CN103789338B - 质粒、重组工程菌及制备均一分子量透明质酸的方法 - Google Patents
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Abstract
一种基因工程技术领域的质粒、重组工程菌及制备均一分子量透明质酸的方法，向革兰氏阳性安全微生物中引入禽多杀性巴氏杆菌透明质酸合成酶(Pasteurella multocida hyaluronan synthase)基因(序列表中的SEQ NO.1)组成的第一个重组表达质粒和克隆自枯草芽孢杆菌与透明质酸前体合成相关基因(序列表中的SEQ NO.2、SEQ NO.3、SEQ NO.4、SEQ NO.5)组成的第二个重组表达质粒，通过由两种重组表达质粒组成的表达调控系统分别对透明质酸合成酶和透明质酸前体合成相关酶的控制，以生物合成的方法制备获得均一分子量透明质酸。本发明不仅提高了宿主菌株合成透明质酸的能力，而且能够获得几种足量、纯净和均一分子量的透明质酸。
Description
技术领域
本发明涉及的是一种微生物的基因工程技术领域的方法，具体是通过质粒形式和基因组整合方式构建的革兰氏阳性安全微生物为安全工程菌株制备几种均一分子量透明质酸的生物合成方法。
背景技术
透明质酸(Hyaluronic Acid，Hyaluronan，HA)是由β-D-葡萄糖醛酸(GlcUA)和β-D-N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)组成的双糖单位反复交连而成的线性无分支大分子酸性粘多糖。天然透明质酸平均分子量(MW)范围是2×104-7×107Da。不同分子量的HA具有不同的生物功能：高分子量HA(HMW-HA，MW＞2×106)具有的高度粘弹性、可塑性、渗透性和良好的生物相容性，临床上透明质酸主要进行膝关节腔内注射透明质酸治疗骨关节炎，既可以关节滑液中形成的粘弹性对关节软骨起着减震和润滑等机械保护作用，又能够与靶细胞的受体结合发挥对滑膜炎症的抑制作用及对关节疼痛的缓解作用。由于其良好的黏弹性和假塑流变性，HA被广泛用于眼科显微手术、关节炎治疗、组织工程、外科手术防粘连等领域。其中，MW在(1～2)×106的HA因具有良好的保湿性而用于滴眼液和化妆品等。低分子量HA(LMW-HA，8×104＞MW＞1×104)近年来在载药系统方面的应用以及长效、缓释药物的开发方面逐渐显现出其特有的优势。例如，轻度修饰的HA衍生物能够用于核苷酸胞内递呈和靶向性治疗，高度修饰的HA衍生物则能够共价连接多肽和蛋白质，在其长效药物开发方面发挥重要作用，此外，通过各种物理和化学方式交联而成的HA水凝胶用于各种药物的递呈和缓释也逐渐成为研究和应用的热点。寡聚HA(Oligo-HA，MW＜1×104)具有促血管生成、促进创伤愈合、抗肿瘤及免疫调节等生物活性，其中4糖的透明质酸片断具有上调Hsp72表达、上调Fas表达、抑制细胞凋亡等活性；6糖的透明质酸对树突状细胞中细胞因子的合成具有促进作用；10个单糖单位的透明质酸具有上调肿瘤细胞中PTEN水平的作用；8～32个单糖单位的透明质酸具有促血管内皮细胞生成作用；10～40个单糖单位的透明质酸具有促肿瘤细胞迁移作用。然而无论是高分子量的长链多糖还是低分子量的寡聚片段，良好的均一度才是多糖行使其生物和物理化学功能的基础。
传统的制备透明质酸的方法为从鸡冠等动物组织提取，尽管这种方法制备的透明质酸早已批准用于医药领域，但是分离纯化困难，得率较低和具有安全隐患的问题依然存在。目前制备透明质酸这一重要粘多糖的另一种主要方法是利用A组和C组链球菌进行发酵生产。这种方法虽然具有成本低，产量大的优点，但是所得透明质酸成分极其复杂(含杂蛋白、菌体杂质及其他糖类物质等)，分子量分布于104～107Da的范围内，均一度较差，并且由于链球菌为条件致病菌，此方法制备的透明质酸同样具有一定的安全隐患。而利用透明质酸酶降解法制备均一透明质酸也存在底物特异性差，降解产物过短不易纯化的问题。局限于化学合成策略的不可行性和分离纯化的难度及成本考虑，此类尝试从未能成为实质性解决方案。化学酶合成法可以通过人工添加UDP-单糖体外催化合成均一分子量的透明质酸片段，但是也存在着合成成本高，仅能合成寡聚透明质酸，产量过小等问题。这些问题使此方法无法应用于生产，并未从实质上解决制备均一透明质酸这一难题。
利用基因工程技术构建重组工程菌生产透明质酸近年来逐渐成为研究热点。研究者们除了对链球菌属各种野生菌株通过基因工程以及发酵工程的手段对其进行改造，从而达到降低生产成本和提高透明质酸产量的目的以外，更多的精力放在了寻找新型表达系统以克服链球菌属具有致病性这一安全隐患。近年来，包括枯草杆菌，土壤杆菌，乳酸乳球菌以及大肠杆菌在内的各种革兰氏阴性菌和阳性菌被用于利用基因工程手段引入外源透明质酸合成酶基因表达透明质酸已经陆续见诸报道。尽管在产量上和传统的链球菌生产透明质酸相比还有一定差距，但是这些有益的尝试却为体内合成制备均一分子量透明质酸提供了广泛的选择和新颖的思路。
经过对现有技术信息的查阅检索发现，B.Widner等(Widner，B.，R.Behr，et a1.(2005).″Hyaluronic Acid Production in Bacillus subtilis.″Appl.Environ.Microbiol.71(7)：3747-3752.)中国专利文献号CN101426925A，公开日2009-5-6，记载了一种“在芽孢杆菌细胞中生产透明质酸的方法”，这些方法在枯草芽孢杆菌中成功表达从革兰氏阳性的链锁状链球菌中得到的透明质酸合成基因，重组工程菌通过摇瓶发酵获得1g/L的透明质酸。
上述现有技术的共性在于描述了以枯草芽孢杆菌为宿主，将合成透明质酸相关的基因组合构成一个人工操纵子，包括透明质酸合成酶基因和透明质酸前体合成相关基因在内的基因转录均同步进行，另外，透明质酸的合成与宿主细胞的增殖也是同步进行。尽管上述技术能够实现透明质酸在枯草芽孢杆菌中的异源合成，但是如果高效制备更加精细的透明质酸，即均一分子量透明质酸，并且通过人工调控获取不同分子量的均一透明质酸，现有技术还无法实现。
发明内容
本发明针对现有技术存在的上述不足，提供一种基于革兰氏阳性安全微生物的几种不同分子量均一透明质酸的生物合成制备方法，该方法将透明质酸合成酶基因和透明质酸前体合成相关酶基因分别与可诱导启动子组成两个重组表达质粒，通过将透明质酸前体合成、透明质酸合成与宿主细胞的生长分开以及基于两个重组表达质粒分别调控的诱导表达策略，最终，不但大大提高了宿主细胞合成透明质酸的能力，完成了透明质酸在革兰氏阳性安全微生物的异源合成，而且获得了几种不同分子量的均一度良好的透明质酸。
本发明是通过以下技术方案实现的，本发明包括以下步骤：
一种重组质粒1，其特征在于核苷酸序列为Seq NO：6。
一种重组质粒2，其特征在于核苷酸序列为Seq NO：7。
一种重组质粒3，其特征在于核苷酸序列为Seq NO：8。
一种重组质粒4，其特征在于核苷酸序列为Seq NO：9。
一种重组工程菌1，其特征在于含有权利要求1所述的重组质粒1和权利要求2所述的重组质粒2。
一种重组工程菌2，其特征在于含有权利要求1所述的重组质粒1和权利要求3所述的重组质粒3。
一种重组工程菌3，其特征在于含有权利要求1所述的重组质粒1和权利要求4所述的重组质粒4。
一种重组工程菌1制备透明质酸的方法，其特征在于按如下步骤实现：
A、以总体积100mL含1g氯化钠，1g蛋白胨，0.5g酵母抽提物的体系中按1％v/v接种重组工程菌1；发酵液OD600nm达到0.2时加入诱导剂IPTG至终浓度1mmol/L，发酵液OD600nm达到0.2到0.4时加入诱导剂木糖至终浓度0.5％w/v，发酵终点为接种后培养48小时，从培养基中分离得到重均分子量为5.43MDa的透明质酸；
