CN105647977A - 一种固定化糖化酶及酵母同步糖化发酵木薯生产乙醇的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于发酵工程技术领域，为一种固定化糖化酶及酵母同步糖化发酵木薯生产乙醇的方法，步骤如下：以木薯粉、水和α-淀粉酶为原料，然后添加硫酸铵、硫酸镁和磷酸二氢钾制得发酵液化醪液；将海藻酸钠和聚氧化乙烯混合制备成凝胶，然后将液体糖化酶与超级酿酒高活性干酵母添加制备好的凝胶液中混合，再逐滴滴加到氯化钙溶液中，形成小球，制得糖化酶与酵母固定细胞；将糖化酶与酵母固定细胞添加到液化醪液中，搅拌、发酵，得到乙醇产品。本发明的优点：与常规工业乙醇发酵工艺相比极大地缩短发酵时间；采用的原料价格便宜且对发酵没有毒害作用，可以在发酵完毕后回收制备饲料；极大地提高了乙醇发酵效率。
Description
技术领域
本发明属于发酵工程技术领域，涉及一种固定化糖化酶及酵母同步糖化发酵木薯生产乙醇的方法，提供一种以木薯为原料，利用固定化糖化酶及酵母生产乙醇的方法。通过使用本发明公开的特殊的固定化剂，取得了缩短发酵时间、提高了发酵效率。
背景技术
在现有技术中固定化细胞发酵具有能使发酵罐内细胞浓度提高，细胞可连续使用，最终使发酵液酒精浓度得以提高。在游离发酵过程中，菌种细胞随着酵液流出，造成菌种细胞浓度迅速降低，发酵速度变慢。
目前研究比较广泛的是采用聚乙烯醇(PVA)为载体共固定化酵母菌细胞和糖化酶，在酵母菌与糖化酶共固定化木薯酒精连续发酵工艺研究中，以木薯糖化醪液为发酵底物，在共固定化生物反应器中，控制发酵温度30℃，在糖化醪流加速率为9mL/h，停留时间3.1h和稀释速率为0.155h-1条件下进行酒精连续发酵，成熟发酵醪液残余总糖和残余还原糖含量均较低，游离细胞数较常规发酵低1个数量级以上，总糖利用率高达96.91％。
共固定化酵母菌细胞和糖化酶可用于木薯酒精连续发酵工艺，但聚乙烯醇存在有危险性，当吸入、摄入或经皮肤吸收聚乙烯醇后对身体有害，对眼睛和皮肤有刺激作用，而且聚乙烯醇可燃，具有刺激性，其粉体与空气可形成爆炸性混合物，当达到一定浓度时，遇火星会发生爆炸，加热分解产生易燃气体。
综上所述说明聚乙烯醇不适合在木薯酒精连续发酵工艺中大规模应用。
中国专利CN103484504A,于2014年1月1日公开了一种以木薯为原料发酵制备乙醇的方法，其中酵母菌的固定化采用海藻酸钠溶液。该方法包括木薯液化、糖化、固定化酵母发酵、蒸馏提取乙醇的步骤，所述木薯液化是将木薯粉碎后加水搅匀，按照5U/g～10U/g木薯的比例添加淀粉酶，在96℃～98℃下液化20min～30min，得到液化浆液；
所述糖化是将木薯液化得到的浆液真空降温至58℃～62℃，采用注射方式加入硫酸调节pH＝4.5～5.0，再按照150U/g～200U/g木薯的比例往木薯液化浆液中加入糖化酶保温糖化40min～50min，得到糖化醪；
所述固定化酵母发酵是向糖化醪中接种经固定化的酵母菌，其用量以酵母菌计，为木薯重量的0.5‰～1‰,在38℃～40℃下发酵9h～11h，收集流出液。
所述的以木薯为原料发酵制备乙醇的方法，其中酵母菌的规定化方法为：将活化酵母与2w％的海藻酸钠溶液混匀后用注射器逐滴滴加到2w％的氯化钙溶液中，反应2小时，形成海藻酸钙凝胶颗粒；再将海藻酸钙凝胶颗粒水洗后移入到2w％的氯化钙溶液中，在4℃下平衡12小时，用蒸馏水洗涤3次后，移入到1w％的硫酸铝溶液中，在4℃下交换12小时，得到海藻酸铝凝胶颗粒。
