CN101426472A

CN101426472A - 固定化酶或固定在聚乙烯醇凝胶中的微生物形式的生物催化剂的工业生产方法、用途及其生产装置

Info

Publication number: CN101426472A
Application number: CN200780009339.6A
Authority: CN
Inventors: R·斯鲁卡尔; M·罗森伯格; M·瑞布罗斯
Original assignee: Lentikats AS
Current assignee: Aoyuan Tyco Environmental Protection Technology Beijing Co ltd
Priority date: 2006-03-13
Filing date: 2007-03-06
Publication date: 2009-05-06
Anticipated expiration: 2027-03-06
Also published as: CN101426472B; CZ17631U1

Abstract

含有生物活性材料的固定化酶或固定在聚乙烯醇凝胶中的微生物形式的生物催化剂的工业生产方法及所述生物催化剂的应用，其中，所述由游离的天然或经预处理的(聚合的)酶催化剂或产酶微生物或其部分以及聚乙烯醇凝胶的混合物所形成的生物活性材料被用于其工业生产，根据生物活性材料的范围，所述混合物在80℃至15℃之间在干燥空气流中凝胶化并成型，其中所述生物催化剂的表面积与体积的几何比保持在7mm^－1以上，因而所制备的生物催化剂可以培养或保存并随后在一定条件下在生物技术过程中使用，从而确保所述生物技术过程具有更高产率、更高产量和酶稳定性、长期并反复使用或随后易于分离所述生物催化剂的明确的过程控制一种工业生产装置，该装置能根据生物活性材料范围提供最优化生物载体体积和表面积，其包括置于连续传送带(1)运行经过的干燥通道(2)之前的浇铸装置(17)，所述装置配备有至少一个具有与压力推动罐(15)和压缩机(16)相连的两排浇铸针的浇铸头(17)、传送带(1)和作为干燥空气源(4)的干燥系统，干燥空气通过通风设备导入与加热元件(5)整合的空气分配系统(6)，进入上部干燥通道(2)，并随后进入下部干燥通道(3)和重胀罐(7)，两者间装有基于机械擦拭和高压冲洗而设计的擦拭和收集装置(9)，其与具有一体化的高压泵(10)和低压泵(11)并进入带有冷却的收集池(8)的管道相连，两者之间还有另一个冲洗箱(13)，通过与低压泵(14)相连的喷嘴对连续传送带(1)进行最后清洗，该低压泵通过管道与冲洗罐(12)相连。

Description

固定化酶或固定在聚乙烯醇凝胶中的微生物形式的生物催化剂的工业生产方法、用途及其生产装置

发明领域

本发明涉及用于固定化酶或固定在聚乙烯醇凝胶中的微生物形式的具有生物活性材料的生物催化剂的工业生产的方法，以及所述生物催化剂的使用和一种工业生产装置，该装置能够根据生物活性材料的范围将生物载体的体积和面积加以最优化，该包括置于干燥管道前的浇铸装置，连续传送带运行经过所述干燥管道。

发明背景

使用聚乙烯醇载体或聚亚安酯载体包埋细菌是本领域内已知的。CZ专利249 179中公开了用置于聚乙烯醇凝胶(下文中用PVA凝胶表示)中的微生物、酶、孢子和、或细胞形式的生物活性材料生产生物催化剂的方法。PVA凝胶作为生物活性材料的凝胶载体非常适用于化学或生物催化剂的生产。按照这一方法生产的胶体与以前已知的胶体相比具有更高的机械稳定性，尤其是在抗磨损性和抗张强度方面。由于上面提到的改善的机械性质，可以生产易反应且动力学适当的透镜状胶体。因此与此前已知胶体相比，生产的所述胶体即便在高速旋转震荡条件下在几个月内是牢固并抗磨损的。由于具有大直径和低高度特点的透镜形状，物理、化学或生物活性材料总是位于紧邻表面下的位置，这赋予其易反应性和有益的动力学排列。采用PVA凝胶作为生物活性材料载体的生物技术工艺是本领域内已知的。

在从废水中除氮的工艺中使用上述载体是已知的。这样的应用在例如EP0758680(多孔纤维素衍生物)、WO09508513(聚乙烯醇、蛭石、聚亚胺酯)和CN1076488(聚乙烯醇)中有所描述。所提及的载体通常用于通过各种方法先期富集(尤其是硝化细菌)的加菌淤泥的固定化，但也直接用于纯化的硝化细菌或脱硝细菌的固定化。如文献所述，对于载体而言，一个非常重要的特征是其比表面积与反应器体积(或更精确地说是目前处理的废水体积)的比值范围。这就是说，这一参数与反应器尺寸和反应器中废水保留时间直接相关，因为它尤其受到置于反应器中的具有特定具体表面积的载体的量(或更精确地说是重量或体积)的影响。例如，采用固定在具有几何维度S/V为3和2的片状聚乙二醇(PEG)载体中的细菌进行氮污染去除工艺，使用载体中含有2％湿生物量加菌淤泥可以实现每天0.34-1.14kg/m³的氮去除率(T.Sumino，H.Nakamura，N.Mori，Y.Kawaguchi：Immobilization of Nitrifying Bacteria by Polyethylene GlycolPrepolymer(通过聚乙烯醇预聚物固定硝化细菌)，Journal of Fermentation andBioengineering，73(1)，37-42，1992)。

然而，载体比(几何)表面积相对于其体积(或更精确地说相对于其形状和度量)的范围是同质参数，尤其是考虑到经济原因。形状接近于球形或圆柱形、其底部直径(d)和高度(h)数值近似的载体仍被用于通过固定化细胞从污水中去除氮。用于从废水中除氮的载体度量的最小值为1mm。所述载体通常使用度量为3mm，这意味着载体表面积与体积之比的值约为2mm^-1到6mm^-1。如果使用透镜状或带状载体，即便是在相同或更高的工艺强度下，与目前使用固定化细胞从饮用水、工业和生活废水中去除氮化合物的工艺相比，可以使用更少的生物催化剂。

生物技术工艺中凝胶载体的另一种应用是用于乳酸生产。与其他酸一起，乳酸广泛应用于食品、制药和化学工业。许多微生物产乳酸，但主要由丝状真菌和细菌生产。在丝状真菌中，少根根霉(Rhizopus arrhizus)或曲霉(oryzae)是良好的产乳酸菌。与细菌相比，其突出的优点是它只产L(+)乳酸。然而，其发酵方式是需氧的(要求制备大量无菌空气)。丝状真菌的好氧模式在直接制备乳酸钙盐的情况下可能是有益的，在此过程中，碳酸钙中和不足(微弱震荡)会导致发酵延长和产量降低(Mattey M.：Critical Reviews in Biotechnology 12，87-132，1992)。

细菌发酵的优点在于其厌氧模式，因此要求简单的培养设备和较低的无菌要求。在工业生产中主要使用乳酸杆菌(Lactobacillus)属的细菌，根据产酸菌的性质，它们在30℃至40℃将蔗糖底物(葡萄糖、蔗糖、乳糖)转化成不同L(+)-、D(-)-和DL酸含量的乳酸。

通过包埋在凝胶载体中的微生物固定化是一种在反应器中浓缩生物质而避免发酵培养基中生物质生长的方法。这一方法包括将细胞包埋在天然或合成凝胶的囊中。细胞必须大于载体的空隙从而避免细胞的释放，同时保证底物和产物向所包埋细胞的自由扩散。

乳酸菌在不同载体中的固定化是目前已知的。最主要的是天然凝胶角叉胶、果胶、藻酸胶(Norton，S.等：Enzyme Microbial Technol 16，457-466，1994；Richter，K.等：Acta Biotechnol.11，229-341，1991；Yan，J.等：Chem.Biochem.Eng.Q.15(2)，59-63，2001)和聚丙烯酰胺合成载体(Tuli，A.等：Enzyme MicrobialTechnol.7，164-168，1985)。固定化物通常通过将相关凝胶滴入硬化溶液产生直径3mm至5mm的小球。然而，这一方法的缺点在于固定化物的球形形状导致球体内部的扩散限制。整个凝胶体积未加利用从而导致微生物仅在紧邻球体的表面下生长。

固定化的另一种合适的方法是将乳酸菌包埋在聚乙烯醇凝胶中。这与其他载体相比具有许多优点。首先它便宜、对于微生物而言无毒、难以生物降解、具有优秀的物理机械性质、对微生物无副作用并具有长期稳定性(德国专利19827 552.8)。此外，采用按照上述发明所述方法的细胞固定化适用于多产微生物(确保固定化后微生物的高生存力和固定化步骤后高比例的存活微生物)，因为基质的交联在干燥空气流中发生并以此取代了目前所用步骤中通过冷冻(德国专利43 27 923)或在含硼酸的体系中硬化(美国专利5 290 693)进行交联。此外，固定化物的透镜状形状保证了用于微生物生长和乳酸生产的载体的整个体积的最佳载量。通过这一方法制备的固定化物可以在批次、半连续和连续发酵操作模式中重复使用。

通常已知，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或其他在发酵过程中能将葡萄糖和其他糖类转化成乙醇的酵母通常用于乙醇的生产。这一发酵是啤酒和葡萄酒生产的基础，也是出于工业化、食品和燃料目的的乙醇生产的基础。最近，对使用细菌作为乙醇生产者的技术的兴趣正不断增长。运动发酵单孢菌(Zymomonas mobilis)是一种产乙醇菌。它是一种革兰氏阴性的兼性厌氧微生物。与酵母相比具有多个有点：生物质的更快生长(但通常生物质产量较低)、更高的底物利用和产物生成速率，它不需要监控的供氧并产生较少的副代谢物。它通过通常发生在厌氧微生物中的Entner-Doudoroff途径代谢葡萄糖和果糖。在这一代谢途径中，1摩尔葡萄糖转化成2摩尔乙醇、2摩尔CO₂和1摩尔ATP。这一代谢途径将变为生物质的葡萄糖量最小化并由此提高乙醇产量。使用细菌的实际得率(克乙醇/克葡萄糖)提高到0.49，使用酵母时该值通常为0.44。

