JP2994486B2 - リポペプチドデアシラーゼ - Google Patents
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Description
【０００１】本発明は、酵素技術に関するものである。
具体的には、本発明は、微生物、Actinoplanes utahens
isによって産生される、抗真菌性代謝物質、エキノカン
ジンＢ(echinocandinB, ＥＣＢ)、アクレアシン(aculea
cin)、およびＥＣＢの類似体の脂質親和性アシル側鎖を
脱アシル化するリポペプチドデアシラーゼの精製に関す
るものである。
具体的には、本発明は、微生物、Actinoplanes utahens
isによって産生される、抗真菌性代謝物質、エキノカン
ジンＢ(echinocandinB, ＥＣＢ)、アクレアシン(aculea
cin)、およびＥＣＢの類似体の脂質親和性アシル側鎖を
脱アシル化するリポペプチドデアシラーゼの精製に関す
るものである。
【０００２】エキノカンジンＢおよびアクレアシンは、
それぞれリノレオイルおよびパルミトイル側鎖を有する
既知の環状ヘキサペプチドである。ボエック等(Boeck,
L.D.,et al.),1988.J.Antibiot.(Tokyo),41,1085-109
2；ボエック等(Boeck,L.D., etal.),1989.J.Antibiot.
(Tokyo),42,382-388；およびキムラ等(Kimura,Y., et a
l.),1987.Agri.Biol.Chem.51,1617-1623は、Actinoplan
es utahensis および Pseudomonas 種の全細胞によるＥ
ＣＢのリノレオイル基の脱アシル化を報告している。タ
ケシマ等(Takeshima,H., et al.),1989.J.Biochem.105,
606-610 は、アクレアシンを脱アシル化する、A.utahen
sis由来のデアシラーゼの精製および部分的特性化を報
告している。
それぞれリノレオイルおよびパルミトイル側鎖を有する
既知の環状ヘキサペプチドである。ボエック等(Boeck,
L.D.,et al.),1988.J.Antibiot.(Tokyo),41,1085-109
2；ボエック等(Boeck,L.D., etal.),1989.J.Antibiot.
(Tokyo),42,382-388；およびキムラ等(Kimura,Y., et a
l.),1987.Agri.Biol.Chem.51,1617-1623は、Actinoplan
es utahensis および Pseudomonas 種の全細胞によるＥ
ＣＢのリノレオイル基の脱アシル化を報告している。タ
ケシマ等(Takeshima,H., et al.),1989.J.Biochem.105,
606-610 は、アクレアシンを脱アシル化する、A.utahen
sis由来のデアシラーゼの精製および部分的特性化を報
告している。
【０００３】天然の抗真菌物質の構造的修飾によって、
シロファンギンおよびダプトマイシンのような有用な治
療薬が得られた。デボノ等(Debono,M., et al.),1989.
J.Antiabiot.(Tokyo),42,389-397； デボノ等(Debono,
M., etal.),1988.Ann.N.Y.Acad.Sci.544,152-167；ゴル
ディー等(Gordee,R.S. et al.),1988.Ann.N.Y.Acad.Sc
i.544,294-309；およびボエック(Boeck,L.D., et al.),
1988.J.Antibiot.(Tokyo),41,1085-1092。例えばＥＣＢ
>は、A.utahensisの全細胞で脱アシル化されて脂質親和
性のアシル側鎖が切断され、ＥＣＢの環状ヘキサペプチ
ド核を与える。化学的方法によって核を再アシル化する
と、改善された抗真菌特性を有するシロファンギンのよ
うなアシルＥＣＢ化合物が得られる。
シロファンギンおよびダプトマイシンのような有用な治
療薬が得られた。デボノ等(Debono,M., et al.),1989.
J.Antiabiot.(Tokyo),42,389-397； デボノ等(Debono,
M., etal.),1988.Ann.N.Y.Acad.Sci.544,152-167；ゴル
ディー等(Gordee,R.S. et al.),1988.Ann.N.Y.Acad.Sc
i.544,294-309；およびボエック(Boeck,L.D., et al.),
1988.J.Antibiot.(Tokyo),41,1085-1092。例えばＥＣＢ
>は、A.utahensisの全細胞で脱アシル化されて脂質親和
性のアシル側鎖が切断され、ＥＣＢの環状ヘキサペプチ
ド核を与える。化学的方法によって核を再アシル化する
と、改善された抗真菌特性を有するシロファンギンのよ
うなアシルＥＣＢ化合物が得られる。
【０００４】全身の真菌感染症の治療のための改善され
た抗真菌薬が必要とされているので、これらの製造方法
は重要である。このような化合物を製造するための酵素
的方法は通常、化学的方法よりシンプルかつ経済的な方
法なので、これらの方法はとりわけ望ましい。従って、
このような変換に有用な酵素を入手し得ることは、非常
に望ましい。
た抗真菌薬が必要とされているので、これらの製造方法
は重要である。このような化合物を製造するための酵素
的方法は通常、化学的方法よりシンプルかつ経済的な方
法なので、これらの方法はとりわけ望ましい。従って、
このような変換に有用な酵素を入手し得ることは、非常
に望ましい。
【０００５】Actinoplanes utahensis デアシラーゼ
は、精製された形で提供される。この酵素は、ＥＣＢの
リノレオイル基およびアクレアシンのパルミトイル基の
切断を触媒する。この酵素は、pＨ６.０および６０℃で
最も活性な、６３ＫＤおよび１８ＫＤのサブユニットを
含有しているヘテロダイマーである。この酵素は、細胞
に関連しており、コファクター、金属イオンキレートま
たはスルフヒドリル試薬に影響されない。
は、精製された形で提供される。この酵素は、ＥＣＢの
リノレオイル基およびアクレアシンのパルミトイル基の
切断を触媒する。この酵素は、pＨ６.０および６０℃で
最も活性な、６３ＫＤおよび１８ＫＤのサブユニットを
含有しているヘテロダイマーである。この酵素は、細胞
に関連しており、コファクター、金属イオンキレートま
たはスルフヒドリル試薬に影響されない。
【０００６】この酵素は、環状ヘキサペプチド核の製造
方法およびＡ２１９７８Ｃ抗生物質の環状ペプチド核の
製造方法において有用である。
方法およびＡ２１９７８Ｃ抗生物質の環状ペプチド核の
製造方法において有用である。
【０００７】本発明はまた、疎水性相互作用、陽イオン
交換、染色−リガンドクロマトグラフィーおよびゲル濾
過からなる、デアシラーゼ酵素をほぼ均一まで精製する
ための方法を提供するものである。
交換、染色−リガンドクロマトグラフィーおよびゲル濾
過からなる、デアシラーゼ酵素をほぼ均一まで精製する
ための方法を提供するものである。
【０００８】本発明によって提供されるActinoplanes u
tahensisのデアシラーゼを、本明細書では簡便のため
に、ＥＣＢデアシラーゼと呼ぶ。その全てが実質上細胞
に関連しているこの酵素は、その精製された状態で、以
下の物理的、触媒的、および速度論的特性を有してい
る。
tahensisのデアシラーゼを、本明細書では簡便のため
に、ＥＣＢデアシラーゼと呼ぶ。その全てが実質上細胞
に関連しているこの酵素は、その精製された状態で、以
下の物理的、触媒的、および速度論的特性を有してい
る。
【０００９】ＥＣＢデアシラーゼは、６３ＫＤおよび１
８ＫＤのサブユニットを含有している８１キロダルトン
(ＫＤ)のヘテロダイマーである。この大きい方および小
さい方のサブユニットのアミノ末端配列は、それぞれ以
下の通りである。Ｓer−Ａsn−Ａla−Ｔyr−Ｇly−Ｌeu
−Ｇly−Ａla−Ｇln−Ａla−Ｔhr−Ｖal−Ａsn−Ｇly−
Ｓer−Ｇly−Ｍet−Ｖal−Ｌeu−Ａla−Ａsn−Ｐro−Ｈ
is−Ｐhe−Ｐro−(Ｔrp)−Ｇln−−−Ａla−Ｇlu−(Ａr
g)−Ｐhe−Ｔyr。Ｈis−Ａsp−Ｇly−Ｇly−Ｔyr−Ａla
−Ａla−Ｌeu−Ｉle−Ａrg−Ａrg−Ａla−Ｓer−Ｔyr−
Ｇly−Ｖal−(Ｐro)−Ｈis−Ｉle−Ｔhr−Ａla−Ａsp−
Ａsp−Ｐhe。上の配列において、括弧中のアミノ酸残基
は不確かな指定を示し、“−−−"は、この残基がまだ
確認されていないことを示す。
８ＫＤのサブユニットを含有している８１キロダルトン
(ＫＤ)のヘテロダイマーである。この大きい方および小
さい方のサブユニットのアミノ末端配列は、それぞれ以
下の通りである。Ｓer−Ａsn−Ａla−Ｔyr−Ｇly−Ｌeu
−Ｇly−Ａla−Ｇln−Ａla−Ｔhr−Ｖal−Ａsn−Ｇly−
Ｓer−Ｇly−Ｍet−Ｖal−Ｌeu−Ａla−Ａsn−Ｐro−Ｈ
is−Ｐhe−Ｐro−(Ｔrp)−Ｇln−−−Ａla−Ｇlu−(Ａr
g)−Ｐhe−Ｔyr。Ｈis−Ａsp−Ｇly−Ｇly−Ｔyr−Ａla
−Ａla−Ｌeu−Ｉle−Ａrg−Ａrg−Ａla−Ｓer−Ｔyr−
Ｇly−Ｖal−(Ｐro)−Ｈis−Ｉle−Ｔhr−Ａla−Ａsp−
Ａsp−Ｐhe。上の配列において、括弧中のアミノ酸残基
は不確かな指定を示し、“−−−"は、この残基がまだ
確認されていないことを示す。
【００１０】精製酵素のアミノ酸組成を、以下の表１に
示す。この組成は、ドツラフおよびイェー(Dotzlaf,J.
