CN110157603A - 一种固定化黑曲霉产柠檬酸的发酵反应器及其方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种固定化黑曲霉产柠檬酸的发酵反应器及其方法，包括发酵罐，发酵罐中部设有载体框，载体框内填充有固定化载体；载体框中部纵向贯穿有一圆筒，圆筒上端内部设有推进式桨叶，圆筒下方依次设有涡轮桨叶和平式桨叶，涡轮桨叶和平式桨叶位于载体框的下方；推进式桨叶、涡轮桨叶和平式桨叶自上而下分布在同一转轴上，转轴顶部与发酵罐上方的电机连接，由电机驱动推进式桨叶、涡轮桨叶和平式桨叶同时转动；发酵罐底部设有气体分布器，气体分布器位于平式桨叶的下方。本发明发酵稳定性好，可以重复多批次发酵而产量保持稳定产酸水平没有降低，最终柠檬酸产量可达180g/L以上，发酵速率达3.1g/L/h以上，糖酸转化率97％以上。
Description
技术领域
本发明属于工业生物技术领域，具体涉及一种固定化黑曲霉产柠檬酸的发酵反应器及其方法。
背景技术
柠檬酸作为全世界需求量最大的有机酸之一，被广泛用于食品、化工、医药等行业。目前，我国柠檬酸年产量200多万吨，占世界总量80％以上，是世界第一的柠檬酸生产和出口国。传统柠檬酸行业存在种子制备耗时、生产效率低下等问题，严重制约行业发展。
黑曲霉表面固定化连续发酵体系可以解决副产物多、耐受性差、转化率低等问题，但是黑曲霉与介质之间的界面作用机制，以及调控过程仍不明了，严重制约了表面固定化发酵体系的建立与应用推广。在固定化细胞发酵模式下，选择适宜的固定化载体是能否实现工业化的关键。另外，现有固定化工艺中，载体制备工艺较复杂、载体回收损失较大、载体重复使用次数有限、一些载体的使用不利于发酵后期产物的分离纯化，因而难以在工业规模上生产扩大。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种固定化黑曲霉产柠檬酸的发酵反应器，以提高发酵过程的稳定性和发酵柠檬酸产量。
为了解决上述技术问题，本发明采取的技术方案如下：
一种固定化黑曲霉产柠檬酸的发酵反应器，包括发酵罐，所述发酵罐中部设有载体框，所述载体框内填充有固定化载体；载体框中部纵向贯穿有一圆筒，所述圆筒上端内部设有推进式桨叶，圆筒下方依次设有涡轮桨叶和平式桨叶，所述涡轮桨叶和平式桨叶位于载体框的下方；推进式桨叶、涡轮桨叶和平式桨叶自上而下分布在同一转轴上，所述转轴顶部与发酵罐上方的电机连接，由电机驱动推进式桨叶、涡轮桨叶和平式桨叶同时转动；所述发酵罐底部设有气体分布器，所述气体分布器位于平式桨叶的下方。
优选地，所述载体框的上下为中空的多孔圆盘，其外径与发酵罐内经相等；所述圆筒直径为发酵罐内经1/4～1/2。
优选地，所述推进式桨叶直径为圆筒内径的0.6～0.9倍；所述涡轮桨叶为具有上下圆盘的后弯叶涡轮式桨叶，其上圆盘为圆锥式，下圆盘为平面式，直径为发酵罐内经的0.4～0.7倍；所述平式桨叶为平直涡轮桨叶，直径为发酵罐内经的0.1～0.4倍。
优选地，所述气体分布器为盘管式或者立柱式，位于平式桨叶的下方，其外周直径为平式桨叶直径的0.8～1.1倍。
具体地，所述固定化载体为边长1～5cm的正方体，或边长1～6cm、厚度为1-3cm的长方体；其材质为多孔聚氨酯、多孔活性炭、活性炭过滤棉、聚醚多元醇泡沫、冻干处理的多孔细菌纤维素、蜂孔纤维棉中的任意一种。
本发明进一步提供上述发酵反应器固定化黑曲霉产柠檬酸的方法，具体包括如下步骤：
(1)孢子制备：接种环在平板或斜面上刮5-6环黑曲霉至麸曲瓶中，温度36度、湿度60％光照培养5-8天；
(2)黑曲霉固定培养，采用以下任意一种方法：
其一，扩培式发酵固定：孢子量按0.1-0.4g/L接入装有种子培养基的种子罐，35-38℃、转速400-600r/min、通气量300-600L/h，培养24-28小时，形成大小均一的菌丝球，且酸度值达1-1.8；然后按10-20wt％接入装有发酵培养基的发酵反应器中，进行固定化培养，培养条件为35-38℃，转速450-600r/min，通气量1800-2500L/h，压力0.05-0.12Mpa，待还原糖降低至1g/L以下排料；
其二，孢子直接固定培养：称取0.1-0.4g/L孢子，直接接入装有种子培养基的发酵反应器中，按种子培养条件进行固定化培养，待还原糖降至1g/L以下，结束固定化培养；
(3)柠檬酸发酵，采用间歇式发酵或者补料式发酵：
间歇式发酵过程为：固定化培养结束后补加新的发酵培养基，培养条件为36-38℃，转速400-600r/min，通气量1500-2300L/h，压力0.05-0.12Mpa，待还原糖降到1g/L以下结束发酵；
补料式发酵过程为：待发酵pH降到1.6-2.2，将所得到30-60wt％发酵液泵入另外的发酵罐进行后发酵，并流加等同体积的新发酵培养基。
具体地，步骤(2)中，所述种子培养基和发酵培养基为玉米液化液、木薯液化液、糖蜜、合成培养基中的一种或者几种的组合，装填量为50-75vt％；种子培养基初始总糖80-150g/L，总氮1-5g/L；所述发酵培养基初始总糖150-190g/L，总氮0.5-4g/L。
优选地，所述玉米液化液和木薯液化液制备方法为：料水比1:4-1:1.2，pH5.5-6，液化酶(α淀粉液化酶)添加量15-20U/g干物质，80-95℃水解1.5-2.5小时。
具体地，步骤(3)中，所述间歇式发酵过程中，补加新的发酵培养基量为30-60vt％。
有益效果：
1、本发明所采用的固定化材料为化学惰性，对细胞没有毒害作用；机械强度高，也不会被细胞代谢分解；黑曲霉不会在载体表面过度生长，而是均匀分布在载体表面。
2、本发明选用的多孔材料具有较高的孔隙率和比表面积，吸附效果好，保证了高密度发酵的优势，发酵周期缩短；而且具有良好的传质传热性能。
3、与游离发酵相比，固定化发酵液中的菌体量明显减少，有利于后期的产物和菌体的分离。用于菌体生长的碳源消耗更少，残总糖消耗较为彻底，故固定化发酵柠檬酸产量明显提高，糖酸转化率较高。
4、本发明发酵稳定性好，可以重复多批次发酵而产量保持稳定产酸水平没有降低。最终柠檬酸产量可达180g/L以上,发酵速率达3.1g/L/h以上，糖酸转化率(柠檬酸产量/葡萄糖消耗)97％(w/w)以上。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。
图1为本发明发酵反应器的结构示意图。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。
说明书附图所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容所能涵盖的范围内。同时，本说明书中所引用的如“上”、“下”、“前”、“后”、“中间”等用语，亦仅为便于叙述的明了，而非用以限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容下，当亦视为本发明可实施的范畴。
如图1所示，该固定化黑曲霉产柠檬酸的发酵反应器(50L罐)包括发酵罐1，发酵罐1中部设有载体框2，所述载体框2内填充有固定化载体3；载体框2中部纵向贯穿有一圆筒4，所述圆筒4上端内部设有推进式桨叶5，圆筒4下方依次设有涡轮桨叶6和平式桨叶7，所述涡轮桨叶6和平式桨叶7位于载体框2的下方；推进式桨叶5、涡轮桨叶6和平式桨叶7自上而下分布在同一转轴8上，所述转轴8顶部与发酵罐1上方的电机9连接，由电机驱动推进式桨叶、涡轮桨叶和平式桨叶同时转动；所述发酵罐1底部设有气体分布器10，所述气体分布器10位于平式桨叶7的下方。
载体框的上下为中空的多孔圆盘，其外径与发酵罐内经(30cm)相等；圆筒直径为发酵罐内经1/4。推进式桨叶直径为圆筒内径的0.8倍；所述涡轮桨叶为具有上下圆盘的后弯叶涡轮式桨叶，其上圆盘为圆锥式，与垂直方向的角度为80°；下圆盘为平面式，直径为发酵罐内经的0.5倍；所述平式桨叶为平直涡轮桨叶，直径为发酵罐内经的0.2倍。气体分布器为盘管式，位于平式桨叶的下方，其外周直径为平式桨叶直径的1.1倍。
加水至载体框之上，转速450r/min、通气量2000L/h。可明显观察到发酵罐内水体流动情况。气体从分布器出来后，经过最下层平式桨叶的作用被打成细小气泡，并被其上的圆盘涡轮桨叶甩至发酵罐周围，从载体框下端进入载体框内，使得固定化载体呈悬浮状态，此方式对固定化载体密度没有严格要求，应用范围较广。流体随后从载体框上端出来，在最上层推进式桨叶作用下，被吸进载体框中部的圆筒内，并从圆筒底部出来，从而形成明显的内循环流体状态。下端圆盘涡轮式桨叶上侧设计成略倾斜式，有利于避免带渣物料囤积，降低染菌风险。
本发明所述方法可以适用所有黑曲霉菌株，以下实施例中使用的生产柠檬酸的菌株为黑曲霉ATCC12846。
实施例1黑曲霉孢子扩陪后固定化培养、发酵
液化制糖：11kg玉米粉加33升水调浆，pH在5.8-6.0，加液化酶16U/g玉米粉，65℃液化45分钟，升温至95℃液化45min，DE达到25％。留8L带渣的回料备用，剩余液化醪进行离心处理，清液备用。
种子制备：用带渣回料制备种子液5L(采用10L种子罐，T&J-Btype×2，迪必尔生物工程(上海)有限公司)，总糖120g/L，接种孢子1g，通气量400L/h，转速500r/min、温度36℃培养至26小时左右，pH在2.5以下，酸度1.5-2.0，菌球均一。
固定化培养与发酵：种子培养结束后按12％接种量接入装有33L发酵培养基的固定化发酵罐中(固定化载体为多孔聚氨酯)，其中发酵培养基包括4L回料和23L清液，且混合液加了糖化酶(100U/玉米粉)在62℃下糖化了2小时，并115℃实消15分钟备用，初始总糖160g/L。培养条件：温度37℃、转速450r/min、通气量2100L/h。发酵至还原糖降到1g/L以下排出发酵液，重新补加新的发酵培养基。连续运行5批，平均柠檬酸产量为160.7g/L，平均发酵时间为50小时，明显低于游离发酵(58小时)；平均糖酸转化率(质量比，下同)提高了3.2个百分点。
实施例2黑曲霉孢子扩培后进行固定化培养、发酵
将培养好的孢子按0.2g/L接入装有发酵培养基的固定化发酵罐中(固定化载体为多孔聚氨酯)，第1批等同于固定培养过程，发酵培养基制备和培养条件同实施例1，发酵至还原糖降到1g/L以下排出发酵液，重新补加新的发酵培养基。连续运行12批，平均发酵时间为46小时，平均糖酸转化率达95.5％。
实施例3不同载体尺寸对固定和发酵的影响
将培养好的孢子按0.2g/L接入装有发酵培养基的固定化发酵罐中(载体为活性炭过滤棉)，考察不同尺寸(1cm×1cm×1cm，2cm×2cm×1cm，2.5cm×2.5cm×2.5cm)对黑曲霉固定和发酵影响，各发酵3批(第1批等同于固定培养过程，不计入发酵批次)，发酵培养基与培养条件同实施例1。结果表明第2种发酵效果最佳，产酸率分别3.16g/L/h、3.33g/L/h、2.85g/L/h。
实施例4补料式发酵
将培养好的孢子按0.3g/L接入装有发酵培养基的固定化发酵罐中，载体同实施例3(活性炭过滤棉，尺寸2cm×2cm×1cm)，发酵培养基与培养条件同实施例1。待发酵pH降到1.9时，将40wt％发酵液泵入另外发酵罐进行后发酵，并流加等同体积的新发酵培养基。运行20批，固定化发酵罐平均产酸率为3.47g/L/h，转化率可达97.1％。
实施例5以糖蜜为发酵培养基进行固定化发酵
将培养好的孢子按0.22g/L接入装有发酵培养基的固定化发酵罐中(载体为蜂孔棉纤维)，发酵培养基为甜菜糖蜜，总糖为150.6g/L，另加0.8g/L的尿素。培养条件同实施例1。发酵10批，平均发酵周期为45小时，柠檬酸产量为151.2g/L，转化率93.9％。
本发明提供了一种固定化黑曲霉产柠檬酸的发酵反应器及其方法的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。
Claims (9)
1.一种固定化黑曲霉产柠檬酸的发酵反应器，包括发酵罐(1)，其特征在于，所述发酵罐(1)中部设有载体框(2)，所述载体框(2)内填充有固定化载体(3)；载体框(2)中部纵向贯穿有一圆筒(4)，所述圆筒(4)上端内部设有推进式桨叶(5)，圆筒(4)下方依次设有涡轮桨叶(6)和平式桨叶(7)，所述涡轮桨叶(6)和平式桨叶(7)位于载体框(2)的下方；推进式桨叶(5)、涡轮桨叶(6)和平式桨叶(7)自上而下分布在同一转轴(8)上，所述转轴(8)顶部与发酵罐(1)上方的电机(9)连接；所述发酵罐(1)底部设有气体分布器(10)，所述气体分布器(10)位于平式桨叶(7)的下方。
2.根据权利要求1所述的发酵反应器，其特征在于，所述载体框(2)的上下为中空的多孔圆盘，其外径与发酵罐(1)内经相等；所述圆筒(4)直径为发酵罐(1)内经1/4～1/2。
3.根据权利要求2所述的发酵反应器，其特征在于，所述推进式桨叶(5)直径为圆筒(4)内径的0.6～0.9倍；所述涡轮桨叶(6)为具有上下圆盘的后弯叶涡轮式桨叶，其上圆盘为圆锥式，下圆盘为平面式，直径为发酵罐(1)内经的0.4～0.7倍；所述平式桨叶(7)为平直涡轮桨叶，直径为发酵罐(1)内经的0.1～0.4倍。
4.根据权利要求3所述的发酵反应器，其特征在于，所述气体分布器(10)为盘管式或者立柱式，位于平式桨叶(7)的下方，其外周直径为平式桨叶(7)直径的0.8～1.1倍。
5.根据权利要求1所述的发酵反应器，其特征在于，所述固定化载体(3)为边长1～5cm的正方体，或边长1～6cm、厚度为1-3cm的长方体；其材质为多孔聚氨酯、多孔活性炭、活性炭过滤棉、聚醚多元醇泡沫、冻干处理的多孔细菌纤维素、蜂孔纤维棉中的任意一种。
6.权利要求1所述发酵反应器固定化黑曲霉产柠檬酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)孢子制备：接种环在平板或斜面上刮5-6环黑曲霉至麸曲瓶中，温度36度、湿度60％光照培养5-8天；
(2)黑曲霉固定培养，采用以下任意一种方法：
其一，扩培式发酵固定：孢子量按0.1-0.4g/L接入装有种子培养基的种子罐，35-38℃、转速400-600r/min、通气量300-600L/h，培养24-28小时，形成大小均一的菌丝球，且酸度值达1-1.8；然后按10-20wt％接入装有发酵培养基的发酵反应器中，进行固定化培养，培养条件为35-38℃，转速450-600r/min，通气量1800-2500L/h，压力0.05-0.12Mpa，待还原糖降低至1g/L以下排料；
其二，孢子直接固定培养：称取0.1-0.4g/L孢子，直接接入装有种子培养基的发酵反应器中，按种子培养条件进行固定化培养，待还原糖降至1g/L以下，结束固定化培养；
(3)柠檬酸发酵，采用间歇式发酵或者补料式发酵：
间歇式发酵过程为：固定化培养结束后补加新的发酵培养基，培养条件为36-38℃，转速400-600r/min，通气量1500-2300L/h，压力0.05-0.12Mpa，待还原糖降到1g/L以下结束发酵；
补料式发酵过程为：待发酵pH降到1.6-2.2，将所得到30-60wt％发酵液泵入另外发酵罐进行后发酵，并流加等同体积的新发酵培养基。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述种子培养基和发酵培养基为玉米液化液、木薯液化液、糖蜜、合成培养基中的一种或者几种的组合，装填量为50-75vt％；种子培养基初始总糖80-150g/L，总氮1-5g/L；所述发酵培养基初始总糖150-190g/L，总氮0.5-4g/L。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述玉米液化液和木薯液化液制备方法为：料水比1:4-1:1.2，pH5.5-6，液化酶添加量15-20U/g干物质，80-95℃水解1.5-2.5小时。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述间歇式发酵过程中，补加新的发酵培养基量为30-60vt％。
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