。在本文提供的多特异性NKp46/BCMA抗体的一些实施方案中，第一结合结构域与NKp46特异性结合。在本文提供的多特异性NKp46/BCMA抗体的一些实施方案中，第一结合结构域的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3形成NKp46的抗原的结合位点。在本文提供的多特异性NKp46/BCMA抗体的一些实施方案中，第一结合结构域的VHCDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3形成NKp46的表位的结合位点。在本文提供的多特异性NKp46/BCMA抗体的一些实施方案中，NKp46存在于NK细胞的表面上。
在本文提供的多特异性NKp46/BCMA抗体的一些实施方案中，结合BCMA的第二结合结构域包含VH，该VH包含分别具有SEQ ID NO:99的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3。在本文提供的多特异性NKp46/BCMA抗体的一些实施方案中，结合BCMA的第二结合结构域包含VL，该VL包含分别具有SEQ ID NO:100的VL CDR1、VLCDR2和VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。在本文提供的多特异性NKp46/BCMA抗体的一些实施方案中，结合BCMA的第二结合结构域包含：(i)VH，该VH包含分别具有SEQ ID NO:99的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VHCDR3；和(ii)VL，该VL包含分别具有SEQ ID NO:100的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。在本文提供的多特异性NKp46/BCMA抗体的一些实施方案中，结合BCMA的第二结合结构域包含具有SEQ ID NO:99的氨基酸序列的VH。在本文提供的多特异性NKp46/BCMA抗体的一些实施方案中，结合BCMA的第二结合结构域包含具有SEQID NO:100的氨基酸序列的VL。在本文提供的多特异性NKp46/BCMA抗体的一些实施方案中，结合BCMA的第二结合结构域包含具有SEQ ID NO:99的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:100的氨基酸序列的VL。
在本文提供的多特异性NKp46/BCMA抗体的一些实施方案中，结合BCMA的第二结合结构域的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3氨基酸序列根据Kabat编号系统。在本文提供的多特异性NKp46/BCMA抗体的一些实施方案中，结合BCMA的第二结合结构域的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3氨基酸序列根据Chothia编号系统。在本文提供的多特异性NKp46/BCMA抗体的一些实施方案中，结合BCMA的第二结合结构域的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3氨基酸序列根据AbM编号系统。在本文提供的多特异性NKp46/BCMA抗体的一些实施方案中，结合BCMA的第二结合结构域的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3氨基酸序列根据Contact编号系统。在本文提供的多特异性NKp46/BCMA抗体的一些实施方案中，结合BCMA的第二结合结构域的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3氨基酸序列根据IMGT编号系统。
在本文提供的多特异性NKp46/BCMA抗体的一些实施方案中，第二结合结构域结合BCMA抗原。在本文提供的多特异性NKp46/BCMA抗体的一些实施方案中，第二结合结构域结合BCMA表位。在本文提供的多特异性NKp46/BCMA抗体的一些实施方案中，第二结合结构域与BCMA特异性结合。在本文提供的多特异性NKp46/BCMA抗体的一些实施方案中，第二结合结构域的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3形成BCMA的抗原的结合位点。在一些实施方案中，第二结合结构域的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3形成BCMA的表位的结合位点。在一些实施方案中，BCMA存在于肿瘤细胞的表面上。
在本文提供的多特异性NKp46/BCMA抗体的一些实施方案中，第三靶标不是NKp46抗原。在本文提供的多特异性NKp46/BCMA抗体的一些实施方案中，第四靶标不是NKp46抗原。在本文提供的多特异性NKp46/BCMA抗体的一些实施方案中，第三靶标不是NKp46抗原，并且第四靶标不是NKp46抗原。在本文提供的多特异性NKp46/BCMA抗体的一些实施方案中，第三靶标不是BCMA抗原。在本文提供的多特异性NKp46/BCMA抗体的一些实施方案中，第四靶标不是BCMA抗原。在本文提供的多特异性NKp46/BCMA抗体的一些实施方案中，第三靶标不是BCMA抗原，并且第四靶标不是BCMA抗原。在本文提供的多特异性NKp46/BCMA抗体的一些实施方案中，第三靶标不是NKp46表位。在本文提供的多特异性NKp46/BCMA抗体的一些实施方案中，第四靶标不是NKp46表位。在本文提供的多特异性NKp46/BCMA抗体的一些实施方案中，第三靶标不是NKp46表位，并且第四靶标不是NKp46表位。在本文提供的多特异性NKp46/BCMA抗体的一些实施方案中，第三靶标不是BCMA表位。在本文提供的多特异性NKp46/BCMA抗体的一些实施方案中，第四靶标不是BCMA表位。在本文提供的多特异性NKp46/BCMA抗体的一些实施方案中，第三靶标不是BCMA表位，并且第四靶标不是BCMA表位。
在具体实施方案中，靶标来自哺乳动物。在具体实施方案中，靶标来自大鼠。在具体实施方案中，靶标来自小鼠。在具体实施方案中，靶标来自灵长目动物。在具体实施方案中，靶标来自人。
在具体的实施方案中，以杵臼结构形式提供了多特异性NKp46/BCMA抗体。在具体的实施方案中，以杵臼结构形式提供了双特异性NKp46/BCMA抗体。在具体实施方案中，以杵臼结构形式提供了三特异性抗体。在具体实施方案中，以杵臼结构形式提供了四特异性抗体。可使用本领域熟知的方法将其他特异性添加到呈杵臼结构形式的抗体中(例如，将scFv添加到N-末端或C-末端)。此外，制备多特异性抗体的其他形式和方法也是本领域已知的并且被考虑。在一些实施方案中，本文提供的NKp46/BCMA抗体包含在双特异性抗体中。在一些实施方案中，本文提供的NKp46/BCMA抗体包含在三特异性抗体中。在一些实施方案中，本文提供的NKp46/BCMA抗体包含在四特异性抗体中。在一些实施方案中，本文提供的NKp46/BCMA双特异性抗体包含在多特异性抗体中。
在某些实施方案中，本文提供的三特异性NKp46/BCMA抗体包含：第一结合结构域，该第一结合结构域包含与NKp46表位结合的本文提供的NKp46抗体；第二结合结构域，该第二结合结构域包含与BCMA表位结合的本文提供的BCMA抗体；以及第三结合结构域，该第三结合结构域与第三表位结合，其中NKp46表位、BCMA表位和第三表位不同。在某些实施方案中，本文提供的四特异性抗体包含：第一结合结构域，该第一结合结构域包含与NKp46表位结合的本文提供的NKp46抗体；第二结合结构域，该第二结合结构域包含与BCMA表位结合的本文提供的BCMA抗体；第三结合结构域，该第三结合结构域与第三表位结合；以及第四结合结构域，该第四结合结构域与第四表位结合，其中NKp46表位、BCMA表位、第三表位和第四表位不同。在某些实施方案中，本文提供的三特异性抗体包含：第一结合结构域，该第一结合结构域包含与NKp46抗原结合的本文提供的NKp46抗体；第二结合结构域，该第二结合结构域包含与BCMA抗原结合的本文提供的BCMA抗体；以及第三结合结构域，该第三结合结构域与第三抗原结合，其中NKp46抗原、BCMA抗原和第三抗原不同。在某些实施方案中，本文提供的四特异性抗体与NKp46抗原结合；第二结合结构域，该第二结合结构域包含与BCMA抗原结合的本文提供的BCMA抗体；第三结合结构域，该第三结合结构域与第三抗原结合，以及第四结合结构域，该第四结合结构域与第四抗原结合，其中NKp46抗原、BCMA抗原、第三抗原和第四抗原不同。在本文提供的多特异性NKp46/BCMA抗体的某些实施方案中，与NKp46结合的第一结合结构域与NKp46特异性结合。在本文提供的多特异性NKp46/BCMA抗体的其他实施方案中，与BCMA结合的第二结合结构域与BCMA特异性结合。在本文提供的多特异性NKp46/BCMA抗体的又一些实施方案中，与NKp46结合的第一结合结构域与NKp46特异性结合，并且与BCMA结合的第二结合结构域与BCMA特异性结合。
在一些实施方案中，多特异性NKp46/BCMA抗体包含重链可变区和轻链可变区。在一些实施方案中，第一结合结构域包含重链可变区和轻链可变区。在一些实施方案中，第二结合结构域包含重链可变区和轻链可变区。在一些实施方案中，第一结合结构域包含重链可变区和轻链可变区，并且第二结合结构域包含重链可变区和轻链可变区。在一些实施方案中，NKp46抗体不是单结构域抗体或纳米抗体。在一些实施方案中，第三结合结构域包含重链可变区和轻链可变区。在一些实施方案中，第四结合结构域包含重链可变区和轻链可变区。
在某些实施方案中，NKp46/BCMA多特异性抗体或其抗原结合片段与位于NKp46上的第一表位和位于BCMA上的第二表位结合。在一些实施方案中，本文提供了一种多特异性NKp46/BCMA抗体，其包含：(a)与NKp46抗原结合的第一结合结构域，和(b)与BCMA抗原结合的第二结合结构域。在一些实施方案中，本文提供了一种多特异性NKp46/BCMA抗体，其包含：(a)与NKp46抗原特异性结合的第一结合结构域，和(b)与BCMA抗原特异性结合的第二结合结构域。在一些实施方案中，本文提供了一种多特异性NKp46/BCMA抗体，其包含：(a)与NKp46抗原上的第一表位结合的第一结合结构域，和(b)与BCMA抗原上的第二表位结合的第二结合结构域。在一些实施方案中，本文提供了一种多特异性抗体，其包含：(a)与NKp46抗原上的第一表位特异性结合的第一结合结构域，和(b)与BCMA抗原上的第二表位特异性结合的第二结合结构域。
在具体的实施方案中，NKp46抗原位于NK细胞的表面上。在具体的实施方案中，BCMA抗原位于肿瘤细胞的表面上。NKp46/BCMA多特异性抗体与存在于NK细胞表面上的NKp46和存在于肿瘤细胞表面上的BCMA的结合可例如导致杀死肿瘤细胞。在其他实施方案中，NKp46/BCMA多特异性抗体与存在于NK细胞表面上的NKp46和存在于肿瘤细胞表面上的BCMA的结合可例如导致NK细胞的活化。
在具体实施方案中，NKp46抗原位于T细胞的表面上。在某些实施方案中，BCMA抗原位于肿瘤细胞的表面上。NKp46/BCMA多特异性抗体与存在于T细胞表面上的NKp46和存在于肿瘤细胞表面上的BCMA的结合可例如导致杀死肿瘤细胞。在其他实施方案中，NKp46/BCMA多特异性抗体与存在于T细胞表面上的NKp46和存在于肿瘤细胞表面上的BCMA的结合可例如导致T细胞的活化。在一些实施方案中，T细胞是γδT细胞。在一些实施方案中，T细胞是先天淋巴细胞。
在另一方面，本文提供了多特异性抗体，该多特异性抗体包含与NKp46结合的第一结合结构域以及与GPRC5d结合的第二结合结构域(“多特异性NKp46/GPRC5d抗体”)。在一些实施方案中，多特异性NKp46/GPRC5d抗体是双特异性抗体。在一些实施方案中，多特异性NKp46/GPRC5d抗体是三特异性抗体。在一些实施方案中，多特异性NKp46/GPRC5d抗体是四特异性抗体。
在一些实施方案中，本文提供的多特异性NKp46/GPRC5d抗体包含：(a)结合NKp46的第一结合结构域，和(b)与GPRC5d结合的第二结合结构域。在一个实施方案中，多特异性NKp46/GPRC5d抗体包含：(a)结合NKp46的第一结合结构域，和(b)与GPRC5d结合的第二结合结构域，以及(c)与第三靶标结合的第三结合结构域。在一个实施方案中，多特异性NKp46/GPRC5d抗体包含：(a)结合NKp46的第一结合结构域，和(b)与GPRC5d结合的第二结合结构域，(c)与第三靶标结合的第三结合结构域，以及(d)与第四靶标结合的第四结合结构域。
在本文提供的多特异性NKp46/GPRC5d抗体的一些实施方案中，结合NKp46的第一结合结构域包含VH，该VH包含分别具有VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的氨基酸序列的VHCDR1、VH CDR2和VH CDR3，这些VH CDR属于具有SEQ ID NO:67的氨基酸序列的VH。在本文提供的多特异性NKp46/GPRC5d抗体的一些实施方案中，结合NKp46的第一结合结构域包含VL，该VL包含分别具有VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VLCDR3，这些VL CDR属于具有SEQ ID NO:68的氨基酸序列的VL。在本文提供的多特异性NKp46/GPRC5d抗体的一些实施方案中，结合NKp46的第一结合结构域包含：(i)VH，该VH包含分别具有VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，这些VHCDR属于具有SEQ ID NO:67的氨基酸序列的VH；和(ii)VL，该VL包含分别具有VL CDR1、VLCDR2和VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，这些VL CDR属于具有SEQ IDNO:68的氨基酸序列的VL。在本文提供的多特异性NKp46/GPRC5d抗体的一些实施方案中，结合NKp46的第一结合结构域包含具有SEQ ID NO:67的氨基酸序列的VH。在本文提供的多特异性NKp46/GPRC5d抗体的一些实施方案中，结合NKp46的第一结合结构域包含具有SEQ IDNO:68的氨基酸序列的VL。在本文提供的多特异性NKp46/GPRC5d抗体的一些实施方案中，结合NKp46的第一结合结构域包含具有SEQ ID NO:67的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:68的氨基酸序列的VL。
在本文提供的多特异性NKp46/GPRC5d抗体的一些实施方案中，结合NKp46的第一结合结构域的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3氨基酸序列根据Kabat编号系统。在本文提供的多特异性NKp46/GPRC5d抗体的一些实施方案中，结合NKp46的第一结合结构域的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3氨基酸序列根据Chothia编号系统。在本文提供的多特异性NKp46/GPRC5d抗体的一些实施方案中，结合NKp46的第一结合结构域的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3氨基酸序列根据AbM编号系统。在本文提供的多特异性NKp46/GPRC5d抗体的一些实施方案中，结合NKp46的第一结合结构域的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3氨基酸序列根据Contact编号系统。在本文提供的多特异性NKp46/GPRC5d抗体的一些实施方案中，结合NKp46的第一结合结构域的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3氨基酸序列根据IMGT编号系统。
在本文提供的多特异性NKp46/GPRC5d抗体的一些实施方案中，第一结合结构域结合NKp46抗原。在本文提供的多特异性NKp46/GPRC5d抗体的一些实施方案中，第一结合结构域结合NKp46表位。在本文提供的多特异性NKp46/GPRC5d抗体的一些实施方案中，第一结合结构域与NKp46特异性结合。在本文提供的多特异性NKp46/GPRC5d抗体的一些实施方案中，第一结合结构域的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3形成NKp46的抗原的结合位点。在本文提供的多特异性NKp46/GPRC5d抗体的一些实施方案中，第一结合结构域的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3形成NKp46的表位的结合位点。在本文提供的多特异性NKp46/GPRC5d抗体的一些实施方案中，NKp46存在于NK细胞的表面上。
在本文提供的多特异性NKp46/GPRC5d抗体的一些实施方案中，结合GPRC5d的第二结合结构域包含VH，该VH包含分别具有SEQ ID NO:131的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3。在本文提供的多特异性NKp46/GPRC5d抗体的一些实施方案中，结合GPRC5d的第二结合结构域包含VL，该VL包含分别具有SEQ ID NO:132的VLCDR1、VL CDR2和VL CDR3的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。在本文提供的多特异性NKp46/GPRC5d抗体的一些实施方案中，结合GPRC5d的第二结合结构域包含：(i)VH，该VH包含分别具有SEQ ID NO:131的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的氨基酸序列的VH CDR1、VHCDR2和VH CDR3；和(ii)VL，该VL包含分别具有SEQ ID NO:132的VL CDR1、VL CDR2和VLCDR3的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。在本文提供的多特异性NKp46/GPRC5d抗体的一些实施方案中，结合GPRC5d的第二结合结构域包含具有SEQ ID NO:131的氨基酸序列的VH。在本文提供的多特异性NKp46/GPRC5d抗体的一些实施方案中，结合GPRC5d的第二结合结构域包含具有SEQ ID NO:132的氨基酸序列的VL。在本文提供的多特异性NKp46/GPRC5d抗体的一些实施方案中，结合GPRC5d的第二结合结构域包含具有SEQ ID NO:131的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:132的氨基酸序列的VL。
在本文提供的多特异性NKp46/GPRC5d抗体的一些实施方案中，结合GPRC5d的第二结合结构域的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3氨基酸序列根据Kabat编号系统。在本文提供的多特异性NKp46/GPRC5d抗体的一些实施方案中，结合GPRC5d的第二结合结构域的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3氨基酸序列根据Chothia编号系统。在本文提供的多特异性NKp46/GPRC5d抗体的一些实施方案中，结合GPRC5d的第二结合结构域的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3氨基酸序列根据AbM编号系统。在本文提供的多特异性NKp46/GPRC5d抗体的一些实施方案中，结合GPRC5d的第二结合结构域的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3氨基酸序列根据Contact编号系统。在本文提供的多特异性NKp46/GPRC5d抗体的一些实施方案中，结合GPRC5d的第二结合结构域的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VLCDR3氨基酸序列根据IMGT编号系统。
在本文提供的多特异性NKp46/GPRC5d抗体的一些实施方案中，第二结合结构域结合GPRC5d抗原。在本文提供的多特异性NKp46/GPRC5d抗体的一些实施方案中，第二结合结构域结合GPRC5d表位。在本文提供的多特异性NKp46/GPRC5d抗体的一些实施方案中，第二结合结构域与GPRC5d特异性地结合。在本文提供的多特异性NKp46/GPRC5d抗体的一些实施方案中，第二结合结构域的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3形成GPRC5d的抗原的结合位点。在一些实施方案中，第二结合结构域的VH CDR1、VH CDR2、VHCDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3形成GPRC5d的表位的结合位点。在一些实施方案中，GPRC5d存在于肿瘤细胞的表面上。
在本文提供的多特异性NKp46/GPRC5d抗体的一些实施方案中，第三靶标不是NKp46抗原。在本文提供的多特异性NKp46/GPRC5d抗体的一些实施方案中，第四靶标不是NKp46抗原。在本文提供的多特异性NKp46/GPRC5d抗体的一些实施方案中，第三靶标不是NKp46抗原，并且第四靶标不是NKp46抗原。在本文提供的多特异性NKp46/GPRC5d抗体的一些实施方案中，第三靶标不是GPRC5d抗原。在本文提供的多特异性NKp46/GPRC5d抗体的一些实施方案中，第四靶标不是GPRC5d抗原。在本文提供的多特异性NKp46/GPRC5d抗体的一些实施方案中，第三靶标不是GPRC5d抗原，并且第四靶标不是GPRC5d抗原。在本文提供的多特异性NKp46/GPRC5d抗体的一些实施方案中，第三靶标不是NKp46表位。在本文提供的多特异性NKp46/GPRC5d抗体的一些实施方案中，第四靶标不是NKp46表位。在本文提供的多特异性NKp46/GPRC5d抗体的一些实施方案中，第三靶标不是NKp46表位，并且第四靶标不是NKp46表位。在本文提供的多特异性NKp46/GPRC5d抗体的一些实施方案中，第三靶标不是GPRC5d表位。在本文提供的多特异性NKp46/GPRC5d抗体的一些实施方案中，第四靶标不是GPRC5d表位。在本文提供的多特异性NKp46/GPRC5d抗体的一些实施方案中，第三靶标不是GPRC5d表位，并且第四靶标不是GPRC5d表位。
在具体实施方案中，靶标来自哺乳动物。在具体实施方案中，靶标来自大鼠。在具体实施方案中，靶标来自小鼠。在具体实施方案中，靶标来自灵长目动物。在具体实施方案中，靶标来自人。
在具体实施方案中，以杵臼结构形式提供了多特异性NKp46/GPRC5d抗体。在具体实施方案中，以杵臼结构形式提供了双特异性NKp46/GPRC5d抗体。在具体实施方案中，以杵臼结构形式提供了三特异性抗体。在具体实施方案中，以杵臼结构形式提供了四特异性抗体。可使用本领域熟知的方法将其他特异性添加到呈杵臼结构形式的抗体中(例如，将scFv添加到N-末端或C-末端)。此外，制备多特异性抗体的其他形式和方法也是本领域已知的并且被考虑。在一些实施方案中，本文提供的NKp46/GPRC5d抗体包含在双特异性抗体中。在一些实施方案中，本文提供的NKp46/GPRC5d抗体包含在三特异性抗体中。在一些实施方案中，本文提供的NKp46/GPRC5d抗体包含在四特异性抗体中。在一些实施方案中，本文提供的NKp46/GPRC5d双特异性抗体包含在多特异性抗体中。
在某些实施方案中，本文提供的三特异性NKp46/GPRC5d抗体包含：第一结合结构域，该第一结合结构域包含与NKp46表位结合的本文提供的NKp46抗体；第二结合结构域，该第二结合结构域包含与GPRC5d表位结合的本文提供的GPRC5d抗体；以及第三结合结构域，该第三结合结构域与第三表位结合，其中NKp46表位、GPRC5d表位和第三表位不同。在某些实施方案中，本文提供的四特异性抗体包含：第一结合结构域，该第一结合结构域包含与NKp46表位结合的本文提供的NKp46抗体；第二结合结构域，该第二结合结构域包含与GPRC5d表位结合的本文提供的GPRC5d抗体；第三结合结构域，该第三结合结构域与第三表位结合；以及第四结合结构域，该第四结合结构域与第四表位结合，其中NKp46表位、GPRC5d表位、第三表位和第四表位不同。在某些实施方案中，本文提供的三特异性抗体包含：第一结合结构域，该第一结合结构域包含与NKp46抗原结合的本文提供的NKp46抗体；第二结合结构域，该第二结合结构域包含与GPRC5d抗原结合的本文提供的GPRC5d抗体；以及第三结合结构域，该第三结合结构域与第三抗原结合，其中NKp46抗原、GPRC5d抗原和第三抗原不同。在某些实施方案中，本文提供的四特异性抗体与NKp46抗原结合；第二结合结构域，该第二结合结构域包含与GPRC5d抗原结合的本文提供的GPRC5d抗体；第三结合结构域，该第三结合结构域与第三抗原结合，以及第四结合结构域，该第四结合结构域与第四抗原结合，其中NKp46抗原、GPRC5d抗原、第三抗原和第四抗原不同。在本文提供的多特异性NKp46/GPRC5d抗体的某些实施方案中，与NKp46结合的第一结合结构域与NKp46特异性结合。在本文提供的多特异性NKp46/GPRC5d抗体的其他实施方案中，与GPRC5d结合的第二结合结构域与GPRC5d特异性地结合。在本文提供的多特异性NKp46/GPRC5d抗体的又一些实施方案中，与NKp46结合的第一结合结构域与NKp46特异性地结合，并且与GPRC5d结合的第二结合结构域与GPRC5d特异性地结合。
在一些实施方案中，多特异性NKp46/GPRC5d抗体包含重链可变区和轻链可变区。在一些实施方案中，第一结合结构域包含重链可变区和轻链可变区。在一些实施方案中，第二结合结构域包含重链可变区和轻链可变区。在一些实施方案中，第一结合结构域包含重链可变区和轻链可变区，并且第二结合结构域包含重链可变区和轻链可变区。在一些实施方案中，NKp46抗体不是单结构域抗体或纳米抗体。在一些实施方案中，第三结合结构域包含重链可变区和轻链可变区。在一些实施方案中，第四结合结构域包含重链可变区和轻链可变区。
在某些实施方案中，NKp46/GPRC5d多特异性抗体或其抗原结合片段与位于NKp46上的第一表位和位于GPRC5d上的第二表位结合。在一些实施方案中，本文提供了一种多特异性NKp46/GPRC5d抗体，其包含：(a)与NKp46抗原结合的第一结合结构域，和(b)与GPRC5d抗原结合的第二结合结构域。在一些实施方案中，本文提供了一种多特异性NKp46/GPRC5d抗体，其包含：(a)与NKp46抗原特异性结合的第一结合结构域，和(b)与GPRC5d抗原特异性结合的第二结合结构域。在一些实施方案中，本文提供了一种多特异性NKp46/GPRC5d抗体，其包含：(a)与NKp46抗原上的第一表位结合的第一结合结构域，和(b)与GPRC5d抗原上的第二表位结合的第二结合结构域。在一些实施方案中，本文提供了一种多特异性抗体，其包含：(a)与NKp46抗原上的第一表位特异性结合的第一结合结构域，和(b)与GPRC5d抗原上的第二表位特异性结合的第二结合结构域。
在具体的实施方案中，NKp46抗原位于NK细胞的表面上。在具体的实施方案中，GPRC5d抗原位于肿瘤细胞的表面上。NKp46/GPRC5d多特异性抗体与存在于NK细胞表面上的NKp46和存在于肿瘤细胞表面上的GPRC5d的结合可例如导致杀死肿瘤细胞。在其他实施方案中，NKp46/GPRC5d多特异性抗体与存在于NK细胞表面上的NKp46和存在于肿瘤细胞表面上的GPRC5d的结合可例如导致NK细胞的活化。
在具体实施方案中，NKp46抗原位于T细胞的表面上。在某些实施方案中，GPRC5d抗原位于肿瘤细胞的表面上。NKp46/GPRC5d多特异性抗体与存在于T细胞表面上的NKp46和存在于肿瘤细胞表面上的GPRC5d的结合可例如导致杀死肿瘤细胞。在其他实施方案中，NKp46/GPRC5d多特异性抗体与存在于T细胞表面上的NKp46和存在于肿瘤细胞表面上的GPRC5d的结合可例如导致T细胞的活化。在一些实施方案中，T细胞是γδT细胞。在一些实施方案中，T细胞是先天淋巴细胞。
在一些具体的实施方案中，本文提供了在以下第7部分中产生的双特异性抗体，例如，如表21和表22所示。
在一些实施方案中，本文提供了一种双特异性抗体，该双特异性抗体包含与NK细胞上的抗原结合的第一结合结构域，该第一结合结构域包含SEQ ID NO:2的第一VH和SEQID NO:3的第一VL；和与肿瘤抗原结合的第二结合结构域，该第二结合结构域包含SEQ IDNO:99的第二VH和SEQ ID NO:100的第二VL。
在一些实施方案中，本文提供了一种双特异性抗体，该双特异性抗体包含与NK细胞上的抗原结合的第一结合结构域，该第一结合结构域包含SEQ ID NO:2的第一VH和SEQID NO:3的第一VL；和与肿瘤抗原结合的第二结合结构域，该第二结合结构域包含SEQ IDNO:131的第二VH和SEQ ID NO:132的第二VL。
在一些实施方案中，本文提供了一种双特异性抗体，该双特异性抗体包含与NK细胞上的抗原结合的第一结合结构域，该第一结合结构域包含SEQ ID NO:34的第一VH和SEQID NO:35的第一VL；和与肿瘤抗原结合的第二结合结构域，该第二结合结构域包含SEQ IDNO:99的第二VH和SEQ ID NO:100的第二VL。
在一些实施方案中，本文提供了一种双特异性抗体，该双特异性抗体包含与NK细胞上的抗原结合的第一结合结构域，该第一结合结构域包含SEQ ID NO:34的第一VH和SEQID NO:35的第一VL；和与肿瘤抗原结合的第二结合结构域，该第二结合结构域包含SEQ IDNO:131的第二VH和SEQ ID NO:132的第二VL。
在一些实施方案中，本文提供了一种双特异性抗体，该双特异性抗体包含与NK细胞上的抗原结合的第一结合结构域，该第一结合结构域包含SEQ ID NO:67的第一VH和SEQID NO:68的第一VL；和与肿瘤抗原结合的第二结合结构域，该第二结合结构域包含SEQ IDNO:99的第二VH和SEQ ID NO:100的第二VL。
在一些实施方案中，本文提供了一种双特异性抗体，该双特异性抗体包含与NK细胞上的抗原结合的第一结合结构域，该第一结合结构域包含SEQ ID NO:67的第一VH和SEQID NO:68的第一VL；和与肿瘤抗原结合的第二结合结构域，该第二结合结构域包含SEQ IDNO:131的第二VH和SEQ ID NO:132的第二VL。
在一些实施方案中，本文提供了一种双特异性抗体，该双特异性抗体包含SEQ IDNO:164的第一多肽、SEQ ID NO:163的第二多肽和SEQ ID NO:165的第三多肽。
在一些实施方案中，本文提供了一种双特异性抗体，该双特异性抗体包含SEQ IDNO:164的第一多肽、SEQ ID NO:163的第二多肽和SEQ ID NO:174的第三多肽。
在一些实施方案中，本文提供了一种双特异性抗体，该双特异性抗体包含SEQ IDNO:168的第一多肽、SEQ ID NO:169的第二多肽和SEQ ID NO:165的第三多肽。
在一些实施方案中，本文提供了一种双特异性抗体，该双特异性抗体包含SEQ IDNO:173的第一多肽、SEQ ID NO:170的第二多肽和SEQ ID NO:165的第三多肽。
在一些实施方案中，本文提供了一种双特异性抗体，该双特异性抗体包含SEQ IDNO:168的第一多肽、SEQ ID NO:169的第二多肽和SEQ ID NO:174的第三多肽。
在一些实施方案中，本文提供了一种双特异性抗体，该双特异性抗体包含SEQ IDNO:173的第一多肽、SEQ ID NO:170的第二多肽和SEQ ID NO:174的第三多肽。
在一些实施方案中，本文提供了一种双特异性抗体，该双特异性抗体包含SEQ IDNO:177的第一多肽、SEQ ID NO:163的第二多肽和SEQ ID NO:180的第三多肽。
在一些实施方案中，本文提供了一种双特异性抗体，该双特异性抗体包含SEQ IDNO:194的第一多肽、SEQ ID NO:163的第二多肽和SEQ ID NO:196的第三多肽。
在一些实施方案中，本文提供了一种双特异性抗体，该双特异性抗体包含SEQ IDNO:166的第一多肽和SEQ ID NO:163的第二多肽。在一些实施方案中，双特异性抗体包含两个各自包含SEQ ID NO:166的多肽和两个各自包含SEQ ID NO:163的多肽。
在一些实施方案中，本文提供了一种双特异性抗体，该双特异性抗体包含SEQ IDNO:167的第一多肽和SEQ ID NO:163的第二多肽。在一些实施方案中，双特异性抗体包含两个各自包含SEQ ID NO:167的多肽和两个各自包含SEQ ID NO:163的多肽。
在一些实施方案中，本文提供了一种双特异性抗体，该双特异性抗体包含SEQ IDNO:171的第一多肽和SEQ ID NO:170的第二多肽。在一些实施方案中，双特异性抗体包含两个各自包含SEQ ID NO:171的多肽和两个各自包含SEQ ID NO:170的多肽。
在一些实施方案中，本文提供了一种双特异性抗体，该双特异性抗体包含SEQ IDNO:172的第一多肽和SEQ ID NO:169的第二多肽。在一些实施方案中，双特异性抗体包含两个各自包含SEQ ID NO:172的多肽和两个各自包含SEQ ID NO:169的多肽。
在一些实施方案中，本文提供了一种双特异性抗体，该双特异性抗体包含SEQ IDNO:175的第一多肽和SEQ ID NO:170的第二多肽。在一些实施方案中，双特异性抗体包含两个各自包含SEQ ID NO:175的多肽和两个各自包含SEQ ID NO:170的多肽。
在一些实施方案中，本文提供了一种双特异性抗体，该双特异性抗体包含SEQ IDNO:176的第一多肽和SEQ ID NO:169的第二多肽。在一些实施方案中，双特异性抗体包含两个各自包含SEQ ID NO:176的多肽和两个各自包含SEQ ID NO:169的多肽。
本文提供的抗体可以来自任何动物来源，包括鸟和哺乳动物(例如，人、猴、鼠、驴、绵羊、兔、山羊、豚鼠、骆驼、马或鸡)。在某些实施方案中，本文提供的抗体是人或人源化单克隆抗体。如本文所用，“人”抗体包括具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗体，并且包括从人免疫球蛋白文库或从表达来自人基因的抗体的小鼠分离的抗体。
在某些实施方案中，抗体是全小鼠抗体。在某些实施方案中，抗体是小鼠-人嵌合抗体。在某些实施方案中，抗体是人源化抗体。在某些实施方案中，抗体是全人抗体。在其他实施方案中，本文提供的抗体是人源化抗体(例如，包含人恒定区和框架区)。本文提供的抗体可以是双特异性的、三特异性的或更高的多特异性。
在一些实施方案中，本文提供的抗体或抗原结合片段以小于1000nM的KD结合NKG2d。在一些实施方案中，本文提供的抗体或抗原结合片段以小于100nM的KD结合NKG2d。在一些实施方案中，本文提供的抗体或抗原结合片段以小于50nM的KD结合NKG2d。在一些实施方案中，本文提供的抗体或抗原结合片段以小于40nM的KD结合NKG2d。在一些实施方案中，本文提供的抗体或抗原结合片段以小于30nM的KD结合NKG2d。在一些实施方案中，本文提供的抗体或抗原结合片段以小于20nM的KD结合NKG2d。在一些实施方案中，本文提供的抗体或抗原结合片段以小于10nM的KD结合NKG2d。在一些实施方案中，本文提供的抗体或抗原结合片段以小于9nM的KD结合NKG2d。在一些实施方案中，本文提供的抗体或抗原结合片段以小于8nM的KD结合NKG2d。在一些实施方案中，本文提供的抗体或抗原结合片段以小于7nM的KD结合NKG2d。在一些实施方案中，本文提供的抗体或抗原结合片段以小于6nM的KD结合NKG2d。在一些实施方案中，本文提供的抗体或抗原结合片段以小于5nM的KD结合NKG2d。在一些实施方案中，本文提供的抗体或抗原结合片段以小于4nM的KD结合NKG2d。在一些实施方案中，本文提供的抗体或抗原结合片段以小于3nM的KD结合NKG2d。在一些实施方案中，本文提供的抗体或抗原结合片段以小于2nM的KD结合NKG2d。在一些实施方案中，本文提供的抗体或抗原结合片段以小于1nM的KD结合NKG2d。在一些实施方案中，本文提供的抗体或抗原结合片段以小于0.1nM的KD结合NKG2d。在一些实施方案中，本文提供的抗体或抗原结合片段以小于0.01nM的KD结合NKG2d。KD或KD值还可通过本领域中任何已知的方法来测量，例如，使用生物层干涉法(BLI)或表面等离子体共振(SPR)测定由使用例如/>系统、或由/>使用例如/>TM-2000或/>TM-3000来测量。“结合速率”或“缔合的速率”或“缔合速率”或“kon”也可用上述相同的生物层干涉测量法(BLI)或表面等离子共振(SPR)技术使用例如/> TM-2000或/>TM-3000系统来确定。在一个具体的实施方案中，KD通过/>测定来确定。在一些实施方案中，NKG2d是人NKG2d。在一些实施方案中，NKG2d是食蟹猕猴NKG2d。在一些实施方案中，NKG2d是大鼠NKG2d。在其他实施方案中，NKG2d是小鼠NKG2d。
在其他实施方案中，本文提供的抗体或抗原结合片段以小于1000nM的KD结合NKp46。在一些实施方案中，本文提供的抗体或抗原结合片段以小于100nM的KD结合NKp46。在一些实施方案中，本文提供的抗体或抗原结合片段以小于50nM的KD结合NKp46。在一些实施方案中，本文提供的抗体或抗原结合片段以小于40nM的KD结合NKp46。在一些实施方案中，本文提供的抗体或抗原结合片段以小于30nM的KD结合NKp46。在一些实施方案中，本文提供的抗体或抗原结合片段以小于20nM的KD结合NKp46。在一些实施方案中，本文提供的抗体或抗原结合片段以小于10nM的KD结合NKp46。在一些实施方案中，本文提供的抗体或抗原结合片段以小于9nM的KD结合NKp46。在一些实施方案中，本文提供的抗体或抗原结合片段以小于8nM的KD结合NKp46。在一些实施方案中，本文提供的抗体或抗原结合片段以小于7nM的KD结合NKp46。在一些实施方案中，本文提供的抗体或抗原结合片段以小于6nM的KD结合NKp46。在一些实施方案中，本文提供的抗体或抗原结合片段以小于5nM的KD结合NKp46。在一些实施方案中，本文提供的抗体或抗原结合片段以小于4nM的KD结合NKp46。在一些实施方案中，本文提供的抗体或抗原结合片段以小于3nM的KD结合NKp46。在一些实施方案中，本文提供的抗体或抗原结合片段以小于2nM的KD结合NKp46。在一些实施方案中，本文提供的抗体或抗原结合片段以小于1nM的KD结合NKp46。在一些实施方案中，本文提供的抗体或抗原结合片段以小于0.1nM的KD结合NKp46。在一些实施方案中，本文提供的抗体或抗原结合片段以小于0.01nM的KD结合NKp46。KD或KD值还可通过本领域中任何已知的方法来测量，例如，使用生物层干涉法(BLI)或表面等离子体共振(SPR)测定由使用例如/>Red96系统、或由/>使用例如/>TM-2000或/>TM-3000来测量。“结合速率”或“缔合的速率”或“缔合速率”或“kon”也可用上述相同的生物层干涉测量法(BLI)或表面等离子共振(SPR)技术使用例如/>Red96、/>TM-2000或/>TM-3000系统来确定。在一个具体的实施方案中，KD通过/>测定来确定。在一些实施方案中，NKp46是人NKp46。在一些实施方案中，NKp46是食蟹猕猴NKp46。在一些实施方案中，NKp46是大鼠NKp46。在其他实施方案中，NKp46是小鼠NKp46。