该专利所选择的高分子载体为海藻酸铝，具有价格便宜，制备简单，安全无毒、扩散系数大，机械强度好，固定化条件温和等优点，同时具有很强的耐盐能力，尤其是耐磷酸盐的能力，选用海藻酸铝合凝胶固定化酵母菌能明显延长固定化酵母的使用寿命，降低生产成本。
中国专利CN103571880A，于2014年2月12日公开了一种利用甜菜生产燃料乙醇的方法，其中酵母细胞的固定化采用海藻钠和聚乙烯醇，该方法包含有：
A、制备玉米浆液：1L水中加入30g玉米粉，加热为(90±2)℃，加入α-淀粉酶液化35min，冷却降温至(55±2)℃，加入糖化酶糖化50min；
B、制备固定化酵母细胞活化增殖培养基：葡萄糖20g，玉米浆液30ml，硫酸铵0.5g，磷酸二氢钾0.02g，硫酸亚铁0.003g，加水至1000ml，常规高压灭菌后冷却备用；
C、酵母菌细胞的固定化：将适量活性干酵母置于30℃无菌水中化开后，按比例与含有0.6％海藻酸钠的6％聚乙烯醇水溶液混匀，再用注射器逐滴滴入含1％氯化钙的5％硼酸液中，制得直径为3mm左右的固定化凝胶颗粒，固化50min，滤出固定化凝胶颗粒，用生理盐水洗涤3次，浸入无菌水中备用；
D、固定化酵母细胞的增殖：将固定化酵母细胞凝胶颗粒用无菌水浸洗5次，加入同体积的固定化酵母活化增殖培养基，于30℃、120r/min通气振荡培养，13h后酵母细胞开始增殖。
当培养时间至24小时时，游离酵母数为3.8×107个/ml以上，即完成增殖过程；
E、固定化生物催化剂酒精连续发酵：
将备好的连续发酵培养基用蠕动泵恒速输入固定化生物反应器中，控制发酵温度30℃，在糖化醪流加速率为15ml/h～16ml/h、停留时间为3h～4h和稀释速率为0.15h-1～0.16h-1条件下进行酒精连续发酵；
F、确定聚乙烯醇(PVA)凝胶颗粒的稳定性。
该专利的优点是通过将酵母固定化，使得酵母在发酵甜菜生产燃料酒精时可以重复利用，且提高了发酵效率和酵母的稳定性。
美国专利US5766907A，于1998年6月16日公开了一种固定化微生物细胞的方法，其采用海藻酸钠和聚氧乙烯山梨糖醇。
以上三个专利的存在的不足之处是发酵时间相对较长，发酵效率相对较低。
发明内容
本发明的就是方案是为了克服现有技术中存在的原料聚乙烯醇对身体有害，对眼睛和皮肤有刺激作用，而且聚乙烯醇可燃，具有刺激性，其粉体与空气可形成爆炸性混合物，当达到一定浓度时，遇火星会发生爆炸，加热分解产生易燃气体、发酵时间相对较长，发酵效率相对较低的不足之处，而提出了一种固定化糖化酶及酵母同步糖化发酵木薯生产乙醇的方法，该方法选取海藻酸钠和聚氧化乙烯为载体，代替聚乙烯醇在共固定化酵母菌细胞和糖化酶上的应用。本发明适用于制备固定化细胞或固定化酶，采用该法制备的固定化细胞或酶可用于化工、生物、医学等领域，进行发酵、细胞与酶的增值、核酸提纯和DNA分离等。
本发明可应用到淀粉质原料发酵生产乙醇的工业化上，固定化细胞发酵技术有许多突出优点：由于大大增加了细胞浓度,增强了菌体对外部条件温度和酸碱度抵抗能力；缩短了发酵周期，提高反应器单位体积生物转化速率；而且由于细胞被固定，减少了细胞流失,细胞可长时间反复使用，并为产物分离等发酵连续化和规模化提供了方便。
本发明的技术方案：
一种固定化糖化酶及酵母同步糖化发酵木薯生产乙醇的方法，该方法包括如下步骤：