可以在批次、半连续以及连续操作模式中使用游离的运动发酵单孢菌(Zymomonas mobilis)进行发酵(Rogers P.L.，Tribe D.E.：美国专利4403034；Rogers P.L等，美国专利4443543；Salzbrunn W.等，美国专利4876196；Bu’lockJ.D.，英国专利2075053)。

到目前为止，研究兴趣已经集中在通过各种创新(例如细胞重复利用、使用絮凝化微生物等等)以提高微生物的产率以及改进发酵设备的安置上(ArcuriE.J.等，美国专利4413058；Rogers P.L等，美国专利4443544)。

发酵产物(乙醇)在液体培养基中积累并几乎完全通过蒸馏加以分离。在产物分离过程中希望通过沉淀、离心、过滤等步骤显著降低生物质含量，这与所使用的装置与技术无关。增加的不溶物质含量提高了蒸馏能量要求，引起技术问题(蒸馏装置结垢、产生泡沫等等)、增加了维护要求并也可能影响产品质量。另一方面，必须实现乙醇生产的效率最大化。乙醇产率直接与发酵罐中的生物质的量成正比。这意味着在恒定的条件下，生物质含量的提高导致生产确定量的乙醇所需的时间缩短。能够保证反应器中生物质浓度而避免在整个发酵培养基中生物质生长的方法之一是通过在凝胶载体中包埋的微生物固定化。这一方法基于将细胞包埋在天然或合成凝胶囊中。细胞大小必须大于载体孔隙的大小从而避免细胞释放，但同时保证底物和产物向被包埋细胞的自由扩散。

在各种载体中固定化发酵单胞菌属细菌是目前已知的。最重要的是天然凝胶的角叉胶和藻酸胶(Cheetham P.S.J.，美国专利4393136；Chibata I.，美国专利4350765；Kikuta M.，美国专利5990191；Yamada T.等，美国专利4680263)以及合成载体聚丙烯酰胺(Yamada T.等，美国专利4680263；Cheetham P.S.J.，美国专利4393136)。固定化物通常是直径为3mm至5mm的球形，通过将相关凝胶滴入硬化溶液进行生产。然而，这种方法的缺点在于球形的固定化物引起球体内部扩散的限制。不是整个凝胶体积用于负载细胞，微生物仅在紧邻球形载体的表面下生长，没有装满整个载体体积。

将运动发酵单孢菌(Zymomonas mobilis)包埋入聚乙烯醇凝胶是一种合适的固定化方法。它与其他载体相比具有许多优点。首先，它便宜、对微生物无毒性、难以生物降解、具有优秀的物理机械性质、对微生物无副作用并表现出长期稳定性(德国专利198 27 552.8)。此外，采用按照上述发明所述方法的细胞固定化适用于多产微生物(确保固定化后微生物的高生存力和固定化步骤后高比例的存活微生物)，因为基质的交联在干燥空气流中发生并以此取代了目前所用步骤中通过冷冻(德国专利43 27 923)或在含硼酸的体系中硬化(美国专利5290 693)进行交联。此外，固定化物的透镜形状保证了用于微生物生长和乙醇生产的载体整个体积的最佳利用。通过这一方法制备的固定化物可以在批次、半连续和连续发酵模式中反复使用。

使用球形固定化物时，使用在角叉胶中固定化的运动发酵单孢菌(Zymomonas mobilis)的乙醇产量为77mg_乙醇/ml_凝胶/小时，其中使用了10重量％的葡萄糖培养基，含20ml直径为4mm的固定化物的500ml批次反应器，温度为30℃(Chibata I.，美国专利4350765)。在生产菌固定化在藻酸钠中，其中固定化物含重量体积比为20％的湿细胞重量(湿细胞重量对应于1/5干细胞重量)的情况下，相同条件下在批次体系中的产率是0.49g_乙醇/g_{湿细胞重量}/小时，重新计算后该值对应于98mg_乙醇/ml_凝胶/小时，在连续模式中为0.47g_乙醇/g_{湿细菌重量}/小时，重新计算后该值对应于94mg_乙醇/ml_凝胶/小时(Cheetham PS.J.，美国专利4393136)。

使用固定化的转化酶从蔗糖生产葡萄糖的方法是生物技术工程中凝胶载体的另一种应用。蔗糖是主要存在于甜菜和甘蔗中的一种存储二糖，应用于食品工业，也作为底物应用于发酵工艺。它由单糖葡萄糖和果糖组成。蔗糖通过水解(例如使用转化酶的酶水解)形成这些单糖。其应用产生葡萄糖和果糖的混合物(转化糖)，其与未水解的蔗糖相比具有许多优点：降低的晶体浊度、甜味增加以及在发酵过程中的可用性。

在工业实践中，将不可循环使用的转化酶的酶制剂用于蔗糖水解。这是这种酶成为葡萄糖-果糖糖浆生产中最大的经济支出之一的原因。该酶的适当的固定化方法能实现其多次使用，并因而可以使得整个生产过程连续化并因此显著提高其效率。交联是最常用的技术。所使用的最常见的交联剂是聚酰胺(SouM.等，JP58086085，Rohrbach R.P.等，US 426842)、戊二醛(Lee D.M等，US4749653)、具有未化合羧基团的聚合物(Mauz O.US 4767620)、具有环氧基团的聚合物(Mauz O.US 4931476)、固定化入光交联沥青(Kunihiro I.JP55023941)、以及通过交联剂插入各种机制，诸如通过戊二醛固定化在玻璃球上(Toshiyuki Y.等，JP58179494)。其他方法包括通过戊二醛将转化酶共价附着在硅胶颗粒上(Thibault P.A.EP 0231668)、通过二硫键在有机和无机载体上共价连接(CormierR.A.等，US 4176006)、通过有机硅共价连接(Ho G.H.等，US4384045)、通过二醛共价连接在纤维素和木质素材料上(Monsan P.US 4405715)以及共价连接在二烷氨基烷基纤维素上(Lapins Ch.D.等，US 4933284)。转化酶也通过吸附固定化，例如吸附在动物骨骼基质上(Findlay Ch.J.US 5037749)。另一种方法是将具有高转化酶活性的溶菌液包埋进藻酸胶(Obana H.等，JP 57163484，ChangH.N.等，US 5766907)或聚亚胺酯聚合物(Hartdegen F.J.等，US 4098645)。例如将酶吸附在聚乙烯亚胺处理的棉絮上并随后通过戊二醛交联的组合方法也具有实际应用(Yamazaki H.等，CA1203187)。

使用PVA看来是一种很好的选择。转化酶被成功地固定化入具有固体核心、包裹着PVA凝胶的载体中(Yamamoto H.和ko等，JP2005042037)。与聚乙二醇混合的光交联PVA也被用于共价结合以及转化酶包埋(Ichimura K.JP58152483，Suehiro T.等，JP 1252285，Izumida H.等，JP 1071491)。PVA基质也可以通过硼酸(凝胶中包埋转化酶)(Guocheng Ch.等，CN 1076488)或干燥交联(Ishimura F等.US 4727030)。也使用与交联(Tsutsumi S.等，JP 2046288)、添加乙酸乙烯(Moriya T.等，JP 56113290)、乙烯胺(Moriya T.等，JP 56113292)或甘氨酸化PVA(Yamauchi A.等，US 4307151)组合的其他方法。

通过固定化葡糖淀粉酶从淀粉生产葡萄糖的方法是生物技术过程中凝胶载体的另一种应用。淀粉作为植物的营养存储物质是食品工业和发酵工业中葡萄糖的主要来源。淀粉包括两种分子：直链淀粉和支链淀粉。例如在玉米中，直链淀粉占总淀粉的10％。它由1000个以内的葡萄糖单位构成，相互之间以α-1，4-糖苷键相连。其余90％为支链淀粉，其中除α-1，4-糖苷键外也包含α-1，6-糖苷键。侧链中的葡萄糖单位数可达1000。

为了用于发酵过程，淀粉原材料的预处理过程包括两个步骤。在第一步中，通过内酶α-淀粉酶(其在高温下随机解离α-1，4-糖苷键)将淀粉液化。这一反应形成糊精以及具有不同侧链长度的寡糖。

在第二步中，在外酶葡糖淀粉酶作用下糊精和寡糖从非还原末端解离成葡萄糖单位。葡糖淀粉酶解离α-1，4-和α-1，6-糖苷键。然而，水解α-1，6-糖苷键的速率低得多。水解速率也取决于侧链长度。

在工业实践中，每吨淀粉使用11到1.21不可重复使用的葡糖淀粉酶制剂。适当的该酶固定化方法可以使其多次使用，从而使整个过程连续化。通过与诸如聚胺(Symon等，U.S.4415663，Lantero等，U.S.5472861，DeFilippi U.S.4343901，Rohrbach等，U.S.4268423)、戊二醛(Lee等，U.S.4749653，Nishimura等，U.S.4888285，Rorvah等，K.R.8601229)、丙烯或酰基物质(Boross等，U.S.4794083，Selemenev等，RU 2204600)等物质交联将酶锚定在无机或有机载体上的该酶的固定化已经取得了显著提高。使用吸附方法(Abdullah等，U.S.4226937，Kumakura等，JP 61060700，Motai等，J.P59232092，Selemenev等，R.U.2181770，Kimura等，J.P.63056297)以及使用固定化葡糖淀粉酶的膜反应器(Thomas等，U.S.5130237)看来也是可行的。将生物材料包埋进凝胶结构并主要用于微生物固定化的包埋技术在葡糖淀粉酶固定化过程中还未应用。然而，没有交联进较大的结构中的话，酶易于从载体孔隙中被洗出。

使用固定化β-半乳糖苷酶的乳糖溶液水解以及从乳糖溶液生产D-半乳糖、D-葡萄糖和半乳寡糖的方法是生物技术过程中凝胶载体的另一种应用。

二糖乳糖是在大部分哺乳动物的乳腺中合成的。商业上通过从乳清中提取的方法从牛奶(乳糖含量4.5-5重量％)进行生产(Baldrick和Bamford，1997)。牛奶和奶制品中的乳糖是一种重要的营养指标。它支持双歧杆菌的生长，是产生半乳糖脂和半乳寡糖所需的半乳糖的来源，促进钙吸收等等(Maldonado等，1998)。它具有低溶解度并在浓度大于18重量％时结晶。这看来是一个问题，因为乳糖晶体在诸如炼乳和冰淇淋等奶制品生产中产生令人厌恶的沙粒样质地(Zadow，1992)。这是对于这些产品来说非常希望乳糖水解的原因。此外，乳糖水解也会引起干奶制品吸湿性显著降低、甜度增加以及美拉德反应的降低(

等，2001，Zadow，1992，Rosenberg等，1995)。

β-半乳糖苷酶不但在牛奶中的乳糖水解中意义重大，在乳清处理中也很重要。乳清作为乳品工业中一种副产品在奶酪、白软干酪和酪蛋白生产过程中大量产生。在奶酪生产中，全球每年产生1亿5千万吨以上的乳清(平均每公斤奶酪产生10升乳清)，并且全球奶酪生产正稳步增长。乳清还没有进行深加工，这是一个经济和生态问题(Novalin等，2005)。此外，其处理受到许多限制，不能不受约束地将其释放到环境中去。所产生的废产物的一半用于乳清蛋白浓缩物(WPC)的生产，但最要用于喂养家畜(Rudolfová和

，2005)。乳清也可以用作乙醇生产的原材料。考虑到这一点，它可能是未来发酵工艺中具有吸引力的底物(Coté等，2004)。例如，在乙醇生产过程中可以使用利用乳糖的克鲁维酵母(Kluyveromyces)。乳糖水解能够使用具有较高碳源浓度的稠化乳清作为底物并因而显著提高发酵产量(Rosenberg等，1995)。在有些情况下，可以以这样的方式进行发酵过程，即生产性微生物只利用所存在的葡萄糖，而对残留的半乳糖随后进行分离、纯化或化学修饰(Rosenberg，2000)。

β-半乳糖苷酶在食品工业中的另一种重要应用是生产半乳寡糖(GOS)。它们在乳糖水解过程中通过β-半乳糖苷酶的转糖苷活性同时生成。20世纪50年代首次描述了β-半乳糖苷酶的转糖苷活性(Aronson，1952)。最先出版的研究工作着重于GOS的有益的作用及其生产的最优化方法的研究(Mahoney，1998)。

GOS属于益生元，它们是不吸收的食物成分，能选择性地刺激人消化道中益生菌群的生长。由于其β构象，GOS对选择性水解β-糖苷键的唾液和消化液酶的水解具有抗性(Sako等，1999)。GOS进入大肠，在大肠中参与许多重要过程。双歧杆菌菌群将GOS代谢为短链脂肪酸(醋酸、丙酸、乳酸和丁酸)和气体(Johnson等，1993)。初级酸刺激肠道蠕动并通过降低pH帮助钙和铁的吸收。GOS也被称为双歧杆菌生长因子，其有益的健康作用是公认的。此外，双歧杆菌选择性地利用半乳寡糖，抑制消化道中不需要的微生物的生长(Pennisin，1997)。GOS也有益于口腔健康，它们不被口腔菌群(链球菌突变体)所利用，因而避免龋齿的形成(Szilagyi，1999)。

各种β-半乳糖苷酶在其所形成GOS总的数量和结构上有所差异。例如，从不同的双歧杆菌菌株中分离β-半乳糖苷酶并随后将其用于由30％的乳糖溶液进行的GOS合成过程，所生产的数量明显不同。在角形双歧杆菌(Bifidobacterium angulatum)的情况下，它们占到溶液中所有糖类的43.8％，而在假长双歧杆菌(Bifidobacterium pseudolongum)的情况下，仅为26.8％(Rabiu等，2001)。至于结构，在两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)的情况下两个单糖单位(半乳糖-半乳糖，半乳糖-葡萄糖)新形成的糖苷键的种类是β(1-3)(Dumortier等，1994)，与环状芽胞杆菌(Bacillus circulans)中的β(1-4)(Mozaffar等，1984)和嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)中的β(1-6)(Matsumoto，1990)不同。

β-半乳糖苷酶通过以下方法固定化：截留(Mammarella和Rubiolo，2005，Rodriguez-Nogales和Delgadillo，2005)、交联(Sungur和Akbulut，1994)、吸附(Carpio等，2000)、共价结合(Hu等，1993，Findlay，1991，Di Serio等，2003)包埋在膜中(Novalin等，2005)，或这些方法的组合(在1.2.1部分中描述更详细)。

β-半乳糖苷酶的固定化具有某些缺点，诸如固定化后酶活性的丢失。取决于所使用的固定化方法，固定化后β-半乳糖苷酶活性降低5％至90％。通过固定化物的重复使用性弥补了这一缺陷。重复使用过程中保持酶活性的能力以及固定化物的稳定性是决定固定化物工业规模应用的决定性参数(Tanaka和Kawamoto，1999)。

聚丙烯酰胺和聚乙烯醇凝胶常用于截留的方法。PVA基质也用于从丝状真菌分离的β-半乳糖苷酶的包埋，以此提高其热稳定性。所述酶在50℃下24小时后保留其原先活性的70％，60℃24小时后保留其原先活性的5％(Batsalova等，1987)。Khare和Gupta(1988)使用交联和随后的在聚丙烯酰胺凝胶中包埋这两种方法的组合对大肠杆菌β-半乳糖苷酶进行了固定化。在相同的但使用己二亚氨二甲酯作为交联剂以及BSA、半胱氨酸和乳糖作为酶阻碍剂的过程中，检测到先前固定化酶190％的活性。比较嗜热细菌水生栖热菌(Thermusaquaticus)的β-半乳糖苷酶不同固定化方法显示，交联并随后截留在琼脂糖颗粒中是高浓度酶固定化的优选工艺，具有高酶活性的好处(Berger等，1995)。这一固定化工艺能在不同条件下提高酶的稳定性。将米曲霉(A.oryzae)的β-半乳糖苷酶包埋在PVA凝胶中提高了酶对温度、pH值和离子强度的抗性(Rossi等，1999)。

吸附是技术上要求不高的一种固定化方法。例如，疏水性棉纤维可以作为一种载体，在这之上酶保持其先前活力的50％(Sharma和Yamazaki，1984)。Bakken等在轴向流反应器中的牛奶的乳糖水解过程中，通过将其吸附在膜形式的聚氯乙烯和硅胶上，使用了米曲霉(A.oryzae)的β-半乳糖苷酶(1990)。通过吸附在骨粉上固定化的β-半乳糖苷酶保留了其原先活力的83％，但在4批次水解过程中，固定化物逐渐丧失其活性。第4次水解后，固定化物的活性仅有原先的24％(Carpio等，2000)。这一实验说明了这一固定化方法的缺点，会发生轻微的解吸附。这一影响可以通过添加适当的交联剂加以消除(Szczodrak，2000)。

Piettaa等(1989)通过共价键将米曲霉(A.oryzae)的β-半乳糖苷酶在两种不同载体中固定化。第一种是沸石，但它并不方便，因为仅结合少量的酶。与此相反，尼龙-6粉末共价结合更多的酶并形成稳定的复合物。Peters和Rehm(2006)通过共价结合在聚羟基脂肪酸酯颗粒上进行了β-半乳糖苷酶的固定化。所得到的固定化物在不同条件的保存过程中长期稳定，这说明在载体和固定化酶之间的牢固结合。

具有两个反应性功能团的戊二醛是β-半乳糖苷酶固定化中最常用的交联剂(Guisán等，1997，Szczodrak，2000，Zhou和Chen2，2001)。然而，交联固定化的方法在很大程度上与诸如吸附或截留等其他方法(如上所述，Panesar等，印刷中)组合使用。例如，通过截留方法固定化在由藻酸胶和明胶构成的纤维内的米曲霉(A.oryzae)的β-半乳糖苷酶随后用戊二醛交联以防止酶的洗出(Tanriseven和Dogan，2002)。此类交联也在藻酸钴凝胶中β-半乳糖苷酶的固定化中使用。然而，乳糖水解过程中钴的释放使这种固定化物不能用于食品工业(Ates和Mehmetoglu，1997)。

固定化酶的活性和稳定性受到pH值、温度和离子强度的影响(Roy和Gupta，2003)。如大部分发表的工作中所述，与游离酶相比，固定化酶具有更广的最适pH和温度范围。在较低pH值和较高温度下固定化的β-半乳糖苷酶具有较高的稳定性，这在乳糖水解中具有优势，而且，通过降低pH值和提高温度降低了污染风险。另一方面，在这些条件下，最适pH的偏移和稳定性提高在甜乳清(其pH位于5.5至6.0的区间)中乳糖水解过程中是一个优势(Szczodrak，2000)。

来自不同微生物的β-半乳糖苷酶也被固定化以在连续和批处理模式中进行半乳寡糖的生产(Chockchaisawasdee等，2005)。与游离酶相比，固定化的酶产生较低的GOS浓度。这一浓度的降低是由固定化系统中底物与酶的接近受到限制引起的(Mahoney，1998)。所形成的GOS浓度和结构在相当程度上取决于初始底物浓度和酶的来源。初始乳糖浓度从14％提高到23％使得GOS产量翻倍(Foda和Lopez-Leiva，2000，Chockchaisawasdee等，2005)。

Shin等(1998)将分离自布勒掷孢酵母(Bullera singularis)ATCC24193的酶固定化入壳聚糖颗粒。他们在GOS生产中使用这样固定化的酶。实验延续了15天，在此期间，他们记录了所有糖类中55重量％的GOS(初始浓度100g/l)，体积产率为4.4g/l/小时。Albayrak和Yang(2002)的工作中也描述了另一个固定化β-半乳糖苷酶在寡糖生产中应用的例子。他们通过使用固定化在棉纤维上的米曲霉(A.oryzae)的酶达到了总糖中26重量％的产率(底物浓度400g/l)，体积产率106g/l/小时。Foda和Lopez-Leiva(2000)用固定化的β-半乳糖苷酶测试了膜流式反应器生产GOS。他们使用超滤处理的含20重量％的初始乳糖浓度的乳清达到了最高产量(31重量％)。乳清是乳糖的丰富来源，其在GOS生产中的使用看来是非常有吸引力的。

在固定化物生产中使用的浇铸单元是已知的，所述固定化物是通常以透镜状或小带状生产的产品(在聚乙烯醇载体基础上的生物催化剂)。PVA凝胶和生物质混合物通过滴落、浇铸机制以准确的、预先设定的剂量撒在连续传送带上，在这之上通过生产过程中的干燥和物理凝胶化变为粘性物质。目前，用于生产基于聚乙烯醇载体的固定化物生产的浇铸单元包括置于干燥通道前的浇铸装置，一个连续传送带(由例如聚乙烯制成)在干燥通道内运行。被称为浇铸头的浇铸装置装有一排直径为0.1mm到2.00mm的浇铸针注射器，它们以不同的频率和不同的脉冲宽度在电磁铁的帮助下律动，并将PVA凝胶和生物质的混合物转移到或灌注到连续传送带上。所述浇铸单元还包含一个置于干燥通道上部中的重胀部分，它由一个低压喷嘴系统构成，用以湿润(重胀)干燥的产物。此外，所述浇铸单元配备有收集部分，包括一个位于所述传送带驱动柱上方由不锈钢片制成的压力擦拭器，该擦拭器由置于压力不锈钢擦拭器上方的喷嘴清洗并安装在所述浇铸单元的承载框架上。通过使用连续的除湿空气或在进入干燥通道前由加热元件加热的连续冷空气将环境空气或除湿空气作为干燥介质，这保证了通过干燥基于PVA载体所形成的固定化物的凝胶化。尤其是因为难于从传送带上去除基于PVA载体的固定化物，这种方式安置的浇铸单元不能进行长期的经济化生产。使用机械不锈钢擦拭器用于擦拭以及后续的收集。擦拭器牢固地压在传送带表面(即基于其弹性)，并随后由擦拭器擦下所述产品并落入收集罐中。这种从传送带上机械去除产品的方法并不完美，尤其是要考虑到形成大团大块的聚乙烯醇载体，以及随之产生的低活性或无活性的产品。另一个缺点是所述浇铸单元连续传送带的显著的机械磨损。进一步了解到，在浇铸单元的重胀部分使用盐溶液引起盐粘附在传送带表面并由此引起浇铸单元连续传送带的表面张力的改变，进而导致产品形状改变。这一改变意味着在大多数情况下，在从传送带上去除和分开固定化物的过程中，损伤和大的团块的形成是不可避免的。

发明概述

通过以下途径可消除上述缺点：含有生物活性材料的固定化酶或固定在聚乙烯醇凝胶中的微生物形式的生物催化剂的工业生产方法及所述生物催化剂的应用，在进行工业生产时使用了由游离的天然或经预处理的(聚合的)酶催化剂或产酶微生物或其部分以及聚乙烯醇凝胶的混合物所形成的生物活性材料，根据生物活性材料的范围，所述混合物在80℃至15℃之间在干燥空气流中凝胶化并成型，其中所述生物催化剂的表面积与体积的几何比保持在7mm^-1以上，所制备的生物催化剂可以培养并随后在一定条件下在生物技术过程中使用，该条件可确保所述生物技术过程具有更高产率、更高产量和酶稳定性、长期并反复使用或随后易于分离所述生物催化剂的明确的过程控制。

使用固定化细胞技术的主要优点在于：具体过程操作成本的显著降低，这与可以重复使用所述生物催化剂并使得所述过程连续化、在系统中保持固定的生物质的高浓度以及生物质分离及产物分离的成本较低有关。如果过程是连续的，不发生生物质从载体冲走的情况，降低了非生产性生长期，提高了产量并实现了更高的反应速率。还有一个优点是，如本发明所述的生物技术过程控制方法导致所需的反应体积和反应周期减小，这意味着运作成本和投资的降低。

为了强化目前通过固定化细胞从饮用水、工业废水和废水中以气体氮的形式去除氮化合物的处理工艺，希望使用透镜状载体，或更精确地说使用其高度比其底部半径小4倍到最多达20倍的圆柱体状载体，或是使用小带状载体，或更精确地说使用其一维比其他二维小4倍到最多达20倍的块状载体，从而使得所述载体的表面积与体积的几何比(S/V)大于7mm^-1。

为了制备用于从饮用水、工业废水和废水中去除氮污染，可以将硝化和脱硝细菌包埋进聚乙烯醇凝胶中，并随后通过干燥在80℃至15℃的温度下将PVA载体和细菌细胞混合物凝胶化并形成透镜或小带形状，从而使得所述生物催化剂的表面积与体积比最小为7.0mm^-1，并随后在适当的硫酸钠溶液中硬化固定化物。固定化物随后在温度为20℃至35℃、pH6.0至9.5的条件下在含有10mg/l到1000mg/l N-NH₄和10mg/l到1500mg/l N-NO₃氮底物的水营养培养基中培养。

分别制备含生物催化剂的硝化细菌与含生物催化剂的脱硝细菌。含有两种生物催化剂的生物质在培养后可以直接用于硝化和脱硝化的工业设备。

硝化细菌(欧洲亚硝化单胞菌(Nitrosomonas europeae)和维氏硝化细菌(Nitrobacter winogradskiy))的纯净混合培养物通过在PVA基质中包埋用于固定化物制备。所使用的无机营养菌(缓慢生长有机体)，在欧洲亚硝化毛杆菌(Nitrosomonas europaea)的情况下从氨(N-NH₃)氧化中获得其生存所需的能量，在维氏硝化杆菌(N.winogradskyi)的情况下从亚硝酸盐(N-NO₂)氧化中获得能量。

通过在PVA基质中包埋，将硝酸盐(N-NO₃)的氮用作代替氧的电子受体的脱硝细菌脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)用于固定化物的制备。所述脱硝细菌是有机营养菌，其生长需要有机碳。所使用的培养溶液和一些真实的工业废水不含任何有机物质，因此必须添加有机碳，如乙醇、糖等等，优选添加甲醇，因为它便宜却产生相对少的生物质。

透镜状固定化物保持微生物生长所需的整个凝胶载体体积的最佳利用(细胞载量)，并由此对微生物和酶的生产性酶性质的最佳利用，这通过使用PVA固定化物的生物技术过程的具体产率的提高得以体现。以此方法制备的生物催化剂可在批次、半连续和连续发酵模式中重复使用。

为了制备用于从糖底物生产乙醇的所述生物催化剂，可以将厌氧菌运动发酵单孢菌(Zymomonas mobilis)在PVA凝胶中包埋，随后通过干燥在80℃至15℃将PVA载体和发酵单孢菌混合物凝胶化并定型，随后在温度为20℃至40℃、pH 3.5至7.0、含1-15重量％乙醇的条件下将固定化物在含有2-25重量％糖底物的水培养基中培养。在这一过程中，也可以在生产结束后将固定化细胞与液体部分分离并重复用于乙醇生产。如此制备的生物催化剂可以在批次、半连续和连续发酵模式中重复使用。

为了制备用于从糖底物生产乳酸的生物催化剂，可以将嗜热菌凝结芽胞杆菌(Bacillus coagulans)包埋在PVA凝胶中，随后通过干燥在80℃至15℃将PVA载体与凝结芽胞杆菌(Bacillus coagulans)的混合物凝胶化并定型，使得固定化物的表面积与体积比大于7.0mm^-1，随后在温度为30℃至60℃、pH5.0至7.5、存在1-12重量％乳酸或其盐的条件下在含2-14重量％糖底物的水培养基中培养固定化细胞。也可以在生产结束后，将所述固定化细胞与液体部分分离并重复用于乳酸生产。如此制备的生物催化剂可以在批次、半连续和连续发酵模式中重复使用。

可以使用凝结芽胞杆菌CCM 4318菌株以提高乳酸生产的产率。该菌株的特征是乳酸生产中的高产率，考虑到将生物催化剂的表面积与体积比保持在7.0mm^-1以上，其乳酸产率变得更高。

为了制备用于从糖溶液转化糖制剂的的生物催化剂，可以将转化酶包埋在PVA中，并随后在80℃到15℃通过干燥将PVA载体和酶的混合物凝胶化并以表面积与体积比大于7.0mm^-1成形，随后将如此制备的酶在温度为20℃至50℃、pH 3.5至7.0的条件下用于含2-50重量％糖底物的糖溶液的水解。

可以在水解结束后，将所述固定化酶从液体部分中分离并在转化蔗糖生产中重复使用，采用固定化转化酶的蔗糖水解可以在批次、半连续和连续模式中进行。

所述将转化酶固定化在PVA凝胶中的方法是基于在温度80℃至15℃下在干燥空气流中凝胶的干燥，此时可以发生凝胶和转化酶功能团之间的相互作用。在固定化物表面积和体积比大于7.0mm^-1的条件下，固定化物的透镜形状保证了对整个凝胶体积的最佳利以及转化酶高特异性活性的实现。这样固定化的酶不会从基质中被洗出并可用于批次、半连续和连续运行模式。

为了制备用于从高糖制备D-葡萄糖的生物催化剂，可以将葡糖淀粉酶固定化在PVA凝胶中并随后通过干燥在80℃至15℃将PVA载体与酶的混合物凝胶化并定型，使得固定化物的表面积和体积比大于7.0mm^-1，如此生产的酶用于高糖水解，所述高糖是在温度为20℃至45℃、pH 3.5至7的条件下通过含2-40重量％糖的淀粉水解制备的。

为了避免葡糖淀粉酶被洗出，可以在空气流中干燥过程中，在80℃至15℃的温度条件下进行PVA凝胶中酶的固定化，此时可以发生凝胶功能基团与葡糖淀粉酶的相互作用。采用这一方法固定化的酶不会从基质中被洗出并可用于批次、半连续和连续模式。这样制备的含有葡萄糖的糖底物可以用于发酵和食品工业。

可以在水解完成后将所述固定化葡糖淀粉酶从液体部分中分离并在葡萄糖生产中重复使用。

也可以将采用固定化葡糖淀粉酶的水解用于批次、分批补料和连续运行模式。

也可以在乙醇发酵生产过程中将所述固定化葡糖淀粉酶用于淀粉底物的糖化。

也可以在乳酸发酵生产过程中将所述固定化葡糖淀粉酶用于淀粉底物的糖化。

为了制备用于由乳糖溶液进行乳糖溶液水解、制备D-半乳糖、D-葡萄糖和半乳寡糖的生物催化剂，可以将β-半乳糖苷酶包埋在PVA凝胶中，并随后通过80℃至15℃的干燥将PVA载体与酶的混合物凝胶化并定型，使得固定化物的表面积与体积比不小于7.0mm^-1，如此生产的酶在温度为20℃至60℃、pH 3.0至7.0的条件下用于含2-50重量％糖底物的乳糖溶液的水解。

可以在水解完成后，将所述固定化的β-半乳糖苷酶从液体部分中分离并重复使用于D-半乳糖、D-葡萄糖和半乳寡糖的生产，采用固定化β-半乳糖苷酶的乳糖水解在批次、分批补料和连续运行模式中进行。

用于制备固定化生物催化剂的装置是工业生产装置，它根据生物活性材料的范围，提供了生物载体的最佳体积和表面积，该装置包括一个置于干燥通道之前的滴落、浇铸装置，连续传送带运行通过干燥通道，所述装置中配备有至少一个含两排与压力调节罐及压缩器相连的浇铸针注射器的浇铸头、传送带和干燥系统(干燥空气源)，干燥空气通过通风设备吹入包含一体化加热元件的空气分配系统，干燥空气进入上部干燥通道、并进一步进入下部干燥通道和重胀罐(reswelling tank)，两者之间安装了一个根据机械擦拭和高压清洗原理设计的擦拭和收集装置，该装置和具有一体化高压泵和低压泵的管道相连，该管道进入具有冷却功能的收集池，两者之间还有冲洗箱用于通过与低压泵相连的喷嘴对连续传送带进行最后清洁，其中所述低压泵通过管道与清洗罐相连。

如本发明所述的装置形成了一个全新的工业浇铸装置组合物，该装置包含一个或两个配有两排浇铸针注射器的浇铸头，注射器直径为0.1到2.00mm，通过电磁铁以不同的频率和脉冲宽度律动；具有受控驱动器的传送带；具有逆流干燥的干燥通道；重胀罐；独立的收集用低压清洗系统；以及所述浇铸装置下部具有逆流干燥的下部干燥通道。也可以在所述收集池中使用采用水盐溶液的独立高压清洗系统作为所述装置的一部分，其中所述的高压清洗系统包含用于将压力水输送到高压喷嘴的高压泵。以这种方法实现从传送带上机械擦拭下物质的效率的提高。

同样重要的是，本发明所述的装置，即包含此类收集和清洗设备的装置，能够保证基于聚乙烯醇载体的固定化物的不间断经济化工业生产。

为了作为所述浇铸装置一部分的可擦拭收集装置的正确运行，如果它是由一个侧板形成的，其中提供清洗的机械聚合物擦拭器以45°至80°的角度置于不锈钢压力装置上，具有弹簧压力装置及高压喷嘴系统提供的清洗装置，固定在支持不锈钢管道分配系统上，后者固定在所述框架上，用于传送带内侧及外侧的清洗，可以存在具有安装在所述具有弹簧装置的机械聚合物擦拭器后的具有聚合物毛刷的上部和下部擦拭器，并用于在产品离开所述结构处将产品从传送带上最终清洗下来，可以进一步具有下部和上部擦拭器。所设计的可擦拭收集装置也能清洗连续传送带的其他侧面，即便其内表面是不平坦的、有褶皱的或粗糙的，这也是一个优点。

本发明所述的装置也可以用于在其他粘性材料生产中从传送带上擦拭下其他粘性物质。

附图说明

通过附图对本发明进行更详细的阐述，其中图1显示了所述浇铸装置的示意图，图2是重胀罐的示意图，图3是所述收集装置的局部剖视图，图4是清洗箱的示意图。

相关技术说明

上述载体生产的方法以及其通过将硝化和脱硝细胞在聚乙烯醇凝胶中固定化从废水中除氮的过程中的应用将在以下的实施例中加以描述。

实施例1

固定化物—用于硝化的生物催化剂是通过将硝化菌(欧洲亚硝化单胞菌(Nitrosomonas europeae)和维氏硝化细菌(Nitrobacter winogradskiy))的纯的混合培养物在PVA-水凝胶中包埋进行制备的。

固定化物—用于脱硝化的生物催化剂是通过脱销细菌(Paraccocusdenitrificans)的包埋进行制备的。

固定化按照以下方法进行：制备含100g PVA(聚乙烯醇)、60g PEG(聚乙二醇)、790g蒸馏水的PVA溶液。将50ml匀质化的生物质悬浮液加入所制备的溶液，使得所得到的细胞浓度达到0.60g细胞/dm³凝胶。如此制备的PVA溶液中的细胞混合物滴在硬质平板上，随后加以交联并在80℃至15℃条件下在干燥空气流中成形。将表面积与体积比不小于7mm^-1的固定化物转移到硫酸钠(0.01mol/l)和氯化铵(0.1mol/l)溶液中并保留60分钟。所述固定化物过滤后在存储培养基中4℃培养或保存。

在硝化微生物的情况下，在逐步提高的氮底物含量(50mg/l至500mg/lN-NH₄)的水培养基中进行批次培养，其中pH值为7.0、溶氧浓度大于1.5mg/l。

在脱硝化微生物的情况下，在含有200mg/l N-NO₃氮底物含量和其他营养物质的水培养基中进行批次培养，其中温度为20℃至35℃、pH值7.8、甲醇作为碳底物。培养后两种生物催化剂中的生物质含量为每1000ml PVA含60mg至80mg生物质干物质。

随后所制备的固定化物进行重复批次发酵。在有效体积为17升、含15升合成废水(WW)(其中包含约800mg/l N-NH₄和2000g含包埋的硝化细菌的生物催化剂)的反应器中，硝化(从氨水中去除氮)在4小时后完成，这说明硝化速率约为1500mg N-NH₄/小时 x kg所述生物催化剂，分别是约4.8kg N-NH₄/m³WW x 天数和36kg N-NH₄/m³生物催化剂 x 天数。

在有效体积为15.8升、含15升合成废水(其中含有浓度为800mg/l N-NO₃和800g含包埋的硝化细菌的生物催化剂)的反应器中，在存在甲醇作为碳底物的条件下，3小时后完成脱硝化(从硝酸盐中除氮)，这表示脱硝化速率约为2000mg N-NO₃/小时 x kg所述生物催化剂，分别相当于约6kg N-NO₃/m³WW x 天数以及45kg N-NO₃/m³所述生物催化剂 x 天数。

实施例2

如上述实施例1中所述制备并培养的固定化物以硝化和脱硝化的连续调节模式用于从实际废水中去除氮污染，废水中含有高浓度氮污染(200mg/l至1000mg/l N-NH₄)并且实际上其重铬酸盐值为0。

连续模式单元用于检测同时硝化和脱硝化，其中震荡硝化反应器的有效体积为17升，震荡脱硝化反应器的有效体积为3.8升。实际工业废水的流速为35升/天，其中N-NH₄含量为1600mg/l。

在硝化反应器中加入2000g含包埋的硝化细菌的生物催化剂。在脱硝化反应器中加入800g含包埋的脱硝化细菌的生物催化剂。

在95％硝化效率情况下，平均硝化速率为约1000mg N-NH₄/小时 x kg生物催化剂，在甲醇作为碳底物的情况下，脱硝化的平均速率为约1600mg N-NO₃/小时 x kg生物催化剂，这一结果在为期数周的实验过程中得到。氮污染去除速率约为1.5kg/m³WW x 天数。

实施例3

如上述实施例1中所述制备并培养的固定化物以连续的硝化和脱硝化的调节模式用于从实际废水中去除氮污染，废水中含有高浓度氮污染(200mg/l至1000mg/l N-NH₄)以及高重铬酸盐值(>1000mg/l)。

所制备的固定化物进行批次发酵。在有效体积为17升、含15升合成废水(WW)(其中包含约800mg/l N-NH₄和2000g含包埋的硝化细菌的生物催化剂)的反应器中，硝化过程(从氨水中除氮)在12小时后完成，这表示硝化速率约为500mg N-NH₄/小时 x kg生物催化剂，分别相当于约1.6kg N-NH₄/m³WW x 天数和12kg N-NH₄/m³生物催化剂 x 天数。

在有效体积为15.8升、含15升合成废水(其中包含浓度为800mg/l N-NO₃和800g含包埋的硝化细菌的生物催化剂)的反应器中，在甲醇作为碳底物的条件下，脱硝化过程(亚硝酸氮去除)在6小时后完成，这表示脱硝化速率约为1000mg N-NO₃/小时 x kg生物催化剂，分别相当于约3kg N-NO₃/m³WW x 天数和22.5kg N-NO₃/m³生物催化剂 x 天数。

在采用在聚乙烯醇凝胶中固定化的凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)从糖底物生产乳酸过程中的生产方法及上述载体的应用将在以下实施例中阐述。

实施例 4

通过将0.2cm³保存培养物接种至培养皿(直径9cm)中含无菌CaCO₃(3小时，160℃)的MRS琼脂表面制备凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)CCM 4318孢子悬浮液。在实验室恒温器中50℃孵育72小时。随后用5cm³无菌蒸馏水覆盖形成孢子的培养物并将其移入Erlenmayer烧瓶。所获得的悬浮液70℃孵育25分钟后用于PVA凝胶中的固定化。

制备含100g PVA(聚乙烯醇)、60g PEG(聚乙二醇)和790g蒸馏水的PVA溶液。在所述溶液中加入50ml匀质化生物质悬浮液，使得细胞终浓度达到0.67g细胞(干物质)/dm³凝胶。将如此制备的PVA凝胶中的细胞混合物滴在硬质平面上，随后交联并以80℃至15℃的温度梯度在干燥空气流中成形。随后将表面积与体积比不小于7mm^-1的固定化物转移至硫酸钠溶液中(0.1mol/l)并保留60分钟。过滤后将固定化物用于批次发酵或保存在4℃的无菌水自来水中。