B、以总体积100mL含1g氯化钠，1g蛋白胨，0.5g酵母抽提物的体系中按1％v/v接种重组工程菌1进行发酵；发酵液OD600nm达到0.2时加入诱导剂IPTG至终浓度1mmol/L，发酵液OD600nm达到0.2到0.4时加入诱导剂木糖至终浓度0.5％w/v，发酵终点为接种后培养8小时；从培养基中分离得到重均分子量为4.55MDa的透明质酸；
C、以总体积100mL含1g氯化钠，1g蛋白胨，0.5g酵母抽提物的体系中按1％v/v接种重组工程菌1进行发酵；发酵液OD600nm达到0.2时加入诱导剂IPTG至终浓度1mmol/L，发酵液OD600nm达到1.0到1.2时加入诱导剂木糖至终浓度0.5％w/v，发酵终点为接种后培养48小时；从培养基中分离得到重均分子量为7.99KDa的透明质酸。
所述的一种重组工程菌2制备透明质酸的方法，其特征在于按如下步骤实现：
以总体积100mL含1g氯化钠，1g蛋白胨，0.5g酵母抽提物的体系中按1％v/v接种重组工程菌2进行发酵；发酵液OD600nm达到0.2时加入诱导剂IPTG至终浓度1mmol/L，发酵液OD600nm达到0.2到0.4时加入诱导剂木糖至终浓度0.5％w/v，发酵终点为接种后培养48小时，从培养基中分离得到重均分子量为13.20KDa的透明质酸。
所述的一种重组工程菌3制备透明质酸的方法，其特征在于按如下步骤实现：
以总体积100mL含1g氯化钠，1g蛋白胨，0.5g酵母抽提物的体系中按1％v/v接种重组工程菌3进行发酵；发酵液OD600nm达到0.2时加入诱导剂IPTG至终浓度1mmol/L，发酵液OD600nm达到0.2到0.4时加入诱导剂木糖至终浓度0.5％w/v，发酵终点为接种后培养48小时；从培养基中分离得到重均分子量为4.53MDa的透明质酸。
进一步说明：
第一步、从禽多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida P-1059ATCC#15742)分离透明质酸合成酶基因(Pasteurella multocida Hyaluronate synthase gene)，即SEQNO.1；
第二步、从革兰氏阳性安全微生物宿主分离与透明质酸前体，即UDP-葡萄糖醛酸和UDP-N-乙酰-葡萄糖氨的合成相关基因，包括：UDP-葡萄糖脱氢酶基因(UDP-Glucosedehydrogenase gene)，即SEQ NO.2；UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因(UDP-Glucosepyrophosphorylase gene)，即SEQ NO.3；乙酰转移酶(Acetyltransferase)和UDP-N-乙酰-葡萄糖氨焦磷酸化酶基因(UDP-GlcNAc pyrophosphorylase gene)，即SEQ NO.4；葡萄糖-6-磷酸变位酶基因(phosphoglucoisomerase gene)，SEQ NO.5；
第三步、将SEQ NO.1与化学诱导启动子组成第一个重组表达质粒；将来自SEQNO.2到SEQ NO.5中的任何一个基因与另一个化学诱导启动子组成第二个重组表达质粒；
所述的化学诱导启动子包括：枯草芽孢杆菌的木糖异构酶基因的启动子和大肠杆菌的乳糖利用操纵子的启动子。
所述的化学诱导启动子的转录是指：所述的木糖异构酶基因的启动子只有加入木糖后才可能启动下游基因的转录，木糖的质量百分比浓度为0.5％到2％；所述的乳糖利用操纵子的启动子只有加入IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)后才可能启动下游基因的转录，IPTG的摩尔浓度为25mmol/L到1mmol/L。
所述的透明质酸合成的诱导剂是指：木糖、IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)。
第四步、采用制备感受态细胞的方法将两个重组表达质粒转化革兰氏阳性微生物宿主菌，用选择标记筛选，得到能分泌表达不同分子量均一透明质酸的革兰氏阳性基因工程安全菌株。
所述的选择标记是指：用来筛选含有透明质酸合成相关基因的基因工程安全菌株的抗性基因，包括：红霉素抗性基因，氯霉素抗性基因。
第五步、对革兰氏阳性基因工程安全菌株进行发酵培养，在不同培养阶段加入诱导透明质酸前体合成的诱导剂和诱导透明质酸合成的诱导剂以及设置不同发酵终点，借此控制透明质酸在宿主菌体内合成进程以获得不同分子量均一透明质酸，发酵结束后即从培养基中分离纯化得到基于基因工程安全菌株的不同分子量均一透明质酸。
本发明所述的革兰氏阳性安全微生物包括枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、短芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、短短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜淀粉拟杆菌、嗜热脂肪地芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、缓慢芽孢杆菌、嗜淀粉拟杆菌、纳豆芽孢杆菌。
发明原理
代谢工程即利用重组DNA技术有目的地操纵细胞的酶、转运和调控功能从而改善细胞的活性，从上世纪90年代初期发展至今已有20年历史，对微生物发酵工业的发展起到了极大的推动作用。从广义上讲，一直以来对透明质酸生产菌株的开发和改造均属于代谢工程范畴。目前，代谢工程亟待解决的问题是发展新型的代谢工程改造策略以使微生物表达系统获得合成精细化合物的能力，而解决这一难题的关键是了解代谢合成途径中关键酶基因在代谢网络中的位置和作用并通过设计适当的策略将各个元件整合串联起来从而能够合成具有特殊性质和满足特殊要求的精细化合物。这与制备均一分子量透明质酸在扩展和延伸透明质酸研究和应用方面的重要性不谋而合。
传统的天然透明质酸生产菌株，即A组和C组链球菌中，透明质酸的合成需要以透明质酸合成酶基因为核心的一系列基因的参与，这些基因包括UDP-葡萄糖脱氢酶基因，UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因，葡萄糖-6-磷酸变位酶基因，乙酰转移酶利UDP-N-乙酰-葡萄糖氨焦磷酸化酶基因，这些基因往往和透明质酸合成酶基因组成-个表达基因簇，完成透明质酸的合成。尽管这样的天然透明质酸表达系统能够合成满足链球菌自身需要的足量透明质酸，但是应用于生产实践总却远远无法满足人类对透明质酸的需要，并且由于其链球菌透明质酸表达系统的天然同有特性，无法对其进行人工调控，从而无法制备更为精细的不同分子量大小的均一分子量透明质酸，经链球菌发酵制备的透明质酸分子量分布于104～107Da的范围内，均一度较差，并且无法通过人工调控制备特定分子量的透明质酸，从而极大的限制了透明质酸这一重要生物聚合物分子的研究和应用。
近年来，研究者们将研究重点放在了利用基因工程方法对链球菌属各种野生菌株进行改造从而达到降低生产成本和提高透明质酸产量的目的和发掘新型微生物表达系统以克服链球菌属具有致病性这一安全隐患上。而在大量制备更为精细的不同分子量的均一透明质酸方面却鲜有尝试。
为了增强透明质酸在革兰氏阳性安全微生物宿主细胞体内的合成能力，并通过人工调节控制透明质酸前体合成以及透明质酸的合成，达到制备不同分子量均一度良好的透明质酸的目的，本发明设计并构建如下两种重组质粒，并制定相应的表达策略，即将透明质酸合成酶基因(SEQ NO.1)与木糖异构酶基因的启动子组成第一个重组表达质粒，将与透明质酸前体合成相关酶基因(SEQ NO.2，SEQ NO.3；SEQ NO.4；SEQ NO.5)，即UDP-葡萄糖脱氢酶基因，UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因，乙酰转移酶和UDP-N-乙酰-葡萄糖氨焦磷酸化酶基因，葡萄糖-6-磷酸变位酶基因，分别与乳糖利用操纵子的启动子组成第二个重组表达质粒。透明质酸前体合成相关酶基因按在透明质酸合成过程中的功能分为以下三类：第一类，UDP-葡萄糖脱氢酶基因，UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因(SEQ NO.2，SEQ NO.3)负责透明质酸合成所需两种单糖原料之一的UDP-葡萄糖醛酸(UDP-GIcUA)在宿主细胞体内的合成；第二类，乙酰转移酶和UDP-N-乙酰-葡萄糖氨焦磷酸化酶基因(SEQ NO.4)负责透明质酸合成所需两种单糖原料之一的UDP-乙酰氨基葡萄糖(UDP-GlcNAc)在宿主细胞体内的合成；第三类，葡萄糖-6-磷酸变位酶基因(SEQ NO.5)负责透明质酸合成所需两种单糖原料的相互转化，能够调节两种单糖原料的平衡。将两种重组表达质粒按功能进行有序组合，转化至宿主细胞内，获得三株革兰氏阳性安全表达菌株：第一个表达菌株含有透明质酸合成酶基因(SEQ NO.1)与木糖异构酶基因的启动子组成第一个重组表达质粒，UDP-葡萄糖脱氢酶基因，UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因(SEQ NO.2，SEQ NO.3)与乳糖利用操纵子的启动子组成第二个重组表达质粒。第二个表达菌株含有透明质酸合成酶基因(SEQ NO.1)与木糖异构酶基因的启动子组成第一个重组表达质粒，乙酰转移酶和UDP-N-乙酰-葡萄糖氨焦磷酸化酶基因(SEQ NO.4)与乳糖利用操纵子的启动子组成第二个重组表达质粒。第三个表达菌株含有透明质酸合成酶基因(SEQ NO.1)与木糖异构酶基因的启动子组成第一个重组表达质粒，葡萄糖-6-磷酸变位酶基因(SEQ NO.5)与乳糖利用操纵子的启动子组成第二个重组表达质粒。其中，第一个重组表达质粒由于含有宿主细胞缺乏的透明质酸合成酶基因，因而确保了透明质酸能够在宿主菌株体内进行异源合成；第二个重组表达质粒由于含有透明质酸前体合成相关酶基因，因而能够为透明质酸在宿主细胞体内的合成提供活性单糖原料。此外，由于两个重组表达质粒分别使用不同的化学诱导启动子，因而能够人工控制透明质酸前体的合成与透明质酸的合成，这样设计的目的在于首先将透明质酸前体的合成与透明质酸的合成这两个具有时间先后顺序的代谢过程彼此分开，并且将其与宿主细胞的增殖分开，从而避免了各个代谢过程之间因为原料和能源竞争而导致的效率低下，增强了透明质酸的异源合成能力；其次，在将透明质酸前体的合成与透明质酸的合成这两个具有时间先后顺序的代谢过程彼此分开的基础上，通过对不同诱导启动子的使用，能够在不同时间，不同水平的启动透明质酸前体的合成，即使透明质酸合成所需活性单糖原料在宿主细胞内不同程度的积累，进而相应的启动透明质酸的合成，从而达到合成不同分子量均一度良好的透明质酸的目的。本发明通过这种特殊的双重组表达质粒的形式以及相应的人工调控诱导表达策略，不但大大提高了宿主细胞合成透明质酸的能力，完成了透明质酸在革兰氏阳性安全微生物的异源合成，而且获得了几种不同分子量的均一度良好的透明质酸。
为了得到较稳定的能够合成不同分子量均一透明质酸的基因工程革兰氏阳性安全微生物工程菌株，本发明将第一个重组表达质粒定点整合到革兰氏阳性安全微生物宿主基因组，整合位点lacA选择为革兰氏阳性安全微生物基因组上能够接纳外源表达元件而不会使宿主菌本身生长和初级代谢受到影响的位置；第二个重组表达质粒选择为附加型严谨表达载体，选择低拷贝的严谨型表达载体能够克服革兰氏阳性安全微生物中载体丢失的问题，增加外源表达元件的稳定性。
有益效果：
经携带两种质粒工程菌株发酵所得的不同分子量均一透明质酸由D-葡萄糖醛酸与N-乙酰-葡萄糖氨组成的双糖单位反复交替连接而成的线性无分支大分子酸性粘多糖，所得到的几种均一透明质酸重均分子量(Mw)分别为4.55MDa7.99KDa13.20KDa5.43MDa4.53MDa，分散度分别为1.351.171.681.141.13。
重均分子量为5.43MDa4.55MDa7.99KDa的透明质酸由第一个表达菌株，即含有透明质酸合成酶基因(SEQ NO.1)和UDP-葡萄糖脱氢酶基因，UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因(SEQNO.2，SEQ NO.3)通过不同条件生物合成获得，三种分子量透明质酸生物合成条件分别为：5.43MDa，发酵液OD600nm达到0.2时加入诱导剂IPTG至终浓度1mmol/L，发酵液OD600nm达到0.2到0.4时加入诱导剂木糖至终浓度0.5％(w/v)，发酵终点为接种后培养48小时；4.55MDa，发酵液OD600nm达到0.2时加入诱导剂IPTG至终浓度1mmol/L，发酵液OD600nm达到0.2到0.4时加入诱导剂木糖至终浓度0.5％(w/v)，发酵终点为接种后培养8小时；7.99KDa，发酵液OD600nm达到0.2时加入诱导剂IPTG至终浓度1mmol/L，发酵液OD600nm达到1.0到1.2时加入诱导剂木糖至终浓度0.5％(w/v)，发酵终点为接种后培养48小时。
重均分子量为13.20KDa的透明质酸由第二个表达菌株，即含有透明质酸合成酶基因(SEQ NO.1)和乙酰转移酶和UDP-N-乙酰-葡萄糖氨焦磷酸化酶基因(SEQ NO.4)通过生物合成获得，生物合成条件为：发酵液OD600nm达到0.2时加入诱导剂IPTG至终浓度1mmol/L，发酵液OD600nm达到0.2到0.4时加入诱导剂木糖至终浓度0.5％(w/v)，发酵终点为接种后培养48小时。
重均分子量为4.53MDa的透明质酸由第三个表达菌株，即含有透明质酸合成酶基因(SEQ NO.1)和葡萄糖-6-磷酸变位酶基因(SEQ NO.5)通过生物合成获得，生物合成条件为：发酵液OD600nm达到0.2时加入诱导剂IPTG至终浓度1mmol/L，发酵液OD600nm达到0.2到0.4时加入诱导剂木糖至终浓度0.5％(w/v)，发酵终点为接种后培养48小时。
附图说明
图1为第一个重组表达质粒(SEQ NO.6)的构建，即含有来自禽多杀性巴氏杆菌的透明质酸合成酶基因与木糖诱导的启动子的基因组整合型表达载体。
图中：
lacA与lacA'分别表示beta-galactosidase基因的5'和3'端同源整合臂；erm表示红霉素抗性基因
PmHAS表示禽多杀性巴氏杆菌透明质酸合成酶基因；
PxylA表示来自枯草芽孢杆菌的木糖诱导启动子；
bla表示氨苄青霉素抗性基因；
ori表示在大肠杆菌中复制起始DNA序列。
图2为第二个重组表达质粒(SEQ NO.7)的构建，即含有来自枯草芽孢杆菌UDP-葡萄糖脱氢酶基因、UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因和乳糖利用操纵子的启动子的附加型严谨表达载体。
图中：
tuaD表示枯草芽孢杆菌UDP-葡萄糖脱氢酶基因；gtaB表示枯草芽孢杆菌UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因；
cat表示氯霉素抗性基因；
Pspac和lacI表示IPTG诱导的乳糖利用操纵子的启动子及其调控元件；
bla表示氨苄青霉素抗性基因；
rep表示来在枯草芽孢杆菌中进行theta复制的复制起始蛋白基因。
图3为第三个重组表达质粒(SEQ NO.8)的构建，即含有来自枯草芽孢杆菌乙酰转移酶和UDP-N-乙酰-葡萄糖氨焦磷酸化酶基因和乳糖利用操纵子的启动子的附加型严谨表达载体。
图中：
gcaD表示枯草芽孢杆菌乙酰转移酶和UDP-N-乙酰-葡萄糖氨焦磷酸化酶基因；
cat表示氯霉素抗性基因；
Pspac和lacI表示IPTG诱导的乳糖利用操纵子的启动子及其调控元件；
bla表示氨苄青霉素抗性基因；
rep表示来在枯草芽孢杆菌中进行theta复制的复制起始蛋白基因。
图4为第四个重组表达质粒(SEQ NO.9)的构建，即含有来自枯草芽孢杆菌葡萄糖-6-磷酸变位酶基因和乳糖利用操纵子的启动子的附加型严谨表达载体。
图中：
pgi表示来自枯草芽孢杆菌葡萄糖-6-磷酸变位酶基因；
cat表示氯霉素抗性基因；
Pspac和lacI表示IPTG诱导的乳糖利用操纵子的启动子及其调控元件；
bla表示氨苄青霉素抗性基因；
rep表示来在枯草芽孢杆菌中进行theta复制的复制起始蛋白基因。
图5为实施例5中样品红外光谱鉴定图谱。
图6为实施例7中样品高效液相色谱图。
图中：
图6A为表1中NO.1样品高效液相色谱图
图6B为表1中NO.2样品高效液相色谱图
图6C为表1中NO.3样品高效液相色谱图
图6D为表1中NO.4样品高效液相色谱图
图6E为表1中NO.5样品高效液相色谱图
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
以下实施例中禽多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida P-1059ATCC#15742)来源于国家兽医微生物菌种保藏中心，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilissubsp.subtilis168BGSCID#1A1)来源于美国俄亥俄州州立大学杆状菌遗传库存中心(Bacillus Genetic Stock Center，The Ohio State University)，pAX01(BGSCID#ECE137)来源于美国俄亥俄州州立大学杆状菌遗传库存中心(Bacillus Genetic StockCenter，The Ohio State University)，原始质粒SEQ NO.10，pHCMC05构建参考文献(Nguyen，H.D.，Nguyen，Q.A.，Ferreira，R.C.，Ferreira，L.C.S.，Tran，L.T.，Schumann，W.，2005.Construction of plasmid-based expression vectors for Bacillus subtilisexhibiting full structural stability.Plasmid.54，241-248.)原始质粒SEQ NO.11。
各实施例中所用细菌基因组提取试剂盒购于天根(北京)生化有限公司，限制性内切酶和T载体连接试剂盒(18-T Simple Vector)购于宝生物工程(大连)有限公司，引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成，聚苯乙烯硫酸酯钠盐对照品购于北京龙智达公司，凝胶柱Shodex SB-806HQ购于昭和电工(东京)株式会社，其他试剂均为分析纯，购于生工生物工程(上海)股份有限公司。
实施例1：透明质酸合成酶基因的克隆和整合表达载体的构建
(1)禽多杀性巴氏杆菌透明质酸合成酶基因(Pasteurella multocidaHyaluronate synthase gene)的克隆
使用天根细菌基因组DNA提取试剂盒提取禽多杀性巴氏杆菌(Pasteurellamultocida P-1059ATCC#15742)基因组DNA，设计一对引物，以提取的禽多杀性巴氏杆菌基因组DNA为模板进行PCR反应，具体反应条件为94℃预变性5分钟，再按照94℃1分钟、48℃1分钟、72℃2分钟30秒进行30个循环，最后按72℃延伸8分钟的程序进行。设计的一对引物序列如下：
5'-CGACTAGTATGAATACATTATCACAAGCAATAAAAGC-3'(5'端带有Spe I酶切位点，ACTAGT)，引物SEQ NO.12。
5'-CGGGATCCCTAAATATCTTTTAAGATATCAATCT-3'(5'端带有BamH I酶切位点，GGATCC)，引物SEQNO.13。
按照上面的方法扩增出的禽多杀性巴氏杆菌透明质酸合成酶基因大小为2109bp，即SEQ NO.1。
(2)含有禽多杀性巴氏杆菌透明质酸合成酶基因的整合表达载体的构建
将经连接T载体(连接使用T载体连接试剂盒18-T Simple Vector)后测序正确的禽多杀性巴氏杆菌透明质酸合成酶基因用Spe I和BamH I双酶切后进行胶回收，连接至用Spe I和BamH I双酶切的整合型表达载体pAX01中，构成含有禽多杀性巴氏杆菌透明质酸合成酶基因的整合表达载体pAX01-PmHAS(图谱如图1)，即重组质粒1，其核苷酸序列为SEQ NO.6。该载体含有透明质酸合成酶基因和可诱导的木糖异构酶基因的启动子。
实施例2：透明质酸前体合成相关酶基因的克隆和附加型严谨表达载体的构建
(1)来自枯草芽孢杆菌UDP-葡萄糖脱氢酶基因(UDP-Glucose dehydrogenasegene)的克隆
使用天根细菌基因组DNA提取试剂盒提取枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilissubsp.subtilis168)基因组DNA，设计一对引物，以提取的枯草芽孢杆菌基因组DNA为模板进行PCR反应，具体反应条件为94℃预变性5分钟，再按照94℃1分钟、48℃1分钟、72℃1分钟30秒进行30个循环，最后按72℃延伸8分钟的程序进行。设计的一对引物序列如下：
5'-CGGGATCCGGAGAGGGTTGAGCGCTGTGAA-3'(5'端带有BamH I酶切位点，GGATCC)，引物SEQNO.14。
5'-GCTCTAGATTATAAATTGACGCTTCCCAAGTCTTTAG-3'(5'端带有Xba I酶切位点，TCTAGA)，引物SEQ NO.15。
按照上面的方法扩增出的来自枯草芽孢杆菌UDP-葡萄糖脱氢酶基因大小为1403bp，即SEQ NO.2
(2)来自枯草芽孢杆菌UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因(UDP-Glucosepyrophosphorylase gene)的克隆
使用天根细菌基因组DNA提取试剂盒提取枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilissubsp.subtilis168)基因组DNA，设计一对引物，以提取的枯草芽孢杆菌基因组DNA为模板进行PCR反应，具体反应条件为94℃预变性5分钟，再按照94℃1分钟、48℃1分钟、72℃1分钟进行30个循环，最后按72℃延伸8分钟的程序进行。设计的一对引物序列如下：
5'-GCTCTAGAGGAAGGTGCCTTTTAAATGAA-3'(5'端带有Xba I酶切位点，TCTAGA)，引物SEQNO.16。
5'-CCCCCGGGTTAGATTTCTTCTTTGTTTAGTAAACC-3'(5'端带有Xma I酶切位点，CCCGGG)，引物SEQ NO.17。
按照上面的方法扩增出的来自枯草芽孢杆菌UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因大小为895bp，即SEQ NO.3
(3)含有来自枯草芽孢杆菌UDP-葡萄糖脱氢酶基因和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因的附加型严谨表达载体的构建
将经连接T载体(连接使用T载体连接试剂盒18-T Simple Vector)后测序正确的枯草芽孢杆菌UDP-葡萄糖脱氢酶基因用BamH I和Xba I双酶切后进行胶回收，连接至用BamH I和Xba I双酶切的附加型严谨表达载体pHCMC05中，构成含有枯草芽孢杆菌UDP-葡萄糖脱氢酶基因的附加型严谨表达载体pHCMC05-tuaD，然后用Xba I利Xma I双酶切pHCMC05-tuaD，胶回收得到载体片段DNA。将经连接T载体(连接使用T载体连接试剂盒18-T Simple Vector)后测序正确的来自枯草芽孢杆菌UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因用XbaI和Xma I双酶切，与用Xba I和Xma I双酶切的载体pHCMC05-tuaD连接，得到新的附加型严谨表达载体pHCMC05-tuaD-gtaB(图谱如图2)，即重组质粒2，其核苷酸序列为SEQ NO.7。该载体含有来自枯草芽孢杆菌UDP-葡萄糖脱氢酶基因和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因和可诱导的乳糖利用操纵子的启动子。
(4)来自枯草芽孢杆菌乙酰转移酶(Acetyltransferase)和UDP-N-乙酰-葡萄糖氨焦磷酸化酶基因(UDP-GIcNAc pyrophosphorylase gene)的克隆
使用天根细菌基因组DNA提取试剂盒提取枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilissubsp.subtilis168)基因组DNA，设计一对引物，以提取的枯草芽孢杆菌基因组DNA为模板进行PCR反应，具体反应条件为94℃预变性5分钟，再按照94℃1分钟、48℃1分钟、72℃1分钟30秒进行30个循环，最后按72℃延伸8分钟的程序进行。设计的一对引物序列如下：
5'-CGGGATCCATGGATAAGCGGTTTGCAGTTGT-3'(5'端带有BamH I酶切位点，GGATCC)，引物SEQNO.18。
5'-GCTCTAGATTATTTTTTATGAATATTTTTCACA-3'(5'端带有Xba I酶切位点，TCTAGA)，引物SEQNO.19。
按照上面的方法扩增出的来自枯草芽孢杆菌UDP-葡萄糖脱氢酶基因大小为1371bp，即SEQ NO.4
(5)含有来自枯草芽孢杆菌乙酰转移酶和UDP-N-乙酰-葡萄糖氨焦磷酸化酶基因的附加型严谨表达载体的构建
将经连接T载体(连接使用T载体连接试剂盒18-T Simple Vector)后测序正确的枯草芽孢杆菌UDP-葡萄糖脱氢酶基因用BamH I和Xba I双酶切后进行胶回收，连接至用BamH I和Xba I双酶切的附加型严谨表达载体pHCMC05中，构成含有枯草芽孢杆菌乙酰转移酶和UDP-N-乙酰-葡萄糖氨焦磷酸化酶基因的附加型严谨表达载体pHCMC05-gcaD(图谱如图3)，即重组质粒3，其核苷酸序列为SEQ NO.8。该载体含有来自枯草芽孢杆菌乙酰转移酶和UDP-N-乙酰-葡萄糖氨焦磷酸化酶基因和可诱导的乳糖利用操纵子的启动子。
(6)来自枯草芽孢杆菌葡萄糖-6-磷酸变位酶基因(phosphoglucoisomerasegene)的克隆
使用天根细菌基因组DNA提取试剂盒提取枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilissubsp.subtilis168)基因组DNA，设计一对引物，以提取的枯草芽孢杆菌基因组DNA为模板进行PCR反应，具体反应条件为94℃预变性5分钟，再按照94℃1分钟、48℃1分钟、72℃1分钟30秒进行30个循环，最后按72℃延伸8分钟的程序进行。设计的一对引物序列如下：
5'-TAGGATCCATGACGCATGTACGCTTTGA-3'(5'端带有BamH I酶切位点，GGATCC)，引物SEQNO.20。
5'-GCTCTAGATTAATCTTCCAGACGTTT-3'(5'端带有Xba I酶切位点，TCTAGA)，引物SEQ NO.21。
按照上面的方法扩增出的来自枯草芽孢杆菌葡萄糖-6-磷酸变位酶基因大小为1353bp，即SEQ NO.5
(7)含有来自枯草芽孢杆菌葡萄糖-6-磷酸变位酶基因的附加型严谨表达载体的构建
将经连接T载体(连接使用T载体连接试剂盒18-T Simple Vector)后测序正确的枯草芽孢杆菌葡萄糖-6-磷酸变位酶基因用BamH I和Xba I双酶切后进行胶回收，连接至用BamH I和Xba I双酶切的附加型严谨表达载体pHCMC05中，构成含有枯草芽孢杆菌乙酰转移酶和UDP-N-乙酰-葡萄糖氨焦磷酸化酶基因的附加型严谨表达载体pHCMC05-pgi(图谱如图4)，即重组质粒4，其核苷酸序列为SEQ NO.9。该载体含有来自枯草芽孢杆菌葡萄糖-6-磷酸变位酶基因和可诱导的乳糖利用操纵子的启动子。
实施例3：将实施例1和2构建的各个表达载体分别转化到枯草芽孢杆菌宿主细胞中，获得重组工程菌株，并通过其发酵制备几种不同分子量的均一透明质酸。
本项实施例描述通过制备感受态的方法将实施例1和2构建的各个表达载体转化到枯草芽孢杆菌宿主细胞中，获得重组工程菌株，并通过其发酵制备几种不同分子量的均一透明质酸。
(1)将构建的整合型表达载体pAX01-PmHAS转化到枯草芽孢杆菌细胞中，获得重组工程菌株B.subtilis(pAX01-PmHAS)。
按照以下方法制备枯草芽孢杆菌的感受态：将枯草芽孢杆菌在LB平板上划线得到单菌落，再将单菌落接种到3mL液体LB培养基中在37℃振荡培养过夜，取160μL培养液接种到8mLSP I培养基中，37℃，220r/min培养4到5小时到对数生长期。取200μL培养至对数生长期的SP I培养液接种至2mLSPII培养基中，37℃，100r/min培养90分钟。在上述SPII培养基的菌体中加入20μL10mmol/L EGTA，再于37℃，100r/min培养10分钟。将上述处理后的菌液分装成500μL每管，加入5μL质粒载体pAX01-PmHAS(1μg/μL)，再于37℃，220r/min培养90分钟，取菌液涂布含有5μg/mL红霉素的LB平板，37℃培养48小时，得到单菌落。挑取单菌落提取基因组DNA，以克隆基因设计的引物(SEQNO.：12和13)进行PCR扩增。得到大小为2100bp的DNA条带，与禽多杀性巴氏杆菌透明质酸合成酶基因实际大小一致。
感受态制备所需溶液的配制方法为：
SP-A盐溶液：秤取2g硫酸铵，14g三水合磷酸氢二钾，6g磷酸二氢钾，1g柠檬酸钠加蒸馏水定容至500mL，121℃灭菌20分钟。
SP-B盐溶液：秤取0.2g七水合硫酸镁加蒸馏水定容至500mL，121℃灭菌20分钟。
100X CAYE溶液：2g酪蛋白水解物，10g酵母抽提物加蒸馏水定容至100mL，121℃灭菌20分钟。
SP I培养基(20mL)：量取9.8mL SP-A盐溶液，9.8mL SP-B盐溶液，200μL葡萄糖溶液(50％w/v115℃灭菌20分钟)，200μL100X CAYE溶液。
SPII培养基(6mL)：量取5.88mL SP I培养基，60μL50mmol/L氯化钙溶液，60μL250mmol/L氯化镁溶液。
100X EGTA溶液：10mmol/L EGTA溶液，溶解时加入少量氢氧化钠至pH8.0。
(2)将构建的附加型严谨表达载体pHCMC05-tuaD-gtaB转化到整合有PmHAS枯草芽孢杆菌细胞中，获得重组工程菌株B.subtilis(pAX01-PmHAS/pHCMC05-tuaD-gtaB)。
按照以下方法制备整合有PmHAS枯草芽孢杆菌的感受态：将整合有PmHAS枯草芽孢杆菌在含有5μg/mL红霉素的LB平板上划线得到单菌落，再将单菌落接种到3mL液体LB培养基中在37℃振荡培养过夜，取160μL培养液接种到8mLSP I培养基中，37℃，220r/min培养4到5小时到对数生长期。取200μL培养至对数生长期的SP I培养液接种至2mLSPII培养基中，37℃，100r/min培养90分钟。在上述SPII培养基的菌体中加入20μL10mmol/L EGTA，再于37℃，100r/min培养10分钟。将上述处理后的菌液分装成500μL每管，加入5μL质粒载体pHCMC05-tuaD-gtaB(1μg/μL)，再于37℃，220r/min培养90分钟，取菌液涂布含有5μg/mL红霉素和5μg/mL氯霉素的LB平板，37℃培养48小时，得到单菌落。挑取单菌落提取附加型质粒载体DNA，以克隆基因设计的引物(SEQ NO.：14、15、16、17)进行PCR扩增。得到大小为1400bp和900bp的DNA条带，与来自枯草芽孢杆菌UDP-葡萄糖脱氢酶基因和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因实际大小一致。
(3)将构建的附加型严谨表达载体pHCMC05-gcaD转化到整合有PmHAS枯草芽孢杆菌细胞中获得重组工程菌株B.subtilis(pAX01-PmHAS/pHCMC05-gcaD)。
按照以下方法制备整合有PmHAS枯草芽孢杆菌的感受态：将整合有PmHAS枯草芽孢杆菌在含有5μg/mL红霉素的LB平板上划线得到单菌落，再将单菌落接种到3mL液体LB培养基中在37℃振荡培养过夜，取160μL培养液接种到8mLSP I培养基中，37℃，220r/min培养4到5小时到对数生长期。取200μL培养至对数生长期的SP I培养液接种至2mLSP II培养基中，37℃，100r/min培养90分钟。在上述SPII培养基的菌体中加入20μL10mmol/L EGTA，再于37℃，100r/min培养10分钟。将上述处理后的菌液分装成500μL每管，加入5μL质粒载体pHCMC05-gcaD(1μg/μL)，再于37℃，220r/min培养90分钟，取菌液涂布含有5μg/mL红霉素和5μg/mL氯霉素的LB平板，37℃培养48小时，得到单菌落。挑取单菌落提取附加型质粒载体DNA，以克隆基因设计的引物(SEQ NO.：18和19)进行PCR扩增。得到大小为1400bp的DNA条带，与来自枯草芽孢杆菌乙酰转移酶和UDP-N-乙酰-葡萄糖氨焦磷酸化酶基因实际大小一致。
(4)将构建的附加型严谨表达载体pHCMC05-pgi转化到整合有PmHAS枯草芽孢杆菌细胞中，获得重组工程菌株B.subtilis(pAX01-PmHAS/pHCMC05-pgi)。
按照以下方法制备整合有PmHAS枯草芽孢杆菌的感受态：将整合有PmHAS枯草芽孢杆菌在含有5μg/mL红霉素的LB平板上划线得到单菌落，再将单菌落接种到3mL液体LB培养基中在37℃振荡培养过夜，取160μL培养液接种到8mLSP I培养基中，37℃，220r/min培养4到5小时到对数生长期。取200μL培养至对数生长期的SP I培养液接种至2mLSP II培养基中，37℃，100r/min培养90分钟。在上述SPII培养基的菌体中加入20μL10mmol/L EGTA，再于37℃，100r/min培养10分钟。将上述处理后的菌液分装成500μL每管，加入5μL质粒载体pHCMC05-pgi(1g/μL)，再于37℃，220r/min培养90分钟，取菌液涂布含有5μg/mL红霉素和5μg/mL氯霉素的LB平板，37℃培养48小时，得到单菌落。挑取单菌落提取附加型质粒载体DNA，以克隆基因设计的引物(SEQ NO.：20和21)进行PCR扩增。得到大小为1400bp的DNA条带，与来自枯草芽孢杆菌葡萄糖-6-磷酸变位酶基因实际大小一致。
(5)利用重组工程菌株B.subtilis(pAX01-PmHAS/pHCMC05-tuaD-gtaB)摇瓶发酵制备3种不同分子量均一透明质酸。
①重组工程菌株B.subtilis(pAX01-PmHAS/pHCMC05-tuaD-gtaB)摇瓶发酵制备重均分子量为4.55MDa的均一分子量透明质酸。
工程菌株摇瓶发酵制备重均分子量为4.55MDa的均一分子量透明质酸按以下方法进行：在500mL三角瓶中，以总体积100mL含1g氯化钠，1g蛋白胨，0.5g酵母抽提物的体系中按1％(v/v)接种含有SEQ NO.1、SEQ NO.2、SEQ NO.3的pAX01/pHCMC05/B.subtilis，当发酵液OD600nm达到0.2时加入诱导剂IPTG至终浓度1mmol/L，当发酵液OD600nm达到0.2到0.4时加入诱导剂木糖至终浓度0.5％(w/v)，发酵条件为37℃，220rpm，发酵终点为接种后培养48小时，最后，从100mL培养基分离纯化得到300mg的分子量为4.55MDa的均一分子量透明质酸。
从工程菌株摇瓶发酵培养基中分离纯化透明质酸按照以下方法进行：向发酵液中加入等体积的十二烷基硫酸钠溶液(0.1％SDS，w/v)，4000rpm离心20min，去除菌体沉淀，保留上清液。向上清液中加入10％(v/v)的十六烷基三甲基溴化铵溶液(10％CTAB，w/v)，4000rpm离心20min，弃去上清，保留沉淀。用1mol/L的NaCl溶液解离沉淀至溶液澄清。向溶液中加入5倍体积的预冷无水乙醇，4℃醇沉。4000rpm离心20min，弃去上清，用无水乙醇洗涤沉淀2-3次，将沉淀放置在真空干燥箱中进行干燥。干燥后白色沉淀即为透明质酸样品。
②重组工程菌株B.subtilis(pAX01-PmHAS/pHCMC05-tuaD-gtaB)摇瓶发酵制备重均分子量为7.99KDa的均一分子量透明质酸。
工程菌株摇瓶发酵制备重均分子量为7.99KDa的均一分子量透明质酸按以下方法进行：在500mL三角瓶中，以总体积100mL含1g氯化钠，1g蛋白胨，0.5g酵母抽提物的体系中按1％(v/v)接种含有SEQ NO.1、SEQ NO.2、SEQ NO.3的pAX01/pHCMC05/B.subtilis，当发酵液OD600nm达到0.2时加入诱导剂IPTG至终浓度1mmol/L，当发酵液OD600nm达到1.0到1.2时加入诱导剂木糖至终浓度0.5％(w/v)，发酵条件为37℃，220rpm，发酵终点为接种后培养48小时，最后，从100mL培养基分离纯化得到100mg的分子量为7.99KDa的均一分子量透明质酸。
从工程菌株摇瓶发酵培养基中分离纯化透明质酸按照以下方法进行：向发酵液中加入等体积的十二烷基硫酸钠溶液(0.1％SDS，w/v)，4000rpm离心20min，去除菌体沉淀，保留上清液。向上清液中加入4％(v/v)的十六烷基三甲基溴化铵溶液(10％CTAB，w/v)，4000rpm离心20min，弃去上清，保留沉淀。用1mol/L的NaCl溶液解离沉淀至溶液澄清。向溶液中加入5倍体积的预冷无水乙醇，4℃醇沉。4000rpm离心20min，弃去上清，用无水乙醇洗涤沉淀2-3次，将沉淀放置在真空干燥箱中进行干燥。干燥后白色沉淀即为透明质酸样品。
③重组工程菌株B.subtilis(pAX01-PmHAS/pHCMC05-tuaD-gtaB)摇瓶发酵制备重均分子量为5.43MDa的均一分子量透明质酸。
工程菌株摇瓶发酵制备重均分子量为5.43MDa的均一分子量透明质酸按以下方法进行：在500mL三角瓶中，以总体积100mL含1g氯化钠，1g蛋白胨，0.5g酵母抽提物的体系中按1％(v/v)接种含有SEQNO.1、SEQ NO.2、SEQ NO.3的pAX01/pHCMC05/B.subtilis，当发酵液OD600nm达到0.2时加入诱导剂IPTG至终浓度1mmol/L，当发酵液OD600nm达到0.2到0.4时加入诱导剂木糖至终浓度0.5％(w/v)，发酵条件为37℃，220rpm，发酵终点为接种后培养8小时，最后，从100mL培养基分离纯化得到60mg的分子量为5.43MDa的均一分子量透明质酸。
从工程菌株摇瓶发酵培养基中分离纯化透明质酸按照以下方法进行：向发酵液中加入等体积的十二烷基硫酸钠溶液(0.1％SDS，w/v)，4000rpm离心20min，去除菌体沉淀，保留上清液。向上清液中加入4％(v/v)的十六烷基三甲基溴化铵溶液(10％CTAB，w/v)，4000rpm离心20min，弃去上清，保留沉淀。用1mol/L的NaCl溶液解离沉淀至溶液澄清。向溶液中加入5倍体积的预冷无水乙醇，4℃醇沉。4000rpm离心20min，弃去上清，用无水乙醇洗涤沉淀2-3次，将沉淀放置在真空干燥箱中进行干燥。干燥后白色沉淀即为透明质酸样品。
(6)利用重组工程菌株B.subtilis(pAX01-PmHAS/pHCMC05-gcaD)摇瓶发酵制备1种重均分子量为13.20KDa均一透明质酸。
工程菌株摇瓶发酵制备重均分子量为13.20KDa的均一分子量透明质酸按以下方法进行：在500mL三角瓶中，以总体积100mL含1g氯化钠，1g蛋白胨，0.5g酵母抽提物的体系中按1％(v/v)接种含有SEQ NO.1、SEQ NO.4的pAX01/pHCMC05/B.subtilis，当发酵液OD600nm达到0.2时加入诱导剂IPTG至终浓度1mmol/L，当发酵液OD600nm达到0.2到0.4时加入诱导剂木糖至终浓度0.5％(w/v)，发酵条件为37℃，220rpm，发酵终点为接种后培养48小时，最后，从100mL培养基分离纯化得到80mg的分子量为13.20KDa的均一分子量透明质酸。
从工程菌株摇瓶发酵培养基中分离纯化透明质酸按照以下方法进行：向发酵液中加入等体积的十二烷基硫酸钠溶液(0.1％SDS，w/v)，4000rpm离心20min，去除菌体沉淀，保留上清液。向上清液中加入4％(v/v)的十六烷基三甲基溴化铵溶液(10％CTAB，w/v)，4000rpm离心20min，弃去上清，保留沉淀。用1mol/L的NaCl溶液解离沉淀至溶液澄清。向溶液中加入5倍体积的预冷无水乙醇，4℃醇沉。4000rpm离心20min，弃去上清，用无水乙醇洗涤沉淀2-3次，将沉淀放置在真空干燥箱中进行干燥。干燥后白色沉淀即为透明质酸样品。
(7)利用重组工程菌株B.subtilis(pAX01-PmHAS/pHCMC05-pgi)摇瓶发酵制备1种重均分子量为4.54MDa均一透明质酸。
工程菌株摇瓶发酵制备重均分子量为4.54MDa的均一分子量透明质酸按以下方法进行：在500mL三角瓶中，以总体积100mL含1g氯化钠，1g蛋白胨，0.5g酵母抽提物的体系中按1％(v/v)接种含有SEQNO.1、SEQ NO.5的pAX01/pHCMC05/B.subtilis，当发酵液OD600nm达到0.2时加入诱导剂IPTG至终浓度1mmol/L，当发酵液OD600nm达到0.2到0.4时加入诱导剂木糖至终浓度0.5％(w/v)，发酵条件为37℃，220rpm，发酵终点为接种后培养48小时，最后，从100mL培养基分离纯化得到150mg的分子量为4.54MDa的均一分子量透明质酸。
从工程菌株摇瓶发酵培养基中分离纯化透明质酸按照以下方法进行：向发酵液中加入等体积的十二烷基硫酸钠溶液(0.1％SDS，w/v)，4000rpm离心20min，去除菌体沉淀，保留上清液。向上清液中加入8％(v/v)的十六烷基三甲基溴化铵溶液(10％CTAB，w/v)，4000rpm离心20min，弃去上清，保留沉淀。用1mol/L的NaCl溶液解离沉淀至溶液澄清。向溶液中加入5倍体积的预冷无水乙醇，4℃醇沉。4000rpm离心20min，弃去上清，用无水乙醇洗涤沉淀2-3次，将沉淀放置在真空干燥箱中进行干燥。干燥后白色沉淀即为透明质酸样品。
实施例4：工程菌株摇瓶发酵制备几种不同分子量均一透明质酸的红外光谱鉴定
将实施例3得到的白色透明质酸样品进行溴化钾压片，再进行红外光谱检测分析，得到红外吸收特征性光谱图，与标准透明质酸红外吸收特征性光谱图进行比较，结果可以看出，经工程菌发酵制备所得的白色沉淀即为透明质酸。经工程菌发酵制备所得的白色沉淀红外吸收光谱图如图5
由图5可以看出，在3400cm-1-3440cm-1有强的O-H伸缩振动的特征吸收，表明有多羟基结构；在2900cm-1-2930cm-1附近有-CH2的伸缩振动；在1729cm-1-1622cm-1处有-C＝O和-C-N伸缩振动及-N-H弯曲振动的吸收峰，表明存在乙酰氨基结构；1405cm-1处有O＝C-O-伸缩振动及1251cm-1处的-OH伸缩振动的两个吸收峰表明羧基的存在。该白色沉淀物质的红外吸收峰与标准透明质酸红外吸收峰完全吻合，表明经工程菌发酵制备所得的白色沉淀为透明质酸。
实施例5：工程菌株摇瓶发酵制备几种不同分子量均一透明质酸的含量测定
(1)通过硫酸咔唑法测定葡萄糖醛酸含量计算透明质酸含量。
对照品溶液的制备：取经105℃干燥至恒重的葡萄糖醛酸对照品60mg，精密称定，置100ml容量瓶中，用水溶解，并稀释至刻度，摇匀；精密量取10ml，置100ml容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。
样品溶液的制备：取本品约80mg，精密称定，置100ml容量瓶中，用水溶解，并稀释至刻度，摇匀；用内容量移液管量取10ml，置100ml容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。
标准曲线的制备：精密量取对照品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml，分别置25ml具塞试管中，依次分别加水至1.0ml，混匀，冰浴中冷却，并在不断振摇下缓缓滴加0.025mol/L硼砂硫酸溶液5.0ml，密塞，沸水浴加热10分钟(中间振摇一次)，迅速冷却，加0.125％咔唑的无水乙醇溶液0.2ml，摇匀，沸水浴中加热15分钟(中间振摇一次)，冷却至室温。照紫外-可见分光光度法(中国药典2010年版二部附录IVA)，以0管为空白，在530nm的波长处测定吸光度，以葡萄糖醛酸的μg数对相应的吸光度计算回归方程。
测定法：精密量取样品溶液1ml，置25ml具塞试管中，自“冰浴中冷却”起照标准曲线制备项下的方法测定，由回归方程计算葡萄糖醛酸的含量，乘以2.0675，即得透明质酸含量。
(2)通过CTAB比浊法测定发酵液中透明质酸含量。
对照品溶液的制备：精密称定10mg透明质酸标准品，置10ml量瓶中，用水溶解，并稀释至刻度，摇匀。
样品溶液的制备：取发酵液培养基1mL加入3mL无水乙醇，离心去上清，将沉淀溶于1mL水。