本领域已知的任何多特异性抗体平台或形式可用于本公开，包括本领域中任何已知的双特异性抗体形式。
在一些实施方案中，本文提供的多特异性抗体是经由受控Fab臂交换得到的双价抗体、交叉体或多特异性抗体，如本文所述的那些。
在一些实施方案中，多特异性抗体包括具有促进异源二聚化的互补CH3结构域的IgG样分子；重组IgG样双靶向分子，其中该分子的两侧各自含有至少两种不同抗体的Fab片段的一部分或Fab片段；IgG融合分子，其中全长IgG抗体与额外的Fab片段或Fab片段的部分融合；Fc融合分子，其中单链Fv分子或稳定的双体抗体与重链恒定结构域、Fc区或其部分融合；Fab融合分子，其中不同的Fab片段融合在一起；基于ScFv和双体抗体的重链抗体(例如结构域抗体、纳米抗体)，其中不同的单链Fv分子或不同的双体抗体或不同的重链抗体(例如结构域抗体、纳米抗体)彼此融合或与另一蛋白质或载剂分子融合。
在一些实施方案中，具有互补CH3结构域分子的IgG样分子包括Triomab/Quadroma(Trion Pharma/Fresenius Biotech)、杵臼结构(Knobs-into-Holes)抗体(Genentech)、CrossMAbs(Roche)和静电配对体(electrostatically-matched)(Amgen)、LUZ-Y(Genentech)、链交换工程化结构域体(Strand Exchange Engineered Domain body)(SEEDbody)(EMD Serono)、Biclonic(Merus)和DuoBody(Genmab A/S)。
在一些实施方案中，重组IgG样双靶向分子包括双重靶向(DT)-Ig(GSK/Domantis)、二合一抗体(Genentech)、交联Mabs(Karmanos Cancer Center)、mAb2(F-Star)和CovX体(CovX/Pfizer)。
在一些实施方案中，IgG融合分子包括双重可变结构域(DVD)-Ig(Abbott)、IgG样双特异性抗体(ImClone/Eli Lilly)、Ts2Ab(MedImmune/AZ)和BsAb(Zymogenetics)、HERCULES(Biogen Idec)以及TvAb(Roche)。
在一些实施方案中，Fc融合分子可包括ScFv/Fc融合体(Academic Institution)、SCORPION(Emergent BioSolutions/Trubion,Zymogenetics/BMS)、双亲和性重靶向技术(Fc-DART)(MacroGenics)或双(ScFv)2-Fab(National Research CenterforAntibodyMedicine--China)。
在一些实施方案中，Fab融合双特异性抗体包括F(ab)2(Medarex/AMGEN)、Dual-Action或Bis-Fab(Genentech)、Dock-and-Lock(DNL)(ImmunoMedics)、二价双特异性抗体(Biotecnol)和Fab-Fv(UCB-Celltech)。基于ScFv的、基于双价抗体的结构域抗体包括但不限于双特异性T细胞衔接器(BiTE)(Micromet)、串联双价抗体(Tandab)(Affimed)、双亲和重靶向技术(DART)(MacroGenics)、单链双价抗体(Academic)、TCR样抗体(AIT，ReceptorLogics)、人血清白蛋白ScFv融合体(Merrimack)和COMBODY(Epigen Biotech)、双重靶向纳米抗体(Ablynx)、双重靶向仅重链结构域抗体。
本文所提供的全长双特异性抗体可例如使用两个单特异性二价抗体之间的Fab臂交换(或半分子交换)通过下列方式生成：在每个半分子中的重链CH3交界处引入置换以促成两个在体外无细胞环境中或使用共表达而具有不同特异性的抗体半分子的异源二聚体形成。Fab臂交换反应是二硫键异构化反应和CH3结构域解离-缔合的结果。亲本单特异性抗体的铰链区中的重链二硫键减少。亲本单特异性抗体之一的所得游离半胱氨酸与第二亲本单特异性抗体分子的半胱氨酸残基形成重链间二硫键，同时亲本抗体的CH3结构域通过解离-缔合而释放和重新形成。可以对Fab臂的CH3结构域进行工程改造，以促成异源二聚化而非同源二聚化。所得产物是具有两个Fab臂或半分子的双特异性抗体，这两个Fab臂或半分子各自结合不同的表位。制备多特异性抗体的其他方法是已知的和考虑的。
如本文所用，“同源二聚化”是指具有相同CH3氨基酸序列的两条重链的相互作用。如本文所用，“同源二聚体”是指具有含有相同CH3氨基酸序列的两条重链的抗体。
如本文所用，“异源二聚化”是指具有不同CH3氨基酸序列的两条重链的相互作用。如本文所用，“异源二聚体”是指具有含有不同CH3氨基酸序列的两条重链的抗体。
“杵臼结构”策略(参见例如PCT公布WO2006/028936)可用于生成全长双特异性抗体。简而言之，在人IgG中形成CH3结构域的交界的选定氨基酸可在影响CH3结构域相互作用的位置处突变，从而促进异源二聚体形成。将具有小侧链(杵)的氨基酸引入特异性地结合第一抗原的抗体的重链中，并将具有大侧链(杵)的氨基酸引入特异性地结合第二抗原的抗体的重链中。在两种抗体共表达后，由于具有“臼”的重链与具有“杵”的重链的优先相互作用而形成异源二聚体。形成杵臼结构的示例性CH3置换对(表示为第一重链的第一CH3结构域中的修饰位置/第二重链的第二CH3结构域中的修饰位置)是：T366Y/F405A、T366W/F405W、F405W/Y407A、T394W/Y407T、T394S/Y407A、T366W/T394S、F405W/T394S和T366W/T366S_L368A_Y407V。
还可使用其他策略，诸如通过在一个CH3表面置换带正电荷的残基并在第二CH3表面置换带负电荷的残基使用静电相互作用促进重链异源二聚化，如美国专利公布号US2010/0015133；美国专利公布号US2009/0182127；美国专利公布号US2010/028637；或美国专利公布号US2011/0123532中所述。在其他策略中，可通过下面的置换(表示为第一重链的第一CH3结构域中的修饰位置/第二重链的第二CH3结构域中的修饰位置)促进异源二聚化：L351Y_F405AY407V/T394W、T366I_K392M_T394W/F405A_Y407V、T366L_K392M_T394W/F405A_Y407V、L351Y_Y407A/T366A_K409F、L351Y_Y407A/T366V K409F Y407A/T366A_K409F或T350V_L351Y_F405A Y407V/T350V_T366L_K392L_T394W，如美国专利公布号US2012/0149876或美国专利公布号US2013/0195849中所述。
除上述方法之外，本文所提供的双特异性抗体还可在体外无细胞环境中通过下列方式生成：在两种单特异性同源二聚抗体的CH3区中引入非对称突变，并且在还原条件下由两种亲本单特异性同源二聚抗体形成双特异性异源二聚抗体，从而根据国际专利公布WO2011/131746中所述的方法允许二硫键异构化。在所述方法中，将第一单特异性二价抗体和第二单特异性二价抗体工程化为在CH3结构域处具有促进异源二聚体稳定性的某些置换；将这些抗体在足以使铰链区中的半胱氨酸发生二硫键异构化的还原条件下一起温育；从而通过Fab臂交换生成双特异性抗体。温育条件可以任选地恢复到非还原条件。可使用的示例性还原剂为2-巯基乙胺(2-MEA)、二硫苏糖醇(DTT)、二硫赤藓糖醇(DTE)、谷胱甘肽、三(2-羧乙基)膦(TCEP)、L-半胱氨酸和β-巯基乙醇，优选地为选自由2-巯基乙胺、二硫苏糖醇和三(2-羧乙基)膦组成的组的还原剂。例如，可使用如下条件：在至少25mM 2-MEA的存在下或在至少0.5mM二硫苏糖醇的存在下，在5至8的pH下，例如在7.0的pH下或在7.4的pH下，在至少20℃的温度下，温育至少90分钟。
在一些实施方案中，多特异性抗体是双特异性抗体，其中该双特异性抗体呈两脚台支架构型。在一些实施方案中，多特异性抗体是呈两脚台支架构型的双特异性抗体，其中第一结合结构域是Fab区，并且第二结合结构域是scFv区。在一些实施方案中，第一结合结构域与NK细胞上存在的抗原结合。在一些实施方案中，第一结合结构域与NKG2d结合。在一些实施方案中，第一结合结构域与NKp46结合。在一些实施方案中，第二结合结构域与肿瘤细胞上存在的抗原结合。在一些实施方案中，第二结合结构域结合BCMA。在一些实施方案中，第二结合结构域与GPRC5d结合。
在一些实施方案中，多特异性抗体是双特异性抗体，其中该双特异性抗体呈莫里森支架构型。在一些实施方案中，多特异性抗体是呈莫里森支架构型的双特异性抗体，其中第一结合结构域包含两个Fab区并且第二结合结构域包含两个scFv区。在一些实施方案中，第一结合结构域与NK细胞上存在的抗原结合。在一些实施方案中，第一结合结构域与NKG2d结合。在一些实施方案中，第一结合结构域与NKp46结合。在一些实施方案中，第二结合结构域与肿瘤细胞上存在的抗原结合。在一些实施方案中，第二结合结构域结合BCMA。在一些实施方案中，第二结合结构域与GPRC5d结合。
在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，Fc区包含IgG1沉默突变。在一些实施方案中，Fc区包含AAS突变。在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，Fc区包含用于增强抗体的效应子功能的突变。在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，Fc区包含CDC增强突变。在一些实施方案中，Fc区包含K248E和T437R突变。在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，对该Fc区进行非岩藻糖修饰。
在一些实施方案中，本文提供了与NKG2d特异性结合并且可以调节NK细胞活性的抗体。在一些实施方案中，本文提供了与NKp46特异性结合并且可以调节NK细胞活性的抗体。
在一些实施方案中，本文所述的多特异性抗体使NK细胞活化。在某些实施方案中，本文所述的多特异性抗体将NK细胞接触或引导至靶细胞。在某些实施方案中，本文所述的多特异性抗体将NK细胞接触或引导至靶细胞，其中该多特异性抗体包含与NK细胞上的第一抗原结合的第一结合结构域和与靶细胞上的第二抗原结合的第二结合结构域。在具体的实施方案中，靶细胞是肿瘤细胞。在某些实施方案中，本文所述的多特异性抗体诱导肿瘤细胞的NK细胞依赖性细胞毒性，其中该多特异性抗体包含与NK细胞上的第一抗原结合的第一结合结构域和与靶细胞上的第二抗原结合的第二结合结构域。在具体的实施方案中，NK细胞是人NK细胞。
在一些实施方案中，本文所述的与NKG2d结合的多特异性抗体使NK细胞活化。在某些实施方案中，本文所述的与NKG2d结合的多特异性抗体将NK细胞接触或引导至靶细胞。在某些实施方案中，本文所述的与NKG2d结合的多特异性抗体将NK细胞接触或引导至靶细胞，其中该多特异性抗体包含与NK细胞上的NKG2d结合的第一结合结构域和与靶细胞上的第二抗原结合的第二结合结构域。在具体的实施方案中，靶细胞是肿瘤细胞。在某些实施方案中，本文所述的多特异性抗体诱导肿瘤细胞的NK细胞依赖性细胞毒性，其中该多特异性抗体包含与NK细胞上的NKG2d结合的第一结合结构域和与肿瘤细胞上的第二抗原结合的第二结合结构域。在具体的实施方案中，NK细胞是人NK细胞。
在一些实施方案中，本文所述的与NKp46结合的多特异性抗体使NK细胞活化。在某些实施方案中，本文所述的与NKp46结合的多特异性抗体将NK细胞接触或引导至靶细胞。在某些实施方案中，本文所述的与NKp46结合的多特异性抗体将NK细胞接触或引导至靶细胞，其中该多特异性抗体包含与NK细胞上的NKp46结合的第一结合结构域和与靶细胞上的第二抗原结合的第二结合结构域。在具体的实施方案中，靶细胞是肿瘤细胞。在某些实施方案中，本文所述的多特异性抗体诱导肿瘤细胞的NK细胞依赖性细胞毒性，其中该多特异性抗体包含与NK细胞上的NKp46结合的第一结合结构域和与肿瘤细胞上的第二抗原结合的第二结合结构域。在具体的实施方案中，NK细胞是人NK细胞。
在一些实施方案中，本文所述的多特异性抗体与在表达NKp46的免疫细胞上表达的NKp46结合。在一些实施方案中，表达NKp46的免疫细胞是T细胞。在一些实施方案中，T细胞是γδT细胞。在一些实施方案中，T细胞是先天淋巴细胞的粘膜群体。
在一些实施方案中，本文所述的与NKp46结合的多特异性抗体可使表达NKp46的免疫细胞活化。在某些实施方案中，本文所述的与NKp46结合的多特异性抗体将表达NKp46的免疫细胞接触或引导至靶细胞。在某些实施方案中，本文所述的与NKp46结合的多特异性抗体将表达NKp46的免疫细胞接触或引导至靶细胞，其中该多特异性抗体包含与表达NKp46的免疫细胞上的NKp46结合的第一结合结构域和与靶细胞上的第二抗原结合的第二结合结构域。在具体的实施方案中，靶细胞是肿瘤细胞。在某些实施方案中，本文所述的多特异性抗体诱导肿瘤细胞的表达NKp46的免疫细胞依赖性细胞毒性，其中该多特异性抗体包含与表达NKp46的免疫细胞上的NKp46结合的第一结合结构域和与肿瘤细胞上的第二抗原结合的第二结合结构域。在具体的实施方案中，NK细胞是人NK细胞。
在某些实施方案中，本文所述的多特异性抗体可通过使NK细胞受体和Fc受体两者活化而发挥作用，从而使NK细胞活化。在某些实施方案中，本文所述的多特异性抗体将NK细胞接触或引导至肿瘤细胞。在某些实施方案中，本文所述的多特异性抗体可通过使NK细胞受体和Fc受体两者活化而发挥作用，从而诱导肿瘤细胞的NK细胞依赖性细胞毒性。在某些实施方案中，本文所述的多特异性抗体诱导肿瘤细胞的NK细胞依赖性细胞毒性，即使多特异性抗体的Fc区包含IgG1沉默突变。
在一些实施方案中，本文所述的多特异性抗体可使免疫抑制肿瘤环境中的NK细胞活化。在某些实施方案中，本文所述的多特异性抗体将NK细胞接触或引导至免疫抑制肿瘤环境中的肿瘤细胞。在某些实施方案中，本文所述的多特异性抗体诱导免疫抑制肿瘤环境中的肿瘤细胞的NK细胞依赖性细胞毒性。在某些实施方案中，本文所述的多特异性抗体诱导免疫抑制肿瘤环境中的肿瘤细胞的NK细胞依赖性细胞毒性，即使多特异性抗体的Fc区包含IgG1沉默突变。
在某些实施方案中，本文所述的多特异性抗体不会对NK细胞产生有害影响。在某些实施方案中，本文所述的多特异性抗体缺乏抗NK细胞的细胞毒性。在某些实施方案中，本文所述的具有WT IgG1骨架的多特异性抗体不会导致NK细胞的CDC杀伤。在某些实施方案中，本文所述的具有一组CDC增强突变(例如，K248E/T437R)的多特异性抗体不会导致NK细胞的CDC杀伤。在一些实施方案中，多特异性抗体是NKp46×BCMA双特异性抗体。在一些实施方案中，多特异性抗体是NKG2d×BCMA双特异性抗体。在一些实施方案中，多特异性抗体是NKp46×GPRC5d双特异性抗体。在一些实施方案中，多特异性抗体是NKG2d×GPRC5d双特异性抗体。
在一些实施方案中，本文所述的多特异性抗体诱导NK细胞裂解少于25％。在一些实施方案中，本文所述的多特异性抗体诱导NK细胞裂解少于20％。在一些实施方案中，本文所述的多特异性抗体诱导NK细胞裂解少于15％。在一些实施方案中，本文所述的多特异性抗体诱导NK细胞裂解少于10％。在一些实施方案中，本文所述的多特异性抗体诱导NK细胞裂解少于5％。在一些实施方案中，本文所述的多特异性抗体诱导NK细胞裂解少于3％。在一些实施方案中，本文所述的多特异性抗体诱导NK细胞裂解少于2％。在一些实施方案中，本文所述的多特异性抗体诱导NK细胞裂解少于1％。
在一些实施方案中，本文所述的多特异性抗体使NK细胞活化。在一些实施方案中，本文所述的双特异性抗体使NK细胞活性活化至少约10％。在一些实施方案中，本文所述的双特异性抗体使NK细胞活性活化至少约20％。在一些实施方案中，本文所述的双特异性抗体使NK细胞活性活化至少约30％。在一些实施方案中，本文所述的双特异性抗体使NK细胞活性活化至少约40％。在一些实施方案中，本文所述的双特异性抗体使NK细胞活性活化至少约50％。在一些实施方案中，本文所述的双特异性抗体使NK细胞活性活化至少约60％。在一些实施方案中，本文所述的双特异性抗体使NK细胞活性活化至少约70％。在一些实施方案中，本文所述的双特异性抗体使NK细胞活性活化至少约80％。在一些实施方案中，本文所述的双特异性抗体使NK细胞活性活化至少约90％。在一些实施方案中，本文所述的双特异性抗体使NK细胞活性活化至少约95％。在一些实施方案中，本文所述的双特异性抗体使NK细胞活性活化至少约95％。在某些实施方案中，本文所述的双特异性抗体使NK细胞活性活化至少约15％至约65％。在某些实施方案中，本文所述的双特异性抗体使NK细胞活性活化至少约20％至约65％。在某些实施方案中，本文所述的双特异性抗体使NK细胞活性活化至少约30％至约65％。在具体的实施方案中，NK细胞是人NK细胞。
在一些实施方案中，本文所述的双特异性抗体促进NK细胞的IFNg产生。在一些实施方案中，本文所述的双特异性抗体将NK细胞的IFNg产生促进至少10％。在一些实施方案中，本文所述的双特异性抗体将NK细胞的IFNg产生促进至少20％。在一些实施方案中，本文所述的双特异性抗体将NK细胞的IFNg产生促进至少30％。在一些实施方案中，本文所述的双特异性抗体将NK细胞的IFNg产生促进至少40％。在一些实施方案中，本文所述的双特异性抗体将NK细胞的IFNg产生促进至少50％。在一些实施方案中，本文所述的双特异性抗体将NK细胞的IFNg产生促进至少60％。在一些实施方案中，本文所述的双特异性抗体将NK细胞的IFNg产生促进至少70％。在一些实施方案中，本文所述的双特异性抗体将NK细胞的IFNg产生促进至少80％。在一些实施方案中，本文所述的双特异性抗体将NK细胞的IFNg产生促进至少90％。在一些实施方案中，本文所述的双特异性抗体将NK细胞的IFNg产生促进至少95％。在某些实施方案中，本文所述的双特异性抗体将NK细胞的IFNg产生促进至少约15％至约65％。在某些实施方案中，本文所述的双特异性抗体将NK细胞的IFNg产生促进至少约20％至约65％。在某些实施方案中，本文所述的双特异性抗体将NK细胞的IFNg产生促进至少约30％至约65％。在具体的实施方案中，NK细胞是人NK细胞。
在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，该多特异性抗体将肿瘤细胞的NK细胞依赖性细胞毒性诱导至少10％。在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，该多特异性抗体将肿瘤细胞的NK细胞依赖性细胞毒性诱导至少20％。在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，该多特异性抗体将肿瘤细胞的NK细胞依赖性细胞毒性诱导至少30％。在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，该多特异性抗体将肿瘤细胞的NK细胞依赖性细胞毒性诱导至少40％。在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，该多特异性抗体将肿瘤细胞的NK细胞依赖性细胞毒性诱导至少50％。在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，该多特异性抗体将肿瘤细胞的NK细胞依赖性细胞毒性诱导至少60％。在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，该多特异性抗体将肿瘤细胞的NK细胞依赖性细胞毒性诱导至少70％。在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，该多特异性抗体将肿瘤细胞的NK细胞依赖性细胞毒性诱导至少80％。在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，该多特异性抗体将肿瘤细胞的NK细胞依赖性细胞毒性诱导至少90％。在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，该多特异性抗体将肿瘤细胞的NK细胞依赖性细胞毒性诱导至少95％。在本文提供的多特异性抗体的某些实施方案中，该多特异性抗体将肿瘤细胞的NK细胞依赖性细胞毒性诱导至少约15％至约65％。在本文提供的多特异性抗体的某些实施方案中，该多特异性抗体将肿瘤细胞的NK细胞依赖性细胞毒性诱导至少约20％至约65％。在本文提供的多特异性抗体的某些实施方案中，该多特异性抗体将肿瘤细胞的NK细胞依赖性细胞毒性诱导至少约30％至约65％。
在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，该多特异性抗体在体外以小于约500pM的IC50诱导肿瘤细胞的NK细胞依赖性细胞毒性。在一些实施方案中，该多特异性抗体在体外以小于约300pM的IC50诱导肿瘤细胞的NK细胞依赖性细胞毒性。在一些实施方案中，该多特异性抗体在体外以小于约100pM的IC50诱导肿瘤细胞的NK细胞依赖性细胞毒性。在一些实施方案中，该多特异性抗体在体外以小于约50pM的IC50诱导肿瘤细胞的NK细胞依赖性细胞毒性。在一些实施方案中，该多特异性抗体在体外以小于约20pM的IC50诱导肿瘤细胞的NK细胞依赖性细胞毒性。在一些实施方案中，该多特异性抗体在体外以小于约15pM的IC50诱导肿瘤细胞的NK细胞依赖性细胞毒性。在一些实施方案中，该多特异性抗体在体外以小于约10pM的IC50诱导肿瘤细胞的NK细胞依赖性细胞毒性。
在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，用NK效应细胞和表达该第二抗原的靶细胞的混合物评估该IC50。
在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，该多特异性抗体在体外以小于约2000pM的EC50诱导肿瘤细胞的NK细胞依赖性细胞毒性。在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，该多特异性抗体在体外以小于约1000pM的EC50诱导肿瘤细胞的NK细胞依赖性细胞毒性。在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，该多特异性抗体在体外以小于约500pM的EC50诱导肿瘤细胞的NK细胞依赖性细胞毒性。在一些实施方案中，该多特异性抗体在体外以小于约300pM的EC50诱导肿瘤细胞的NK细胞依赖性细胞毒性。在一些实施方案中，该多特异性抗体在体外以小于约100pM的EC50诱导肿瘤细胞的NK细胞依赖性细胞毒性。在一些实施方案中，该多特异性抗体在体外以小于约50pM的EC50诱导肿瘤细胞的NK细胞依赖性细胞毒性。在一些实施方案中，该多特异性抗体在体外以小于约20pM的EC50诱导肿瘤细胞的NK细胞依赖性细胞毒性。在一些实施方案中，该多特异性抗体在体外以小于约15pM的EC50诱导肿瘤细胞的NK细胞依赖性细胞毒性。在一些实施方案中，该多特异性抗体在体外以小于约10pM的EC50诱导肿瘤细胞的NK细胞依赖性细胞毒性。
在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，用NK效应细胞和表达该第二抗原的靶细胞的混合物评估该EC50。
在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，效应细胞与靶细胞的比率为约0.01:1至约10:1。在本文提供的多特异性抗体的一些实施方案中，效应细胞与靶细胞的比率为约0.01:1至约5:1。在一些实施方案中，效应细胞与靶细胞的比率为约0.1:1至约2:1。在一些实施方案中，效应细胞与靶细胞的比率为约1:1。在某些实施方案中，效应细胞与靶细胞的比率可以例如为0.01:1、0.02:1、0.03:1、0.04:1、0.05:1、0.06:1、0.07:1、0.08:1、0.09:1、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1或10:1。在某些实施方案中，多特异性抗体或其抗原结合片段的浓度为约0.000005ng/mL、约0.00005ng/mL、约0.0005ng/mL、约0.005ng/mL、约0.01ng/mL、约0.02ng/mL、约0.03ng/mL、约0.04ng/mL、约0.05ng/mL、约0.06ng/mL、约0.07ng/mL、约0.08ng/mL、约0.09ng/mL、约0.1ng/mL、约0.5ng/mL、约1.0ng/mL、约10ng/mL、约20ng/mL、约30ng/mL、约40ng/mL、约50ng/mL、约60ng/mL、约70ng/mL、约80ng/mL、约90ng/mL、约100ng/mL或约1000ng/mL。
5.2.3.单克隆抗体
本公开的抗体可以是单克隆抗体或来源于单克隆抗体。可使用首先由Kohler等人，1975，Nature 256:495-97描述的杂交瘤方法来制备单克隆抗体，或者可通过重组DNA方法制备单克隆抗体(参见例如，美国专利4,816,567)。
在杂交瘤方法中，如上所述将小鼠或其他合适的宿主动物诸如仓鼠免疫，以引发产生或能够产生与用于免疫的蛋白质特异性结合的抗体的淋巴细胞。另选地，可在体外将淋巴细胞免疫。免疫后，分离出淋巴细胞，并且然后使用合适的融合剂(诸如聚乙二醇)将淋巴细胞与骨髓瘤细胞系融合以形成杂交瘤细胞(Goding，Monoclonal Antibodies:Principles and Practice 59-103(1986))。
将由此制备的杂交瘤细胞接种并培养在合适的培养基中，在某些实施方案中，该培养基含有抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞(也被称为融合配偶体)的生长或存活的一种或多种物质。例如，如果亲本骨髓瘤细胞缺乏酶次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖基酶(HGPRT或HPRT)，则用于杂交瘤的选择性培养基通常将包含次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(HAT培养基)，其防止缺乏HGPRT的细胞生长。
示例性融合配偶体骨髓瘤细胞是有效地融合、通过所选的抗体生成细胞支持抗体的稳定高水平产生并且对针对未融合亲本细胞进行选择的选择性培养基敏感的那些。示例性骨髓瘤细胞系是鼠骨髓瘤细胞系，诸如SP-2和衍生物，例如可从美国典型培养物保藏中心(Manassas,VA)获得的X63-Ag8-653细胞以及源自可从索尔克研究所细胞配送中心(SanDiego,CA)获得的MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的那些。另外已经描述人骨髓瘤和小鼠-人异质骨髓瘤细胞系用于产生人单克隆抗体(Kozbor，1984，Immunol.133:3001-05；以及Brodeur等人，1987，Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications，51-63)。
测定其中培养杂交瘤细胞以用于产生针对抗原的单克隆抗体的培养基。通过免疫沉淀或通过体外结合测定诸如RIA或ELISA来确定由杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性。可例如通过Munson等人，1980，Anal.Biochem.107:220-39中所述的斯卡查德分析(Scatchard analysis)来确定单克隆抗体的结合亲和力。
一旦鉴定出产生期望的特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞，就可通过有限稀释程序对克隆进行亚克隆，并且通过标准方法培养(Goding，出处同上)。用于此目的的合适的培养基包括例如DMEM或RPMI-1640培养基。此外，例如，通过将细胞腹腔注射到小鼠中，杂交瘤细胞可在体内作为动物的腹水瘤培养。
通过常规抗体纯化程序诸如例如亲和色谱法(例如，使用蛋白A或蛋白G-琼脂糖)或离子交换色谱法、羟基磷灰石色谱法、凝胶电泳、渗析等将由亚克隆分泌的单克隆抗体与培养基、腹水或血清适当地分离。
使用常规程序(例如，通过使用能够与编码鼠抗体的重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)将编码单克隆抗体的DNA容易地分离和测序。杂交瘤细胞可用作此类DNA的来源。在分离之后，可将DNA置于表达载体中，然后将这些表达载体转染到宿主细胞诸如不以另外的方式产生抗体蛋白质的大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞中，以实现单克隆抗体在重组宿主细胞中的合成。有关编码抗体的DNA在细菌中重组表达的综述文章包括Skerra等人，1993，Curr.Opinion in Immunol.5:256-62和Plückthun，1992，Immunol.Revs.130:151-88。
在另一个实施方案中，单克隆抗体或抗体片段可从使用例如Antibody PhageDisplay:Methods and Protocols(O'Brien和Aitken编辑，2002)中所述的技术生成的抗体噬菌体文库中分离。在噬菌体展示方法中，功能性抗体结构域展示在噬菌体颗粒的表面上，这些噬菌体颗粒携带编码功能性抗体结构域的多核苷酸序列。可用于制备本文所述抗体的噬菌体展示方法的示例包括以下中所公开的那些：Brinkman等人，1995，J.Immunol.Methods182:41-50；Ames等人，1995，J.Immunol.Methods 184:177-186；Kettleborough等人，1994，Eur.J.Immunol.24:952-958；Persic等人，1997，Gene 187:9-18；Burton等人，1994，Advances in Immunology 57:191-280；PCT申请PCT/GB91/O1134；国际公布WO 90/02809、WO 91/10737、WO 92/01047、WO 92/18619、WO 93/11236、WO 95/15982、WO 95/20401和WO97/13844；和美国专利5,698,426、5,223,409、5,403,484、5,580,717、5,427,908、5,750,753、5,821,047、5,571,698、5,427,908、5,516,637、5,780,225、5,658,727、5,733,743和5,969,108。
原则上，通过筛选含有噬菌体的噬菌体文库来选择合成的抗体克隆，这些噬菌体展示与噬菌体外壳蛋白融合的抗体可变区(Fv)的各种片段。针对期望的抗原筛选此类噬菌体文库。表达能够与期望抗原结合的Fv片段的克隆被吸附到抗原，并因此与文库中的非结合克隆分离。然后将结合克隆从抗原中洗脱出，并且可通过附加的抗原吸附/洗脱循环将结合克隆进一步富集。
可变结构域可在功能上作为单链Fv(scFv)片段(其中VH和VL通过柔性短肽共价连接)或作为Fab片段(其中它们各自与恒定结构域融合并且非共价地相互作用)展示在噬菌体上，如例如在Winter等人，1994，Ann.Rev.Immunol.12:433-55中所述。
通过PCR将VH和VL基因的组库单独克隆，并且在噬菌体文库中随机重组，然后可搜索抗原结合克隆，如在Winter等人，出处同上中所述。来自免疫源的文库无需构建杂交瘤即可提供针对免疫原的高亲和力抗体。另选地，可克隆原初组库以在无任何免疫的情况下向广泛的非自体抗原以及自体抗原提供单一来源的人抗体，如Griffiths等人，1993，EMBO J12:725-34所述。最后，也可通过克隆来自干细胞的未重排V-基因片段并且使用含有随机序列的PCR引物来合成制备原始文库，用于编码高度可变的CDR3区并在体外完成重排，如例如Hoogenboom和Winter，1992，J.Mol.Biol.227:381-88中所述。
文库的筛选可通过本领域已知的各种技术来实现。例如，NKG2d或NKp46(例如，NKG2d或NKp46多肽、片段或表位)可用于涂覆吸附板的孔，在附连于吸附板的宿主细胞上表达或用于细胞分选，缀合至生物素以用于链霉亲和素包被的小珠捕获，或在任何其他方法中用于平移展示文库。可如Bass等人，1990，Proteins 8:309-14和WO 92/09690中所述通过使用长洗涤和单价噬菌体展示，以及如Marks等人，1992，Biotechnol.10:779-83中所述通过使用低涂布密度的抗原来促进选择具有慢速解离动力学(例如，良好结合亲和力)的抗体。
可通过以下方式获得抗体：设计合适的抗原筛选程序以选择目的噬菌体克隆，然后使用VH和/或VL序列(例如，Fv序列)或来自目的噬菌体克隆的VH和VL序列的各种CDR序列以及Kabat等人，出处同上中所述的合适的恒定区(例如Fc)序列来构建全长抗体克隆。
本文所述的抗体还可例如包括嵌合抗体。嵌合抗体是其中抗体的不同部分来源于不同免疫球蛋白分子的分子。例如，嵌合抗体可含有与人抗体的恒定区融合的小鼠或大鼠单克隆抗体的可变区。用于产生嵌合抗体的方法是本领域已知的。参见例如，Morrison，1985，Science 229:1202；Oi等人，1986，BioTechniques 4:214；Gillies等人，1989，J.Immunol.Methods125:191-202；和美国专利5,807,715、4,816,567、4,816,397和6,331,415。
使用诸如本文所述的那些技术产生的抗体或抗原结合片段可使用众所周知的标准技术分离。例如，可通过常规免疫球蛋白纯化程序诸如例如蛋白A-琼脂糖、羟基磷灰石色谱法、凝胶电泳、透析或亲和色谱法将抗体或抗原结合片段与例如培养基、腹水、血清、细胞溶解物、合成反应材料等适当地分离。如本文所用，“分离的”或“纯化的”抗体基本上不含来自抗体所来源于的细胞或组织源的细胞物质或其他蛋白质，或当化学合成时基本上不含化学前体或其他化学物质。
5.2.4.抗体片段
本公开提供了抗体(例如，多特异性抗体)，其包含与例如NKG2d和NKp46结合的抗体片段。
已经开发了各种技术来产生抗体片段。传统上，这些片段是经由完整抗体的蛋白水解衍生的(参见例如，Morimoto等人，1992，J.Biochem.Biophys.Methods 24:107-17；和Brennan等人，1985，Science229:81-83)。然而，这些片段现在可以直接由重组宿主细胞产生。Fab、Fv和scFv抗体片段全部均可在大肠杆菌或酵母细胞中表达并分泌，从而允许容易地产生大量的这些片段。抗体片段可从上述抗体噬菌体文库中分离。可替代地，Fab'-SH片段可从大肠杆菌直接回收并化学偶联以形成F(ab')2片段(Carter等人，1992，Bio/Technology 10:163-67)。根据另一种方法，F(ab')2片段可直接从重组宿主细胞培养物中分离。具有增加的体内半衰期的包含补救受体结合表位残基的Fab和F(ab')2片段描述于例如美国专利5,869,046。生产抗体片段的其他技术对本领域技术人员来说是显而易见的。在某些实施方案中，抗体是单链Fv片段(scFv)(参见例如，WO 93/16185；美国专利5,571,894和5,587,458)。Fv和scFv具有完整的结合位点，没有恒定区；因此，它们可适于在体内使用期间减少非特异性结合。可构建scFv融合蛋白以在scFv的氨基或羧基末端产生效应蛋白的融合(参见，例如，Borrebaeck编辑，出处同上)。抗体片段也可以是“线性抗体”，例如，如上文引用的参考文献中所述。此类线性抗体可以是单特异性或多特异性的，诸如双特异性的。
较小的抗体衍生的结合结构是单独的可变结构域(V结构域)，也称为单可变结构域抗体(sdAb)。某些类型的生物，羊驼和软骨鱼，具有高亲和力的单个V样结构域，该结构域安装在作为其免疫系统的一部分的Fc等价结构域结构上。(Woolven等人，1999，Immunogenetics 50:98-101；和Streltsov等人，2004，Proc Natl Acad Sci USA.101:12444-49)。V样结构域(在羊驼中称为VhH，在鲨鱼中称为V-NAR)通常显示长表面环，其允许靶抗原的腔穿透。它们还通过掩蔽疏水性表面斑来稳定分离的VH结构域。
这些VhH和V-NAR结构域已经用于工程化sdAb。已经使用从噬菌体文库中选择和产生稳定的、高结合VL和VH衍生的结构域的其他方法设计了人V结构域变体。
本文提供的抗体包括但不限于免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，例如含有与例如NKG2d或NKp46表位结合的抗原结合位点的分子。本文提供的免疫球蛋白分子可以是免疫球蛋白分子的任何类别(例如IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)或任何亚类(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)。在一些实施方案中，抗体是IgG抗体。在一些实施方案中，IgG抗体是IgG1抗体。在一些实施方案中，IgG抗体是IgG2、IgG3或IgG4抗体。
抗体的变体和衍生物包括保留与例如NKG2d或NKp46表位结合的能力的抗体功能片段。示例性功能片段包括Fab片段(例如，含有抗原结合结构域并包含通过二硫键桥接的轻链和部分重链的抗体片段)；Fab'(例如，含有单个抗原结合结构域的抗体片段，该抗原结合结构域包含Fab和通过铰链区的重链的附加部分)；F(ab')2(例如，通过重链的铰链区中的链间二硫键连接的两个Fab'分子；Fab'分子可以针对相同或不同的表位)；双特异性Fab(例如，具有两个抗原结合结构域的Fab分子，其中每个抗原结合结构域可以针对不同的表位)；包含可变区的单链，也称为scFv(例如，通过10个至25个氨基酸的链连接在一起的抗体的单个轻链和重链的可变抗原结合决定区)；二硫键连接的Fv或dsFv(例如，通过二硫键连接在一起的抗体的单个轻链和重链的可变抗原结合决定区)；羊驼VH(例如，抗体的单重链的可变抗原结合决定区，其中VH界面处的一些氨基酸是天然存在的羊驼抗体的重链中发现的那些氨基酸)；双特异性scFv(例如，具有两个抗原结合结构域的scFv或dsFv分子，其中每个抗原结合结构域可以针对不同的表位)；双抗体(例如，当第一scFv的VH结构域与第二scFv的VL结构域组装并且第一scFv的VL结构域与第二scFv的VH结构域组装时形成的二聚化scFv；双抗体的两个抗原结合区可以针对相同或不同的表位)；三抗体(例如，三聚化的scFv，以类似于双抗体的方式形成，但是其中在单个复合物中产生三个抗原结合结构域；三个抗原结合结构域可以针对相同或不同的表位)；和四抗体(例如，四聚化的scFv，以类似于双抗体的方式形成，但是其中在单个复合物中产生四个抗原结合结构域；四个抗原结合结构域可以针对相同或不同的表位)。
在一些实施方案中，多特异性抗体是双特异性抗体。
在一些实施方案中，多特异性抗体是双特异性抗体，其中该双特异性抗体呈两脚台支架构型。在一些实施方案中，多特异性抗体是呈两脚台支架构型的双特异性抗体，其中第一结合结构域是Fab区，并且第二结合结构域是scFv区。
在一些实施方案中，多特异性抗体是双特异性抗体，其中该双特异性抗体呈莫里森支架构型。在一些实施方案中，多特异性抗体是呈莫里森支架构型的双特异性抗体，其中第一结合结构域包含两个Fab区并且第二结合结构域包含两个scFv区。
