CN109593809A - 一种固定化微生物酶转化棘白菌素b的方法 - Google Patents

一种固定化微生物酶转化棘白菌素b的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种固定化微生物酶转化棘白菌素B的方法，属于生物工程领域，包括以下步骤：(1)犹他游动放线菌发酵，收集菌丝，利用细胞破碎仪，采用超声破碎的方法使细胞破碎，离心取上清液，得棘白菌素B脱酰酶的粗酶液；(2)向步骤(1)中的粗酶液中缓慢加入硫酸铵溶液，得沉淀；(3)将步骤(2)中的沉淀溶解于缓冲盐水溶液中；(4)向步骤(3)中加入海藻酸钠，搅拌均匀后滴加预冷的氯化钙水溶液，置于冰箱过夜，过滤得固定化微生物酶；(5)将棘白菌素B溶解乙醇中，并加入步骤(4)所述的固定化微生物酶，转化收集滤液，得棘白菌素B母核溶液。转化率高，转化时间短，产物易分离，转化液色素少，固定化酶易于保存且可重复使用。

Description

一种固定化微生物酶转化棘白菌素B的方法
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种固定化微生物酶转化棘白菌素B的方法。
背景技术
侵袭性真菌感染是引起免疫功能不全或住院病患罹病及死亡的主要原因之一，其中又以念珠菌属为常见致病菌，过去常用的抗真菌药物如两性霉素B易引起肾脏毒性，唑类抗真菌药物(如氟康唑、伊曲康唑)易与其他药物发生交互作用，使得临床使用受到限制。最新发展的棘白菌素类抗真菌药物，因疗效及安全性良好，成为侵袭性真菌感染的新选择。
芬净类药物作为棘白菌素家族的重要成员，可以抑制真菌细胞壁β-(1→3)-萄聚糖合成，对于临床常见的念珠菌属及其他真菌有较强的抗菌活性。已上市的芬净类药物阿尼芬净(anidulafungin)和米卡芬净(micafungin)都是由各自的前体在酰基水解酶作用下得到母核，再经过化学修饰而得，因此，制备棘白菌素母核已经成为芬净类药物合成的关键步骤。
目前，制备棘白菌素B母核通常由微生物转化来完成。棘白菌素B脱酰酶可从犹他游动放线菌(Actinoplanes utahensis)的发酵液中分离得到，该放线菌所产生的酰基水解酶可以水解棘白菌素B从而获得其母核。由于该步骤催化效率较低，微生物菌体难于稳定保持，致使该环节成为阿尼芬净生产过程中的瓶颈环节。
发明内容
针对上述用放线菌所产生的酰基水解酶水解棘白菌素B得到其母核时，催化效率较低，微生物菌体难于稳定保持的缺陷，本发明的目的在于提供一种固定化微生物酶转化棘白菌素B的方法。
为解决以上技术问题，本发明提供的技术方案是一种固定化微生物酶转化棘白菌素B的方法，包括以下步骤：
(1)犹他游动放线菌发酵，收集菌丝体，利用细胞破碎仪，采用超声破碎的方法使细胞破碎，控制温度，离心取上清液，得棘白菌素B脱酰酶的粗酶液300-500ml；
(2)向步骤(1)中的粗酶液中缓慢加入硫酸铵溶液，硫酸铵溶液的浓度为20％-40％，得沉淀；
(3)将步骤(2)中的沉淀溶解于缓冲盐水溶液中，缓冲盐水溶液的浓度为0.05-0.1mol/L，pH6.0～7.0；
(4)向步骤(3)中加入质量浓度为1％-5％的海藻酸钠，搅拌均匀后滴加预冷的氯化钙水溶液，置于冰箱过夜，过滤得固定化微生物酶；
(5)将棘白菌素B溶解乙醇中，并加入步骤(4)所述的固定化微生物酶，转化10-16h，收集滤液，即得棘白菌素B母核溶液。
从犹他游动放线菌菌丝体中含有棘白菌素B脱酰酶，将犹他游动放线菌通过发酵后，得到菌丝体，将菌丝体细胞破碎后离心取上清液，得棘白菌素B脱酰酶的粗酶液，因放线菌菌丝体在生长过程中会释放色素，本申请将离心后的上清液不含菌丝体细胞，因此减少了色素的增生；浓度为20％-40％的硫酸铵溶液为酸性溶液，在此浓度下，棘白菌素B脱酰酶所带正电荷与负电荷恰好相等，即总净电荷为零，在棘白菌素B脱酰酶在等电点时，因为没有相同的电荷而互相排斥的影响，所以最不稳定，溶解度最小，极易结合成较大的聚集体，沉淀析出，棘白菌素B脱酰酶沉淀析出后，进一步除去了菌丝体细胞破碎后的色素；棘白菌素B脱酰酶在浓度为0.05-0.1mol/L，pH6.0～7.0的缓冲盐水溶液很稳定，不分解，此外，通过对棘白菌素B脱酰酶通过步骤(2)的沉淀和步骤(3)的溶解后，使棘白菌素B脱酰酶液得到了浓缩，纯化；海藻酸钠遇到钙离子可迅速发生离子交换，生成凝胶将缓冲盐水溶液中的棘白菌素B脱酰酶吸附并裹住形成颗粒小珠，使棘白菌素B脱酰酶充分固定化，此外便于固液分离，过滤得固定化微生物酶，于乙醇中转化棘白菌素B。
转化率(％)＝(棘白菌素B母核浓度/棘白菌素B浓度)×100％。
本申请的技术方案中，用高效液相法检测棘白菌素B母核浓度。
本申请的技术方案中，棘白菌素B脱酰酶对棘白菌素B的转化率高达80％以上，转化效率高；转化时间仅为12-16h，转化时间短；利用棘白菌素B脱酰酶的等电点，使其沉淀析出，之后再利用海藻酸钠遇到钙离子可迅速发生离子交换，生成凝胶将缓冲盐水溶液中的棘白菌素B脱酰酶吸附并裹住形成颗粒小珠，使棘白菌素B脱酰酶充分固定化，使产物易于分离提取；将菌丝体细胞破碎后离心取上清液，之后加硫酸铵沉淀后在缓冲盐水溶液中溶解，使棘白菌素B脱酰酶液中不含或含少量的色素；棘白菌素B脱酰酶易于保存且可重复使用，有利于将来放大生产。
优选的，步骤(1)中，所述超声功率为500-600W，超声时间为10-30min。
优选的，步骤(1)中所述温度为10℃以下。
优选的，步骤(2)中，所述硫酸铵溶液的用量为40-80ml。
优选的，步骤(3)中所述缓冲盐水溶液为磷酸盐缓冲液或醋酸盐缓冲液，所述缓冲盐水溶液的用量为20-40ml。
优选的，步骤(4)中，所述氯化钙水溶液的用量为300-1000ml，所述冰箱的温度为2-8℃。
优选的，步骤(4)中，所述固定化微生物酶的浓度为50-100g/L。
优选的，步骤(5)中，所述转化温度为25-35℃。
优选的，步骤(5)中，所述棘白菌素B的浓度为0.5-1.0g/L。
本申请技术方案中，犹他游动放线菌(Actinoplanes utahensis)及其他原料均来自市售。
基于以上阐述，本申请与现有技术相比，其有益效果在于：(1)棘白菌素B脱酰酶对棘白菌素B的转化率高达80％以上，转化效率高；(2)转化时间仅为12-16h，转化时间短；(3)利用棘白菌素B脱酰酶的等电点，使其沉淀析出，之后再利用海藻酸钠遇到钙离子可迅速发生离子交换，生成凝胶将缓冲盐水溶液中的棘白菌素B脱酰酶吸附并裹住形成颗粒小珠，使棘白菌素B脱酰酶充分固定化，使产物易于分离提取；(4)将菌丝体细胞破碎后离心取上清液，之后加硫酸铵沉淀后在缓冲盐水溶液中溶解，使棘白菌素B脱酰酶液中不含或含少量的色素；(5)棘白菌素B脱酰酶易于保存且可重复使用，有利于将来放大生产。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1
一种固定化微生物酶转化棘白菌素B的方法，包括以下步骤：
(1)犹他游动放线菌发酵，收集菌丝体，利用细胞破碎仪，采用超声破碎的方法使细胞破碎，控制温度，所述温度为10℃以下，离心取上清液，得棘白菌素B脱酰酶的粗酶液300，所述超声功率为500W，超声时间为10min；
(2)向步骤(1)中的粗酶液中缓慢加入硫酸铵溶液，硫酸铵溶液的浓度为20％，所述硫酸铵溶液的用量为40，得沉淀；
(3)将步骤(2)中的沉淀溶解于缓冲盐水溶液中，缓冲盐水溶液的浓度为0.05mol/L，pH6.0，所述缓冲盐水溶液为磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液的用量为20ml；
(4)向步骤(3)中加入质量浓度为1％的海藻酸钠，搅拌均匀后滴加预冷的氯化钙水溶液，置于冰箱过夜，所述氯化钙水溶液的用量为300ml，所述冰箱的温度为2℃，过滤得固定化微生物酶，所述固定化微生物酶的浓度为50g/L；
(5)将棘白菌素B溶解乙醇中，并加入步骤(4)所述的固定化微生物酶，转化10h，收集滤液，所述转化温度为25℃，即得棘白菌素B母核溶液，所述棘白菌素B的浓度为0.5g/L。
本实施例中，固定化微生物酶对棘白菌素B的转化率达80％；转化时间为12小时。
实施例2
一种固定化微生物酶转化棘白菌素B的方法，包括以下步骤：
(1)犹他游动放线菌发酵，收集菌丝体，利用细胞破碎仪，采用超声破碎的方法使细胞破碎，控制温度，所述温度为10℃以下，离心取上清液，得棘白菌素B脱酰酶的粗酶液400ml，所述超声功率为550W，超声时间为20min；
(2)向步骤(1)中的粗酶液中缓慢加入硫酸铵溶液，硫酸铵溶液的浓度为30％，所述硫酸铵溶液的用量为60ml，得沉淀；
(3)将步骤(2)中的沉淀溶解于缓冲盐水溶液中，缓冲盐水溶液的浓度为0.075mol/L，pH6.5，所述缓冲盐水溶液为醋酸盐缓冲液，醋酸盐缓冲液的用量为30ml；
(4)向步骤(3)中加入质量浓度为3％的海藻酸钠，搅拌均匀后滴加预冷的氯化钙水溶液，置于冰箱过夜，所述氯化钙水溶液的用量为650ml，所述冰箱的温度为4℃，过滤得固定化微生物酶，所述固定化微生物酶的浓度为75g/L；
(5)将棘白菌素B溶解乙醇中，并加入步骤(4)所述的固定化微生物酶，转化13h，收集滤液，所述转化温度为30℃，即得棘白菌素B母核溶液，所述棘白菌素B的浓度为0.75g/L。
本实施例中，固定化微生物酶对棘白菌素B的转化率达83％；转化时间为14小时。
实施例3
一种固定化微生物酶转化棘白菌素B的方法，包括以下步骤：
(1)犹他游动放线菌发酵，收集菌丝体，利用细胞破碎仪，采用超声破碎的方法使细胞破碎，控制温度，所述温度为10℃以下，离心取上清液，得棘白菌素B脱酰酶的粗酶液500ml，所述超声功率为600W，超声时间为30min；
(2)向步骤(1)中的粗酶液中缓慢加入硫酸铵溶液，硫酸铵溶液的浓度为40％，所述硫酸铵溶液的用量为80ml，得沉淀；
(3)将步骤(2)中的沉淀溶解于缓冲盐水溶液中，缓冲盐水溶液的浓度为0.1mol/L，pH7.0，所述缓冲盐水溶液为磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液的用量为40ml；
(4)向步骤(3)中加入质量浓度为5％的海藻酸钠，搅拌均匀后滴加预冷的氯化钙水溶液，置于冰箱过夜，所述氯化钙水溶液的用量为1000ml，所述冰箱的温度为8℃，过滤得固定化微生物酶，所述固定化微生物酶的浓度为100g/L；
(5)将棘白菌素B溶解乙醇中，并加入步骤(4)所述的固定化微生物酶，转化16h，收集滤液，所述转化温度为35℃，即得棘白菌素B母核溶液，所述棘白菌素B的浓度为1.0g/L。
本实施例中，固定化微生物酶对棘白菌素B的转化率达86％：转化时间为15小时。
实施例4
实施例1-3中，犹他游动放线菌发酵具体为：将配制好的种子培养基和发酵培养基，分别分装至500ml三角瓶中，装液量为100ml，在120℃下灭菌30min，冷却备用；通过挖块法将斜面种子接种至种子培养基中，于28℃、220rpm培养2天，按10％种量转种至发酵培养中，于28℃、220rpm培养5天，收集菌丝体。
所述种子培养基：葡萄糖1％，淀粉1％，蔗糖1％，蛋白胨2％，酵母膏2％，硫酸镁0.1％，pH6.0。
所述发酵培养基：葡萄糖2％，甘露醇2％，蛋白胨2％，酵母膏1％，硫酸镁0.1％，磷酸二氢钾0.5％，氯化钠0.1％，pH6.0。
实施例5
实施例1-3中，犹他游动放线菌发酵具体为：将配制好的种子培养基和发酵培养基，分别分装至500ml三角瓶中，装液量为100ml，在121℃下灭菌30min，冷却备用；通过挖块法将斜面种子接种至种子培养基中，于28℃、220rpm培养2天，按10％种量转种至发酵培养中，于28℃、220rpm培养5天，收集菌丝体。
所述种子培养基：葡萄糖2.5％，淀粉2.5％，蔗糖2.5％，蛋白胨3.5％，酵母膏3.5％，硫酸镁0.3％，pH6.5。
所述发酵培养基：葡萄糖3.5％，甘露醇3.5％，蛋白胨3.5％，酵母膏2％，硫酸镁0.3％，磷酸二氢钾0.75％，氯化钠0.3％，pH6.5。
实施例6
实施例1-3中，犹他游动放线菌发酵具体为：将配制好的种子培养基和发酵培养基，分别分装至500ml三角瓶中，装液量为100ml，在122℃下灭菌30min，冷却备用；通过挖块法将斜面种子接种至种子培养基中，于28℃、220rpm培养2天，按10％种量转种至发酵培养中，于28℃、220rpm培养5天，收集菌丝体。
所述种子培养基：葡萄糖4％，淀粉4％，蔗糖4％，蛋白胨5％，酵母膏5％，硫酸镁0.5％，pH7.0。
所述发酵培养基：葡萄糖5％，甘露醇5％，蛋白胨5％，酵母膏3％，硫酸镁0.5％，磷酸二氢钾1.0％，氯化钠0.5％，pH7.0。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种固定化微生物酶转化棘白菌素B的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)犹他游动放线菌发酵，收集菌丝体，利用细胞破碎仪，采用超声破碎的方法使细胞破碎，控制温度，离心取上清液，得棘白菌素B脱酰酶的粗酶液300-500ml；
(2)向步骤(1)中的粗酶液中缓慢加入硫酸铵溶液，硫酸铵溶液的浓度为20％-40％，得沉淀；
(3)将步骤(2)中的沉淀溶解于缓冲盐水溶液中，缓冲盐水溶液的浓度为0.05-0.1mol/L，pH6.0～7.0；
(4)向步骤(3)中加入质量浓度为1％-5％的海藻酸钠，搅拌均匀后滴加预冷的氯化钙水溶液，置于冰箱过夜，过滤得固定化微生物酶；
(5)将棘白菌素B溶解乙醇中，并加入步骤(4)所述的固定化微生物酶，转化10-16h，收集滤液，即得棘白菌素B母核溶液。
2.根据权利要求1所述的一种固定化微生物酶转化棘白菌素B的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述超声功率为500-600W，超声时间为10-30min。
3.根据权利要求1所述的一种固定化微生物酶转化棘白菌素B的方法，其特征在于，步骤(1)中所述温度为10℃以下。
4.根据权利要求1所述的一种固定化微生物酶转化棘白菌素B的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述硫酸铵溶液的用量为40-80ml。
5.根据权利要求1所述的一种固定化微生物酶转化棘白菌素B的方法，其特征在于，步骤(3)中所述缓冲盐水溶液为磷酸盐缓冲液或醋酸盐缓冲液，所述缓冲盐水溶液的用量为20-40ml。
6.根据权利要求1所述的一种固定化微生物酶转化棘白菌素B的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述氯化钙水溶液的用量为300-1000ml，所述冰箱的温度为2-8℃。
7.根据权利要求1所述的一种固定化微生物酶转化棘白菌素B的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述固定化微生物酶的浓度为50-100g/L。
8.根据权利要求1所述的一种固定化微生物酶转化棘白菌素B的方法，其特征在于，步骤(5)中，所述转化温度为25-35℃。
9.根据权利要求1所述的一种固定化微生物酶转化棘白菌素B的方法，其特征在于，步骤(5)中，所述棘白菌素B的浓度为0.5-1.0g/L。
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