在含2.6升生产培养基的5升实验室发酵罐中以反复批次发酵方式进行生物质的增殖。生产培养基在1升蒸馏水中包含60g蔗糖、10g酵母提取物、1g(NH₄)₂HPO₄、0.2g MgSO₄ x 7H₂O、0.05g MnSO₄ x 4H₂O、0.01g FeSO₄ x 7H₂O。将生产培养基短时煮沸，冷却至60℃，随后加入400g湿固定化物。在1小时内将温度逐步降至45℃，同时将pH降至6.9到5.0，随后通过添加26％的氨水溶液在后续的发酵过程中保持pH值5.8。以批次模式进行发酵并连续震荡(200rpm)。糖底物消耗后将固定化物与发酵培养基分离并用于新一次发酵。在以下条件下以类似方式进行一系列共9批发酵：第2到第5次转化在50℃、pH6.0条件下进行，第6至10次转化在52℃、pH 6.3条件下进行。在乳酸产率91％到93％的情况下，重复发酵过程中总的发酵时间从48小时(第1次转化)缩短到12小时(第10次转化)。第10次转化后PVA凝胶中的生物质浓度提高到0.065g_细胞/g_固定化物。

实施例5

培养基组成、固定化物制备以及批次发酵与实施例4中所述类似，只是在生产培养基中将葡萄糖(60g/l)代替蔗糖使用。在第10次转化中，14小时发酵后产生55.2g/l乳酸和1.2g/l葡萄糖。

实施例6

如上述实施例4中所述制备的350g湿固定化物转移至6升发酵罐并加入2dm³生产培养基，其在1升蒸馏水中包含60g蔗糖、5.0g酵母提取物、0.8g(NH₄)₂HPO₄、0.2g MgSO₄ x 7H₂O、0.05g MnSO₄ x 4H₂O、0.01g FeSO₄ x 7H₂O。以批次方式进行发酵，52℃震荡(200rpm)，通过添加26％的氨水保持pH 6.3。当蔗糖浓度降至20g x dm^-3后，将2升含140g/l蔗糖的相同成分生产培养基以能将浓度维持在15g/l至30g/l的速度分批加入。15小时后培养基中的乳酸含量为93.5g x dm^-3，残余蔗糖为2.6g/l。

实施例7

培养基成分以及固定化物的制备与实施例5中所述的一致。10次转化后将350g固定化物转移至6升发酵罐并添加2.5dm³生产培养基，该培养基在1升蒸馏水中包含60g葡萄糖、5.0g酵母提取物、0.8g(NH₄)₂HPO₄、0.2g MgSO₄x 7H₂O、0.05g MnSO₄ x 4H₂O、0.01g FeSO₄ x 7H₂O。52℃震荡(200rpm)发酵，保持pH值为6.3。葡萄糖浓度降至20g x dm^-3后分批补加生产培养基并取走相同成分的发酵培养基，使得反应器中的残留蔗糖浓度为15g/l至30g/l，以保持残留葡萄糖浓度为10g/dm³至15g/dm³，实际乳酸浓度40g/dm³至48g/dm³。连续发酵40天，所述过程中的平均设备体积产率为13.5至17.0(g_乳酸 x dm^-3x小时^-1)。

在采用在聚乙烯醇凝胶中固定化的运动发酵单孢菌(Zymomonas mobilis)从糖底物生产乙醇过程中的生产方法及上述载体的应用将在以下实施例中阐述。

实施例8

在250ml培养烧瓶中制备100ml培养基(121℃灭菌20分钟)。培养基在1升蒸馏水中包含5g酵母提取物、1g(NH₄)₂SO₄、0.5g MgSO₄ x 7H₂O、1gKH₂PO₄、100g葡萄糖(pH 5到5.5)。将在固体培养基上生长并30℃静止培养24到48小时的运动发酵单孢菌(Zymomonas mobilis)CCM 2770接种所制备的培养基。所制备的生物质作为接种体(10％体积)接种在含100ml上述组分培养基的250ml培养瓶中。30℃静止培养12小时后将微生物再次转移到培养基中(5％体积)。在30℃下进行培养直到生物质干物质达到1.2g x dm^-3，培养基可以轻微震荡。培养结束后通过离心(5500rpm，25分钟)分离生物质并在固定化中使用。

制备含有100g PVA(聚乙烯醇)、60g PEG(聚乙二醇)和790g蒸馏水的PVA溶液。在所制备的溶液中加入50ml匀质化的生物质悬浮液，使得所得到的细胞浓度达到0.56g细胞/dm³凝胶。将这样的PVA溶液中的细胞混合物滴在硬质平面上并在80℃至15℃温度梯度的干燥空气流中交联和成形。随后将表面积与体积比不小于7mm^-1的固定化物转移到硫酸钠溶液(0.1mol/l)中，保留30到60分钟。

固定化物中的细菌生物质在6dm³实验室发酵罐中增殖，发酵过程中每次使用3dm³无菌培养基，然后在25℃通过分批补料对培养基中23％(体积)的固定化物进行培养，同时保持震荡(80rpm)，使得培养基pH调节为6.5并自动降至pH4.0。去除流体相并向固定化物添加新鲜培养基，该过程重复一次。随后去除流体相并向固定化物添加新鲜培养基并将pH值调节为6.5(使用1M的NaOH溶液)。通过自发发酵pH值随后降至5，同时保持震荡(80rpm)，然后进行发酵直至耗完葡萄糖。去除流体相并向固定化物添加新鲜培养基，该过程重复6次。如此制备的固定化物中细胞干物质提高到65.8g细胞/dm³凝胶。

向所制备的固定化细胞(450g湿生物催化剂)添加含150g x dm^-3葡萄糖含量且pH5.5的无菌生产培养基2.2dm³。在5升生物反应器中30℃进行发酵并保持震荡(80rpm)，通过添加NaOH(2mol/dm³)溶液保持pH值为5.0。11小时发酵后，该培养基含73.8g.dm^-3乙醇，而残留葡萄糖浓度为1.8g.dm^-3。在PVA载体中固定化的运动发酵单孢菌(Zymomonas mobilis)的乙醇产率达到202mg_乙 _醇/ml_凝胶/小时。

实施例9

将如实施例8中所述制备的450g湿固定化物加入2.2dm³葡萄糖浓度为200g.dm^-3(pH 5.0)的生产培养基中。以批次方式在30℃下进行发酵并保持震荡(80rpm)，通过添加NaOH(2mol.dm^-3)溶液将pH保持在5.0。按照此方法进行6次发酵。每次转化13小时后，培养基中的乙醇含量不小于94.0g.dm^-3至98.0g.dm^-3，残留葡萄糖3g.dm^-3至8g.dm^-3(即94％到98％的理论产率)。

实施例10

使用了如实施例9中所述制备并增殖的固定化物。在1050ml葡萄糖含量为150g.dm^-3的生产培养基(固定化物占发酵培养基体积的30％)中添加450g固定化物。以批次方式30℃进行发酵，并保持震荡(80rpm)，通过添加NaOH(2mol/dm³)将pH维持在5.0。葡萄糖浓度降至20g.dm^-3后，以逐步分批补料方式添加1500ml葡萄糖浓度为320g.dm^-3的培养基，补料速度可以保持发酵罐中残留葡萄糖浓度为15g.dm^-3至30g.dm^-3。20小时后培养基中的乙醇含量为113.5g.dm^-3，即91％的理论产率，残留葡萄糖为4.6g.dm^-3。

实施例11

使用了如实施例8中所述制备并增殖的运动发酵单孢菌(Z.mobilis)CCM2770固定化物。在含150g.dm^-3葡萄糖的培养基中加入450g湿固定化物，pH调节为5.0。在pH5.0及30℃条件下进行发酵。葡萄糖含量降至10g.dm^-3到20g.dm^-3后，连续补加葡萄糖含量为50g.dm^-3的培养基，并以一定速率去除发酵的培养基，使得发酵罐中残留的葡萄糖浓度保持在17g.dm^-3到30g.dm^-3，并且实际乙醇浓度为58g.dm^-3至65g.dm^-3。连续发酵50天，而所述设备的体积产率为30g_乙醇/dm³/小时，这对应于乙醇产量140mg_乙醇/ml_凝胶/小时。

实施例12

过程与实施例8中所述相同，将运动发酵单胞菌苹果汁亚属(Zymomonasmobilis subsp.pomacii)CCM2771用作生产微生物。发酵15小时后，培养基含有68.3g.dm^-3的乙醇，而残留葡萄糖浓度为6.8g.dm^-3。

在采用在聚乙烯醇凝胶中包埋的转化酶从蔗糖溶液制备转化糖的过程中的生产方法及上述载体的应用将在以下实施例中阐述。

实施例13

制备含有100g PVA(聚乙烯醇)、60g PEG(聚乙二醇)、790g蒸馏水的PVA溶液。在所制备的溶液中加入50ml转化酶制剂(Sigma)(酶浓度100g/l)。将所制备的PVA中的酶混合物滴在硬质平面上并在温度梯度为80℃至15℃的干燥空气流中干燥并成形。将表面积与体积比不小于7mm^-1的固定化物移至硫酸钠溶液(0.1mol/l)并保留10到120分钟。所制备的固定化物可以保存在4℃的10mM的醋酸缓冲溶液中(pH 4.5)。

这样制备的固定化酶可以在溶于10mM醋酸缓冲液(pH 4.5)的蔗糖水解中使用。在1000ml蔗糖溶液中(100g/l)加入120g固定化转化酶。以批次方式在30℃下进行水解并保持震荡(80rpm)。水解5分钟后，蔗糖被完全水解为葡萄糖和果糖。

实施例14

在30℃下向1000ml浓度为450g/l(pH＝4.5，10mM醋酸缓冲液)的蔗糖溶液中加入120g如实施例13中所述制备的湿固定化物。以批次方式进行水解，并连续震荡。水解360分钟后按照此方法的残留蔗糖浓度为10.1g/l。

实施例15

在30℃下向1000ml浓度为280g/l(pH＝4.5，10mM醋酸缓冲液)的蔗糖溶液中加入120g如实施例13中所述制备的湿固定化物。以批次方式进行水解，并连续震荡。360分钟后按照此方法的残留蔗糖浓度为1.8g/l。水解后去除流体相，固定化的酶通过上述方法用于重复批次水解。水解240分钟后按照此方法的残留蔗糖浓度为3g/l。

实施例16

如实施例13中所述制备固定化物。将25g湿固定化物移至0.5升蔗糖浓度为120g/l、pH4.5(通过H₂SO₄调节)的糖浆中。在pH＝4.5、30℃以及200rpm震荡的条件下进行水解。发酵罐中蔗糖量降至30g/l到40g/l后，向发酵罐中连续补加浓度为120g/l的糖浆，并以一定速率去除水解的培养基，使得蔗糖浓度达到30g/l至40g/l(66％至75％转化率)。在这种模式中，固定化物的特异活性为0.35g/g/h。

实施例17

使用如实施例13中所述制备的固定化物。将25g湿固定化物移至0.5升蔗糖浓度为120g/l、pH 4.5的糖浆中。在pH＝4.5、40℃以及200rpm震荡的条件下进行水解。发酵罐中蔗糖量降至30g/l到40g/l后，向发酵罐中连续补加浓度为120g/l的糖浆，并以一定速率去除水解的培养基，使得蔗糖浓度达到30g/l至40g/l(66％至75％转化率)。在这种连续进行500小时的水解模式中，固定化物的特异活性为0.55g/g/h至0.60g/g/h。

在采用在聚乙烯醇凝胶中包埋的葡糖淀粉酶从淀粉水解物生产葡萄糖的过程中的生产方法及上述载体的应用将在以下实施例中阐述。

实施例18

制备含100g PVA(聚乙烯醇)、60g PEG(聚乙二醇)、790g蒸馏水的PVA溶液。在所制备的溶液中加入50ml酶制剂SUN Ultra L(Novozymes)。将所制备的PVA溶液中的酶混合物滴在硬质平面上并在温度梯度为80℃到15℃的干燥空气流中交联并成形。随后将表面积与体积比不小于7mm^-1的固定化物移至硫酸钠溶液((0.1mol/l))中并保留10到120分钟。所制备的固定化物可以保存在4℃的溶于10mM醋酸缓冲溶液(pH 4.5)的30重量％的葡萄糖中。

将如此制备的固定化酶用于淀粉水解物(例如溶于10mM醋酸缓冲溶液(pH4.5)的麦芽糖浆，成分：33重量％高糖、20重量％麦芽三糖、53重量％麦芽糖、4重量％葡萄糖)的水解。在如此制备的1000ml糖浓度为100g/l的溶液中加入120g固定化葡糖淀粉酶。在30℃下以批次方式进行水解，并保持震荡(200rpm)。水解60分钟后。培养基包含70g/l到80g/l的葡萄糖。

实施例19

在40℃下，向5000ml糖浓度为250g/l的麦芽糖培养基(pH＝4.5)加入200g如实施例18中所述制备的湿固定化物。以批次方式进行水解并保持震荡。按此方式，6小时内产生了180g/l葡萄糖。水解后去除流体相，并将固定化葡糖淀粉酶按照上述程序用于重复批次水解。第6次转化后，水解6小时后所产生的葡萄糖浓度为178g/l。

实施例20

使用了如实施例18中所述制备的固定化物。在0.5升糖浓度为100g/l、pH4.5的麦芽糖糖浆中加入25g湿固定化物。在温度为30℃以及200rpm震荡的条件下进行水解。当发酵罐中的葡萄糖浓度提高到55g/l至65g/l以后，以一定速率向发酵罐内连续补加糖浓度为100g/l的麦芽糖糖浆，并去除已水解的培养基，使得葡萄糖浓度达到50g/l至60g/l(50％至60％的转化率)。以此水解模式连续进行900小时后，固定化物的特异活性是0.3g/g/h到0.4g/g/h(g所产生的葡萄糖/g固定化物/小时)。

实施例21

使用了如实施例18中所述制备的固定化物。在0.5升糖浓度为100g/l、pH4.5的麦芽糖糖浆中加入25g湿固定化物，在温度为45℃、pH 4.5以及200rpm震荡的条件下进行水解。当发酵罐中的葡萄糖浓度提高到55g/l至65g/l以后，以一定速率向发酵罐内连续补加糖浓度为100g/l的麦芽糖糖浆，并去除已水解的培养基，使得葡萄糖浓度达到60g/l至70g/l(60％至70％的转化率)。以此水解模式连续进行1500小时后，固定化物的特异活性是0.55g/g/h至0.6g/g/h(每小时每克固定化物生成的葡萄糖)。

实施例22

使用了如实施例18中所述制备的固定化物。培养基包含以下成分：糖浓度为195g/l的麦芽糖糖浆、5g/l酵母提取物、1g/l(NH₄)₂SO₄、0.5g/l MgSO₄ x7H₂O、1g/l KH₂PO₄。将其全部溶解在蒸馏水中，pH4.5。在1升如此制备的无菌培养基中加入50g含固定化葡糖淀粉酶的固定化物。随后用10％体积的处于微生物指数生长期的运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)接种体接种悬浮液。在水解过程中发生微生物产生乙醇以及对新生葡萄糖的同时利用。再次方法中，13.5小时后产生70g/l乙醇。

实施例23

使用了如实施例18中所述制备的固定化物。培养基具有以下成分：将糖含量为80g的麦芽糖糖浆、10g酵母提取物、1g(NH₄)₂HPO₄、0.2g MgSO₄ x7H₂O、0.05g MnSO₄ x 4H₂O、0.01g FeSO₄ x 7H₂O全部溶解在1升蒸馏水中，pH6.0。该培养基用于转化。在1升如此制备的无菌培养基中加入50g含固定化葡糖淀粉酶的固定化物。用5％体积的凝结芽孢杆菌孢子悬浮液接种所述悬浮液。在水解过程中发生微生物生产乳酸以及同时对新生葡萄糖的利用。发酵24小时后，培养基中存在55.2g/l乳酸和1.2g/l葡萄糖。

在采用在聚乙烯醇凝胶中包埋的β-半乳糖苷酶在乳糖水解以及D-半乳糖、D-葡萄糖和半乳寡糖制备中的生产方法及上述载体的应用将在以下实施例中阐述。

实施例24

制备含有100g PVA(聚乙烯醇)、60g PEG(聚乙二醇)、790g蒸馏水的PVA溶液。在如此制备的溶液中加入50ml Lactozyme(Novozymes)酶制剂。将这样制备的PVA溶液中的酶混合物滴在硬质平面上并随后在80℃至15℃温度梯度的干燥空气流中交联并成形。随后将表面积与体积比不小于7mm^-1的固定化物移至磷酸钾缓冲溶液中(pH 6.5)并保留10到120分钟。所制备的固定化物可以保存在添加了5％到10％乙醇的4℃的磷酸盐缓冲溶液中(pH 6.5)。

以此方法制备的固定化酶的初始活性为900±100U.cm^-3。

实施例25

使用按照实施例24的描述制备的固定化物。在水解中使用添加了2mMMgCl₂、溶于0.1M磷酸盐缓冲液(pH 6.5)的乳糖溶液。在1000ml所制备的乳糖浓度为100g/l的溶液中加入130g固定化β-半乳糖苷酶。在30℃下以批次方式进行水解，并保持震荡(200rpm)。水解后去除流体相，并按照上述程序将固定化的β-半乳糖苷酶用于重复批次水解。水解210分钟后，培养基包含13g/l至2g/l的乳糖。

实施例26

使用如实施例24中所述制备的固定化物。在水解中使用添加了2mMMgCl₂、溶于0.1M磷酸盐缓冲液(pH 6.5)的乳糖溶液。在1000ml如此制备的乳糖浓度为100g/l的溶液中加入130g初始活性为786U.cm^-3的β-半乳糖苷酶。在30℃、保持连续震荡(200rpm)的条件下以批次方式进行水解。转化持续时间相同。25批次水解后(这通常延续160小时)发现固定化物的活性降低了5％到10％。

在上述实施例中提到的、用于生产基于聚乙烯醇载体的固定化物的浇铸装置的布置，将在下文中加以说明。显而易见地，以下描述仅说明了本发明原则的一种应用的原理。

附图1显示了用于生产基于聚乙烯醇载体的固定化物的浇铸装置的构造版本，该版本针对连续工业生产进行了调整。所述构造版本包括安装在上部干燥通道2之前的滴落浇铸部件，该部件由一个或多个滴落浇铸双排头17组成，它(们)配备有两排浇铸注射器并与压力调节罐15和压缩器或压缩空气存贮器16相连。具有受控驱动器的连续传送带1在上部干燥通道2内部运行，上部干燥通道配备有作为干燥空气来源4的干燥系统，除湿空气经第一辅助通风机19从所述干燥系统传送讲入配有一体化加热元件5的空气分配系统6，除湿空气在几个点上进入上部干燥通道。连续传送带1在离开上部干燥通道后，运行经过重胀罐7和最终干燥通道3，后者安装在所述浇铸装置的另一侧底部，用于从上部干燥通道传送干燥空气的第二辅助通风机20由管道引导进入其一侧，用于离开清洗箱13后对连续传送带的最终干燥，潮湿的废气从其另一侧的输出管18导出。根据机械擦拭和高压清洗原理所设计的可擦拭收集装置9通过具有一体化高压泵10和低压泵11的管道与收集池8相连，收集池8含有重胀收集盐溶液24并带有冷却装置。清洗箱13利用与低压泵14相连的喷嘴对连续传送带1进行清洗，低压泵14通过管道与含有去矿物质水的清洗罐12相连。可擦拭收集装置9和清洗箱13整合在含重胀盐溶液24的重胀罐7和最终干燥通道3之间。

所述装置用于生产基于聚乙烯醇载体的固定化物的作用如下所述：聚乙烯醇凝胶和生物物质混合物从滴落浇铸部件中转移或喷射到具有受控驱动器的连续传送带1上，其中滴落浇铸部件由两个配备有两排浇铸针的浇铸头17组成，浇铸针的直径为0.1到2.00mm，通过不同频率和脉冲宽度的电磁铁律动，而连续传送带1运行通过上部干燥通道2。在压力调节罐15中分批加入用于滴落、浇铸的混合物，压力调节罐15与压缩器或压缩空气罐16相连。通过从连续空气除湿器4获得的除湿空气来保证所述混合物在连续传送带1上的干燥，其中干燥空气流经第一辅助通风机19和加热元件5，加热元件安装在空气调节分配管道6中，这样的管道控制上部干燥通道中的温度梯度并导入上部干燥管道2的每一段。附着在连续传送带1上的干燥混合物随后运行经过含重胀盐溶液的重胀罐7，随后将产品(即基于聚乙烯醇载体的固定化物)在可擦拭收集装置9中剥离。这一装置配备有用于提供高压水的系统，该系统由高压泵10和喷嘴组成，并与独立的回路相连。通过聚合物擦拭片和喷射由高压泵10提供的水性盐溶液将产品从传送带上剥离。传送带1最后通过安装在清洗箱13中的喷嘴进行处理，低压泵13和清洗去矿物质水在清洗罐12中收集，其中水是从清洗箱13中流入的。用于清洗传送带的低压水输送系统与独立的回路相连。湿的传送带1随后在下部干燥通道3中最后干燥，干燥空气经过其中安装了第二个通风机20的管道，从上部干燥通道吹入下部干燥通道3，而潮湿废气从下部干燥通道3经潮湿废气排出口18排出。

附图2显示了重胀罐的结构。这种式样的重胀罐7由底部倾斜的罐体21构成，安装在其最低点的输出阀22用于排出产物和重胀盐溶液。由一对前导张力辊23引导传送带1运行通过罐体21，其中前导张力辊23同时作用，将传送带浸入充满罐体21的重胀水性盐溶液中。

附图3显示了可擦拭收集装置9的构造。这种样式的可擦拭收集装置9由侧板25构成，其中机械聚合物擦拭器安装在具有弹簧压力部件28的不锈钢压力部件27上。弹簧压力部件28由具有垫圈的推力调节螺丝34形成，在这之上安装有弹簧35。可擦拭收集装置9进一步包括高压喷嘴26，其与固定在框架25中的支撑用不锈钢管分配系统相连，确保以45°到80°的角度进行清洗。不锈钢管道分配系统30配备有高度调节，由调节螺丝31调节。当传送带在擦拭器之间运行时，具有固定在上框33上的聚合物毛刷32的下部和上部擦拭器29与机械擦拭器27后的传送带的内外侧紧密接触，以清洁传送带的内侧面。传送带配备有用于在传送带脱离框架25的位置上对传送带1的内侧和外侧面进行最后处理的下部和上部聚合物擦拭器29。

擦拭收集装置9在重胀罐7之后在生产线上发挥作用，传送带1已经从重胀罐的下半部分运行出来，因此是反方向的。显而易见的是，在所述装置上半部分附着在传送带1上的产品是正面垂直向下的。从传送带上剥离产物的方法是机械擦拭器27以及高压喷嘴26对粘附在传送带1的外侧面上的产物共同作用的结果。传送带1上的产物首先进行高压冲洗，这由通过压力喷嘴26输送的水性盐溶液的压力压力分配系统进行，压力喷嘴26以相对于具有弹簧压力装置28的机械擦拭器27呈40°到80°的角度工作，其朝向传送带1的倾斜度也可以在5°到15°范围内调节。牢固固定的具有聚合物毛刷的下部和上部擦拭器29安装在弹簧机械聚合物擦拭器27之后的不锈钢压力部件28上，上部和下部擦拭器29同时对传送带1的内侧面和外侧面进行最后处理。传送带1经过对其两侧作最后处理的上部和下部聚合物擦拭器离开框架25。

附图4显示了清洗箱13的构造。这种式样的清洗箱13由相互连接的具有盖子43的上部36和具有排放口38的下部37构成，当这些部分与浇铸机器框架39相连时，传送带1在这两者之间运行。此外，与提供清洗用水的管道41相连的上部清洗喷嘴安装在上部36中,与供水管道41相连的下部清洗喷嘴42以同样方式安装在下部37中。可调节的聚合物擦拭器44固定在上部36的两个侧面上，用于从传送带上擦去水分，擦拭器45以相同方式固定在下部37的两个侧面上。清洗箱13通过上部和下部装配段46和47与浇铸机器框架39固定。

工业应用

本发明可以用于固定化物的生产，这些固定化物适用于食品工业、制药工业和废水处理，尤其适用于从饮用水、供水和废水(废水、农业废水、生活废水、工业废水)中氮化合物的生物去除，其中所存在的各种氮化合物通过硝化和脱硝细菌的生理活性转化成气体氮，此外这些固定化物适用于乳酸、乙醇、葡萄糖和葡萄糖-果糖糖浆的生产过程、乳糖水解成D-半乳糖过程、以及半乳寡糖生产过程。所有这些固定化物通过以每小时1kg到10kg LentiKats(商标)固定化物的产能提供连续工业生产的装置进行生产。

用于针对食品工业、制药和废水处理的固定化物生产的装置可以用于连续生产。

Claims

1.含有生物活性材料的固定化酶或固定在聚乙烯醇凝胶中的微生物形式的生物催化剂的工业生产方法及所述生物催化剂的应用，其中，所述由游离的天然或经预处理的(聚合的)酶催化剂或产酶微生物或其部分以及聚乙烯醇凝胶的混合物所形成的生物活性材料被用于其工业生产，根据生物活性材料的范围，所述混合物在80℃至15℃之间在干燥空气流中凝胶化并成型，其中所述生物催化剂的表面积与体积的几何比保持在7mm^-1以上，因而所制备的生物催化剂可以培养或保存并随后在一定条件下在生物技术过程中使用，该条件可确保所述生物技术过程具有更高产率、更高产量和酶稳定性、长期并反复使用或随后易于分离所述生物催化剂的明确的过程控制。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述工业生产的生物催化剂在重复分批发酵或反复分批补料发酵或连续发酵中反复使用。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，将硝化微生物包埋在聚乙烯醇凝胶中以制备生物催化剂用于从废水中去除氮污染，并且所述生物催化剂成形为透镜状或小带状，并随后在氮底物含量为50mg/l至500mg/l N-NH₄、pH7.0、温度为20℃至35℃以及溶氧浓度大于1.5mg/l的水营养培养基中培养所述固定化物。

4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，将脱硝微生物包埋在聚乙烯醇凝胶中以制备生物催化剂用于从废水中去除氮污染，所述生物催化剂成形为小扁豆状或带状，并随后在氮底物含量为50mg/l至500mg/l N-NO₃、pH7.8、温度为20℃至35℃以及在脱硝微生物情况下存在甲醇作为碳源的水营养培养基中培养所述固定化物。

5.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，将厌氧菌运动发酵单孢菌(Zymomonas mobilis)包埋在聚乙烯醇凝胶中制备生物催化剂，用于从糖类底物中生产乙醇，所述生物催化剂成形为透镜状或小带状，并随后在糖底物含量为2-25重量％、温度20℃至40℃、pH3.5至7.0、存在1-15重量％乙醇的水营养培养基中培养所述固定化物。

6.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，将嗜热菌凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)包埋在聚乙烯醇凝胶中制备生物催化剂，用于从糖类底物生产乳酸，所述生物催化剂成形为透镜状或小带状，并随后在糖底物含量为2-14重量％、温度30℃至60℃、pH5.0至7.5、存在1-12重量％乳酸或其盐的水营养培养基中培养所述固定化物。

7.如权利要求5所述的生产方法，其特征在于，制备时优选使用凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)CCM 4318菌株。

8.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，将葡糖淀粉酶包埋在聚乙烯醇凝胶中制备生物催化剂，用于淀粉和纤维素底物的水解，所述生物催化剂成形为小扁豆状或带状。

9.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，将转化酶包埋在聚乙烯醇凝胶中制备生物催化剂，用于水解蔗糖底物，所述生物催化剂成形为透镜状或小带状。

10.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，将β-半乳糖苷酶包埋在聚乙烯醇凝胶中制备生物催化剂，用于乳糖水解以及生产D-半乳糖、D-葡萄糖和半乳寡聚糖，所述生物催化剂成形为透镜状或小带状。

11.如权利要求1或2或9所述的方法，其特征在于，在2-50重量％糖类底物、温度为20℃至50℃以及pH3.5至7.0的蔗糖溶液中将所述固定化酶用于水解。

12.如权利要求1或2或8所述的在D-葡萄糖制备中使用包埋在聚乙烯醇凝胶中的葡糖淀粉酶的方法，其特征在于，所述固定化酶用于在温度为20℃至45℃以及pH3.5至7条件下水解通过含2-40重量％糖类底物的部分淀粉水解所制备的高糖。

13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述固定化葡糖淀粉酶用于乙醇发酵生产中含淀粉底物的糖化。

14.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述固定化葡糖淀粉酶用于乳酸发酵生产过程中的含淀粉底物的糖化。

15.如权利要求1或2或10所述的在D-半乳糖、D-葡萄糖和半乳寡聚糖制备中使用包埋在聚乙烯醇凝胶中的β-半乳糖苷酶的方法，其特征在于，所述固定化酶用于在温度20℃至60℃、pH3.5至7条件下水解含2-40重量％糖底物的乳糖溶液。

16.一种工业生产装置，如权利要求1所述，该装置能根据生物活性材料范围提供最优化生物载体体积和表面积，其包括置于连续传送带(1)运行经过的干燥通道(2)之前的浇铸装置(17)，其中，所述装置配备有至少一个具有与压力推动罐(15)和压缩机(16)相连的两排浇铸针的浇铸头(17)、传送带(1)和作为干燥空气源(4)的干燥系统，干燥空气通过通风设备导入与加热元件(5)整合的空气分配系统(6)，进入上部干燥通道(2)，并随后进入下部干燥通道(3)和重胀罐(7)，两者间装有基于机械擦拭和高压冲洗而设计的擦拭和收集装置(9)，其与具有一体化的高压泵(10)和低压泵(11)并进入带有冷却的收集池(8)的管道相连，两者之间还有另一个冲洗箱(13)，通过与低压泵(14)相连的喷嘴对连续传送带(1)进行最后清洗，该低压泵通过管道与冲洗罐(12)相连。

17.如权利要求14所述的工业生产装置，其特征在于，其收集装置(9)由一框架(25)构成，其中安装有具有弹簧压力机制(28)的机械擦拭器(27)和以45°至80°角固定在框架(25)上的高压喷嘴(26)，而具有毛刷的用于传送带(1)内部清洁的上部擦拭器(29)牢固安装在其内侧并与所述机械擦拭器(27)相对，传送带(1)配备有下部擦拭器(29)，用于在其框架(25)出口处的最终清洁。