5.2.5.人源化抗体
本文所述的抗体(例如，多特异性抗体)可以例如包括人源化抗体(例如，去免疫或复合人抗体)。
人源化抗体可包含人框架区和人恒定区序列。例如，人源化抗体可包含人恒定区序列。在某些实施方案中，人源化抗体可选自任何类别的免疫球蛋白，包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE以及任何同种型，包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4(例如，IgG4和IgG4无效体的变体)。在某些实施方案中，人源化抗体可包含κ或λ轻链恒定序列。
人源化抗体可以使用本领域已知的多种技术产生，这些技术包括但不限于CDR移植(欧洲专利EP 239,400；国际公布WO 91/09967；以及美国专利号5,225,539、5,530,101和5,585,089)、镶面或表面重修(欧洲专利EP 592,106和EP 519,596；Padlan，1991，Molecular Immunology28(4/5):489-498；Studnicka等人，1994，Protein Engineering 7(6):805-814；和Roguska等人，1994，PNAS 91:969-973)、链改组(美国专利5,565,332)，以及例如以下参考文献中公开的技术：美国专利6,407,213、美国专利5,766,886、WO 93/17105，Tan等人，J.Immunol.169:111925(2002)，Caldas等人，Protein Eng.13(5):353-60(2000)，Morea等人，Methods 20(3):26779(2000)，Baca等人，J.Biol.Chem.272(16):10678-84(1997)，Roguska等人，Protein Eng.9(10):895904(1996)，Couto等人，CancerRes.55(23增刊)：5973s-5977s(1995)，Couto等人，Cancer Res.55(8):1717-22(1995)，Sandhu JS，Gene 150(2):409-10(1994)，和Pedersen等人，J.Mol.Biol.235(3):959-73(1994)。还可参见美国专利公布号US2005/0042664A1(2005年2月24日)，这些文献中的每一篇全文以引用的方式并入本文。
在一些实施方案中，本文提供的抗体可以是结合NKG2d或NKp46的人源化抗体，包括人、食蟹猕猴、大鼠和小鼠NKG2d或NKp46。例如，本公开的人源化抗体可包含如本文提供的序列表中所示的一个或多个CDR。用于人源化非人抗体的各种方法是本领域已知的。例如，人源化抗体可具有从非人来源引入其中的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常称为“输入”残基，其通常取自“输入”可变结构域。人源化可以例如按照Jones等人，1986，Nature 321:522-25；Riechmann等人，1988，Nature 332:323-27；和Verhoeyen等人，1988，Science 239:1534-36)的方法，通过用高变区序列取代人抗体的对应序列来执行。
在一些情况下，人源化抗体通过CDR移植构建，其中亲本非人(例如，啮齿动物)抗体的六个CDR的氨基酸序列移植到人抗体框架上。例如，Padlan等人确定CDR中仅约三分之一的残基实际上接触抗原，并且将这些残基称为“特异性决定残基”或SDR(Padlan等人，1995，FASEB J.9:133-39)。在SDR接枝技术中，仅SDR残基被接枝到人抗体框架上(参见例如，Kashmiri等人，2005，Methods 36:25-34)。
用于制备人源化抗体的人可变结构域(轻链和重链两者)的选择对于降低抗原性很重要。例如，根据所谓的“最佳拟合”方法，针对已知人可变结构域序列的整个文库筛选非人(例如，啮齿动物)抗体的可变结构域的序列。可选择最接近啮齿动物的人序列作为人源化抗体的人框架(Sims等人，1993，J.Immunol.151:2296-308；和Chothia等人，1987，J.Mol.Biol.196:901-17)。另一种方法使用来源于特定轻链或重链亚组的所有人抗体的共有序列的特定框架。相同的框架可用于几种不同的人源化抗体(Carter等人，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:4285-89；和Presta等人，1993，J.Immunol.151:2623-32)。在一些情况下，框架源自最丰富的人亚类VL6亚组I(VL6I)和VH亚组III(VHIII)的共有序列。在另一种方法中，人类种系基因用作框架区的来源。
在基于CDR的比较的另选范例中，称为超人源化，FR同源性是不相关的。所述方法由非人序列与功能性人种系基因组库的比较组成。然后选择对鼠序列进行编码相同或紧密相关正则结构的那些基因。接着，在与非人抗体共享规范结构的基因中，选择在CDR内具有最高同源性的基因作为FR供体。最后，将非人CDR接枝到这些FR上(参见例如，Tan等人，2002，J.Immunol.169:1119-25)。
通常还期望抗体被人源化，同时保留其对抗原的亲和力和其他有利的生物特性。为了实现这个目标，根据一个方法，人源化抗体使用亲本和人源化序列的三维模型通过亲本序列和各种概念上的人源化产物的分析过程进行制备。三维免疫球蛋白模型通常是可用的并且是为本领域的技术人员所熟悉的。举例说明且显示所选候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序是可用的。这些包括例如WAM(Whitelegg和Rees,2000,ProteinEng.13:819-24)、Modeller(Sali和Blundell,1993,J.Mol.Biol.234:779-815)以及SwissPDB Viewer(Guex和Peitsch,1997,Electrophoresis 18:2714-23)。这些展示的检测使得能分析在候选免疫球蛋白序列的功能发挥中残基的可能作用，例如分析影响候选免疫球蛋白与其抗原结合的能力的残基。以这种方式，可以从受体和输入序列中选择和组合FR残基，从而能实现所需抗体特征，诸如对靶抗原的增加的亲和力。通常，高变区残基直接且基本上大多数涉及影响抗原结合。
用于抗体人源化的另一种方法是基于称为人类链含量(HSC)的抗体人源性的度量。该方法将小鼠序列与人种系基因的组库进行比较，并且差异被评分为HSC。然后通过使其HSC最大化而不是使用全局同一性测量来人源化靶序列，以生成多种不同人源化变体(Lazar等人，2007，Mol.Immunol.44:1986-98)。
除了上述方法之外，经验方法还可以用于生成和选择人源化抗体。这些方法包括基于生成人源化变体的大基因库和使用富集技术或高通量筛选技术选择最佳克隆的方法。抗体变体可从噬菌体、核糖体和酵母展示文库中分离以及通过细菌菌落筛选分离(参见例如，Hoogenboom,2005,Nat.Biotechnol.23:1105-16；Dufner等人，2006，TrendsBiotechnol.24:523-29；Feldhaus等人，2003，Nat.Biotechnol.21:163-70；以及Schlapschy等人，2004，Protein Eng.Des.Sel.17:847-60)。
在FR文库方法中，在FR中的特定位置处引入残基变体的集合，随后筛选文库以选择最佳支持移植CDR的FR。待取代的残基可包括一些或所有被鉴定为可能有助于CDR结构的“Vernier”残基(参见例如，Foote和Winter,1992,J.Mol.Biol.224:487-99)，或通过Baca等人鉴定的更有限的靶残基组(1997,J.Biol.Chem.272:10678-84)。
在FR改组中，将完整FR与非人CDR组合，而不是产生所选残基变体的组合文库(参见例如，Dall’Acqua等人，2005，Methods 36:43-60)。可在两步法：第一步人源化VL，然后人源化VH中筛选用于结合的文库。另选地，可使用一步FR改组方法。已证实这种方法比两步筛选更有效，因为所得抗体表现出改进的生物化学和物理化学性质，包括增强的表达、增加的亲和力和热稳定性(参见例如，Damschroder等人，2007，Mol.Immunol.44:3049-60)。
“人源改造”方法基于实验鉴定必需的最小特异性决定簇(MSD)，并且基于将非人片段顺序替换到人FR文库中并评估结合。其开始于非人VH和VL链的CDR3区，并且将非人抗体的其他区逐渐替换为人FR，包括VH和VL两者的CDR1和CDR2。该方法通常导致表位保留和鉴定具有不同人V-区段CDR的多个亚类的抗体。人源改造允许分离与人种系基因抗体91％-96％同源的抗体(参见例如，Alfenito，Cambridge Healthtech Institute's ThirdAnnualPEGS，The Protein Engineering Summit，2007)。
“人类工程化”方法涉及通过对抗体的氨基酸序列进行特异性改变来改变非人抗体或抗体片段诸如小鼠或嵌合抗体或抗体片段，以便产生在人类中具有降低的免疫原性的修饰抗体，该抗体仍然保留原始非人抗体的所需结合特性。通常，该技术涉及将非人(例如，小鼠)抗体的氨基酸残基分类为“低风险”、“中等风险”或“高风险”残基。使用整体风险/回报计算来执行分类，该整体风险/回报计算评估针对取代将影响所得抗体折叠的风险进行特定取代(例如针对人类中的免疫原性)的预测益处。可通过将来自非人抗体可变区的氨基酸序列与特定或共有人抗体序列的相应区域进行比对来选择在非人(例如，小鼠)抗体序列的给定位置(例如，低或中等风险)处待被取代的特定人氨基酸残基。非人序列中的低或中度风险位置处的氨基酸残基可以根据比对来取代人抗体序列中的对应残基。在Studnicka等人，1994，Protein Engineering 7:805-14；美国专利5,766,886、5,770,196、5,821,123和5,869,619；和PCT公布WO 93/11794中更详细地描述了用于制备人类工程化蛋白的技术。
可以使用例如复合人抗体TM技术(Antitope Ltd.,Cambridge,United Kingdom)产生复合人抗体。为了产生复合人抗体，以避免T细胞表位的方式从多个人抗体可变区序列的片段设计可变区序列，从而使所得抗体的免疫原性最小化。此类抗体可包含人恒定区序列，例如人轻链和/或重链恒定区。
去免疫抗体是其中已经去除T细胞表位的抗体。已经描述了用于制备去免疫抗体的方法。参见例如，Jones等人，Methods Mol Biol.2009；525:405-23，xiv，和De Groot等人，Cell.Immunol.244:148-153(2006))。去免疫抗体包含T细胞表位耗竭的可变区和人恒定区。简而言之，克隆抗体的VH和VL，并且随后通过在T细胞增殖测定中测试来源于抗体的VH和VL的重叠肽来鉴定T细胞表位。经由电子方法鉴定T细胞表位以鉴定与人MHC II类结合的肽。将突变引入VH和VL中以消除与人MHC II类的结合。然后利用突变的VH和VL来生成去免疫抗体。
5.2.6.人抗体
在具体的实施方案中，本文提供的多特异性抗体包含全人抗人抗体或其片段。全人抗体可通过本领域已知的任何方法产生。本文提供的人抗体可通过将选自人来源的噬菌体展示文库的Fv克隆可变结构域序列与已知的人恒定结构域序列组合来构建。另选地，本公开的人单克隆抗体可通过杂交瘤方法制备。已经描述了用于制备人单克隆抗体的人骨髓瘤和鼠-人异源骨髓瘤细胞系，例如由Kozbor，1984，J.Immunol.133:3001-05；Brodeur等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，51-63(1987)；和Boerner等人，1991，J.Immunol.147:86-95。
还可能产生转基因动物(例如，小鼠)，该转基因动物在免疫后能够在不存在内源免疫球蛋白产生的情况下产生人抗体的全部库。表达人抗体库的转基因小鼠已被用于产生针对多种潜在药物靶标的高亲和力人序列单克隆抗体(参见例如，Jakobovits,A.，1995，Curr.Opin.Biotechnol.6(5):561-66；Brüggemann和Taussing，1997，Curr.Opin.Biotechnol.8(4):455-58；美国专利6,075,181和6,150,584；和Lonberg等人，2005，Nature Biotechnol.23:1117-25)。
另选地，人抗体可以经由产生针对靶抗原的抗体的人B淋巴细胞的永生化来制备(例如，此类B淋巴细胞可以从个体中回收或者可以已经被体外免疫)(参见例如，Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy(1985)；Boerner等人，1991，J.Immunol.147(1):86-95；和美国专利5,750,373)。
基因改组也可用于从非人(例如，啮齿动物)抗体衍生人抗体，其中人抗体具有与起始非人抗体类似的亲和力和特异性。根据该方法，其也被称为“表位印记”或“指导选择”，通过如本文所述的噬菌体展示技术获得的非人抗体片段的重链或轻链可变区被人V结构域基因库替换，产生非人链/人链scFv或Fab嵌合体群体。用抗原选择导致非人链/人链嵌合scFv或Fab的分离，其中人链恢复在原代噬菌体展示克隆中去除相应的非人链后破坏的抗原结合位点(例如，表位指导(印记)人链伴侣的选择)。当重复该过程以置换剩余的非人链时，获得人抗体(参见例如，PCT WO 93/06213；和Osbourn等人，2005，Methods 36:61-68)。与通过CDR移植的非人抗体的传统人源化不同，该技术提供完全人抗体，该完全人抗体不具有非人来源的FR或CDR残基。对针对细胞表面抗原的小鼠抗体进行人源化的引导选择的示例包括存在于卵巢癌细胞上的叶酸结合蛋白(参见例如，Figini等人，1998，CancerRes.58:991-96)和在肝细胞癌上高度表达的CD147(参见例如，Bao等人，2005，CancerBiol.Ther.4:1374-80)。
引导选择方法的潜在缺点是一条抗体链的改组同时保持另一条抗体链恒定可能导致表位漂移。为了维持被非人抗体识别的表位，可以应用CDR保留(参见例如，Klimka等人，2000，Br.J.Cancer.83:252-60；和Beiboer等人，2000，J.Mol.Biol.296:833-49)。在该方法中，非人VH CDR3通常被保留，因为该CDR可能位于抗原结合位点的中心，并且可能是抗体用于抗原识别的最重要区域。然而，在一些情况下，非人抗体的VH CDR3和VL CDR3以及VHCDR2、VL CDR2和VL CDR1可被保留。
5.2.7.Fc工程化
可能需要通过Fc工程化修饰本文提供的抗体。在某些实施方案中，对抗体的Fc区的修饰导致抗体的效应子功能的降低或消除。在某些实施方案中，效应子功能是ADCC、ADCP和/或CDC。在一些实施方案中，效应子功能是ADCC。在其他实施方案中，效应子功能是ADCP。在其他实施方案中，效应子功能是CDC。在一个实施方案中，效应子功能是ADCC和ADCP。在一个实施方案中，效应子功能是ADCC和CDC。在一个实施方案中，效应子功能是ADCP和CDC。在一个实施方案中，效应子功能是ADCC、ADCP和CDC。这可以通过在抗体的Fc区中引入一个或多个氨基酸取代来实现。在一些实施方案中，Fc区包含IgG1沉默突变。在一些实施方案中，Fc区包含AAS突变。
在某些实施方案中，对抗体的Fc区的修饰导致抗体的效应子功能的增强。在某些实施方案中，效应子功能是ADCC、ADCP和/或CDC。在一些实施方案中，效应子功能是ADCC。在其他实施方案中，效应子功能是ADCP。在其他实施方案中，效应子功能是CDC。在一个实施方案中，效应子功能是ADCC和ADCP。在一个实施方案中，效应子功能是ADCC和CDC。在一个实施方案中，效应子功能是ADCP和CDC。在一个实施方案中，效应子功能是ADCC、ADCP和CDC。这可以通过在抗体的Fc区中引入一个或多个氨基酸取代来实现。在某些实施方案中，Fc区包含CDC增强突变。在一些实施方案中，Fc区包含K248E和T437R突变。
在本文提供的抗体的某些实施方案中，对该Fc区进行非岩藻糖修饰。
为了延长抗体的血清半衰期，可将补救受体结合表位掺入抗体(尤其是抗体片段)中，例如，如美国专利5,739,277中所述。术语“补救受体结合表位”是指IgG分子(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的Fc区的表位，其负责增加IgG分子的体内血清半衰期。
5.2.8.替代结合剂
本公开包括与本文公开的抗体特异性结合相同表位的非免疫球蛋白结合剂。在一些实施方案中，非免疫球蛋白结合剂被鉴定为在竞争性结合测定中置换本公开的抗体或被本公开的抗体置换的试剂。这些替代结合剂可包括例如本领域已知的任何工程化蛋白质支架。此类支架包括例如基于脂质运载蛋白支架的抗运载蛋白，脂质运载蛋白支架是一种蛋白质结构，其特征在于支持形成配体结合位点的四个高变环的刚性β-桶。新的结合特异性可通过环区中的靶向随机诱变并结合功能展示和指导选择来工程化(参见，例如，Skerra，2008，FEBS J.，第275卷：第2677-2683页)。其他合适的支架可包括，例如，基于人纤连蛋白III的第十个胞外结构域的adnectin或单体(参见，例如，Koide和Koide，2007，MethodsMol.Biol.第352卷：第95-109页)；基于葡萄球菌蛋白A的Z结构域的亲和体(参见，例如，Nygren等人，2008，FEBS J.，第275卷：第2668-2676页)；基于锚蛋白重复蛋白的DARPin(参见，例如，Stumpp等人，2008，Drug.Discov.Today，第13卷：第695-701页)；基于人Fyn蛋白激酶的SH3结构域的fynomer(参见，例如，Grabulovski等人，2007，J.Biol.Chem.第282卷：第3196-3204页)；基于来自嗜酸硫化叶菌(Sulfolobus acidolarius)的Sac7d的affitin(参见，例如，Krehenbrink等人，2008，J.Mol.Biol.第383卷：第1058-1068页)；基于人y-B-晶状体蛋白的affilin(参见，例如，Ebersbach等人，2007，J.Mol.Biol.第372卷：第172-185页)；基于膜受体蛋白的A结构域的高亲和性多聚体(参见，例如，Silverman等人，2005，Biotechnol.第23卷：第1556-1561页)；富含半胱氨酸的打结素肽(参见，例如，Kolmar，2008，FEBS J.，第275卷：第2684-2690页)；和工程化的Kunitz型抑制剂(参见，例如，Nixon和Wood，2006，Curr.Opin.Drug.Discov.Dev.第9卷：第261-268页)。有关综述，参见例如，Gebauer和Skerra，2009，Curr.Opin.Chem.Biol.13:245-55。
5.2.9.抗体变体
在一些实施方案中，考虑了本文提供的与例如NKG2d、NKp46结合的抗体或抗原结合片段的氨基酸序列修饰。例如，可能期望改善抗体的结合亲和力和/或其他生物特性，包括但不限于特异性、热稳定性、表达水平、效应子功能、糖基化、降低的免疫原性或溶解度。因此，除本文所述的抗体之外，预期可制备抗体变体。例如，可通过将适当的核苷酸变化引入编码DNA和/或通过合成期望的抗体或多肽来制备抗体变体。本领域技术人员将理解，氨基酸变化可改变抗体的翻译后过程，诸如改变糖基化位点的数量或位置或改变膜锚固特征。
在一些实施方案中，本文提供的抗体例如通过将任何类型的分子共价连接至抗体而被化学修饰。抗体衍生物可包括已经例如通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过已知保护/封闭基团的衍生化、蛋白水解裂解、与细胞配体或其他蛋白质的连接等被化学修饰的抗体。许多化学修饰中的任一种化学修饰可通过已知技术进行，这些技术包括但不限于特异性化学裂解、乙酰化、配制、衣霉素的代谢合成等。另外，抗体可含有一种或多种非典型氨基酸。
变体可以是编码抗体或多肽的一个或多个密码子的取代、缺失或插入，这导致氨基酸序列与天然序列抗体或多肽相比发生变化。氨基酸取代可以是用具有类似结构和/或化学特性的一个氨基酸替换另一个氨基酸的结果，诸如用丝氨酸替换亮氨酸，例如，保守氨基酸替换。本领域技术人员已知的标准技术可用于在编码本文提供的分子的核苷酸序列中引入突变，包括例如导致氨基酸取代的定点诱变和PCR介导的诱变。插入或缺失可任选地在约1至5个氨基酸的范围内。在某些实施方案中，取代、缺失或插入包括相对于原始分子少于25个氨基酸取代、少于20个氨基酸取代、少于15个氨基酸取代、少于10个氨基酸取代、少于5个氨基酸取代、少于4个氨基酸取代、少于3个氨基酸取代或少于2个氨基酸取代。在一个具体的实施方案中，取代是在一个或多个预测的非必需氨基酸残基处进行的保守氨基酸取代。所允许的变体可通过系统地对序列中的氨基酸进行插入、缺失或取代并针对全长或成熟天然序列所表现出的活性测试所得变体来确定。
氨基酸序列插入包括长度范围从一个残基到含有一百个或更多个残基的多肽的氨基和/或羧基末端融合物，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的示例包括具有N-末端甲硫氨酰残基的抗体。抗体分子的其他插入变体包括抗体的N-末端或C-末端与酶(例如，对于抗体导向的酶前药疗法来说)或多肽的融合物，这延长了抗体的血清半衰期。
“保守氨基酸取代”是其中氨基酸残基被具有带类似电荷的侧链的氨基酸残基替换的取代。本领域已经定义了具有带类似电荷的侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-支链侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。另选地，突变可沿编码序列的全部或部分诸如通过饱和诱变随机引入，并且可筛选所得突变体的生物活性以鉴定保留活性的突变体。在诱变后，可表达所编码的蛋白质，并且可确定蛋白质的活性。
抗体的生物特性中的基本修饰是通过选择取代而实现的，这些取代对维持(a)多肽主链在取代区域中的结构，例如，作为折叠或螺旋构象；(b)分子在靶位点处的电荷或疏水性；或(c)侧链的本体的效果显著不同。另选地，(例如，在具有相似特性和/或侧链的氨基酸基团内)可进行保守取代，以便维持或不显著改变特性。氨基酸可根据其侧链特性的相似性来分组(参见例如，Lehninger，Biochemistry 73-75(第2版1975))：(1)非极性：Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M)；(2)不带电荷极性：Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q)；(3)酸性：Asp(D)、Glu(E)；和(4)碱性：Lys(K)、Arg(R)、His(H)。
另选地，天然存在的残基可基于常见的侧链特性分成几组：(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性亲水：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性：Asp、Glu；(4)碱性：His、Lys、Arg；(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；和(6)芳族：Trp、Tyr、Phe。
非保守取代需要将这些类别中的一个类别的成员交换为另一类别。也可将此类经取代的残基引入保守取代位点或引入剩余(非保守)位点。因此，在一个实施方案中，与NKG2d表位结合的抗体或其抗原结合片段包含与本文所述抗体的氨基酸序列至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同的氨基酸序列。因此，在一个实施方案中，与NKp46表位结合的抗体或其抗原结合片段包含与本文所述抗体的氨基酸序列至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同的氨基酸序列。
可使用本领域已知的方法进行变化，诸如寡核苷酸介导的(定点)诱变、丙氨酸扫描和PCR诱变。定点诱变(参见例如，Carter，1986，Biochem J.237:1-7；和Zoller等人，1982，Nucl.Acids Res.10:6487-500)、盒式诱变(参见，例如，Wells等人，1985，Gene 34:315-23)或其他已知技术可以对克隆的DNA执行以产生抗NKG2d或抗NKp46抗体变体DNA。
任何不参与维持本文提供的抗体正确构象的半胱氨酸残基也可例如用另一氨基酸诸如丙氨酸或丝氨酸取代，以提高分子的氧化稳定性并防止异常交联。相反地，可将半胱氨酸键加入抗体中以改善其稳定性(例如，当抗体是抗体片段诸如Fv片段时)。
在一些实施方案中，本公开的抗体分子是“去免疫”抗体。“去免疫”抗体是衍生自人源化抗体或嵌合抗体的抗体，与相应的原始未去免疫抗体相比，该“去免疫”抗体在其氨基酸序列中具有一个或多个改变，这些改变导致该抗体的免疫原性降低。产生此类抗体突变体的方法之一包括鉴定和去除抗体分子的T细胞表位。在第一步中，可以通过几种方法测定抗体分子的免疫原性，例如，通过本领域已知的体外测定T细胞表位或计算机预测此类表位。一旦鉴定了T细胞表位功能的关键残基，可进行突变以去除免疫原性并保留抗体活性。有关综述，参见例如，Jones等人，2009，Methods in Molecular Biology 525:405-23。
5.2.10.体外亲和力成熟
在一些实施方案中，与亲本抗体相比具有改善的特性(诸如亲和力、稳定性或表达水平)的抗体变体可通过体外亲和力成熟来制备。与天然原型一样，体外亲和力成熟基于突变和选择的原理。抗体文库展示在生物体(例如，噬菌体、细菌、酵母或哺乳动物细胞)的表面上或与其编码mRNA或DNA缔合(例如，共价或非共价)。对所展示的抗体的亲和力选择允许分离携带编码抗体的遗传信息的生物体或复合物。使用展示方法诸如噬菌体展示进行的两轮或三轮突变和选择通常产生具有低纳摩尔范围内的亲和力的抗体片段。亲和力成熟的抗体可对靶抗原具有纳摩尔或甚至皮摩尔的亲和力。
噬菌体展示是用于展示和选择抗体的普遍方法。抗体展示在Fd或M13噬菌体的表面上，作为与噬菌体外壳蛋白的融合物。选择涉及暴露于抗原以允许噬菌体展示的抗体结合其靶标，该过程被称为“淘选”。回收与抗原结合的噬菌体，并用于感染细菌以产生用于进一步轮次选择的噬菌体。有关综述，参见例如，Hoogenboom,2002,Methods.Mol.Biol.178:1-37；以及Bradbury和Marks，2004，J.Immunol.Methods 290:29-49。
在酵母展示系统中(参见例如，Boder等人，1997，Nat.Biotech.15:553-57；和Chao等人，2006，Nat.Protocols 1:755-68)，抗体可与酵母凝集素蛋白Aga2p的粘附亚基(其通过与Aga1p结合的二硫键附接到酵母细胞壁)融合。经由Aga2p展示蛋白质使蛋白质从细胞表面突出，从而使与酵母细胞壁上其他分子的潜在相互作用最小化。使用磁分离和流式细胞术筛选文库以选择具有改善的亲和力或稳定性的抗体。通过用生物素酰化抗原和与荧光团缀合的第二试剂诸如链霉亲和素标记酵母来测定与可溶性目的抗原的结合。抗体表面表达的变体可通过免疫荧光标记侧接scFv的血凝素或c-Myc表位标签来测量。已显示表达与所展示的蛋白质的稳定性相关，并且因此可选择稳定性和亲和力改善的抗体(参见例如，Shusta等人，1999，J.Mol.Biol.292:949-56)。酵母展示的另一个优点是，利用内质网伴侣和质控机制，将所展示的蛋白质在真核酵母细胞的内质网中折叠。一旦成熟完成，抗体亲和力就可方便地“滴定”，同时在酵母表面上展示，从而消除了对每个克隆的表达和纯化的需要。酵母表面展示的理论限制是功能性文库的大小可能比其他展示方法的小；然而，最近的方法使用酵母细胞的交配系统来产生大小估计为1014的组合多样性(参见例如，美国专利公布2003/0186374；和Blaise等人，2004，Gene 342:211-18)。
在核糖体展示中，生成抗体-核糖体-mRNA(ARM)复合物用于在无细胞系统中进行选择。编码特定抗体文库的DNA文库与缺乏终止密码子的间隔序列基因融合。当翻译时，该间隔序列仍附接到肽基tRNA并且占据核糖体通道，并且因此允许目的蛋白质从核糖体突出并折叠。所得的mRNA、核糖体和蛋白质的复合物可与表面结合的配体结合，从而允许通过与配体的亲和力捕获同时分离抗体及其编码mRNA。然后将核糖体结合的mRNA逆转录回cDNA，然后可进行诱变并用于下一轮选择(参见例如，Fukuda等人，2006，Nucleic Acids Res.34:e127)。在mRNA展示中，使用嘌呤霉素作为衔接分子在抗体与mRNA之间建立共价键(Wilson等人，2001，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98:3750-55)。
由于这些方法完全在体外进行，它们提供了两个优于其他选择技术的主要优点。首先，文库的多样性不受细菌细胞转化效率的限制，而仅测试管中存在的核糖体和不同mRNA分子的数目的限制。其次，在每个选择轮次后，可容易地引入随机突变，例如，通过非校正聚合酶，因为在任何多样化步骤后不必转化文库。
在一些实施方案中，可使用哺乳动物展示系统。
多样性也可以靶向方式或通过随机引入而引入抗体文库的CDR中。前一种方法包括通过高或低水平的诱变顺序靶向抗体的所有CDR或靶向体细胞超突变的分离热点(参见例如，Ho等人，2005，J.Biol.Chem.280:607-17)或基于实验基础或结构原因怀疑影响亲和力的残基。多样性也可通过替换天然多样的区域，经由DNA改组或类似技术引入(参见例如，Lu等人，2003，J.Biol.Chem.278:43496-507；美国专利5,565,332和6,989,250)。另选的技术靶向延伸到框架区残基中的高变环(参见例如，Bond等人，2005，J.Mol.Biol.348:699-709)，采用CDR中的环缺失和插入或使用基于杂交的多样化(参见例如，美国专利公布2004/0005709)。生成CDR多样性的附加的方法公开于例如美国专利7,985,840中。可用于生成抗体文库和/或抗体亲和力成熟的其他方法公开于例如美国专利8,685,897和8,603,930以及美国公布2014/0170705、2014/0094392、2012/0028301、2011/0183855和2009/0075378中，这些文献中的每一篇以引用的方式并入本文。
文库的筛选可通过本领域已知的各种技术来实现。例如，抗体可被固定化到固体支持物、柱、针或纤维素/聚(偏二氟乙烯)膜/其他过滤器上，在附连到吸附板或用于细胞分选的宿主细胞上表达，或缀合到生物素以用链霉亲和素包被的珠捕获或用于淘选展示文库的任何其他方法。
关于体外亲和力成熟方法的综述，参见例如，Hoogenboom,2005,NatureBiotechnology 23:1105-16；Quiroz和Sinclair,2010,Revista Ingeneria Biomedia4:39-51；以及其中的参考文献。
5.2.11.抗体修饰
本文提供的与例如NKG2d和NKp46结合的抗体的共价修饰包括在本公开的范围内。共价修饰包括使抗体的靶向氨基酸残基与有机衍生化试剂反应，该有机衍生化试剂能够与抗体的所选择的侧链或N-或C-末端残基反应。其他修饰包括谷氨酰胺酰基和天冬酰胺酰基残基分别脱酰胺成对应的谷氨酰基和天冬氨酰基残基，脯氨酸和赖氨酸的羟基化，丝氨酰或苏氨酰残基的羟基磷酸化，赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的α-氨基的甲基化(参见例如，Creighton，Proteins:Structure and Molecular Properties 79-86(1983))，N-末端胺的乙酰化，以及任何C-末端羧基的酰胺化。
包括在本公开内容范围内的本文提供的抗体的其他类型的共价修饰包括改变抗体或多肽的天然糖基化模式(参见例如，Beck等人，2008，Curr.Pharm.Biotechnol.9:482-501；和Walsh，2010，Drug Discov.Today15:773-80)，并以例如美国专利4,640,835、4,496,689、4,301,144、4,670,417、4,791,192或4,179,337中所述的方式将抗体连接到多种非蛋白质聚合物(例如，聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇或聚氧化烯)中的一者。
本公开的抗体还可以被修饰以形成嵌合分子，该嵌合分子包含与另一种异源多肽或氨基酸序列融合的抗体，该另一种异源多肽或氨基酸序列例如是表位标签(参见例如，Terpe，2003，Appl.Microbiol.Biotechnol.60:523-33)或IgG分子的Fc区(参见例如，Aruffo，Antibody Fusion Proteins 221-42(Chamow和Ashkenazi编辑，1999))。
本文还提供了包含与例如NKG2d、NKp46结合的本文提供的抗体和异源多肽的融合蛋白。
本文还提供了与NKG2d、NKp46抗原结合的抗体面板。在具体的实施方案中，抗体面板具有不同的缔合速率、不同的解离速率、对NKG2d、NKp46抗原的不同亲和力和/或对NKG2d、NKp46抗原的不同特异性。在一些实施方案中，该面板包括以下或由以下组成：约10、约25、约50、约75、约100、约125、约150、约175、约200、约250、约300、约350、约400、约450、约500、约550、约600、约650、约700、约750、约800、约850、约900、约950或约1000个抗体或更多。抗体面板可用于例如96孔或384孔板中，用于测定诸如ELISA。
5.2.12.免疫缀合物
本公开还提供了包含通过合成接头与一种或多种非抗体试剂共价结合的本公开的抗体中的任一种抗体的缀合物。
在一些实施方案中，本文提供的抗体例如与治疗剂(例如，细胞毒性剂)或诊断或可检测分子缀合或重组融合。缀合的或重组融合的抗体可用于例如治疗或预防疾病或病症。缀合的或重组融合的抗体可用于例如监测或预后疾病或病症的发作、发展、进展和/或严重程度。
此类诊断和检测可例如通过将抗体偶联到可检测物质上来实现，该可检测物质包括但不限于各种酶，诸如但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；辅基，诸如但不限于链霉亲和素/生物素或亲和素/生物素；荧光材料，诸如但不限于伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基氨基荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料，诸如但不限于鲁米诺；生物发光材料，诸如但不限于荧光素酶、虫荧光素或水母发光蛋白；化学发光材料，诸如但不限于基于吖啶酯的化合物或HALOTAG；放射性材料，诸如但不限于碘(131I、125I、123I和121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、铟(115In、113In、112In和111In)、锝(99Tc)、铊(201Ti)、镓(68Ga和67Ga)、钯(103Pd)、钼(99Mo)、氙(133Xe)、氟(18F)、153Sm、177Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、186Re、188Re、142Pr、105Rh、97Ru、68Ge、57Co、65Zn、85Sr、32P、153Gd、169Yb、51Cr、54Mn、75Se、113Sn或117Sn；使用各种正电子发射断层显像的正电子发射金属；和非放射性顺磁性金属离子。
本文还提供了重组融合或化学缀合(共价或非共价缀合)至异源蛋白质或多肽(或其片段，例如，至约10个、约20个、约30个、约40个、约50个、约60个、约70个、约80个、约90个或约100个氨基酸的多肽)以生成融合蛋白的抗体，以及其用途。具体地，本文提供了包含本文提供的抗体的抗原结合片段(例如，CDR1、CDR2和/或CDR3)和异源蛋白质、多肽或肽的融合蛋白。在一个实施方案中，与抗体融合的异源蛋白质、多肽或肽可用于将抗体靶向至特定细胞类型。
此外，本文提供的抗体可与标记物或“标签”序列(诸如肽)融合，以促进纯化。在具体的实施方案中，标记物或标签氨基酸序列是六聚组氨酸肽，诸如在pQE载体中提供的标签(参见例如，QIAGEN,Inc.)等，其中许多是可商购获得的。例如，如Gentz等人，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:821-24中所述，六聚组氨酸提供了便利的融合蛋白纯化。用于纯化的其他肽标签包括但不限于血凝素(“HA”)标签，其对应于衍生自流感血凝素蛋白的表位(Wilson等人，1984，Cell 37:767-78)和“FLAG”标签。
用于将部分(包括多肽)融合或缀合至抗体的方法是已知的(参见例如，Arnon等人，Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs in Cancer Therapy，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy 243-56(Reisfeld等人编辑，1985)；Hellstrom等人，Antibodies for Drug Delivery，in Controlled Drug Delivery 623-53(Robinson等人编辑，第2版1987)；Thorpe,Antibody Carriers ofCytotoxic Agents inCancer Therapy:A Review，Monoclonal Antibodies:Biological and ClinicalApplications 475-506(Pinchera等人编辑，1985)；Analysis,Results,and FutureProspective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody in CancerTherapy，Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy 303-16(Baldwin等人编辑，1985)；Thorpe等人，1982，Immunol.Rev.62:119-58；美国专利5,336,603；5,622,929；5,359,046；5,349,053；5,447,851；5,723,125；5,783,181；5,908,626；5,844,095；和5,112,946；EP 307,434；EP 367,166；EP 394,827；PCT公布WO 91/06570、WO 96/04388、WO96/22024、WO 97/34631和WO 99/04813；Ashkenazi等人，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88:10535-39；Traunecker等人，1988，Nature，331:84-86；Zheng等人，1995，J.Immunol.154:5590-600；以及Vil等人，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:11337-41)。