E. and Yeh,W-K,1987,J.Bacteriol.169,1611-1618)によ
って記載された方法により決定された。
示す。この組成は、ドツラフおよびイェー(Dotzlaf,J.
E. and Yeh,W-K,1987,J.Bacteriol.169,1611-1618)によ
って記載された方法により決定された。
【００１１】
【表１】A.utahensis デアシラーゼのアミノ酸組成 ａ：加水分解のゼロ時間まで外挿することによって決定
した。 ｂ：システイン酸によって決定した。 ｃ：チオグリコール酸の存在下で加水分解することによ
って決定した。
した。 ｂ：システイン酸によって決定した。 ｃ：チオグリコール酸の存在下で加水分解することによ
って決定した。
【００１２】ウルトロゲル(Ultrogel) ＡcＡ ４４でゲ
ル濾過することによって評価した時、ＥＣＢデアシラー
ゼの分子量は、４６,０００であった。前記のサブユニ
ットの分子量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定され
た。ゲル濾過で決定された分子量は、酵素の異常なゲル
溶出挙動に起因するかもしれない著しい過小評価であ
る。ゲルにおける酵素のこの異常な溶出挙動は、高分子
の疎水性が通常高いことに起因する膜結合蛋白に特有の
性質である。
ル濾過することによって評価した時、ＥＣＢデアシラー
ゼの分子量は、４６,０００であった。前記のサブユニ
ットの分子量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定され
た。ゲル濾過で決定された分子量は、酵素の異常なゲル
溶出挙動に起因するかもしれない著しい過小評価であ
る。ゲルにおける酵素のこの異常な溶出挙動は、高分子
の疎水性が通常高いことに起因する膜結合蛋白に特有の
性質である。
【００１３】ＥＣＢデアシラーゼは、その活性の発現の
ために、外来のリン脂質、コファクター、金属イオンま
たは還元剤を必要としない単純な酵素である(２個のサ
ブユニットを含有しているが)。また、通常のコファク
ター、金属イオンまたは還元剤はいずれも、このデアシ
ラーゼを刺激しない。驚くべきことに、Ｎ−エチルマレ
イミド(ＮＥＭ)は、ＥＣＢのＥＣＢ核への変換の割合お
よび精製されたデアシラーゼを約６−７倍高める。
ために、外来のリン脂質、コファクター、金属イオンま
たは還元剤を必要としない単純な酵素である(２個のサ
ブユニットを含有しているが)。また、通常のコファク
ター、金属イオンまたは還元剤はいずれも、このデアシ
ラーゼを刺激しない。驚くべきことに、Ｎ−エチルマレ
イミド(ＮＥＭ)は、ＥＣＢのＥＣＢ核への変換の割合お
よび精製されたデアシラーゼを約６−７倍高める。
【００１４】精製されたデアシラーゼの重要な特性は、
高い塩濃度の存在下でその活性が高められることであ
る。幾つかの通常の１価および２価の金属塩の存在下
で、活性は３倍まで高められる。塩化ナトリウム、塩化
カリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、硝酸ナ
トリウムまたはカリウムのような塩類は、好ましい刺激
性の塩である。この目的のために好ましい塩は、塩化カ
リウムである。約０.１モルから約３.０モルまでの塩濃
度が最も好適であるらしい。より低い塩濃度でも活性が
高められることが、観察される。
高い塩濃度の存在下でその活性が高められることであ
る。幾つかの通常の１価および２価の金属塩の存在下
で、活性は３倍まで高められる。塩化ナトリウム、塩化
カリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、硝酸ナ
トリウムまたはカリウムのような塩類は、好ましい刺激
性の塩である。この目的のために好ましい塩は、塩化カ
リウムである。約０.１モルから約３.０モルまでの塩濃
度が最も好適であるらしい。より低い塩濃度でも活性が
高められることが、観察される。
【００１５】pＨ７および９におけるネイティブ−ＰＡ
ＧＥでデアシラーゼが分割されないことが観察されたと
いうことは、この酵素の等電点が９より高いことを示し
ている。ネイティブ−ＰＡＧＥは、ブラックシェア(Bla
ckshear,P.J.)の(1984) Methods Enzymol.104,237-255
に従って行われた。
ＧＥでデアシラーゼが分割されないことが観察されたと
いうことは、この酵素の等電点が９より高いことを示し
ている。ネイティブ−ＰＡＧＥは、ブラックシェア(Bla
ckshear,P.J.)の(1984) Methods Enzymol.104,237-255
に従って行われた。
【００１６】精製酵素の速度論的および触媒的特性の研
究のために使用された基質は、エキノカンジンＢであっ
た。ＥＣＢは実質上、水性溶液に不溶性である。水性媒
質中でのＥＣＢの可溶化のために試験された幾つかの水
混和性溶媒の内、約１５％またはより低い低濃度でのジ
メチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)が、デアシラーゼによっ
て触媒される反応およびその後の酵素活性のＨＰＬＣ分
析に最も好適であった。
究のために使用された基質は、エキノカンジンＢであっ
た。ＥＣＢは実質上、水性溶液に不溶性である。水性媒
質中でのＥＣＢの可溶化のために試験された幾つかの水
混和性溶媒の内、約１５％またはより低い低濃度でのジ
メチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)が、デアシラーゼによっ
て触媒される反応およびその後の酵素活性のＨＰＬＣ分
析に最も好適であった。
【００１７】この酵素は、０.０５Ｍ ＫＨ2ＰＯ4緩衝液
中、pＨ６.０、６０℃で最も活性である。本発明者ら
は、反応(ＥＣＢからＥＣＢ核)が基質によってではな
く、酵素によって開始された時、この酵素は少なくとも
２倍活性であることを見い出した。
中、pＨ６.０、６０℃で最も活性である。本発明者ら
は、反応(ＥＣＢからＥＣＢ核)が基質によってではな
く、酵素によって開始された時、この酵素は少なくとも
２倍活性であることを見い出した。
【００１８】ラインウィーバー−バーク(Lineweaver-Bu
rk)法によって決定した時、エキノカンジンＢに対する
このデアシラーゼのＫm値は、５０μＭであった。
rk)法によって決定した時、エキノカンジンＢに対する
このデアシラーゼのＫm値は、５０μＭであった。
【００１９】ＥＣＢ反応についてのＶmaxは、生成され
たペプチド(ＥＣＢ核)１０−１１μモル／分／mg蛋白で
あった。
たペプチド(ＥＣＢ核)１０−１１μモル／分／mg蛋白で
あった。
【００２０】反応の化学量論については、ＥＣＢの消失
に対するＥＣＢ核の生成の割合は、約５２.４％である
と観察された。変換割合が低いという観察は、何か他の
反応が起こっているか、あるいは幾らか分解されている
かもしれないということに起因するかもしれない。
に対するＥＣＢ核の生成の割合は、約５２.４％である
と観察された。変換割合が低いという観察は、何か他の
反応が起こっているか、あるいは幾らか分解されている
かもしれないということに起因するかもしれない。
【００２１】前記のように、A.utahensisデアシラーゼ
は、細胞に関連している。例えば、ＥＣＢデアシラーゼ
の高い全活性を示す、A.utahensisの通常の９０時間培
養ブロスでは、９９％より高いデアシラーゼ活性が細胞
に関連していた。５％より低い細胞関連デアシラーゼ活
性は、０.０１Ｍ ＫＨ2ＰＯ4、pＨ６.０中で１日間、細
胞をインキュベートすることによって放出された。この
緩衝液およびその他の緩衝液のイオン強度を増大させて
も、可溶性デアシラーゼの回収にわずかしか効果がなか
った。しかしながら、本発明者らは、塩化カリウムまた
はナトリウム、硝酸カリウムまたはナトリウム、および
マグネシウムまたはカルシウム塩のような塩で細胞を処
理することによって、可溶性デアシラーゼの高い回収率
(６０〜８０％)が実現されるということを見い出した。
この塩処理の効果を以下の表２に示す。
は、細胞に関連している。例えば、ＥＣＢデアシラーゼ
の高い全活性を示す、A.utahensisの通常の９０時間培
養ブロスでは、９９％より高いデアシラーゼ活性が細胞
に関連していた。５％より低い細胞関連デアシラーゼ活
性は、０.０１Ｍ ＫＨ2ＰＯ4、pＨ６.０中で１日間、細
胞をインキュベートすることによって放出された。この
緩衝液およびその他の緩衝液のイオン強度を増大させて
も、可溶性デアシラーゼの回収にわずかしか効果がなか
った。しかしながら、本発明者らは、塩化カリウムまた
はナトリウム、硝酸カリウムまたはナトリウム、および
マグネシウムまたはカルシウム塩のような塩で細胞を処
理することによって、可溶性デアシラーゼの高い回収率
(６０〜８０％)が実現されるということを見い出した。
この塩処理の効果を以下の表２に示す。
【００２２】
【表２】
【００２３】Actinoplanes utahensisを液中好気性発酵
条件下で培養することによって、ＥＣＢデアシラーゼを
産生させる。使用した発酵方法および条件は、既知であ
る：ボエック等(Boeck,L.D., Fukuda,D.S., Abbott,B.
J. and Debono,M.),1989.J.Antibiot.(Tokyo),42,382-3
88。デアシラーゼ活性の最大産生は、培養培地の接種後
約９０時間で起こる。前記、および下記実施例１の記載
の如く、全細胞を好ましくは塩化カリウムで塩処理する
ことによって、粗製形の酵素を可溶化する。
条件下で培養することによって、ＥＣＢデアシラーゼを
産生させる。使用した発酵方法および条件は、既知であ
る：ボエック等(Boeck,L.D., Fukuda,D.S., Abbott,B.
J. and Debono,M.),1989.J.Antibiot.(Tokyo),42,382-3
88。デアシラーゼ活性の最大産生は、培養培地の接種後
約９０時間で起こる。前記、および下記実施例１の記載
の如く、全細胞を好ましくは塩化カリウムで塩処理する
ことによって、粗製形の酵素を可溶化する。
【００２４】粗製可溶化酵素は、疎水性相互作用クロマ
トグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィーおよび
ゲル濾過工程からなる本発明の精製法でほぼ均一まで精
製される。前記のように、ＥＣＢデアシラーゼは、ゆる
く細胞に結合した蛋白として作用し、A.utahensisの全
細胞を無機塩で処理することによって、選択的に可溶化
される。塩化カリウムを使用するのが好ましい。可溶化
した酵素の溶液を望ましくは濾過し、濾液を限外濾過に
よって濃縮して、以下の工程のためのより濃縮されたデ
アシラーゼ溶液を得る。
トグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィーおよび
ゲル濾過工程からなる本発明の精製法でほぼ均一まで精
製される。前記のように、ＥＣＢデアシラーゼは、ゆる
く細胞に結合した蛋白として作用し、A.utahensisの全
細胞を無機塩で処理することによって、選択的に可溶化
される。塩化カリウムを使用するのが好ましい。可溶化
した酵素の溶液を望ましくは濾過し、濾液を限外濾過に
よって濃縮して、以下の工程のためのより濃縮されたデ
アシラーゼ溶液を得る。
【００２５】この方法の第１工程では、濃縮された細胞
抽出物を約６０℃で１時間加熱し、温時、１４％硫酸ア
ンモニウムおよび１.２Ｍ塩化カリウムで処理する。熱
処理によって、６０℃で不安定な溶液中の他の蛋白は沈
澱する。ＥＣＢデアシラーゼは６０℃で安定であり、可
溶化が維持される。
抽出物を約６０℃で１時間加熱し、温時、１４％硫酸ア
ンモニウムおよび１.２Ｍ塩化カリウムで処理する。熱
処理によって、６０℃で不安定な溶液中の他の蛋白は沈
澱する。ＥＣＢデアシラーゼは６０℃で安定であり、可
溶化が維持される。
【００２６】次いで、熱処理抽出物を、例えば市販品と
して入手し得るオクチル・セファロース(Octyl Sepharo
se, Pharmacia)の如き脂質置換アガロースのような疎水
性相互作用クロマトグラフィー用物質にて、約２５℃の
温度で、疎水性相互作用クロマトグラフィーにかける。
約０.０５Ｍリン酸二水素カリウムまたはその他の好適
な緩衝液、１.２Ｍ塩化カリウムおよび１４％硫酸アン
モニウムで、カラムをpＨ６に平衡化する。カラムを望
ましくは同一緩衝液で洗浄し、結合している蛋白を、
０.０５Ｍ ＫＨ2ＰＯ4、pＨ６緩衝液中、ＫＣl(１.２−
０.１Ｍ)と(ＮＨ4)2ＳＯ4(１４−０％)の同時直線グラ
ジエントで溶離する。ＥＣＢデアシラーゼは、単一の不
均整な活性ピークとして溶出される。
して入手し得るオクチル・セファロース(Octyl Sepharo
se, Pharmacia)の如き脂質置換アガロースのような疎水
性相互作用クロマトグラフィー用物質にて、約２５℃の
温度で、疎水性相互作用クロマトグラフィーにかける。
約０.０５Ｍリン酸二水素カリウムまたはその他の好適
な緩衝液、１.２Ｍ塩化カリウムおよび１４％硫酸アン
モニウムで、カラムをpＨ６に平衡化する。カラムを望
ましくは同一緩衝液で洗浄し、結合している蛋白を、
０.０５Ｍ ＫＨ2ＰＯ4、pＨ６緩衝液中、ＫＣl(１.２−
０.１Ｍ)と(ＮＨ4)2ＳＯ4(１４−０％)の同時直線グラ
ジエントで溶離する。ＥＣＢデアシラーゼは、単一の不
均整な活性ピークとして溶出される。
【００２７】全デアシラーゼ活性の約９５％を含有して
いるピーク画分を集め、硫酸アンモニウム分画を行な
う。１０−３６％(ＮＨ4)2ＳＯ4画分を集め、０.８Ｍ
ＫＣlを含有しているpＨ６緩衝液中でゲル濾過を行な
う。使用し得るゲルのタイプは種々であってよいが、セ
ファクリル(Sephacryl) Ｓ−２００ＨＲは好適なゲルで
ある。酵素は、１つの主要な活性ピークおよびそれより
小さい活性ピークとして溶出される。主要なピークか
ら、デアシラーゼ活性の９０％を含有するピーク画分を
集め、０.０５Ｍ ＫＣl、pＨ５.６に調節する。集めた
画分を、例えばトリスアクリル−ＣＭ(Trisacryl-CM,IB
F Biotechnics)である、市販品として入手し得るトリス
アクリル樹脂の１種のような適当な陽イオン交換樹脂に
て、陽イオン交換クロマトグラフィーにかける。０.０
５Ｍ ＫＨ2ＰＯ4、pＨ５.６および０.０５Ｍ ＫＣlでカ
ラムを平衡化する。同一緩衝液でカラムを洗浄し、結合
している蛋白を、同一緩衝液中ＫＣlの直線グラジエン
ト(０.０５Ｍ−０.５Ｍ)で溶離する。デアシラーゼ酵素
は、２つの活性ピークとして溶出される。
いるピーク画分を集め、硫酸アンモニウム分画を行な
う。１０−３６％(ＮＨ4)2ＳＯ4画分を集め、０.８Ｍ
ＫＣlを含有しているpＨ６緩衝液中でゲル濾過を行な
う。使用し得るゲルのタイプは種々であってよいが、セ
ファクリル(Sephacryl) Ｓ−２００ＨＲは好適なゲルで
ある。酵素は、１つの主要な活性ピークおよびそれより
小さい活性ピークとして溶出される。主要なピークか
ら、デアシラーゼ活性の９０％を含有するピーク画分を
集め、０.０５Ｍ ＫＣl、pＨ５.６に調節する。集めた
画分を、例えばトリスアクリル−ＣＭ(Trisacryl-CM,IB
F Biotechnics)である、市販品として入手し得るトリス
アクリル樹脂の１種のような適当な陽イオン交換樹脂に
て、陽イオン交換クロマトグラフィーにかける。０.０
５Ｍ ＫＨ2ＰＯ4、pＨ５.６および０.０５Ｍ ＫＣlでカ
ラムを平衡化する。同一緩衝液でカラムを洗浄し、結合
している蛋白を、同一緩衝液中ＫＣlの直線グラジエン
ト(０.０５Ｍ−０.５Ｍ)で溶離する。デアシラーゼ酵素
は、２つの活性ピークとして溶出される。
【００２８】それぞれのピークからデアシラーゼ活性含
有画分を集めて０.０５Ｍ ＫＣlに調節し、レッド−セ
ファロース(Red-Sepharose, Pharmacia, Inc.)またはダ
イマトレックス・ブルーＡ(Dyematrex Blue A, Amicon)
のような染色−リガンドゲルに適用する。使用前に、
０.０５Ｍ ＫＨ2ＰＯ4、pＨ６.０および０.０５Ｍ ＫＣ
lでゲルを平衡化する。結合した蛋白を、好ましくは同
一緩衝液中、ＫＣｌのステップワイズグラジエント(０.
０５−２−３.３Ｍ)でレッド−セファロースから、また
は好ましくは同一緩衝液中ＫＣｌの直線グラジエント
(０.０５−２.５Ｍ)でブルーＡゲルから溶離する。染色
−リガンドクロマトグラフィーから、ブロードな広い不
均整な活性ピークを得る。
有画分を集めて０.０５Ｍ ＫＣlに調節し、レッド−セ
ファロース(Red-Sepharose, Pharmacia, Inc.)またはダ
イマトレックス・ブルーＡ(Dyematrex Blue A, Amicon)
のような染色−リガンドゲルに適用する。使用前に、
０.０５Ｍ ＫＨ2ＰＯ4、pＨ６.０および０.０５Ｍ ＫＣ
lでゲルを平衡化する。結合した蛋白を、好ましくは同
一緩衝液中、ＫＣｌのステップワイズグラジエント(０.
０５−２−３.３Ｍ)でレッド−セファロースから、また
は好ましくは同一緩衝液中ＫＣｌの直線グラジエント
(０.０５−２.５Ｍ)でブルーＡゲルから溶離する。染色
−リガンドクロマトグラフィーから、ブロードな広い不
均整な活性ピークを得る。
【００２９】染色−リガンドゲルから、全活性の約８０
％を含有しているピーク画分を集め、０.０５Ｍ ＫＨ2
ＰＯ4、pＨ６.０および０.２Ｍ ＫＣlで予め平衡化した
ウルトラゲルＡｃＡ４４(IBF Biotechnics)のようなタ
イプのゲルでゲル濾過する。酵素は単一の活性ピークと
して溶出され、デアシラーゼの全てを含有しているピー
ク画分を集める。
％を含有しているピーク画分を集め、０.０５Ｍ ＫＨ2
ＰＯ4、pＨ６.０および０.２Ｍ ＫＣlで予め平衡化した
ウルトラゲルＡｃＡ４４(IBF Biotechnics)のようなタ
イプのゲルでゲル濾過する。酵素は単一の活性ピークと
して溶出され、デアシラーゼの全てを含有しているピー
ク画分を集める。
【００３０】集めた画分を０.０４Ｍ ＫＣl、pＨ７.０
に調節し、次いで再び、トリスアクリル−ＣＭのような
負に荷電した樹脂で陽イオン交換クロマトグラフィーを
行なう。使用前に、０.０５Ｍ ＫＨ2ＰＯ4、pＨ７.０お
よび０.０４Ｍ ＫＣl緩衝液で樹脂を平衡化し、結合し
たデアシラーゼを同一緩衝液中ＫＣlのステップワイズ
グラジエント(０.０４−０.５−２Ｍ)で溶離する。１つ
のブロードな活性ピークおよび１つのシャープなそれよ
り小さい活性ピークが観察される。これらの２つの活性
ピークからの精製酵素画分を、使用時まで−７０℃で貯
蔵することができる。
に調節し、次いで再び、トリスアクリル−ＣＭのような
負に荷電した樹脂で陽イオン交換クロマトグラフィーを
行なう。使用前に、０.０５Ｍ ＫＨ2ＰＯ4、pＨ７.０お
よび０.０４Ｍ ＫＣl緩衝液で樹脂を平衡化し、結合し
たデアシラーゼを同一緩衝液中ＫＣlのステップワイズ
グラジエント(０.０４−０.５−２Ｍ)で溶離する。１つ
のブロードな活性ピークおよび１つのシャープなそれよ
り小さい活性ピークが観察される。これらの２つの活性
ピークからの精製酵素画分を、使用時まで−７０℃で貯
蔵することができる。
【００３１】ＥＣＢデアシラーゼの精製のための上記８
工程法の間に、２種類のサイズおよび２種類の電荷の形
の酵素が観察される。最後の陽イオン交換クロマトグラ
フィーで得た主要なピークをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって
分析した結果、２本の近接した遅く移動するバンドと２
本の近接した速く移動するバンドを示した。小さい方の
陽イオン交換クロマトグラフィーピークは、１本の遅く
移動するバンドと２本の速く移動するバンドを示した。
第２の遅く移動するバンドが存在しないことは、この蛋
白がおそらく、第１の遅く移動するバンドからの分解産
物であることを示唆している。
工程法の間に、２種類のサイズおよび２種類の電荷の形
の酵素が観察される。最後の陽イオン交換クロマトグラ
フィーで得た主要なピークをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって
分析した結果、２本の近接した遅く移動するバンドと２
本の近接した速く移動するバンドを示した。小さい方の
陽イオン交換クロマトグラフィーピークは、１本の遅く
移動するバンドと２本の速く移動するバンドを示した。
第２の遅く移動するバンドが存在しないことは、この蛋
白がおそらく、第１の遅く移動するバンドからの分解産
物であることを示唆している。
【００３２】本発明の精製法によって得られた精製ＥＣ
Ｂデアシラーゼは、リポ環状ペプチドを脱アシル化して
その環状ペプチド核を得るための方法に有用である。具
体的には、この酵素は、シクロヘキサペプチドであるエ
キノカンジンＢおよびアクレアシンを脱アシル化する。
更に、この精製酵素は、ダプトマイシンを包含する環状
ペプチド、Ａ２１９７８抗生物質因子から脂肪酸側鎖を
切断する。
Ｂデアシラーゼは、リポ環状ペプチドを脱アシル化して
その環状ペプチド核を得るための方法に有用である。具
体的には、この酵素は、シクロヘキサペプチドであるエ
キノカンジンＢおよびアクレアシンを脱アシル化する。
更に、この精製酵素は、ダプトマイシンを包含する環状
ペプチド、Ａ２１９７８抗生物質因子から脂肪酸側鎖を
切断する。
【００３３】本発明の方法は、式ＡまたはＢ：
【化２】 ［式Ａにおいて、Ｒはリノレオイル、ミリストイルまた
はパルミトイルであり、式Ｂにおいて、Ｒ'はデカノイ
ル、８−メチルデカノイル、１０−メチルウンデカノイ
ルまたは１０−メチルドデカノイルである］で示される
環状ペプチドを、pＨ約５〜約７の水性媒質中、約２５
℃〜約７５℃の温度でエキノカンジンＢデアシラーゼと
混合し、ＲおよびＲ'が水素である式ＡまたはＢの化合
物を得ることからなる。
はパルミトイルであり、式Ｂにおいて、Ｒ'はデカノイ
ル、８−メチルデカノイル、１０−メチルウンデカノイ
ルまたは１０−メチルドデカノイルである］で示される
環状ペプチドを、pＨ約５〜約７の水性媒質中、約２５
℃〜約７５℃の温度でエキノカンジンＢデアシラーゼと
混合し、ＲおよびＲ'が水素である式ＡまたはＢの化合
物を得ることからなる。
【００３４】この方法は、約５５℃〜約６５℃の温度で
好適に行われる。適当な緩衝液を用いて媒質のpＨを維
持することができる。例えばＫＣlまたはＮaＣlの如き
塩化アルカリ金属、またはＫＮＯ3の如き硝酸アルカリ
金属のような塩は、酵素の活性に対して好ましい効果を
有するらしく、水性媒質に含有させることができる。塩
は、約０.０５Ｍ〜約３.０Ｍの濃度のＫＣlであるのが
好ましい。
好適に行われる。適当な緩衝液を用いて媒質のpＨを維
持することができる。例えばＫＣlまたはＮaＣlの如き
塩化アルカリ金属、またはＫＮＯ3の如き硝酸アルカリ
金属のような塩は、酵素の活性に対して好ましい効果を
有するらしく、水性媒質に含有させることができる。塩
は、約０.０５Ｍ〜約３.０Ｍの濃度のＫＣlであるのが
好ましい。
【００３５】基質の水溶解性が低い場合、媒質に水混和
性溶媒を加えてもよい。例えば、エキノカンジンＢは、
水に低い溶解性を有している。その溶解性を高めるため
に、反応媒質にジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)を加え
ることができる。ＤＭＳＯはデアシラーゼとも適合す
る。ＥＣＢおよびアクレアシンの場合に示されるよう
に、通常、約５％〜１５％v:vの量でＤＭＳＯを加える
ことができる。
性溶媒を加えてもよい。例えば、エキノカンジンＢは、
水に低い溶解性を有している。その溶解性を高めるため
に、反応媒質にジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)を加え
ることができる。ＤＭＳＯはデアシラーゼとも適合す
る。ＥＣＢおよびアクレアシンの場合に示されるよう
に、通常、約５％〜１５％v:vの量でＤＭＳＯを加える
ことができる。
【００３６】この方法は、緩衝化水性媒質で基質の溶液
を調製し、この混合物を反応温度に温め、酵素を加える
ことによって、好適に行なわれる。反応混合物を撹拌す
るか、振盪するか、またはかきまぜて、基質と酵素を十
分接触させる。反応混合物は、後述する分析方法で混合
物の少量を分析することによって、時々モニターするこ
とができる。また、緩衝化酵素溶液に基質の溶液を加え
てもよい。しかしながら、よりよい脱アシル化の結果は
通常、基質に酵素を加えることによって得られる。
を調製し、この混合物を反応温度に温め、酵素を加える
ことによって、好適に行なわれる。反応混合物を撹拌す
るか、振盪するか、またはかきまぜて、基質と酵素を十
分接触させる。反応混合物は、後述する分析方法で混合
物の少量を分析することによって、時々モニターするこ
とができる。また、緩衝化酵素溶液に基質の溶液を加え
てもよい。しかしながら、よりよい脱アシル化の結果は
通常、基質に酵素を加えることによって得られる。
【００３７】反応をモニターすることによって調べた
時、反応の進行が遅すぎるか、または早く終了しすぎた
りした場合、脱アシル化を完全にするために更に新しい
酵素を加えることができる。
時、反応の進行が遅すぎるか、または早く終了しすぎた
りした場合、脱アシル化を完全にするために更に新しい
酵素を加えることができる。
【００３８】固定化された酵素で本方法を行なうことも
できる。適当な不活性樹脂支持体に酵素を結合させ、カ
ラムに充填することができる。水性緩衝化溶液をカラム
に負荷し、緩衝液で洗浄すればよい。完全な変換を行な
うために、再び環形成が必要かもしれない。
できる。適当な不活性樹脂支持体に酵素を結合させ、カ
ラムに充填することができる。水性緩衝化溶液をカラム
に負荷し、緩衝液で洗浄すればよい。完全な変換を行な
うために、再び環形成が必要かもしれない。
【００３９】本発明の方法の好ましい態様は、エキノカ
ンジンＢ(式Ａ、Ｒ＝リノレオイル)のエキノカンジンＢ
核(式Ａ、Ｒ＝Ｈ)への脱アシル化を包含する。その他の
好ましい態様は、アクレアシン(式Ａ、Ｒ＝パルミトイ
ル)のそのＥＣＢ核への脱アシル化を包含する。
ンジンＢ(式Ａ、Ｒ＝リノレオイル)のエキノカンジンＢ
核(式Ａ、Ｒ＝Ｈ)への脱アシル化を包含する。その他の
好ましい態様は、アクレアシン(式Ａ、Ｒ＝パルミトイ
ル)のそのＥＣＢ核への脱アシル化を包含する。
【００４０】本発明の精製デアシラーゼについて行なわ
れた基質特異性の研究から、式ＡのエキノカンジンＢタ
イプおよび式ＢのＡ２１９７８抗生物質タイプの環状ペ
プチドについて、かなりブロードな特異性が判明した。
Ａ２１９７８基質は、米国特許第４,５３７,７１７号に
よって記載された既知の代謝物質である。この核のアシ
ル化によって製造される、ＥＣＢ核の幾つかの誘導体も
デアシラーゼのための基質であることが見い出された。
このようなアシル誘導体の例は、Ｒが、パラ位がＣ7Ｈ
15Ｏ−(３０％)、Ｃ5Ｈ11Ｏ−(１２％)で置換されてい
る３−フェニルプロピオニル基であるか；パラ位がＣ8
Ｈ7Ｏ−(３０％)またはＣ11Ｈ23Ｃ(Ｏ)ＮＨ−基(５％)
で置換されているフェニルアセチル基であるか；パラ位
がＣ11Ｈ23Ｃ(Ｏ)ＮＨ−基で置換されているベンゾイル
基であるか；またはパラ位がＣ11Ｈ23Ｃ(Ｏ)ＮＨ−基
(１５％)で置換されているシンナモイル基である時、上
の式Ａによって表わされる。括弧中の数は、ＥＣＢそれ
自体のデアシラーゼ活性を１００％とした時の活性パー
セントである。以下の実施例は本発明を更に例示および
説明するが、その限定を意図するものではない。
れた基質特異性の研究から、式ＡのエキノカンジンＢタ
イプおよび式ＢのＡ２１９７８抗生物質タイプの環状ペ
プチドについて、かなりブロードな特異性が判明した。
Ａ２１９７８基質は、米国特許第４,５３７,７１７号に
よって記載された既知の代謝物質である。この核のアシ
ル化によって製造される、ＥＣＢ核の幾つかの誘導体も
デアシラーゼのための基質であることが見い出された。
このようなアシル誘導体の例は、Ｒが、パラ位がＣ7Ｈ
15Ｏ−(３０％)、Ｃ5Ｈ11Ｏ−(１２％)で置換されてい
る３−フェニルプロピオニル基であるか；パラ位がＣ8
Ｈ7Ｏ−(３０％)またはＣ11Ｈ23Ｃ(Ｏ)ＮＨ−基(５％)
で置換されているフェニルアセチル基であるか；パラ位
がＣ11Ｈ23Ｃ(Ｏ)ＮＨ−基で置換されているベンゾイル
基であるか；またはパラ位がＣ11Ｈ23Ｃ(Ｏ)ＮＨ−基
(１５％)で置換されているシンナモイル基である時、上
の式Ａによって表わされる。括弧中の数は、ＥＣＢそれ
自体のデアシラーゼ活性を１００％とした時の活性パー
セントである。以下の実施例は本発明を更に例示および
説明するが、その限定を意図するものではない。
【００４１】実施例１ ＥＣＢデアシラーゼの製造およ
び精製 Ａ．Actinoplanes utahensisの発酵 Actinoplanes utahensis NRRL 12052を、ボエック等（B
oeck,L.D., Fukuda,D.S., Abbott,B.J., and Debono,
M.) 1989. J.Antibiot.(Tokyo),42, 382-388によって記
載された条件下、１５０リットル発酵槽で増殖させた。
高い活性のエキノカンジンＢデアシラーゼを含有してい
る細胞(接種後９０時間)を遠心によって集め、０.０５
Ｍ ＫＨ2ＰＯ4、pＨ６.０で洗浄し、酵素の単離および
精製のために使用した。
び精製 Ａ．Actinoplanes utahensisの発酵 Actinoplanes utahensis NRRL 12052を、ボエック等（B
oeck,L.D., Fukuda,D.S., Abbott,B.J., and Debono,
M.) 1989. J.Antibiot.(Tokyo),42, 382-388によって記
載された条件下、１５０リットル発酵槽で増殖させた。
高い活性のエキノカンジンＢデアシラーゼを含有してい
る細胞(接種後９０時間)を遠心によって集め、０.０５
Ｍ ＫＨ2ＰＯ4、pＨ６.０で洗浄し、酵素の単離および
精製のために使用した。
【００４２】Ｂ．酵素の可溶化および精製特に断らない
限り、約０℃〜４℃の温度で以下の分離精製法を行なっ
た。９０時間で発酵培地１００リットルの検定を行なっ
たところ、実質上全てのデアシラーゼ活性が細胞に関連
していることを示した。この実施例で使用した検定法を
以下に記載する。
限り、約０℃〜４℃の温度で以下の分離精製法を行なっ
た。９０時間で発酵培地１００リットルの検定を行なっ
たところ、実質上全てのデアシラーゼ活性が細胞に関連
していることを示した。この実施例で使用した検定法を
以下に記載する。
【００４３】新鮮な細胞(７.９kg湿重量)を０.０５Ｍ
ＫＨ2ＰＯ4、pＨ６.０および０.８ＭＫＣlに再懸濁して
５７リットルの総容量とし、この懸濁液を連続して１日
間撹拌した。この塩処理によって、大部分の細胞関連デ
アシラーゼ活性が選択的に可溶化した。
ＫＨ2ＰＯ4、pＨ６.０および０.８ＭＫＣlに再懸濁して
５７リットルの総容量とし、この懸濁液を連続して１日
間撹拌した。この塩処理によって、大部分の細胞関連デ
アシラーゼ活性が選択的に可溶化した。
【００４４】可溶化したデアシラーゼをワットマンＮ
ｏ．１ペーパーで濾過し、濾液をアミコンＹＭ３０スパ
イラル限外濾過カートリッジで３.３リットル容量に濃
縮した。濃縮された抽出物を６０℃で１時間加熱した。
ｏ．１ペーパーで濾過し、濾液をアミコンＹＭ３０スパ
イラル限外濾過カートリッジで３.３リットル容量に濃
縮した。濃縮された抽出物を６０℃で１時間加熱した。
【００４５】熱処理した酵素抽出物を１４％濃度の(Ｎ
Ｈ4)2ＳＯ4および１.２Ｍ ＫＣlで処理し、０.０５Ｍ
ＫＨ2ＰＯ4、pＨ６.０、１.２ＭＫＣlおよび１４％(Ｎ
Ｈ4)2ＳＯ4で予め平衡化したオクチル−セファロースカ
ラム(５×３６cm)に負荷した。カラムを２倍床容量の同
一緩衝液で洗浄し、結合している蛋白を０.０５Ｍ ＫＨ
2ＰＯ4、pＨ６.０中、ＫＣl(１.２−０.１Ｍ)および(Ｎ
Ｈ4)2ＳＯ4(１４−０％)の同時直線グラジエントで溶離
した。このクロマトグラフィー(疎水性相互作用クロマ
トグラフィー)を約２５℃の温度で行なった。ＥＣＢデ
アシラーゼは、単一であるが不均整な活性ピークとして
溶出された。
Ｈ4)2ＳＯ4および１.２Ｍ ＫＣlで処理し、０.０５Ｍ
ＫＨ2ＰＯ4、pＨ６.０、１.２ＭＫＣlおよび１４％(Ｎ
Ｈ4)2ＳＯ4で予め平衡化したオクチル−セファロースカ
ラム(５×３６cm)に負荷した。カラムを２倍床容量の同
一緩衝液で洗浄し、結合している蛋白を０.０５Ｍ ＫＨ
2ＰＯ4、pＨ６.０中、ＫＣl(１.２−０.１Ｍ)および(Ｎ
Ｈ4)2ＳＯ4(１４−０％)の同時直線グラジエントで溶離
した。このクロマトグラフィー(疎水性相互作用クロマ
トグラフィー)を約２５℃の温度で行なった。ＥＣＢデ
アシラーゼは、単一であるが不均整な活性ピークとして
溶出された。
【００４６】全デアシラーゼ活性の９５％を含有してい
るピーク画分を集め、(ＮＨ4)2ＳＯ4で分画した。１０
−３６％(ＮＨ4)2ＳＯ4画分を、０.０５Ｍ ＫＨ2Ｐ
Ｏ4、pＨ６.０および０.８Ｍ ＫＣl(緩衝液Ａ)で予め平
衡化したセファクリルＳ−２００ＨＲカラム(５×６９c
m)に負荷した。デアシラーゼは、主要な活性ピークおよ
びそれより小さい活性ピークとして溶出された。主要な
ピークから酵素活性の９０％を含有しているピーク画分
を集め、０.０５Ｍ ＫＣｌ、ｐＨ５.６に調節し、０.０
５Ｍ ＫＨ2ＰＯ4、pＨ５.６および０.０５Ｍ ＫＣl(緩
衝液Ｂ)で予め平衡化したトリアスクリル−ＣＭカラム
(２.５×３３cm)に負荷した。カラムを２倍床容量の緩
衝液Ｂで洗浄し、結合している蛋白を緩衝液Ｂ中、ＫＣ
ｌの直線グラジエント(０.０５−０.５Ｍ)で溶離した。
デアシラーゼは、２つの活性ピークとして溶出された。
るピーク画分を集め、(ＮＨ4)2ＳＯ4で分画した。１０
−３６％(ＮＨ4)2ＳＯ4画分を、０.０５Ｍ ＫＨ2Ｐ
Ｏ4、pＨ６.０および０.８Ｍ ＫＣl(緩衝液Ａ)で予め平
衡化したセファクリルＳ−２００ＨＲカラム(５×６９c
m)に負荷した。デアシラーゼは、主要な活性ピークおよ
びそれより小さい活性ピークとして溶出された。主要な
ピークから酵素活性の９０％を含有しているピーク画分
を集め、０.０５Ｍ ＫＣｌ、ｐＨ５.６に調節し、０.０
５Ｍ ＫＨ2ＰＯ4、pＨ５.６および０.０５Ｍ ＫＣl(緩
衝液Ｂ)で予め平衡化したトリアスクリル−ＣＭカラム
(２.５×３３cm)に負荷した。カラムを２倍床容量の緩
衝液Ｂで洗浄し、結合している蛋白を緩衝液Ｂ中、ＫＣ
ｌの直線グラジエント(０.０５−０.５Ｍ)で溶離した。
デアシラーゼは、２つの活性ピークとして溶出された。
【００４７】２つのピークのそれぞれからデアシラーゼ
活性を含有している画分を集め、ピーク毎に集めた。こ
の２つの酵素プールを０.０５Ｍ ＫＣlに調節し、一方
のプールをレッド−セファロースカラム(３.２×１５.
５cm)に、他方をダイマトレックス・ブルーＡカラム
(２.２×２２cm)に負荷した。両方のカラムを、０.０５
ＭＫＨ2ＰＯ4、pＨ６.０および０.０５Ｍ ＫＣl(緩衝液
Ｃ)で予め平衡化した。両方のカラムを２倍床容量の緩
衝液Ｃで洗浄した後、結合している蛋白を、緩衝液Ｃ中
ＫＣｌのステップワイズグラジエント(０.０５−２−
３.３Ｍ)でレッド−セファロースカラムから、緩衝液Ｃ
中ＫＣｌの直線グラジエント(０.０５−２.５Ｍ)でブル
ーＡカラムから溶離した。各染色−リガンドクロマトグ
ラフィーから、ブロードかつ不均整な活性ピークが観察
された。
活性を含有している画分を集め、ピーク毎に集めた。こ
の２つの酵素プールを０.０５Ｍ ＫＣlに調節し、一方
のプールをレッド−セファロースカラム(３.２×１５.
５cm)に、他方をダイマトレックス・ブルーＡカラム
(２.２×２２cm)に負荷した。両方のカラムを、０.０５
ＭＫＨ2ＰＯ4、pＨ６.０および０.０５Ｍ ＫＣl(緩衝液
Ｃ)で予め平衡化した。両方のカラムを２倍床容量の緩
衝液Ｃで洗浄した後、結合している蛋白を、緩衝液Ｃ中
ＫＣｌのステップワイズグラジエント(０.０５−２−
３.３Ｍ)でレッド−セファロースカラムから、緩衝液Ｃ
中ＫＣｌの直線グラジエント(０.０５−２.５Ｍ)でブル
ーＡカラムから溶離した。各染色−リガンドクロマトグ
ラフィーから、ブロードかつ不均整な活性ピークが観察
された。
【００４８】レッド−セファロースのピークから全デア
シラーゼ活性の８０％を含有しているピーク画分を集
め、０.０５Ｍ ＫＨ2ＰＯ4、pＨ６.０、および０.２Ｍ
ＫＣl(緩衝液Ｄ)で予め平衡化したウルトラゲルＡｃ４
４カラム(１×１１８cm)に負荷した。デアシラーゼは、
単一の活性ピークとして溶出された。
シラーゼ活性の８０％を含有しているピーク画分を集
め、０.０５Ｍ ＫＨ2ＰＯ4、pＨ６.０、および０.２Ｍ
ＫＣl(緩衝液Ｄ)で予め平衡化したウルトラゲルＡｃ４
４カラム(１×１１８cm)に負荷した。デアシラーゼは、
単一の活性ピークとして溶出された。
【００４９】デアシラーゼ活性の全てを含有しているピ
ーク画分を集め、０.０４Ｍ ＫＣl、pＨ７.０に調節
し、０.０５Ｍ ＫＨ2ＰＯ4、pＨ７.０、および０.０４
Ｍ ＫＣl(緩衝液Ｅ)で予め平衡化したトリスアクリル−
ＣＭカラム(１×３４cm)に負荷した。２倍床容量の緩衝
液Ｅでカラムを洗浄した後、結合している蛋白を、緩衝
液Ｅ中ＫＣlのステップ−ワイズグラジエント(０.０４
−０.５−２Ｍ)で溶離した。１つのブロードな主要な活
性ピークおよび１つのシャープな小さい活性ピークが観
察された。この２つの活性ピークからの画分を、必要時
までそれぞれ−７０℃で貯蔵した。
ーク画分を集め、０.０４Ｍ ＫＣl、pＨ７.０に調節
し、０.０５Ｍ ＫＨ2ＰＯ4、pＨ７.０、および０.０４
Ｍ ＫＣl(緩衝液Ｅ)で予め平衡化したトリスアクリル−
ＣＭカラム(１×３４cm)に負荷した。２倍床容量の緩衝
液Ｅでカラムを洗浄した後、結合している蛋白を、緩衝
液Ｅ中ＫＣlのステップ−ワイズグラジエント(０.０４
−０.５−２Ｍ)で溶離した。１つのブロードな主要な活
性ピークおよび１つのシャープな小さい活性ピークが観
察された。この２つの活性ピークからの画分を、必要時
までそれぞれ−７０℃で貯蔵した。
【００５０】以下の表３は、上で詳述したＥＣＢデアシ
ラーゼの分離および精製の各工程で得られた結果を示
す。
ラーゼの分離および精製の各工程で得られた結果を示
す。
【表３】
【００５１】前記のように、トリスアクリル−ＣＭによ
る第１および第２の陽イオン交換クロマトグラフィーで
は２つの活性ピークが観察された。第１のクロマトグラ
フィーの２つのピーク、ＡおよびＢの各々から画分を集
め、示されたようにして別個に分析した。集めたＡ画分
をレッド−セファロース染色−リガンドクロマトグラフ
ィー(Ａ１)にかけ、一方、第２の活性ピークＢの画分を
ダイマトレックス・ブルーＡ染色−リガンドクロマトグ
ラフィー(Ｂ１)にかけた。それぞれの染色−リガンドク
ロマトグラフィーの溶出液を分析した時、レッド−セフ
ァロース処理では比活性が上昇したが、ブルーＡでは比
活性がわずかしか上昇しなかった。従って、この場合、
ウルトロゲル濾過(Ａla)、次いでトリスアクリル−ＣＭ
による陽イオン交換クロマトグラフィーによって更に精
製するために、レッド−セファロースカラムの溶出液が
選択された。前記陽イオン交換クロマトグラフィーの場
合と同様に、２つの活性ピーク(酵素形)を集め、別個に
検定した。
る第１および第２の陽イオン交換クロマトグラフィーで
は２つの活性ピークが観察された。第１のクロマトグラ
フィーの２つのピーク、ＡおよびＢの各々から画分を集
め、示されたようにして別個に分析した。集めたＡ画分
をレッド−セファロース染色−リガンドクロマトグラフ
ィー(Ａ１)にかけ、一方、第２の活性ピークＢの画分を
ダイマトレックス・ブルーＡ染色−リガンドクロマトグ
ラフィー(Ｂ１)にかけた。それぞれの染色−リガンドク
ロマトグラフィーの溶出液を分析した時、レッド−セフ
ァロース処理では比活性が上昇したが、ブルーＡでは比
活性がわずかしか上昇しなかった。従って、この場合、
ウルトロゲル濾過(Ａla)、次いでトリスアクリル−ＣＭ
による陽イオン交換クロマトグラフィーによって更に精
製するために、レッド−セファロースカラムの溶出液が
選択された。前記陽イオン交換クロマトグラフィーの場
合と同様に、２つの活性ピーク(酵素形)を集め、別個に
検定した。
【００５２】酵素検定 デアシラーゼ活性を決定および測定するために本発明
で使用した検定は、基質としてエキノカンジンＢを使用
する。ＥＣＢデアシラーゼ検定のための代表的反応混合
物１mlは、ＥＣＢの溶液を調製するために、０.６８Ｍ
ＫＣlおよび１５％ＤＭＳＯの存在下、０.０５Ｍ ＫＨ2
ＰＯ4、pＨ６.０中に、ＥＣＢ４２５μモルおよび酵素
０.０００００３〜０.００３単位を含有した。酵素反応
は、酵素を加えることによって開始され、リン酸を加え
て停止されるまで６０℃で２０分間続けられた。低速遠
心して沈殿した蛋白を除去した後、ＨＰＬＣを使用し、
２２５nmでＥＣＢ核の形成をモニターすることによっ
て、デアシラーゼ活性を測定した。
で使用した検定は、基質としてエキノカンジンＢを使用
する。ＥＣＢデアシラーゼ検定のための代表的反応混合
物１mlは、ＥＣＢの溶液を調製するために、０.６８Ｍ
ＫＣlおよび１５％ＤＭＳＯの存在下、０.０５Ｍ ＫＨ2
ＰＯ4、pＨ６.０中に、ＥＣＢ４２５μモルおよび酵素
０.０００００３〜０.００３単位を含有した。酵素反応
は、酵素を加えることによって開始され、リン酸を加え
て停止されるまで６０℃で２０分間続けられた。低速遠
心して沈殿した蛋白を除去した後、ＨＰＬＣを使用し、
２２５nmでＥＣＢ核の形成をモニターすることによっ
て、デアシラーゼ活性を測定した。
【００５３】ＨＰＬＣの構成要素は、ＩＢＭ ＰＳ／２
モデル８０およびカラー・ディスプレイ(Color Displa
y, IBM，Armonk, N.Y.)、ウォーター７１５ウルトラＷ
ＩＳＰサンプル・プロセッサー(Water 715 Ultra WISP
Sample Processor, Waters Associates, Milford, M
A)、およびベックマン・システム・ゴールド・プログラ
マブル・ソルベント・モジュール１２６(Beckman Syste
m Gold Programmable Solvent Module 126)およびスキ
ャンニング・ディテクター・モジュール１６７(Scannin
g Detector Module 167, Beckman, Fullerton, CA)であ
った。
モデル８０およびカラー・ディスプレイ(Color Displa
y, IBM，Armonk, N.Y.)、ウォーター７１５ウルトラＷ
ＩＳＰサンプル・プロセッサー(Water 715 Ultra WISP
Sample Processor, Waters Associates, Milford, M
A)、およびベックマン・システム・ゴールド・プログラ
マブル・ソルベント・モジュール１２６(Beckman Syste
m Gold Programmable Solvent Module 126)およびスキ
ャンニング・ディテクター・モジュール１６７(Scannin
g Detector Module 167, Beckman, Fullerton, CA)であ
った。
【００５４】アペックス・オクタデシル３μ(Apex Octa
decyl3μ)カラム(4.6×10cm)(Jones Chromatography, L
ittleton, Co.)から、３.９％ ＣＨ3ＣＮ／０.１％ ト
リフルオロ酢酸の移動相および１ml／分の流速でＥＣＢ
核を溶離した。核の形成は、検定の間、時間について直
線状であった。ＨＰＬＣ分析を２回行なった結果、平均
２−３％の偏差があった。本明細書で使用する時、酵素
活性１単位は、上記の反応条件下、ＥＣＢから１分間当
たり１マイクロモルのＥＣＢ核を形成させるのに必要な
デアシラーゼの量として定義される。
decyl3μ)カラム(4.6×10cm)(Jones Chromatography, L
ittleton, Co.)から、３.９％ ＣＨ3ＣＮ／０.１％ ト
リフルオロ酢酸の移動相および１ml／分の流速でＥＣＢ
核を溶離した。核の形成は、検定の間、時間について直
線状であった。ＨＰＬＣ分析を２回行なった結果、平均
２−３％の偏差があった。本明細書で使用する時、酵素
活性１単位は、上記の反応条件下、ＥＣＢから１分間当
たり１マイクロモルのＥＣＢ核を形成させるのに必要な
デアシラーゼの量として定義される。
【００５５】比活性(表３)は、蛋白１mg当たりの単位と
して定義される。蛋白含有量は、標準としてウシ血清ア
ルブミンを使用するブラッドフォードの方法(Bradford,
M.M.,(1976) Anal.Biochem.72,248-254)によって決定さ
れた。
して定義される。蛋白含有量は、標準としてウシ血清ア
ルブミンを使用するブラッドフォードの方法(Bradford,
M.M.,(1976) Anal.Biochem.72,248-254)によって決定さ
れた。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ウ・ヤン・イェ アメリカ合衆国46142インディアナ州グ リーンウッド、プライムローズ・コート 720番 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (10)
- 【請求項１】 約１０Ｕ／mg〜約１１.２５Ｕ／mgの比
活性を有し、アミノ末端配列：Ｓer−Ａsn−Ａla−Ｔyr
−Ｇly−Ｌeu−Ｇly−Ａla−Ｇln−Ａla−Ｔhr−Ｖal−
Ａsn−Ｇly−Ｓer−Ｇly−Ｍet−Ｖal−Ｌeu−Ａla−Ａ
sn−Ｐro−Ｈis−Ｐhe−Ｐro−(Ｔrp)−Ｇln−−−Ａla
−Ｇlu−(Ａrg)−Ｐhe−Ｔyrを有する６３−キロダルト
ンのサブユニットおよびアミノ末端配列：Ｈis−Ａsp−
Ｇly−Ｇly−Ｔyr−Ａla−Ａla−Ｌeu−Ｉle−Ａrg−Ａ
rg−Ａla−Ｓer−Ｔyr−Ｇly−Ｖal−(Ｐro)−Ｈis−Ｉ
le−Ｔhr−Ａla−Ａsp−Ａsp−Ｐheを有する１８−キロ
ダルトンのサブユニットを有し、基質としてのエキノカ
ンジンＢの脱アシル化において、０.０５Ｍ ＫＨ2ＰＯ4
緩衝液中、約pＨ６.０、約６０℃で至適触媒活性を示
す、以下のアミノ酸組成： を有する８１−キロダルトンのヘテロダイマーである、
精製エキノカンジンＢデアシラーゼ。 - 【請求項２】 １）約pＨ６.０で緩衝化された粗製デア
シラーゼの水性溶液を約６０℃の温度で約１時間加熱
し、２）pＨ６.０、１.２Ｍ ＫＣｌおよび１４％(Ｎ
Ｈ4)2ＳＯ4で緩衝化された熱処理抽出物を、疎水性相互
作用クロマトグラフィーにてクロマトグラフし、３）工
程３からのデアシラーゼ活性の９５％を含有している溶
出液を(ＮＨ4)2ＳＯ4によって分画して、１０％〜３６
％(ＮＨ4)2ＳＯ4画分を分離し、４）該(ＮＨ4)2ＳＯ4画
分を、０.８Ｍ ＫＣｌを含有しているpＨ６.０の緩衝液
中でゲル濾過して、デアシラーゼ活性の９０％を含有し
ている溶出液画分を合し、５）該画分を、pＨ５.６、
０.０５Ｍ ＫＣｌ緩衝液中、陽イオン交換クロマトグラ
フィーでクロマトグラフして、該クロマトグラフィーは
該緩衝液中ＫＣｌの直線グラジエント(０.０５−０.５
Ｍ)で溶離し、６）工程５のデアシラーゼ含有溶出液を
０.０５Ｍ ＫＣｌに調節して、該溶出液を、０.０５Ｍ
ＫＨ2ＰＯ4、pＨ６.０および０.０５Ｍ ＫＣｌ緩衝液
中、染色−リガンドクロマトグラフィーでクロマトグラ
フし、該クロマトグラフィーはＫＣｌの直線グラジエン
ト(０.０５Ｍ−２.５Ｍ)で溶離し、７）デアシラーゼ活
性の８０％を含有している工程６からの集めた溶出画分
を０.０５Ｍ ＫＨ2ＰＯ4、pＨ６.０および０.２Ｍ ＫＣ
ｌ緩衝液中でゲル濾過し、８）工程７のデアシラーゼ含
有溶出液を０.０４Ｍ ＫＣｌ、pＨ７に調節して、該溶
出液を、０.０５Ｍ ＫＨ2ＰＯ4、pＨ７.０および０.０
４Ｍ ＫＣｌ緩衝液中、陽イオン交換クロマトグラフィ
ーでクロマトグラフし、ＫＣlのステップ−ワイズグラ
ジエント(０.０４−０.５−２Ｍ)で精製デアシラーゼを
溶離することからなる、請求項１の精製デアシラーゼの
製造法。 - 【請求項３】 式ＡまたはＢ： 【化１】 ［式Ａにおいて、Ｒはリノレオイル、ミリストイルまた
はパルミトイルであり、式Ｂにおいて、Ｒ'はデカノイ
ル、８−メチルデカノイル、１０−メチルウンデカノイ
ルまたは１０−メチルドデカノイルである］で示される
環状ペプチドを、pＨ約５〜約７の水性媒質中、約２５
℃〜約７５℃の温度で請求項１の精製デアシラーゼと混
合し、ＲまたはＲ'が水素である式ＡまたはＢの化合物
を得ることからなる、該環状ペプチドの脱アシル化法。 - 【請求項４】 温度が約５５℃から約６５℃で維持され
る請求項３に記載の方法。 - 【請求項５】 水性媒質が塩化アルカリ金属または硝酸
アルカリ金属から選ばれる無機塩を含有する請求項３に
記載の方法。 - 【請求項６】 塩が約０.１Ｍから約３.０Ｍの濃度の塩
化カリウムである請求項５に記載の方法。 - 【請求項７】 式Ａにおいて、Ｒがリノレオイルである
請求項３に記載の方法。 - 【請求項８】 式Ａにおいて、Ｒがパルミトイルである
請求項３に記載の方法。 - 【請求項９】 式Ｂにおいて、Ｒ'がデカノイルである
請求項３に記載の方法。 - 【請求項１０】 水性媒質が約５％〜約１５％の濃度で
ジメチルスルホキシドを含有する請求項３に記載の方
法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US53439490A | 1990-06-07 | 1990-06-07 | |
| US534,394 | 1990-06-07 |
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|---|---|
| JPH04228072A JPH04228072A (ja) | 1992-08-18 |
| JP2994486B2 true JP2994486B2 (ja) | 1999-12-27 |
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| US6361988B1 (en) | 1997-03-25 | 2002-03-26 | California Institute Of Technology | ECB deacylase mutants |
| US6153410A (en) * | 1997-03-25 | 2000-11-28 | California Institute Of Technology | Recombination of polynucleotide sequences using random or defined primers |
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| IL143563A0 (en) | 1998-12-09 | 2002-04-21 | Lilly Co Eli | Purification of echinocandin cyclopeptide compounds |
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| ATE338060T1 (de) | 1999-03-03 | 2006-09-15 | Lilly Co Eli | Bildung und anionenaustausch von inneren kristallinen ammoniumsalzen des echinocandins b |
| JP2002538097A (ja) | 1999-03-03 | 2002-11-12 | イーライ リリー アンド カンパニー | 薬学的経口ｅｃｂ処方物および組成物の作製方法 |
| EP1156782B1 (en) | 1999-03-03 | 2005-05-04 | Eli Lilly And Company | Echinocandin pharmaceutical formulations containing micelle-forming surfactants |
| HUP0202315A2 (en) * | 1999-07-15 | 2002-10-28 | Lilly Co Eli | Process for deacylation of lipodepsipeptides |
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| US7408025B2 (en) * | 1999-12-15 | 2008-08-05 | Cubist Pharmaceuticals, Inc. | Lipopeptides as antibacterial agents |
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| NZ531493A (en) * | 2001-08-06 | 2006-03-31 | Cubist Pharm Inc | Novel depsipeptides and process for preparing same, useful in the treatment of bacterial infection |
| US6991800B2 (en) | 2002-06-13 | 2006-01-31 | Vicuron Pharmaceuticals Inc. | Antifungal parenteral products |
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