标准曲线的制备：从精密配制的浓度为1mg/mL的HA标准溶液中分别量取0，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8mL于带塞试管中，加水至1mL，加入2mL2.5g/L的CTAB溶液后混匀，在25℃的条件下反应10min，测定A400nm。以HA标准液的浓度对A400nm做图，制作标准曲线。
测定法：精密量取样品溶液1ml，稀释适当倍数，按照上述方法测定A400nm。由标准曲线回归方程计算出相应浓度，乘以稀释倍数得到发酵液培养基中透明质酸的含量。
实施例6：工程菌株摇瓶发酵制备几种不同分子量均一透明质酸的分子量与分子量分布测定
取本品5mg，加流动相至50ml，摇匀，室温放置过夜，作为供试品溶液。另取5个已知分子量范围0.1万～500万的聚苯乙烯硫酸酯钠盐对照品，同法配制成每1ml中约含0.1mg的溶液作为系列对照品溶液。照分子排阻色谱法(中国药典2010年版二部附录VH)，用多糖测定用凝胶柱Shodex SB-806HQ(8.0mm×300mm)，以0.2mol/L氯化钠溶液(取氯化钠11.9g，叠氮化钠0.1g，加纯水使溶解并稀释至1000m1)为流动相，柱温35℃，流速为每分钟0.5ml，检测器为示差折光检测器，高效液相系统为安捷伦(Agilent)1100。透明质酸样品高效液相色谱图如图6。
取上述各对照品溶液100μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，由GPC软件进行普适校正计算线性回归方程，对照品K值为0.00018，a值为0.65；本品K值为0.00057，a值为0.75。取供试品溶液100μ1，同法测定，用GPC软件计算出供试品的分子量及分子量分布。
本发明的工程菌株摇瓶发酵制备的几种不同分子量均一透明质酸的分子量与分子量分布见表1。
表1几种不同分子量均一透明质酸的分子量与分子量分布
Claims (8)
1.一种重组工程菌1，其特征在于含有重组质粒1和重组质粒2；其中重组质粒1的核苷酸序列为SEQ NO：6，重组质粒2的核苷酸序列为SEQ NO：7。
2.一种重组工程菌2，其特征在于含有重组质粒1和重组质粒3，其中所述的重组质粒1的核苷酸序列为SEQ NO：6，重组质粒3的核苷酸序列为SEQ NO：8。
3.一种重组工程菌3，其特征在于含有重组质粒1和重组质粒4，其中重组质粒1的核苷酸序列为SEQ NO：6，重组质粒4的核苷酸序列为SEQ NO：9。
4.利用权利要求1所述的一种重组工程菌1制备透明质酸的方法，其特征在于按如下步骤实现：
A、以总体积100mL含1g氯化钠，1g蛋白胨，0.5g酵母抽提物的体系中按1％v/v接种重组工程菌1；发酵液OD600nm达到0.2时加入诱导剂IPTG至终浓度1mmol/L，发酵液OD600nm达到0.2到0.4时加入诱导剂木糖至终浓度0.5％w/v，发酵终点为接种后培养48小时，从培养基中分离得到重均分子量为5.43MDa的透明质酸；
B、以总体积100mL含1g氯化钠，1g蛋白胨，0.5g酵母抽提物的体系中按1％v/v接种重组工程菌1进行发酵；发酵液OD600nm达到0.2时加入诱导剂IPTG至终浓度1mmol/L，发酵液OD600nm达到0.2到0.4时加入诱导剂木糖至终浓度0.5％w/v，发酵终点为接种后培养8小时；从培养基中分离得到重均分子量为4.55MDa的透明质酸；
C、以总体积100mL含1g氯化钠，1g蛋白胨，0.5g酵母抽提物的体系中按1％v/v接种重组工程菌1进行发酵；发酵液OD600nm达到0.2时加入诱导剂IPTG至终浓度1mmol/L，发酵液OD600nm达到1.0到1.2时加入诱导剂木糖至终浓度0.5％w/v，发酵终点为接种后培养48小时；从培养基中分离得到重均分子量为7.99KDa的透明质酸。
5.利用权利要求2所述的一种重组工程菌2制备透明质酸的方法，其特征在于按如下步骤实现：
以总体积100mL含1g氯化钠，1g蛋白胨，0.5g酵母抽提物的体系中按1％v/v接种重组工程菌2进行发酵；发酵液OD600nm达到0.2时加入诱导剂IPTG至终浓度1mmol/L，发酵液OD600nm达到0.2到0.4时加入诱导剂木糖至终浓度0.5％w/v，发酵终点为接种后培养48小时，从培养基中分离得到重均分子量为13.20KDa的透明质酸。
6.利用权利要求3所述的一种重组工程菌3制备透明质酸的方法，其特征在于按如下步骤实现：
以总体积100mL含1g氯化钠；1g蛋白胨，0.5g酵母抽提物的体系中按1％v/v接种重组工程菌3进行发酵；发酵液OD600nm达到0.2时加入诱导剂IPTG至终浓度1mmol/L，发酵液OD600nm达到0.2到0.4时加入诱导剂木糖至终浓度0.5％w/v，发酵终点为接种后培养48小时；从培养基中分离得到重均分子量为4.53MDa的透明质酸。
7.一种制备透明质酸的生物合成方法，其特征在于按如下步骤实现：
第一步、从禽多杀性巴氏杆菌Pasteurella multocida P-1059ATCC#15742分离透明质酸合成酶基因，即SEQ NO.1；
第二步、从革兰氏阳性安全微生物宿主分离与透明质酸前体，即UDP-葡萄糖醛酸和UDP-N-乙酰-葡萄糖氨的合成相关基因，包括：UDP-葡萄糖脱氢酶基因，即SEQ NO.2；UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因，即SEQ NO.3；乙酰转移酶和UDP-N-乙酰-葡萄糖氨焦磷酸化酶基因，即SEQNO.4；葡萄糖-6-磷酸变位酶基因，即SEQNO.5；
第三步、将SEQ NO.1与化学诱导启动子组成第一个重组表达质粒；将来自SEQ NO.2到SEQ NO.5中的任何一个基因与另一个化学诱导启动子组成第二个重组表达质粒；
所述的化学诱导启动子包括：枯草芽孢杆菌的木糖异构酶基因的启动子和大肠杆菌的乳糖利用操纵子的启动子；
第四步、采用制备感受态细胞的方法将两个重组表达质粒转化革兰氏阳性微生物宿主菌，用选择标记筛选，得到能分泌表达不同分子量均一透明质酸的革兰氏阳性基因工程安全菌株；
所述的选择标记是指：用来筛选含有透明质酸合成相关基因的基因工程安全菌株的抗性基因，包括：红霉素抗性基因，氯霉素抗性基因；
第五步、对革兰氏阳性基因工程安全菌株进行发酵培养，在不同培养阶段加入诱导透明质酸前体合成的诱导剂和诱导透明质酸合成的诱导剂以及设置不同发酵终点，借此控制透明质酸在宿主菌体内合成进程以获得不同分子量均一透明质酸，发酵结束后即从培养基中分离纯化得到基于基因工程安全菌株的不同分子量均一透明质酸；
所述的化学诱导启动子的转录是指：所述的木糖异构酶基因的启动子只有加入木糖后才可能启动下游基因的转录，木糖的质量百分比浓度为0.5％到2％；所述的乳糖利用操纵子的启动子只有加入IPTG后才可能启动下游基因的转录，IPTG的摩尔浓度为1mmol/L到25mmol/L。
8.根据权利要求7所述的一种制备透明质酸的生物合成方法，其特征在于所述的革兰氏阳性安全微生物包括枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、短芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、短短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜淀粉拟杆菌、嗜热脂肪地芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、缓慢芽孢杆菌、嗜淀粉拟杆菌、纳豆芽孢杆菌中任一种。
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