融合蛋白可例如通过基因改组、基序改组、外显子改组和/或密码子改组(统称为“DNA改组”)的技术来生成。DNA改组可用于改变如本文所提供的抗体的活性，包括例如具有较高亲和力和较低解离速率的抗体(参见例如，美国专利5,605,793；5,811,238；5,830,721；5,834,252；和5,837,458；Patten等人，1997，Curr.Opinion Biotechnol.8:724-33；Harayama，1998，Trends Biotechnol.16(2):76-82；Hansson等人，1999，J.Mol.Biol.287:265-76；以及Lorenzo和Blasco，1998，Biotechniques24(2):308-13)。可在重组之前通过易错PCR、随机核苷酸插入或其他方法进行随机诱变来改变抗体或编码的抗体。编码本文提供的抗体的多核苷酸可与一种或多种异源分子的一种或多种组分、基序、区段、部分、结构域、片段等重组。
本文提供的抗体也可与第二抗体缀合以形成抗体异缀合物，如例如美国专利4,676,980中所述。
如本文所提供的抗体也可附接到固体支持物上，这对于靶抗原的免疫测定或纯化特别有用。此类固体支持物包括但不限于玻璃、纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。
接头可以是促进缀合剂在细胞中释放的“可切割接头”，但本文还考虑了不可切割的接头。用于本公开的缀合物的接头包括但不限于设计用于逃避多药物转运蛋白介导的抗性的酸不稳定性接头(例如，腙接头)、含二硫化物接头、肽酶敏感性接头(例如，包含氨基酸例如缬氨酸和/或瓜氨酸诸如瓜氨酸-缬氨酸或苯丙氨酸-赖氨酸的肽接头)、光不稳定性接头、二甲基接头(参见例如，Chari等人，1992，Cancer Res.52:127-31；和美国专利5,208,020)、硫醚接头或亲水性接头(参见例如，Kovtun等人，2010，CancerRes.70:2528-37)。
抗体和试剂的缀合物可使用多种双功能性蛋白质偶联剂诸如BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC、磺基-SMPB和SVSB(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯砜)苯甲酸酯)来制备。本公开还考虑了抗体和试剂的缀合物可使用如本领域公开的任何合适的方法来制备(参见例如，Bioconjugate Techniques(Hermanson编辑，第2版，2008))。
抗体和试剂的常规缀合策略已基于随机缀合化学，涉及Lys残基的ε-氨基基团或Cys残基的硫醇基团，这导致异质缀合物。最近开发的技术允许与抗体的位点特异性缀合，从而导致均匀的加载并避免具有改变的抗原结合或药代动力学的缀合物亚群。在重链和轻链上的位置处包含半胱氨酸取代的“thiomab”工程包括在内，其提供反应性硫醇基团并且不破坏免疫球蛋白折叠和组装或改变抗原结合(参见例如，Junutula等人，2008，J.Immunol.Meth.332:41-52；和Junutula等人，2008，Nature Biotechnol.26:925-32)。在另一种方法中，通过重新编码终止密码子UGA 从终止到硒代半胱氨酸插入，将硒代半胱氨酸共翻译插入抗体序列中，从而在存在其他天然氨基酸的情况下，在硒代半胱氨酸的亲核硒醇基团处允许位点特异性共价缀合(参见例如，Hofer等人，2008，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 105:12451-56；和Hofer等人，2009，Biochemistry 48(50):12047-57)。
5.3.多核苷酸
在某些实施方案中，本公开涵盖编码本文所述抗体的多核苷酸。术语“编码多肽的多核苷酸”涵盖仅包含多肽的编码序列的多核苷酸以及包含附加的编码和/或非编码序列的多核苷酸。本公开的多核苷酸可以是RNA形式或DNA形式。DNA包括cDNA、基因组DNA和合成DNA；并且可以是双链或单链的，并且如果是单链，可以是编码链或非编码(反义)链。
在某些实施方案中，多核苷酸包含与有助于例如多肽从宿主细胞表达和分泌的多核苷酸在同一阅读框中融合的多肽的编码序列(例如，前导序列，其充当用于控制多肽的转运的分泌序列)。多肽可具有被宿主细胞裂解以形成多肽的“成熟”形式的前导序列。
在某些实施方案中，多核苷酸包含与标记或标签序列在同一阅读框中融合的多肽的编码序列。例如，在一些实施方案中，标记序列是由载体提供的六组氨酸标签，其允许在细菌宿主的情况下有效纯化与标记物融合的多肽。在一些实施方案中，标记物与其他亲和标签一起使用。
本公开还涉及本文所述的多核苷酸的变体，其中该变体编码例如多肽的片段、类似物和/或衍生物。在某些实施方案中，本公开提供了一种多核苷酸，其包括具有与编码包含本文所述抗体或抗原结合片段的多肽的多核苷酸至少约80％相同、至少约85％相同、至少约90％相同、至少约95％相同，并且在一些实施方案中至少约96％、97％、98％或99％相同的核苷酸序列的多核苷酸。
如本文所用，短语“具有与参考核苷酸序列至少例如95％“相同”的核苷酸序列的多核苷酸”旨在意指该多核苷酸的核苷酸序列与参考序列相同，不同的是该多核苷酸序列可包括参考核苷酸序列的每100个核苷酸至多五个点突变。换句话讲，为了获得具有与参考核苷酸序列至少95％相同的核苷酸序列的多核苷酸，参考序列中至多5％的核苷酸可缺失或被另一核苷酸取代，或者可将参考序列中总核苷酸的至多5％的核苷酸数目插入参考序列中。参考序列的这些突变可发生在参考核苷酸序列的5'或3'末端位置或那些末端位置之间的任何位置，或者单独散布在参考序列的核苷酸中，或者散布在参考序列内的一个或多个连续组中。
多核苷酸变体可在编码区、非编码区或两者中含有改变。在一些实施方案中，多核苷酸变体含有产生沉默取代、添加或缺失但不改变所编码的多肽的特性或活性的改变。在一些实施方案中，多核苷酸变体包含沉默取代，其不导致多肽的氨基酸序列的改变(由于遗传密码的简并性)。多核苷酸变体可出于各种原因产生，例如，为了优化特定宿主的密码子表达(即，将人mRNA中的密码子改变为细菌宿主诸如大肠杆菌(E.coli)的优选密码子)。在一些实施方案中，多核苷酸变体在序列的非编码区或编码区中包含至少一个沉默突变。
在一些实施方案中，产生多核苷酸变体以调节或改变所编码的多肽的表达(或表达水平)。在一些实施方案中，产生多核苷酸变体以增加所编码的多肽的表达。在一些实施方案中，产生多核苷酸变体以降低所编码的多肽的表达。在一些实施方案中，多核苷酸变体与亲本多核苷酸序列相比具有增加的所编码的多肽的表达。在一些实施方案中，多核苷酸变体与亲本多核苷酸序列相比具有降低的所编码的多肽的表达。
在某些实施方案中，本公开提供了一种多核苷酸，其包含与本文提供的序列表中列出的多核苷酸至少约80％相同、至少约85％相同、至少约90％相同、至少约95％相同，并且在一些实施方案中至少约96％、97％、98％或99％相同的核苷酸序列。
在某些实施方案中，本公开提供了一种多核苷酸，其包含与选自本文提供的多核苷酸的多核苷酸至少约80％相同、至少约85％相同、至少约90％相同、至少约95％相同，并且在一些实施方案中至少约96％、97％、98％或99％相同的核苷酸序列。
在某些实施方案中，多核苷酸是分离的。在某些实施方案中，多核苷酸是基本上纯的。
还提供了包含本文所述的多核苷酸的载体和细胞。在一些实施方案中，表达载体包含多核苷酸分子。在一些实施方案中，宿主细胞包含表达载体，该表达载体包含多核苷酸分子。在一些实施方案中，宿主细胞包含一种或多种包含多核苷酸分子的表达载体。在一些实施方案中，宿主细胞包含多核苷酸分子。在一些实施方案中，宿主细胞包含一种或多种多核苷酸分子。
5.4.制备抗体的方法(“methods”或“processes”)
在又一方面，本文提供了用于制备本文提供的各种分子的方法(“methods”或“processes”)。在一些实施方案中，本文提供了一种用于制备与多于一个靶分子结合的分子的方法，该方法包括：用于执行获得能够与NK细胞的表面上的第一抗原结合的结合结构域的功能的步骤；用于执行获得能够与第二抗原结合的结合结构域的功能的步骤；以及用于执行提供能够与所述第一抗原和所述第二抗原结合的分子的功能的步骤。
本文提供的抗体的重组表达需要构建含有编码抗体或其抗原结合片段的多核苷酸的表达载体。一旦已经获得编码本文提供的抗体分子、抗体的重链或轻链或其片段(诸如但不一定含有重链和/或轻链可变结构域)的多核苷酸，就可以使用本领域熟知的技术通过重组DNA技术生产用于生产抗体分子的载体。因此，本文描述了通过表达含有抗体编码核苷酸序列的多核苷酸来制备蛋白质的方法。本领域技术人员众所周知的方法可用于构建含有抗体编码序列和适当转录和翻译控制信号的表达载体。这些方法包括例如体外重组DNA技术、合成技术和体内遗传重组。还提供了可复制载体，该可复制载体包含可操作地连接到启动子的编码本文提供的抗体分子、抗体的重链或轻链、抗体或其片段的重链或轻链可变结构域、或重链或轻链CDR的核苷酸序列。此类载体可包括编码抗体分子的恒定区的核苷酸序列(参见例如，国际公布WO 86/05807和WO 89/01036；和美国专利5,122,464)，并且可将抗体的可变结构域克隆到此类载体中以表达整个重链、整个轻链或整个重链和轻链两者。
通过常规技术将表达载体转移到宿主细胞中，然后通过常规技术培养经转染的细胞以产生本文提供的抗体。因此，本文还提供了含有可操作地连接到异源启动子的编码本文提供的抗体或其片段、或其重链或轻链、或其片段、或本文提供的单链抗体的多核苷酸的宿主细胞。在用于表达双链抗体的某些实施方案中，编码重链和轻链两者的载体可在宿主细胞中共表达以表达整个免疫球蛋白分子，如下所详述。
可利用多种宿主表达载体系统来表达本文提供的抗体分子(参见例如，美国专利5,807,715)。此类宿主表达系统代表了可产生并随后纯化目的编码序列的媒介物，而且也代表了在经适当的核苷酸编码序列转化或转染时可原位表达本文提供的抗体分子的细胞。这些包括但不限于用含有抗体编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的微生物诸如细菌(例如，大肠杆菌(E.coli)和枯草芽孢杆菌(B.subtilis))；用含有抗体编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母(例如，毕赤酵母(Saccharomyces Pichia)；用含有抗体编码序列的重组病毒表达载体(例如，杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用含有抗体编码序列的重组病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒、CaMV、烟草花叶病毒、TMV)感染的或用重组质粒表达载体(例如，Ti质粒)转化的植物细胞系统；或哺乳动物细胞系统(例如，COS、CHO、BHK、293、NS0和3T3细胞)，这些重组表达构建体含有源自哺乳动物细胞的基因组(例如，金属硫蛋白启动子)或源自哺乳动物病毒(例如，腺病毒晚期启动子；牛痘病毒7.5K启动子)的启动子。细菌细胞诸如大肠杆菌(Escherichia coli)或真核细胞，尤其是对于整个重组抗体分子的表达，可用于重组抗体分子的表达。例如，哺乳动物细胞(诸如中国仓鼠卵巢细胞(CHO))与载体(诸如来自人巨细胞病毒的主要中间早期基因启动子元件)结合是用于抗体的有效表达系统(Foecking等人，1986，Gene 45:101；和Cockett等人，1990，Bio/Technology 8:2)。在一些实施方案中，本文提供的抗体在CHO细胞中产生。在一个具体的实施方案中，编码本文提供的与NKG2d抗原免疫特异性结合的抗体的核苷酸序列的表达是由组成型启动子、诱导型启动子或组织特异性启动子调控的。在一个具体的实施方案中，编码本文提供的与NKp46抗原免疫特异性结合的抗体的核苷酸序列的表达是由组成型启动子、诱导型启动子或组织特异性启动子调控的。
在细菌系统中，根据旨在用于表达抗体分子的用途，可有利地选择许多表达载体。例如，当要产生大量此类抗体时，为了生成抗体分子的药物组合物，可能期望指导表达易于纯化的高水平融合蛋白产物的载体。此类载体包括但不限于大肠杆菌(E.coli)表达载体pUR278(Ruther等人，1983，EMBO，12:1791)，其中可将抗体编码序列与lac Z编码区同框地单独连接到载体中，使得产生融合蛋白；pIN载体(Inouye和Inouye,1985,Nucleic AcidsRes.13:3101-3109；Van Heeke和Schuster，1989，J.Biol.Chem.24:5503-5509)；等。pGEX载体还可用于表达外来多肽作为与谷胱甘肽5-转移酶(GST)的融合蛋白。通常，此类融合蛋白是可溶的并且可通过吸附和结合到基质谷胱甘肽琼脂糖珠，然后在游离谷胱甘肽存在下洗脱而容易地从裂解细胞中纯化。pGEX载体被设计成包括凝血酶或因子Xa蛋白酶切割位点，使得克隆的靶基因产物可从GST部分释放。
在昆虫系统中，加州苜蓿夜蛾(Autographa californica)核型多角体病毒(AcNPV)用作表达外来基因的载体。病毒在秋粘虫(Spodoptera frugiperda)细胞中生长。可将抗体编码序列单独地克隆到病毒的非必需区(例如多角体蛋白基因)中并且置于AcNPV启动子(例如，多角体蛋白启动子)的控制下。
在哺乳动物宿主细胞中，可利用许多基于病毒的表达系统。在将腺病毒用作表达载体的情况下，可将目的抗体编码序列连接到腺病毒转录/翻译控制复合物，例如晚期启动子和三联前导序列。然后该嵌合基因可通过体外或体内重组插入在腺病毒基因组中。插入病毒基因组的非必需区(例如，El或E3区)将得到活的并能够在感染的宿主中表达抗体分子的重组病毒(例如，参见Logan和Shenk，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:355-359)。对于所插入的抗体编码序列的有效翻译也可能需要特定的起始信号。这些信号包括ATG起始密码子和相邻序列。此外，起始密码子必须与期望的编码序列的阅读框相同，以确保整个插入物的翻译。这些外源翻译控制信号和起始密码子可以是天然和合成两者的多种来源。可通过包含适当的转录增强子元件、转录终止子等来增强表达效率(参见例如，Bittner等人，1987，Methods in Enzymol.153:51-544)。
此外，可选择调节所插入的序列的表达或以期望的特定方式修饰和加工基因产物的宿主细胞株。蛋白质产物的此类修饰(例如，糖基化)和加工(例如，裂解)对于蛋白质的功能可能是重要的。不同的宿主细胞具有用于蛋白质和基因产物的翻译后加工和修饰的特征性和特异性机制。可选择适当的细胞系或宿主系统以确保对所表达的外来蛋白的正确修饰和加工。为此，可以使用具有用于基因产物的初级转录物的适当加工、糖基化和磷酸化的细胞机制的真核宿主细胞。此类哺乳动物宿主细胞包括但不限于CHO、VERY、BHK、Hela、COS、MDCK、293、3T3、W138、BT483、Hs578T、HTB2、BT2O和T47D、NS0(不内源性地产生任何免疫球蛋白链的鼠骨髓瘤细胞系)、CRL7O3O和HsS78Bst细胞。在一些实施方案中，本文提供的完全人单克隆抗体在哺乳动物细胞(诸如CHO细胞)中产生。
对于重组蛋白的长期、高产率生产，可利用稳定表达。例如，可对稳定表达抗体分子的细胞系进行工程化。不使用含有病毒复制起点的表达载体，而是用由适当表达控制元件(例如，启动子、增强子、序列、转录终止子、聚腺苷酸化位点等)控制的DNA和选择性标记物转化宿主细胞。外来DNA引入之后，可允许工程化细胞在富集培养基中生长1-2天，然后转换到选择培养基。重组质粒中的选择性标记赋予选择抗性，并且允许细胞将质粒稳定整合到其染色体中并长成集落，继而可将其克隆并扩增成细胞系。该方法可有利地用于工程化表达抗体分子的细胞系。此类工程化细胞系可特别用于筛选和评估与抗体分子直接或间接相互作用的组合物。
可使用许多选择系统，包括但不限于单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等人，1977，Cell 11:223)、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Szybalska和Szybalski，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48:202)和腺嘌呤磷酸核糖转移酶(Lowy等人，1980，Cell 22:8-17)基因，可分别用于tk-、hgprt-或aprt-细胞。此外，抗代谢物抗性可用作以下基因的选择基础：dhfr，其赋予对甲氨蝶呤的抗性(Wigler等人，1980，Natl.Acad.Sci.USA 77:357；O’Hare等人，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:1527)；gpt，其赋予对霉酚酸的抗性(Mulligan和Berg，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:2072)；neo，其赋予对氨基糖苷G-418的抗性(Wu和Wu，1991，Biotherapy 3:87-95；Tolstoshev，1993，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32:573-596；Mulligan，1993，Science 260:926-932；以及Morgan和Anderson，1993，Ann.Rev.Biochem.62:191-217；1993，TIB TECH 11(5):l55-215)；和hygro，其赋予对潮霉素的抗性(Santerre等人，1984，Gene 30:147)。重组DNA技术领域中通常已知的方法可常规地应用于选择所需的重组克隆，并且此类方法描述于例如Ausubel等人(编辑)，CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，NY(1993)；Kriegler，Gene Transfer and Expression，A Laboratory Manual，StocktonPress，NY(1990)；以及第12章和第13章，Dracopoli等人(编辑)，Current Protocols inHuman Genetics，John Wiley&Sons，NY(1994)；Colberre-Garapin等人，1981，J.Mol.Biol.150:1，这些文献全文以引用方式并入本文。
抗体分子的表达水平可通过载体扩增来提高(综述参见Bebbington和Hentschel，The use ofvectors based on gene amplification for the expression of clonedgenes in mammalian cells in DNA cloning，第3卷(Academic Press，New York，1987))。当表达抗体的载体系统中的标记物可扩增时，宿主细胞培养物中存在的抑制剂水平的增加将增加标记物基因的拷贝数。由于扩增区与抗体基因缔合，因此产生的抗体也将增加(Crouse等人，1983，Mol.Cell.Biol.3:257)。
宿主细胞可用本文提供的两种或更多种表达载体共转染。两种或更多种载体可含有相同的选择性标记，其使得能够相等地表达例如重链和轻链多肽。另选地，可使用编码并能够表达本公开的抗体的不同组分多肽，例如重链和轻链多肽两者的单个载体。编码序列可包括cDNA或基因组DNA。
一旦通过重组表达产生了本文提供的抗体分子，其就可通过本领域已知的用于纯化免疫球蛋白分子的任何方法，例如通过色谱法(例如，离子交换、亲和(特别是通过蛋白A后对特定抗原的亲和)和尺寸柱色谱法)、离心、差异溶解度或通过用于纯化蛋白质的任何其他标准技术来纯化。此外，本文提供的抗体可与本文所述或本领域以其他方式已知的异源多肽序列融合以促进纯化。
5.5.药物组合物
在一个方面，本公开还提供了包含本公开的至少一种抗体或其抗原结合片段的药物组合物。在一些实施方案中，药物组合物包含治疗有效量的本文提供的抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的赋形剂。还提供了一种产生药物组合物的方法，该方法包括将本文提供的抗体或其抗原结合片段与药学上可接受的载体组合以获得该药物组合物。
在另一个总的方面，提供了一种药物组合物，该药物组合物包含本文提供的多特异性抗体和药学上可接受的载体。在某些实施方案中，该多特异性抗体是分离的。还提供了一种产生该药物组合物的方法，该方法包括将该多特异性抗体与药学上可接受的载剂组合以获得该药物组合物。在另一方面，本文提供了一种药物组合物，该药物组合物包含：(a)与NKG2d结合的第一结合结构域和(b)与第二靶标结合的第二结合结构域，以及药学上可接受的载剂。在另一方面，本文提供了一种药物组合物，该药物组合物包含：(a)与NKp46结合的第一结合结构域和(b)与第二靶标结合的第二结合结构域，以及药学上可接受的载剂。在该药物组合物中考虑了本文提供的任何多特异性抗体。在某些实施方案中，第二结合结构域与BCMA结合。在某些实施方案中，第二结合结构域与GPRC5d结合。在该药物组合物中考虑了本文提供的任何抗体。
通过将具有期望纯度的蛋白与任选的生理学上可接受的赋形剂混合来制备包含抗体或其抗原结合片段的药物组合物以供以水溶液的形式或者冻干或其他干燥形式储存(参见例如，Remington，Remington's Pharmaceutical Sciences(第18版，1980))。
本公开的抗体或其抗原结合片段可被配制成任何合适的形式以例如作为微胶囊或粗乳液递送至靶细胞/组织(Remington，出处同上；Park等人，2005，Molecules 10:146-61；Malik等人，2007，Curr.Drug.Deliv.4:141-51)，作为缓释制剂(Putney和Burke，1998,Nature Biotechnol.16:153-57)，或在脂质体中(Maclean等人，1997，Int.J.Oncol.11:325-32；Kontermann，2006，Curr.Opin.Mol.Ther.8:39-45)。
本文提供的抗体或其抗原结合片段还可被包埋在微胶囊中，该微胶囊例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备，例如分别为羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊，包埋在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)中或包埋在粗乳液中。此类技术公开于例如Remington，出处同上。
各种组合物和递送系统是已知的并且可与如本文所述的抗体或其抗原结合片段一起使用，包括但不限于包封在脂质体、微粒、微胶囊、能够表达抗体或其抗原结合片段/受体介导的胞吞的重组细胞中(参见例如，Wu和Wu，1987，J.Biol.Chem.262:4429-32)，核酸作为逆转录病毒或其他载体的一部分的构建等。在另一个实施方案中，组合物可作为控释或缓释系统提供。在一个实施方案中，可使用泵来实现控释或缓释(参见例如，Langer，出处同上；Sefton,1987,Crit.Ref.Biomed.Eng.14:201-40；Buchwald等人，1980，Surgery 88:507-16；和Saudek等人，1989，N.Engl.J.Med.321:569-74)。在另一个实施方案中，可使用聚合材料来实现预防性或治疗性药剂(例如，如本文所述的抗体或其抗原结合片段)或本文提供的组合物的控释或缓释(参见例如，Medical Applications of Controlled Release(Langer和Wise编辑，1974)；Controlled Drug Bioavailability,Drug Product Designand Performance(Smolen和Ball编辑，1984)；Ranger和Peppas，1983,J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23:61-126；Levy等人，1985，Science 228:190-92；During等人，1989，Ann.Neurol.25:351-56；Howard等人，1989，J.Neurosurg.71:105-12；美国专利5,679,377；5,916,597；5,912,015；5,989,463；和5,128,326；PCT公布WO 99/15154和WO 99/20253)。用于缓释制剂的聚合物的示例包括但不限于聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸)、聚(乙烯-共-乙酸乙烯酯)、聚(甲基丙烯酸)、聚乙交酯(PLG)、聚酸酐、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚丙烯酰胺、聚(乙二醇)、聚丙交酯(PLA)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)和聚原酸酯。在一个实施方案中，用于缓释制剂中的聚合物为惰性的，不含可浸出的杂质，储存稳定，无菌，并且可生物降解。
在另一个实施方案中，可将控释或缓释系统置于特定靶组织(例如，鼻通道或肺)附近，因此仅需要全身剂量的一部分(参见例如，Goodson，Medical Applications ofControlled Release，第2卷，115-38(1984))。控释系统例如通过Langer,1990,Science249:1527-33论述。本领域技术人员已知的任何技术可用于产生包含一种或多种如本文所述的抗体或其抗原结合片段的缓释制剂(参见例如，美国专利4,526,938，PCT公布WO 91/05548和WO 96/20698，Ning等人，1996，Radiotherapy&Oncology 39:179-89；Song等人，1995，PDA J.of Pharma.Sci.&Tech.50:372-97；Cleek等人，1997，Pro.Int’l.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.24:853-54；和Lam等人，1997，Proc.Int’l.Symp.ControlRel.Bioact.Mater.24:759-60)。
5.6.使用方法
在又一方面，本文提供了一种富集、分离、隔离、纯化、分选、选择、捕获、检测或耗竭表达NKG2d的细胞的方法，该方法包括：提供包含表达NKG2d的细胞的样品；使该样本与本文提供的NKG2d抗体接触；以及富集、分离、隔离、纯化、分选、选择、捕获、检测或耗竭表达NKG2d并与NKG2d抗体结合的细胞。
在又一方面，本文提供了本文提供的NKG2d抗体用于富集、分离、隔离、纯化、分选、选择、捕获、检测或耗竭表达NKG2d的细胞的用途，该用途包括：提供包含表达NKG2d的细胞的样品；使该样本与本文提供的NKG2d抗体接触；以及富集、分离、隔离、纯化、分选、选择、捕获、检测或耗竭表达NKG2d并与NKG2d抗体结合的细胞。
在另一方面，本文提供了一种富集、分离、隔离、纯化、分选、选择、捕获、检测或耗竭表达NKp46的细胞的方法，该方法包括：提供包含表达NKp46的细胞的样品；使该样品与本文提供的NKp46抗体接触；以及富集、分离、隔离、纯化、分选、选择、捕获、检测或耗竭表达NKp46并与NKp46抗体结合的细胞。
在另一方面，本文提供了本文提供的NKp46抗体用于富集、分离、隔离、纯化、分选、选择、捕获、检测或耗竭表达NKp46的细胞的用途，该用途包括：提供包含表达NKp46的细胞的样品；使该样品与本文提供的NKp46抗体接触；以及富集、分离、隔离、纯化、分选、选择、捕获、检测或耗竭表达NKp46并与NKp46抗体结合的细胞。
在一些实施方案中，细胞是NK细胞。在一些实施方案中，样本是血液样本。在其他实施方案中，样本是组织样本。
在又一方面，本文提供了一种将NK细胞引导至靶细胞的方法，该方法包括使NK细胞与本文提供的多特异性抗体接触，从而将NK细胞引导至靶细胞，其中该多特异性抗体包含与NK细胞上的第一抗原结合的第一结合结构域和与靶细胞上的第二抗原结合的第二结合结构域。在一些实施方案中，靶细胞是肿瘤细胞。在某些实施方案中，多特异性抗体是多特异性NKG2d/BCMA抗体，其中第一靶标是NKG2d，并且第二靶标是BCMA。在某些实施方案中，多特异性抗体是多特异性NKG2d/GPRC5d抗体，其中第一靶标是NKG2d，并且第二靶标是GPRC5d。在某些实施方案中，多特异性抗体是多特异性NKp46/BCMA抗体，其中第一靶标是NKp46，并且第二靶标是BCMA。在某些实施方案中，多特异性抗体是多特异性NKp46/GPRC5d抗体，其中第一靶标是NKp46，并且第二靶标是GPRC5d。
在又一方面，本文提供了本文提供的多特异性抗体用于将NK细胞引导至靶细胞的用途，该用途包括使NK细胞与本文提供的多特异性抗体接触，从而将NK细胞引导至靶细胞，其中该多特异性抗体包含与NK细胞上的第一抗原结合的第一结合结构域和与靶细胞上的第二抗原结合的第二结合结构域。在一些实施方案中，靶细胞是肿瘤细胞。在某些实施方案中，多特异性抗体是多特异性NKG2d/BCMA抗体，其中第一靶标是NKG2d，并且第二靶标是BCMA。在某些实施方案中，多特异性抗体是多特异性NKG2d/GPRC5d抗体，其中第一靶标是NKG2d，并且第二靶标是GPRC5d。在某些实施方案中，多特异性抗体是多特异性NKp46/BCMA抗体，其中第一靶标是NKp46，并且第二靶标是BCMA。在某些实施方案中，多特异性抗体是多特异性NKp46/GPRC5d抗体，其中第一靶标是NKp46，并且第二靶标是GPRC5d。
在又一方面，本文提供了一种使NK细胞活化的方法，该方法包括使该NK细胞与本文提供的多特异性抗体接触，其中该多特异性抗体包含与NK细胞上的第一抗原结合的第一结合结构域和与靶细胞上的第二抗原结合的第二结合结构域。在一些实施方案中，靶细胞是肿瘤细胞。在某些实施方案中，多特异性抗体是多特异性NKG2d/BCMA抗体，其中第一靶标是NKG2d，并且第二靶标是BCMA。在某些实施方案中，多特异性抗体是多特异性NKG2d/GPRC5d抗体，其中第一靶标是NKG2d，并且第二靶标是GPRC5d。在某些实施方案中，多特异性抗体是多特异性NKp46/BCMA抗体，其中第一靶标是NKp46，并且第二靶标是BCMA。在某些实施方案中，多特异性抗体是多特异性NKp46/GPRC5d抗体，其中第一靶标是NKp46，并且第二靶标是GPRC5d。
在又一方面，本文提供了本文提供的多特异性抗体用于使NK细胞活化的用途，该用途包括使该NK细胞与本文提供的多特异性抗体接触，其中该多特异性抗体包含与NK细胞上的第一抗原结合的第一结合结构域和与靶细胞上的第二抗原结合的第二结合结构域。在某些实施方案中，多特异性抗体是多特异性NKG2d/BCMA抗体，其中第一靶标是NKG2d，并且第二靶标是BCMA。在某些实施方案中，多特异性抗体是多特异性NKG2d/GPRC5d抗体，其中第一靶标是NKG2d，并且第二靶标是GPRC5d。在某些实施方案中，多特异性抗体是多特异性NKp46/BCMA抗体，其中第一靶标是NKp46，并且第二靶标是BCMA。在某些实施方案中，多特异性抗体是多特异性NKp46/GPRC5d抗体，其中第一靶标是NKp46，并且第二靶标是GPRC5d。
在又一方面，本文提供了一种抑制在细胞表面上表达第二抗原的靶细胞的生长或增殖的方法，该方法包括使该靶细胞与本文提供的多特异性抗体接触，其中该多特异性抗体包含与NK细胞上的第一抗原结合的第一结合结构域和与该第二抗原结合的第二结合结构域。在一些实施方案中，第二抗原在肿瘤细胞上表达。在某些实施方案中，多特异性抗体是多特异性NKG2d/BCMA抗体，其中第一靶标是NKG2d，并且第二靶标是BCMA。在某些实施方案中，多特异性抗体是多特异性NKG2d/GPRC5d抗体，其中第一靶标是NKG2d，并且第二靶标是GPRC5d。在某些实施方案中，多特异性抗体是多特异性NKp46/BCMA抗体，其中第一靶标是NKp46，并且第二靶标是BCMA。在某些实施方案中，多特异性抗体是多特异性NKp46/GPRC5d抗体，其中第一靶标是NKp46，并且第二靶标是GPRC5d。
在又一方面，本文提供了本文提供的多特异性抗体用于抑制在细胞表面上表达第二抗原的靶细胞的生长或增殖的用途，该用途包括使该靶细胞与本文提供的多特异性抗体接触，其中该多特异性抗体包含与NK细胞上的第一抗原结合的第一结合结构域和与该第二抗原结合的第二结合结构域。在某些实施方案中，多特异性抗体是多特异性NKG2d/BCMA抗体，其中第一靶标是NKG2d，并且第二靶标是BCMA。在某些实施方案中，多特异性抗体是多特异性NKG2d/GPRC5d抗体，其中第一靶标是NKG2d，并且第二靶标是GPRC5d。在某些实施方案中，多特异性抗体是多特异性NKp46/BCMA抗体，其中第一靶标是NKp46，并且第二靶标是BCMA。在某些实施方案中，多特异性抗体是多特异性NKp46/GPRC5d抗体，其中第一靶标是NKp46，并且第二靶标是GPRC5d。
在又另一方面，本文提供了一种用于在受试者中消除表达第二抗原的靶细胞或治疗全部或部分地由表达该第二抗原的靶细胞引起的疾病或病症的方法，该方法包括向该受试者施用有效量的本文提供的多特异性抗体，其中该多特异性抗体包含与NK细胞上的第一抗原结合的第一结合结构域和与该第二抗原结合的第二结合结构域。在一些实施方案中，第二抗原在肿瘤细胞上表达。在某些实施方案中，多特异性抗体是多特异性NKG2d/BCMA抗体，其中第一靶标是NKG2d，并且第二靶标是BCMA。在某些实施方案中，多特异性抗体是多特异性NKG2d/GPRC5d抗体，其中第一靶标是NKG2d，并且第二靶标是GPRC5d。在某些实施方案中，多特异性抗体是多特异性NKp46/BCMA抗体，其中第一靶标是NKp46，并且第二靶标是BCMA。在某些实施方案中，多特异性抗体是多特异性NKp46/GPRC5d抗体，其中第一靶标是NKp46，并且第二靶标是GPRC5d。
在又另一方面，本文提供了本文提供的双特异性抗体用于在受试者中消除表达第二抗原的靶细胞或治疗全部或部分地由表达该第二抗原的靶细胞引起的疾病或病症的用途，该用途包括向该受试者施用有效量的本文提供的多特异性抗体，其中该多特异性抗体包含与NK细胞上的第一抗原结合的第一结合结构域和与该第二抗原结合的第二结合结构域。在某些实施方案中，多特异性抗体是多特异性NKG2d/BCMA抗体，其中第一靶标是NKG2d，并且第二靶标是BCMA。在某些实施方案中，多特异性抗体是多特异性NKG2d/GPRC5d抗体，其中第一靶标是NKG2d，并且第二靶标是GPRC5d。在某些实施方案中，多特异性抗体是多特异性NKp46/BCMA抗体，其中第一靶标是NKp46，并且第二靶标是BCMA。在某些实施方案中，多特异性抗体是多特异性NKp46/GPRC5d抗体，其中第一靶标是NKp46，并且第二靶标是GPRC5d。
在又一方面，本文提供了一种抑制或耗竭患有癌症的受试者的癌细胞和的方法，该方法包括向该受试者施用本文提供的多特异性抗体。
在又一方面，本文提供了本文提供的多特异性抗体用于抑制或耗竭患有癌症的受试者的癌细胞和的用途，该用途包括向该受试者施用本文提供的多特异性抗体。
在又一方面，本文提供了一种治疗受试者的癌症的方法，该方法包括向受试者施用本文提供的多特异性抗体。本文还提供了一种如本文所述的多特异性抗体，其用于治疗受试者的癌症。在一些实施方案中，癌症是实体瘤癌症。在其他实施方案中，癌症是血癌。在又一方面，本文提供了一种如本文所述的多特异性抗体，其用作药物。
在另一方面，本文提供了一种治疗受试者的疾病或病症的方法，该方法包括向受试者施用有效量的本文提供的抗体或其抗原结合片段。本文还提供了一种如本文所述的抗体或其抗原结合片段，其用于治疗疾病或病症。
在另一方面，本文提供了一种治疗受试者的疾病或病症的方法，该方法包括向该受试者施用有效量的本文提供的多特异性抗体。本文还提供了一种如本文所述的多特异性抗体，其用于治疗疾病或病症。
本文还提供了一种治疗疾病或病症的方法，其中将一种或多种治疗剂与本文提供的抗体或其抗原结合片段组合施用给受试者。
在另一方面，本文提供了本文提供的抗体或其抗原结合片段在制造用于治疗受试者的疾病或病症的药物中的用途。在另一方面，本文提供了本文提供的多特异性抗体在制造用于治疗受试者的疾病或病症的药物中的用途。
在另一方面，本文提供了本文提供的药物组合物在制造用于治疗受试者的疾病或病症的药物中的用途。
在一个具体的实施方案中，本文提供了一种组合物，其用作药物，其中该组合物包含抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的赋形剂/载体。在一个具体的实施方案中，本文提供了一种组合物，其用于预防和/或治疗疾病或病症，其中该组合物包含抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的赋形剂/载体。在一个实施方案中，本文提供了一种组合物，其用于预防疾病或病症，其中该组合物包含抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的赋形剂/载体。在一个实施方案中，本文提供了一种组合物，其用于治疗疾病或病症，其中该组合物包含抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的赋形剂/载体。在一个实施方案中，本文提供了一种组合物，其用于治疗癌症，其中该组合物包含抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的赋形剂/载体。在某些实施方案中，受试者是对其有需要的受试者。在一些实施方案中，受试者患有疾病或病症。在其他实施方案中，受试者具有罹患疾病或病症的风险。在一些实施方案中，施用导致疾病或病症的预防、管理、治疗或改善。
在一个实施方案中，本文提供了一种组合物，其用于预防和/或治疗疾病或病症的症状，其中该组合物包含所提供的抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的赋形剂/载体。在一个实施方案中，本文提供了一种组合物，其用于预防疾病或病症的症状，其中该组合物包含抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的赋形剂/载体。在一个实施方案中，本文提供了一种组合物，其用于治疗疾病或病症的症状，其中该组合物包含抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的赋形剂/载体。在某些实施方案中，受试者是对其有需要的受试者。在一些实施方案中，受试者患有疾病或病症。在其他实施方案中，受试者具有罹患疾病或病症的风险。在一些实施方案中，施用导致疾病或病症的症状的预防或治疗。
在另一个实施方案中，本文提供了一种预防和/或治疗受试者的疾病或病症的方法，该方法包括施用有效量的本文提供的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方案中，本文提供了一种预防受试者的疾病或病症的方法，该方法包括施用有效量的本文提供的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方案中，本文提供了一种治疗受试者的疾病或病症的方法，该方法包括施用有效量的本文提供的抗体或其抗原结合片段。在某些实施方案中，受试者是对其有需要的受试者。在一些实施方案中，受试者患有疾病或病症。在其他实施方案中，受试者具有罹患疾病或病症的风险。在一些实施方案中，施用导致疾病或病症的预防或治疗。
在另一个实施方案中，本文提供了一种预防和/或治疗受试者的疾病或病症的症状的方法，该方法包括施用有效量的本文提供的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方案中，本文提供了一种预防受试者的疾病或病症的症状的方法，该方法包括施用有效量的本文提供的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方案中，本文提供了一种治疗受试者的疾病或病症的症状的方法，该方法包括施用有效量的本文提供的抗体或其抗原结合片段。在某些实施方案中，受试者是对其有需要的受试者。在一些实施方案中，受试者患有疾病或病症。在其他实施方案中，受试者具有罹患疾病或病症的风险。在一些实施方案中，施用导致疾病或病症的症状的预防或治疗。
本文还提供了通过向受试者施用有效量的本文提供的抗体或其抗原结合片段或包含本文提供的抗体或其抗原结合片段的药物组合物来预防和/或治疗疾病或病症的方法。在一个方面，抗体或其抗原结合片段是基本上纯化的(即，基本上不含限制其效果或产生不期望的副作用的物质)。给予治疗的受试者可以是哺乳动物，诸如非灵长类动物或灵长类动物(例如，人)。在一个实施方案中，受试者是人。在另一个实施方案中，受试者是患有疾病或病症的人。
各种递送系统是已知的并且可用于施用预防性或治疗性药剂(例如，本文提供的抗体或其抗原结合片段)，包括但不限于包封在脂质体、微粒、微胶囊、能够表达抗体或其抗原结合片段/受体介导的胞吞的重组细胞中(参见例如，Wu和Wu，J.Biol.Chem.262:4429-4432(1987))、核酸作为逆转录病毒或其他载体的一部分的构建等。施用预防性或治疗性药剂(例如，本文提供的抗体或其抗原结合片段)或药物组合物的方法包括但不限于肠胃外施用(例如，皮内、肌内、腹膜内、静脉内和皮下)、硬膜外施用和粘膜施用(例如，鼻内和口服途径)。在一个具体的实施方案中，预防性或治疗性药剂(例如，本文提供的抗体或其抗原结合片段)或药物组合物经鼻内、肌内、静脉内或皮下施用。预防性或治疗性药剂或组合物可通过任何便利的途径施用，例如通过输注或推注、通过上皮层或粘膜层(例如，口腔粘膜、鼻内粘膜、直肠和肠粘膜等)的吸收来施用并且可与其他生物活性剂一起施用。施用可以是全身的或局部的施用。另外，也可采用经肺部施用，例如，通过使用吸入器或雾化器和用气溶胶剂配制。参见例如，美国专利6,019,968、5,985,320、5,985,309、5,934,272、5,874,064、5,855,913、5,290,540和4,880,078；以及PCT公布WO 92/19244、WO 97/32572、WO 97/44013、WO 98/31346和WO 99/66903，这些文献中的每一篇全文以引用的方式并入本文。
在一个具体的实施方案中，可能期望将预防性或治疗性药剂或本文提供的药物组合物局部施用于需要治疗的区域。这可通过例如但不限于局部输注、通过局部施用(例如，通过鼻内喷雾)、通过注射或借助于植入物来实现，所述植入物具有多孔、无孔或凝胶状材料，包括膜(诸如sialastic膜)或纤维。在一些实施方案中，当施用本文提供的抗体或其抗原结合片段时，必须小心使用抗体或其抗原结合片段不吸收的材料。
在另一个实施方案中，预防性或治疗性药剂或本文提供的组合物可在囊泡，特别是脂质体中递送(参见Langer，1990，Science 249:1527-1533；Treat等人，in Liposomesin the Therapy of Infectious Disease and Cancer，Lopez-Berestein and Fidler(编辑)，Liss，New York，第353-365页(1989)；Lopez-Berestein，ibid.，第317-327页；一般参见ibid.)。
在另一个实施方案中，可在控释或缓释系统中递送预防性或治疗性药剂或本文提供的组合物。在一个实施方案中，可使用泵来实现控释或缓释(参见Langer，出处同上；Sefton，1987，CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14:20；Buchwald等人，1980，Surgery 88:507；Saudek等人，1989，N.Engl.J.Med.321:574)。在另一个实施方案中，可使用聚合材料来实现预防性或治疗性药剂(例如，本文提供的抗体)或本文提供的组合物的控释或缓释(参见例如，Medical Applications of Controlled Release，Langer和Wise(编辑)，CRC Pres.，Boca Raton，Florida(1974)；Controlled Drug Bioavailability,Drug Product Designand Performance，Smolen和Ball(编辑)，Wiley，New York(1984)；Ranger和Peppas，1983，J.,Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23:61；也参见Levy等人，1985，Science 228:190；During等人，1989，Ann.Neurol.25:351；Howard等人，1989，J.Neurosurg.71:105)；美国专利5,679,377；美国专利5,916,597；美国专利5,912,015；美国专利5,989,463；美国专利5,128,326；PCT公布WO 99/15154；和PCT公布WO 99/20253。用于缓释制剂的聚合物的示例包括但不限于聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸)、聚(乙烯-共-乙酸乙烯酯)、聚(甲基丙烯酸)、聚乙交酯(PLG)、聚酸酐、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚丙烯酰胺、聚(乙二醇)、聚丙交酯(PLA)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)和聚原酸酯。在一个实施方案中，用于缓释制剂中的聚合物为惰性的，不含可浸出的杂质，储存稳定，无菌，并且可生物降解。在另一个实施方案中，可将控释或缓释系统置于治疗靶标(即，鼻通道或肺)附近，因此仅需要全身剂量的一部分(参见例如，Goodson，Medical Applications ofControlled Release，出处同上，第2卷，第115-138页(1984))。控释系统通过Langer(1990，Science249:1527-1533)在综述中论述。可使用本领域技术人员已知的任何技术来产生包含本文提供的一种或多种抗体或其抗原结合片段的缓释制剂。参见例如，美国专利4,526,938；PCT公布WO 91/05548；PCT公布WO 96/20698；Ning等人，1996，“IntratumoralRadioimmunotherapy of aHuman Colon Cancer Xenograft Using a Sustained-ReleaseGel”，Radiotherapy&Oncology 39:179-189；Song等人，1995，“Antibody Mediated LungTargeting of Long-Circulating Emulsions”，PDA Journal of PharmaceuticalScience&Technology 50:372-397；Cleek等人，1997，“Biodegradable PolymericCarriers for a bFGF Antibody for Cardiovascular Application”，Pro.Int’l.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.24:853-854；和Lam等人，1997，“Microencapsulation ofRecombinant Humanized Monoclonal Antibody for Local Delivery”，Proc.Int’l.Symp.Control Rel.Bioact.Mater.24:759-760，这些文献中的每一篇全文以引用的方式并入本文。
在一个具体的实施方案中，在本文提供的组合物是编码预防性或治疗性药剂(例如，本文提供的抗体或其抗原结合片段)的核酸的情况下，核酸可通过以下方式在体内施用以促进其编码的预防性或治疗性药剂的表达：例如，通过使用逆转录病毒载体(参见美国专利4,980,286)或通过直接注射或通过使用微粒轰击(例如，基因枪；Biolistic，Dupont)将核酸构建为适当核酸表达载体的一部分并且施用以使其变成细胞内的，或通过用脂质或细胞表面受体或转染剂涂覆，或通过将核酸与已知进入细胞核的同源框样肽连接施用(参见例如，Joliot等人，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:1864-1868)等。另选地，可通过同源重组将核酸引入细胞内并掺入宿主细胞DNA中以进行表达。
在一个具体的实施方案中，本文提供的组合物包含本文提供的一种、两种或更多种抗体或其抗原结合片段。在另一个实施方案中，本文提供的组合物包含本文提供的一种、两种或更多种抗体或其抗原结合片段以及除本文提供的抗体或其抗原结合片段之外的预防性或治疗性药剂。在一个实施方案中，已知预防性或治疗性药剂可用于或已经用于或目前用于预防、管理、治疗和/或改善疾病或病症。除了预防性或治疗性药剂之外，本文提供的组合物还可包含赋形剂。
本文提供的组合物包括可用于制备单位剂型的可用于制造药物组合物(例如，适于施用给受试者或患者的组合物)的原料药物组合物。在一个实施方案中，本文提供的组合物是药物组合物。此类组合物包含预防或治疗有效量的一种或多种预防性或治疗性药剂(例如，本文提供的抗体或其抗原结合片段或其他预防性或治疗性药剂)和药学上可接受的赋形剂。药物组合物可被配制成适于向受试者施用的途径。
在一个具体的实施方案中，术语“赋形剂”还可指稀释剂、佐剂(例如，弗氏佐剂(完全或不完全))或媒介物。药物赋形剂可以是无菌的液体，诸如水和油，包括那些衍生自石油、动物、植物的油或合成的油，诸如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当静脉内施用药物组合物时，水是示例性赋形剂。盐水溶液和右旋糖水溶液以及甘油溶液也可用作液体赋形剂，尤其是用于注射溶液。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等。如果需要，组合物还可含有少量润湿剂或乳化剂或pH缓冲剂。这些组合物可采用溶液、悬浮液、乳液、片剂、丸剂、胶囊、粉末、缓释制剂等形式。口服制剂可包含标准赋形剂，诸如药物级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。合适的药物赋形剂的示例描述于Remington’s Pharmaceutical Sciences(1990)Mack Publishing Co.，Easton，PA中。此类组合物将含有预防或治疗有效量的本文提供的抗体或其抗原结合片段，诸如纯化形式，以及合适量的赋形剂，以便提供用于适当施用于患者的形式。制剂应与施用方式相适应。
在一个实施方案中，根据常规程序将组合物配制为适于向人类静脉内施用的药物组合物。通常，用于静脉内施用的组合物是无菌等渗缓冲水溶液。在必要时，组合物还可包含增溶剂和局部麻醉剂诸如利多卡因，以减轻注射部位处的疼痛。然而，此类组合物可通过除静脉内施用之外的途径施用。
通常，本文提供的组合物的成分在指示活性剂的量的气密密封容器诸如安瓿或小袋中单独提供或以单位剂型混合在一起，例如，作为干燥冻干粉末或无水浓缩物。在组合物通过输注施用的情况下，可使用含有无菌药物级水或盐水的输注瓶来分配组合物。在组合物通过注射施用的情况下，可提供无菌注射用水或盐水的安瓿，使得可在施用之前混合成分。
本文提供的抗体或其抗原结合片段可包装在指示抗体的量的气密密封容器诸如安瓿或小袋中。在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段作为干燥灭菌的冻干粉末或无水浓缩物在气密密封容器中提供并且可例如用水或盐水重构至适当浓度以施用于受试者。冻干抗体或其抗原结合片段可在其原始容器中储存在2℃至8℃之间，并且抗体或其抗原结合片段可在重构后12小时内，诸如在6小时内、5小时内、3小时内或1小时内施用。在另选的实施方案中，本文提供的抗体或其抗原结合片段在指示抗体的量和浓度的气密密封容器中以液体形式提供。
本文提供的组合物可被配制为中性或盐形式。药学上可接受的盐包括由阴离子形成的那些，诸如衍生自盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的那些；以及由阳离子形成的那些，诸如衍生自钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的那些。
有效预防和/或治疗疾病或病症的预防性或治疗性药剂(例如，本文提供的抗体或其抗原结合片段)或本文提供的组合物的量可通过标准临床技术确定。此外，可任选地采用体外测定来帮助确定最佳剂量范围。在制剂中待采用的精确剂量也将取决于施用途径以及疾病或病症的严重程度，并且应该根据医生的判断和每个患者的情况来决定。
有效剂量可通过源自体外或动物模型测试体系的剂量反应曲线来推导。
在某些实施方案中，向患者施用一定剂量的本文提供的抗体或其抗原结合片段的途径是鼻内、肌内、静脉内、皮下或它们的组合，但是本文所述的其他途径也是可接受的。每个剂量可以或可以不通过相同的施用途径施用。在一些实施方案中，本文提供的抗体或其抗原结合片段可经由多种施用途径同时或随后施用至本文提供的相同或不同抗体或其抗原结合片段的其他剂量。
在某些实施方案中，本文提供的抗体或其抗原结合片段预防性或治疗性地施用于受试者。本文提供的抗体或其抗原结合片段可预防性或治疗性地施用于受试者，以便防止、减轻或改善疾病或其症状。
5.7.基因治疗
在一个具体的实施方案中，将包含编码抗体或其功能性衍生物的序列的核酸施用于受试者以用于本文提供的方法中，例如，以通过基因治疗预防、管理、治疗和/或改善疾病、病症或病状。此类疗法包括通过向受试者施用表达的或可表达的核酸来进行的疗法。在一个实施方案中，核酸产生其编码的抗体，并且该抗体介导预防性或治疗性效果。可以使用本领域中可获得的用于重组基因表达(或基因治疗)的任何方法。
关于基因治疗方法的一般综述，参见Goldspiel等人，1993，Clinical Pharmacy12:488-505；Wu和Wu，1991，Biotherapy 3:87-95；Tolstoshev，1993，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32:573-596；Mulligan，1993，Science260:926-932；以及Morgan和Anderson，1993，Ann.Rev.Biochem.62:191-217；1993年5月，TIBTECH 11(5):155-215。重组DNA技术领域中通常已知的可使用的方法描述于Ausubel等人(编辑)，CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley和Sons，NY(1993)；以及Kriegler，GeneTransfer and Expression,A LaboratoryManual，Stockton Press，NY(1990)。
在一个具体的实施方案中，组合物包含编码本文提供的抗体的核酸，该核酸是在合适的宿主中表达抗体或嵌合蛋白或其重链或轻链的表达载体的一部分。特别地，此类核酸具有可操作地连接到抗体编码区的启动子，诸如异源启动子，该启动子是诱导型或组成型的，并且任选地是组织特异性的。在另一个特定的实施方案中，使用这样的核酸分子，其中抗体编码序列和任何其他所需序列的侧翼是促进基因组中所需位点处的同源重组的区域，从而提供抗体编码核酸的染色体内表达(Koller和Smithies，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:8932-8935；Zijlstra等人，1989，Nature 342:435-438)。在一些实施方案中，表达的抗体分子是单链抗体；另选地，核酸序列包括编码抗体的重链和轻链两者或其片段的序列。
将核酸递送至受试者体内可以是直接的，在这种情况下，受试者直接暴露于核酸或携带核酸的载体，或者是间接的，在这种情况下，首先在体外用核酸转化细胞，然后移植到受试者体内。这两种方法分别已知为体内基因治疗或离体基因治疗。
在一个具体的实施方案中，核酸序列直接体内施用，其中序列被表达以产生编码产物。这可以通过本领域已知的多种方法中的任一种方法来完成，例如，通过将它们构建为合适的核酸表达载体的一部分并且施用该载体使得这些序列变成细胞内的，例如，通过使用有缺陷的或减弱的逆转录病毒或其他病毒载体进行感染(参见美国专利4,980,286)，或通过直接注射裸DNA，或通过使用微粒轰击(例如，基因枪；Biolistic，Dupont)，或用脂质或细胞表面受体或转染剂包被，包封在脂质体、微粒或微胶囊中，或通过将它们与已知进入细胞核的肽连接施用，通过将其与经历受体介导的胞吞作用的配体连接施用(参见例如，Wu和Wu，1987，J.Biol.Chem.262:4429-4432)(其可用于靶向特异性表达受体的细胞类型)等。在另一个实施方案中，可形成核酸-配体复合物，其中配体包含融合病毒肽以破坏内体，从而允许核酸避免溶酶体降解。在又一个实施方案中，通过靶向特异性受体，核酸可在体内靶向细胞特异性摄取和表达(参见例如，PCT公布WO 92/06180；WO 92/22635；WO 92/20316；WO93/14188、WO 93/20221)。另选地，可通过同源重组将核酸引入细胞内并掺入宿主细胞DNA中以进行表达(Koller和Smithies，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:8932-8935；和Zijlstra等人，1989，Nature 342:435-438)。
在一个具体的实施方案中，使用含有编码抗体的核酸序列的病毒载体。例如，可以使用逆转录病毒载体(参见Miller等人，1993，Meth.Enzymol.217:581-599)。这些逆转录病毒载体含有正确包装病毒基因组和整合到宿主细胞DNA中所必需的组分。可将编码用于基因治疗的抗体的核酸序列克隆到一个或多个载体中，这有利于将基因递送至受试者体内。关于逆转录病毒载体的更多细节可见于Boesen等人，1994，Biotherapy 6:291-302，其描述了使用逆转录病毒载体将MDR1基因递送至造血干细胞以使干细胞对化疗更具抗性。阐述逆转录病毒载体在基因治疗中的用途的其他参考文献是：Clowes等人，1994，J.Clin.Invest.93:644-651；Klein等人，1994，Blood 83:1467-1473；Salmons和Gunzberg，1993，Human Gene Therapy 4:129-141；以及Grossman和Wilson，1993，Curr.Opin.inGenetics和Devel.3:110-114。
腺病毒是可用于重组生产抗体的其他病毒载体。腺病毒是用于将基因递送至呼吸道上皮细胞的特别有吸引力的载体。腺病毒天然地感染呼吸上皮细胞，并在上皮细胞处引起轻微的疾病。基于腺病毒的递送系统的其他靶标是肝、中枢神经系统、内皮细胞和肌肉。腺病毒具有能够感染非分裂细胞的优点。Kozarsky和Wilson，1993，Current Opinion inGenetics and Development 3:499-503提供了基于腺病毒的基因治疗的综述。Bout等人，1994，Human Gene Therapy 5:3-10证明了使用腺病毒载体可将基因转移至恒河猴的呼吸上皮细胞。腺病毒在基因治疗中的应用的其他实例可见于Rosenfeld等人，1991，Science252:431-434；Rosenfeld等人，1992，Cell68:143-155；Mastrangeli等人，1993，J.Clin.Invest.91:225-234；PCT公布WO94/12649；和Wang等人，1995，Gene Therapy 2:775-783。在一个具体的实施方案中，使用腺病毒载体。
也可使用腺伴随病毒(AAV)(Walsh等人，1993，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.204:289-300；和美国专利5,436,146)。在一个具体的实施方案中，AAV载体用于表达本文提供的抗体。在某些实施方案中，AAV包含编码VH结构域的核酸。在其他实施方案中，AAV包含编码VL结构域的核酸。在某些实施方案中，AAV包含编码VH结构域和VL结构域的核酸。在本文提供的方法的一些实施方案中，向受试者施用包含编码VH结构域的核酸的AAV和包含编码VL结构域的核酸的AAV。在其他实施方案中，向受试者施用包含编码VH结构域和VL结构域的核酸的AAV。在某些实施方案中，VH结构域和VL结构域是过表达的。
基因治疗的另一种方法包括通过诸如电穿孔、微脂粒感染、磷酸钙介导的转染或病毒感染的方法将基因转移到组织培养物的细胞中。通常，转移方法包括将选择性标记转移到细胞上。然后将细胞置于选择下以分离那些已摄取并表达转移基因的细胞。然后将这些细胞递送给受试者。
在该实施方案中，在体内施用所得重组细胞之前将核酸引入细胞中。此类引入可通过本领域已知的任何方法进行，包括但不限于转染、电穿孔、显微注射、用含有核酸序列的病毒或噬菌体载体感染、细胞融合、染色体介导的基因转移、微细胞介导的基因转移、原生质球融合等。本领域已知多种用于将外源基因引入细胞的技术(参见例如，Loeffler和Behr，1993，Meth.Enzymol.217:599-618；Cohen等人，1993，Meth.Enzymol.217:618-644；Clin.Pharma.Ther.29:69-92(1985))并且可根据本文提供的方法使用，条件是受体细胞的必要发育和生理功能不被破坏。该技术应提供核酸向细胞的稳定转移，使得核酸可由细胞表达，诸如可遗传并可由其细胞后代表达。
所得重组细胞可通过本领域已知的各种方法递送至受试者。重组血细胞(例如，造血干细胞或祖细胞)可以静脉内施用。预期使用的细胞的量取决于期望的效果、患者状态等，并且可以由本领域技术人员确定。
为了基因治疗的目的，可以向其中引入核酸的细胞包括任何所需的、可获得的细胞类型，并且包括但不限于上皮细胞、内皮细胞、角质细胞、成纤维细胞、肌细胞、肝细胞；血细胞，诸如T淋巴细胞、B淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、巨核细胞、粒细胞；各种干细胞或祖细胞，特别是造血干细胞或祖细胞，例如从骨髓、脐带血、外周血、胎肝等获得的造血干细胞或祖细胞。
在一个具体的实施方案中，用于基因治疗的细胞对于受试者来说是自体的。
在基因治疗中使用重组细胞的实施方案中，将编码抗体的核酸序列引入细胞中，使得它们可被细胞或它们的后代表达，然后体内施用重组细胞以获得治疗效果。在一个具体的实施方案中，使用干细胞或祖细胞。根据本文提供的方法的实施方案，可潜在地使用可在体外分离和维持的任何干细胞和/或祖细胞(参见例如，PCT公布WO 94/08598；Stemple和Anderson，1992，Cell 7 1:973-985；Rheinwald，1980，Meth.Cell Bio.21A:229；以及Pittelkow和Scott，1986，Mayo Clinic Proc.61:771)。
在一个具体的实施方案中，为了基因治疗的目的而引入的核酸包含可操作地连接到编码区的诱导型启动子，使得核酸的表达可通过控制合适的转录诱导物的存在或不存在来控制。
5.8.诊断测定和方法
与本文提供的抗原免疫特异性结合的标记抗体及其衍生物和类似物可用于诊断目的以检测、诊断或监测疾病或病症。
本文提供的抗体可用于使用本文所述或本领域技术人员已知的经典免疫组织学方法测定生物样本中的抗原水平(例如，参见Jalkanen等人，1985，J.Cell.Biol.101:976-985；和Jalkanen等人，1987，J.Cell.Biol.105:3087-3096)。可用于检测蛋白质基因表达的其他基于抗体的方法包括免疫测定，诸如酶联免疫吸附测定(ELISA)和放射性免疫测定(RIA)。合适的抗体测定标记物是本领域已知的并且包括酶标记物，诸如葡萄糖氧化酶；放射性同位素，诸如碘(125I，121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、铟(121In)和锝(99Tc)；发光标记物，诸如鲁米诺；和荧光标记物，诸如荧光素和罗丹明，以及生物素。本文提供的一个方面是检测和诊断人的疾病或病症。
在本领域中应当理解，受试者的体型和所用的成像系统将决定产生诊断图像所需的成像部分的量。在放射性同位素部分的情况下，对于人类受试者，注射的放射性的量通常在约5毫居里至20毫居里的99Tc的范围内。然后，标记的抗体将在含有特定蛋白质的细胞的位置处积累。体内肿瘤成像描述于S.W.Burchiel等人，“Immunopharmacokinetics ofRadiolabeled Antibodies and Their Fragments”，(Tumor Imaging:The RadiochemicalDetection of Cancer第13章，S.W.Burchiel和B.A.Rhodes编辑，Masson Publishing Inc.(1982)。
取决于若干变量，包括所用标记物的类型和施用模式，施用后允许标记抗体在受试者体内的部位浓缩和允许未结合的标记抗体被清除至背景水平的时间间隔为6小时至48小时或6小时至24小时或6小时至12小时。在另一个实施方案中，施用后的时间间隔为5天至20天或5天至10天。
在一个实施方案中，疾病或病症的监测通过重复用于诊断疾病或病症的方法来进行，例如在初始诊断后一个月、初始诊断后六个月、初始诊断后一年等。
标记分子的存在可以使用本领域已知的用于体内扫描的方法在受试者体内检测到。这些方法取决于所用标记物的类型。技术人员将能够确定用于检测特定标记物的适当方法。可用于本文提供的诊断方法中的方法和装置包括但不限于计算机断层摄影(CT)、全身扫描诸如正电子发射断层摄影(PET)、磁共振成像(MRI)和超声波检查法。
在一个具体的实施方案中，分子用放射性同位素标记，并使用辐射响应外科器械在患者体内检测(Thurston等人，美国专利5,441,050)。在另一个实施方案中，分子用荧光化合物标记，并使用荧光响应扫描器械在患者体内检测。在另一个实施方案中，分子用正电子发射金属标记，并使用正电子发射断层摄影在患者体内检测。在另一个实施方案中，分子用顺磁性标记物标记，并使用磁共振成像(MRI)在患者体内检测。
5.9.试剂盒
本文还提供了试剂盒，该试剂盒包含包装到合适的包装材料中的本文提供的抗体(例如，抗NKG2d多特异性抗体或抗NKp46多特异性抗体)或其组合物(例如，药物组合物)。试剂盒任选地包括标签或包装说明书，该包装说明书包括组分的描述或其中组分的体外、体内或离体使用的说明。
术语“包装材料”是指容纳试剂盒的组分的物理结构。包装材料可以无菌地保持组分，并且可以由通常用于此类目的的材料(例如，纸、波纹纤维、玻璃、塑料、箔、安瓿、小瓶、管等)制成。
本文提供的试剂盒可包括标签或使用说明书。标签或使用说明书包括“印刷物质”，例如纸或纸板，单独或附着于组分、试剂盒或包装材料(例如盒)，或附着于例如含有试剂盒组分的安瓿、管或小瓶。标签或使用说明书可另外包括计算机可读介质，诸如盘(例如硬盘、卡、存储盘)、光盘(诸如CD或DVD-ROM/RAM、DVD、MP3、磁带)或电存储介质(诸如RAM和ROM)或这些的混合(诸如磁/光存储介质、FLASH介质或存储型卡)。标签或使用说明书可包括识别制造商信息、批号、制造商位置和日期的信息。
本文提供的试剂盒可另外包括其他组分。试剂盒的每个组分可被包封在单独的容器内，并且所有各种容器可在单个包装内。试剂盒也可设计用于冷藏。试剂盒还可设计成含有本文提供的抗体，或含有编码本文提供的抗体的核酸的细胞。试剂盒中的细胞可维持在合适的储存条件下直至准备使用。
本文还提供了与抗原(例如NKG2d或NKp46)免疫特异性结合的抗体面板。在具体的实施方案中，本文提供了具有不同的缔合速率常数、不同的解离速率常数、对抗原的不同亲和力和/或对抗原的不同特异性的抗体面板。在某些实施方案中，本文提供了为约10个，优选地约25个、约50个、约75个、约100个、约125个、约150个、约175个、约200个、约250个、约300个、约350个、约400个、约450个、约500个、约550个、约600个、约650个、约700个、约750个、约800个、约850个、约900个、约950个或约1000个抗体或更多的面板。抗体面板可用于例如96孔或384孔板中，诸如用于测定诸如ELISA。
除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管类似于或等同于本文所述的那些的方法和材料可用于本发明的实践或试验，但本文描述的是合适的方法和材料。
如本文所用，数值通常以范围形式贯穿本文件给出。范围形式的使用仅仅是为了方便和简洁，并且不应当被解释为对本发明范围的绝对的限制，除非上下文明确指出。因此，使用的范围明确地包括所有可能的子范围、该范围之内的所有单个数值以及所有数值或数值范围(包括此类范围之内的整数和该范围之内的数值的分数或整数)，除非上下文明确指出。无论范围的宽度如何，在贯穿本专利文件的所有上下文中，该构造都适用。因此，例如，提及90％至100％的范围包括91％至99％、92％至98％、93％至95％、91％至98％、91％至97％、91％至96％、91％至95％、91％至94％、91％至93％等。提及90％至100％的范围还包括91％、92％、93％、94％、95％、95％、97％等，以及91.1％、91.2％、91.3％、91.4％、91.5％等，以及92.1％、92.2％、92.3％、92.4％、92.5％等。
另外，提及1至3、3至5、5至10、10至20、20至30、30至40、40至50、50至60、60至70、70至80、80至90、90至100、100至110、110至120、120至130、130至140、140至150、150至160、160至170、170至180、180至190、190至200、200至225、225至250的范围包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20等。在另一个示例中，提及25至250、250至500、500至1,000、1,000至2,500、2,500至5,000、5,000至25,000、25,000至50,000的范围包括任何数值或者此类值以内或涵盖此类值的范围，例如25、26、27、28、29…250、251、252、253、254…500、501、502、503、504…等。
本文还使用的一系列范围在整篇文献中公开。一系列范围的使用包括上限和下限的组合以提供另一个范围。无论范围的宽度如何，在贯穿本专利文件的所有上下文中，该构造都适用。因此，例如，提及诸如5至10、10至20、20至30、30至40、40至50、50至75、75至100、100至150的一系列范围包括诸如5至20、5至30、5至40、5至50、5至75、5至100、5至150和10至30、10至40、10至50、10至75、10至100、10至150和20至40、20至50、20至75、20至100、20至150等的范围。
为了简洁起见，本文使用某些缩写。一个示例是表示氨基酸残基的单字母缩写。氨基酸及其对应的三字母和单字母缩写如下：
本文使用肯定语言来描述多个实施方案而总体上公开本发明。本发明还具体地包括其中完全或部分排除特定主题诸如物质或材料、方法步骤和条件、方案、程序、测定或分析的实施方案。因此，即使本发明通常不是按照本发明不包括的内容来表达的，但本文仍然公开了未明确包括在本发明中的方面。
已描述了本发明的多个实施方案。然而，应当理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可进行各种修改。因此，以下实施例旨在说明而非限制权利要求书中描述的发明的范围。
6.实施方案
本发明提供了以下非限制性实施方案。
在一组实施方案(A组实施方案)中，提供了：
A1.一种多特异性抗体，所述多特异性抗体包含：
(a)第一结合结构域，所述第一结合结构域与在自然杀伤(NK)细胞上表达的第一抗原结合；和
(b)第二结合结构域，所述第二结合结构域与第二抗原结合。
A2.根据实施方案A1所述的多特异性抗体，其中所述第一抗原是NK细胞活化受体。
A3.根据实施方案A2所述的多特异性抗体，其中该第一抗原是NKG2d。
A4.根据实施方案A3所述的多特异性抗体，其中该第一结合结构域包含：
(i)重链可变区(VH)，其包含：
(a)具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的VH CDR3；
(b)具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的VH CDR3；
(c)具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的VH CDR3；
(d)具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的VH CDR3；或
(e)具有SEQ ID NO:28的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:29的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:30的氨基酸序列的VH CDR3；
和
轻链可变区(VL)，其包含：
(a)具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的VL CDR3；
(b)具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VL CDR3；
(c)具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的VL CDR3；
(d)具有SEQ ID NO:25的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:27的氨基酸序列的VL CDR3；或
(e)具有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:32的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的VL CDR3；
或者
(ii)重链可变区(VH)，其包含：
(a)具有SEQ ID NO:36的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的VH CDR3；
(b)具有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的VH CDR3；
(c)具有SEQ ID NO:48的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:49的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:50的氨基酸序列的VH CDR3；
(d)具有SEQ ID NO:54的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:55的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:56的氨基酸序列的VH CDR3；或
(e)具有SEQ ID NO:60的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:61的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:62的氨基酸序列的VH CDR3；
和
轻链可变区(VL)，其包含：
(a)具有SEQ ID NO:39的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:40的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的VL CDR3；
(b)具有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:47的氨基酸序列的VL CDR3；
(c)具有SEQ ID NO:51的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:52的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:53的氨基酸序列的VL CDR3；
(d)具有SEQ ID NO:57的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:58的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:59的氨基酸序列的VL CDR3；或
(e)具有SEQ ID NO:63的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:64的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:65的氨基酸序列的VL CDR3。
A5.根据实施方案A4所述的多特异性抗体，其中所述第一结合结构域包含具有SEQID NO:2的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的VL，或者其中所述第一结合结构域包含：具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:35的氨基酸序列的VL。
A6.根据实施方案A2所述的多特异性抗体，其中该第一抗原是NKp46。
A7.根据实施方案A6所述的多特异性抗体，其中该第一结合结构域包含：
(i)重链可变区(VH)，其包含：
(a)具有SEQ ID NO:69的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:70的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的VH CDR3；
(b)具有SEQ ID NO:75的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:76的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:77的氨基酸序列的VH CDR3；
(c)具有SEQ ID NO:81的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:82的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:83的氨基酸序列的VH CDR3；
(d)具有SEQ ID NO:87的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:88的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:89的氨基酸序列的VH CDR3；或
(e)具有SEQ ID NO:93的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:94的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:95的氨基酸序列的VH CDR3；
和
(ii)轻链可变区(VL)，其包含：
(a)具有SEQ ID NO:72的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:73的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:74的氨基酸序列的VL CDR3；
(b)具有SEQ ID NO:78的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:79的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:80的氨基酸序列的VL CDR3；
(c)具有SEQ ID NO:84的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:85的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:86的氨基酸序列的VL CDR3；
(d)具有SEQ ID NO:90的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:91的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:92的氨基酸序列的VL CDR3；或
(e)具有SEQ ID NO:96的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:97的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:98的氨基酸序列的VL CDR3。
A8.根据实施方案A7所述的多特异性抗体，其中所述第一结合结构域包含：具有SEQ ID NO:67的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:68的氨基酸序列的VL。
A9.根据实施方案A1至A8中任一项所述的多特异性抗体，其中所述第二抗原位于细胞表面上。
A10.根据实施方案A1至A8中任一项所述的多特异性抗体，其中所述第二抗原在肿瘤细胞上表达。
A11.根据实施方案A10所述的多特异性抗体，其中所述第二抗原是肿瘤特异性抗原(TSA)或肿瘤相关抗原(TAA)。
A12.根据实施方案A10所述的多特异性抗体，其中所述第二抗原是BCMA。
A13.根据实施方案A10所述的多特异性抗体，其中所述第二抗原是GPRC5d。
A14.根据实施方案A1至A13中任一项所述的多特异性抗体，其中所述第一结合结构域是人源化的，所述第二结合结构域是人源化的，或者所述第一结合结构域和所述第二结合结构域两者均是人源化的。
A15.根据实施方案A1至A14中任一项所述的多特异性抗体，其中该多特异性抗体是IgG抗体。
A16.根据实施方案A15所述的多特异性抗体，其中该IgG抗体是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体。
A17.根据实施方案A16所述的多特异性抗体，其中该IgG抗体是IgG1抗体。
A18.根据实施方案A1至A17中任一项所述的多特异性抗体，其中该多特异性抗体是双特异性抗体。
A19.根据实施方案A18所述的多特异性抗体，其中所述双特异性抗体呈两脚台支架构型。
A20.根据实施方案A19所述的多特异性抗体，其中所述第一结合结构域是Fab区，并且所述第二结合结构域是scFv区。
A21.根据实施方案A18所述的多特异性抗体，其中所述双特异性抗体呈莫里森支架构型。
A22.根据实施方案A21所述的多特异性抗体，其中所述第一结合结构域包含两个Fab区，并且所述第二结合结构域包含两个scFv区。
A23.根据实施方案A10至A22中任一项所述的多特异性抗体，其中
所述多特异性抗体在体外以小于约500pM的IC50诱导所述肿瘤细胞的ΝK细胞依赖性细胞毒性。
A24.根据实施方案A10至A22中任一项所述的多特异性抗体，其中
所述多特异性抗体在体外以小于约300pM的IC50诱导所述肿瘤细胞的ΝK细胞依赖性细胞毒性。
A25.根据实施方案A10至A22中任一项所述的多特异性抗体，其中
所述多特异性抗体在体外以小于约100pM的IC50诱导所述肿瘤细胞的ΝK细胞依赖性细胞毒性。
A26.根据实施方案A10至A22中任一项所述的多特异性抗体，其中
所述多特异性抗体在体外以小于约50pM的IC50诱导所述肿瘤细胞的ΝK细胞依赖性细胞毒性。
A27.根据实施方案A10至A22中任一项所述的多特异性抗体，其中
所述多特异性抗体在体外以小于约20pM的IC50诱导所述肿瘤细胞的ΝK细胞依赖性细胞毒性。
A28.根据实施方案A10至A22中任一项所述的多特异性抗体，其中
所述多特异性抗体在体外以小于约15pM的IC50诱导所述肿瘤细胞的ΝK细胞依赖性细胞毒性。
A29.根据实施方案A10至A22中任一项所述的多特异性抗体，其中
所述多特异性抗体在体外以小于约10pM的IC50诱导所述肿瘤细胞的ΝK细胞依赖性细胞毒性。
A30.根据实施方案A23至A29中任一项所述的多特异性抗体，其中
用ΝK效应细胞和表达所述第二抗原的靶细胞的混合物评估所述IC50。
A31.根据实施方案A30所述的多特异性抗体，其中所述效应细胞与靶细胞的比率为约0.01:1至约5:1。
A32.根据实施方案A30所述的多特异性抗体，其中所述效应细胞与靶细胞的比率为约0.1:1至约2:1。
A33.根据实施方案A30所述的多特异性抗体，其中所述效应细胞与靶细胞的比率为约1:1。
A34.一种核酸，该核酸编码根据实施方案A1至A33中任一项所述的多特异性抗体。
A35.一种载体，该载体包含根据实施方案A34所述的核酸。
A36.一种宿主细胞，该宿主细胞包含根据实施方案A35所述的载体。
A37.一种试剂盒，该试剂盒包括根据实施方案A35所述的载体以及用于该载体的包装。
A38.一种结合NKG2d的抗体，所述抗体包含：
(i)重链可变区(VH)，其包含：
(a)具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的VH CDR3；
(b)具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的VH CDR3；
(c)具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的VH CDR3；
(d)具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的VH CDR3；或
(e)具有SEQ ID NO:28的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:29的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:30的氨基酸序列的VH CDR3；
和
轻链可变区(VL)，其包含：
(a)具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的VL CDR3；
(b)具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VL CDR3；
(c)具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的VL CDR3；
(d)具有SEQ ID NO:25的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:27的氨基酸序列的VL CDR3；或
(e)具有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:32的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的VL CDR3；
或者
(ii)重链可变区(VH)，其包含：
(a)具有SEQ ID NO:36的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的VH CDR3；
(b)具有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的VH CDR3；
(c)具有SEQ ID NO:48的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:49的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:50的氨基酸序列的VH CDR3；
(d)具有SEQ ID NO:54的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:55的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:56的氨基酸序列的VH CDR3；或
(e)具有SEQ ID NO:60的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:61的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:62的氨基酸序列的VH CDR3；
和
轻链可变区(VL)，其包含：
(a)具有SEQ ID NO:39的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:40的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的VL CDR3；
(b)具有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:47的氨基酸序列的VL CDR3；
(c)具有SEQ ID NO:51的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:52的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:53的氨基酸序列的VL CDR3；
(d)具有SEQ ID NO:57的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:58的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:59的氨基酸序列的VL CDR3；或
(e)具有SEQ ID NO:63的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:64的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:65的氨基酸序列的VL CDR3。
A39.根据实施方案A38所述的抗体，其中所述第一结合结构域包含具有SEQ IDNO:2的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的VL，或者其中所述第一结合结构域包含具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:35的氨基酸序列的VL。
A40.一种结合NKp46的抗体，所述抗体包含：
(i)重链可变区(VH)，其包含
(a)具有SEQ ID NO:69的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:70的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的VH CDR3；
(b)具有SEQ ID NO:75的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:76的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:77的氨基酸序列的VH CDR3；
(c)具有SEQ ID NO:81的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:82的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:83的氨基酸序列的VH CDR3；
(d)具有SEQ ID NO:87的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:88的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:89的氨基酸序列的VH CDR3；或
(e)具有SEQ ID NO:93的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:94的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:95的氨基酸序列的VH CDR3；
和
(ii)轻链可变区(VL)，其包含
(a)具有SEQ ID NO:72的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:73的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:74的氨基酸序列的VL CDR3；
(b)具有SEQ ID NO:78的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:79的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:80的氨基酸序列的VL CDR3；
(c)具有SEQ ID NO:84的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:85的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:86的氨基酸序列的VL CDR3；
(d)具有SEQ ID NO:90的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:91的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:92的氨基酸序列的VL CDR3；或
(e)具有SEQ ID NO:96的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:97的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:98的氨基酸序列的VL CDR3。
A41.根据实施方案A40所述的抗体，其中所述第一结合结构域包含具有SEQ IDNO:67的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:68的氨基酸序列的VL。
A42.一种核酸，该核酸编码根据实施方案A38至A41中任一项所述的抗体。
A43.一种载体，该载体包含根据实施方案A42所述的核酸。
A44.一种宿主细胞，该宿主细胞包含根据实施方案A43所述的载体。
A45.一种试剂盒，该试剂盒包括根据实施方案A43所述的载体以及用于该载体的包装。
在一组实施方案(B组实施方案)中，提供了：
B1.一种药物组合物，其包含多特异性抗体和药学上可接受的载体，
其中所述多特异性抗体包含：
(a)第一结合结构域，所述第一结合结构域与在自然杀伤(NK)细胞上表达的第一抗原结合；和
(b)第二结合结构域，所述第二结合结构域与第二抗原结合。
B2.根据实施方案B1所述的药物组合物，其中所述第一抗原是NK细胞活化受体。
B3.根据实施方案B2所述的药物组合物，其中所述第一抗原是NKG2d。
B4.根据实施方案B3所述的药物组合物，其中所述第一结合结构域包含：
(i)重链可变区(VH)，其包含：
(a)具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的VH CDR3；
(b)具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的VH CDR3；
(c)具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的VH CDR3；
(d)具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的VH CDR3；或
(e)具有SEQ ID NO:28的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:29的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:30的氨基酸序列的VH CDR3；
和
轻链可变区(VL)，其包含：
(a)具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的VL CDR3；
(b)具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VL CDR3；
(c)具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的VL CDR3；
(d)具有SEQ ID NO:25的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:27的氨基酸序列的VL CDR3；或
(e)具有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:32的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的VL CDR3；
或者
(ii)重链可变区(VH)，其包含：
(a)具有SEQ ID NO:36的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的VH CDR3；
(b)具有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的VH CDR3；
(c)具有SEQ ID NO:48的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:49的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:50的氨基酸序列的VH CDR3；
(d)具有SEQ ID NO:54的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:55的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:56的氨基酸序列的VH CDR3；或者
(e)具有SEQ ID NO:60的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:61的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:62的氨基酸序列的VH CDR3；
和
轻链可变区(VL)，其包含：
(a)具有SEQ ID NO:39的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:40的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的VL CDR3；
(b)具有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:47的氨基酸序列的VL CDR3；
(c)具有SEQ ID NO:51的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:52的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:53的氨基酸序列的VL CDR3；
(d)具有SEQ ID NO:57的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:58的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:59的氨基酸序列的VL CDR3；或者
(e)具有SEQ ID NO:63的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:64的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:65的氨基酸序列的VL CDR3。
B5.根据实施方案B4所述的药物组合物，其中所述第一结合结构域包含具有SEQID NO:2的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的VL，或者其中所述第一结合结构域包含：具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:35的氨基酸序列的VL。
B6.根据实施方案B2所述的药物组合物，其中该第一抗原是NKp46。
B7.根据实施方案B6所述的药物组合物，其中该第一结合结构域包含：
(i)重链可变区(VH)，其包含
(a)具有SEQ ID NO:69的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:70的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的VH CDR3；
(b)具有SEQ ID NO:75的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:76的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:77的氨基酸序列的VH CDR3；
(c)具有SEQ ID NO:81的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:82的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:83的氨基酸序列的VH CDR3；
(d)具有SEQ ID NO:87的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:88的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:89的氨基酸序列的VH CDR3；或者
(e)具有SEQ ID NO:93的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:94的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:95的氨基酸序列的VH CDR3；
和
(ii)轻链可变区(VL)，其包含
(a)具有SEQ ID NO:72的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:73的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:74的氨基酸序列的VL CDR3；
(b)具有SEQ ID NO:78的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:79的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:80的氨基酸序列的VL CDR3；
(c)具有SEQ ID NO:84的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:85的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:86的氨基酸序列的VL CDR3；
(d)具有SEQ ID NO:90的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:91的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:92的氨基酸序列的VL CDR3；或
(e)具有SEQ ID NO:96的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:97的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:98的氨基酸序列的VL CDR3。
B8.根据实施方案B7所述的药物组合物，其中所述第一结合结构域包含具有SEQID NO:67的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:68的氨基酸序列的VL。
B9.根据实施方案B1至B8中任一项所述的药物组合物，其中所述第二抗原位于细胞表面上。
B10.根据实施方案B1至B8中任一项所述的药物组合物，其中所述第二抗原在肿瘤细胞上表达。
B11.根据实施方案B10所述的药物组合物，其中所述第二抗原是肿瘤特异性抗原(TSA)或肿瘤相关抗原(TAA)。
B12.根据实施方案B10所述的药物组合物，其中所述第二抗原是BCMA。
B13.根据实施方案B10所述的药物组合物，其中所述第二抗原是GPRC5d。
B14.根据实施方案B1至B13中任一项所述的药物组合物，其中所述第一结合结构域是人源化的，所述第二结合结构域是人源化的，或者所述第一结合结构域和所述第二结合结构域两者均是人源化的。
B15.根据实施方案B1至B14中任一项所述的药物组合物，其中该多特异性抗体是IgG抗体。
B16.根据实施方案B15所述的药物组合物，其中该IgG抗体是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体。
B17.根据实施方案B16所述的药物组合物，其中该IgG抗体是IgG1抗体。
B18.根据实施方案B1至B17中任一项所述的药物组合物，其中该多特异性抗体是双特异性抗体。
B19.根据实施方案B18所述的药物组合物，其中所述双特异性抗体呈两脚台支架构型。
B20.根据实施方案B19所述的药物组合物，其中所述第一结合结构域是Fab区，并且所述第二结合结构域是scFv区。
B21.根据实施方案B18所述的药物组合物，其中所述双特异性抗体呈莫里森支架构型。
B22.根据实施方案B21所述的药物组合物，其中所述第一结合结构域包含两个Fab区，并且所述第二结合结构域包含两个scFv区。
B23.根据实施方案B10至B22中任一项所述的药物组合物，其中所述多特异性抗体在体外以小于约500pM的IC50诱导所述肿瘤细胞的NK细胞依赖性细胞毒性。
B24.根据实施方案B10至B22中任一项所述的药物组合物，其中所述多特异性抗体在体外以小于约300pM的IC50诱导所述肿瘤细胞的NK细胞依赖性细胞毒性。
B25.根据实施方案B10至B22中任一项所述的药物组合物，其中所述多特异性抗体在体外以小于约100pM的IC50诱导所述肿瘤细胞的NK细胞依赖性细胞毒性。
B26.根据实施方案B10至B22中任一项所述的药物组合物，其中所述多特异性抗体在体外以小于约50pM的IC50诱导所述肿瘤细胞的NK细胞依赖性细胞毒性。
B27.根据实施方案B10至B22中任一项所述的药物组合物，其中所述多特异性抗体在体外以小于约20pM的IC50诱导所述肿瘤细胞的NK细胞依赖性细胞毒性。
B28.根据实施方案B10至B22中任一项所述的药物组合物，其中所述多特异性抗体在体外以小于约15pM的IC50诱导所述肿瘤细胞的NK细胞依赖性细胞毒性。
B29.根据实施方案B10至B22中任一项所述的药物组合物，其中所述多特异性抗体在体外以小于约10pM的IC50诱导所述肿瘤细胞的NK细胞依赖性细胞毒性。
B30.根据实施方案B23至B29中任一项所述的药物组合物，其中用NK效应细胞和表达所述第二抗原的靶细胞的混合物评估所述IC50。
B31.根据实施方案B30所述的药物组合物，其中所述效应细胞与靶细胞的比率为约0.01:1至约5:1。
B32.根据实施方案B30所述的药物组合物，其中所述效应细胞与靶细胞的比率为约0.1:1至约2:1。
B33.根据实施方案B30所述的药物组合物，其中所述效应细胞与靶细胞的比率为约1:1。
在一组实施方案(C组实施方案)中，提供了：
C1.一种用于制备多特异性抗体的方法，所述方法包括向宿主细胞中引入一种或多种核酸，所述一种或多种核酸编码与在自然杀伤(NK)细胞上表达的第一抗原结合的第一结合结构域和与第二抗原结合的第二结合结构域。
C2.根据实施方案C1所述的方法，其中所述第一抗原是NK细胞活化受体。
C3.根据实施方案C2所述的方法，其中该第一抗原是NKG2d。
C4.根据实施方案C3所述的方法，其中该第一结合结构域包含：
(i)重链可变区(VH)，其包含
(a)具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的VH CDR3；
(b)具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的VH CDR3；
(c)具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的VH CDR3；
(d)具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的VH CDR3；或
(e)具有SEQ ID NO:28的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:29的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:30的氨基酸序列的VH CDR3；
和
轻链可变区(VL)，其包含
(a)具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的VL CDR3；
(b)具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VL CDR3；
(c)具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的VL CDR3；
(d)具有SEQ ID NO:25的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:27的氨基酸序列的VL CDR3；或者
(e)具有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:32的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的VL CDR3；
或者
(ii)重链可变区(VH)，其包含
(a)具有SEQ ID NO:36的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的VH CDR3；
(b)具有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的VH CDR3；
(c)具有SEQ ID NO:48的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:49的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:50的氨基酸序列的VH CDR3；
(d)具有SEQ ID NO:54的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:55的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:56的氨基酸序列的VH CDR3；或者
(e)具有SEQ ID NO:60的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:61的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:62的氨基酸序列的VH CDR3；
和
轻链可变区(VL)，其包含
(a)具有SEQ ID NO:39的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:40的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的VL CDR3；
(b)具有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:47的氨基酸序列的VL CDR3；
(c)具有SEQ ID NO:51的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:52的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:53的氨基酸序列的VL CDR3；
(d)具有SEQ ID NO:57的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:58的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:59的氨基酸序列的VL CDR3；或者
(e)具有SEQ ID NO:63的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:64的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:65的氨基酸序列的VL CDR3。
C5.根据实施方案C4所述的方法，其中所述第一结合结构域包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的VL，或者其中所述第一结合结构域包含：具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:35的氨基酸序列的VL。
C6.根据实施方案C2所述的方法，其中该第一抗原是NKp46。
C7.根据实施方案C6所述的方法，其中该第一结合结构域包含：
(i)重链可变区(VH)，其包含
(a)具有SEQ ID NO:69的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:70的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的VH CDR3；
(b)具有SEQ ID NO:75的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:76的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:77的氨基酸序列的VH CDR3；
(c)具有SEQ ID NO:81的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:82的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:83的氨基酸序列的VH CDR3；
(d)具有SEQ ID NO:87的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:88的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:89的氨基酸序列的VH CDR3；或者
(e)具有SEQ ID NO:93的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:94的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:95的氨基酸序列的VH CDR3；
和
(ii)轻链可变区(VL)，其包含
(a)具有SEQ ID NO:72的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:73的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:74的氨基酸序列的VL CDR3；
(b)具有SEQ ID NO:78的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:79的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:80的氨基酸序列的VL CDR3；
(c)具有SEQ ID NO:84的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:85的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:86的氨基酸序列的VL CDR3；
(d)具有SEQ ID NO:90的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:91的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:92的氨基酸序列的VL CDR3；或
(e)具有SEQ ID NO:96的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:97的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:98的氨基酸序列的VL CDR3。
C8.根据实施方案C7所述的方法，其中所述第一结合结构域包含具有SEQ ID NO:67的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:68的氨基酸序列的VL。
C9.根据实施方案C1至C8中任一项所述的方法，其中所述第二抗原位于细胞表面上。
C10.根据实施方案C1至C8中任一项所述的方法，其中所述第二抗原在肿瘤细胞上表达。
C11.根据实施方案C10所述的方法，其中所述第二抗原是肿瘤特异性抗原(TSA)或肿瘤相关抗原(TAA)。
C12.根据实施方案C10所述的方法，其中所述第二抗原是BCMA。
C13.根据实施方案C10所述的方法，其中所述第二抗原是GPRC5d。
C14.根据实施方案C1至C13中任一项所述的方法，其中所述第一结合结构域是人源化的，所述第二结合结构域是人源化的，或者所述第一结合结构域和所述第二结合结构域两者均是人源化的。
C15.根据实施方案C1至C14中任一项所述的方法，其中该多特异性抗体是IgG抗体。
C16.根据实施方案C15所述的方法，其中所述IgG抗体是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体。
C17.根据实施方案C16所述的方法，其中该IgG抗体是IgG1抗体。
C18.根据实施方案C1至C17中任一项所述的方法，其中该多特异性抗体是双特异性抗体。
C19.根据实施方案C18所述的方法，其中所述双特异性抗体呈两脚台支架构型。
C20.根据实施方案C19所述的方法，其中所述第一结合结构域是Fab区，并且所述第二结合结构域是scFv区。
C21.根据实施方案C18所述的方法，其中所述双特异性抗体呈莫里森支架构型。
C22.根据实施方案C21所述的方法，其中所述第一结合结构域包含两个Fab区，并且所述第二结合结构域包含两个scFv区。
C23.根据实施方案C10至C22中任一项所述的方法，其中所述多特异性抗体在体外以小于约500pM的IC50诱导所述肿瘤细胞的ΝK细胞依赖性细胞毒性。
C24.根据实施方案C10至C22中任一项所述的方法，其中所述多特异性抗体在体外以小于约300pM的IC50诱导所述肿瘤细胞的ΝK细胞依赖性细胞毒性。
C25.根据实施方案C10至C22中任一项所述的方法，其中所述多特异性抗体在体外以小于约100pM的IC50诱导所述肿瘤细胞的ΝK细胞依赖性细胞毒性。
C26.根据实施方案C10至C22中任一项所述的方法，其中所述多特异性抗体在体外以小于约50pM的IC50诱导所述肿瘤细胞的ΝK细胞依赖性细胞毒性。
C27.根据实施方案C10至C22中任一项所述的方法，其中所述多特异性抗体在体外以小于约20pM的IC50诱导所述肿瘤细胞的ΝK细胞依赖性细胞毒性。
C28.根据实施方案C10至C22中任一项所述的方法，其中所述多特异性抗体在体外以小于约15pM的IC50诱导所述肿瘤细胞的ΝK细胞依赖性细胞毒性。
C29.根据实施方案C10至C22中任一项所述的方法，其中所述多特异性抗体在体外以小于约10pM的IC50诱导所述肿瘤细胞的ΝK细胞依赖性细胞毒性。
C30.根据实施方案C23至C29中任一项所述的方法，其中用ΝK效应细胞和表达所述第二抗原的靶细胞的混合物评估所述IC50。
C31.根据实施方案C30所述的方法，其中所述效应细胞与靶细胞的比率为约0.01:1至约5:1。
C32.根据实施方案C30所述的方法，其中所述效应细胞与靶细胞的比率为约0.1:1至约2:1。
C33.根据实施方案C30所述的方法，其中所述效应细胞与靶细胞的比率为约1:1。
在一组实施方案(D组实施方案)中，提供了：
D1.一种将NK细胞引导至靶细胞的方法，所述方法包括使所述NK细胞与多特异性抗体接触，从而将所述NK细胞引导至所述靶细胞，其中所述多特异性抗体包含与NK细胞上的第一抗原结合的第一结合结构域和与靶细胞上的第二抗原结合的第二结合结构域。
D2.一种使NK细胞活化的方法，所述方法包括使所述NK与多特异性抗体接触，其中所述多特异性抗体包含与所述NK细胞上的第一抗原结合的第一结合结构域和与靶细胞上的第二抗原结合的第二结合结构域。
D3.一种抑制在细胞表面上表达第二抗原的靶细胞的生长或增殖的方法，所述方法包括使所述靶细胞与多特异性抗体接触，其中所述多特异性抗体包含与NK细胞上的第一抗原结合的第一结合结构域和与所述第二抗原结合的第二结合结构域。
D4.一种用于在受试者中消除表达第二抗原的靶细胞或治疗全部或部分地由表达所述第二抗原的靶细胞引起的疾病或病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的多特异性抗体，其中所述多特异性抗体包含与NK细胞上的第一抗原结合的第一结合结构域和与所述第二抗原结合的第二结合结构域。
D5.根据实施方案D4所述的方法，其中所述受试者是有需要的受试者。
D6.根据实施方案D4或实施方案D5所述的方法，其中所述受试者是人。
D7.根据实施方案D4至D6中任一项所述的方法，其中所述疾病或障碍为癌症。
D8.根据实施方案D7所述的方法，其中所述癌症是血癌。
D9.根据实施方案D7所述的方法，其中所述癌症是实体瘤癌症。
D10.根据实施方案D1至D9中任一项所述的方法，其中所述第一抗原是NK细胞活化受体。
D11.根据实施方案D10所述的方法，其中所述第一抗原是NKG2d。
D12.根据实施方案D11所述的方法，其中所述第一结合结构域包含：
(i)重链可变区(VH)，其包含
(a)具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的VH CDR3；
(b)具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的VH CDR3；
(c)具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的VH CDR3；
(d)具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的VH CDR3；或
(e)具有SEQ ID NO:28的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:29的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:30的氨基酸序列的VH CDR3；
和
轻链可变区(VL)，其包含
(a)具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的VL CDR3；
(b)具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VL CDR3；
(c)具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的VL CDR3；
(d)具有SEQ ID NO:25的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:27的氨基酸序列的VL CDR3；或者
(e)具有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:32的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的VL CDR3；
或者
(ii)重链可变区(VH)，其包含
(a)具有SEQ ID NO:36的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的VH CDR3；
(b)具有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的VH CDR3；
(c)具有SEQ ID NO:48的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:49的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:50的氨基酸序列的VH CDR3；
(d)具有SEQ ID NO:54的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:55的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:56的氨基酸序列的VH CDR3；或者
(e)具有SEQ ID NO:60的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:61的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:62的氨基酸序列的VH CDR3；
和
轻链可变区(VL)，其包含
(a)具有SEQ ID NO:39的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:40的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的VL CDR3；
(b)具有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:47的氨基酸序列的VL CDR3；
(c)具有SEQ ID NO:51的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:52的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:53的氨基酸序列的VL CDR3；
(d)具有SEQ ID NO:57的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:58的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:59的氨基酸序列的VL CDR3；或者
(e)具有SEQ ID NO:63的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:64的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:65的氨基酸序列的VL CDR3。
D13.根据实施方案D12所述的方法，其中所述第一结合结构域包含具有SEQ IDNO:2的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的VL，或者其中所述第一结合结构域包含具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:35的氨基酸序列的VL。
D14.根据实施方案D10所述的方法，其中所述第一抗原是NKp46。
D15.根据实施方案D14所述的方法，其中所述第一结合结构域包含：
(i)重链可变区(VH)，其包含
(a)具有SEQ ID NO:69的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:70的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的VH CDR3；
(b)具有SEQ ID NO:75的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:76的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:77的氨基酸序列的VH CDR3；
(c)具有SEQ ID NO:81的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:82的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:83的氨基酸序列的VH CDR3；
(d)具有SEQ ID NO:87的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:88的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:89的氨基酸序列的VH CDR3；或者
(e)具有SEQ ID NO:93的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:94的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:95的氨基酸序列的VH CDR3；
和
(ii)轻链可变区(VL)，其包含
(a)具有SEQ ID NO:72的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:73的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:74的氨基酸序列的VL CDR3；
(b)具有SEQ ID NO:78的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:79的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:80的氨基酸序列的VL CDR3；
(c)具有SEQ ID NO:84的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:85的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:86的氨基酸序列的VL CDR3；
(d)具有SEQ ID NO:90的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:91的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:92的氨基酸序列的VL CDR3；或
(e)具有SEQ ID NO:96的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:97的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:98的氨基酸序列的VL CDR3。
D16.根据实施方案D15所述的方法，其中所述第一结合结构域包含具有SEQ IDNO:67的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:68的氨基酸序列的VL。
D17.根据实施方案D1至D16中任一项所述的方法，其中所述第二抗原位于细胞表面上。
D18.根据实施方案D1至D17中任一项所述的方法，其中所述第二抗原在肿瘤细胞上表达。
D19.根据实施方案D18所述的方法，其中所述第二抗原是肿瘤特异性抗原(TSA)或肿瘤相关抗原(TAA)。
D20.根据实施方案D19所述的方法，其中所述第二抗原是BCMA。
D21.根据实施方案D19所述的方法，其中所述第二抗原是GPRC5d。
D22.根据实施方案D1至D21中任一项所述的方法，其中所述第一结合结构域是人源化的，所述第二结合结构域是人源化的，或者所述第一结合结构域和所述第二结合结构域两者均是人源化的。
D23.根据实施方案D1至D21中任一项所述的方法，其中该多特异性抗体是IgG抗体。
D24.根据实施方案D23所述的方法，其中所述IgG抗体是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体。
D25.根据实施方案D24所述的方法，其中该IgG抗体是IgG1抗体。
D26.根据实施方案D1至D25中任一项所述的方法，其中该多特异性抗体是双特异性抗体。
D27.根据实施方案D26所述的方法，其中所述双特异性抗体呈两脚台支架构型。
D28.根据实施方案D27所述的方法，其中所述第一结合结构域是Fab区，并且所述第二结合结构域是scFv区。
D29.根据实施方案D26所述的方法，其中所述双特异性抗体呈莫里森支架构型。
D30.根据实施方案D29所述的方法，其中所述第一结合结构域包含两个Fab区，并且所述第二结合结构域包含两个scFv区。
D31.根据实施方案D18至D30中任一项所述的方法，其中所述多特异性抗体在体外以小于约500pM的IC50诱导所述肿瘤细胞的NK细胞依赖性细胞毒性。
D32.根据实施方案D18至D30中任一项所述的方法，其中所述多特异性抗体在体外以小于约300pM的IC50诱导所述肿瘤细胞的NK细胞依赖性细胞毒性。
D33.根据实施方案D18至D30中任一项所述的方法，其中所述多特异性抗体在体外以小于约100pM的IC50诱导所述肿瘤细胞的NK细胞依赖性细胞毒性。
D34.根据实施方案D18至D30中任一项所述的方法，其中所述多特异性抗体在体外以小于约50pM的IC50诱导所述肿瘤细胞的NK细胞依赖性细胞毒性。
D35.根据实施方案D18至D30中任一项所述的方法，其中所述多特异性抗体在体外以小于约20pM的IC50诱导所述肿瘤细胞的NK细胞依赖性细胞毒性。
D36.根据实施方案D18至D30中任一项所述的方法，其中所述多特异性抗体在体外以小于约15pM的IC50诱导所述肿瘤细胞的NK细胞依赖性细胞毒性。
D37.根据实施方案D18至D30中任一项所述的方法，其中所述多特异性抗体在体外以小于约10pM的IC50诱导所述肿瘤细胞的NK细胞依赖性细胞毒性。
D38.根据实施方案D31至D37中任一项所述的方法，其中用NK效应细胞和表达所述第二抗原的靶细胞的混合物评估所述IC50。
D39.根据实施方案D38所述的方法，其中所述效应细胞与靶细胞的比率为约0.01:1至约5:1。
D40.根据实施方案D38所述的方法，其中所述效应细胞与靶细胞的比率为约0.1:1至约2:1。
D41.根据实施方案D38所述的方法，其中所述效应细胞与靶细胞的比率为约1:1。
在一组实施方案(E组实施方案)中，提供了：
E1.一种分子，所述分子包含用于接合或活化自然杀伤(NK)细胞的第一工具和用于结合肿瘤细胞的第二工具，其中所述分子能够诱导针对所述肿瘤细胞的NK细胞依赖性细胞毒性。
E2.根据实施方案E1所述的分子，其中所述第一工具包含与在NK细胞上表达的第一抗原结合的第一结合结构域，并且所述第二工具包含与在肿瘤细胞上表达的第二抗原结合的第二结合结构域。
E3.根据实施方案E2所述的分子，其中所述第一抗原是NK细胞活化受体。
E4.根据实施方案E2所述的分子，其中所述第一抗原是NKG2d。
E5.根据实施方案E2所述的分子，其中所述第一抗原是NKp46。
E6.根据实施方案E2所述的分子，其中所述第二抗原是肿瘤特异性抗原(TSA)或肿瘤相关抗原(TAA)。
E7.根据实施方案E6所述的分子，其中所述第二抗原是BCMA。
E8.根据实施方案E6所述的分子，其中所述第二抗原是GPRC5d。
E9.一种用于制备与多于一个靶分子结合的分子的方法，所述方法包括：用于执行获得能够与NK细胞上的第一抗原结合的结合结构域的功能的步骤；用于执行获得能够与肿瘤细胞上的第二抗原结合的结合结构域的功能的步骤；以及用于执行提供能够与所述第一抗原和所述第二抗原结合的分子的功能的步骤。
E10.一种将NK细胞引导至靶细胞的方法，所述方法包括使所述NK细胞与根据实施方案E1至E8中任一项所述的分子接触。
E11.一种使NK细胞活化的方法，所述方法包括使所述NK与根据实施方案E1至E8中任一项所述的分子接触。
E12.一种抑制靶细胞的生长或增殖的方法，所述方法包括使所述靶细胞与根据实施方案E1至E8中任一项所述的分子接触。
E13.一种用于在受试者中消除表达第二抗原的靶细胞或治疗全部或部分地由表达所述第二抗原的靶细胞引起的疾病或病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据实施方案E1至E8中任一项所述的分子。
本文描述了本发明的特定实施方案。在阅读前述描述后，所公开的实施方案的变型对于本领域的技术人员来说可能变得显而易见，并且预期那些技术人员可适当地采用此类变型。因此，本发明旨在以不同于本文具体描述的方式实践，并且本发明包括在适用法律允许的情况下在所附权利要求中记载的主题的所有修改和等同物。此外，除非本文另有说明或以其它方式与上下文明显矛盾，否则在其所有可能变型中的上述元素的任何组合均涵盖于本发明中。已描述了本发明的多个实施方案。然而，应当理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可进行各种修改。因此，实施例部分中的描述旨在说明而非限制权利要求书中描述的本发明的范围。
7.实施例
7.1实施例1：结合NK细胞的抗NKG2D抗体的产生
7.1.1.通过免疫生产抗NKG2D抗体(NKGB125)。
为了获得用于人NKG2d的结合物，通过用NKGW1(NKG2d80-216胞外结构域)免疫来进行抗体发现。用人NKGW1对OmniRat进行免疫(表1)，并在7周内通过每周免疫进行强化，之后从安乐死的动物收集血清。
表1.用于免疫的抗原
无菌地收获并合并腹股沟淋巴结和腘窝淋巴结。还收获来自所有8只动物的下颌淋巴结。从2只动物将全血收集到RNA管中。还将来自这2只动物的股骨的骨髓收集到冷的无菌1×PBS(HYB：212，Jen Pitcher ELN：NKG2d-00011)中。测量血清滴度以确定对免疫的免疫应答(图1)。
将来自免疫大鼠的总淋巴细胞合并为两组，并将活细胞计数测量为约60％(HaiSheng，ELN：NKG2d-00023)。通过离心收集细胞。收集融合比为1:1的FO细胞。简言之，非分泌性Balb/c小鼠骨髓瘤融合伴侣FO细胞的细胞库获自通过Janssen's Cell BiologyServices(CBS)贮存的ATCC(目录号：CRL-1646)。接收一个冷冻小瓶，并将其放入使用DMEM+glutamax(Invitrogen目录号：10569，批号：1676884)/10％FBS(Invitrogen 16140，批次1671884)的培养物中。每隔几天以1:2至1:10进行分裂，将细胞保持在对数期。通过离心收集细胞，在1×PBS中洗涤一次并计数，将存活率为96.4％的5×107个细胞的FO用于各组融合。将淋巴细胞和FO细胞一起添加并在1×PBS中洗涤，弃去上清液，并通过轻弹将细胞沉淀物重悬。向每个混合的细胞群体中添加1mL 37℃PEG 4000(2g PEG(EMD目录号：9727.2)、2mL DMEM(Invitrogen目录号11995，批号：1676884)、400μL DMSO(sigma D2650)/108个细胞(最大1mL)。将细胞混合物在37℃水浴中涡旋一分钟。在一分钟内添加37℃DMEM+Glutamax(Invitrogen目录号：11995，批号：1676884)(40mL)以停止反应。将细胞在室温下静置5分钟，然后离心，以收集细胞沉淀物。将细胞重悬于MediumE(StemCell Technologies目录号：15A60952，批号：15F64268)+HAT(Gibco目录号：21060-017)中，然后以200μL/孔平板接种，从而产生1.13×104个淋巴细胞/孔。将细胞在37℃、5％CO2下温育7天。然后将细胞用200μL新鲜培养基(StemCell Technologies目录号：03805，批号：15A60952)再喂养。
使用固定化的人和食蟹猴NKG2d对上清液(Mike Miller，ELN：NKG2d Oncology-00001)进行基于ELISA的筛选测定。对于固定化抗原形式，简言之，用50μg/孔的1μg/mLNKG2d包被板。通过添加200μL/孔的0.4％BSA-PBS将板封闭，并在4℃下温育过夜，然后使用300μL/孔的1×PBS+0.02％Tween 20洗涤三次。然后将50μL测试上清液和培养基对照添加到孔中，在室温下温育1小时。添加50μL/孔的来自AFP2016.017.JP的混合血清(在封闭缓冲液中1:2000稀释)作为阳性对照。向背景对照孔中添加FO培养基(50μL/孔)。将孔在1×PBS+0.02％Tween 20中洗涤3次，然后添加50μL/孔的山羊抗鼠IgG Fc-HRP(在封闭缓冲液中1:10K稀释的Jackson目录号：112-036-071)，在室温下温育30分钟，在1×PBS+0.02％Tween20中洗涤3次，添加50μL/孔的TMB底物缓冲液(Thermo目录号：34022)并在黑暗中温育约10分钟，然后通过向所有孔中添加25μL/孔的4N H2SO4来停止反应。使用Biotek(Gen5软件)在450nm处读板。选择OD值大于培养基背景对照的2倍平均值的命中物，用于与人NKG2d的结合确认。
总之，筛选来自95个融合板的培养上清液中与人NKG2d结合的抗体。以两种ELISA形式筛选上清液；直接包被的NKG2d和生物素化的NKG2d。使用R分析法分析两种初筛的ELISA数据，并为每种形式生成单独的板图。去除两个命中物板图之间的重复命中物，以生成最终编译的板图，其由用于结合确认的259个命中物组成。去除两个命中物之间的重复命中物，以生成168个经确认的人NKG2d特异性命中物的最终列表(表2)。对命中物与食蟹猴NKG2d的交叉反应性结合(在MPB移交后)进行表征。以两种形式筛选抗原：直接包被和生物素化。将阳性结合确定为OD值大于2倍平均背景对照。在两种测定形式(直接包被的抗原和/或生物素化的抗原)中的至少一种中，168个命中物中的163个具有与食蟹猴NKG2d蛋白的交叉反应性。
表2.针对人NKG2d的杂交瘤命中物的总结
从来源于用人NKG2d(Maria MacWilliams，ELN：Biologics Research Requests–2016-00387)免疫的OmniRat的NKGY1融合杂交瘤中分离出RNA。将RNA用作模板以在逆转录酶反应中制备cDNA，然后将cDNA用作模板以用于Ig可变区的PCR扩增。简言之，首先将板以500×g离心5分钟。轻弹掉培养基，并将板轻轻地放置成与清洁区域接触，以去除附加的培养基。重复这些步骤以从孔中去除残留的培养基。向每个孔中添加140μL RLT+143mM 2-巯基乙醇。将板在工作台表面上快速前后移动10秒，然后转动90度并再次振荡10秒。使用RNeasy 96方案在Qiagen Biorobot 8000上分离RNA(关于程序信息，参见Metadata标签中的RNeasy 96Biorobot 8000试剂盒)。在RLT+BME细胞裂解步骤后立即开始自动化程序。最终洗脱体积为100μL。BioMek机器人将8μL的每个RNA样品转移至微量滴定板用于cDNA合成，并将80μL转移至微量滴定板。将8μL等分试样立即用作cDNA合成的模版。将80μL板各自用密封膜覆盖，然后包裹在箔片中。将这些板保存在-80℃下。为了制备cDNA，根据制造商的说明书使用Invitrogen Superscript III First Strand Synthesis System(目录号：18080-051)。简言之，在20μL反应中使用8μL的RNA。基因特异性引物(vH、vK和vL mRNA各一个)靶向抗体可变区。为了检测抗体基因mRNA并确定所表达的抗体链上存在的可变区的序列，进行了PCR。对于每个杂交瘤，进行两个单独的反应：一个用于IgG重链，一个用于λ轻链。将反应的引物序列列在RT-PCR标签的子标签中。将Platinum Pfx聚合酶(Invitrogen目录号：11708-021)用于改编自制造商的程序中。免疫的动物仅产生λ轻链，因此不进行κ反应。进行琼脂糖凝胶分析以确认PCR产物的存在。基于与人和食蟹猴NKG2d的特异性结合来选择克隆NKGY1_045_F04。
总之，在128个杂交瘤中，约125个具有可见的vH和vL PCR产物。通过桑格测序(Sanger sequencing)对样品进行测序以获得v区序列，然后将v区克隆到人IgG1σ和λ恒定区中。克隆NKGY1_045_F04由此获得mAb标识符NKGB125。下表3中提供了NKGB125的可变区序列。表4中提供了NKGB125的CDR序列。以2mL规模表达抗体面板，并且NKGB125给出0.37mg的最终抗体，其落入抗体产率的约前6％内(Mike Diem，ELN：Biologics Research Requests–2016-00739)并且单体为约97％(Ed Swift，ELN：Biologics Research Requests-2016-00796)。
表3.NKGB125的V区
表4.NKGB125的CDR氨基酸序列
7.1.2.通过在NKL细胞系上免疫获得的抗NKG2D抗体的结合活性的测定
针对结合表达NKG2d的NKL细胞的能力筛选抗体面板(Lamar Blackwell，ELN：NKG2d-00048)。简言之，洗涤细胞并以1×106个细胞/ml重悬于PBS中，向其中添加1μL绿色live-dead染色(L-23101Thermo)，并将细胞以100μL/孔在4℃下平板接种30分钟。将细胞重悬于200μL染色缓冲液中，旋转400g，持续5分钟，并用50μL的NKG2d抗体或同种型对照(两者均在PBS中稀释，浓度分别为60nM、6nM和0.6nM)进行处理。将板在4℃下温育1小时。然后将细胞重悬于150μL染色缓冲液中，旋转400g，持续5分钟，轻弹，重悬于200μL染色缓冲液中，旋转400g，持续5分钟，并将PBS中的山羊抗hu-Fc AF647(Jackson109-606-098，批次122473)添加至2μg/ml，并在4℃下添加50μL/孔，持续30分钟。在自动进样器(通过Intellicyte)上获得样品。使用ForeCytTM筛选软件分析数据。使用来自ForCyte的几何平均荧光强度(geomeans)值进行分析(表5)。没有抗体显示出与不表达NKG2d的HEK293细胞的显著结合。
表5.对抗NKG2d抗体结合NKL细胞的能力的分析。(Lamar Blackwell，ELN：NKG2d-
00048)
/>
总之，10种抗体展示出与NKL细胞的剂量依赖性、NKG2d特异性结合：NKGB129、NKGB130、NKGB138、NKGB125、NKGB221、NKGB206、NKGB200、NKGB202、NKGB203和NKGB219(表5)。
7.1.3.通过筛选噬菌体展示文库产生抗NKG2D抗体(NKGB83)
为了获得用于人NKG2d的结合物，通过筛选噬菌体展示文库(Rama Reddy，ELN：Biologics Research Requests-2016-00137)进行抗体发现。使用的文库是：从头Fab-pIX噬菌体文库(WO 2009/085462 A1)。
从头Fab-pIX噬菌体文库(WO 2009/085462 A1)：
V2.1–重链(1-69、3-23、5-51)；种系轻链(A27、B3、L6、012)
V3.0–重链(1-69、3-23、5-51)；多样化轻链(A27、B3、L6、012)通过重链，例如{1-69+(A27、B3、L6、012)}合并100uL的每个文库，以生成6个文库池
V5.0–克隆重链(1-69、3-23、5-51)；种系轻链(A27、B3、L6、012)
(ELN：从头2010噬菌体文库SRI-005、从头2010噬菌体文库SRI-006和从头2010噬菌体文库SRI-007)
从每个Hc/Lc对的每个H3长度合并10uL文库，从而得到110μL的噬菌体文库用于淘洗。然后合并每个HC对，从而得到3个文库用于淘选。
简言之，将抗体文库展示在PIX噬菌体的表面上，并通过基于ELISA的与固定化人生物素化NKGW1的结合来选择菌落。
将噬菌体在大肠杆菌中扩增，并使用桑格方法通过v区进行测序。总体而言，45个独特的抗体v区被鉴定为能够结合NKG2d。然后将V区克隆到沉默人IgG1/κ恒定区中，并以2mL规模表达。
7.1.4.通过在NKL细胞系上筛选噬菌体展示文库获得的抗NKG2D抗体的结合活性的测定
以与实施例1.2中的抗体相同的方式测试抗体结合NKL细胞(Lamar Blackwell，ELN：NKG2d-00035)的能力(表6)。
表6.对抗NKG2d抗体结合NKL细胞的能力的分析。(Lamar Blackwell，ELN：NKG2d-
00048)
/>
总之，11种抗体显示出与NKL细胞的显著特异性结合：NKGB108、NKGB116、NKGB83、NKGB95、NKGB99、NKGB100、NKGB88、NKGB93、NKGB75、NKGB98和NKGB102。
下表7中提供了NKGB83的可变区序列。表8中提供了NKGB83的CDR序列。
表7.NKGB83的V区
表8.NKGB83的CDR氨基酸序列
7.1.5.通过免疫和筛选针对NKG2D的噬菌体展示文库获得的抗NKG2D抗体的结合活性的测定
然后将通过免疫(HYB：212)和通过噬菌体展示(APD182)获得的靶向NKG2d的抗体组合到单个面板中，然后测试针对人和食蟹猴NKG2d的结合亲和力，其通过表面等离子共振测量(JOSEPH Bourghol，ELN：NKG2d-00074)(表9)。
表9.抗NKG2d抗体对人和食蟹猴NKG2d的结合亲和力
总之，7种抗体对人和食蟹猴NKG2d展示出比1nM更紧密的亲和力：NKGB125、NKGB130、NKGB203、NKGB204、NKGB206、NKGB219和NKGB221。NKGB83展示出较弱的亲和力(KD为约8nM)。
7.2实施例2：抗NKG2D抗体的功能测定
将通过免疫(HYB：212)和噬菌体展示(APD182)获得的靶向NKG2d的抗体组合到单个面板中，然后通过测量IFNg产生来测试它们活化NK细胞的能力。图2示出了通过交联活化受体的基于珠的NK细胞激动测定。
使用磁体将2000μL的珠在2mL-5mL PBS/2％FBS中洗涤两次，然后重悬于2000μLPBS中。然后将1000μL经洗涤的珠等分到falcon管中，并以1:10稀释。总体积为10mL。然后将10μL经稀释的珠等分到测定板中。将100μL抗体添加到含有10μL珠的测定板中。将得到的复合物在4℃下摇动温育120分钟。使用磁体将珠在200μL PBS中洗涤三次，然后重悬于测定培养基中。将测定培养基中的10μL珠等分到96孔的指定孔中，并且每孔添加1×10e5个NK细胞。每孔的总体积为200μL。将板在37℃/5％CO2下温育16-24小时，然后以1300RPMI旋转3分钟。收集上清液用于IFNg生产测量。
总之，基于IFNg生产的诱导(表10)，总共11种抗体(4种来自OMT大鼠，7种来自噬菌体展示)展示出活化NK细胞的能力：使用OMT大鼠发现NKGB125、NKGB130、NKGB208、NKGB202，并且使用噬菌体展示发现NKGB116、NKGB83、NKGB89、NKGB90、NKGB99、NKGB63、NKGB65。
表10.对抗NKG2d抗体活化NK细胞的能力的分析
其中，NKGB125和NKGB83展示出高水平的活化。尽管一些抗体展示出更高的诱导，但这两种抗体还展示出更高水平的细胞结合，这表明它们将更适合于体内细胞结合。
7.3实施例3：结合NK细胞的抗NKP46抗体的产生
7.3.1.通过免疫产生抗NKp46抗体(N46B105)
为了获得用于人NKp46的结合物，通过免疫进行抗体发现。用于免疫的人NKp46是5T4，购自R&D systems(目录号1850-N)。
用人NKp46(表11，R&D systems目录号：1850-NK)对OmniRat进行免疫，并在8周内通过每周两次免疫进行强化，之后从安乐死的动物收集血清(Jen Pitcher，ELN：OncologyTargetDiscovery-00192)。
表11.用于免疫的抗原
如上所述获得淋巴结。测量血清滴度以确定对免疫的免疫应答(图3)。
收获淋巴结和全血，并如上所述生成杂交瘤(Mike Miller，ELN：Oncology TargetDiscovery-00217)。简言之，将淋巴细胞从淋巴结中提取出来，并与FO细胞融合以生成杂交瘤。生成100个融合板。平均融合效率为150％。淋巴细胞也从全血中获得，并与FO细胞融合以生成杂交瘤。生成10个融合板。平均融合效率为78％。筛选来自110个融合板的培养上清液中与NKp46结合的抗体。使用R分析法分析ELISA数据，并基于组合的命中物列表产生797个命中物(使用R中值抛光命中物和2倍背景)。R分析法生成用于结合确认的264个命中物的板图。总体而言，将来自初筛的264个命中物再次筛选，以确认与NKp46的结合，并且针对B7-H6/Fc进行交叉筛选。258个命中物(97％)被确认为免疫原NKp46的阳性结合物。117个(在258个中；45％)证实了结合物特异性结合至NKp46，与B7-H6/Fc的Fc部分没有交叉反应性。由于HitGroup排名"1的数量较多，将来自初筛的附加的158个命中物再次筛选，以确认与NKp46的结合，并且针对B7-H6/Fc进行交叉筛选。153个命中物(97％)被确认为免疫原NKp46的阳性结合物。91个(在153个中；59％)证实结合物特异性结合至NKp46，与GITR/Fc的Fc部分没有交叉反应性。总之，208个证实了NKp46的特异性结合物，与B7-H6/Fc或GITR/Fc的Fc部分没有交叉反应性。在将命中物扩增到48孔板中后，通过目视检查鉴定169个汇合的杂交瘤，并将其移交进行v区克隆和测序。制备安全冷冻。从初始面板中去除生长缓慢的杂交瘤，并在移交之前使其达到更高的汇合度。在另一轮结合确认后，在第二轮v区克隆中提供35个附加的命中物。制备安全冷冻。总之，将针对NKp46的总共204个特异性结合物移交用于v区测序(Req8788和Req8799)。总共回收168个抗体序列(Lauren Peters，ELN：BiologicsResearch Requests-2015-00839)并以2mL规模表达。
通过ELISA(Lamar Blackwell，ELN：ADIPOR-00126)测试抗体结合重组NKp46的能力。简言之，将重组NKp46在PBS中稀释至2μg/ml，并在4℃下添加50μL/孔过夜。用PBS洗涤板，并添加50μL的封闭缓冲液(PBS 0.4％BSA)。将板在室温下振荡30分钟。再次用PBS洗涤板，并将50μL的15ug/ml NKp46抗体添加到孔中。将板在室温下振荡30分钟。用PBS洗涤板，并添加50μL山羊抗人κ和λ二级抗体。将板在室温下振荡30分钟。用PBS洗涤板，并添加50μL的Sigma底物，在室温下温育2-4分钟。然后添加50μL的停止溶液。在Envision上在450nm处读板，用于ELISA。总共有28种抗体展示出显著的结合。
7.3.2.通过在NKL细胞系上免疫获得的抗NKp46抗体的结合活性的测定
然后如上所述评估抗体结合NKL细胞的能力(Lamar Blackwell，ELN：NKG2d-00022)。总体而言，104种抗体展示出与NKL细胞的显著结合(表12)。
表12.通过抗NKp46抗体的NKL细胞结合
/>
/>
/>
/>
7.3.3.抗NKP46抗体针对N46W3(NKP46 D1)的结合活性的测定
另外测试抗体结合重组全长NKp46:N46W1和NKp46 D1:N46W3的能力(表13)(Sanjib Dutta，ELN：NKG2d-00026)。N46B105和N46B76展示出与N46W3的特异性结合，该N46W3仅含有NKp46的结构域1，其中KD值分别为3.5nM和70nM(表13)。
表13.抗NKp46抗体对N46W3的结合亲和力
/>
/>
/>
/>
/>
下表14中提供了N46B105的可变区序列。表15中提供了N46B105的CDR序列。
表14.N46B105的V区
表15.N46B105的CDR氨基酸序列
7.4实施例4：双特异性抗体的产生
使用抗BCMA或抗GPRC5d scFv生成BsAb(表16)。将该分子形式化为莫里森支架抗体，其含有两组相同的结合NK细胞的Fab区和靶向C-末端肿瘤的scFv部分。还将该分子形式化为两脚台支架抗体，其包含靶向肿瘤的scFv和结合NK细胞的Fab区。使用正常IgG1生成所有分子，抗体的构型显示在图4中。
表16.bsAb的描述
| 名称 | NK衔接器 | 肿瘤抗原 | 恒定区 |
| NG2BB22 | NKGB125 | BCMB519 | IgG1 |
| NG2BB21 | NKGB83 | BCMB519 | IgG1 |
| N46BB6 | N46B105 | BCMB519 | IgG1 |
| NG2BB10 | NKGB125 | BCMB519 | IgG1 |
| NG2BB9 | NKGB83 | BCMB519 | IgG1 |
| N46BB4 | N46B105 | BCMB519 | IgG1 |
| NG2GB19 | NKGB125 | GC5B680N68S，S69T | IgG1 |
| NG2GB16 | NKGB83 | GC5B680N68S，S69T | IgG1 |
| N46GB9 | N46B105 | GC5B680N68S，S69T | IgG1 |
| NG2GB23 | NKGB125 | GC5B680N68S，S69T | IgG1 |
| NG2GB24 | NKGB83 | GC5B680N68S，S69T | IgG1 |
| N46GB6 | N46B105 | GC5B680N68S，S69T | IgG1 |
下表17中提供了抗BCMA抗体的可变区序列。表18中提供了抗BCMA抗体的CDR序列。
表17.抗BCMA抗体的VH和VL氨基酸序列
表18.抗BCMA抗体的CDR氨基酸序列
下表19中提供了抗GPRC5d抗体的可变区序列。表20中提供了抗GPRC5d抗体的CDR序列。
表19.抗GPRC5d抗体的VH和VL氨基酸序列
表20.抗GPRC5d抗体的CDR氨基酸序列
下表21和表22中提供了示例性双特异性抗体的序列(包括图4中的那些)。
表21.bsAb的VH和VL序列
| 名称 | VH1 | VL1 | VH2 | VL2 |
| N46BB4 | SEQ ID NO:67 | SEQ ID NO:68 | SEQ ID NO:99 | SEQ ID NO:100 |
| N46BB6 | SEQ ID NO:67 | SEQ ID NO:68 | SEQ ID NO:99 | SEQ ID NO:100 |
| N46GB6 | SEQ ID NO:67 | SEQ ID NO:68 | SEQ ID NO:131 | SEQ ID NO:132 |
| N46GB9 | SEQ ID NO:67 | SEQ ID NO:68 | SEQ ID NO:131 | SEQ ID NO:132 |
| NG2BB10 | SEQ ID NO:2 | SEQ ID NO:3 | SEQ ID NO:99 | SEQ ID NO:100 |
| NG2BB21 | SEQ ID NO:34 | SEQ ID NO:35 | SEQ ID NO:99 | SEQ ID NO:100 |
| NG2BB22 | SEQ ID NO:2 | SEQ ID NO:3 | SEQ ID NO:99 | SEQ ID NO:100 |
| NG2BB9 | SEQ ID NO:34 | SEQ ID NO:35 | SEQ ID NO:99 | SEQ ID NO:100 |
| NG2GB16 | SEQ ID NO:34 | SEQ ID NO:35 | SEQ ID NO:131 | SEQ ID NO:132 |
| NG2GB19 | SEQ ID NO:2 | SEQ ID NO:3 | SEQ ID NO:131 | SEQ ID NO:132 |
| NG2GB23 | SEQ ID NO:2 | SEQ ID NO:3 | SEQ ID NO:131 | SEQ ID NO:132 |
| NG2GB24 | SEQ ID NO:34 | SEQ ID NO:35 | SEQ ID NO:131 | SEQ ID NO:132 |
表22.bsAbs的重链和轻链序列
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
7.5实施例5：对双特异性抗体的细胞毒性特性的评价
进一步评价bsAb的细胞毒性特性。简言之，将内源表达BCMA和GPRC5d的H929/GFP细胞用作靶细胞，并将人PBMC(Hemcare，PB009C-50，批号：19054456)用作效应细胞。制备靶细胞、效应细胞和抗体处理物，并以6.6:1的效应物与靶标比率添加到透明底板(PerkinElmer#6057300)的孔中。使用实时活细胞成像系统Incucyte(Sartarious)每小时对细胞进行成像，并定量每孔的总GFP整合信号。计算重复的平均值和标准偏差。当添加处理物时，将时间点数据相对于时间0进行归一化。绘制这些分子的终点(47小时)剂量反应曲线，并通过Graphpad Prism进行四参数非线性回归以获得IC50。
总体而言，莫里森支架bsAb展示出弱活性，这可能是由于与靶细胞的结合较弱。在这种形式中，仅NG2BB21和NG2GB26介导基于NK细胞的细胞毒性，具有纳摩尔范围内的IC50值(图5A-D，表23)。
表23.BsAb细胞毒性的IC50值
| 名称 | IC50(nM) | 名称 | IC50(nM) |
| NG2BB22 | 太弱 | NG2GB19 | 1.99E-11 |
| NG2BB21 | 1.236E-09 | NG2GB16 | 太弱 |
| N46BB6 | 太弱 | N46GB9 | 太弱 |
| NG2BB10 | 2.095E-11 | NG2GB23 | 3.37E-12 |
| NG2BB9 | 7.224E-12 | NG2GB24 | 1.44E-11 |
| N46BB4 | 1.534E-12 | N46GB6 | 太弱 |
两脚台支架分子尽管以单价为特征，但显示出更强的活性。在这种形式中，所有基于BCMA的bsAb具有活性NG2BB10(基于NKGB125)、NG2BB9(基于NKGB83)和N46BB4(基于N46B105)，其特征都是正常的IgG1恒定区，但NK细胞衔接器不同。这些分子都具有几乎相同的活性，IC50值为约10pM。这种趋势对于靶向GPRC5d的两脚台bsAb也是如此，其中恒定区的特征比NK细胞衔接器的特征更显著地影响IC50。
结果说明，首先，三个NK细胞衔接器：NKGB125、NKGB83和N46B105均有能力介导NK细胞重定向类似活性。第二，与莫里森支架bsAb构型相比，基于两脚台的构型更适于NK细胞重定向。
7.6实施例6：双特异性NK衔接器通过使NK受体和FC受体两者活化而发挥作用，从而具有优异的细胞毒性
为了进一步研究双特异性NK衔接器的细胞毒性特性，将一种NKp46结合物N46B105与BCMA结合物配对，该BCMA结合物具有在常规和非岩藻糖修饰的细胞中制备的沉默或野生型Fc(图6)。用NK细胞或PMBC直接对这些分子进行ADCC，或者在预期模拟免疫抑制肿瘤环境的条件下，诸如在存在TGFβ的情况下或低氧下进行ADCC。
在TGFβ研究中，使PBMC复苏并休息过夜。在从PBMC中分离NK细胞(CD16+/CD56+)后，将它们用不同浓度的TGFβ处理或在不含TGFβ的培养基中温育72小时，并且在添加TGFβ处理的或未处理的NK细胞4小时后，使用DELFIA-EuTDA时间分辨荧光细胞毒性试剂盒(PerkinElmer)进行ADCC测定。
图7示出了NK细胞对内源表达BCMA的H929细胞的ADCC活性。在不使用TGFβ对效应细胞进行预处理的情况下，双特异性NK衔接器N46BB10.AFU的表现优于对应的抗体BCMB1106.AFU，这指示除了由Fc 受体(特别是CD16)诱导的效应之外，NKp46臂还能进一步增强NK细胞的细胞毒性效应。效应细胞在TGFβ中预处理后，由于TGFβ的免疫抑制特性，细胞毒性效应降低。然而，双特异性NK衔接器仍然比对应的缺乏NKp46结合物的抗体更有效，这表明了使NKp46转化成免疫抑制环境的这种益处。
在低氧研究中，将PBMC(Hemacare PB009C-3，批次19055785)解冻、反应并在37℃、5％CO2、2％O2、3.0PSI的条件下在Avatar Hipoxia室(Xcellbio)中温育四天。然后制备MM1R/GFP细胞、效应细胞和抗体处理物，并以10:1的PBMC与靶标比率添加到透明底板(PerkinElmer#6057300)的孔中。使用实时活细胞成像系统Incucyte(Sartarious)每小时对细胞进行成像，并定量每孔的总GFP整合信号。计算重复的平均值和标准偏差。当添加处理物时，将时间点数据相对于时间0进行归一化。绘制这些分子的终点(48小时)剂量反应曲线，并通过Graphpad Prism进行四参数非线性回归以获得IC50。
缺氧细胞毒性动力学和终点剂量反应显示在图8A、8B和8C中。对于双特异性NK衔接器N46BB10.AFU和对应的抗体BCMB1106.AFU，可在添加抗体和效应细胞后数小时内观察到ADCC活性，并在一天后进行平板接种(图8A和8B)。具有IgG1沉默突变的NK衔接器变体(N46BB14)单独能够诱导约47％细胞毒性，EC50为约1.191nM(图8C)，这表示NKp46单独重定向的细胞毒性作用的贡献。通过活性野生型Fc(N46BB10)或通过非岩藻糖修饰的Fc(N46BB10.AFU)添加Fc受体诱导的细胞毒性分别将最大溶解百分比增加至约68％和72％，同时将EC50值分别降低至约0.07nM和0.006nM。将通过NKp46以及Fc受体发挥作用的非岩藻糖修饰的双特异性NK衔接器(N46BB10.AFU)与通过单独的Fc受体发挥作用的对应抗体(BCMB1106.AFU)进行比较，最大裂解百分比以及效力均增加，这证明了双特异性和双功能NK衔接器作为治疗剂的功效的潜在优越性。
N46BB10的氨基酸序列信息如下列在表24中。
表24.N46BB10的氨基酸序列
/>
N46BB10的核酸序列信息如下列在表25中。
表25.N46BB10的核酸序列
/>
/>
/>
N46BB14的氨基酸序列信息如下列在表26中。
表26.N46BB14的氨基酸序列
/>
N46BB14的核酸序列信息如下列在表27中。
表27.N46BB14的核酸序列
/>
/>
/>
BCMB1106的氨基酸序列信息如下列在表28中。
表28.BCMB1106的氨基酸序列
/>
BCMB1106的核酸序列信息如下列在表29中。
表29.BCMB1106的核酸序列
/>
/>
/>
7.7实施例7：缺乏抗NK细胞毒性
双特异性NK衔接器(N46BB10.AFU)通过ADCC机制具有活性并且与对应抗体(BCMB1106.AFU)相比具有优越性的这一发现(图7和图8A-图8C)还证明了双特异性NK衔接器不会以自相残杀的方式对NK细胞产生有害影响。
为了评价含有NKp46结合物的双特异性抗体是否会通过CDC机制导致抗NK细胞毒性，将纯化的NK细胞与双特异性抗体在存在40％人血清的情况下温育12小时。然后按照制造商的指示使用Cell-Titerglo(Promega,Madison,WI)测量NK细胞的活力。将抗CD38抗体(已知其通过CDC引起抗NK细胞毒性)和非特异性同种型对照用作阳性对照和阴性对照。如图9所示，抗CD38抗体显示出CDC介导的NK细胞的杀伤。相反，具有WT IgG1主链(N46BB10.AFU)或甚至一组CDC增强突变(K248E/T437R，N46BB12)的NKp46×BCMA双特异性抗体不引起NK细胞的CDC杀伤。这些数据表明，在所测试的双特异性形式中掺入NKp46结合物不会导致抗NK细胞毒性。
7.8实施例8：治疗潜力
在本发明中表明，在靶向肿瘤的bsAb中掺入抗NKp46结合物可增强表达NKp46的免疫效应细胞针对肿瘤靶标的细胞毒性活性。最近的研究开始发现，NKp46并不只存在于NK细胞上，其还在T细胞亚群上表达，这些亚群包括γδT细胞(Mikulak等人，JCIInsight.2019)，以及先天淋巴细胞的粘膜群(Narni-Maninelli等人，PNAS2011)，这些含有NKp46的分子具有诱导除NK细胞之外的其他表达NKp46的免疫细胞类型杀死肿瘤靶标的潜力。多种免疫效应细胞的这种作用机制可以将本发明与单克隆和双特异性治疗抗体的其他效应子功能区分开来。
Claims (45)
1.一种多特异性抗体，所述多特异性抗体包含：
(a)第一结合结构域，所述第一结合结构域与在自然杀伤(NK)细胞上表达的第一抗原结合；和
(b)第二结合结构域，所述第二结合结构域与第二抗原结合。
2.根据权利要求1所述的多特异性抗体，其中所述第一抗原是NK细胞活化受体。
3.根据权利要求2所述的多特异性抗体，其中所述第一抗原是NKG2d。
4.根据权利要求3所述的多特异性抗体，其中所述第一结合结构域包含：
(i)重链可变区(VH)，其包含
(a)具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的VH CDR3；
(b)具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的VH CDR3；
(c)具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的VH CDR3；
(d)具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的VH CDR3；或
(e)具有SEQ ID NO:28的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:29的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:30的氨基酸序列的VH CDR3；
和
轻链可变区(VL)，其包含
(a)具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的VLCDR2和具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的VL CDR3；
(b)具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VLCDR2和具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VL CDR3；
(c)具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的VLCDR2和具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的VL CDR3；
(d)具有SEQ ID NO:25的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的VLCDR2和具有SEQ ID NO:27的氨基酸序列的VL CDR3；或
(e)具有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:32的氨基酸序列的VLCDR2和具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的VL CDR3；
或者
(ii)重链可变区(VH)，其包含
(a)具有SEQ ID NO:36的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的VH CDR3；
(b)具有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的VH CDR3；
(c)具有SEQ ID NO:48的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:49的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:50的氨基酸序列的VH CDR3；
(d)具有SEQ ID NO:54的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:55的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:56的氨基酸序列的VH CDR3；或
(e)具有SEQ ID NO:60的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:61的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:62的氨基酸序列的VH CDR3；
和
轻链可变区(VL)，其包含
(a)具有SEQ ID NO:39的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:40的氨基酸序列的VLCDR2和具有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的VL CDR3；
(b)具有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的VLCDR2和具有SEQ ID NO:47的氨基酸序列的VL CDR3；
(c)具有SEQ ID NO:51的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:52的氨基酸序列的VLCDR2和具有SEQ ID NO:53的氨基酸序列的VL CDR3；
(d)具有SEQ ID NO:57的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:58的氨基酸序列的VLCDR2和具有SEQ ID NO:59的氨基酸序列的VL CDR3；或
(e)具有SEQ ID NO:63的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:64的氨基酸序列的VLCDR2和具有SEQ ID NO:65的氨基酸序列的VL CDR3。
5.根据权利要求4所述的多特异性抗体，其中所述第一结合结构域包含具有SEQ IDNO:2的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的VL，或者其中所述第一结合结构域包含：具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:35的氨基酸序列的VL。
6.根据权利要求2所述的多特异性抗体，其中所述第一抗原是NKp46。
7.根据权利要求6所述的多特异性抗体，其中所述第一结合结构域包含：
(i)重链可变区(VH)，其包含
(a)具有SEQ ID NO:69的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:70的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的VH CDR3；
(b)具有SEQ ID NO:75的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:76的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:77的氨基酸序列的VH CDR3；
(c)具有SEQ ID NO:81的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:82的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:83的氨基酸序列的VH CDR3；
(d)具有SEQ ID NO:87的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:88的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:89的氨基酸序列的VH CDR3；或
(e)具有SEQ ID NO:93的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:94的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:95的氨基酸序列的VH CDR3；
和
(ii)轻链可变区(VL)，其包含
(a)具有SEQ ID NO:72的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:73的氨基酸序列的VLCDR2和具有SEQ ID NO:74的氨基酸序列的VL CDR3；
(b)具有SEQ ID NO:78的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:79的氨基酸序列的VLCDR2和具有SEQ ID NO:80的氨基酸序列的VL CDR3；
(c)具有SEQ ID NO:84的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:85的氨基酸序列的VLCDR2和具有SEQ ID NO:86的氨基酸序列的VL CDR3；
(d)具有SEQ ID NO:90的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:91的氨基酸序列的VLCDR2和具有SEQ ID NO:92的氨基酸序列的VL CDR3；或
(e)具有SEQ ID NO:96的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:97的氨基酸序列的VLCDR2和具有SEQ ID NO:98的氨基酸序列的VL CDR3。
8.根据权利要求7所述的多特异性抗体，其中所述第一结合结构域包含：具有SEQ IDNO:67的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:68的氨基酸序列的VL。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的多特异性抗体，其中所述第二抗原位于细胞表面上。
10.根据权利要求1至8中任一项所述的多特异性抗体，其中所述第二抗原在肿瘤细胞上表达。
11.根据权利要求10所述的多特异性抗体，其中所述第二抗原是肿瘤特异性抗原(TSA)或肿瘤相关抗原(TAA)。
12.根据权利要求10所述的多特异性抗体，其中所述第二抗原是BCMA。
13.根据权利要求10所述的多特异性抗体，其中所述第二抗原是GPRC5d。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的多特异性抗体，其中所述第一结合结构域是人源化的，所述第二结合结构域是人源化的，或者所述第一结合结构域和所述第二结合结构域两者均是人源化的。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的多特异性抗体，其中所述多特异性抗体是IgG抗体。
16.根据权利要求15所述的多特异性抗体，其中所述IgG抗体是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体。
17.根据权利要求16所述的多特异性抗体，其中所述IgG抗体是IgG1抗体。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的多特异性抗体，其中所述多特异性抗体是双特异性抗体。
19.根据权利要求18所述的多特异性抗体，其中所述双特异性抗体呈两脚台支架构型。
20.根据权利要求19所述的多特异性抗体，其中所述第一结合结构域是Fab区，并且所述第二结合结构域是scFv区。
21.根据权利要求18所述的多特异性抗体，其中所述双特异性抗体呈莫里森支架构型。
22.根据权利要求21所述的多特异性抗体，其中所述第一结合结构域包含两个Fab区，并且所述第二结合结构域包含两个scFv区。
23.根据权利要求10至22中任一项所述的多特异性抗体，其中所述多特异性抗体在体外以小于约500pM的IC50诱导所述肿瘤细胞的ΝK细胞依赖性细胞毒性。
24.根据权利要求10至22中任一项所述的多特异性抗体，其中所述多特异性抗体在体外以小于约300pM的IC50诱导所述肿瘤细胞的ΝK细胞依赖性细胞毒性。
25.根据权利要求10至22中任一项所述的多特异性抗体，其中所述多特异性抗体在体外以小于约100pM的IC50诱导所述肿瘤细胞的ΝK细胞依赖性细胞毒性。
26.根据权利要求10至22中任一项所述的多特异性抗体，其中所述多特异性抗体在体外以小于约50pM的IC50诱导所述肿瘤细胞的ΝK细胞依赖性细胞毒性。
27.根据权利要求10至22中任一项所述的多特异性抗体，其中所述多特异性抗体在体外以小于约20pM的IC50诱导所述肿瘤细胞的ΝK细胞依赖性细胞毒性。
28.根据权利要求10至22中任一项所述的多特异性抗体，其中所述多特异性抗体在体外以小于约15pM的IC50诱导所述肿瘤细胞的ΝK细胞依赖性细胞毒性。
29.根据权利要求10至22中任一项所述的多特异性抗体，其中所述多特异性抗体在体外以小于约10pM的IC50诱导所述肿瘤细胞的ΝK细胞依赖性细胞毒性。
30.根据权利要求23至29中任一项所述的多特异性抗体，其中用ΝK效应细胞和表达所述第二抗原的靶细胞的混合物评估所述IC50。
31.根据权利要求30所述的多特异性抗体，其中所述效应细胞与靶细胞的比率为约0.01:1至约5:1。
32.根据权利要求30所述的多特异性抗体，其中所述效应细胞与靶细胞的比率为约0.1:1至约2:1。
33.根据权利要求30所述的多特异性抗体，其中所述效应细胞与靶细胞的比率为约1:1。
34.一种核酸，所述核酸编码根据权利要求1至33中任一项所述的多特异性抗体。
35.一种载体，所述载体包含根据权利要求34所述的核酸。
36.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含根据权利要求35所述的载体。
37.一种试剂盒，所述试剂盒包括根据权利要求36所述的载体以及用于所述载体的包装。
38.一种结合NKG2d的抗体，所述抗体包含：
(i)重链可变区(VH)，其包含
(a)具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的VH CDR3；
(b)具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的VH CDR3；
(c)具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的VH CDR3；
(d)具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的VH CDR3；或
(e)具有SEQ ID NO:28的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:29的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:30的氨基酸序列的VH CDR3；
和
轻链可变区(VL)，其包含
(a)具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的VLCDR2和具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的VL CDR3；
(b)具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VLCDR2和具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VL CDR3；
(c)具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的VLCDR2和具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的VL CDR3；
(d)具有SEQ ID NO:25的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的VLCDR2和具有SEQ ID NO:27的氨基酸序列的VL CDR3；或
(e)具有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:32的氨基酸序列的VLCDR2和具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的VL CDR3；
或者
(ii)重链可变区(VH)，其包含
(a)具有SEQ ID NO:36的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的VH CDR3；
(b)具有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的VH CDR3；
(c)具有SEQ ID NO:48的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:49的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:50的氨基酸序列的VH CDR3；
(d)具有SEQ ID NO:54的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:55的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:56的氨基酸序列的VH CDR3；或
(e)具有SEQ ID NO:60的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:61的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:62的氨基酸序列的VH CDR3；
和
轻链可变区(VL)，其包含
(a)具有SEQ ID NO:39的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:40的氨基酸序列的VLCDR2和具有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的VL CDR3；
(b)具有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的VLCDR2和具有SEQ ID NO:47的氨基酸序列的VL CDR3；
(c)具有SEQ ID NO:51的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:52的氨基酸序列的VLCDR2和具有SEQ ID NO:53的氨基酸序列的VL CDR3；
(d)具有SEQ ID NO:57的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:58的氨基酸序列的VLCDR2和具有SEQ ID NO:59的氨基酸序列的VL CDR3；或
(e)具有SEQ ID NO:63的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:64的氨基酸序列的VLCDR2和具有SEQ ID NO:65的氨基酸序列的VL CDR3。
39.根据权利要求38所述的抗体，其中所述第一结合结构域包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的VL，或者其中所述第一结合结构域包含具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:35的氨基酸序列的VL。
40.一种结合NKp46的抗体，所述抗体包含：
(i)重链可变区(VH)，其包含
(a)具有SEQ ID NO:69的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:70的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的VH CDR3；
(b)具有SEQ ID NO:75的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:76的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:77的氨基酸序列的VH CDR3；
(c)具有SEQ ID NO:81的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:82的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:83的氨基酸序列的VH CDR3；
(d)具有SEQ ID NO:87的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:88的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:89的氨基酸序列的VH CDR3；或
(e)具有SEQ ID NO:93的氨基酸序列的VH互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:94的氨基酸序列的VH CDR2和具有SEQ ID NO:95的氨基酸序列的VH CDR3；
和
(ii)轻链可变区(VL)，其包含
(a)具有SEQ ID NO:72的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:73的氨基酸序列的VLCDR2和具有SEQ ID NO:74的氨基酸序列的VL CDR3；
(b)具有SEQ ID NO:78的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:79的氨基酸序列的VLCDR2和具有SEQ ID NO:80的氨基酸序列的VL CDR3；
(c)具有SEQ ID NO:84的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:85的氨基酸序列的VLCDR2和具有SEQ ID NO:86的氨基酸序列的VL CDR3；
(d)具有SEQ ID NO:90的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:91的氨基酸序列的VLCDR2和具有SEQ ID NO:92的氨基酸序列的VL CDR3；或
(e)具有SEQ ID NO:96的氨基酸序列的VL CDR1、具有SEQ ID NO:97的氨基酸序列的VLCDR2和具有SEQ ID NO:98的氨基酸序列的VL CDR3。
41.根据权利要求40所述的抗体，其中所述第一结合结构域包含具有SEQ ID NO:67的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:68的氨基酸序列的VL。
42.一种核酸，所述核酸编码根据权利要求38至41中任一项所述的抗体。
43.一种载体，所述载体包含根据权利要求42所述的核酸。
44.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含根据权利要求43所述的载体。
45.一种试剂盒，所述试剂盒包括根据权利要求43所述的载体以及用于所述载体的包装。
Applications Claiming Priority (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US202163168611P | 2021-03-31 | 2021-03-31 | |
| US63/168605 | 2021-03-31 | ||
| US63/168628 | 2021-03-31 | ||
| US63/168618 | 2021-03-31 | ||
| US63/168611 | 2021-03-31 | ||
| US63/168621 | 2021-03-31 | ||
| PCT/US2022/022500 WO2022212470A2 (en) | 2021-03-31 | 2022-03-30 | Materials and methods for immune effector cells redirection |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117500836A true CN117500836A (zh) | 2024-02-02 |
Family
ID=89671308
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202280039033.XA Pending CN117500836A (zh) | 2021-03-31 | 2022-03-30 | 用于免疫效应细胞重定向的材料和方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117500836A (zh) |
-
2022
- 2022-03-30 CN CN202280039033.XA patent/CN117500836A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20210340272A1 (en) | Anti-mesothelin constructs and uses thereof | |
| KR20180054824A (ko) | Pd-1 결합 단백질 및 이의 사용 방법 | |
| US20210380675A1 (en) | Il-36 antibodies and uses thereof | |
| US20240182582A1 (en) | Materials and methods for immune effector cells redirection | |
| US20220289857A1 (en) | Fn14 antibodies and uses thereof | |
| US20220112276A1 (en) | Biosynthetic materials and methods for multidirectional biotransportation | |
| KR20240070496A (ko) | 활성화된 간 성상세포(hscs)의 고갈 및 이의 용도 | |
| CN117500836A (zh) | 用于免疫效应细胞重定向的材料和方法 | |
| US20220267456A1 (en) | Materials and methods for targeting regulatory t cells for enhancing immune surveillance | |
| US20230227545A1 (en) | Materials and methods of il-1beta binding proteins | |
| US20220356266A1 (en) | Biosynthetic glycoprotein populations | |
| CN117177998A (zh) | 用于靶向调节性t细胞以增强免疫监视的材料和方法 | |
| WO2024013727A1 (en) | Material and methods for improved bioengineered pairing of antigen-binding variable regions | |
| CN117545505A (zh) | 具有工程化抗体恒定区变体的分子 | |
| JP2024515303A (ja) | 操作された抗体定常領域変異体を有する分子 | |
| CN114173801A (zh) | 用于多向生物转运的材料和方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |