CN103993022B - 低分子量透明质酸的制备方法及工程菌 - Google Patents

Abstract

本发明涉及了一种低分子量透明质酸的制备方法及工程菌，本发明利用同源重组技术将兽疫链球菌中的乳酸脱氢酶编码基因进行无缝敲除，获得ldh基因敲除的重组菌。本发明将敲除ldh基因的重组菌进行发酵分析，将发酵液预处理后利用特性黏度法测定HA的分子量，得到平均分子量为0.4×10⁶Da的HA，本发明通过微生物发酵就可以直接在发酵液中分离获得低分子量的HA，成本低，易于形成规模化工业生产。

Description

低分子量透明质酸的制备方法及工程菌

技术领域

本发明属于透明质酸生产领域，尤其是一种低分子量透明质酸的制备方法及工程菌。

背景技术

透明质酸（HA）是一种高分子直链聚糖，是由D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺组成的高级多糖，D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺之间由β-1,3-糖苷键相连，双糖单位之间由β-1,4-糖苷键相连。HA及其盐广泛分布于机体的各种组织中，具有特殊的生理功能，具体表现为：保水作用、润滑作用、对细胞的保护作用、对组织和血管生成的作用、对肿瘤的防治作用、对创伤愈合和止血等方面的作用，由于这些生理功能，HA被广泛应用于日化用品、食品保健、美容整形及医药等领域。

HA最早发现于动物组织，后来发现是链球菌荚膜的主要成分，HA的生产也相应经历了组织提取和发酵生产两个阶段。与提取法相比，微生物发酵法不受动物原料限制，适合规模化生产。随着生物合成HA关键酶基因的克隆，构建基因工程菌成为提高产量并控制分子量的研发热点。

微生物发酵法生产透明质酸较之动物组织提取法具有原料易得、成本低、有不同阶段的分子量和更高的产量的优点，使其成为透明质酸发展的方向。

在兽疫链球菌中，一些用于HA合成的前体如1-P-葡萄糖、UDP-葡萄糖和UDP-N-乙酰氨基葡萄糖胺同时也用于合成细胞壁(约占细胞干重的20%，w/w)，即HA合成和细胞生长之间存在着对碳源的竞争性关系，这是兽疫链球菌发酵生产HA的一个很重要的代谢特性，同时部分碳源(果糖)进入糖酵解途径(产能途径)，其主要代谢产物为乳酸，乳酸对细胞生长和HA合成有较强的抑制作用，因此如何有效转变细胞的产能途径以降低乳酸对细胞生长和HA合成的抑制作用对于提高整个发酵过程的生产强度和生产效率具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种低分子量透明质酸的制备方法及工程菌，本方法利用同源重组技术获得ldh的基因敲除菌株，不用插入筛选标记，无缝定点敲除ldh基因，不影响其上游和下游基因的转录水平，保证透明质酸的产量，其菌株发酵获得平均分子量为0.4×10⁶Da的透明质酸。