(1)发酵液化醪液的制备：以木薯粉、水和α-淀粉酶为原料，液化温度为80℃～90℃，充分搅拌并保温60min～160min，控制DE值在16％～22％，然后添加硫酸铵0.25g/L～0.35g/L、硫酸镁0.045g/L～0.055g/L、磷酸二氢钾0.145g/L～0.155g/L，制得发酵液化醪液；
(2)糖化酶与酵母固定细胞的制备：将质量浓度为2％～3％海藻酸钠和0.1％～0.5％聚氧化乙烯混合制备成凝胶，然后将15U/g～25U/g的液体糖化酶与4g/L～5g/L超级酿酒高活性干酵母添加制备好的凝胶液中混合，混合均匀后用注射器逐滴滴加到2％～5％的氯化钙溶液中，形成粒径3mm～5mm的小球，在3℃～5℃下平衡反应静置过夜后备用；
(3)将步骤(2)中制备的糖化酶与酵母固定细胞添加到液化醪液中，pH控制在4.0～5.0，发酵温度在35℃～40℃，固定细胞的填充率在45％～55％之间,搅拌转数150rpm/min，发酵时间40h，发酵终止时，发酵浓醪液乙醇质量浓度达到13％～15％。
所述木薯粉与水的质量比为1:3。
所述的α-淀粉酶添加量为5U/g～15U/g。
所述的液化温度优选为85℃。
所述的保温的优选时间为120min。
所述的优选DE值控制在20％。
所述的液体糖化酶的用量优选为15U/g。
所述的优选的pH值为4.5。
所述的海藻酸钠粘度在1.05Pa·S～1.15Pa·S。
所述的聚氧化乙烯分子量在30万以上。
本发明的有益效果：
本发明主要选取海藻酸钠和聚氧化乙烯为载体，代替聚乙烯醇在共固定化酵母菌细胞和糖化酶上的应用。海藻酸钠是一种天然膳食纤维，被作为食品添加剂，广泛用于各类食品。聚氧化乙烯是无毒无害的水溶性聚合物，美国食品药物管理局(FDA)已经批准聚氧化乙烯水溶液树脂在专门的食品包装和啤酒的直接添加剂方面的用途。
本发明的优点如下：
(1)本发明与常规工业乙醇发酵工艺相比极大地缩短发酵时间。
(2)本发明原料采用海藻酸钠、聚氧化乙烯，其价格便宜且属于食品级原料对发酵没有毒害作用，可以在发酵完毕后回收制备饲料。采用固定化发酵工艺发酵醪液终乙醇的质量浓度可达到13％～15％之间，极大地提高了乙醇发酵效率。
附图说明
本说明书共有1幅附图。
图1.为本发明的固定化糖化酶及酵母同步糖化发酵木薯生产乙醇的方法的流程图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的实施方式作进一步描述。
本发明的目的是提供一种以木薯为原料，利用固定化糖化酶及酵母生产乙醇的方法。该方法的过程如图1所示。
本发明包括如下步骤：
(1)发酵液化醪液的制备：
以木薯粉、水、α-淀粉酶为原料，液化温度在80℃～85℃，充分搅拌并保温60min～120min，控制DE值在18％～20％；
然后添加硫酸铵0.3g/L、硫酸镁0.05g/L、磷酸二氢钾0.15g/L，制得发酵液化醪液；
(2)糖化酶与酵母固定细胞的制备：
将2％～3％海藻酸钠和0.1％～0.5％聚氧化乙烯混合制备成凝胶；
然后将15U/g～20U/g的液体糖化酶与4g/L～5g/L超级酿酒高活性干酵母添加制备好的凝胶液中混合；
混合均匀后用注射器逐滴滴加到2％～5％的氯化钙溶液中，形成粒径3mm～5mm的小球；
在3℃～5℃下平衡反应静置过夜后备用；
(3)将步骤(2)添加到液化醪液中，pH控制在4.0～4.5，发酵温度在35℃～40℃，固定细胞的填充率在45％～55％之间,搅拌转数150rpm/min，发酵时间40h，终发酵浓醪液乙醇质量浓度达到13％～15％。
所述的木薯粉与水的质量比为1:3，α-淀粉酶用量为5U/g～15U/g。
所述的海藻酸钠粘度在1.05Pa·S～1.15Pa·S，聚氧化乙烯分子量在30万以上。
本发明使用的材料与试剂：
木薯粉：产地广西北海，淀粉含量79％；
超级酿酒高活性干酵母：安琪酵母股份有限公司产；
液体a-淀粉酶(160000U/g)：诺维信(中国)生物技术有限公司；
液体糖化酶(220000U/g)：诺维信(中国)生物技术有限公司；
海藻酸钠(1.05-1.15Pa·S)：天津市福晨化学试剂厂产，实验试剂；
聚氧化乙烯(30万分子量)：天津市丰越化学品有限公司产，分析纯；
氯化钙：天津天达净化材料精细化工厂产，分析纯；
硫酸镁：天津市光复科技发展有限公司产，分析纯；
硫酸铵：天津市瑞金特化学品有限公司产，分析纯；
磷酸二氢钾：天津市福晨化学试剂厂产，分析纯。
对比例1：
(1)木薯粉发酵糖化醪液的制备：
以木薯粉、水和α-淀粉酶为原料，木薯粉与水的质量比为1:3，α-淀粉酶为5U/g，pH在5.5，糖化温度在50℃，充分搅拌并保温60min，控制葡萄糖值(DE值)在18％。
然后添加硫酸铵0.3g/L、硫酸镁0.05g/L、磷酸二氢钾0.15g/L，制得糖化醪液。
(2)液化液的制备过程：
在糖化醪液中添加液化酶10U/g，pH在5.5，液化温度控制在80℃，充分搅拌并保温60min；
然后降温到35℃接种酵母，按4g/L的接种量添加超级酿酒高活性干酵母。
(3)发酵：
控制pH在4.0，发酵温度在35℃，搅拌转数150rpm/min，发酵时间40h，终发酵浓醪液乙醇质量浓度达到11.6％。
实施例1：
(1)木薯粉发酵液化醪液的制备：
以木薯粉、水和α-淀粉酶为原料，木薯粉与水的质量比为1:3，α-淀粉酶为5U/g，pH在5.5，液化温度在80℃，充分搅拌并保温60分钟，控制DE值在18％；
然后添加硫酸铵0.3g/L、硫酸镁0.05g/L、磷酸二氢钾0.15g/L，制得发酵液化醪液。
(2)糖化酶与酵母固定细胞的制备：
海藻酸钠粘度在1.05Pa·S～1.15Pa·S，聚氧化乙烯分子量在30万以上。2％海藻酸钠和0.5％聚氧化乙烯混合制备成凝胶；
然后将15U/g的液体糖化酶与4g/L超级酿酒高活性干酵母添加到凝胶液中，混合均匀后用注射器逐滴滴加到2％的氯化钙溶液中，形成粒径在3mm的小球；
在3℃下平衡反应静置过夜后备用。
(3)发酵：
将步骤(2)添加到液化醪液中，pH在4.0，控制发酵温度在35℃，控制固定细胞的填充率在45％，搅拌转数150rpm/min，发酵时间40h，终发酵浓醪液乙醇质量浓度达到13％。
实施例2：
(1)木薯粉发酵液化醪液的制备：
以木薯粉、水和α-淀粉酶为原料，木薯粉与水的质量比为1:3，α-淀粉酶用量为15U/g，pH在6.0，液化温度在85℃，充分搅拌并保温120min，控制DE值在20％；
然后添加硫酸铵添0.3g/L、硫酸镁0.05g/L、磷酸二氢钾0.15g/L,制得发酵液化醪液。
(2)糖化酶与酵母固定细胞的制备：
海藻酸钠粘度在1.05Pa·S～1.15Pa·S，聚氧化乙烯分子量在30万以上。3％海藻酸钠和0.3％聚氧化乙烯混合制备成凝胶；
然后将20U/g的液体糖化酶与4g/L超级酿酒高活性干酵母添加到凝胶液中，混合均匀后用注射器逐滴滴加到5％的氯化钙溶液中，形成粒径在4mm的小球；
在4℃下平衡反应静置过夜后备用。
(3)发酵：
将步骤(2)添加到液化醪液中，pH在4.5，控制发酵温度在38℃，控制固定细胞的填充率在50％，搅拌转数150rpm/min，发酵时间40h，终发酵浓醪液乙醇质量浓度达到15％。
实施例3：
(1)木薯粉发酵液化醪液的制备：
以木薯粉、水和α-淀粉酶为原料，木薯粉与水的质量比为1:3，α-淀粉酶用量为15U/g，pH在6.0，液化温度在85℃，充分搅拌并保温120min，控制DE值在20％；
然后添加硫酸铵添0.3g/L、硫酸镁0.05g/L、磷酸二氢钾0.15g/L,制得发酵液化醪液。
(2)糖化酶与酵母固定细胞的制备：
海藻酸钠粘度在1.05Pa·S～1.15Pa·S，聚氧化乙烯分子量在30万以上。3％海藻酸钠和0.3％聚氧化乙烯混合制备成凝胶；
然后将20U/g的液体糖化酶与4g/L超级酿酒高活性干酵母添加到凝胶液中，混合均匀后用注射器逐滴滴加到5％的氯化钙溶液中，形成粒径在4mm的小球；
在4℃下平衡反应静置过夜后备用。
(3)发酵：
将步骤(2)添加到液化醪液中，pH在4.5，控制发酵温度在38℃，控制固定细胞的填充率在50％，搅拌转数150rpm/min，发酵时间40h，终发酵浓醪液乙醇质量浓度达到15％。
实施例4：
(1)木薯粉发酵液化醪液的制备：
以木薯粉、水和α-淀粉酶为原料，木薯粉与水的质量比为1:3，α-淀粉酶用量为13U/g，pH在6.0，液化温度在83℃，充分搅拌并保温100min，控制DE值在20％；
然后添加硫酸铵0.3g/L、硫酸镁0.05g/L、磷酸二氢钾0.15g/L,制得发酵液化醪液。
(2)糖化酶与酵母固定细胞的制备：
海藻酸钠粘度在1.05Pa·S～1.15Pa·S，聚氧化乙烯分子量在30万以上。2.5％海藻酸钠和0.5％聚氧化乙烯混合制备成凝胶；
然后将20U/g的液体糖化酶与5g/L超级酿酒高活性干酵母添加到凝胶液中，混合均匀后用注射器逐滴滴加到3％的氯化钙溶液中，形成粒径在4mm的小球；
在5℃下平衡反应静置过夜后备用。
(3)发酵：
将步骤(2)添加到液化醪液中，pH在4.5，控制发酵温度在40℃，控制固定细胞的填充率在50％，搅拌转数150rpm/min，发酵时间40h，终发酵浓醪液乙醇质量浓度达到15％。
实施例5：
(1)木薯粉发酵液化醪液的制备：
以木薯粉、水和α-淀粉酶为原料，木薯粉与水的质量比为1:3，α-淀粉酶用量为8U/g，pH在5.8，液化温度在83℃，充分搅拌并保温100min，控制DE值在19％；
然后添加硫酸铵0.3g/L、硫酸镁0.05g/L、磷酸二氢钾0.15g/L,制得发酵液化醪液。
(2)糖化酶与酵母固定细胞的制备：
海藻酸钠粘度在1.05Pa·S～1.15Pa·S，聚氧化乙烯分子量在30万以上。2.5％海藻酸钠和0.5％聚氧化乙烯混合制备成凝胶；
然后将15U/g的液体糖化酶与4g/L超级酿酒高活性干酵母添加到凝胶液中，混合均匀后用注射器逐滴滴加到3％的氯化钙溶液中，形成粒径在4mm的小球；
在5℃下平衡反应静置过夜后备用。
(3)发酵：
将步骤(2)添加到液化醪液中，pH在4.3，控制发酵温度在40℃，控制固定细胞的填充率在55％，搅拌转数150rpm/min，发酵时间40h，终发酵浓醪液乙醇质量浓度达到14％。
本发明适用于制备固定化细胞或固定化酶，采用该法制备的固定化细胞或酶可用于化工、生物、医学等领域，进行发酵、细胞与酶的增值、核酸提纯和DNA分离等。
本发明可应用到淀粉质原料发酵生产乙醇的工业化上，固定化细胞发酵技术有许多突出优点：由于大大增加了细胞浓度,增强了菌体对外部条件温度和酸碱度抵抗能力；缩短了发酵周期，提高反应器单位体积生物转化速率；而且由于细胞被固定，减少了细胞流失,细胞可长时间反复使用，并为产物分离等发酵连续化和规模化提供了方便。
上所述实施例仅是为说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所做出的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
Claims (10)
1.一种固定化糖化酶及酵母同步糖化发酵木薯生产乙醇的方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：
(1)发酵液化醪液的制备：以木薯粉、水和α-淀粉酶为原料，液化温度为80℃～90℃，充分搅拌并保温60min～160min，控制DE值在16％～22％，然后添加硫酸铵0.25g/L～0.35g/L、硫酸镁0.045g/L～0.055g/L、磷酸二氢钾0.145g/L～0.155g/L，制得发酵液化醪液；
(2)糖化酶与酵母固定细胞的制备：将质量浓度为2％～3％海藻酸钠和0.1％～0.5％聚氧化乙烯混合制备成凝胶，然后将15U/g～25U/g的液体糖化酶与4g/L～5g/L超级酿酒高活性干酵母添加制备好的凝胶液中混合，混合均匀后用注射器逐滴滴加到2％～5％的氯化钙溶液中，形成粒径3mm～5mm的小球，在3℃～5℃下平衡反应静置过夜后备用；
(3)将步骤(2)中制备的糖化酶与酵母固定细胞添加到液化醪液中，pH控制在4.0～5.0，发酵温度在35℃～40℃，固定细胞的填充率在45％～55％之间,搅拌转数150rpm/min，发酵时间40h，发酵终止时，发酵浓醪液乙醇质量浓度达到13％～15％。
2.根据权利要求1所述一种固定化糖化酶及酵母同步糖化发酵木薯生产乙醇的方法，其特征在于木薯粉与水的质量比为1:3。
3.根据权利要求1所述一种固定化糖化酶及酵母同步糖化发酵木薯生产乙醇的方法，其特征在于：所述的α-淀粉酶添加量为5U/g～15U/g。
4.根据权利要求1所述一种固定化糖化酶及酵母同步糖化发酵木薯生产乙醇的方法，其特征在于：所述的液化温度优选为85℃。
5.根据权利要求1所述一种固定化糖化酶及酵母同步糖化发酵木薯生产乙醇的方法，其特征在于：所述的保温的优选时间为120min。
6.根据权利要求1所述一种固定化糖化酶及酵母同步糖化发酵木薯生产乙醇的方法，其特征在于：所述的优选DE值控制在20％。
7.根据权利要求1所述一种固定化糖化酶及酵母同步糖化发酵木薯生产乙醇的方法，其特征在于：所述的液体糖化酶的用量优选为15U/g。
8.根据权利要求1所述一种固定化糖化酶及酵母同步糖化发酵木薯生产乙醇的方法，其特征在于：所述的优选的pH值为4.5。
9.根据权利要求1所述一种固定化糖化酶及酵母同步糖化发酵木薯生产乙醇的方法，其特征在于：所述的海藻酸钠粘度在1.05Pa·S～1.15Pa·S。
10.根据权利要求1所述一种固定化糖化酶及酵母同步糖化发酵木薯生产乙醇的方法，其特征在于：所述的聚氧化乙烯分子量在30万以上。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20160608 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |