SU582745A3 - Способ получени туберкулина - Google Patents

Description

1

Изобретение относитс  к способам получени  чистых белков, которые могут быть использованы дл  диагностики туберкулеза.

Известен способ получени  белка из туберкулезных бактерий путем отделени  бактериальной массы от жидкост добавлени  буферного раствора и органических растворителей, автолиза бактерий, отделени  нерастворимых продуктов автолиза и концентрировани препарата при помощи упаривани .

..Однако такой способ не обеспечивае высокой степени чистоты целевого продукта.

С целью повышени  степени чистоты целевого продукта по предлагаемому способу органическим растворителем обрабатывают инактивированные клетки K|ycobacterL.uTr tuberculosis штамм Аог5с1ма d В и подвергают их действию нуклеазы, а фильтрат хроматографически очищают и выдел ют целевой продук кристаллизацией .

Способ осуществл ют следующим образом .

Инактивированные клетки МусоЬасterCutn tuburcu Eo&is обрабатывают Органическими растворител ми, напри ер , кетонаьш, спиртами, карбоновыми

кислотами, предпочтительно ацетоном, метанолом или уксусной кислотой. Эти растворители можно использовать вместе с водой. Клетки, обработанные растворителем, подвергают варке с нуклеазами, например с рибонуклеазами , дезоксирибонуклеазами. Водорастворимые белки выдел ют из полученной смеси и подвергают диализу с применением буферов с рН 5,5-7,8, например, буфера (рН 7,0), содержащего трис- (оксиметил)-аминометан и хлористый водород, а также этилендиаминтетрауксускую кислоту (рП 7,2), динатрийфосфат , монокалийфосфат.

Claims (3)

1. Диализованные белки фракционир уют хроматографией и/или ф льтpoвaниeм через гель; предпочтительнее хроматографи  на колонке с применением ионообменной целлюлозы или фильтрование через гель с применением, мостиковидносшитого декстранового полимера . vп  фракционировани  диализатов используют ионообменную целлюлозу например, аминоэтилцеллюлозу, диэтиламиноэтил (ДЭАЭ)-целлюлозу, триаминозтил (ТАЭ)-целлюлоау или эпихлоргидринтриз;таноламино (ЭХТЭО.ЛА) -целлюло .зу. Диализованные белки элюируют буфер ными смес ми. Кристаллические туберкулиновые белки растворимы в воде, их молекул  . иьай вес составл ет 3000-3500 в зависимости от клеток, примен емых дл  их получени , кожные пробы на тубер кулин показывают, что туберкулиновые белки обладают активностью в 10- 100 раз превьлиающей активность очище ных производных белков (ОПБ) на морс кие свинки, сенсибилизированные штам мом Аойама В или бациллой Кельметта Герена (БКГ), инактивизированных термообработкой микроорганизмов вида Mycobcicterc.Li-m tubcrcutosue. Туберкулиновые пептиды получают гидролизом кристаллических туберкули новых белков, фракционированием гид ролизатов этих белков хроматографие ИЛИ Фильтрованием через гель. Туберкулиновые белки подвергают гидролизу химическими или ферментати ными способами. Химический гидролиз провод т с помощью минеральных кислот , а ферментативный с применением протеолитического фермента, например трипсина, химотрипсина, пепсина, папаина, бактериальных протеиназ, карбопептидаз А и В. Полученные гидролизаты фракциониру ют хроматографией на колонке, бумажн хроматографией, высоковольтным бумажным электрофорезом, фильтрованием через гель. Фильтрование через гель осуществл ют с применением аммониевоацетатного буфера (рИ 5,9) через Сефадекс &-25 или КМ-Сефадекс , пиридино-ацетатного буфера (рН 4,5) через СЗ-Сефадекс Э--50 или пиридино-ацетатного буфера (рН 3,1). Туберкулиновые пептидн представл ю собой белые кристаллы, растворимые 13 воде, с молекул рным весом 50030J )0, Кожные пробы на туберкулин показывают , что туберкулиновые пептиды обладают более высокой, чем ОПБ, активностью , на морские свинки, сеисибилйзированные штаммом Аойайа В или БКГ, микроорганизмов Mycobactcriom tuberculosis инактивированных термообработкой . Пример 1. Культивированные клетки (100 г) штамма Аойама В Муcobacf егСитп ti/bbrcvitosCs инактивируют термообработкой при 120 С в течение 30 мин. Клетки вьщел ют из культуральной среды фильтрованием , затем их разрывают посредством звуковой обработки и обрабатывают ацетоном. Полученный остаток подвергают варке с рибонуклеазой и дезоксирибонуклеазой , и вываренную смесь центрифугируют дл  отделени  водорастворимых беЛков, Полученные водорастворимые белки диализуют с применением 0,001 м раствора буфера на трис-(оксиметил)- аминометане и хлористом водороде (рП 7,0), содержащего 0,0001 М раствор этилендиаминотетрауксусной кислоты. Полученный диализат хроматографируют на ДЭАЭ-целлюлозе. Элюирование провод т в среде, содерх ащей хлористый натрий. Весь активный туберкулин содержитс  во второй белковой фракции. Последующую хроматографию на Сефадексе &- провод т аналогично, и продукт фракционируют на три фракции. Весь активный туберкулин содержитс  в большей фракции. Активный туберкулин .кристаллизуетс  спонтанно при выдерживании раствора при в смешанном растворе того же буфера с очищенным ацетоном. Из 100 г клеток (мокрый вес) штамма Аойама В микроорганизма вида Иус-Оbctcterium tuberauEosLb получают 25 мг кристаллического туберкулинового белка . Туберкулиновый белок, полученный по этому способу, состоит из 89 остатков аминокислот, расположенных в следующем пор дке: НгК -Apr -Лей -Лей -дт-Ам 7 8 9 10 гТ -Пере - Tlfo - - Вал -Аиз-...Цис И то 71 72 73 -..Цис -,..Асп -Гли -Сер -Глу74 89 89 -Кет - ...Ала - Аиз - СООН Кожна  проба на туберкулин показыает , что полученный туберкулиновый елок обладает активностью в 100 раз ревышающей активность ОПВ на морсие свинки, сенсибилизированные штамом В или ЕКГ, инактивированых термообработкой. Пример
2. 2. Получают белок с ктивностью туберкулина, с молекул рым весом 500 из БКГ по методике, писанной в примере 1, Пор док расположени  аминокислот того туберкулинового белка, состо щео из 135 остатков аминокислот: N-KOHевые и С-концевне аминокислоты, а акже первична  структура в основном акие же, что и у белков штамма Аойма В, инактивированных термообработ ой, Кожные пробы на туберкулин показыают , что активность этого туберкулиового белка почти соответствует акивности белка из штамма Аойама В, нактивированных термообработкой икроорганизмов My cQbCict.CrCi- Tn to bircutosift на морские свинки, сенсибили зированные инактивированными термооб работкой штаммами Аойама В или ЯКГ, Пример 3, Кристаллический туберкулиновый белок, получении по методике примера 1, подвергают ферме тативному гидролизу при в течен 6 ч с применением 1%-ного раствора трипсина при рН 8,4. ДвухразмерныП высоковольтный бумажный электрофорез полученного гидролизата провод т при 75 В/см в пиридино-ацетатном буфере (рН 4,5), после чего хроматографирую на бумаге в смеси бутанола, уксусной кислоты и воды ( 4 ,1 1 : 4 по объему Про вление приводит к отделению некоторых активных пептидов, один из которых представл ет собоГ пентапептид со следующим пор дком расположен аминокислот: 1 г 3 4 5 Н2Н - Асп - Глц - Сер- глу - Mem - СООН Выделен также нонапептид с молекул рным весом- 950. Кожные пробы на туберкулин показывают , что активность этих туберкулиновых пептидов составл ет 1-10 по отношению к активности исходного туберкулинового белка. Пример 4. Кристаллический туберкулиновый белок, полученный по методике примера 1, подвергают гидролизу в 0,5%-ном растворе химотрипсина Полученный гидролизат хроматографируют на колонке, заполненной Сефадексом G-25, причем элюирование про вод т аммониевоацетатным буфером при . рН 5,9. Полученные пептиды с активностью туберкулина затем фракционируют пиридинацетатным буфером (рН 3,1) на колонке, заполненной Довексом 1-Х2. Полученный туберкулиновый пентапептид имеет такую же структуру, как пептид, полученный по методике примера 3. Пример 5. Туберкулиновый белок, полученный по методике примера 2, обрабатывают, аналогичнопримеру 4. Получают такой же туберкулиновый пентапептид , как полученный по методике примера
3. 3. , Формула изобретени . Способ получени  туберкулина путем обработки клеток Mycobacterium tubcrcofiobLs органическим растворителем, а затем ферментом, отделени  нерастворимых примесей и выделени  целевого продукта из фильтрата, отличающийс  тем, что, с целью повышени  степени чистоты целевого продукта, органическим растворителем обрабатывают инактивированные клетки Му&о bactCriom tubercutosCs штамм Аойама в и подвергают их действию нуклеазы , а фильтрат хроматографически очищают и выдел ют целевой продукт кристаллизацией.