本发明实现目的的技术方案如下：

一种乳酸脱氢酶编码基因的左臂右臂连接序列，基因序列如序列3所示。

一种包含乳酸脱氢酶编码基因的左臂右臂连接序列的载体。

而且，所述载体为pSET4s::sacB::ldh-LR，载体中包括sacB基因。

一种将敲除载体转入到宿主菌，特异性无缝敲除乳酸脱氢酶编码基因ldh，获得乳酸脱氢酶基因功能缺失的工程菌株。

而且，工程菌的宿主菌为兽疫链球菌（Streptococcus zooepidemicus)ATCC39920。

而且，所用发酵培养基：蔗糖50g/L，酪蛋白胨10g/L，酵母提取物3.5g/L，K₂HPO₄2g/L，NaCl1.5g/L，MgSO₄·7H₂O0.4g/L。

而且，发酵条件：3L发酵液，接种量8%，37℃，pH7.0，通气量3vvm，发酵24h。

一种兽疫链球菌中ldh左臂806bp基因ldh-L，所述基因序列见序列1。

一种兽疫链球菌中ldh右臂831bp基因ldh-R，所述基因序列见序列2。

一种兽疫链球菌中ldh左臂右臂1637bp重叠基因ldh-LR，所述基因序列见序列3。

一种含有ldh-LR基因的敲除载体。

一种敲除ldh基因的工程菌株。

而且，含有ldh-LR基因的载体为pSET4s::sacB::ldh-LR。

而且，所述的工程菌株为兽疫链球菌Streptococcus zooepidemicusATCC39920。

本发明的优点和积极效果如下：

1、本发明利用同源重组技术获得ldh的基因敲除菌株，不用插入筛选标记，无缝定点敲除ldh基因，不影响其上游和下游基因的转录水平，保证透明质酸的产量，其菌株发酵获得分子量为33-45万道尔顿的透明质酸。

2、本发明将敲除ldh基因的工程菌进行发酵分析，将发酵液预处理后利用特性黏度法测定HA的分子量，得到平均分子量为0.4×10⁶Da的HA。

3、本发明通过微生物发酵就可以直接在发酵液中分离获得低分子量的HA，成本低，易于形成规模化工业生产。

附图说明

图1为本发明载体pSET4s::sacB的构建图谱；

图2为本发明构建载体pSET4s::sacB的PCR验证图，M：DNAMarker；1：以Pcm-sacB片段为模板的阳性对照,扩增获得Pcm-sacB片段，大小为1686bp；2：阴性对照；3、4、6、7：Pcm-sacB片段没有连接到载体pSET4s上的菌株；5、8、9：Pcm-sacB片段成功连接到载体pSET4s上的菌株，扩增获得Pcm-sacB片段，大小与阳性对照同为1686bp；

图3为本发明敲除载体pSET4s::sacB::ldh-LR的构建图谱；

图4为本发明构建敲除载体pSET4s::sacB::ldh-LR的PCR验证图，M：DNAMarker；1：阴性对照；2：以ldh-LR片段为模板的阳性对照，扩增获得ldh-LR片段，大小为1637bp；3、4：片段成功连接到载体上的菌株，扩增获得ldh-LR片段，大小为1637bp，与阳性对照相同；

图5为本发明ldh敲除菌株筛选的同源重组原理图；

图6为本发明ldh基因敲除菌株PCR验证图，M：DNAMarker；1：阴性对照；2：野生型；3～8、10：没有发生同源重组的菌株；9、11～14：发生同源重组的菌株；

图7为本发明将ldh敲除菌株发酵处理后利用特性黏度法测定HA分子量的图谱。

具体实施方式

下面结合实施例，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。

本发明利用同源重组技术将兽疫链球菌中的乳酸脱氢酶编码基因（lacticdehydrogenase，ldh）进行无缝敲除，获得乳酸脱氢酶基因功能缺失的工程菌株，本发明的内容包括：构建带有sacB筛选标记的敲除载体，构建所述ldh敲除载体的方法，构建ldh基因敲除菌株的方法。所述载体为pSET4s(GenBank:AB0556.1),载体中包括sacB基因。

本发明所述的ldh-L来源于兽疫链球菌（Streptococcus zooepidemicus），菌株保藏编号为ATCC39920，其核苷酸序列如序列1所示；ldh-R来源于兽疫链球菌（Streptococcuszooepidemicus），菌株保藏编号为ATCC39920，其核苷酸序列如序列2所示。所述的ldh-LR是ldh-L、ldh-R连接在一起的序列，是以ldh-L、ldh-R为模板通过重叠PCR技术扩增得到的，其核苷酸序列如序列3所示。所述的敲除载体pSET4s::sacB::ldh-LR是分别将sacB片段、ldh-LR片段插入到初始载体pSET4s，构建了敲除载体pSET4s::sacB::ldh-LR，并将它电转进入兽疫链球菌中，得到ldh基因敲除菌株。上述菌株经发酵培养后，取不同培养时间的发酵液进行HA分子量的检测，平均分子量为0.4×10⁶Da。

枯草芽孢杆菌sacB基因编码分泌型蔗糖果聚糖酶，该酶能催化蔗糖水解和合成高分子量的果聚糖。高分子量果聚糖积累对细胞存在潜在的毒性作用，可造成细胞死亡。也就是说，sacB基因使得细菌获得蔗糖敏感的特性。本研究已发现在5%或5%以上的蔗糖存在下，sacB基因的表达可以导致兽疫链球菌ATCC399920死亡。基于这种特性，sacB基因在遗传上被作为一种反向筛选标记应用于兽疫链球菌的基因功能研究上。5%蔗糖存在下的致死作用(5%蔗糖存在下，菌全部死亡)。本发明具体操作步骤如下：

一、载体pSET4s::sacB的构建

1、以枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）的基因组为模板，利用表1中的引物sacB-F和sacB-R通过PCR扩增得到sacB基因。sacB核苷酸序列如序列4所示。

PCR反应体系为：2×PCRBuffer（含Mg²⁺）10μl，dNTP（2mM）2μl，上游引物sacB-F和下游引物sacB-R（10μM）各0.4μl，模板0.2μl，KODFxDNA聚合酶(购自TOYOBO公司，货号KFX-101)0.2μl，加无菌水至终体积为20μl。

2、以质粒pSET1(GenBank:AB042426.1)为模板，利用表1中的引物Pcm-F和Pcm-R通过PCR扩增得到PcmDNA片段(Pcm为氯霉素启动子)。其核苷酸序列如序列5所示。

PCR反应体系为：2×PCRBuffer（含Mg²⁺）10μl，dNTP（2mM）2μl，上游引物Pcm-F和下游引物Pcm-R（10μM）各0.4μl，模板0.2μl，KODFxDNA聚合酶0.2μl，加无菌水至终体积为20μl。

3、以sacB、Pcm为模板，利用表1中的引物Pcm-F和sacB-R进行重叠PCR扩增获得Pcm-sacB片段，大小为1686bp。

PCR反应体系为：2×PCRBuffer（含Mg²⁺）10μl，dNTP（2mM）2μl，引物Pcm-F和sacB-R（10μM）各0.4μl，模板sacB和Pcm各0.2μl，KODFxDNA聚合酶0.2μl，加无菌水至终体积为20μl。

PCR反应条件为：94℃预变性2min，98℃变性10s，58℃退火30s，68℃延伸1min50s，反应35个循环，68℃再延伸10min。其中55℃～72℃之间设置12个梯度。

表1所用引物序列

将已获得的DNA片段Pcm-sacB用BglII（购自TaKaRa公司，货号D1021S）进行单酶切，回收后与经同样内切酶处理过的质粒片段pSET4s进行连接，将连接产物转化至大肠杆菌JM109感受态细胞，并均匀涂布于带有壮观霉素（50μg/ml）的LB平板上，37℃培养过夜，挑取单克隆，进行菌落PCR验证和酶切验证，获得载体pSET4s::sacB，验证图如图2。

LB培养基：

胰蛋白胨：10.0g，酵母浸出物：5.0g，NaCl：10.0g，去离子水溶解后，定容至1.0L，pH调至7.0-7.2，固体培养基加1.5%的琼脂粉。121℃灭菌20min。

二、敲除载体pSET4s::sacB::ldh-LR的构建

1、以兽疫链球菌（Streptococcus zooepidemicus）的基因组为模板，利用表2中的引物ldhL-F和ldhL-R通过PCR扩增得到ldh-L，以ldhR-F和ldhR-R为引物通过PCR扩增得到ldh-R。

PCR反应体系为：2×PCRBuffer（含Mg²⁺）10μl，dNTP（2mM）2μl，上游引物ldhL-F和下游引物ldhL-R（10μM）各0.4μl，模板0.2μl，KODFxDNA聚合酶0.2μl，加无菌水至终体积为20μl。

PCR反应体系为：2×PCRBuffer（含Mg²⁺）10μl，dNTP（2mM）2μl，上游引物ldhR-F和下游引物ldhR-R（10μM）各0.4μl，模板0.2μl，KODFxDNA聚合酶0.2μl，加无菌水至终体积为20μl。

PCR反应条件为：94℃预变性2min，98℃变性10s，58℃退火30s，68℃延伸1min，反应35个循环，68℃再延伸10min。

PCR结束后获得完整的目的片段核苷酸序列，其序列见序列1、序列2。

2、以ldh-L、ldh-R为模板，利用表2中的引物进行重叠PCR扩增获得ldh-LR。

PCR反应体系为：2×PCRBuffer（含Mg²⁺）10μl，dNTP（2mM）2μl，引物ldhL-F和ldhR-R（10μM）各0.4μl，模板ldh-L和ldh-R各0.2μl，KODFxDNA聚合酶0.2μl，加无菌水至终体积为20μl。

PCR反应条件为：94℃预变性2min，98℃变性10s，58℃退火30s，68℃延伸1min50s，反应35个循环，68℃再延伸10min。其中55℃～72℃之间设置12个梯度。

PCR结束后获得完整的目的片段核苷酸序列，其序列见序列3。

表2所用引物序列

将已获得的DNA片段ldh-LR用BamHI（购自TaKaRa公司，货号D1010A）和PstI(购自TaKaRa公司，货号D1073A)进行双酶切，回收后与经同样内切酶处理过的质粒片段pSET4s::sacB进行连接，将连接产物转化至大肠杆菌JM109感受态细胞，并均匀涂布于带有壮观霉素（50μg/ml）的LB平板上，37℃培养过夜，挑取单克隆，进行菌落PCR验证和酶切验证，获得敲除载体pSET4s::sacB::ldh-LR，验证图如图4。

三、ldh基因敲除菌株的构建

将上述已获得的敲除载体电转入兽疫链球菌，具体方法为：

（1）从-80℃保藏的兽疫链球菌甘油管中吸取3μl于THY平板上，划线接种，37℃培养至出现单菌落。

（2）挑取单菌落接入THY液体培养基的中，37℃，200r/min培养12～14h。

（3）1%的接种量接种到新鲜的100mlTHY液体培养基中，37℃，200r/min培养至OD530约0.37，加入透明质酸酶(购自上海生工生物工程有限公司，货号37326-33-3)12.5ku，继续培养30min，培养结束时OD530约0.58。

（4）培养结束后冰浴10min，使其停止生长。

（5）用灭过菌的50ml离心管收集菌液，12000r/min4℃离心10min。

（6）去除上清，加入冰浴的0.5M的蔗糖溶液20ml重悬菌体。

（7）12000r/min4℃离心10min。

（8）弃去上清，用5ml冰浴的0.5M蔗糖溶液重悬菌体。

（9）12000r/min4℃度离心10min。

（10）弃去上清，加入500μl含15%甘油的0.5M的蔗糖溶液重悬菌体后，50μl等体积分装到无菌的1.5mlEP管中。

（11）取4μl重组质粒，加入到兽疫链球菌感受态细胞中，混合均匀，转入预冷的2mm电转杯中，置于冰上。

（12）将电转杯放入电转仪中电击，调节电转仪参数如下进行电转化：

（13）电击后立即加入1ml预冷的THY液体培养基，充分混匀，并将混合液一并转移到无菌的1.5mlEP管中。

（14）30℃，200r/min复苏3～4h。

（15）12000r/min离心2min，弃上清，剩余100～200ul与菌体混匀，涂布在含有壮观霉素（100μg/ml）的THY平板上。30℃培养48～76h，待长出转化子，将转化子点接到含有壮观霉素（100μg/ml）的THY平板上二次验证。

THY培养基：

牛肉浸粉：10.0g，胰蛋白胨：20.0g，葡萄糖：2.0g，酵母浸出物：2.0g，NaHCO₃：2.0g，NaCl：2.0g，Na₂HPO₄：0.4g，去离子水溶解后，定容至1.0L，pH调至6.8，固体培养基加1.5%的琼脂粉，121℃灭菌20min。

四、ldh敲除菌株的筛选，具体方法如下：

（1）挑取正确的转化子接种到含有壮观霉素（100μg/ml）的THY液体培养基内，30℃培养12h～24h。

（2）1%的接种量接种至THY液体培养基中，30℃培养12h。

（3）再次1%的接种量接种至THY液体培养基中，37℃培养6～8h。

（4）取100μl菌液稀释至10^-5次，涂布在含有壮观霉素（100μg/ml）的THY平板上，37℃培养24～48h。

（5）待长出单菌落，挑取单菌落接种到含有壮观霉素（100μg/mL）的THY液体培养基内，37℃，200r/min培养12～24h。

（6）1%的接种量接种至THY液体培养基中，37℃，200r/min培养12h。

（7）取100μl菌液稀释至10^-2、10^-3次，涂布在含有5%蔗糖的THY平板上，37℃培养24～48h。

（8）挑取单菌落接种到THY液体培养基中，37℃，200r/min培养12～18h，提取基因组，利用表3中的引物P1、P2验证发生同源重组的菌株，同源重组原理图如图5，其中引物P1位于ldh-L上游50bp，引物P2位于ldh-R下游46bp。以待检测菌株的基因组为模板，如果没有发生同源重组，则用引物P1、P2扩增出来的片段大小为2687bp；如果发生了同源重组，则片段大小为1733bp，如图6。

PCR反应体系为：10×PCRBuffer2μl，dNTP（10mM）0.4μl，引物P1、P2（10μM）各0.4μl，模板1μl，TaqDNA聚合酶(购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，货号PER001-1)0.4μl，加无菌水至终体积为20μl。

PCR反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min50s，反应35个循环，72℃后延伸10min。

表3所用引物序列

五、ldh基因敲除菌株的HA分子量的检测

ldh基因敲除菌株在5L发酵罐中进行发酵。

所用发酵培养基：蔗糖50g/L，酪蛋白胨10g/L，酵母提取物3.5g/L，K₂HPO₄2g/L，NaCl1.5g/L,MgSO₄·7H₂O0.4g/L。发酵条件：3L发酵液，接种量8%，37℃，pH7.0，通气量3vvm，发酵24h，用5MNaOH溶液调节pH。每2h取一次发酵液。

HA分子量的检测：取适量不同小时的发酵液用等体积的0.1%SDS处理10min，12000r/min离心15min。取上清，用3倍体积的无水乙醇沉淀30min。12000r/min离心10min，去上清，沉淀用乙醇盐溶液洗涤一次，室温晾干后，用适量0.2MNaCl溶液溶解。充分溶解后，用0.45μm的滤膜过滤，过滤后，用乌氏粘度计测出其特性粘度，用改良咔唑法测出HA含量，根据公式计算出HA的分子量，注意事项如下：

（1）测定出0.2MNaCl溶液流出乌氏粘度计的流出时间t₀，t₀应不小于1.67mim。

（2）测定出不同小时处理好的样品流出乌氏粘度计的流出时间t₁，t₁应介于t₀的1.3～1.5倍之间。

（3）测定出不同时间的样品的HA含量c。

（4）根据公式计算出特性粘度η，根据特性粘度计算出分子量Mη，公式如下：

（5）将ldh敲除菌株发酵处理后利用特性黏度法测定HA分子量，如图7。

Claims (2)

1.一种获得产低分子量透明质酸工程菌的方法，其特征在于：

⑴构建重叠基因ldh-LR，ldh-LR基因序列见序列3，构建带有sacB筛选标记的敲除载体pSET4s::sacB::ldh-LR，所述基因sacB的序列见序列4；

⑵将载体pSET4s::sacB::ldh-LR转进入兽疫链球菌Streptococcus zooepidemicusATCC 39920中，得到敲除乳酸脱氢酶编码基因的工程菌；

⑶工程菌发酵获得透明质酸平均分子量为0.4×10⁶Da。

2.权利要求1所制备的工程菌在制备低分子量透明质酸的应用，其特征在于：所述低分子量透明质酸的平均分子量为0.4×10⁶Da。